JP3830904B2 - ミクロ流体装置と流体内の粒子を選別する方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、流体流動、とりわけ液体流動内で粒子を選別するために、個別粒子を誘導するチャネルを持つ基板より成るミクロ流体装置に関し、また更に粒子を選別する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
浮遊粒子の操作は、一般に公知である（例えば、非特許文献１参照。）。ここで浮遊粒子は、いずれの望ましい粒子であってもよく、さもなければ生物細胞であってもよい。従って以下の本文では、一般にただ粒子という語が使用される。ミクロシステムは、それを通じて粒子を持つ懸濁液が流れるように操作されるとりわけチャネル構造を形成する。チャネル構造においては、超小型電極がチャネル壁にはめあわされ、それに適用される高周波電場を持つ。２個の電極間の高周波電場の作用の下で、分極力が負または正の誘電泳動を基礎にして懸濁粒子内で産生され、前記力は電極による斥力または引力を可能にし、また懸濁液内で流動力の交互作用において、チャネル内での粒子の操作を可能にする（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
インピーダンス分光学によるマイクロチャネルでの細胞を分析することが公知である（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照。）。この場合、用途はチャネルに包埋された電極から作られ、そのため少なくとも２個の場区域が産生され、そこでインピーダンスの測定が行われる。次いで評価が差分測定により、例えば測定ブリッジにより実行される。更なる詳細については、測定原理と先行技術に関連し、これらの刊行物と、そこで与えられた説明が参考にされる。
【０００４】
このような分析の結果は、次いで細胞選別を実行するのに使用することができる。ここで同様に、誘電泳動に基づいて細胞選別を行うことは公知である。例えば、誘電泳動により、石油から硫黄を分離することは公知である（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
また、混合物から生細胞を連続選別する方法と装置を開示し、ここで１個またはそれ以上の電極を通過する細胞は、そのサイズ、物理的構造、化学的組成物および電気特性に従って選別され、この電極はそこで無線周波発生機と接続される（例えば、特許文献３参照。）。
【０００６】
前記の方法において、粒子に対する異なった電気泳動特性は、これらを流体流動から導き出すのに使用される。これは、粒子が誘導されるか、されないかに関する特異的な決定がなし得ないために、受動選別である。
【０００７】
粒子、とりわけ生物細胞を特徴付け、選別し、計数する従来公知の装置（例えば、血球計算器）は、非常に複雑な装置により際立っており、その装置は一般に、ＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器）に基づく光学分析装置または光学および電気測定装置を組合せたものより成る。純粋な電気検出および選別は行われない。従ってこれらの装置の場合には、光学分析のための粒子の追加の調製が必要とされる。これはこのような装置による分析を複雑なものとし、また時間を余計にかけることにつながる。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第００ ００ ２９３号パンフレット
【特許文献２】
米国特許第４，３２６，９３４号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，４８９，５０６号明細書
【非特許文献１】
Ｇ．フュール他著，「ナトゥールヴィッセンシャフテン」８１巻，１９９４年 ５２８ページ以下
【非特許文献２】
Ｓ．ガワード他著，「医学および生物学におけるマイクロ工学に関する第１回年次国際ＩＥＥＥ−ＥＭＢＳ 特殊論題会議，２０００年１０月１２−１４日，フランス，リヨン」，１−５ページ
【非特許文献３】
Ｓ．ガワード他著，「チップに関するラボ」，２００１年１月，７６乃至８２ページ
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、ミクロ工学またはナノ工学での基板上でできる限り速やかにかつ正確に同定および計数ならびに選別を可能にする電気的フローサイトメーター（流動細胞高度測定器）を提案する目的に基礎を置く。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、この目的は、請求項１に記載される基板を含むミクロ流体装置、および請求項１３記載の方法により達成される。装置の更なる有利で精緻な改良は、従属請求項に記載されたものより得ることができる。
【００１１】
すなわち、前記の目的を達成するために、ミクロ流体装置と流体を選別する方法を、以下の（１）〜（１８）のとおりに構成する。
【００１２】
（１）一つの基板より成るミクロ流体装置であって、流体に個別粒子（１７）を通す少なくとも１個のチャネル（２）と、粒子（１７）に誘電泳動により影響し、かつそれを分離するための調製区域（６）と、粒子（１７）を特徴付ける電極装置を持ち、その電極装置はそれぞれの区域でインピーダンスを測定するための基準探知区域と測定探知区域の少なくとも２個の探知区域を持つ測定チャネル区域（７）と、誘電泳動により測定チャネル区域（７）で同定される粒子（１７）を選別する電極装置を持つ選別区域（８）と、を有し、測定チャネル区域（７）における探知区域の断面が、調整区域（６）および選別区域（８）の断面よりも小さく、電極への信号と電極からの信号を伝送するために、個別区域（６−８）において、電極（１３、１４′、１４″、２０−３０）に電気的に接続される導線トラックを持つ基板より成ることを特徴とするミクロ流体装置。
【００１３】
（２）前記（１）記載の装置であって、前記粒子（１７）が、電極装置により調製区域（６）において誘電泳動により影響を受け、第１電極は、まず粒子（１７）を分離し次いで流体流動での特異的な位置に粒子を留める電極配列（９）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１４】
（３）前記（２）記載の装置であって、前記粒子（１７）を分離する電極配列（９）が、流動方向に対して斜めに配列され、また、ほぼロート状の配列を持ち、また流動方向でこれらに続いて通路開口部（１９）のあるロート状配列で間隙をあけて平行に配置された第２電極（１４′、１４″）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１５】
（４）前記（２）記載の装置であって、前記位置決めのための電極配列（９）が、粒子（１７）を流体流動物理的中心に留める電極（２０、２１）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１６】
（５）前記（４）記載の装置であって、電極配列（９）が、流動方向に対して斜めに配列され、側壁（１５、１６）からチャネル（２）に突出し中央通路開口部（１９）を形成する電極アーム（２２）と共にロート形状に配列される電極（２０、２１）を持ち、また直接それに隣接して通路開口部（１９）から離れて、平行に走る電極アーム（２２、２３ ）を持ち、第１電極アーム（２２）は粒子（１７）を流体流動の中心の平面に整列するのに役立ち、また第２電極アームは粒子（１７）を流体流動の中心線に沿って整列させるのに役立つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１７】
（６）前記（５）記載の装置であって、前記第２電極アーム（２３）が平衡状態にある電極間の空間内で粒子（１７）に作用する力を与えるのに十分な長さを持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１８】
（７）前記（１）乃至（６）のいずれか１項記載の装置であって、前記電極（１３、１４′、１４″）の間の距離が粒子径の２乃至４倍であることを特徴とするミクロ流体装置。
【００１９】
（８）前記（１）乃至（７）のいずれか１項記載の装置であって、ここで測定チャネル区域（７）内でのチャネル（２）の電極装置が、測定チャネル内での特異的経路に粒子（１７）を案内する第１電極配列（２６）と、それぞれの区域でインピーダンスを測定するために２個の探知区域（２４、２５）を産生する第２電極配列とを持ち、一つの探知区域２４は測定される粒子（１７）の経路に配列され、また他の探知区域（２５）は基準インピーダンスを提供するために経路の外側に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
【００２０】
（９）前記（１）乃至（８）のいずれか１項記載の装置であって、ここで選別区域（８）にある電極装置が、第１選別電極配列（２９）および少なくとも第２選別電極配列（３０）を持ち、第１選別電極配列（２９）は粒子（１７）の経路（３３）に配列され、また第２選別電極配列（３０）は第１選別電極配列（２９）により選別された粒子（１７）を特異的に前方向に誘導するために、粒子の経路の側面に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
【００２１】
（１０）前記（９）記載の装置であって、前記第２選別電極配列（３０）が、誘導方向に対して斜めに配列され、また粒子（１７）の経路のための出口開口部（３１）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００２２】
（１１）前記（１０）記載の装置であって、前記第２選別電極配列（３０）の後、フォーク（３２）が選別区域（８）のチャネル（２）に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
【００２３】
（１２）前記（９）乃至（１１）のいずれか１項記載の装置であって、前記第１選別電極配列（２９）の上流での粒子経路の選別区域（８）で、粒子（１７）をアライメントするために電極配列（２７、２８）が配列され、この配列は、測定チャネル区域（７）からの測定チャネル（２）より生じる粒子（１７）を、流体流動でのもっとも狭くすることの可能な経路に案内され、また第１選別電極配列（２９）の電極が、粒子（１７）の経路で斜めに配列され、かつ経路の幅にほぼ合致する長さを持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００２４】
（１３）ミクロ流体装置により流体流動における粒子を選別するための一つの方法であって、それが、
Ａ．誘電泳動により粒子を分離し、次いで粒子を流体流動の物理的中心に位置決めし、
Ｂ．測定チャネル区域（７）に２以上の電場（２４、２５）を生成することによるインピーダンス測定により、測定チャネル区域（７）の調整区域（６）と選別区域（８）の断面より狭い断面の流体流動に導かれた分離粒子を特徴付け、そして、前記電場を比較することにより、前記粒子の大きさと電気的特性についての情報が決定され、
Ｃ．第１粒子経路（３３）から粒子を有効に選別して誘電泳動によりステップＢで定義 される特徴を基礎にして測定チャネル区域（７）で記録された粒子を選別し、選別された粒子を、第１粒子経路（３３）にほぼ平行して走る第２粒子経路（３４）に向けて特異的に誘導し、
Ｄ．粒子経路（３３、３４）を分割し、
Ｅ．必要とあれは、ステップＣとＤを繰返す、
ことより成ることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２５】
（１４）前記（１３）記載の方法であって、１ｋＨｚ乃至２００ＭＨｚの周波数を持つ１個または異なる電圧が電場を生成するために使用されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２６】
（１５）前記（１３）記載の方法であって、最高最低電圧がせいぜい２ボルトであることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２７】
（１６）前記（１３）乃至（１５）のいずれか１項記載の方法であって、選別前に、粒子の速度が光学的または電気的に測定されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２８】
（１７）前記（１３）乃至（１６）のいずれか１項記載の方法であって、選別前に、粒子が流体流動の粒子経路に集められることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２９】
（１８）前記（１７）記載の方法であって、前記粒子が、第１電場障壁を設定しまたは除去することにより粒子経路（３３）から継続して誘導され、また第１粒子経路（３３）にほぼ平行する粒子経路（３４）に更なる電場障壁（３０）に沿って誘導され、また流体流動が２個の粒子経路（３３、３４）に従って続いて分割されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の基本的な考えは、個別粒子が流体内で誘導される少なくとも１個の伸長チャネルで、以下で基板と呼ばれる担体物質上で前記粒子がまず第２測定チャネル区域での測定を続けるために流体流動での測定区域で調製され、次いで測定チャネル区域を出た後で、粒子は粒子の記録された特徴に基づいて第３区域、すなわち選別区域で分離される。この場合、２個の異なる型以上に分離を行うことはもち論可能である。従って、チャネルは、特異的に粒子に影響を与え、望ましくは誘電泳動により粒子を分離する第１電極装置を持つ調製区域より成る。これに続いて測定チャネル区域があり、これは粒子を特徴付ける第２電極装置を持つ。さらに続いて選別区域があり、これは誘電泳動により測定区域で同定された粒子を選別するための第３電極を持つ。もち論、基板上では、更に加えて導線トラックが存在し、これは電極からあるいは電極へと信号を伝送するために、それぞれの電極に電気的に接続されている。この目的のために、流体装置は、本発明の目的ではないが、適切な測定装置および制御装置と接続されねばならない。
【００３１】
この場合、個々の断面は、測定チャネル区域でのチャネル（測定チャネル）の断面が、調製区域および選別区域での断面よりもかなり小さい形であるように変化している。
【００３２】
誘電泳動との関連で使用される電極配列は、いつも一対の同一の電極より成り、これは原則として横方向で、あるいは上面および底面でチャネル壁に嵌合され、そのため個別電極間の符合する区域において、電場を構築し、それが粒子に望ましい動きをさせる原因となる。従って、これからの明細書中で、電極または電極対は同義語として使用されるであろう。
【００３３】
特徴づけと続く選別をともかく可能にするために、調製区域では粒子を分離する必要があり、ここでは粒子を凝集させてクラスターにすることができ、次いでそれらを制御したやり方で測定チャネル区域に供給することが可能である。これはとりわけ対応する電極配列により行われ、それにより粒子を誘電泳動、およびその結果として粒子に作用する力を利用して分解し、適切な粒子経路にもたらされる。
【００３４】
【実施例】
望ましい実施例において、粒子を分離する電極装置は電極配列を持ち、この電極配列は、流動方向に対して斜めに配列されまたほぼロート状の配列を持つ第１電極と、それに続いて流動方向で経路開口部を有する同じくロート状配列にある離れて平行する第２電極を含む電極配列を持つ。この場合、続く平行第２電極は継続して電位で保持され、そのため流入する粒子は持ち上げられ粒子が個別に通過するように経路開口部を通過することができる。より大きなクラスターは通過することができない。形状の結果として、経路開口部はチャネル内で狭いスリットを構成する。経路開口部の上流に位置するクラスターを分離するために、第１電極にパルスを与え、その結果生じる力により逃れようとしまた加工中である粒子は他の粒子群から離脱する。電極間の距離は、望ましくは粒子径の２乃至４倍である。
【００３５】
これに続いて、粒子は流体流動でアライメントされ、そのため粒子は定められた粒子経路を検知する。更なる望ましい実施例に従って、分離のための第１電極配列は定められた粒子経路に粒子をアライメントする第２電極配列に直接続く。分離電極配列は、望ましくは更にアライメントのための電極配列と結合され、ここで前記の経路開口部を持つ第２平行電極は、経路開口部（ギャップ）の間隔をあけて平行に延伸する電極アームを持つ。従ってこの電極配列は、ギャップ幅のあき空間に配列された２個の上部電極アームと２個の関連する下部電極アームとより成り、それぞれの場合、場が関連上部および下部電極上に構築される。４個の電極アームを配列する結果として、粒子は丁度中心部で平衡状態を見つけ出すように企てる。この場合には、溶液の流速に関連して、平衡状態に到達できるように十分に長い電極アームの長さが必要となる。経路開口部の幅と電極アームのあき空間は、粒子よりもいくらか大きい。
【００３６】
このように調製されたこれらの粒子は、次いで測定チャネル区域に入り、それは流入する粒子よりもほんの僅かばかり大きい断面を持つ。その典型的なチャネルサイズは５乃至１０μｍであることができる。粒子、とりわけ例えば個別細胞の粒子の経路は、電気インピーダンスの変化により記録されまた同定され、これは細胞の場合には、細胞サイズで、細胞膜および細胞質との関係を持つ。電極の測定と配列については、前記ガワード他による文献を参照されたい。
【００３７】
もひとつの望ましい実施例に従って、幅広い測定チャネルが使用され、これは遮断のリスクが減少するという利点を持つ。この幅広の測定チャネルで、個別粒子は誘電泳動によりチャネルの一側面の特異的経路に偏向され、次いで２個の電極間の測定場を通過し、基準場は粒子が全然移動しない区域に配列される。
【００３８】
チャネルの大きさは、測定される典型的な粒子サイズの大きさの桁、または前記の大きさの桁にある。電極は同一チャネル内の少なくとも２個の検出区域を提供するために、各種の方法で側壁に配列することができる。電極はチャネルの一側面に次々に配列することができ、上側だけに、または上と下にあるいは横方向にチャネルを取り囲む。もし電極がチャネルの一側面にのみ次々に配列されるならば、測定期間中に粒子位置に大きく影響する。もし粒子の位置が正確に測定されるべきであるとすれば、分枝上部または下部電極対の間の微分測定により測定を行うことは適切である。これは粒子の垂直アライメントに依存して、上部および下部電極は多少とも影響を受けるという効果を持つ。同じように、これは側壁でも実行することができる。
【００３９】
個別粒子が測定チャネル区域を通過した後に、粒子はより大きな断面を持つ選別電極区域に入る。望ましい実施例に従って適切な選別が可能であるためには、粒子を流体流動でもっとも狭い通路に誘導するために、選別電極配列の上流で粒子をアライメントするための電極配列が存在する。これは高速で正確な選別を可能にするが、その理由は対応する電極が小さな電極長を持つことができ、従って粒子経路から誘導される選別粒子の経路が電極に沿って小さく、従って新しい選別をその後比較的速やかに行えるためである。
【００４０】
本発明のとりわけ望ましい実施例に従って、選別区域での電極装置は第１選別電極配列と少なくとも第２選別電極配列を持ち、第１選別電極配列は粒子の経路に配列され、また第２選別電極配列は、第１選別電極配列で選別された粒子を特異的に誘導するために、粒子の経路の側方で配列される。第２選別電極配列は、望ましくは粒子を通過させる出力を持ち、そのため選別された粒子は、第１粒子経路にほぼ平行した第２経路に移動する。これに続き、チャネルにフォークが配列され、これは粒子経路に基づく流体流動を分割する。従って基板は、１個の入口と少なくとも２個の出口を持つ。出口は次いで適切な保持コンテナーまたは類似のものに送られる。
【００４１】
光学的方法による観察と検出を可能にするために、基板を透明にすることも適切である。
【００４２】
従って本発明に基づく基板は、できる限り小さな空間で通過する大量の粒子から秒当り１００個またはそれ以上の桁で個別粒子を決定することを可能にする。本発明は、粒子の位置決め、インピーダンスの測定、測定チャネルに流入する粒子の速度と位置、および選別区域での流動切換配列を可能にし、この流動切換え配列は、測定区域での前もって定義された基準に従って、２個またはそれ以上のサブチャネルへの誘導を容易にする。このようなマイクロ工学的に産出された装置は、細胞を計数し、それを識別し、その型、サイズ、細胞膜特性、特異的な膜受容体の存在およびまたは活性に従ってそれらを選別するために使用することができる。
【００４３】
流体流動内で粒子をミクロ流体装置により選別する方法に従って、下記のステップが実施される。
【００４４】
Ａ．誘電泳動により粒子を分離し、続いて粒子を流体流動の物理的中心に配置し、
Ｂ．インピーダンス測定により測定チャネル区域での小幅の流体流動での分離粒子を特徴付け、
Ｃ．粒子経路から粒子を活発に選別し誘電泳動によりＢで定義された特性を基礎にして測定チャネル区域で記録された粒子を選別し、また選別された粒子を、第１粒子経路とほぼ平行に走る第２粒子経路に特異的に誘導し、
Ｄ．粒子経路に対応する流体流動を分割し、また
Ｅ．もし必要とあればステップＣとＤを繰返す
更に再分割および選別が行われるべきであるような場合には、ステップＣとＤが適切な回数繰返される。
【００４５】
電場を生成するためには、望ましくは１ｋＨｚ乃至２００ＭＨｚの周波数で、適切にはせいぜい２Ｖの最高最低電圧での１個または異なる電圧が使用される。
【００４６】
選別の前には、粒子の速度は光学的にまたは電気的に有利に測定される。
【００４７】
原則としては、装置上に配列および組込まれた装置により、または場産出のための外部装置でこの方法を実行することは可能である。
【００４８】
本発明を更に詳細に説明するために、本発明は例となる実施例を添付する図面と併用して以下で詳細に説明されるであろう。
【００４９】
図１の略図は、ミクロ流体装置１の平面図を示し、ここで伸長チャネル２が示され、これは左側面に入口開口部３を、また右側面に出口開口部４および５を持っている。もち論対応する装置１は、必要とあれば複数の出口開口部または入口開口部を持つこともできる。入口開口部は、液体または多分気体でもよい流体を供給するための適切な装置と接続されている。従って出口開口部４および５は、同じように選別された粒子に適合する適切な装置と接続されている。以下の説明書では、例となる実施例と関連して、液体が流体であると仮定され、それは各種の型の粒子、例えば生物細胞を輸送する。
【００５０】
チャネル２は調製区域６、測定チャネル区域７、および選別区域８に分かれる。個別区域の断面は異なっており、とりわけ測定チャネル区域７は他の二つの区域６および８よりもかなり狭い。個別区域６乃至８では電極配列９乃至１１が略図で示され、これは関連する導線トラック１２を経由して、図示されてはいないが外部の制御および測定装置に接続することができる。電極配列を具えた個別区域は、図と関連して以下の明細書で更に詳細に説明される。
【００５１】
このような装置の産出は例えば以下のようにして行われる。すなわち、例えば、ガラス基板上でまず第一に、電極の位置を決定するために、リフトオフレジスト（耐食膜）が写真平板で適用される。例えばチタンなどの接着層の適用に続き、電極材料として例えばプラチナなどの貴金属および電極の接続のために例えば銅などの導線材料が蒸着される。リフトオフレジストの除去に続き、ポリイミドがチャネル壁をして写真平板で適用される。基板は次いで同質の基板と一緒にされ、封入されたチャネルと電極を持つサンドイッチ構造を形成される。この場合ポリイミド層は１乃至２０μｍである。
【００５２】
異なる材料、例えばプラスチックを基板材料として使用し、またレプリカ作成法を使用することも可能である。
【００５３】
図２は、粒子を分離する各種の方法を示す。図２ａは、第１分離電極１３と第２分離電極１４′および１４″を持つ電極配列の平面図を示す。２個の分離電極は、側壁１５，１６に対して斜めに配列され、その結果ロート様形状を持ち、それはこのチャネル区域に移動する粒子１７または粒子クラスター１８が場の力を基礎にして移動する作用を有する。
【００５４】
続く図面の各平面図では、一般に上部電極のみが示される。前にも述べた通り、誘電泳動を基礎にして粒子に影響を与えるために、対応する下部電極があることは明らかであり、これは上部電極と相互作用し、従って対応する電場を構築し、これが粒子に影響を与える作用を有する。
【００５５】
分離電極１３は、先端に向けて先細になる斜めの電極部分を持つように構築される。電極１４′，１４″は、第１分離電極１３にほぼ平行して側壁１５，１６に対して斜めに配列される。分離電極１３と異なり、それらは末端でお互いに接触することなく、粒子１７の通路として開口部１９を残す。開口部１９は平均粒子径とほぼ一致するかもしくは少しばかり大きい。分離電極１４′，１４″は永続的に接続され、従って障壁を構成し、粒子クラスター１８を保持する。電極１３はパルスされ、そのためクラスターを砕く。これは図２ｂに基づく側面図で例として示される。粒子１７が粒子クラスター１８から分離されるとすぐに、それらは開口部１９を通過できる。
【００５６】
図２ｃは相互に配列された複数の分離電極１３と１４の異なる構成を持つも一つの変形を示す。すべての実施例で、分離電極１３と分離電極１４との間の距離は、それが粒子径よりは大きく、しかし予期された粒子クラスターサイズよりは小さいものであるように選択される。
【００５７】
チャネル２での望ましい位置で経路の粒子１７の次のアライメントに対して、図３ａに基づく電極配列を使用することができる。この図は、ロート状に位置する電極２０と２１の平面図を示し、そのそれぞれが側壁１５と１６に対して斜めに走る電極アーム２２と平行の電極アーム２３とを持つ。これらすべての電極はスイッチが入れられ、位置決め電極アーム２２は、チャネル内で移動する粒子１７が中心に向けて横方向に移動する作用を持つ。位置決め電極アーム２３は、図３ｂで示されるように、粒子の垂直方向位置決めに作用する。前に述べたように、その反対側にチャネルの下部に対応する電極がある平行位置決め電極アーム２３の長さは十分に長く、平衡状態を見出するように垂直方向の力が粒子に作用できるようにし、そのため粒子１７の出口経路の高さが一定であり、またこの場合チャネルの中心に集まる、ということはここで重要である。下部電極の結果として、全体として４個の電極があり、粒子１７に対する力が対称電極設計の場合に高くなるために、前記電極は中心部に集中する傾向がある。電極の間隔あけは、従って粒子が両方の電場（電極アーム２２からの場と電極アーム２３からの場）に影響を受けるように選択されねばならない。位置決め電極アーム２２と２３の間のあき間隔は、粒子径よりも僅かばかり大きい。
【００５８】
図４は、図３ａと図２ａに基づく電極の組合せからの電極配列を示し、本例の実施例でのパルスされた分離電極１３は、先端部に向けて先細になるように構成される。斜めの電極部品のあき間隔は、粒子径の２乃至４倍である。
【００５９】
図５は、適切な電極配列１０を持つ測定チャネル区域７でのチャネル２の例による実施例を示す。この実施例での電極配列１０は、既知の方法で、２個の間隔をあけた電極対２４と２５より成り、この電極対２４，２５はそれらの間に電場を構成するのに使用される。液体と粒子は、測定チャネル区域７のチャネル２を通じて流動する。多くの場合、液体は、粒子とは異なるインピーダンスの電解質を含む。電極対２４と２５は、ここで図示されてはいないが一つの電気システムに接続され、それは個別電極を交差する電圧を測定しました測量電極対２４，２５で形成される区域に通じる電流を測定する。粒子が第１測定電極対２４を通過する毎に、前記の電気パラメーターは変化する。測定電極対２５の区域は変化せず、基準として役立つ。その行動は、粒子１７が第２電極対２５を通過する時に、適切に逆転される。
【００６０】
電気パラメーターの変化は、複数の交流周波数と同時に測定され、それはパラメーターのよりよい分化とより正確な測定を可能にする。測定されたパラメーターは、以下の選別を実行するためにここで図示されてはいないが、一つの制御および測定装置により使用される。
【００６１】
図５ｂは、測定チャネル区域７のより広いチャネル２と、測定電極対２４に誘導する特異的な粒子経路に流入粒子を偏向させる一対の偏向電極とを持つ異なる構成を示す。測定電極対２５は、粒子１７が存在しないチャネルの区域に配列される。従って測定電極対２５は、絶えず基準として役に立つ。この構成は、遮断のリスクがより大きなチャネル幅により減少するという利点を持つ。しかし拡張されたチャネル幅にも拘らず、測定は電極の対応する小さな構成のものにより実行することができる。従って電場は、粒子サイズに関連して集中され、すなわち場の大きな粒子の影響は、より小さい粒子の影響よりも大きくなる。従って粒子が場で可能な限りもっとも大きな区域にわたる場合には、測定はより正確なものとなる。関連する測定電子工学技術は、（この点について）何のも示しておらず、またここで説明されたものを更に説明してはいない（この点に関しては、Ｓ．ガワードによる前記の論文を参照されたい）。
【００６２】
図６は、選別区域８における各種の電極配列１１を示す。この電極配列は、粒子の敏速な選別を可能にする。図６ａは、２個のアライメント電極２７，２８を示し、これは例としての実施例で測定チャネルから流入する粒子１７を、チャネル２の１個の側壁１５近くにある区域にもたらす。両アライメント電極はスイッチを入れられる。電極２９は、実際の選別電極であり、それはアライメント電極２７と２８により前もって決定された経路に留まるべきかどうかに依存してスイッチを切られ、または粒子１７が偏向されるべきならば、それはスイッチを入れられる。偏向電極３０は偏向粒子を遠くに運び開口部３１により粒子を出現させることを可能にし、そのため図１に基づく２個の出口部４および５の方向で、粒子の分割が次のフォーク３２により可能となる。図６ｂは、アライメント電極２７と２８のも一つの代替配列を示し、電極２７は続く選別電極２９よりも短く設計されており、またそれは粒子１７を側壁１５から遠くにまで運ぶのに役立つ。偏向電極３０は、産出結果に影響を与えることなく、ここで一つの例としてここで異なる幾何学的配列を示している。図６ａと６ｂでは、偏向電極の場合に、両電極、すなわち上部および下部電極は平行に図示されており、これは下部および上部偏向電極が平行で示される区域においてのみ、粒子１７の望ましい誘導が生じるという事実を示すためである。残る区域では、通路の開口部３１が産出される。
【００６３】
図６ｃは、偏向電極対３０の更なる可能な構成を示す。
【００６４】
選別操作は、図６ｄを用いることにより、より詳細に説明されるであろう。これは粒子１７の２個の可能な経路を示している。前にも述べたように、アライメント電極２７，２８と偏向電極３０は絶えずスイッチが入れられている。選別電極対２９は、粒子１９が選別される時にスイッチを入れて始動される。これは、粒子が固有に提供される粒子経路３３から偏向され、流体流動により粒子経路３４に沿って移動する効果を持つ。偏向電極３０は、同じ部分で重なり合うことはなく、そのため結果として、これらは粒子のための開口部３１を形成し、これは次いで粒子経路３３にほぼ平行な経路に進むことができる。敏速な選別を達成するために、選別電極２９の長さができるだけ短く、しかしそれにスイッチが入れられた時に、粒子１７が電極３０に向かう経路を続け、次の粒子のため選別電極対２９のスイッチを切る行為をできるだけ早く実施できるようにする時には、その電極２９の長さは十分に長くなければならない、ということが重要である。偏向電極３０は、選別電極２９で選別されない粒子が、偏向電極３０によりあまりにも大きく影響されないでこれらの経路を継続できるように配列される。
【００６５】
誘電泳動により制御されるプロセスに関して、１０ボルトの領域での電圧と１００ｋＨｚ乃至１０ＭＨｚの周波数が液体と粒子に依存して使用される。測定チャネルでの測定に関しては電圧は２ボルト以下であり、周波数は１０ｋＨｚ乃至２００ＭＫｚである。
【００６６】
【発明の効果】
以上記載したミクロ流体装置を利用することにより、結合された敏速で費用効率の高いオンチップ検出および続く分割が容易に可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ミクロ流体装置について個別区域のチャネルを概略表示する平面図。
【図２】 分離粒子の配列の各種実施例を示す図。第１配列の平面図（図２ａ）、チャネルの中心部の対応する断面図（図２ｂ）、および分離のためのも一つの電極配列の平面図（図２ｃ）。
【図３】 流体流動で粒子の位置付けのための電極配列を示す図。平面図（図３ａ）および横方向断面図（図３ｂ）。
【図４】 平面図で図２ａおよび図３ａに基づく電極配列の組合せを示す図。
【図５】 測定チャネル区域のための２個の異なる電極配列を示す図。細幅測定チャネル（図５ａ）および広幅チャネル（図５ｂ）。
【図６】 アライメントと選別区域での選別のための２個の各種の異なる電極配列を示す図。第１幾何学的配列を持つもの（図６ａ）、第２幾何学的配列を持つもの（図６ｂ）、選別された粒子を遠く離れて運ぶ電極のみの第３幾何学的配列（図６ｃ）、粒子の経路を持ち拡大された現場での図６ａに基づく配列（図６ｄ）。
１ ミクロ流体装置
２ チャネル
３ 入口開口部
４ 出口開口部
５ 出口開口部
６ 調製区域
７ 測定チャネル区域
８ 選別区域
９ 電極配列
１０ 電極配列
１１ 電極配列
１２ 導線トラック
１３ 電極、分離電極
１４′電極、分離電極
１４″電極、分離電極
１５ 側壁
１６ 側壁
１７ 粒子
１８ 粒子クラスター
１９ 通路開口部
２０ 電極
２１ 電極
２２ 第１電極アーム
２３ 第２電極アーム
２４ 探知区域、測定電極対
２５ 探知区域、測定電極対
２６ 第１電極配列、偏向電極
２７ 電極配列、アライメント電極
２８ 電極配列、アライメント電極
２９ 第１選別電極配列
３０ 第２選別電極配列、偏向電極
３１ 開口部
３２ フォーク
３３ 経路、第１粒子経路
３４ 経路、第２粒子経路
【発明の属する技術分野】
本発明は、流体流動、とりわけ液体流動内で粒子を選別するために、個別粒子を誘導するチャネルを持つ基板より成るミクロ流体装置に関し、また更に粒子を選別する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
浮遊粒子の操作は、一般に公知である（例えば、非特許文献１参照。）。ここで浮遊粒子は、いずれの望ましい粒子であってもよく、さもなければ生物細胞であってもよい。従って以下の本文では、一般にただ粒子という語が使用される。ミクロシステムは、それを通じて粒子を持つ懸濁液が流れるように操作されるとりわけチャネル構造を形成する。チャネル構造においては、超小型電極がチャネル壁にはめあわされ、それに適用される高周波電場を持つ。２個の電極間の高周波電場の作用の下で、分極力が負または正の誘電泳動を基礎にして懸濁粒子内で産生され、前記力は電極による斥力または引力を可能にし、また懸濁液内で流動力の交互作用において、チャネル内での粒子の操作を可能にする（例えば、特許文献１参照。）。
【０００３】
インピーダンス分光学によるマイクロチャネルでの細胞を分析することが公知である（例えば、非特許文献２、非特許文献３参照。）。この場合、用途はチャネルに包埋された電極から作られ、そのため少なくとも２個の場区域が産生され、そこでインピーダンスの測定が行われる。次いで評価が差分測定により、例えば測定ブリッジにより実行される。更なる詳細については、測定原理と先行技術に関連し、これらの刊行物と、そこで与えられた説明が参考にされる。
【０００４】
このような分析の結果は、次いで細胞選別を実行するのに使用することができる。ここで同様に、誘電泳動に基づいて細胞選別を行うことは公知である。例えば、誘電泳動により、石油から硫黄を分離することは公知である（例えば、特許文献２参照。）。
【０００５】
また、混合物から生細胞を連続選別する方法と装置を開示し、ここで１個またはそれ以上の電極を通過する細胞は、そのサイズ、物理的構造、化学的組成物および電気特性に従って選別され、この電極はそこで無線周波発生機と接続される（例えば、特許文献３参照。）。
【０００６】
前記の方法において、粒子に対する異なった電気泳動特性は、これらを流体流動から導き出すのに使用される。これは、粒子が誘導されるか、されないかに関する特異的な決定がなし得ないために、受動選別である。
【０００７】
粒子、とりわけ生物細胞を特徴付け、選別し、計数する従来公知の装置（例えば、血球計算器）は、非常に複雑な装置により際立っており、その装置は一般に、ＦＡＣＳ（蛍光表示式細胞分取器）に基づく光学分析装置または光学および電気測定装置を組合せたものより成る。純粋な電気検出および選別は行われない。従ってこれらの装置の場合には、光学分析のための粒子の追加の調製が必要とされる。これはこのような装置による分析を複雑なものとし、また時間を余計にかけることにつながる。
【０００８】
【特許文献１】
国際公開第００ ００ ２９３号パンフレット
【特許文献２】
米国特許第４，３２６，９３４号明細書
【特許文献３】
米国特許第５，４８９，５０６号明細書
【非特許文献１】
Ｇ．フュール他著，「ナトゥールヴィッセンシャフテン」８１巻，１９９４年 ５２８ページ以下
【非特許文献２】
Ｓ．ガワード他著，「医学および生物学におけるマイクロ工学に関する第１回年次国際ＩＥＥＥ−ＥＭＢＳ 特殊論題会議，２０００年１０月１２−１４日，フランス，リヨン」，１−５ページ
【非特許文献３】
Ｓ．ガワード他著，「チップに関するラボ」，２００１年１月，７６乃至８２ページ
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従って本発明は、ミクロ工学またはナノ工学での基板上でできる限り速やかにかつ正確に同定および計数ならびに選別を可能にする電気的フローサイトメーター（流動細胞高度測定器）を提案する目的に基礎を置く。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、この目的は、請求項１に記載される基板を含むミクロ流体装置、および請求項１３記載の方法により達成される。装置の更なる有利で精緻な改良は、従属請求項に記載されたものより得ることができる。
【００１１】
すなわち、前記の目的を達成するために、ミクロ流体装置と流体を選別する方法を、以下の（１）〜（１８）のとおりに構成する。
【００１２】
（１）一つの基板より成るミクロ流体装置であって、流体に個別粒子（１７）を通す少なくとも１個のチャネル（２）と、粒子（１７）に誘電泳動により影響し、かつそれを分離するための調製区域（６）と、粒子（１７）を特徴付ける電極装置を持ち、その電極装置はそれぞれの区域でインピーダンスを測定するための基準探知区域と測定探知区域の少なくとも２個の探知区域を持つ測定チャネル区域（７）と、誘電泳動により測定チャネル区域（７）で同定される粒子（１７）を選別する電極装置を持つ選別区域（８）と、を有し、測定チャネル区域（７）における探知区域の断面が、調整区域（６）および選別区域（８）の断面よりも小さく、電極への信号と電極からの信号を伝送するために、個別区域（６−８）において、電極（１３、１４′、１４″、２０−３０）に電気的に接続される導線トラックを持つ基板より成ることを特徴とするミクロ流体装置。
【００１３】
（２）前記（１）記載の装置であって、前記粒子（１７）が、電極装置により調製区域（６）において誘電泳動により影響を受け、第１電極は、まず粒子（１７）を分離し次いで流体流動での特異的な位置に粒子を留める電極配列（９）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１４】
（３）前記（２）記載の装置であって、前記粒子（１７）を分離する電極配列（９）が、流動方向に対して斜めに配列され、また、ほぼロート状の配列を持ち、また流動方向でこれらに続いて通路開口部（１９）のあるロート状配列で間隙をあけて平行に配置された第２電極（１４′、１４″）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１５】
（４）前記（２）記載の装置であって、前記位置決めのための電極配列（９）が、粒子（１７）を流体流動物理的中心に留める電極（２０、２１）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１６】
（５）前記（４）記載の装置であって、電極配列（９）が、流動方向に対して斜めに配列され、側壁（１５、１６）からチャネル（２）に突出し中央通路開口部（１９）を形成する電極アーム（２２）と共にロート形状に配列される電極（２０、２１）を持ち、また直接それに隣接して通路開口部（１９）から離れて、平行に走る電極アーム（２２、２３ ）を持ち、第１電極アーム（２２）は粒子（１７）を流体流動の中心の平面に整列するのに役立ち、また第２電極アームは粒子（１７）を流体流動の中心線に沿って整列させるのに役立つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１７】
（６）前記（５）記載の装置であって、前記第２電極アーム（２３）が平衡状態にある電極間の空間内で粒子（１７）に作用する力を与えるのに十分な長さを持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００１８】
（７）前記（１）乃至（６）のいずれか１項記載の装置であって、前記電極（１３、１４′、１４″）の間の距離が粒子径の２乃至４倍であることを特徴とするミクロ流体装置。
【００１９】
（８）前記（１）乃至（７）のいずれか１項記載の装置であって、ここで測定チャネル区域（７）内でのチャネル（２）の電極装置が、測定チャネル内での特異的経路に粒子（１７）を案内する第１電極配列（２６）と、それぞれの区域でインピーダンスを測定するために２個の探知区域（２４、２５）を産生する第２電極配列とを持ち、一つの探知区域２４は測定される粒子（１７）の経路に配列され、また他の探知区域（２５）は基準インピーダンスを提供するために経路の外側に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
【００２０】
（９）前記（１）乃至（８）のいずれか１項記載の装置であって、ここで選別区域（８）にある電極装置が、第１選別電極配列（２９）および少なくとも第２選別電極配列（３０）を持ち、第１選別電極配列（２９）は粒子（１７）の経路（３３）に配列され、また第２選別電極配列（３０）は第１選別電極配列（２９）により選別された粒子（１７）を特異的に前方向に誘導するために、粒子の経路の側面に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
【００２１】
（１０）前記（９）記載の装置であって、前記第２選別電極配列（３０）が、誘導方向に対して斜めに配列され、また粒子（１７）の経路のための出口開口部（３１）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００２２】
（１１）前記（１０）記載の装置であって、前記第２選別電極配列（３０）の後、フォーク（３２）が選別区域（８）のチャネル（２）に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
【００２３】
（１２）前記（９）乃至（１１）のいずれか１項記載の装置であって、前記第１選別電極配列（２９）の上流での粒子経路の選別区域（８）で、粒子（１７）をアライメントするために電極配列（２７、２８）が配列され、この配列は、測定チャネル区域（７）からの測定チャネル（２）より生じる粒子（１７）を、流体流動でのもっとも狭くすることの可能な経路に案内され、また第１選別電極配列（２９）の電極が、粒子（１７）の経路で斜めに配列され、かつ経路の幅にほぼ合致する長さを持つことを特徴とするミクロ流体装置。
【００２４】
（１３）ミクロ流体装置により流体流動における粒子を選別するための一つの方法であって、それが、
Ａ．誘電泳動により粒子を分離し、次いで粒子を流体流動の物理的中心に位置決めし、
Ｂ．測定チャネル区域（７）に２以上の電場（２４、２５）を生成することによるインピーダンス測定により、測定チャネル区域（７）の調整区域（６）と選別区域（８）の断面より狭い断面の流体流動に導かれた分離粒子を特徴付け、そして、前記電場を比較することにより、前記粒子の大きさと電気的特性についての情報が決定され、
Ｃ．第１粒子経路（３３）から粒子を有効に選別して誘電泳動によりステップＢで定義 される特徴を基礎にして測定チャネル区域（７）で記録された粒子を選別し、選別された粒子を、第１粒子経路（３３）にほぼ平行して走る第２粒子経路（３４）に向けて特異的に誘導し、
Ｄ．粒子経路（３３、３４）を分割し、
Ｅ．必要とあれは、ステップＣとＤを繰返す、
ことより成ることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２５】
（１４）前記（１３）記載の方法であって、１ｋＨｚ乃至２００ＭＨｚの周波数を持つ１個または異なる電圧が電場を生成するために使用されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２６】
（１５）前記（１３）記載の方法であって、最高最低電圧がせいぜい２ボルトであることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２７】
（１６）前記（１３）乃至（１５）のいずれか１項記載の方法であって、選別前に、粒子の速度が光学的または電気的に測定されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２８】
（１７）前記（１３）乃至（１６）のいずれか１項記載の方法であって、選別前に、粒子が流体流動の粒子経路に集められることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００２９】
（１８）前記（１７）記載の方法であって、前記粒子が、第１電場障壁を設定しまたは除去することにより粒子経路（３３）から継続して誘導され、また第１粒子経路（３３）にほぼ平行する粒子経路（３４）に更なる電場障壁（３０）に沿って誘導され、また流体流動が２個の粒子経路（３３、３４）に従って続いて分割されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
【００３０】
【発明の実施の形態】
本発明の基本的な考えは、個別粒子が流体内で誘導される少なくとも１個の伸長チャネルで、以下で基板と呼ばれる担体物質上で前記粒子がまず第２測定チャネル区域での測定を続けるために流体流動での測定区域で調製され、次いで測定チャネル区域を出た後で、粒子は粒子の記録された特徴に基づいて第３区域、すなわち選別区域で分離される。この場合、２個の異なる型以上に分離を行うことはもち論可能である。従って、チャネルは、特異的に粒子に影響を与え、望ましくは誘電泳動により粒子を分離する第１電極装置を持つ調製区域より成る。これに続いて測定チャネル区域があり、これは粒子を特徴付ける第２電極装置を持つ。さらに続いて選別区域があり、これは誘電泳動により測定区域で同定された粒子を選別するための第３電極を持つ。もち論、基板上では、更に加えて導線トラックが存在し、これは電極からあるいは電極へと信号を伝送するために、それぞれの電極に電気的に接続されている。この目的のために、流体装置は、本発明の目的ではないが、適切な測定装置および制御装置と接続されねばならない。
【００３１】
この場合、個々の断面は、測定チャネル区域でのチャネル（測定チャネル）の断面が、調製区域および選別区域での断面よりもかなり小さい形であるように変化している。
【００３２】
誘電泳動との関連で使用される電極配列は、いつも一対の同一の電極より成り、これは原則として横方向で、あるいは上面および底面でチャネル壁に嵌合され、そのため個別電極間の符合する区域において、電場を構築し、それが粒子に望ましい動きをさせる原因となる。従って、これからの明細書中で、電極または電極対は同義語として使用されるであろう。
【００３３】
特徴づけと続く選別をともかく可能にするために、調製区域では粒子を分離する必要があり、ここでは粒子を凝集させてクラスターにすることができ、次いでそれらを制御したやり方で測定チャネル区域に供給することが可能である。これはとりわけ対応する電極配列により行われ、それにより粒子を誘電泳動、およびその結果として粒子に作用する力を利用して分解し、適切な粒子経路にもたらされる。
【００３４】
【実施例】
望ましい実施例において、粒子を分離する電極装置は電極配列を持ち、この電極配列は、流動方向に対して斜めに配列されまたほぼロート状の配列を持つ第１電極と、それに続いて流動方向で経路開口部を有する同じくロート状配列にある離れて平行する第２電極を含む電極配列を持つ。この場合、続く平行第２電極は継続して電位で保持され、そのため流入する粒子は持ち上げられ粒子が個別に通過するように経路開口部を通過することができる。より大きなクラスターは通過することができない。形状の結果として、経路開口部はチャネル内で狭いスリットを構成する。経路開口部の上流に位置するクラスターを分離するために、第１電極にパルスを与え、その結果生じる力により逃れようとしまた加工中である粒子は他の粒子群から離脱する。電極間の距離は、望ましくは粒子径の２乃至４倍である。
【００３５】
これに続いて、粒子は流体流動でアライメントされ、そのため粒子は定められた粒子経路を検知する。更なる望ましい実施例に従って、分離のための第１電極配列は定められた粒子経路に粒子をアライメントする第２電極配列に直接続く。分離電極配列は、望ましくは更にアライメントのための電極配列と結合され、ここで前記の経路開口部を持つ第２平行電極は、経路開口部（ギャップ）の間隔をあけて平行に延伸する電極アームを持つ。従ってこの電極配列は、ギャップ幅のあき空間に配列された２個の上部電極アームと２個の関連する下部電極アームとより成り、それぞれの場合、場が関連上部および下部電極上に構築される。４個の電極アームを配列する結果として、粒子は丁度中心部で平衡状態を見つけ出すように企てる。この場合には、溶液の流速に関連して、平衡状態に到達できるように十分に長い電極アームの長さが必要となる。経路開口部の幅と電極アームのあき空間は、粒子よりもいくらか大きい。
【００３６】
このように調製されたこれらの粒子は、次いで測定チャネル区域に入り、それは流入する粒子よりもほんの僅かばかり大きい断面を持つ。その典型的なチャネルサイズは５乃至１０μｍであることができる。粒子、とりわけ例えば個別細胞の粒子の経路は、電気インピーダンスの変化により記録されまた同定され、これは細胞の場合には、細胞サイズで、細胞膜および細胞質との関係を持つ。電極の測定と配列については、前記ガワード他による文献を参照されたい。
【００３７】
もひとつの望ましい実施例に従って、幅広い測定チャネルが使用され、これは遮断のリスクが減少するという利点を持つ。この幅広の測定チャネルで、個別粒子は誘電泳動によりチャネルの一側面の特異的経路に偏向され、次いで２個の電極間の測定場を通過し、基準場は粒子が全然移動しない区域に配列される。
【００３８】
チャネルの大きさは、測定される典型的な粒子サイズの大きさの桁、または前記の大きさの桁にある。電極は同一チャネル内の少なくとも２個の検出区域を提供するために、各種の方法で側壁に配列することができる。電極はチャネルの一側面に次々に配列することができ、上側だけに、または上と下にあるいは横方向にチャネルを取り囲む。もし電極がチャネルの一側面にのみ次々に配列されるならば、測定期間中に粒子位置に大きく影響する。もし粒子の位置が正確に測定されるべきであるとすれば、分枝上部または下部電極対の間の微分測定により測定を行うことは適切である。これは粒子の垂直アライメントに依存して、上部および下部電極は多少とも影響を受けるという効果を持つ。同じように、これは側壁でも実行することができる。
【００３９】
個別粒子が測定チャネル区域を通過した後に、粒子はより大きな断面を持つ選別電極区域に入る。望ましい実施例に従って適切な選別が可能であるためには、粒子を流体流動でもっとも狭い通路に誘導するために、選別電極配列の上流で粒子をアライメントするための電極配列が存在する。これは高速で正確な選別を可能にするが、その理由は対応する電極が小さな電極長を持つことができ、従って粒子経路から誘導される選別粒子の経路が電極に沿って小さく、従って新しい選別をその後比較的速やかに行えるためである。
【００４０】
本発明のとりわけ望ましい実施例に従って、選別区域での電極装置は第１選別電極配列と少なくとも第２選別電極配列を持ち、第１選別電極配列は粒子の経路に配列され、また第２選別電極配列は、第１選別電極配列で選別された粒子を特異的に誘導するために、粒子の経路の側方で配列される。第２選別電極配列は、望ましくは粒子を通過させる出力を持ち、そのため選別された粒子は、第１粒子経路にほぼ平行した第２経路に移動する。これに続き、チャネルにフォークが配列され、これは粒子経路に基づく流体流動を分割する。従って基板は、１個の入口と少なくとも２個の出口を持つ。出口は次いで適切な保持コンテナーまたは類似のものに送られる。
【００４１】
光学的方法による観察と検出を可能にするために、基板を透明にすることも適切である。
【００４２】
従って本発明に基づく基板は、できる限り小さな空間で通過する大量の粒子から秒当り１００個またはそれ以上の桁で個別粒子を決定することを可能にする。本発明は、粒子の位置決め、インピーダンスの測定、測定チャネルに流入する粒子の速度と位置、および選別区域での流動切換配列を可能にし、この流動切換え配列は、測定区域での前もって定義された基準に従って、２個またはそれ以上のサブチャネルへの誘導を容易にする。このようなマイクロ工学的に産出された装置は、細胞を計数し、それを識別し、その型、サイズ、細胞膜特性、特異的な膜受容体の存在およびまたは活性に従ってそれらを選別するために使用することができる。
【００４３】
流体流動内で粒子をミクロ流体装置により選別する方法に従って、下記のステップが実施される。
【００４４】
Ａ．誘電泳動により粒子を分離し、続いて粒子を流体流動の物理的中心に配置し、
Ｂ．インピーダンス測定により測定チャネル区域での小幅の流体流動での分離粒子を特徴付け、
Ｃ．粒子経路から粒子を活発に選別し誘電泳動によりＢで定義された特性を基礎にして測定チャネル区域で記録された粒子を選別し、また選別された粒子を、第１粒子経路とほぼ平行に走る第２粒子経路に特異的に誘導し、
Ｄ．粒子経路に対応する流体流動を分割し、また
Ｅ．もし必要とあればステップＣとＤを繰返す
更に再分割および選別が行われるべきであるような場合には、ステップＣとＤが適切な回数繰返される。
【００４５】
電場を生成するためには、望ましくは１ｋＨｚ乃至２００ＭＨｚの周波数で、適切にはせいぜい２Ｖの最高最低電圧での１個または異なる電圧が使用される。
【００４６】
選別の前には、粒子の速度は光学的にまたは電気的に有利に測定される。
【００４７】
原則としては、装置上に配列および組込まれた装置により、または場産出のための外部装置でこの方法を実行することは可能である。
【００４８】
本発明を更に詳細に説明するために、本発明は例となる実施例を添付する図面と併用して以下で詳細に説明されるであろう。
【００４９】
図１の略図は、ミクロ流体装置１の平面図を示し、ここで伸長チャネル２が示され、これは左側面に入口開口部３を、また右側面に出口開口部４および５を持っている。もち論対応する装置１は、必要とあれば複数の出口開口部または入口開口部を持つこともできる。入口開口部は、液体または多分気体でもよい流体を供給するための適切な装置と接続されている。従って出口開口部４および５は、同じように選別された粒子に適合する適切な装置と接続されている。以下の説明書では、例となる実施例と関連して、液体が流体であると仮定され、それは各種の型の粒子、例えば生物細胞を輸送する。
【００５０】
チャネル２は調製区域６、測定チャネル区域７、および選別区域８に分かれる。個別区域の断面は異なっており、とりわけ測定チャネル区域７は他の二つの区域６および８よりもかなり狭い。個別区域６乃至８では電極配列９乃至１１が略図で示され、これは関連する導線トラック１２を経由して、図示されてはいないが外部の制御および測定装置に接続することができる。電極配列を具えた個別区域は、図と関連して以下の明細書で更に詳細に説明される。
【００５１】
このような装置の産出は例えば以下のようにして行われる。すなわち、例えば、ガラス基板上でまず第一に、電極の位置を決定するために、リフトオフレジスト（耐食膜）が写真平板で適用される。例えばチタンなどの接着層の適用に続き、電極材料として例えばプラチナなどの貴金属および電極の接続のために例えば銅などの導線材料が蒸着される。リフトオフレジストの除去に続き、ポリイミドがチャネル壁をして写真平板で適用される。基板は次いで同質の基板と一緒にされ、封入されたチャネルと電極を持つサンドイッチ構造を形成される。この場合ポリイミド層は１乃至２０μｍである。
【００５２】
異なる材料、例えばプラスチックを基板材料として使用し、またレプリカ作成法を使用することも可能である。
【００５３】
図２は、粒子を分離する各種の方法を示す。図２ａは、第１分離電極１３と第２分離電極１４′および１４″を持つ電極配列の平面図を示す。２個の分離電極は、側壁１５，１６に対して斜めに配列され、その結果ロート様形状を持ち、それはこのチャネル区域に移動する粒子１７または粒子クラスター１８が場の力を基礎にして移動する作用を有する。
【００５４】
続く図面の各平面図では、一般に上部電極のみが示される。前にも述べた通り、誘電泳動を基礎にして粒子に影響を与えるために、対応する下部電極があることは明らかであり、これは上部電極と相互作用し、従って対応する電場を構築し、これが粒子に影響を与える作用を有する。
【００５５】
分離電極１３は、先端に向けて先細になる斜めの電極部分を持つように構築される。電極１４′，１４″は、第１分離電極１３にほぼ平行して側壁１５，１６に対して斜めに配列される。分離電極１３と異なり、それらは末端でお互いに接触することなく、粒子１７の通路として開口部１９を残す。開口部１９は平均粒子径とほぼ一致するかもしくは少しばかり大きい。分離電極１４′，１４″は永続的に接続され、従って障壁を構成し、粒子クラスター１８を保持する。電極１３はパルスされ、そのためクラスターを砕く。これは図２ｂに基づく側面図で例として示される。粒子１７が粒子クラスター１８から分離されるとすぐに、それらは開口部１９を通過できる。
【００５６】
図２ｃは相互に配列された複数の分離電極１３と１４の異なる構成を持つも一つの変形を示す。すべての実施例で、分離電極１３と分離電極１４との間の距離は、それが粒子径よりは大きく、しかし予期された粒子クラスターサイズよりは小さいものであるように選択される。
【００５７】
チャネル２での望ましい位置で経路の粒子１７の次のアライメントに対して、図３ａに基づく電極配列を使用することができる。この図は、ロート状に位置する電極２０と２１の平面図を示し、そのそれぞれが側壁１５と１６に対して斜めに走る電極アーム２２と平行の電極アーム２３とを持つ。これらすべての電極はスイッチが入れられ、位置決め電極アーム２２は、チャネル内で移動する粒子１７が中心に向けて横方向に移動する作用を持つ。位置決め電極アーム２３は、図３ｂで示されるように、粒子の垂直方向位置決めに作用する。前に述べたように、その反対側にチャネルの下部に対応する電極がある平行位置決め電極アーム２３の長さは十分に長く、平衡状態を見出するように垂直方向の力が粒子に作用できるようにし、そのため粒子１７の出口経路の高さが一定であり、またこの場合チャネルの中心に集まる、ということはここで重要である。下部電極の結果として、全体として４個の電極があり、粒子１７に対する力が対称電極設計の場合に高くなるために、前記電極は中心部に集中する傾向がある。電極の間隔あけは、従って粒子が両方の電場（電極アーム２２からの場と電極アーム２３からの場）に影響を受けるように選択されねばならない。位置決め電極アーム２２と２３の間のあき間隔は、粒子径よりも僅かばかり大きい。
【００５８】
図４は、図３ａと図２ａに基づく電極の組合せからの電極配列を示し、本例の実施例でのパルスされた分離電極１３は、先端部に向けて先細になるように構成される。斜めの電極部品のあき間隔は、粒子径の２乃至４倍である。
【００５９】
図５は、適切な電極配列１０を持つ測定チャネル区域７でのチャネル２の例による実施例を示す。この実施例での電極配列１０は、既知の方法で、２個の間隔をあけた電極対２４と２５より成り、この電極対２４，２５はそれらの間に電場を構成するのに使用される。液体と粒子は、測定チャネル区域７のチャネル２を通じて流動する。多くの場合、液体は、粒子とは異なるインピーダンスの電解質を含む。電極対２４と２５は、ここで図示されてはいないが一つの電気システムに接続され、それは個別電極を交差する電圧を測定しました測量電極対２４，２５で形成される区域に通じる電流を測定する。粒子が第１測定電極対２４を通過する毎に、前記の電気パラメーターは変化する。測定電極対２５の区域は変化せず、基準として役立つ。その行動は、粒子１７が第２電極対２５を通過する時に、適切に逆転される。
【００６０】
電気パラメーターの変化は、複数の交流周波数と同時に測定され、それはパラメーターのよりよい分化とより正確な測定を可能にする。測定されたパラメーターは、以下の選別を実行するためにここで図示されてはいないが、一つの制御および測定装置により使用される。
【００６１】
図５ｂは、測定チャネル区域７のより広いチャネル２と、測定電極対２４に誘導する特異的な粒子経路に流入粒子を偏向させる一対の偏向電極とを持つ異なる構成を示す。測定電極対２５は、粒子１７が存在しないチャネルの区域に配列される。従って測定電極対２５は、絶えず基準として役に立つ。この構成は、遮断のリスクがより大きなチャネル幅により減少するという利点を持つ。しかし拡張されたチャネル幅にも拘らず、測定は電極の対応する小さな構成のものにより実行することができる。従って電場は、粒子サイズに関連して集中され、すなわち場の大きな粒子の影響は、より小さい粒子の影響よりも大きくなる。従って粒子が場で可能な限りもっとも大きな区域にわたる場合には、測定はより正確なものとなる。関連する測定電子工学技術は、（この点について）何のも示しておらず、またここで説明されたものを更に説明してはいない（この点に関しては、Ｓ．ガワードによる前記の論文を参照されたい）。
【００６２】
図６は、選別区域８における各種の電極配列１１を示す。この電極配列は、粒子の敏速な選別を可能にする。図６ａは、２個のアライメント電極２７，２８を示し、これは例としての実施例で測定チャネルから流入する粒子１７を、チャネル２の１個の側壁１５近くにある区域にもたらす。両アライメント電極はスイッチを入れられる。電極２９は、実際の選別電極であり、それはアライメント電極２７と２８により前もって決定された経路に留まるべきかどうかに依存してスイッチを切られ、または粒子１７が偏向されるべきならば、それはスイッチを入れられる。偏向電極３０は偏向粒子を遠くに運び開口部３１により粒子を出現させることを可能にし、そのため図１に基づく２個の出口部４および５の方向で、粒子の分割が次のフォーク３２により可能となる。図６ｂは、アライメント電極２７と２８のも一つの代替配列を示し、電極２７は続く選別電極２９よりも短く設計されており、またそれは粒子１７を側壁１５から遠くにまで運ぶのに役立つ。偏向電極３０は、産出結果に影響を与えることなく、ここで一つの例としてここで異なる幾何学的配列を示している。図６ａと６ｂでは、偏向電極の場合に、両電極、すなわち上部および下部電極は平行に図示されており、これは下部および上部偏向電極が平行で示される区域においてのみ、粒子１７の望ましい誘導が生じるという事実を示すためである。残る区域では、通路の開口部３１が産出される。
【００６３】
図６ｃは、偏向電極対３０の更なる可能な構成を示す。
【００６４】
選別操作は、図６ｄを用いることにより、より詳細に説明されるであろう。これは粒子１７の２個の可能な経路を示している。前にも述べたように、アライメント電極２７，２８と偏向電極３０は絶えずスイッチが入れられている。選別電極対２９は、粒子１９が選別される時にスイッチを入れて始動される。これは、粒子が固有に提供される粒子経路３３から偏向され、流体流動により粒子経路３４に沿って移動する効果を持つ。偏向電極３０は、同じ部分で重なり合うことはなく、そのため結果として、これらは粒子のための開口部３１を形成し、これは次いで粒子経路３３にほぼ平行な経路に進むことができる。敏速な選別を達成するために、選別電極２９の長さができるだけ短く、しかしそれにスイッチが入れられた時に、粒子１７が電極３０に向かう経路を続け、次の粒子のため選別電極対２９のスイッチを切る行為をできるだけ早く実施できるようにする時には、その電極２９の長さは十分に長くなければならない、ということが重要である。偏向電極３０は、選別電極２９で選別されない粒子が、偏向電極３０によりあまりにも大きく影響されないでこれらの経路を継続できるように配列される。
【００６５】
誘電泳動により制御されるプロセスに関して、１０ボルトの領域での電圧と１００ｋＨｚ乃至１０ＭＨｚの周波数が液体と粒子に依存して使用される。測定チャネルでの測定に関しては電圧は２ボルト以下であり、周波数は１０ｋＨｚ乃至２００ＭＫｚである。
【００６６】
【発明の効果】
以上記載したミクロ流体装置を利用することにより、結合された敏速で費用効率の高いオンチップ検出および続く分割が容易に可能となる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 ミクロ流体装置について個別区域のチャネルを概略表示する平面図。
【図２】 分離粒子の配列の各種実施例を示す図。第１配列の平面図（図２ａ）、チャネルの中心部の対応する断面図（図２ｂ）、および分離のためのも一つの電極配列の平面図（図２ｃ）。
【図３】 流体流動で粒子の位置付けのための電極配列を示す図。平面図（図３ａ）および横方向断面図（図３ｂ）。
【図４】 平面図で図２ａおよび図３ａに基づく電極配列の組合せを示す図。
【図５】 測定チャネル区域のための２個の異なる電極配列を示す図。細幅測定チャネル（図５ａ）および広幅チャネル（図５ｂ）。
【図６】 アライメントと選別区域での選別のための２個の各種の異なる電極配列を示す図。第１幾何学的配列を持つもの（図６ａ）、第２幾何学的配列を持つもの（図６ｂ）、選別された粒子を遠く離れて運ぶ電極のみの第３幾何学的配列（図６ｃ）、粒子の経路を持ち拡大された現場での図６ａに基づく配列（図６ｄ）。
１ ミクロ流体装置
２ チャネル
３ 入口開口部
４ 出口開口部
５ 出口開口部
６ 調製区域
７ 測定チャネル区域
８ 選別区域
９ 電極配列
１０ 電極配列
１１ 電極配列
１２ 導線トラック
１３ 電極、分離電極
１４′電極、分離電極
１４″電極、分離電極
１５ 側壁
１６ 側壁
１７ 粒子
１８ 粒子クラスター
１９ 通路開口部
２０ 電極
２１ 電極
２２ 第１電極アーム
２３ 第２電極アーム
２４ 探知区域、測定電極対
２５ 探知区域、測定電極対
２６ 第１電極配列、偏向電極
２７ 電極配列、アライメント電極
２８ 電極配列、アライメント電極
２９ 第１選別電極配列
３０ 第２選別電極配列、偏向電極
３１ 開口部
３２ フォーク
３３ 経路、第１粒子経路
３４ 経路、第２粒子経路
Claims (18)
- 一つの基板より成るミクロ流体装置であって、
流体に個別粒子（１７）を通す少なくとも１個のチャネル（２）と、粒子（１７）に誘電泳動により影響し、かつそれを分離するための調製区域（６）と、
粒子（１７）を特徴付ける電極装置を持ち、その電極装置はそれぞれの区域でインピーダンスを測定するための基準探知区域と測定探知区域の少なくとも２個の探知区域を持つ測定チャネル区域（７）と、
誘電泳動により測定チャネル区域（７）で同定される粒子（１７）を選別する電極装置を持つ選別区域（８）と、を有し、
測定チャネル区域（７）における探知区域の断面が、調整区域（６）および選別区域（８）の断面よりも小さく、
電極への信号と電極からの信号を伝送するために、個別区域（６−８）において、電極（１３、１４′、１４″、２０−３０）に電気的に接続される導線トラックを持つ基板より成ることを特徴とするミクロ流体装置。 - 請求項１記載の装置であって、前記粒子（１７）が、電極装置により調製区域（６）において誘電泳動により影響を受け、第１電極は、まず粒子（１７）を分離し次いで流体流動での特異的な位置に粒子を留める電極配列（９）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項２記載の装置であって、前記粒子（１７）を分離する電極配列（９）が、流動方向に対して斜めに配列され、また、ほぼロート状の配列を持ち、また流動方向でこれらに続いて通路開口部（１９）のあるロート状配列で間隙をあけて平行に配置された第２電極（１４′、１４″）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項２記載の装置であって、前記位置決めのための電極配列（９）が、粒子（１７）を流体流動物理的中心に留める電極（２０、２１）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項４記載の装置であって、電極配列（９）が、流動方向に対して斜めに配列され、側壁（１５、１６）からチャネル（２）に突出し中央通路開口部（１９）を形成する電極アーム（２２）と共にロート形状に配列される電極（２０、２１）を持ち、また直接それに隣接して通路開口部（１９）から離れて、平行に走る電極アーム（２２、２３）を持ち、第１電極アーム（２２）は粒子（１７）を流体流動の中心の平面に整列するのに役立ち、また第２電極アームは粒子（１７）を流体流動の中心線に沿って整列させるのに役立つことを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項５記載の装置であって、前記第２電極アーム（２３）が平衡状態にある電極間の空間内で粒子（１７）に作用する力を与えるのに十分な長さを持つことを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項１乃至６のいずれか１項記載の装置であって、前記電極（１３、１４′、１４″）の間の距離が粒子径の２乃至４倍であることを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項１乃至７のいずれか１項記載の装置であって、ここで測定チャネル区域（７）内でのチャネル（２）の電極装置が、測定チャネル内での特異的経路に粒子（１７）を案内する第１電極配列（２６）と、それぞれの区域でインピーダンスを測定するために２個の探知区域（２４、２５）を産生する第２電極配列とを持ち、一つの探知区域２４は測定される粒子（１７）の経路に配列され、また他の探知区域（２５）は基準インピーダンスを提供するために経路の外側に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項１乃至８のいずれか１項記載の装置であって、ここで選別区域（８）にある電極装置が、第１選別電極配列（２９）および少なくとも第２選別電極配列（３０）を持ち、第１選別電極配列（２９）は粒子（１７）の経路（３３）に配列され、 また第２選別電極配列（３０）は第１選別電極配列（２９）により選別された粒子（１７）を特異的に前方向に誘導するために、粒子の経路の側面に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項９記載の装置であって、前記第２選別電極配列（３０）が、誘導方向に対して斜めに配列され、また粒子（１７）の経路のための出口開口部（３１）を持つことを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項１０記載の装置であって、前記第２選別電極配列（３０）の後、フォーク（３２）が選別区域（８）のチャネル（２）に配列されることを特徴とするミクロ流体装置。
- 請求項９乃至１１のいずれか１項記載の装置であって、前記第１選別電極配列（２９）の上流での粒子経路の選別区域（８）で、粒子（１７）をアライメントするために電極配列（２７、２８）が配列され、この配列は、測定チャネル区域（７）からの測定チャネル（２）より生じる粒子（１７）を、流体流動でのもっとも狭くすることの可能な経路に案内され、また第１選別電極配列（２９）の電極が、粒子（１７）の経路で斜めに配列され、かつ経路の幅にほぼ合致する長さを持つことを特徴とするミクロ流体装置。
- ミクロ流体装置により流体流動における粒子を選別するための一つの方法であって、それが、
Ａ．誘電泳動により粒子を分離し、次いで粒子を流体流動の物理的中心に位置決めし、
Ｂ．測定チャネル区域（７）に２以上の電場（２４、２５）を生成することによるインピーダンス測定により、測定チャネル区域（７）の調整区域（６）と選別区域（８）の断面より狭い断面の流体流動に導かれた分離粒子を特徴付け、そして、前記電場を比較することにより、前記粒子の大きさと電気的特性についての情報が決定され、
Ｃ．第１粒子経路（３３）から粒子を有効に選別して誘電泳動によりステップＢで定義される特徴を基礎にして測定チャネル区域（７）で記録された粒子を選別し、選別された粒子を、第１粒子経路（３３）にほぼ平行して走る第２粒子経路（３４）に向けて特異的に誘導し、
Ｄ．粒子経路（３３、３４）を分割し、
Ｅ．必要とあれは、ステップＣとＤを繰返す、
ことより成ることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。 - 請求項１３記載の方法であって、１ｋＨｚ乃至２００ＭＨｚの周波数を持つ１個または異なる電圧が電場を生成するために使用されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
- 請求項１３記載の方法であって、最高最低電圧がせいぜい２ボルトであることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
- 請求項１３乃至１５のいずれか１項記載の方法であって、選別前に、粒子の速度が光学的または電気的に測定されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
- 請求項１３乃至１６のいずれか１項記載の方法であって、選別前に、粒子が流体流動の粒子経路に集められることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
- 請求項１７記載の方法であって、前記粒子が、第１電場障壁を設定しまたは除去することにより粒子経路（３３）から継続して誘導され、また第１粒子経路（３３）にほぼ平行する粒子経路（３４）に更なる電場障壁（３０）に沿って誘導され、また流体流動が２個の粒子経路（３３、３４）に従って続いて分割されることを特徴とする流体内の粒子を選別する方法。
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