JP3819612B2

JP3819612B2 - β−ｈＣＧの免疫学的測定方法

Info

Publication number: JP3819612B2
Application number: JP29309798A
Authority: JP
Inventors: 英明鈴木; 樹由高橋; 弦一郎荒谷; 寿史葛城; 未央佐藤
Original assignee: Dainichiseika Color and Chemicals Mfg Co Ltd
Current assignee: Dainichiseika Color and Chemicals Mfg Co Ltd
Priority date: 1998-09-30
Filing date: 1998-09-30
Publication date: 2006-09-13
Anticipated expiration: 2018-09-30
Also published as: JP2000111552A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、異所性ヒト絨毛性ゴナドトロピン産生腫瘍等の診断に廣く用いられているヒト絨毛性ゴナドトロピンβ−サブユニット（以下、「β−ｈＣＧ」という。）の血清中の濃度を化学発光法を利用して免疫学的に測定する方法に関するものであり、更に詳しくは、ペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、特定の新規化学発光試薬によりβ−ｈＣＧの血清中濃度を高感度に測定する免疫学的測定方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
β−ｈＣＧは、胎盤から分泌される性腺刺激ホルモンであり、分子量約３８，０００の糖蛋白で、α−サブユニット及びβサブユニットからなり、α−サブユニットのアミノ酸配列は下垂体前葉から分泌される黄体形成ホルモン（ＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ＴＳＨのそれと類似し、β−サブユニットのアミノ酸配列はＦＳＨ、ＴＳＨのそれとはかなり異なるがＬＨのβ−サブユニットとは相似性を有することが知られている。各々のサブユニットは単独では生物学的活性を持たず、生体内では大部分が両者が結合した形で存在している。
【０００３】
ｈＣＧは妊娠中に大量に分泌されるため妊娠診断等に廣く利用されているが、多くの悪性腫瘍において、異所性ｈＣＧとしてｈＣＧのβ−サブユニットが産生されることが判り、腫瘍マーカーとして利用されるようになっている。β−ｈＣＧの測定方法としては、ラジオイムノアッセイ及びエンザイムイムノアッセイ等が行なわれているが、測定感度は必ずしも十分とは云えず、異所性ｈＣＧ産生悪性腫瘍の早期発見に繋がるβ−ｈＣＧの高感度測定法の開発が望まれていた。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の課題は、前記事情に鑑みβ−ｈＣＧの高感度の免疫学的測定方法を提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、前記課題を解決するためにβ−ｈＣＧを従来より高感度に測定する方法について鋭意検討を行なった結果、ペルオキシダーゼ酵素活性の超高感度測定が可能な新規化学発光試薬を用いてβ−ｈＣＧを免疫学的に測定することにより、血中β−ｈＣＧを数ピコグラムのオーダーで測定し得ることを見い出し、これらの知見に基づいて本発明に到達したものである。
【０００６】
即ち、本発明は、ペルオキシダーゼ酵素標識した抗β−ｈＣＧ抗体を試料中のβ−ｈＣＧと接触させ、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を形成させ、必要により、該免疫複合体を不溶性担体に固定化した抗β−ｈＣＧ抗体と反応させて該不溶性担体上に捕捉した後分離し、これに、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加することにより得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その発光強度を測定することにより試料中のβ−ｈＣＧの含有量を定量することを特徴とするβ−ｈＣＧの化学発光法による高感度免疫学的測定方法に関するものである。
【０００７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明につき更に詳しく説明する。
本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法は、抗原抗体反応によりβ−ｈＣＧをペルオキシダーゼ酵素標識抗体を含む抗β−ｈＣＧ抗体との免疫複合体として捕捉する免疫反応段階と、生成した該免疫複合体をその分子中に存在する標識酵素を用いる化学発光法により測定する化学発光反応段階とからなる。
【０００８】
免疫反応段階を構成する抗原抗体反応の方法は任意であり、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物から得られる化学発光試薬を用いることができるものであれば、いずれの方法も採用することができる。
【０００９】
例えば、
▲１▼不溶性担体に結合した抗β−ｈＣＧ抗体に試料中の測定すべきβ−ｈＣＧを捕捉させた後にペルオキシダーゼ酵素標識抗β−ｈＣＧ抗体を反応させるサンドイッチ法、
▲２▼サンドイッチ法において、不溶性担体に結合した抗β−ｈＣＧ抗体と異なる動物種に由来する抗β−ｈＣＧ抗体を用い、生成したサンドイッチ錯体に対して、さらにこの抗β−ｈＣＧ抗体に対する標識した第二抗β−ｈＣＧ抗体を反応させる二抗体法、
▲３▼不溶性担体に結合した抗β−ｈＣＧ抗体に試料中の測定すべきβ−ｈＣＧをペルオキシダーゼ酵素標識抗β−ｈＣＧ抗体の存在下で反応させる競合法、
▲４▼測定すべきβ−ｈＣＧを含有する試料にこれらと特異的に反応する標識した抗β−ｈＣＧ抗体を作用させて凝集沈澱させた後、遠心分離して分離した免疫複合体中の標識物質を検出する凝集沈澱法、さらに、
▲５▼ビオチン標識抗β−ｈＣＧ抗体及びペルオキシダーゼ酵素標識アビジンを反応させるビオチン−アビジン法等
を非限定的に用いることができる。
【００１０】
本発明のβ−ｈＣＧ化学発光法による免疫学的測定方法に用いられる不溶性担体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカライド等の高分子化合物、その他、ガラス、金属、磁性粒子及びこれらの組み合わせ等が挙げられる。また、不溶性担体の形状としては、例えば、トレイ状、球状、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル、マイクロプレート、試験管等の種々の形状で用いることができる。さらに、これら不溶性担体への抗原若しくは抗体の固定化方法は任意であるが、物理的吸着法、共有結合法、イオン結合法等を用いることができる。
【００１１】
尚、本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法において用いられる抗体類はモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれを使うことも可能であり、その形態としては全抗体又はＦ（ａｂ’）₂ 、Ｆａｂ等の断片を用いることができる。また、抗体の起源は任意であるが、マウス、ラット、兎、羊、山羊、鶏等に由来する抗体が好適に用いられる。
【００１２】
さらに、本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法の後段を構成する化学発光反応段階は、化学発光試薬として、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加して得られる生成物を用い、更に所望により発光増強剤の存在下に水素受容体を作用させて不溶性担体上に捕捉された標識物質であるペルオキシダーゼ酵素の活性を測定するものであり、その測定方法は任意であるが、一般に、化学発光性物質及び発光増強剤を含有する測定試薬をペルオキシダーゼ酵素標識抗β−ｈＣＧ抗体を免疫学的に捕捉した不溶性担体に添加し、特定塩基性ｐＨ領域において過酸化水素水溶液を添加して化学発光反応させ、その化学発光量を発光測定装置で測定する方法等が行なわれている。
【００１３】
次に、本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法に用いられる化学発光試薬について説明する。
前記化学発光試薬は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後に特定のアミノアルコール化合物を添加することにより得られる化学発光性物質を含有する反応混合物である。
前記アミノアルコール化合物は、前記光照射前にＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との混合物に添加してもよいが、反応時及び／又は反応後、即ち、光照射時又は光照射後のいずれか或いは光照射時及び光照射後の両者において添加してもよい。特に、発光性能の安定性確立の観点からは光照射後、即ち、反応後に存在させることが肝要である。
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、下記一般式（１）
【００１４】
【化４】

で表わされる。
【００１５】
前記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。また、アルキル基としては炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のものを挙げることができ、特に、炭素数１〜１０のものが好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、イソヘキシル基等を例示することができる。アリール基は炭素数６〜２０のものであり、該アリール基には炭素数１〜１４のアルキル基が結合したものでもよい。具体的にはフェニル基、トリール基、キシリル基等を例示することができる。Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよい。アルキル基は炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状のものであり、特に、炭素数１〜１０のものが好ましく、具体的には、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基等を例示することができる。アリール基は炭素数６〜２０であり、該アリール基には炭素数１〜１４のアルキル基が結合したものでもよい。具体的には、フェニル基、トリール基、キシリル基等を例示することができる。アルコキシ基は炭素数１〜１４の直鎖状又は分岐状アルキル基を有し、また、アリーロキシ基は、炭素数６〜２０のアリール基を有する。
前記式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。陰イオン（対イオン）としては、具体的には硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫酸イオン、スルホン酸イオン等が挙げられる。
【００１６】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジエチル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩などが挙げられる。特に、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）が好適である。
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物は、下記一般式（２）
【００１７】
【化５】

で表わされる。
【００１８】
前記一般式（２）において、Ｒ₁ は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ₂ は、メチル基及びエチル基からなる群より選択され、Ｒ₃ は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子からなる群より選択される少なくとも一種で置換されていてもよく、また、Ｒ₁ 及びＲ₃ は互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。
【００１９】
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が非限定的に挙げられる。
前記アミノアルコール化合物は、下記一般式（３）
【００２０】
【化６】

で表わされる。
【００２１】
前記一般式（３）において、Ｒは、炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素であり、ｍは、１〜３の整数である。
その具体的な例としては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、モノイソプロパノールアミン、ジイソプロパノールアミン、トリイソプロパノールアミン等を非限定的に挙げることができる。
【００２２】
本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法に用いられる化学発光試薬の製造に必要なアミノアルコール化合物の添加は、発光反応時において、ブランク値を低下させる効果及びペルオキシダーゼの高濃度領域における発光強度を上昇させる効果を有し、また、化学発光試薬の保存時において、その発光性能の低下を防ぐ保存安定性を改善する効果等を有し、化学発光試薬の感度や安定性等の性能の向上に寄与する処が大きい。
【００２３】
前記化学発光試薬の製造に用いられる光照射用の光線としては、波長領域が約２９０〜８００ｎｍの範囲の紫外可視部が用いられ、特に、約４００〜８００ｎｍの範囲の可視光が望ましい。これらの光源としては、高圧水銀灯、低圧水銀灯、殺菌灯、蛍光灯及び白熱電灯等を非限定的に用いることができ、特に、白熱電灯が好ましく用いられる。この光照射により得られる化学発光試薬は、光源を用いずに自然光の下で製造した化学発光試薬に較べて、同じ原料ルシゲニン濃度で製造し同量で使用した場合に短時間で非常に高い発光強度を示すことと、この反応を光遮断下に実施した場合にはペルオキシダーゼ濃度依存性を有する化学発光試薬が得られないことから、化学発光性物質の生成には光照射が重要な役割を担っていることが認められる。
【００２４】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、ｐＨ８付近では過酸化水素ともペルオキシダーゼ存在下の過酸化水素とも顕著な発光反応は起こさないが、これはＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンが対イオン、特に硝酸イオンと安定な塩を形成しているためと考えられる。しかし、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物等の極性の高い化合物の存在下で光照射を行なうことにより、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの対アニオンからの電荷移動が促進され、イオン性の高い塩類からラジカル性を有する電荷移動錯体に変化し、この錯体がＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の配位若しくは溶媒和によって安定化され、この安定化されたビラジカル性化合物が過酸化水素の酵素分解により生成する活性酸素と反応して、励起状態のジオキセタン構造を経て発光するのでペルオキシダーゼ濃度に依存した発光強度が得られるものと考えられる。この光照射による反応において、アミノアルコール化合物の添加は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウムカチオンへの電荷移動に関与してその反応を促進し、発光反応時のブランク値を高める副生成物の生成を抑え、且つ生成するビラジカルを更に安定化する作用を有するものと考えられる。
【００２５】
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類、Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及びアミノアルコール化合物の混合割合モル比は、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類に対してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物を１〜１万倍モル、アミノアルコール化合物を１〜１万倍モルの量でそれぞれ用いることができ、さらに、同種及び／又は異種のＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物及び／又はその他の溶媒を反応溶媒として用いることもできる。
【００２６】
前記光照射反応の反応温度は用いられる溶媒の有無及び種類によって異なるが、一般的に−１０〜＋１５０℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ましくは２０〜９０℃の範囲の温度である。また、反応時間は１分〜一昼夜、好ましくは１０分〜１５時間、特に好ましくは３０分〜１０時間の範囲の時間で行なうことができる。
【００２７】
前記化学発光試薬は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において、過剰の過酸化水素の存在下、ペルオキシダーゼの濃度に依存した量で発光する。この発光は、フェノール性化合物等の発光促進剤によって増強することが認められる。このようなフェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェノール、ｐ−ブロモフェノール、ｐ−クロロフェノール、２，４−ジクロロフェノール、ｐ−クマル酸、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトール、ホタルルシフェリン等が非限定的に挙げられる。
【００２８】
前記化学発光試薬の濃度は、１０^-8〜１Ｍ、好ましくは１０^-6〜１Ｍ、更に好ましくは１０^-4〜１０^-2Ｍの範囲であり、その使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００μｌの範囲が望ましい。また、発光促進剤は、化学発光試薬に対し、０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜１０倍モルの範囲で用い、その濃度は１０^-6〜１Ｍ、好ましくは１０^-4〜１０^-2Ｍの範囲で用いるのが望ましい。
【００２９】
また、本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法における化学発光反応に用いられる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質となり得るものであれば特に限定されるものではないが、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられる。特に、過酸化水素が好ましく用いられる。この水素受容体の使用量は化学発光性物質に対して充分に過剰な量で用いることが必要であり、その使用量は化学発光性物質に対して３〜１万倍モル、好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲である。
また、ペルオキシダーゼを標識物質として抗β−ｈＣＧ抗体、核酸等を標識してβ−ｈＣＧを定量する場合には、特に限定されるものではないが、ペルオキシダーゼとして、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）が好ましく用いられる。
【００３０】
前記化学発光反応に用いられる塩基性緩衝液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等を任意に用いることができる。これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜１Ｍの範囲で用いるのが望ましい。また、反応時に界面活性剤、キレート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００３１】
本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法における化学発光反応の発光量は、発光光度計を用いて測定することができる。その際、発光量測定の開始点及び積算時間は任意であるが、発光量が安定し且つ発光量の濃度依存性の高い時間を選択するのが望ましい。例えば、測定開始点は試薬混合後０〜１時間、好ましくは０〜３０分、特に好ましくは０〜１５分であり、測定の積算時間は１秒〜１分、好ましくは１〜３０秒、特に好ましくは１〜１０秒である。
【００３２】
【実施例】
以下、参考例と共に実施例を示し、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は実施例等により限定されるものではない。
尚、参考例及び実施例中の％は重量％を意味する。
【００３３】
［参考例１］
化学発光試薬の調製
ルシゲニンを１．５ｍｇ試験管に採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドを１ｍｌ加えて溶解させた後、３０℃の温度の水浴中で２５０Ｗのコピーランプを７時間照射してから、トリエタノールアミン０．５ｍｌを添加し混合することにより化学発光試薬を得た。次に、この化学発光試薬を８×１０^-4Ｍのｐ−ヨードフェノール７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH8.0) 溶液で５００倍に希釈することにより化学発光試薬溶液を調製した。
【００３４】
［参考例２］
不溶性担体固定化兎抗β−ｈＣＧポリクローナル抗体の製造
β−ｈＣＧに特異的反応性を有する兎等の動物由来の抗β−ｈＣＧポリクローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(pH7.4) に１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を０．４ｍｌずつ加えて３７℃の温度で１時間放置してポストコーティング処理を実施して兎抗β−ｈＣＧポリクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【００３５】
［参考例３］
ペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体の製造
β−ｈＣＧに特異的反応性を有するマウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を１０ｍＭリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）(pH7.4) に１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液１ｍｌに、Ｎ−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエステル（ＭＢＳ）の１０ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液０．１ｍｌを添加し、２５℃の温度で３０分間反応後、この反応混合液をセファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．１Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過を行ない、マレイミド化マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体と未反応ＭＢＳとを分離した。
【００３６】
一方、ペルオキシダーゼ酵素としてホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の５．０ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍリン酸緩衝液(pH6.5) 溶液１ｍｌに、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物（ＳＡＭＳ）の３５ｍｇ／ｍｌの濃度のジメチルホルムアミド溶液５０μｌを添加し、２５℃の温度で２時間反応させた。次いで、この反応混合液に１Ｍヒドロキシルアミンの５ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）含有０．１Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) ０．８ｍｌを添加して３０℃の温度で４分間攪拌してＨＲＰ分子中に導入したＳ−アセチルメルカプト基を脱アセチル化した後、セファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、５ｍＭＥＤＴＡ含有０．１Ｍリン酸緩衝液(pH6.0) でゲル濾過して精製してチオール化ＨＲＰを含有する画分を得た。
【００３７】
次に、マレイミド化マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し、コロジオンバックを用いて氷冷下に４ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度まで濃縮し、４℃で一昼夜放置した後、ウルトロゲルＡｃＡ４４（ＳＥＰＲＡＣＯＲ社）を充填したカラムを用いてゲル濾過し、ペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を得た。
【００３８】
［実施例１］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるβ−ｈＣＧの測定
兎抗β−ｈＣＧポリクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβ−ｈＣＧ（標準物質）を夫々 0、0.01、0.1、 1、 10、100mIU/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.2) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.2) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び０．００１７％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図１に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβ−ｈＣＧを０．０１mIU/mlの濃度まで測定することが可能であった。
【００３９】
［参考例４］
不溶性担体固定化マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体の製造
β−ｈＣＧに特異的反応性を有するマウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を１０ｍＭＰＢＳ(pH7.2) に１０μｇ／ｍｌの濃度で溶解した溶液を、白色マイクロプレート（ラボシステム社）の各ウェルに０．１ｍｌずつ加え、３７℃の温度で１時間放置した後、ＰＢＳで洗浄してから、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液を０．４ｍｌずつ加えて３７℃の温度で１時間放置してポストコーティング処理を実施してマウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体固定化白色マイクロプレートを得た。
【００４０】
［実施例２］
同時サンドイッチ法ＣＬＥＩＡによるβ−ｈＣＧの測定
マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を固定化した白色マイクロプレートに、精製したβ−ｈＣＧ（標準物質）を夫々0、 0.01、 0.1、 1、 10、 100mIU/mlの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.2) ５０μｌとペルオキシダーゼ酵素標識マウス抗β−ｈＣＧモノクローナル抗体を約２μｇ／ｍｌの濃度で含有する２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液(pH7.2) １００μｌとを加え、３７℃の温度で１時間インキュベートした。次に、ウェル内の溶液を吸引除去した後、ウェル内を生理食塩水で洗浄してから、各ウェルに７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) １００μｌを加え、これに参考例１で調製した化学発光試薬溶液１００μｌ及び0.0017％過酸化水素を含む７５ｍＭトリス塩酸緩衝液(pH7.8) ５０μｌを順次注入して発光させた後、この発光量をルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９０００Ｄ）で１〜５秒間積算して測定し、この値を標準物質濃度に対してプロットすることにより、図２に示される濃度依存性の良い検量線を得た。この検量線を用いて血清検体中のβ−ｈＣＧを０．０１mIU/mlの濃度まで測定することが可能であった。
【００４１】
【発明の効果】
本発明のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法は、入手が容易であり取り扱いも比較的に容易なペルオキシダーゼ酵素を標識物質として用い、安価で入手が容易であるルシゲニン等を出発原料とし、且つ容易に製造できる新規化学発光試薬を用いる化学発光法により、血清等の試料中のβ−ｈＣＧを免疫学的に高感度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβ−ｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したβ−ｈＣＧ測定用のポリクローナル抗体系検量線である。
【図２】実施例２記載の反応系を用いて化学発光させた化学発光量をβ−ｈＣＧ（標準物質）の濃度の関数としてプロットして作成したβ−ｈＣＧ測定用のモノクローナル抗体系検量線である。

Claims

ペルオキシダーゼ酵素で標識した抗β−ｈＣＧ抗体を試料中の測定すべきβ−ｈＣＧと接触させ、抗原抗体反応によりペルオキシダーゼ酵素標識−抗原抗体錯体からなる免疫複合体を形成させた後分離し、これに、Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物の存在下において光照射により反応させる際に、その反応時及び／又は反応後にアミノアルコール化合物を添加することにより得られる化学発光性物質を含有する化学発光試薬を添加し、水素受容体の存在下において化学発光させ、その発光強度を測定することにより試料中のβ−ｈＣＧの含有量を定量することを特徴とするβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、下記一般式（１）

（前記一般式（１）において、Ｒ¹ 及びＲ² は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｒ³ 、Ｒ⁴ 、Ｒ⁵ 及びＲ⁶ は、水素原子、アルキル基、アリール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子からなる群より選択され、互いに同一でも又は異なるものでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２である。）
で表わされる化合物である請求項１に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレート（ルシゲニン）である請求項１又は２に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、下記一般式（２）

（前記一般式（２）において、Ｒ₁ は、水素原子、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、Ｒ₂ は、メチル基又はエチル基であり、Ｒ₃ は、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素数２〜１０のアルケニル基及び炭素数６〜２０のアリール基からなる群より選択され、該アリール基はアルキル基、ニトロ基、水酸基、アミノ基及びハロゲン原子等で置換されていてもよく、また、Ｒ₁ 及びＲ₃ は、互いに結合して、それぞれが結合しているカルボニル基の炭素原子及びアミド基の窒素原子と共に環を形成していてもよい。）
で表わされる化合物である請求項１ないし３のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光による免疫学的測定方法。
前記抗原抗体反応を不溶性担体に固定化した抗体の存在下に行ない、標識化された免疫複合体を該不溶性担体上に形成させる請求項１ないし４のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド又はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミドである請求項１ないし５のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記アミノアルコール化合物は、下記一般式（３）

（前記一般式（３）において、Ｒは、炭素数１〜５の二価の脂肪族炭化水素であり、ｍは、１〜３の整数である。）
で表される化合物である請求項１ないし６のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記アミノアルコール化合物が、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群より選択される少なくとも一種の化合物である請求項１ないし７のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記水素受容体が、過酸化水素又は過酸化水素源である請求項１ないし８のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。
前記化学発光反応を行なう際に、さらに、発光増強剤を含有させてなる請求項１ないし９のいずれかの１項に記載のβ−ｈＣＧの化学発光法による免疫学的測定方法。