JP3808498B2 - フラボノールシンターゼ酵素をコードする遺伝子配列およびその用途 - Google Patents
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Description
本発明は一般にフラボノイド代謝酵素および特にフラボノールシンターゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子配列、ならびに植物内での色素分子の産生を操作する場合のようなこれら遺伝子配列の用途に関する。
本明細書において以後引用する刊行物の書誌的詳細は本明細書の詳細な説明の後にまとめてある。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列について本明細書に引用する配列番号は上記書誌事項の後に示す。
花卉産業界は顕花植物の新しい異なる品種の開発に懸命に努力している。このような新規な品種を創製するのに有効な方法は花色を操作することによる方法であるが、伝統的な育種法を用いて、花の実用品種の大部分については高範囲の色が産生され、ある程度成功している。しかし伝統的な方法は、特定の種の遺伝子給源が制約されているため制限があり、またこの理由によって、単一の種が全スペクトルの着色品種をもっていることはまれである。例えばバラ、キク、カーネーション、ユリ、チューリップおよびガーベラのような主な切花の種のブルー色の品種が開発されれば、切花と観賞花卉の両方の市場に大きな機会を提供するであろう。
花および植物の他の部分の色は、主として２種の色素：フラボノイド類およびカロテノイド類に基づいている。フラボノイド類は最も普通でかつ最も重要な花の色素である。花色に関連する最も重要なクラスのフラボノイド類はアントシアニン類、フラボノール類およびフラボン類である。アントシアニン類は、シアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジンおよびペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であり、液胞内に局在している。
花色に対する一つの重要な因子は、タンニン類およびある種のフラボンとフラボノールのグリコシドと、アントシニアニン類とのコピグメント化である（Scott-Moncrieff 1936年）。ある範囲のpH値にわたって比較すると、コピグメント化したアントシアニン類は、通常の色素より青味が多いことが常にみとめられる。またアントシアニン類とフラボノールグリコシド類のコピグメント化は果物の色の発生に重要な場合がある（Yoshitamaら1992年）。アントシアニン：コピグメントのモル比も色に強い影響を与えることがある。フラボノールのアグリコン類が花粉の発育と花粉管の発育にとって不可欠であるということが最近実証されている（Moら1992年）。したがってフラボノール類のようなコピグメントの植物内での産生を制御する性能は、花色を変化させたり植物の稔性を操作するのに有用な用途になるであろう。
アントシアニン色素類の生合成経路は充分に確立されている（Ebe1およびHah1brock 1988年；Hah1brockおよびGrisebach 1979年；Wieringおよびde Vlaming 1984；Schramら1984年；Stafford 1990年）。この経路で最初に行われるステップには、３分子のマロニル−CoAと１分子のρ−クマロイル−CoAの縮合反応が含まれている。この反応は酵素のカルコンシンターゼによって触媒される。この反応の生成物である２′，４，４，６−テスラヒドロキシカルコンは通常、酵素のカルコンフラバノンイソメラーゼによって急速に異性化されてナリンゲニンを生成する。ナリンゲニンは次いでフラバノン３−ヒドロキシラーゼによって中央リングの３位がヒドロキシル化されてジヒヒドロケンフェロール（DHK）を産生する。ジヒドロケンフェロールのβリングは、３′位または３′位と５′位の両者をそれぞれヒドロキシル化されてジヒドロケルセチン（DHQ）およびジヒドロミリセチン（DHM）を生成することができる。DHK，DHQおよびDHMは、少なくとも２種の酵素（ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼおよびフラボノイド−３−グルコシルトランスフェラーゼ）の作用によって、有色アントシアニン類（ペラルゴニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−グルコシドおよびデルフィニジン−３−グルコシド）に変換することができる。
ケンフェロール（Ｋ）、ケルセチン（Ｑ）およびミリセチン（Ｍ）のようなフラボノール類は、図１に示すように、ジヒドロフラボノール類のＣ−２とＣ−３の間に二重結合を導入することによって製造することができる（Forkmann 1991年）。フラボノール類はグリコシル化された形態で蓄積することが多くまたメチル化されることがある。メチル化反応はグリコシル化反応の前後で行うことができる。ジヒドロフラボノール類はフラボノール類への試験管内での変換は、パセリの細胞培養物由来の酵素製剤中に初めて観察された（Britschら1981年）。またフラボノールシンターゼ活性は、マチオラ（Matthiora）属の植物（SpribilleおよびForkmann 1984年）、ペチュニア（Petunia）属の植物（Forkmannら1986年）およびダイアンサス（Dianthus）属の植物（Forkmann 1991年）由来の花の抽出物中に検出されている。フラボノールシンターゼの酵素活性は、２−オキソグルタレート、アスコルベートおよび第一鉄イオンが補因子として必要である。ペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida）の花では遺伝子座Flがフラボノール類の生成を制御している。すなわちフラボノールの合成は、この遺伝子に対してホモの劣性な変異体では大きく減少する（Wieringら1979年；Forkmannら1986年）。ペチュニア由来のフラボノールシンターゼによる試験管内酵素検定の結果は、DHKとDHQはそれぞれのフラボノールに容易に変換したがDHMは変換しにくい基質であった。顕花植物中のフラボノールシンターゼ活性を制御する性能は、フラボノールの産生を変化させて、単一の種がより広範囲の花色を発現できるようにすることによって、花弁の色を操作する手段を提供するであろう。先に述べたように、フラボノールの産生を制御する性能は、雄性稔性（male ferlitity）にも関連がある。このような制御は固有酵素（indigenous enzyme）の産生レベルを調節するかまたは非固有酵素を導入することによって行うことができる。
本願で“固有”酵素という用語を用いる場合、特定の細胞にとって固有であるか（native）または特定の細胞内で自然に発現される酵素を意味する。“非固有”酵素（“non-indigenous” enzyme）は細胞にとって固有でない酵素であるが植物の植物内に例えば導入遺伝子によって遺伝物質を導入することによって発現される酵素を意味する。“内因性”酵素（“endogenous” enzyme）は、細胞によって産生される酵素であるか、その細胞に対して固有であるがもしくは固有でない酵素である。
本発明によって、フラボノールシンターゼ（以後“FLS”と呼ぶ）をコードする遺伝子配列が同定され、いくつかの起源からクローン化され、そして形質転換植物を生成させるのに使用された。またこれらの組換え配列はフラボノール産生のレベルを調節することが可能で、その結果花弁の色と雄性稔性を操作する手段を提供する。またこれらの組換え配列は、DHKの代謝ならびにDHQおよびDHMのような他の基質の代謝を調節することができる。DHK，DHQおよびDHMは着色アントシアニン類の前駆物質であるから、FLSの配列の発現によってこれら前駆物質の濃度を調節することは花色を操作する他の手段になる。
したがって、本発明の一つの態様は、植物のFLS、または前記FLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体をコードするヌクレオチドの配列；または植物のFLS、またはそのFLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。“FLS”という用語には、FLS活性を有するポリペプチド類とタンパク質類、ならびにこのようなポリペプチド類とタンパク質類の変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体または類似体でFLS活性を有するものが含まれる。またFLS活性を有する分子は、FLS活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質と外来性のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質との融合ポリペプチドもしくは融合タンパク質でもよい。
“単離された核酸分子”という用語は、本願で用いる場合、自然には存在しない状態の遺伝子配列を含むことを意味する。一般に、この用語はその自然の状態からかけはなれているか、またはその自然環境では必ずしも遭遇しない方法で形成されていることを意味する。さらに具体的に述べると、この用語には、ゲノムDNAのフラグメント、組換えもしくは合成の分子、および本発明の遺伝子配列と融合されたかまた作動可能に連結された非相同の核酸ような非同相同核酸と組合わせた核酸を含めて、試験管内で形成されるかまたは維持される核酸分子が含まれる。
また“単離された核酸分子”という用語には、FLSまたはFLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体を、そのプロモーターもしくは他のプロモーターに対して逆の配向でコードするゲノムDNAもしくはゲノムcDNAまたはその一部分を含む。またこの用語にはさらに、他の核酸配列に対して少なくとも部分的に精製された天然に存在する配列が含まれる。本願で用いられる“単離された核酸分子”という用語には、“核酸単離物”（“nucleic acid isolate”）と同じ意味を有すると解される。
“遺伝子配列”という用語は、本願では最も一般的な意味で用いられ、FLS活性を有するポリペプチドまたはタンパク質を含むFLS分子を含んでいるアミノ酸の配列を、直接にまたは塩基の相補鎖によって指定するヌクレオチド塩基のつながりを含んでいる。アミノ酸のこのような配列は、例えば配列番号：１もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５に示すような全長のFLS、またはその末端を切り取った活性の形態、またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体を構成している。あるいはこのアミノ酸配列は、例えばこれらの配列の一部、または配列番号：２もしくは配列番号：３に示す配列のすべてもしくは一部を含んでいてもよい。
本発明の他の態様は、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列類似性が少なくとも50％である、
ヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子を提供するものである。
さらに詳しくは本発明は、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列類似性が少なくとも65〜75％である、
ヌクレオチドの配列を含んでなる単離されたDNA分子に関する。
好ましい類似性のパーセント値としては80％，85％，90％，92〜95％，96〜98％および99〜100％がある。上記の類似性のパーセント値は、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示す配列と、他の遺伝子配列を全体にわたって比較することを想定しているが、比較される分子のなかの特定の領域の類似性が50％より低いことがあることは明らかである。この点について、本発明はさらに、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示す配列の一つ以上の領域に対するヌクレオチド配列類似性が少なくとも50〜75％である、
ヌクレオチドの配列を含んでなる核配分子および特にDNA分子として定義される。
また本発明において目的とする核酸配列には、遺伝子プローブとしてまたは植物内で対応する遺伝子の発現を調節できる“アンチセンス”分子として有用なオリゴヌクレオチドが含まれる。また本発明で用いられる“アンチセンス分子”には、構造のゲノム遺伝子もしくはcDNA遺伝子またはその一部分を、それのプロモーターもしくは他のプロモーターに対して逆の配向で含んでなる遺伝子構築物が含まれる。
本発明のこの態様によって、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列を有する分子の一部もしくは領域に実質的に類似しているかまたは相補的な５〜50個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが提供される。上記文言中の“実質的に類似しているかまたは相補的な”という用語は、以下に定義するように、低いストリンジェンシー条件下、あるいは好ましくは中位のストリンジェンシー条件下、あるいは最も好ましくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成しうる類似性を有することを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えばFLSの遺伝子の配列を各種の起源から選別する場合とか、または形質転換植物に導入された遺伝子配列を監視するのに有用である。またかようなオリゴヌクレオチドは一般にプライマーもしくはプローブの形態である。好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドはFLSの保存遺伝子配列、または植物の属、植物の種および１または植物の系統もしくは変種内に保存された配列に関する。
本発明の一つの態様では、オリゴヌクレオチドはFLS遺伝子配列の５′末端もしくは３′末端に相当する。便宜上、本発明では、５′末端は構造遺伝子の開始コドンと該遺伝子の中央部分の間の領域を実質的に形成しているとみなし、３′末端は構造遺伝子の中央部分と該遺伝子の終止コドンの間の領域を実質的に形成しているとみなす。それ故、オリゴヌクレオチドは、５′末端もしくは３′末端、または５′末端と３′末端の両者に共通の領域とハイブリッドを形成できることは明らかである。本発明にはこのようなオリゴヌクレオチドがすべて含まれる。
本発明の一つの実施態様において、FLSをコードする核酸配列またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体は、例えばコサプレッション（米国特許第5,034,323号）を用いることによって、固有FLS活性を低下させるのに使用できる。あるいは、この酵素をコードする核酸配列またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体は、固有FLS活性を低下させるためアンチセンス配向で用いられる。本発明は一つの理論で限定したくないが、アンチセンスFLS転写物またはそのフラグメントもしくは一部分（例えばオリゴヌクレオチド分子）は、上記酵素に対して指定された自然に存在するmRNAのすべてもしくは一部分と二重らせんを形成して、活性酵素の蓄積またはmRNAから活性酵素への翻訳を妨害する。
他の変形では、標的の核酸配列を不活性化するのにリボザイム類を使用できる。リボザイム類についてはHaseloffおよびGerlach（1988年）の文献に充分に報告されている。この実施態様では、そのリボザイムは好ましくはハイブリッド形成部分と触媒部分を含んでなり、そのハイブリッド形成部分は、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すのと実質的に同じヌクレオチド配列を有する遺伝子由来のmRNA転写物とハイブリッドを形成できる一つの好ましくは二つのヌクレオチドアームをもっている。
別の実施態様では、FLSをコードする核酸配列またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体は、固有FLS活性を通常の内因的もしくは既存のレベルより上方に上昇させるため、または活性の通常の内因的もしくは既存のレベルが無視しうるレベルかもしくはゼロの場合にFLS活性を与えるために用いられる。
本発明においてFLSの活性の変更とは、活性の通常の内因的もしくは既存のレベルの上下に、活性を、30％以上、もしくは好ましくは30〜50％、もしくはさらに好ましくは50〜75％、もしくはさらに一層好ましくは75％以上増減させることを意味する。このような増減をFLS酵素活性の“調節”と呼称する。
一般に調節は、FLS遺伝子配列の転写もしくは翻訳のレベルについて行われる。活性のレベルはForkmannら（1986年）の文献に記載の方法の改変法を用いて検定することができる。
本発明の核酸は、リボ核酸類もしくはデオキシリボ核酸類、一本鎖もしくは共有結合で閉環された環状分子でもよい。
本発明の核酸分子としては、cDNAであるかまたはcDNAを起源とする核酸分子が好ましい。また本発明には、本願に開示されている遺伝子配列とハイブリッドを形成する他の核酸分子も含まれる。
本発明のこの態様によって、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列、またはそのそれぞれの相補形とハイブリッドを形成する。
ヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子が提供される。
ストリンジェンシーのレベルを定義するため、便宜上、Maniatisら（1982年）の文献の387〜389頁および特にパラグラフ11を引用することができる。なおこの文献の部分は本願に援用するものである。本願では、低ストリンジェンシーを４〜６×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中、37〜45℃で２〜３時間と定義する。ハイブリッド形成に関与する核酸の起源と濃度によって、他のストリンジェンシー条件例えば本願で１〜４×SSC／0.5〜１％（ｗ／ｖ）SDS中、45℃以上で２〜３時間とする中位のストリンジェンシー条件、または本願で0.1〜１×SSC／0.1〜1.0％（ｗ／ｖ）SDS中60℃以上で１〜３時間とする高ストリンジェンシー条件を利用することができる。
本発明には、その最も好ましい実施態様として、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列をもっているかまたは含んでなる核酸分子、または上記の配列にそれぞれ示すヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列の少なくとも一つ以上の領域に対し、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列のレベルで類似性が少なくとも50％、より好ましくは少なくとも55％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに一層好ましくは少なくとも65〜70％、およびさらにより一層好ましくは85％を超える核酸分子であって；その核酸がFLSの活性を有する酵素をコードするかまたは該酵素をコードする配列に対して相補的である核酸分子が含まれる。しかしヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列は上記パーセント値より低いかもしくは高い類似性を有ししかもFLS様分子をコードすることがあることに注目すべきであり、そしてこのような分子は、配列保存の領域をもっている場合、本発明の範囲内に含まれるとみなすものである。
本発明で目的とする核酸分子は、いずれかの配向で単独で、またはベクター分子好ましくは発現ベクターと組合わせて存在していてもよい。“ベクター分子”という用語は、最も広い意味で用いられ、核酸を植物細胞内へ転移し易くすることができおよび／または植物ゲノムに組込み易くすることができる。核酸分子に対する中間伝達体が含まれている。中間伝達体は、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、アグロバクテリウム（Agrobacterium）による転移またはDNAウイルスもしくはRNAウイルスによる挿入に用いるよう構成されている。本発明に含まれる中間伝達体および／または核酸分子は植物ゲノム中に安定に組込む必要がある場合とない場合がある。またかようなベクター分子は原核細胞中で複製および／または発現することができる。そのベクター分子またはその一部は植物のゲノムに組込むことができるものが好ましい。また本発明の核酸分子はさらに、植物細胞内で核酸分子の発現を指令することができるプロモーターの配列をもっている。また核酸分子とプロモーターは、先に述べたようないくつもの手段によって細胞内に導入することができる。またこのベクター分子は、FLS mRNAの転写物を切断できると先に定義したリボザイムをコードする遺伝子配列を含有していてもよい。
本発明の核酸またはその相補形は全長の酵素またはその誘導体をコードする。“誘導体”という用語は、天然に存在する酵素に対して単一もしくは複数のアミノ酸を置換、欠失および／または付加ししかもFLS活性を有する酵素を意味する。この点について、本発明の核酸には、FLSをコードし天然に存在するヌクレオチド配列が含まれ、または前記の天然に存在する配列に対して置換、欠失および／または付加がなされた単一もしくは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。また本発明の核酸配列またはその相補形は、活性もしくは不活性にかかわらずFLSの“一部分”をコードし、このような核酸分子は、オリゴヌクレオチドのプローブ、ポリメラーゼ連鎖反応もしくは各種の突然変異原性法のプライマーとして有用であり、または対応する遺伝子の植物内での発現を調節できるアンチセンス分子もしくはリボザイム分子の生成のために有用である。
本発明のFLSのアミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸を配列内に挿入したものが含まれる。挿入アミノ酸配列変異体は、１個以上のアミノ酸残基がタンパク質の予め決められた部位に挿入されている変異体であるが、ランダム挿入も、得られる生成物を適切に選別することによって可能である。欠失変異体は、配列から１個以上のアミノ酸を除去されていることを特徴とする変異体である。置換アミノ酸変異体は配列中の少なくとも一つの残基が除かれ、その位置に異なる残基が挿入された変異体である。代表的な置換は後記の表１にしたがって行われる置換である。
FLSがアミノ酸の置換によって誘導体化される場合、そのアミノ酸は一般に、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、かさ高な側鎖などのような類似の特性を有する他のアミノ酸で置換される。アミノ酸の置換は一般に単一の残基の置換である。アミノ酸の挿入は通常、約１〜10個のオーダーのアミノ酸残基の挿入であり、そして欠失は約１〜20個の残基の範囲内で行われる。欠失もしくは挿入は、隣接する対すなわち２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行うことが好ましい。
上記のアミノ酸変異体は、当該技術分野で公知のペプチド合成法、例えば固相ペプチド合成法（Merrifield, 1964年）などを用い、または組換えDNA操作法によって容易に製造することができる。公知の配列または部分的に公知の配列を有するDNAの予め決められた部位に置換突然変異を行う方法は公知であり、例えばＭ13突然変異誘発法がある。置換、挿入もしくは欠失の変異体として発現する変異体タンパク質を製造するためのDNA配列の操作法は、例えばSambrookら（1989年）の文献に便利に記載されている。
本発明のFLS酵素の組換えもしくは合成の変異体および誘導体の他の例としては、炭水化物類、脂質類および／またはタンパク質類もしくはポリペプチド類のような、FLS酵素に関連する分子の単一もしくは複数の置換、欠失および／または付加を行ったものが含まれる。
また“類似体”および“誘導体”という用語には、FLSの化学的機能の均等物および上記のアミノ酸誘導体が含まれる。便宜上、本願において特に以後“FLS”に言及するときは、FLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体または類似体が含まれる。
本発明は、ペチュニア、タバコ、カーネーションおよびキク由来の核酸配列を使用して例示する。というのはこれらのものは、現在までのところ最も便利で好ましい材料源だからである。しかし、当該技術分野の当業者であれば、類似の配列は、他の植物のようないくつもの起源から単離することができるということは直ちに分かるであろう。FLSを直接もしくは間接的にコードするこのような核酸配列はすべて、その起源にかかわらず本発明に含まれる。FLS酵素をコードする遺伝子の他の適切な起源の例としては、限定されないが、バラ、キンギョソウ、リシアンサス（lisianthus）、シクラメン、ブドウおよびパセリがある。
本発明によれば、FLSをコードする核酸配列は、いずれかの配向が形質転換植物に導入され次いで発現されて、DHKおよび／または他の適切な基質が植物細胞内で合成されている場合はこれら基質を最終的にフラボノール類もしくはその誘導体に変換するか、または代わりに内因性もしくは既存のFLS活性を減少させるかもしくは除去することによって代謝物のかような変換を阻害する手段を提供する。これらのフラボノール類が産生されると、花弁の色が改変され、アトシアニン類とのコピグメント化によって一層青味の強い色の生成に寄与する。植物内での本発明の核酸配列の発現は構成的、誘導的または発育的でありまた組織特異的でもある。“発現”という用語はその最も広い意味で用いられ、RNAの産生またはRNAとタンパク質の両者の産生が含まれる。またこの用語には核酸分子の部分発現も含まれる。
本発明のこの態様によれば、前記核酸配列を最終的に発現できるようにする条件下で、前記FLSをコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで該核酸配列を発現できるようにする充分な期間と条件下で前記形質転換植物を成長させることを含んでなる、FLSを合成できる形質転換顕花植物の製造方法が提供される。その結果、この形質転換植物は、同等の非形質転換植物で発現される量に比べて高いレベルで外来のFLSを産生することができる。
本発明の他の態様では、FLS活性をコードするヌクレオチドの配列、またはFLS活性をコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子で、適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで必要な場合に前記形質転換植物を、核酸配列を発現できるようにする充分な条件下で成長させることを含んでなる、固有のもしくは既存のFLS活性を低下させた形質転換植物の製造方法が提供される。
本発明のさらに他の態様では、植物細胞に導入されて適切に変えられたFl遺伝子もしくはその誘導体もしくは一部分からの相同的組換えによって固有配列を修飾することによってFl遺伝子を変化させ、次いでその遺伝子を修飾された植物を該細胞から再生させることを含んでなる、固有のもしくは既存のFLS活性を低下させた、遺伝子を修飾された植物の製造方法が提供される。
好ましい実施態様で、本発明は、本発明の核酸配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生し、次いで前記形質転換植物を、核酸配列がFLSを発現できるようにする充分な期間と条件下で成長させることを含んでなる、変化した花序特性を示す形質転換顕花植物の製造方法を提供するものである。あるいは、前記方法は、本発明の核酸配列またはその相補配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで前記形質転換植物を、固有もしくは既存のFLSの活性のレベルを変えるのに充分な期間と条件下で成長させることを含んでなる方法である。変えられるレベルは、同等の非形質転換植物におけるFLS活性の固有もしくは既存のレベルより低いことが好ましい。本発明を限定したくないが、作用機構の理論は、固有FLSの活性を減少させるには、導入された核酸配列またはその相補配列を発現させる必要があるということである。しかし、所望の作用すなわち変化した花序特性を示す顕花植物を得るのに導入された遺伝子配列またはその相補配列を発現させる必要はない。
関連する実施態様で、本発明は、植物細胞に導入されて適切に変えられたFl遺伝子またはその誘導体もしくは一部分からの相同的組換えによって固有配列を修飾することによってFl遺伝子を変化させ、次いでその細胞から遺伝子を修飾された植物を再生させることを含んでなる、変化した花序特性を示す顕花植物を製造する方法を提供するものである。
好ましくは、その変化した花序には、受容体植物の遺伝子型および生理的状態によって、白、イエロー、ピンク、バイオレットまたはブルーの花の産生が含まれる。
したがって、本発明には、FLSをコードする組換え遺伝子を発現することができる形質転換植物、またはFLSの調節を行う必要がある場合任意に転写可能なmRNA分子のすべてもしくは一部分に実質的に相補的な核酸配列を有する形質転換植物の製造方法であって；FLSをコードするヌクレオチドの配列またはFLSをコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子で、必要な場合、前記単離された核酸分子が最終的に発現できるようにする条件下にて、適切な植物の細胞を安定に形質転換し、次いでその細胞から形質転換植物を再生させることを含んでなる方法が含まれる。“適切な植物”という用語は、DHKなどのFLSの基質を産生することができ、かつ所望の色を発生するのに必要な適正な生理学的特性を有する植物を意味する。
FLS遺伝子配列を導入されたペチュニアおよびタバコの形質転換植物を生成させることによって本発明を例示する。ペチュニアおよびタバコの植物を用いることは、遺伝子配列を有する形質転換植物を生成させるのに特に便利で有用なモデルであり、このような形質転換植物から得られる結果は、一般に他の植物に適用できる。当該技術分野の当業者は、標的植物中に天然に存在する酵素の発現を増減させるような、本発明の方法に適用できる変種に直ちに気付くであろう。この方法によれば異なる色相の色が得られるであろう。ペチュニアおよびタバコに加えて、他の適切な標的植物としては、限定はないがバラ、カーネーション、キク、ガーベラ、リシアンサス、ユリ、アヤメおよびテンジクアオイがある。
したがって、本発明には、本発明の核酸配列のすべてまたは一部を含有するすべての形質転換植物、またはそのアンチセンス形および／またはその相同体もしくは類縁形および特に変化した花序特性を示す形質転換植物が含まれる。これらの形質転換植物は、FLSをコードするヌクレオチド配列またはFLSをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる導入核酸分子を含有している。一般にこの核酸は植物のゲノムに安定に導入されるが、本発明には、植物細胞内で複製できるDNAウイルスもしくはRNAウイルスのような自己複製核酸配列内にFLSヌクレオチド配列を導入することも含まれる。また本発明にはこのような形質転換植物由来の種子も含まれる。このような種子は、特に着色している場合、植物の特性タグとしてとりわけ有用である。さらに本発明には果実、野菜植物、および例えば観賞植物の葉が含まれる。
本発明の他の態様はFLSの組換え産物に関する。この酵素類の組換え産物は、例えば活性が一層大きい酵素を開発するための研究に用いる材料源を提供し、かつフラボノール類および／または着色化合物を産生する試験管内の系を開発するのに有用である。
本発明のさらに別の態様では、植物内で、FLSを発現できるかまたは固有FLS酵素のダウレギュレーションを行うことができる遺伝子構築物を製造する場合の本願に記載の遺伝子配列の用途に関する。
本発明の他の態様は、プラスミドの形態で染色体外に、FLSをコードする遺伝子配列を保有する原核生物もしくは真核生物に関する。一つの実施態様では、そのプラスミドは、大腸菌（Escherichia coli）中に存在するpCGP481である。プラスミドpCGP481を含有する大腸菌の菌株DH5αは、オーストラリア、2037、ニューサウスウェールズ、ピンブル、スアキンストリート１に所在のthe Australian Government Analytical Laboratoriesに、1993年８月５日付けで受託番号Ｎ93/33236号で寄託した。
本発明を以下の図面と実施例を参照して説明するが本発明を限定するものではない。
実施例を含めて本明細書を通じて用いられるアミノ酸の略語を以下の表２に示す。
本願で引用する遺伝子配列に割当てた配列番号をまとめて表３に示す。
図面のうち、
図１はペチュニア、ハイブリダ内でのジヒドロフラボノール類のフラボノール類への変換を示す概略図である。この経路の各ステップに関与する酵素は次のとおりである。Ｆ３′Ｈ＝フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３′５′Ｈ＝フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ；FLS＝フラボノールシンターゼ；DHK＝ジヒドロケンフェロール；DHQ＝ジヒドケルセチン；DHM＝ジヒドロミリセチン；Ｋ＝ケンフェロール；Ｑ＝ケルセチン；Ｍ＝ミリセチン
図２は32ｐで標識を付けたpDIOXC3 cDNA挿入断片でプローブしたRNAゲルブロットのオートラジオグラフである。各レーンは以下のものから単離した全RNA20μｇを含有している。１〜５：五つの発育段階のOGBの花のリムの組織；Ｔ：発育段階３〜４のOGBの花のチューブ組織；Ｌ：OGBの６週齢実生由来の葉の組織。
図３はpCGP481のcDNA挿入断片の完全ヌクレオチド配列を得るために用いた配列決定法を示す。矢印は個々の配列決定反応から読取られる配列の方向と長さを示す。注文製品のオリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ７〜９；配列番号：12〜14）を用いる配列決定反応を示す。
図４はpCGP631の構築を示す概略図である。pCGP631は、発現ベクターpYGA22m内の酵母グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターの後にセンス配向でpCGP481 cDNA挿入断片をクローン化して構築した。pCGP481由来のcDNA挿入断片を、EcoRＩ／XhoＩフラグメントとして、pYGA22mをEcoRＩ／SalＩで消化して得られた大きいフラグメントと連結した。
IR＝２μｍプラスミドの逆方向反復配列、TRP１＝TRP１遺伝子、Ap＝アンピシリン耐性マーカー。
図５は、DHQを基質として用いる、酵母の抽出物のFLS検定結果を示す。このオートラジオグラスはプラスミドpCGP631で形質転換された酵母の酵素抽出物による〔14Ｃ〕-DHQのケルセチンへの変換を示す。未形質転換の酵母に、FLS活性は全く検出されなかった。Ｃ＝酵母エキスなしの未標識ケルセチン、未標識ケルセチンの泳動位置は丸く囲んである。
実施例１−材料
酵素類
酵素はすべて商業的起源から入手し、そのメーカーの推奨にしたがって使用した。
細菌の菌株
下記の大腸菌の菌株を使用した。
PLK-F′およびSURE、両者ともにStratagene社から入手した；XL１-Blue（Bullockら1987年）およびDH５α（Hanahan 1983年およびBRL 1986年）。使用したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の菌株は無毒化されたAGLO（lazoら1991年）であった。
植物の材料
使用したペチュニア・ハイブリダの品種を下記表４に示す。
ダイアンサス・カリオフィルスcvラグナ（Dianthus caryophyllus cv. Laguna）の花は、ビクトリア州所在のVan Wyk and Son Flower Supply社から入手した。
クリサンセマム・モリホリウム（Chrysanthemum morifolium）の品種は、ビクトリア州所在のBaguley Flower and Plant Growers社から入手した。
実施例２−植物の発育条件と発育段階
植物の発芽
ペチュニア・ハイブリダ植物は、日長14時間、光の強さ10,000ルックスおよび温度22〜26℃で特別の発育室にて発育された。OGBの花を下記定義の発育段階で収穫した。
段階１：着色していない閉じたつぼみ（長さ：＜25mm）。
段階２：着色した閉じたつぼみ（長さ：25〜35mm）。
段階３：花冠が現われた暗パープル色のつぼみ（長さ：＞35mm）。
段階４：開葯前の暗パープル色の開いた花（長さ：＞50mm）。
段階５：すべての葯が開きかつ充分に開いた花。
他の品種のペチュニアの花は、開葯する前、色素の蓄積が最も多い段階に収穫した。
ダイアンサス・カリオフィルスの花の発育段階は以下のように定義した。
段階１：目視可能な花芽なし。
段階２：花芽が開きつつある：小花の先端が目視可能。
段階３：ほとんどすべての小花の先端が暴露されている。外側の小花が開きつつあるがどれも水平ではない。
段階４：外側小花が水平。
クリサンセマム属の花の発育の段階は以下のように定義した。
段階０：目視可能な花芽なし。
段階１：花芽が目視可能。小花はほうによって完全に覆われている。
段階２：花芽が開きつつある。小花の先端が目視可能。
段階３：小花がしっかりと重なっている。
段階４：ほとんどすべての小花の先端が暴露されている。外側の小花が開きつつあるがどれも水平ではない。
段階５：外側の小花が水平。
段階６：花が成熟に近づいている。
実施例３
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems PCR-Mate DNA合成機を用い、そのメーカーが推奨する方法を利用して合成した。合成したオリゴヌクレオチドは５′−３：
である。２個のヌクレオチドが括弧内に示されている場合は、そのいずれか一方を選択することを示す。“Ｉ”という略語はデオキシイノシンを表す。
実施例４−ペチュニア由来のジオキシゲナーゼのクローン化
ペチュニアcDNAライブラリーの構築
TurpenおよびGriffith（1986年）の文献に記載の方法を用いて、ペチュニア・ハイブリダcv OGBの段階３〜４の花の花弁の組織から全RNAを単離した。オリゴ−dTセルロースクロマトグラフィー（AvivおよびLeder 1972年）を３サイクル行い、全RNAからポリ（A）+RNAを選択した。
１×Superscript（登録商標）反応緩衝液、10mMジチオスレイトール、500μＭ dATP、500μＭ dGTP、500μＭ dTTP、500μＭ５−メチル−dCTP、0.75μｇオリゴ１（配列番号：６）および２μＬ Superscript（登録商標）逆転写酵素（BRL社）を含有する20μＬの容積内でポリ（A）+RNA ２μｇを逆転写させた。その反応混合物を37℃で50分間次いで44℃で10分間インキュベートし、続いて氷上に置いた。
上記の第一のストランド反応混合物に第二のストランド反応混合物（140μＬ）を添加した。第二のストランド反応混合物は、21mMトリス−HCl、104mM KCl、5.3Ｍ MgCl2、171μＭ β-NAD、11.4mM（NH4）2SO4、214μＭ dATP、642μＭ dCTP、214mM dGTP、214μＭ dTTP、４mM DTT、10μCi32P-dCTP（3000Ci/mmole）、15単位の大腸菌DNAリガーゼ、40単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ Boehringer社）および0.8単位RNアーゼＨで構成されていた。最終混合物を16℃にて150分間インキュベートした。二本鎖cDNAを平滑末端にするため、単位のT4 DNAポリメラーゼを添加し、反応をさらに15分間16℃で続けた。反応を停止させ、次いでcDNAを、フェノール／クロロホルムで抽出し次にクロロホルムで抽出し次いでタノールで沈澱させることによって精製した。
得られたcDNAにEcoRＩアダプター（Promega社）を連結し、次にメーカーが推奨する条件を用いてポリヌクレオチドキナーゼ（Amersham社）でキナーゼ処理を行った。酵素を熱によって変性させ（70℃で20分間加熱）、次いでDNAをフェノール／クロロホルムによる抽出およびエタノールによる沈澱で精製した。cDNAを、メーカーが推奨する条件を使用し、100μＬの反応容積中、50単位のXhoＩ（Boehringer社）で消化した。酵素を熱（70℃で20分間加熱）で失活させ、次いで上記cDNA消化物を、STE緩衝液（Sambrookら1989年）中で予め平衡化させたSephacryl S400スパンカラム（Pharmacia社）を通過させた。得られた溶出液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。４℃にて30分間微量遠心分離にかけた後、得られたcDNAペレットを70%（ｖ／ｖ）エタノールですすぎ、風乾し、次いで10μＬのTE緩衝液（10mMトリス−HCl、１mM EDTA pH7.5）に再懸濁させた。
上記cDNA懸濁液の１／４（2.5μＬ）を、50mMトリス−HCl（pH7.0）、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、１mM ATPおよび２単位のT4 DNAリガーゼからなる反応緩衝液５μＬ中で、λZAPI EcoRＩ／Xho Ｉ／CIAPで処理したベクター（Stratagene社）１μｇと連結した。その反応混合物を４℃で４日間インキュベートした。
室温で２時間インキュベートした後、連結反応混合物をPackagene system（Promega社）を用いてパッケージした。組換え体の総数は１×106個であった。大腸菌PLK-F′細胞にトランスフェクトした後、パッケージされたcDNAの１×１０６プラーク形成単位（pfu）を15cm直径プレートに１枚当り50,000pfuでプレートした。これらのプレートを37℃で８時間インキュベートし、次いで４℃にて一夜貯蔵した。ファージを、プレートからファージ貯蔵緩衝液（８mM MgSO4、１００mM NaCl、0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン、50mMトリス−HCl pH8.0）中に溶出させて増幅cDNAライブラリーストックを形成させた。
ジオキシゲナーゼオリゴヌクレオチドプライマーの設計
植物（Matsudaら1991年；Martinら1991年）、真菌および細菌（Cohenら1990年）のごとき多様な生物由来のいくつものジオキシゲナーゼ類の配列が決定されている。これらのすべての酵素の特徴は、配列が保存された小さな領域がいくつも存在していることである。いくつもの異なる植物ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列を、HigginsとSharp（1988年）の文献に記載されているCLUSTALプログラムを用いて一列に並べた。使用した配列は、Candi（Martinら1991年）、ヒヨスチアミン６β−ヒドロキシラーゼ（H6H）（Matsmaら1991年）、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（F3H）、Ｅ８（DeikmanおよびFisher1988年）、Ａ２（Menssenら1990年）およびTom13（Holdsworthら1987年）であった。この分析によって２個の良好に保存された領域が見出された。その領域を表５に示す。
オリゴヌクレオチドは共通配列に類似の配列をコードする遺伝子とハイブリッドを形成するよう設計した。これらの各オリゴヌクレオチドの配列は、オリゴ２〜６（配列番号：７〜11）と呼称し先に示してある。デオキシイノシン（Ｉ）を含有させて、二つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードする場合のコドン使用についての異なる可能性をカバーした。デオキシイノシンは、類似の効率で、Ａ，Ｔ，ＧおよびＣと塩基対を形成する（Martinら1985年；Ohtsukaら1985年）。
ペチュニアのジオキシゲナーゼ遺伝子のフラグメントのPCRによる増幅
Ba20（flfl）およびＶ26（FlFl）の段階３〜４の花から全RNAを単離した。25μｇの全RNAをエタノールで沈澱させ、ペレット化し次いで10.5μＬの水に再懸濁させた。１μＬ（0.5μｇ）のオリゴ１（配列番号：６）を添加し、得られた混合物を70℃で10分間加熱し次いで氷上に置いた。次に、４μＬ Superscript反応緩衝液（５×ストック）、２μＬの100mMジチオスレイトール、0.5μＬの５mM dATP、0.5μＬの５mM dCTP、0.5μＬの５mM dGTP、0.5μＬの５mM dTTPおよび0.5μＬの〔α−32Ｐ〕−dCTPを添加した。得られた混合物を37℃で２分間インキュベートした。１μＬ（200単位）のSuperscript逆転写酵素を添加し、反応混合物を37℃で60分間インキュベートし、次いで80μＬのSTEを添加して反応を終止させた。得られたcDNAをSephacryl S200スパンカラムクロマトグラフィにかけ次いでエタノールで沈澱させて精製し、100μＬのTE緩衝液に再懸濁させた。このcDNAをPCRの鋳型として用いた。
ペチュニアジオキシゲナーゼ遺伝子フラグメントを増幅するためのPCR反応混合物は、４μＬのcDNA、10mMトリス−HCl（pH8.3）、50mM KCl、２mM MgCl2、0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン、0.2mM各dNTP、0.4μＭ各プライマー、および1.25単位Taqポリメラーゼ（Cetus社）を含有していた。反応混合物（50μＬ）を、94℃で50秒間、42℃で１分間次いで72℃で１分間の処理を40回行った。各PCR 15μＬづつを1.25％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動させた。300〜500bpの大きさの範囲内のDNAフラグメントをNA-45膜上に集めた。そのDNAを上記の膜から溶出させ、次いでエタノールで沈澱させ、遠心分離によってペレット化し、25μＬのTE緩衝液中に再懸濁させた。各V26PCR由来のDNAフラグメント１μＬを集め、オリゴ標識化キット（BRESATEC）を用いて32Ｐで標識を付けた。Ba20PCR由来のDNAフラグメントに、類似の方式で標識を付けた。
ペチュニアの花弁のcDNAライブラリーからのジオキシゲナーゼ相同体の単離
16,000プラクの二つのリフトを、Ｖ26プローブまたはBa20プローブの５×105cpm／μＬとハイブリッドを形成させ次のように洗浄した。すなわち高ストリンジェンシー条件〔ハイブリッド形成：50％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、６×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS、42℃にて16時間および洗浄：２×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS、65℃にて２×15分間、続いて0.2×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS、65℃にて２×15分間〕を利用して姉妹クローンを検出した。14個のクローンがＶ26プローブとハイブリッドを形成したが、Ba20プローブとはハイブリッドを形成しなかった。別の12個のクローンは、Ｖ26プローブに対してBa20プローブよりも一層強くハイブリッドを形成した。
pBluescript中のプラスミドcDNAクローンは、ヘルパーファージR408（Stratagene社）を用いてλZAPIIクローンからレスキューした。
上記のクローンおよび他のクローンのDNA配列決定は、本質的に、Sequenase酵素（USB、バージョン2.1）を用い、Sangerら（1977年）の文献に記載の方法によって実施した。
実施例５−ノーザン分析
全RNAは、液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒により微粉末に粉砕した組織から単離した。４Ｍグアニジウムイソチオシアネート、50mMトリス−HCl（pH8.0）、20mM EDTA、0.1％（ｖ／ｖ）Sarkosylからなる抽出緩衝液を上記組織に添加し、その混合物を、最高速度でポリトロン（poltron）を用いて１分間ホモジナイズした。その懸濁液をMiracloth（Calbiochem社）で濾過し、次にJA20ロータで10分間、10,000rpmで遠心分離にかけた。上澄み液を集め、0.2ｇ／mL CsCl（ｗ／ｖ）にした。次に、試料を、38.5mLのQuic−シール遠心分離管（Beckman社）中に入れた5.7Ｍ CsCl、50mM EDTA（pH7.0）からなるクッション液10mL上に重層し、次いで70Tiロータ内で25℃にて16時間、42000rpmで遠心分離を行った。ペレットを、TE／SDS〔10mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA、0.1％（ｗ／ｖ）SDS〕中に再懸濁し、10mM EDTA（pH7.5）中に飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出した。エタノールで沈澱した後、RNAのペレットをTE／SDS中に再懸濁させた。
20mMモルホリノプロパンスルホン酸（pH7.0）、5mM酢酸ナトリウム、0.1mM EDTA（pH8.0）を含有する泳動緩衝液を用い、2.2Ｍホルムアルデヒド／1.2％（ｗ／ｖ）アガロースゲルによって、RNA試料（20μｇ）の電気泳動を実施した。そのRNAを、メーカーが推奨するようにして、Hybond-N膜（Amersham社）に移し、次いで32Ｐで標識を付けた0.9kbのEcoRＩ−XhoＩ pDIOXC3cDNAフラグメント（108cpm／μｇ、２×106cpm／μＬ）でプローブした。プレハイブリダイゼーション（42℃で１時間）およびハイブリッド形成（42℃で16時間）を、50％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１Ｍ NaCl、１％（ｗ／ｖ）SDS、10％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸中で実施した。分解サケ***DNA（100μｇ／ｍＬ）を、ハイブリッド形成ステップにおいて、32Ｐで標識したプローブとともに添加した。フィルターを、２×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS内で65℃にて１〜２時間次いで0.2×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS内で65℃にて30〜60分間洗浄した。フィルターを増感スクリーン付きKodak XARフィルムに−70℃で48時間暴露した（図２）。
RNAゲルブロット分析の結果、cDNAクローンpDIOXC3に対応する遺伝子は、花の発育段階１の期間中に最高レベルで発現され次いで低下したことが明らかになった。その発現のパターンはペチュニアの花におけるFLS酵素の活性のパターン（Forkmannら1986年）に類似している。
実施例６−pDIOXC3のRFLP地図作成
ペチュニア・ハイブリダには、FLSの活性を制御する一つの遺伝子座Flがある。したがって、Fl遺伝子座がFLSの構造遺伝子をコードしているならば、ペチュニア・ハイブリダのFLSをコードするcDNAクローンはFl遺伝子座に対して位置づけられていると予想された。Flはペチュニア・ハイブリダのゲノムの染色体IIにマッピングされて、PAc1遺伝子の２％組換えの範囲で連結される（Cornuら1990年）。同系繁殖系のＶ23（FlFl）およびＲ51（flfl）間の交雑種由来の植物のＦ2集団から単離されたDNAのRFLP分析を利用して、各種のジオキシゲナーゼ相同体の連鎖のデータを得た。
ゲノムDNAの単離
特にDellaportaら（1983年）の文献に記載されているのと同様にして、DNAをＶ23×R51F2植物の葉の組織から単離した。そのDNAの標品をさらにCsCl浮遊密度遠心分離法（Sambrookら1989年）によって精製した。
サザーンブロット
ゲノムDNA（10μｇ）を、60単位のXbaＩで16時間消化し、次いで泳動緩衝液のTAE（40mMトリス−アセテート、50mM EDTA）中0.7％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルによって電気泳動を行った。そのDNAを変性溶液（1.5Ｍ NaCl／0.5Ｍ NaOH）中で１〜1.5時間変性し、0.5Ｍトリス−HCl（pH7.5）／1.5Ｍ NaCl中で２時間中和し、次いでDNAをHybond-N（Amersham社）フィルター（20×SSC）に移した。
DNAフラグメント（50〜100ng）に、オリゴラベリングキット（Bresatec社）を用いて50μCiの〔α−32Ｐ〕−dCTPで放射能標識した。取りこまれなかった〔α−32Ｐ〕−dCTPをセファデックスG-50（Fine）カラムのクロマトグラフィで除去した。PAc1プローブを、pPAc1の2.7kbのHindIII／BamHＩフラグメントから合成した（BairdおよびMeagher 1987年）。pDIOXC3cDNAプローブをpDIOXC3の0.9kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントから合成した。
XbaＩで消化したゲノムDNAの二つのサザーンブロットを、pDIOXC3プローブまたはPAc1プローブとハイブリッドを形成させてRFLPのパターンを検出した。分析された42の植物のうち40については、PAc1についてのＶ23，VRおよびＲ51のRFLPパターンとpDIOXC3の対応するRFLPパターンとの同時分離（co-segregation）があったが、これは対応する遺伝子が密接に連鎖していることを示している（4.7％組換え）。
これらのデータは、pDIOXC3に対応する遺伝子がFl遺伝子座に連結しているという強力な証拠を与えた。この連結およびノーザン分析の結果は、pDIOXC3cDNAがFLSをコードしているかもしれないという状況証拠を与えた。
実施例７−pDIOXC3の全長姉妹cDNAクローンの単離
予備的な配列分析の結果、pDIOXC3は対応する転写物の全長のクローンを示さなかったことが分かった。pDIOXC3の全長体を得るため、cDNAライブラリーからの約20,000個の組換え体を、pDIOXC3由来の0.9kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントとハイブリッドを形成したクローンについて選別した。６個のクローンが強いハイブリッド形成シグナルを発したので以後の分析用に選択した。いくつものクローンが、cDNA挿入断片とmRNAとの大きさが一致していることに基づいて全長であるようである。これらのクローンのうちの一つからのcDNA挿入断片の完全配列（pCGP481と命名）を、標準のクローニング法（Sambrookら1989年）を用いて得た異なるpBluescriptサブクローンから配列を並べることによって決定した。いくつかの領域については、オーバーラップ配列のデータを得るため特定のオリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ７〜９；S配列番号：12〜14）を合成する必要があった。pCGP481の完全ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列をS配列番号：１に示す。
実施例８−酵母中でのPCGP481cDNAの発現
酵母発現ベクターpYGA22mの構築
M13-mp18をEcoRＩとBglIIで消化して、マルチクローニング部位を有する700bpのフラグメントを製造した。このフラグメントをpYGA2269由来の９kbのEcoRＩ−BglII−フラグメントと連結した（Ashikariら1989年）。得られた構築物（pYGA22mと命名）は、酵母グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターの下流に挿入されたマルチクローニング部位を含有していた。
pCGP631の構築
pCGP481由来の完全cDNA挿入断片を含有する1.3kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントを、pYGA22m由来の９kbのEcoRＩ／SalＩフラグメントと連結した。得られたプラスミド〔pCGP631と命名（図４）〕は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの後にセンス配向で連結したpCGP481cDNAフラグメントを含有していた。
酵母の形質転換
酵母株G-1315（Matα，typ1）（Ashikaraら1989年）を、Itoら（1983年）の文献にしたがってpCGP631で形質転換した。その形質転換体を、G-1315をトリプトファン栄養要求性を回復するそれらの能力によって選択した。
FLS活性の検定を行うための酵母抽出物の製造
G-1315／pCGP631の単一単離物およびトリプトファンを欠いた培地で増殖したG-1315の復帰変異体を用いて、10mLのYNBS｛1.2％（ｗ／ｖ）のアミノ酸なしのイーストナイトロジェンベース（Difco社）および0.3％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Difco社）｝に接種し、次いで振盪して２日間30℃でインキュベートした。
酵母細胞を遠心分離によって収穫し、TE緩衝液で一回洗浄し、チモリアーゼ（zymolyse）（0.1mg／mL）（生化学工業、日本）を含有する緩衝液Ｂ（10mMトリス−HCl（pH7.5）、1.2Ｍソルビトール、0.1mM DTT、0.1mM EDTA）100μＬ中に再懸濁させ、次いで30℃に１時間保持した。スフェロプラストを遠心分離で集めて、1mM ２−メルカプトエタノールおよび１mM PMSFを含有する0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）500μＬ中に再懸濁させた。その懸濁液をガラスビーズ（直径＝0.4mm）とともに激しく振とうさせた。遠心分離を行った後、上澄み液を粗抽出液として使用した。
酵母の酵素抽出物のFLS検定
FLS活性を、改変したForkmannら（1986年）の方法で測定した。反応液は、合計200μＬ中に、0.1Ｍリン酸カリウム（pH7.0）、1.4mM ２−メルカプトエタノール、250μＭ ２−オキソグルタレート、５mMアスコルビン酸、50μＭ硫酸第一鉄、5000cpmの14Ｃ-DHQおよび40μＬの粗抽出液を含有していた。インキュベーションは30℃で10分間または１時間行った。その混合物を500μＬの酢酸エチルで直ちに抽出し、次に標識していないDHQとケルセチンとともに、Forestal（酢酸：HCl：水＝30：３：10）を用い、セルロースプレート（Merck Art 5577、ドイツ）のクロマトグラフィーに付した。オートラジオグラフィーによって放射能の位置を求めた。G-1315／pCGP631から調製した酵素抽出物はFLS活性を有することを示したが、形質転換されていない酵母から調製した同等画分はFLS活性が全くなかった（図５）。
酵母の発現結果から、pCGP481由来のcDNA挿入断片がFLS酵素をコードしていることが確認された。Forkmannら（1986年）の文献には二つの酵素の２−ヒドロキシラーゼとデヒドラターゼがジヒドロフラボノール類をフラボノール類に変換するのに必要であると示唆されている。しかし、上記の試験結果は、ペチュニアFLSのcDNAクローンによってコードされている酵素の酵母内での発現は上記の変換を行うのに充分であり、このことは、ジヒドロフラボノール類をフラボノール類に変換するのに１種の酵素しか必要でないことを示唆している。
実施例９−形質転換植物内でのフラボノールとアントシアニンの合成の操作
バイナリー構築物
pCGP293（Bruglieraら1993年）由来のマルチプルクローニング部位のXbaＩ−KpnＩフラグメントを、XbaＩ，BamHＩ，ApaＩおよびAsp718に対する部位を含有する合成ポリリンカーで置換することによって、バイナリー発現ベクターpCGP478を構築した。この合成ポリリンカーは二つのオリゴヌクレオチドのオリゴ10とオリゴ11（配列番号：15と16）をアニールすることによって製造した。pCGP478のMACプロモーターとmasターミネーターの間のこれら制限酵素部位の順序によって、方向性λZAPIIクローン由来のcDNA挿入断片のアンチセンス配向での直接クローニングが容易になる。
pCGP481由来の完全cDNAを含有する1.2kbのXbaＩ／Asp718フラグメントを、pCGP478のMACプロモーターとmasターミネーターの間に、アンチセンス配向でクローン化してpCGP479を創製した。Gynheungら1988年の文献に記載の方法を用いて、プラスミドpCGP479をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株AGLO（Lazoら1991年）中に導入した。pCGP479を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mLのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。
pCGP481由来のcDNAを含有する1.2kbのXbaＩ／Asp718フラグメントを、pCGP293のMACプロモーターとmasターミネーターの間にセンス配向でクローン化してpCGP482を創製した。このプラスミドpCGP482を、Gynheungら（1988年）の文献に記載の方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株AGLO（Lazoら1991年）中に導入した。pCGP482を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mLのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。
形質転換植物の産生
Horshら（1985年）の文献に記載の方法を用い、葉のディスクをAGLO/pCGP479と共生培養することによって、ペチュニアcv．VR（Flfl）植物を形質転換した。形質転換植物を成長させて開花させ、形質転換されていないVRの花と比較して変化した花色を評価した。12の形質転換植物のうち４が、形質転換されていない対照植物より赤味が多い花を産生した。形質転換ペチュニアの花色の変化以外に、FLScDNAのアンチセンス発現の他の影響は全く観察されなかった。
Horschら（1985年）の文献に記載の方法を用い、葉のディスクをAGLO／pCGP482と共生培養することによって、ペチュニアcv Old Glory Blue植物を形質転換した。形質転換植物を成長させて開花させ、形質転換されていないOld Glory Blueの花と比べて変化した花色を評価した。15の形質転換植物のうち３が形質転換されていない対照植物より赤味が多い花を産生した。形質転換されていないOld Glory Blueの花は一般にブルーバイオレット色であるが、pCGP482で形質転換されたOld Glory Blueの花の色はブルーバイオレットからパープルの範囲の色であった。
Horschら（1985年）の文献に記載の方法を用い、葉のディスクをAGLO／pCGP479と共生培養することによって、タバコ植物〔ニコチアナ・タバカムcv．キサンシ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）〕を形質転換した。タバコの花は通常うすいピンク色であり、花冠のリムに低いレベルのシアニジン誘導体を産生する。タバコをアンチセンスFLS遺伝子構造体で形質転換すると、フラボノールの産生の減少が起こって赤色の花を産生するようになった。赤色の発色は花系でも増大した。この赤色の花色は、花冠のリム内のアントシアニンの産生が３倍増大したためであった。
観察された色の変化は、下記表６に示すようにthe Royal Horticultural Society's Colour Chartの数値によって示す。
しかし、他の生化学的および生理学的条件が個々の結果に影響を与えるので、FLSのセンスおよびアンチセンスの構造体の形質転換植物内での発現によって達成された特定の色の変化を引用しても、観察しうる色の変化の可能な範囲を限定すると解すべきではないことに留意しなければならない。
花由来のフラボノイド類の抽出と分析
１個の花冠を１mLの２Ｍ HCl中で30分間煮沸し次いでフラボノイド類を150μＬの酢酸エチルで抽出することによって、フラボノールアグリコン類をペチュニアの花から単離した。薄層クロマトグラフィー（TLC）を行うために、４μＬの酢酸エチル抽出液および４μＬのフラボノール標品（ケンフェロール、ケルセチンおよびミリセチン）をTLCプレートに塗布し、上記のようにして展開させた。フラボノール類は、アンモニアで燻蒸した後紫外線下で目視可能になった。
ペチュニアVRおよびペチュニアVR／pCGP479の花から抽出したフラボノール類を薄層クロマトグラフィーで分析した。VR／pCGP479の赤色の花は、フラボノール類の産生が形質転換されていないVRの花より著しく少なかった。pCGP479で形質転換されたタバコ植物由来の花を同様に分析した結果、フラボノール含有量が減少していることが見出された。
0.5％HClを含むメタノール溶液を用いて、ペチュニアとタバコの花からアントシアニン類を抽出した。アントシアニン類の濃度は、Gerats（1985年）の文献に記載されているようにして、抽出液のＡ530測定値から推定した。
実施例10−ニコチアナ属の植物からのcDNA相同体の単離
ニコチアナ・アラータ（Nicotiana alata）のcDNAライブラリーの構築と選択
ベクターλZAPのcDNAライブラリーを、Chenら（1992年）の文献に記載されているようにして、S6S6ニコチアナ・アラータの花柱から単離したRNAから単離した。
６×SSC、35％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１％（ｗ／ｖ）SDS中、42℃で16時間加熱することによって、約36,000個のcDNAクローンを32Ｐ標識化pCGP481cDNAフラグメントとハイブリッドを形成した。これらのフィルターを、２×SSC、１％SDS中65℃の中位のストリンジェンシー条件下で洗浄し次いでオートラジオグラフにかけた。ハイブリッドを形成しているプラークを取出してPSB中に入れてファージを溶出させた。一本鎖ヘルパーファージVCSM13（Stratagene社）を用いて８個のプラスミドクローンをレスキューした。最大のcDNA挿入断片を含有するクローンのpCGP489は、配列が決定され（配列番号：２）、ペチュニアFLSの遺伝子配列に対してヌクレオチドレベルで88％の類似性を示し、そしてpCGP481でコードされたペチュニアFLS配列に対して241個のアミノ酸にわたって91％の類似性を示した。
ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）cDNAライブラリーの構築と選択
ベクターλZAPIIのcDNAライブラリーをChenら（1992年）の文献に記載されている方法を用いてニコチアナ・シルベストリスの花柱から単離したRNAから製造した。
低ストリンジェンシーハイブリッド形成緩衝液（６×SSC、35％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１％（ｗ／ｖ）SDS）中、16時間42℃にて、約120,000個のcDNAクローンを32Ｐで標識をつけたpCGP481cDNAフラグメントとハイブリッドを形成させた。それらのフィルターを２×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS中65℃で洗浄し、次いでオートラジオグラフにかけた。ハイブリッドを形成するプラークを取り出してPSBに入れてファージを溶出させた。３個のプラスミドクローンを、一本鎖ヘルパーファージVCSM13を用いてレスキューした。最大のcDNA挿入断片を含有するクローンであるpCGP490は、配列が決定され（配列番号：３）、ペチュニアFLS遺伝子配列に対してヌクレオチドレベルで84％の類似性を示しそしてpCGP481でコードされたペチュニアFLS配列に対し、45個のアミノ酸配列にわたって93％の類似性を示した。
二つのニコチアナcDNAクローン：pCGP489（配列番号：２）およびpCGP490（配列番号：３）のアミノ酸配列を、ペチュニアFLScDNAクローン（配列番号：１）のアミノ酸配列と比べて下記の表７に示す。
TurpenおよびGriffith（1986年）の文献に記載の方法を用い、ディー・カリオフィルスcv. ラグナ（D.Caryophyllus cv. Laguna）の段階３の花の花弁の組織から全RNAを単離した。メーカーのプロトコルにしたがってOligotex dT-30（Takana、日本）によって、上記全RNAからポリ（A）+RNAを選択した。
cDNAを作製し、ペチュニアライブラリーについて用いたプロトコルにしたがってライブラリーをλZAPII中に構築した。
一次ライブラリー（150,000pfuを含有していた）を、大腸菌SURE細胞にトランスフェクトした後、37,500pfu／15cm直径プレートでプレートした。これらのプレートを37℃で８時間インキュベートし次いで４℃で一夜貯蔵した。ファージを、プレートから、ファージ貯蔵緩衝液（８mM MgSO4、100mM NaCl、0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン、50mMトリス−HCl、pH8.0）中に溶出させて、増幅されたcDNAライブラリーストックを形成させた。
ダイアンサスcDNAライブラリーからのFLS相同体の単離
合計100,000のプラークを、２回、32Ｐで標識を付けた1.1kbのEcoRＩ−HindII pDIOXC3cDNAフラグメント（５×105cpm／μＬ）で選択した。ハイブリッド形成は低ストリンジェンシー緩衝液〔６×SSC、0.5％（ｗ／ｖ）SDS、５×デンハート溶液、0.01Ｍ EDTA、100μｇ／mL〕中42℃で16時間行った。それらのフィルターを２×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中65℃で洗浄し次にオートラジオグラフにかけた。ハイブリッドを形成したcDNAクローンを一本鎖ヘルパーファージExassist（Stratagene社）を用い、メーカーの指示にしたがってλZAPIIからレスキューした。
配列決定後、単離されたクローンのうちの一つのpCGP777（配列番号：４）は、pCGP481がコードするペチュニアFLSの配列に対してヌクレオチドおよびアミノ酸の両方のレベルで65％の類似性を示した。
実施例12−クリサンセマム属植物からのcDNA相同体の単離
クリサンセマム属植物のcDNAライブラリーの構築
やはりTurpenおよびGriffith（1986年）の文献記載の方法を用い、クリサンセマム・モリホリウムcv. ダークピンクポンポン（参照番号5999）の段階２と３の花の花弁組織から全RNAを単離した。cDNA合成の鋳型として30μｇの量の全RNAを使用した。
分画と連結を行い、続いてcDNA反応混合物をPackagene system（Promega社）を用いてパッケージした。未増幅ライブラリーのタイターは3.7×104pfu／mLであった。
クリサンセマム属植物cDNAライブラリーからのFLS相同体の単離
上記のパッケージされたcDNAの90,000pfu（増幅されたライブラリー；2.6×107pfu／mL）を、XL1-Blue細胞にトランスフェクトした後、10,000pfu／15cm直径プレートでプレートした。これらのプレートを37℃で一夜インキュベートし次いで４℃で貯蔵した。Colony／Plaque Screen（登録商標）（Dupont社）上にプラークを写し取り、メーカーが推奨するとおりに処理し、次に32Ｐで標識を付けたEcoRＩ−XhoＩ pCGP481cDNAフラグメントで選別した。ハイブリッド形成を、低ストリンジェンシー緩衝液〔６×SSC、1.0％（ｗ／ｖ）SDS、20％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）中、42℃にて16時間行った。それらフィルターを、２×SSC／１％SDS中、65℃で30分間づつ２回洗浄し次いでオートラジオグラフにかけた。
単離されたクローンpCGP874（配列番号：５）は、配列決定により、pCGP481がコードするペチュニアFLS配列に対し、ヌクレオチドレベルで70％の類似性を示し、そしてアミノ酸レベルで72％の類似性を示した。
実施例13−pCGP874cDNAの酵母中での発現
酵母の発現ベクターpYGA22mおよびpCGP492の構築
酵母発現ベクターpYGA22mを、上記実施例８に記載されているようにして構築した。pCGP874由来の完全cDNA挿入断片を含有する1.3kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントを、前記pCGP631を構築したときと同じ方式で、pYGA22m由来の９kbのEcoRＩ／SalＩフラグメントと連結し、それを図４に示す。得られたプラスミド（pCGP492と命名）は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの後にセンス配向で連結されたpCGP874cDNAフラグメントを含有していた。
酵母の形質転換とFLS活性の検定
酵母の形質転換と、FLS活性の検定するのに用いる抽出物の調製は実施例８にすでに記載したようにして実施した。FLSの活性は、やはり、標識されていないDHKとDHQを基質として用い、改変したForkmannら（1986年）の方法で実施した。その試験結果によって、pCGP874 cDNAがキクの機能的FLS酵素をコードしていることが確認された。
当該技術分野の当業者は、本願に記載された発明は、具体的に記載された発明以外に変形と改変を行うことができることが分かるであろう。本発明にはこのような変形と改変がすべて含まれると解すべきである。また本発明には、本明細書に、個々にもしくはまとめて引用もしくは提示されたステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、ならびに前記ステップまたは特徴の二つ以上を組合わせたもののすべてが含まれる。
引用文献
配列の一覧表
（１）一般情報：
（ii）発明の名称：フラボノールシンターゼ酵素をコードする遺伝子配列およびその用途
（iii）配列の数：16
（iv）通信の宛先：
（Ａ）受信者：ディビズ・コリソン・ケイブ
（Ｂ）ストリート：リトル・コリンズ・ストリート １
（Ｃ）市：メルボルン
（Ｄ）州：ビクトリア
（Ｅ）国：オーストラリア
（Ｆ）ZIP：3000
（ｖ）コンピュータが読み取り可能な形態：
（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：IBM PC compatible
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC-DOS／MS-DOS
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：オーストラリア国際特許願
（Ｂ）出願日：1993年８月５日
（Ｃ）分 類：
（viii）弁護士／弁理士の情報：
（Ａ）氏名：スラッタリー，ジョン エム．
（Ｂ）参照／名簿番号：EJH／JMS／EK
（ix）電気通信の情報：
（Ａ）電話：61 3 254 2777
（Ｂ）テレファックス：61 3 254 2770
（Ｃ）テレックス：AA 31787
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1211個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：59..1101
（xi）配列の記載：配列番号：１：
（２）配列番号：２に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：890個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：３．．７２５
（xi）配列の記載：配列番号：２：
（２）配列番号：３に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：236個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：1..135
（xi）配列の記載：配列番号：３：
（２）配列番号：４に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：1236個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：70..1068
（xi）配列の記載：配列番号：４：
（２）配列番号：５に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：1250個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：11..1065
（xi）配列の記載：配列番号：５：
（２）配列番号：６に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：45個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：６：
（２）配列番号：７に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：26個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：７：
（２）配列番号：８に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：19個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：８：
（２）配列番号：９に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：26個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：９：
（２）配列番号：10に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：10：
（２）配列番号：11に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：11：
（２）配列番号：12に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：12：
（２）配列番号：13に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：18個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：13：
（２）配列番号：14に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：19個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：14：
（２）配列番号：15に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：18個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：15：
（２）配列番号：16に関する情報：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：34個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：16：
本明細書において以後引用する刊行物の書誌的詳細は本明細書の詳細な説明の後にまとめてある。ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列について本明細書に引用する配列番号は上記書誌事項の後に示す。
花卉産業界は顕花植物の新しい異なる品種の開発に懸命に努力している。このような新規な品種を創製するのに有効な方法は花色を操作することによる方法であるが、伝統的な育種法を用いて、花の実用品種の大部分については高範囲の色が産生され、ある程度成功している。しかし伝統的な方法は、特定の種の遺伝子給源が制約されているため制限があり、またこの理由によって、単一の種が全スペクトルの着色品種をもっていることはまれである。例えばバラ、キク、カーネーション、ユリ、チューリップおよびガーベラのような主な切花の種のブルー色の品種が開発されれば、切花と観賞花卉の両方の市場に大きな機会を提供するであろう。
花および植物の他の部分の色は、主として２種の色素：フラボノイド類およびカロテノイド類に基づいている。フラボノイド類は最も普通でかつ最も重要な花の色素である。花色に関連する最も重要なクラスのフラボノイド類はアントシアニン類、フラボノール類およびフラボン類である。アントシアニン類は、シアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジンおよびペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であり、液胞内に局在している。
花色に対する一つの重要な因子は、タンニン類およびある種のフラボンとフラボノールのグリコシドと、アントシニアニン類とのコピグメント化である（Scott-Moncrieff 1936年）。ある範囲のpH値にわたって比較すると、コピグメント化したアントシアニン類は、通常の色素より青味が多いことが常にみとめられる。またアントシアニン類とフラボノールグリコシド類のコピグメント化は果物の色の発生に重要な場合がある（Yoshitamaら1992年）。アントシアニン：コピグメントのモル比も色に強い影響を与えることがある。フラボノールのアグリコン類が花粉の発育と花粉管の発育にとって不可欠であるということが最近実証されている（Moら1992年）。したがってフラボノール類のようなコピグメントの植物内での産生を制御する性能は、花色を変化させたり植物の稔性を操作するのに有用な用途になるであろう。
アントシアニン色素類の生合成経路は充分に確立されている（Ebe1およびHah1brock 1988年；Hah1brockおよびGrisebach 1979年；Wieringおよびde Vlaming 1984；Schramら1984年；Stafford 1990年）。この経路で最初に行われるステップには、３分子のマロニル−CoAと１分子のρ−クマロイル−CoAの縮合反応が含まれている。この反応は酵素のカルコンシンターゼによって触媒される。この反応の生成物である２′，４，４，６−テスラヒドロキシカルコンは通常、酵素のカルコンフラバノンイソメラーゼによって急速に異性化されてナリンゲニンを生成する。ナリンゲニンは次いでフラバノン３−ヒドロキシラーゼによって中央リングの３位がヒドロキシル化されてジヒヒドロケンフェロール（DHK）を産生する。ジヒドロケンフェロールのβリングは、３′位または３′位と５′位の両者をそれぞれヒドロキシル化されてジヒドロケルセチン（DHQ）およびジヒドロミリセチン（DHM）を生成することができる。DHK，DHQおよびDHMは、少なくとも２種の酵素（ジヒドロフラボノール−４−レダクターゼおよびフラボノイド−３−グルコシルトランスフェラーゼ）の作用によって、有色アントシアニン類（ペラルゴニジン−３−グルコシド、シアニジン−３−グルコシドおよびデルフィニジン−３−グルコシド）に変換することができる。
ケンフェロール（Ｋ）、ケルセチン（Ｑ）およびミリセチン（Ｍ）のようなフラボノール類は、図１に示すように、ジヒドロフラボノール類のＣ−２とＣ−３の間に二重結合を導入することによって製造することができる（Forkmann 1991年）。フラボノール類はグリコシル化された形態で蓄積することが多くまたメチル化されることがある。メチル化反応はグリコシル化反応の前後で行うことができる。ジヒドロフラボノール類はフラボノール類への試験管内での変換は、パセリの細胞培養物由来の酵素製剤中に初めて観察された（Britschら1981年）。またフラボノールシンターゼ活性は、マチオラ（Matthiora）属の植物（SpribilleおよびForkmann 1984年）、ペチュニア（Petunia）属の植物（Forkmannら1986年）およびダイアンサス（Dianthus）属の植物（Forkmann 1991年）由来の花の抽出物中に検出されている。フラボノールシンターゼの酵素活性は、２−オキソグルタレート、アスコルベートおよび第一鉄イオンが補因子として必要である。ペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida）の花では遺伝子座Flがフラボノール類の生成を制御している。すなわちフラボノールの合成は、この遺伝子に対してホモの劣性な変異体では大きく減少する（Wieringら1979年；Forkmannら1986年）。ペチュニア由来のフラボノールシンターゼによる試験管内酵素検定の結果は、DHKとDHQはそれぞれのフラボノールに容易に変換したがDHMは変換しにくい基質であった。顕花植物中のフラボノールシンターゼ活性を制御する性能は、フラボノールの産生を変化させて、単一の種がより広範囲の花色を発現できるようにすることによって、花弁の色を操作する手段を提供するであろう。先に述べたように、フラボノールの産生を制御する性能は、雄性稔性（male ferlitity）にも関連がある。このような制御は固有酵素（indigenous enzyme）の産生レベルを調節するかまたは非固有酵素を導入することによって行うことができる。
本願で“固有”酵素という用語を用いる場合、特定の細胞にとって固有であるか（native）または特定の細胞内で自然に発現される酵素を意味する。“非固有”酵素（“non-indigenous” enzyme）は細胞にとって固有でない酵素であるが植物の植物内に例えば導入遺伝子によって遺伝物質を導入することによって発現される酵素を意味する。“内因性”酵素（“endogenous” enzyme）は、細胞によって産生される酵素であるか、その細胞に対して固有であるがもしくは固有でない酵素である。
本発明によって、フラボノールシンターゼ（以後“FLS”と呼ぶ）をコードする遺伝子配列が同定され、いくつかの起源からクローン化され、そして形質転換植物を生成させるのに使用された。またこれらの組換え配列はフラボノール産生のレベルを調節することが可能で、その結果花弁の色と雄性稔性を操作する手段を提供する。またこれらの組換え配列は、DHKの代謝ならびにDHQおよびDHMのような他の基質の代謝を調節することができる。DHK，DHQおよびDHMは着色アントシアニン類の前駆物質であるから、FLSの配列の発現によってこれら前駆物質の濃度を調節することは花色を操作する他の手段になる。
したがって、本発明の一つの態様は、植物のFLS、または前記FLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体をコードするヌクレオチドの配列；または植物のFLS、またはそのFLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体をコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる単離された核酸分子を提供する。“FLS”という用語には、FLS活性を有するポリペプチド類とタンパク質類、ならびにこのようなポリペプチド類とタンパク質類の変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体または類似体でFLS活性を有するものが含まれる。またFLS活性を有する分子は、FLS活性を有するポリペプチドもしくはタンパク質と外来性のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質との融合ポリペプチドもしくは融合タンパク質でもよい。
“単離された核酸分子”という用語は、本願で用いる場合、自然には存在しない状態の遺伝子配列を含むことを意味する。一般に、この用語はその自然の状態からかけはなれているか、またはその自然環境では必ずしも遭遇しない方法で形成されていることを意味する。さらに具体的に述べると、この用語には、ゲノムDNAのフラグメント、組換えもしくは合成の分子、および本発明の遺伝子配列と融合されたかまた作動可能に連結された非相同の核酸ような非同相同核酸と組合わせた核酸を含めて、試験管内で形成されるかまたは維持される核酸分子が含まれる。
また“単離された核酸分子”という用語には、FLSまたはFLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体を、そのプロモーターもしくは他のプロモーターに対して逆の配向でコードするゲノムDNAもしくはゲノムcDNAまたはその一部分を含む。またこの用語にはさらに、他の核酸配列に対して少なくとも部分的に精製された天然に存在する配列が含まれる。本願で用いられる“単離された核酸分子”という用語には、“核酸単離物”（“nucleic acid isolate”）と同じ意味を有すると解される。
“遺伝子配列”という用語は、本願では最も一般的な意味で用いられ、FLS活性を有するポリペプチドまたはタンパク質を含むFLS分子を含んでいるアミノ酸の配列を、直接にまたは塩基の相補鎖によって指定するヌクレオチド塩基のつながりを含んでいる。アミノ酸のこのような配列は、例えば配列番号：１もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５に示すような全長のFLS、またはその末端を切り取った活性の形態、またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体を構成している。あるいはこのアミノ酸配列は、例えばこれらの配列の一部、または配列番号：２もしくは配列番号：３に示す配列のすべてもしくは一部を含んでいてもよい。
本発明の他の態様は、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列類似性が少なくとも50％である、
ヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子を提供するものである。
さらに詳しくは本発明は、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列に対するヌクレオチド配列類似性が少なくとも65〜75％である、
ヌクレオチドの配列を含んでなる単離されたDNA分子に関する。
好ましい類似性のパーセント値としては80％，85％，90％，92〜95％，96〜98％および99〜100％がある。上記の類似性のパーセント値は、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示す配列と、他の遺伝子配列を全体にわたって比較することを想定しているが、比較される分子のなかの特定の領域の類似性が50％より低いことがあることは明らかである。この点について、本発明はさらに、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示す配列の一つ以上の領域に対するヌクレオチド配列類似性が少なくとも50〜75％である、
ヌクレオチドの配列を含んでなる核配分子および特にDNA分子として定義される。
また本発明において目的とする核酸配列には、遺伝子プローブとしてまたは植物内で対応する遺伝子の発現を調節できる“アンチセンス”分子として有用なオリゴヌクレオチドが含まれる。また本発明で用いられる“アンチセンス分子”には、構造のゲノム遺伝子もしくはcDNA遺伝子またはその一部分を、それのプロモーターもしくは他のプロモーターに対して逆の配向で含んでなる遺伝子構築物が含まれる。
本発明のこの態様によって、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列を有する分子の一部もしくは領域に実質的に類似しているかまたは相補的な５〜50個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドが提供される。上記文言中の“実質的に類似しているかまたは相補的な”という用語は、以下に定義するように、低いストリンジェンシー条件下、あるいは好ましくは中位のストリンジェンシー条件下、あるいは最も好ましくは高いストリンジェンシー条件下でハイブリッドを形成しうる類似性を有することを意味する。このようなオリゴヌクレオチドは、例えばFLSの遺伝子の配列を各種の起源から選別する場合とか、または形質転換植物に導入された遺伝子配列を監視するのに有用である。またかようなオリゴヌクレオチドは一般にプライマーもしくはプローブの形態である。好ましくは本発明のオリゴヌクレオチドはFLSの保存遺伝子配列、または植物の属、植物の種および１または植物の系統もしくは変種内に保存された配列に関する。
本発明の一つの態様では、オリゴヌクレオチドはFLS遺伝子配列の５′末端もしくは３′末端に相当する。便宜上、本発明では、５′末端は構造遺伝子の開始コドンと該遺伝子の中央部分の間の領域を実質的に形成しているとみなし、３′末端は構造遺伝子の中央部分と該遺伝子の終止コドンの間の領域を実質的に形成しているとみなす。それ故、オリゴヌクレオチドは、５′末端もしくは３′末端、または５′末端と３′末端の両者に共通の領域とハイブリッドを形成できることは明らかである。本発明にはこのようなオリゴヌクレオチドがすべて含まれる。
本発明の一つの実施態様において、FLSをコードする核酸配列またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体は、例えばコサプレッション（米国特許第5,034,323号）を用いることによって、固有FLS活性を低下させるのに使用できる。あるいは、この酵素をコードする核酸配列またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体は、固有FLS活性を低下させるためアンチセンス配向で用いられる。本発明は一つの理論で限定したくないが、アンチセンスFLS転写物またはそのフラグメントもしくは一部分（例えばオリゴヌクレオチド分子）は、上記酵素に対して指定された自然に存在するmRNAのすべてもしくは一部分と二重らせんを形成して、活性酵素の蓄積またはmRNAから活性酵素への翻訳を妨害する。
他の変形では、標的の核酸配列を不活性化するのにリボザイム類を使用できる。リボザイム類についてはHaseloffおよびGerlach（1988年）の文献に充分に報告されている。この実施態様では、そのリボザイムは好ましくはハイブリッド形成部分と触媒部分を含んでなり、そのハイブリッド形成部分は、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すのと実質的に同じヌクレオチド配列を有する遺伝子由来のmRNA転写物とハイブリッドを形成できる一つの好ましくは二つのヌクレオチドアームをもっている。
別の実施態様では、FLSをコードする核酸配列またはその機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体もしくは類似体は、固有FLS活性を通常の内因的もしくは既存のレベルより上方に上昇させるため、または活性の通常の内因的もしくは既存のレベルが無視しうるレベルかもしくはゼロの場合にFLS活性を与えるために用いられる。
本発明においてFLSの活性の変更とは、活性の通常の内因的もしくは既存のレベルの上下に、活性を、30％以上、もしくは好ましくは30〜50％、もしくはさらに好ましくは50〜75％、もしくはさらに一層好ましくは75％以上増減させることを意味する。このような増減をFLS酵素活性の“調節”と呼称する。
一般に調節は、FLS遺伝子配列の転写もしくは翻訳のレベルについて行われる。活性のレベルはForkmannら（1986年）の文献に記載の方法の改変法を用いて検定することができる。
本発明の核酸は、リボ核酸類もしくはデオキシリボ核酸類、一本鎖もしくは共有結合で閉環された環状分子でもよい。
本発明の核酸分子としては、cDNAであるかまたはcDNAを起源とする核酸分子が好ましい。また本発明には、本願に開示されている遺伝子配列とハイブリッドを形成する他の核酸分子も含まれる。
本発明のこの態様によって、
（ｉ）FLSをコードし、および
（ii）低ストリンジェンシー条件下で、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列、またはそのそれぞれの相補形とハイブリッドを形成する。
ヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子が提供される。
ストリンジェンシーのレベルを定義するため、便宜上、Maniatisら（1982年）の文献の387〜389頁および特にパラグラフ11を引用することができる。なおこの文献の部分は本願に援用するものである。本願では、低ストリンジェンシーを４〜６×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中、37〜45℃で２〜３時間と定義する。ハイブリッド形成に関与する核酸の起源と濃度によって、他のストリンジェンシー条件例えば本願で１〜４×SSC／0.5〜１％（ｗ／ｖ）SDS中、45℃以上で２〜３時間とする中位のストリンジェンシー条件、または本願で0.1〜１×SSC／0.1〜1.0％（ｗ／ｖ）SDS中60℃以上で１〜３時間とする高ストリンジェンシー条件を利用することができる。
本発明には、その最も好ましい実施態様として、配列番号：１もしくは配列番号：２もしくは配列番号：３もしくは配列番号：４もしくは配列番号：５の少なくとも一つに示すヌクレオチド配列をもっているかまたは含んでなる核酸分子、または上記の配列にそれぞれ示すヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列の少なくとも一つ以上の領域に対し、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列のレベルで類似性が少なくとも50％、より好ましくは少なくとも55％、さらに好ましくは少なくとも60％、さらに一層好ましくは少なくとも65〜70％、およびさらにより一層好ましくは85％を超える核酸分子であって；その核酸がFLSの活性を有する酵素をコードするかまたは該酵素をコードする配列に対して相補的である核酸分子が含まれる。しかしヌクレオチドもしくはアミノ酸の配列は上記パーセント値より低いかもしくは高い類似性を有ししかもFLS様分子をコードすることがあることに注目すべきであり、そしてこのような分子は、配列保存の領域をもっている場合、本発明の範囲内に含まれるとみなすものである。
本発明で目的とする核酸分子は、いずれかの配向で単独で、またはベクター分子好ましくは発現ベクターと組合わせて存在していてもよい。“ベクター分子”という用語は、最も広い意味で用いられ、核酸を植物細胞内へ転移し易くすることができおよび／または植物ゲノムに組込み易くすることができる。核酸分子に対する中間伝達体が含まれている。中間伝達体は、例えばエレクトロポレーション、マイクロプロジェクタイルボンバードメント、アグロバクテリウム（Agrobacterium）による転移またはDNAウイルスもしくはRNAウイルスによる挿入に用いるよう構成されている。本発明に含まれる中間伝達体および／または核酸分子は植物ゲノム中に安定に組込む必要がある場合とない場合がある。またかようなベクター分子は原核細胞中で複製および／または発現することができる。そのベクター分子またはその一部は植物のゲノムに組込むことができるものが好ましい。また本発明の核酸分子はさらに、植物細胞内で核酸分子の発現を指令することができるプロモーターの配列をもっている。また核酸分子とプロモーターは、先に述べたようないくつもの手段によって細胞内に導入することができる。またこのベクター分子は、FLS mRNAの転写物を切断できると先に定義したリボザイムをコードする遺伝子配列を含有していてもよい。
本発明の核酸またはその相補形は全長の酵素またはその誘導体をコードする。“誘導体”という用語は、天然に存在する酵素に対して単一もしくは複数のアミノ酸を置換、欠失および／または付加ししかもFLS活性を有する酵素を意味する。この点について、本発明の核酸には、FLSをコードし天然に存在するヌクレオチド配列が含まれ、または前記の天然に存在する配列に対して置換、欠失および／または付加がなされた単一もしくは複数のヌクレオチドを含んでいてもよい。また本発明の核酸配列またはその相補形は、活性もしくは不活性にかかわらずFLSの“一部分”をコードし、このような核酸分子は、オリゴヌクレオチドのプローブ、ポリメラーゼ連鎖反応もしくは各種の突然変異原性法のプライマーとして有用であり、または対応する遺伝子の植物内での発現を調節できるアンチセンス分子もしくはリボザイム分子の生成のために有用である。
本発明のFLSのアミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合体、ならびに単一もしくは複数のアミノ酸を配列内に挿入したものが含まれる。挿入アミノ酸配列変異体は、１個以上のアミノ酸残基がタンパク質の予め決められた部位に挿入されている変異体であるが、ランダム挿入も、得られる生成物を適切に選別することによって可能である。欠失変異体は、配列から１個以上のアミノ酸を除去されていることを特徴とする変異体である。置換アミノ酸変異体は配列中の少なくとも一つの残基が除かれ、その位置に異なる残基が挿入された変異体である。代表的な置換は後記の表１にしたがって行われる置換である。
FLSがアミノ酸の置換によって誘導体化される場合、そのアミノ酸は一般に、例えば疎水性、親水性、電気陰性度、かさ高な側鎖などのような類似の特性を有する他のアミノ酸で置換される。アミノ酸の置換は一般に単一の残基の置換である。アミノ酸の挿入は通常、約１〜10個のオーダーのアミノ酸残基の挿入であり、そして欠失は約１〜20個の残基の範囲内で行われる。欠失もしくは挿入は、隣接する対すなわち２個の残基の欠失または２個の残基の挿入で行うことが好ましい。
本発明のFLS酵素の組換えもしくは合成の変異体および誘導体の他の例としては、炭水化物類、脂質類および／またはタンパク質類もしくはポリペプチド類のような、FLS酵素に関連する分子の単一もしくは複数の置換、欠失および／または付加を行ったものが含まれる。
また“類似体”および“誘導体”という用語には、FLSの化学的機能の均等物および上記のアミノ酸誘導体が含まれる。便宜上、本願において特に以後“FLS”に言及するときは、FLSの機能的変異体、誘導体、一部分、フラグメント、相同体または類似体が含まれる。
本発明は、ペチュニア、タバコ、カーネーションおよびキク由来の核酸配列を使用して例示する。というのはこれらのものは、現在までのところ最も便利で好ましい材料源だからである。しかし、当該技術分野の当業者であれば、類似の配列は、他の植物のようないくつもの起源から単離することができるということは直ちに分かるであろう。FLSを直接もしくは間接的にコードするこのような核酸配列はすべて、その起源にかかわらず本発明に含まれる。FLS酵素をコードする遺伝子の他の適切な起源の例としては、限定されないが、バラ、キンギョソウ、リシアンサス（lisianthus）、シクラメン、ブドウおよびパセリがある。
本発明によれば、FLSをコードする核酸配列は、いずれかの配向が形質転換植物に導入され次いで発現されて、DHKおよび／または他の適切な基質が植物細胞内で合成されている場合はこれら基質を最終的にフラボノール類もしくはその誘導体に変換するか、または代わりに内因性もしくは既存のFLS活性を減少させるかもしくは除去することによって代謝物のかような変換を阻害する手段を提供する。これらのフラボノール類が産生されると、花弁の色が改変され、アトシアニン類とのコピグメント化によって一層青味の強い色の生成に寄与する。植物内での本発明の核酸配列の発現は構成的、誘導的または発育的でありまた組織特異的でもある。“発現”という用語はその最も広い意味で用いられ、RNAの産生またはRNAとタンパク質の両者の産生が含まれる。またこの用語には核酸分子の部分発現も含まれる。
本発明のこの態様によれば、前記核酸配列を最終的に発現できるようにする条件下で、前記FLSをコードするヌクレオチドの配列を含んでなる核酸配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで該核酸配列を発現できるようにする充分な期間と条件下で前記形質転換植物を成長させることを含んでなる、FLSを合成できる形質転換顕花植物の製造方法が提供される。その結果、この形質転換植物は、同等の非形質転換植物で発現される量に比べて高いレベルで外来のFLSを産生することができる。
本発明の他の態様では、FLS活性をコードするヌクレオチドの配列、またはFLS活性をコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる核酸分子で、適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで必要な場合に前記形質転換植物を、核酸配列を発現できるようにする充分な条件下で成長させることを含んでなる、固有のもしくは既存のFLS活性を低下させた形質転換植物の製造方法が提供される。
本発明のさらに他の態様では、植物細胞に導入されて適切に変えられたFl遺伝子もしくはその誘導体もしくは一部分からの相同的組換えによって固有配列を修飾することによってFl遺伝子を変化させ、次いでその遺伝子を修飾された植物を該細胞から再生させることを含んでなる、固有のもしくは既存のFLS活性を低下させた、遺伝子を修飾された植物の製造方法が提供される。
好ましい実施態様で、本発明は、本発明の核酸配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生し、次いで前記形質転換植物を、核酸配列がFLSを発現できるようにする充分な期間と条件下で成長させることを含んでなる、変化した花序特性を示す形質転換顕花植物の製造方法を提供するものである。あるいは、前記方法は、本発明の核酸配列またはその相補配列で適切な植物の細胞を安定に形質転換し、その細胞から形質転換植物を再生させ、次いで前記形質転換植物を、固有もしくは既存のFLSの活性のレベルを変えるのに充分な期間と条件下で成長させることを含んでなる方法である。変えられるレベルは、同等の非形質転換植物におけるFLS活性の固有もしくは既存のレベルより低いことが好ましい。本発明を限定したくないが、作用機構の理論は、固有FLSの活性を減少させるには、導入された核酸配列またはその相補配列を発現させる必要があるということである。しかし、所望の作用すなわち変化した花序特性を示す顕花植物を得るのに導入された遺伝子配列またはその相補配列を発現させる必要はない。
関連する実施態様で、本発明は、植物細胞に導入されて適切に変えられたFl遺伝子またはその誘導体もしくは一部分からの相同的組換えによって固有配列を修飾することによってFl遺伝子を変化させ、次いでその細胞から遺伝子を修飾された植物を再生させることを含んでなる、変化した花序特性を示す顕花植物を製造する方法を提供するものである。
好ましくは、その変化した花序には、受容体植物の遺伝子型および生理的状態によって、白、イエロー、ピンク、バイオレットまたはブルーの花の産生が含まれる。
したがって、本発明には、FLSをコードする組換え遺伝子を発現することができる形質転換植物、またはFLSの調節を行う必要がある場合任意に転写可能なmRNA分子のすべてもしくは一部分に実質的に相補的な核酸配列を有する形質転換植物の製造方法であって；FLSをコードするヌクレオチドの配列またはFLSをコードする配列に相補的なヌクレオチドの配列を含んでなる単離された核酸分子で、必要な場合、前記単離された核酸分子が最終的に発現できるようにする条件下にて、適切な植物の細胞を安定に形質転換し、次いでその細胞から形質転換植物を再生させることを含んでなる方法が含まれる。“適切な植物”という用語は、DHKなどのFLSの基質を産生することができ、かつ所望の色を発生するのに必要な適正な生理学的特性を有する植物を意味する。
FLS遺伝子配列を導入されたペチュニアおよびタバコの形質転換植物を生成させることによって本発明を例示する。ペチュニアおよびタバコの植物を用いることは、遺伝子配列を有する形質転換植物を生成させるのに特に便利で有用なモデルであり、このような形質転換植物から得られる結果は、一般に他の植物に適用できる。当該技術分野の当業者は、標的植物中に天然に存在する酵素の発現を増減させるような、本発明の方法に適用できる変種に直ちに気付くであろう。この方法によれば異なる色相の色が得られるであろう。ペチュニアおよびタバコに加えて、他の適切な標的植物としては、限定はないがバラ、カーネーション、キク、ガーベラ、リシアンサス、ユリ、アヤメおよびテンジクアオイがある。
したがって、本発明には、本発明の核酸配列のすべてまたは一部を含有するすべての形質転換植物、またはそのアンチセンス形および／またはその相同体もしくは類縁形および特に変化した花序特性を示す形質転換植物が含まれる。これらの形質転換植物は、FLSをコードするヌクレオチド配列またはFLSをコードする配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでなる導入核酸分子を含有している。一般にこの核酸は植物のゲノムに安定に導入されるが、本発明には、植物細胞内で複製できるDNAウイルスもしくはRNAウイルスのような自己複製核酸配列内にFLSヌクレオチド配列を導入することも含まれる。また本発明にはこのような形質転換植物由来の種子も含まれる。このような種子は、特に着色している場合、植物の特性タグとしてとりわけ有用である。さらに本発明には果実、野菜植物、および例えば観賞植物の葉が含まれる。
本発明の他の態様はFLSの組換え産物に関する。この酵素類の組換え産物は、例えば活性が一層大きい酵素を開発するための研究に用いる材料源を提供し、かつフラボノール類および／または着色化合物を産生する試験管内の系を開発するのに有用である。
本発明のさらに別の態様では、植物内で、FLSを発現できるかまたは固有FLS酵素のダウレギュレーションを行うことができる遺伝子構築物を製造する場合の本願に記載の遺伝子配列の用途に関する。
本発明の他の態様は、プラスミドの形態で染色体外に、FLSをコードする遺伝子配列を保有する原核生物もしくは真核生物に関する。一つの実施態様では、そのプラスミドは、大腸菌（Escherichia coli）中に存在するpCGP481である。プラスミドpCGP481を含有する大腸菌の菌株DH5αは、オーストラリア、2037、ニューサウスウェールズ、ピンブル、スアキンストリート１に所在のthe Australian Government Analytical Laboratoriesに、1993年８月５日付けで受託番号Ｎ93/33236号で寄託した。
本発明を以下の図面と実施例を参照して説明するが本発明を限定するものではない。
実施例を含めて本明細書を通じて用いられるアミノ酸の略語を以下の表２に示す。
図１はペチュニア、ハイブリダ内でのジヒドロフラボノール類のフラボノール類への変換を示す概略図である。この経路の各ステップに関与する酵素は次のとおりである。Ｆ３′Ｈ＝フラボノイド３′−ヒドロキシラーゼ；Ｆ３′５′Ｈ＝フラボノイド３′，５′−ヒドロキシラーゼ；FLS＝フラボノールシンターゼ；DHK＝ジヒドロケンフェロール；DHQ＝ジヒドケルセチン；DHM＝ジヒドロミリセチン；Ｋ＝ケンフェロール；Ｑ＝ケルセチン；Ｍ＝ミリセチン
図２は32ｐで標識を付けたpDIOXC3 cDNA挿入断片でプローブしたRNAゲルブロットのオートラジオグラフである。各レーンは以下のものから単離した全RNA20μｇを含有している。１〜５：五つの発育段階のOGBの花のリムの組織；Ｔ：発育段階３〜４のOGBの花のチューブ組織；Ｌ：OGBの６週齢実生由来の葉の組織。
図３はpCGP481のcDNA挿入断片の完全ヌクレオチド配列を得るために用いた配列決定法を示す。矢印は個々の配列決定反応から読取られる配列の方向と長さを示す。注文製品のオリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ７〜９；配列番号：12〜14）を用いる配列決定反応を示す。
図４はpCGP631の構築を示す概略図である。pCGP631は、発現ベクターpYGA22m内の酵母グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターの後にセンス配向でpCGP481 cDNA挿入断片をクローン化して構築した。pCGP481由来のcDNA挿入断片を、EcoRＩ／XhoＩフラグメントとして、pYGA22mをEcoRＩ／SalＩで消化して得られた大きいフラグメントと連結した。
IR＝２μｍプラスミドの逆方向反復配列、TRP１＝TRP１遺伝子、Ap＝アンピシリン耐性マーカー。
図５は、DHQを基質として用いる、酵母の抽出物のFLS検定結果を示す。このオートラジオグラスはプラスミドpCGP631で形質転換された酵母の酵素抽出物による〔14Ｃ〕-DHQのケルセチンへの変換を示す。未形質転換の酵母に、FLS活性は全く検出されなかった。Ｃ＝酵母エキスなしの未標識ケルセチン、未標識ケルセチンの泳動位置は丸く囲んである。
実施例１−材料
酵素類
酵素はすべて商業的起源から入手し、そのメーカーの推奨にしたがって使用した。
細菌の菌株
下記の大腸菌の菌株を使用した。
PLK-F′およびSURE、両者ともにStratagene社から入手した；XL１-Blue（Bullockら1987年）およびDH５α（Hanahan 1983年およびBRL 1986年）。使用したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の菌株は無毒化されたAGLO（lazoら1991年）であった。
植物の材料
使用したペチュニア・ハイブリダの品種を下記表４に示す。
ダイアンサス・カリオフィルスcvラグナ（Dianthus caryophyllus cv. Laguna）の花は、ビクトリア州所在のVan Wyk and Son Flower Supply社から入手した。
クリサンセマム・モリホリウム（Chrysanthemum morifolium）の品種は、ビクトリア州所在のBaguley Flower and Plant Growers社から入手した。
実施例２−植物の発育条件と発育段階
植物の発芽
ペチュニア・ハイブリダ植物は、日長14時間、光の強さ10,000ルックスおよび温度22〜26℃で特別の発育室にて発育された。OGBの花を下記定義の発育段階で収穫した。
段階１：着色していない閉じたつぼみ（長さ：＜25mm）。
段階２：着色した閉じたつぼみ（長さ：25〜35mm）。
段階３：花冠が現われた暗パープル色のつぼみ（長さ：＞35mm）。
段階４：開葯前の暗パープル色の開いた花（長さ：＞50mm）。
段階５：すべての葯が開きかつ充分に開いた花。
ダイアンサス・カリオフィルスの花の発育段階は以下のように定義した。
段階１：目視可能な花芽なし。
段階２：花芽が開きつつある：小花の先端が目視可能。
段階３：ほとんどすべての小花の先端が暴露されている。外側の小花が開きつつあるがどれも水平ではない。
段階４：外側小花が水平。
クリサンセマム属の花の発育の段階は以下のように定義した。
段階０：目視可能な花芽なし。
段階１：花芽が目視可能。小花はほうによって完全に覆われている。
段階２：花芽が開きつつある。小花の先端が目視可能。
段階３：小花がしっかりと重なっている。
段階４：ほとんどすべての小花の先端が暴露されている。外側の小花が開きつつあるがどれも水平ではない。
段階５：外側の小花が水平。
段階６：花が成熟に近づいている。
実施例３
オリゴヌクレオチドの合成
オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems PCR-Mate DNA合成機を用い、そのメーカーが推奨する方法を利用して合成した。合成したオリゴヌクレオチドは５′−３：
実施例４−ペチュニア由来のジオキシゲナーゼのクローン化
ペチュニアcDNAライブラリーの構築
TurpenおよびGriffith（1986年）の文献に記載の方法を用いて、ペチュニア・ハイブリダcv OGBの段階３〜４の花の花弁の組織から全RNAを単離した。オリゴ−dTセルロースクロマトグラフィー（AvivおよびLeder 1972年）を３サイクル行い、全RNAからポリ（A）+RNAを選択した。
１×Superscript（登録商標）反応緩衝液、10mMジチオスレイトール、500μＭ dATP、500μＭ dGTP、500μＭ dTTP、500μＭ５−メチル−dCTP、0.75μｇオリゴ１（配列番号：６）および２μＬ Superscript（登録商標）逆転写酵素（BRL社）を含有する20μＬの容積内でポリ（A）+RNA ２μｇを逆転写させた。その反応混合物を37℃で50分間次いで44℃で10分間インキュベートし、続いて氷上に置いた。
上記の第一のストランド反応混合物に第二のストランド反応混合物（140μＬ）を添加した。第二のストランド反応混合物は、21mMトリス−HCl、104mM KCl、5.3Ｍ MgCl2、171μＭ β-NAD、11.4mM（NH4）2SO4、214μＭ dATP、642μＭ dCTP、214mM dGTP、214μＭ dTTP、４mM DTT、10μCi32P-dCTP（3000Ci/mmole）、15単位の大腸菌DNAリガーゼ、40単位の大腸菌DNAポリメラーゼＩ Boehringer社）および0.8単位RNアーゼＨで構成されていた。最終混合物を16℃にて150分間インキュベートした。二本鎖cDNAを平滑末端にするため、単位のT4 DNAポリメラーゼを添加し、反応をさらに15分間16℃で続けた。反応を停止させ、次いでcDNAを、フェノール／クロロホルムで抽出し次にクロロホルムで抽出し次いでタノールで沈澱させることによって精製した。
得られたcDNAにEcoRＩアダプター（Promega社）を連結し、次にメーカーが推奨する条件を用いてポリヌクレオチドキナーゼ（Amersham社）でキナーゼ処理を行った。酵素を熱によって変性させ（70℃で20分間加熱）、次いでDNAをフェノール／クロロホルムによる抽出およびエタノールによる沈澱で精製した。cDNAを、メーカーが推奨する条件を使用し、100μＬの反応容積中、50単位のXhoＩ（Boehringer社）で消化した。酵素を熱（70℃で20分間加熱）で失活させ、次いで上記cDNA消化物を、STE緩衝液（Sambrookら1989年）中で予め平衡化させたSephacryl S400スパンカラム（Pharmacia社）を通過させた。得られた溶出液をフェノール／クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させた。４℃にて30分間微量遠心分離にかけた後、得られたcDNAペレットを70%（ｖ／ｖ）エタノールですすぎ、風乾し、次いで10μＬのTE緩衝液（10mMトリス−HCl、１mM EDTA pH7.5）に再懸濁させた。
上記cDNA懸濁液の１／４（2.5μＬ）を、50mMトリス−HCl（pH7.0）、10mM MgCl2、10mMジチオスレイトール、１mM ATPおよび２単位のT4 DNAリガーゼからなる反応緩衝液５μＬ中で、λZAPI EcoRＩ／Xho Ｉ／CIAPで処理したベクター（Stratagene社）１μｇと連結した。その反応混合物を４℃で４日間インキュベートした。
室温で２時間インキュベートした後、連結反応混合物をPackagene system（Promega社）を用いてパッケージした。組換え体の総数は１×106個であった。大腸菌PLK-F′細胞にトランスフェクトした後、パッケージされたcDNAの１×１０６プラーク形成単位（pfu）を15cm直径プレートに１枚当り50,000pfuでプレートした。これらのプレートを37℃で８時間インキュベートし、次いで４℃にて一夜貯蔵した。ファージを、プレートからファージ貯蔵緩衝液（８mM MgSO4、１００mM NaCl、0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン、50mMトリス−HCl pH8.0）中に溶出させて増幅cDNAライブラリーストックを形成させた。
ジオキシゲナーゼオリゴヌクレオチドプライマーの設計
植物（Matsudaら1991年；Martinら1991年）、真菌および細菌（Cohenら1990年）のごとき多様な生物由来のいくつものジオキシゲナーゼ類の配列が決定されている。これらのすべての酵素の特徴は、配列が保存された小さな領域がいくつも存在していることである。いくつもの異なる植物ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列を、HigginsとSharp（1988年）の文献に記載されているCLUSTALプログラムを用いて一列に並べた。使用した配列は、Candi（Martinら1991年）、ヒヨスチアミン６β−ヒドロキシラーゼ（H6H）（Matsmaら1991年）、フラバノン３−ヒドロキシラーゼ（F3H）、Ｅ８（DeikmanおよびFisher1988年）、Ａ２（Menssenら1990年）およびTom13（Holdsworthら1987年）であった。この分析によって２個の良好に保存された領域が見出された。その領域を表５に示す。
ペチュニアのジオキシゲナーゼ遺伝子のフラグメントのPCRによる増幅
Ba20（flfl）およびＶ26（FlFl）の段階３〜４の花から全RNAを単離した。25μｇの全RNAをエタノールで沈澱させ、ペレット化し次いで10.5μＬの水に再懸濁させた。１μＬ（0.5μｇ）のオリゴ１（配列番号：６）を添加し、得られた混合物を70℃で10分間加熱し次いで氷上に置いた。次に、４μＬ Superscript反応緩衝液（５×ストック）、２μＬの100mMジチオスレイトール、0.5μＬの５mM dATP、0.5μＬの５mM dCTP、0.5μＬの５mM dGTP、0.5μＬの５mM dTTPおよび0.5μＬの〔α−32Ｐ〕−dCTPを添加した。得られた混合物を37℃で２分間インキュベートした。１μＬ（200単位）のSuperscript逆転写酵素を添加し、反応混合物を37℃で60分間インキュベートし、次いで80μＬのSTEを添加して反応を終止させた。得られたcDNAをSephacryl S200スパンカラムクロマトグラフィにかけ次いでエタノールで沈澱させて精製し、100μＬのTE緩衝液に再懸濁させた。このcDNAをPCRの鋳型として用いた。
ペチュニアジオキシゲナーゼ遺伝子フラグメントを増幅するためのPCR反応混合物は、４μＬのcDNA、10mMトリス−HCl（pH8.3）、50mM KCl、２mM MgCl2、0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン、0.2mM各dNTP、0.4μＭ各プライマー、および1.25単位Taqポリメラーゼ（Cetus社）を含有していた。反応混合物（50μＬ）を、94℃で50秒間、42℃で１分間次いで72℃で１分間の処理を40回行った。各PCR 15μＬづつを1.25％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で電気泳動させた。300〜500bpの大きさの範囲内のDNAフラグメントをNA-45膜上に集めた。そのDNAを上記の膜から溶出させ、次いでエタノールで沈澱させ、遠心分離によってペレット化し、25μＬのTE緩衝液中に再懸濁させた。各V26PCR由来のDNAフラグメント１μＬを集め、オリゴ標識化キット（BRESATEC）を用いて32Ｐで標識を付けた。Ba20PCR由来のDNAフラグメントに、類似の方式で標識を付けた。
ペチュニアの花弁のcDNAライブラリーからのジオキシゲナーゼ相同体の単離
16,000プラクの二つのリフトを、Ｖ26プローブまたはBa20プローブの５×105cpm／μＬとハイブリッドを形成させ次のように洗浄した。すなわち高ストリンジェンシー条件〔ハイブリッド形成：50％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、６×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS、42℃にて16時間および洗浄：２×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS、65℃にて２×15分間、続いて0.2×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS、65℃にて２×15分間〕を利用して姉妹クローンを検出した。14個のクローンがＶ26プローブとハイブリッドを形成したが、Ba20プローブとはハイブリッドを形成しなかった。別の12個のクローンは、Ｖ26プローブに対してBa20プローブよりも一層強くハイブリッドを形成した。
pBluescript中のプラスミドcDNAクローンは、ヘルパーファージR408（Stratagene社）を用いてλZAPIIクローンからレスキューした。
上記のクローンおよび他のクローンのDNA配列決定は、本質的に、Sequenase酵素（USB、バージョン2.1）を用い、Sangerら（1977年）の文献に記載の方法によって実施した。
実施例５−ノーザン分析
全RNAは、液体窒素中で凍結し、乳鉢と乳棒により微粉末に粉砕した組織から単離した。４Ｍグアニジウムイソチオシアネート、50mMトリス−HCl（pH8.0）、20mM EDTA、0.1％（ｖ／ｖ）Sarkosylからなる抽出緩衝液を上記組織に添加し、その混合物を、最高速度でポリトロン（poltron）を用いて１分間ホモジナイズした。その懸濁液をMiracloth（Calbiochem社）で濾過し、次にJA20ロータで10分間、10,000rpmで遠心分離にかけた。上澄み液を集め、0.2ｇ／mL CsCl（ｗ／ｖ）にした。次に、試料を、38.5mLのQuic−シール遠心分離管（Beckman社）中に入れた5.7Ｍ CsCl、50mM EDTA（pH7.0）からなるクッション液10mL上に重層し、次いで70Tiロータ内で25℃にて16時間、42000rpmで遠心分離を行った。ペレットを、TE／SDS〔10mMトリス−HCl（pH7.5）、1mM EDTA、0.1％（ｗ／ｖ）SDS〕中に再懸濁し、10mM EDTA（pH7.5）中に飽和させたフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25:24:1）で抽出した。エタノールで沈澱した後、RNAのペレットをTE／SDS中に再懸濁させた。
20mMモルホリノプロパンスルホン酸（pH7.0）、5mM酢酸ナトリウム、0.1mM EDTA（pH8.0）を含有する泳動緩衝液を用い、2.2Ｍホルムアルデヒド／1.2％（ｗ／ｖ）アガロースゲルによって、RNA試料（20μｇ）の電気泳動を実施した。そのRNAを、メーカーが推奨するようにして、Hybond-N膜（Amersham社）に移し、次いで32Ｐで標識を付けた0.9kbのEcoRＩ−XhoＩ pDIOXC3cDNAフラグメント（108cpm／μｇ、２×106cpm／μＬ）でプローブした。プレハイブリダイゼーション（42℃で１時間）およびハイブリッド形成（42℃で16時間）を、50％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１Ｍ NaCl、１％（ｗ／ｖ）SDS、10％（ｗ／ｖ）デキストラン硫酸中で実施した。分解サケ***DNA（100μｇ／ｍＬ）を、ハイブリッド形成ステップにおいて、32Ｐで標識したプローブとともに添加した。フィルターを、２×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS内で65℃にて１〜２時間次いで0.2×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS内で65℃にて30〜60分間洗浄した。フィルターを増感スクリーン付きKodak XARフィルムに−70℃で48時間暴露した（図２）。
RNAゲルブロット分析の結果、cDNAクローンpDIOXC3に対応する遺伝子は、花の発育段階１の期間中に最高レベルで発現され次いで低下したことが明らかになった。その発現のパターンはペチュニアの花におけるFLS酵素の活性のパターン（Forkmannら1986年）に類似している。
実施例６−pDIOXC3のRFLP地図作成
ペチュニア・ハイブリダには、FLSの活性を制御する一つの遺伝子座Flがある。したがって、Fl遺伝子座がFLSの構造遺伝子をコードしているならば、ペチュニア・ハイブリダのFLSをコードするcDNAクローンはFl遺伝子座に対して位置づけられていると予想された。Flはペチュニア・ハイブリダのゲノムの染色体IIにマッピングされて、PAc1遺伝子の２％組換えの範囲で連結される（Cornuら1990年）。同系繁殖系のＶ23（FlFl）およびＲ51（flfl）間の交雑種由来の植物のＦ2集団から単離されたDNAのRFLP分析を利用して、各種のジオキシゲナーゼ相同体の連鎖のデータを得た。
ゲノムDNAの単離
特にDellaportaら（1983年）の文献に記載されているのと同様にして、DNAをＶ23×R51F2植物の葉の組織から単離した。そのDNAの標品をさらにCsCl浮遊密度遠心分離法（Sambrookら1989年）によって精製した。
サザーンブロット
ゲノムDNA（10μｇ）を、60単位のXbaＩで16時間消化し、次いで泳動緩衝液のTAE（40mMトリス−アセテート、50mM EDTA）中0.7％（ｗ／ｖ）のアガロースゲルによって電気泳動を行った。そのDNAを変性溶液（1.5Ｍ NaCl／0.5Ｍ NaOH）中で１〜1.5時間変性し、0.5Ｍトリス−HCl（pH7.5）／1.5Ｍ NaCl中で２時間中和し、次いでDNAをHybond-N（Amersham社）フィルター（20×SSC）に移した。
DNAフラグメント（50〜100ng）に、オリゴラベリングキット（Bresatec社）を用いて50μCiの〔α−32Ｐ〕−dCTPで放射能標識した。取りこまれなかった〔α−32Ｐ〕−dCTPをセファデックスG-50（Fine）カラムのクロマトグラフィで除去した。PAc1プローブを、pPAc1の2.7kbのHindIII／BamHＩフラグメントから合成した（BairdおよびMeagher 1987年）。pDIOXC3cDNAプローブをpDIOXC3の0.9kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントから合成した。
XbaＩで消化したゲノムDNAの二つのサザーンブロットを、pDIOXC3プローブまたはPAc1プローブとハイブリッドを形成させてRFLPのパターンを検出した。分析された42の植物のうち40については、PAc1についてのＶ23，VRおよびＲ51のRFLPパターンとpDIOXC3の対応するRFLPパターンとの同時分離（co-segregation）があったが、これは対応する遺伝子が密接に連鎖していることを示している（4.7％組換え）。
これらのデータは、pDIOXC3に対応する遺伝子がFl遺伝子座に連結しているという強力な証拠を与えた。この連結およびノーザン分析の結果は、pDIOXC3cDNAがFLSをコードしているかもしれないという状況証拠を与えた。
実施例７−pDIOXC3の全長姉妹cDNAクローンの単離
予備的な配列分析の結果、pDIOXC3は対応する転写物の全長のクローンを示さなかったことが分かった。pDIOXC3の全長体を得るため、cDNAライブラリーからの約20,000個の組換え体を、pDIOXC3由来の0.9kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントとハイブリッドを形成したクローンについて選別した。６個のクローンが強いハイブリッド形成シグナルを発したので以後の分析用に選択した。いくつものクローンが、cDNA挿入断片とmRNAとの大きさが一致していることに基づいて全長であるようである。これらのクローンのうちの一つからのcDNA挿入断片の完全配列（pCGP481と命名）を、標準のクローニング法（Sambrookら1989年）を用いて得た異なるpBluescriptサブクローンから配列を並べることによって決定した。いくつかの領域については、オーバーラップ配列のデータを得るため特定のオリゴヌクレオチドプライマー（オリゴ７〜９；S配列番号：12〜14）を合成する必要があった。pCGP481の完全ヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列をS配列番号：１に示す。
実施例８−酵母中でのPCGP481cDNAの発現
酵母発現ベクターpYGA22mの構築
M13-mp18をEcoRＩとBglIIで消化して、マルチクローニング部位を有する700bpのフラグメントを製造した。このフラグメントをpYGA2269由来の９kbのEcoRＩ−BglII−フラグメントと連結した（Ashikariら1989年）。得られた構築物（pYGA22mと命名）は、酵母グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼのプロモーターの下流に挿入されたマルチクローニング部位を含有していた。
pCGP631の構築
pCGP481由来の完全cDNA挿入断片を含有する1.3kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントを、pYGA22m由来の９kbのEcoRＩ／SalＩフラグメントと連結した。得られたプラスミド〔pCGP631と命名（図４）〕は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの後にセンス配向で連結したpCGP481cDNAフラグメントを含有していた。
酵母の形質転換
酵母株G-1315（Matα，typ1）（Ashikaraら1989年）を、Itoら（1983年）の文献にしたがってpCGP631で形質転換した。その形質転換体を、G-1315をトリプトファン栄養要求性を回復するそれらの能力によって選択した。
FLS活性の検定を行うための酵母抽出物の製造
G-1315／pCGP631の単一単離物およびトリプトファンを欠いた培地で増殖したG-1315の復帰変異体を用いて、10mLのYNBS｛1.2％（ｗ／ｖ）のアミノ酸なしのイーストナイトロジェンベース（Difco社）および0.3％（ｗ／ｖ）カザミノ酸（Difco社）｝に接種し、次いで振盪して２日間30℃でインキュベートした。
酵母細胞を遠心分離によって収穫し、TE緩衝液で一回洗浄し、チモリアーゼ（zymolyse）（0.1mg／mL）（生化学工業、日本）を含有する緩衝液Ｂ（10mMトリス−HCl（pH7.5）、1.2Ｍソルビトール、0.1mM DTT、0.1mM EDTA）100μＬ中に再懸濁させ、次いで30℃に１時間保持した。スフェロプラストを遠心分離で集めて、1mM ２−メルカプトエタノールおよび１mM PMSFを含有する0.1Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH7.0）500μＬ中に再懸濁させた。その懸濁液をガラスビーズ（直径＝0.4mm）とともに激しく振とうさせた。遠心分離を行った後、上澄み液を粗抽出液として使用した。
酵母の酵素抽出物のFLS検定
FLS活性を、改変したForkmannら（1986年）の方法で測定した。反応液は、合計200μＬ中に、0.1Ｍリン酸カリウム（pH7.0）、1.4mM ２−メルカプトエタノール、250μＭ ２−オキソグルタレート、５mMアスコルビン酸、50μＭ硫酸第一鉄、5000cpmの14Ｃ-DHQおよび40μＬの粗抽出液を含有していた。インキュベーションは30℃で10分間または１時間行った。その混合物を500μＬの酢酸エチルで直ちに抽出し、次に標識していないDHQとケルセチンとともに、Forestal（酢酸：HCl：水＝30：３：10）を用い、セルロースプレート（Merck Art 5577、ドイツ）のクロマトグラフィーに付した。オートラジオグラフィーによって放射能の位置を求めた。G-1315／pCGP631から調製した酵素抽出物はFLS活性を有することを示したが、形質転換されていない酵母から調製した同等画分はFLS活性が全くなかった（図５）。
酵母の発現結果から、pCGP481由来のcDNA挿入断片がFLS酵素をコードしていることが確認された。Forkmannら（1986年）の文献には二つの酵素の２−ヒドロキシラーゼとデヒドラターゼがジヒドロフラボノール類をフラボノール類に変換するのに必要であると示唆されている。しかし、上記の試験結果は、ペチュニアFLSのcDNAクローンによってコードされている酵素の酵母内での発現は上記の変換を行うのに充分であり、このことは、ジヒドロフラボノール類をフラボノール類に変換するのに１種の酵素しか必要でないことを示唆している。
実施例９−形質転換植物内でのフラボノールとアントシアニンの合成の操作
バイナリー構築物
pCGP293（Bruglieraら1993年）由来のマルチプルクローニング部位のXbaＩ−KpnＩフラグメントを、XbaＩ，BamHＩ，ApaＩおよびAsp718に対する部位を含有する合成ポリリンカーで置換することによって、バイナリー発現ベクターpCGP478を構築した。この合成ポリリンカーは二つのオリゴヌクレオチドのオリゴ10とオリゴ11（配列番号：15と16）をアニールすることによって製造した。pCGP478のMACプロモーターとmasターミネーターの間のこれら制限酵素部位の順序によって、方向性λZAPIIクローン由来のcDNA挿入断片のアンチセンス配向での直接クローニングが容易になる。
pCGP481由来の完全cDNAを含有する1.2kbのXbaＩ／Asp718フラグメントを、pCGP478のMACプロモーターとmasターミネーターの間に、アンチセンス配向でクローン化してpCGP479を創製した。Gynheungら1988年の文献に記載の方法を用いて、プラスミドpCGP479をアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株AGLO（Lazoら1991年）中に導入した。pCGP479を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mLのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。
pCGP481由来のcDNAを含有する1.2kbのXbaＩ／Asp718フラグメントを、pCGP293のMACプロモーターとmasターミネーターの間にセンス配向でクローン化してpCGP482を創製した。このプラスミドpCGP482を、Gynheungら（1988年）の文献に記載の方法を用いてアグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株AGLO（Lazoら1991年）中に導入した。pCGP482を保有するアグロバクテリウム・ツメファシエンスの細胞を、100μｇ／mLのゲンタマイシンを含有するMG／Ｌ寒天プレート上で選択した。
形質転換植物の産生
Horshら（1985年）の文献に記載の方法を用い、葉のディスクをAGLO/pCGP479と共生培養することによって、ペチュニアcv．VR（Flfl）植物を形質転換した。形質転換植物を成長させて開花させ、形質転換されていないVRの花と比較して変化した花色を評価した。12の形質転換植物のうち４が、形質転換されていない対照植物より赤味が多い花を産生した。形質転換ペチュニアの花色の変化以外に、FLScDNAのアンチセンス発現の他の影響は全く観察されなかった。
Horschら（1985年）の文献に記載の方法を用い、葉のディスクをAGLO／pCGP482と共生培養することによって、ペチュニアcv Old Glory Blue植物を形質転換した。形質転換植物を成長させて開花させ、形質転換されていないOld Glory Blueの花と比べて変化した花色を評価した。15の形質転換植物のうち３が形質転換されていない対照植物より赤味が多い花を産生した。形質転換されていないOld Glory Blueの花は一般にブルーバイオレット色であるが、pCGP482で形質転換されたOld Glory Blueの花の色はブルーバイオレットからパープルの範囲の色であった。
Horschら（1985年）の文献に記載の方法を用い、葉のディスクをAGLO／pCGP479と共生培養することによって、タバコ植物〔ニコチアナ・タバカムcv．キサンシ（Nicotiana tabacum cv. Xanthi）〕を形質転換した。タバコの花は通常うすいピンク色であり、花冠のリムに低いレベルのシアニジン誘導体を産生する。タバコをアンチセンスFLS遺伝子構造体で形質転換すると、フラボノールの産生の減少が起こって赤色の花を産生するようになった。赤色の発色は花系でも増大した。この赤色の花色は、花冠のリム内のアントシアニンの産生が３倍増大したためであった。
観察された色の変化は、下記表６に示すようにthe Royal Horticultural Society's Colour Chartの数値によって示す。
花由来のフラボノイド類の抽出と分析
１個の花冠を１mLの２Ｍ HCl中で30分間煮沸し次いでフラボノイド類を150μＬの酢酸エチルで抽出することによって、フラボノールアグリコン類をペチュニアの花から単離した。薄層クロマトグラフィー（TLC）を行うために、４μＬの酢酸エチル抽出液および４μＬのフラボノール標品（ケンフェロール、ケルセチンおよびミリセチン）をTLCプレートに塗布し、上記のようにして展開させた。フラボノール類は、アンモニアで燻蒸した後紫外線下で目視可能になった。
ペチュニアVRおよびペチュニアVR／pCGP479の花から抽出したフラボノール類を薄層クロマトグラフィーで分析した。VR／pCGP479の赤色の花は、フラボノール類の産生が形質転換されていないVRの花より著しく少なかった。pCGP479で形質転換されたタバコ植物由来の花を同様に分析した結果、フラボノール含有量が減少していることが見出された。
0.5％HClを含むメタノール溶液を用いて、ペチュニアとタバコの花からアントシアニン類を抽出した。アントシアニン類の濃度は、Gerats（1985年）の文献に記載されているようにして、抽出液のＡ530測定値から推定した。
実施例10−ニコチアナ属の植物からのcDNA相同体の単離
ニコチアナ・アラータ（Nicotiana alata）のcDNAライブラリーの構築と選択
ベクターλZAPのcDNAライブラリーを、Chenら（1992年）の文献に記載されているようにして、S6S6ニコチアナ・アラータの花柱から単離したRNAから単離した。
６×SSC、35％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１％（ｗ／ｖ）SDS中、42℃で16時間加熱することによって、約36,000個のcDNAクローンを32Ｐ標識化pCGP481cDNAフラグメントとハイブリッドを形成した。これらのフィルターを、２×SSC、１％SDS中65℃の中位のストリンジェンシー条件下で洗浄し次いでオートラジオグラフにかけた。ハイブリッドを形成しているプラークを取出してPSB中に入れてファージを溶出させた。一本鎖ヘルパーファージVCSM13（Stratagene社）を用いて８個のプラスミドクローンをレスキューした。最大のcDNA挿入断片を含有するクローンのpCGP489は、配列が決定され（配列番号：２）、ペチュニアFLSの遺伝子配列に対してヌクレオチドレベルで88％の類似性を示し、そしてpCGP481でコードされたペチュニアFLS配列に対して241個のアミノ酸にわたって91％の類似性を示した。
ニコチアナ・シルベストリス（Nicotiana sylvestris）cDNAライブラリーの構築と選択
ベクターλZAPIIのcDNAライブラリーをChenら（1992年）の文献に記載されている方法を用いてニコチアナ・シルベストリスの花柱から単離したRNAから製造した。
低ストリンジェンシーハイブリッド形成緩衝液（６×SSC、35％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、１％（ｗ／ｖ）SDS）中、16時間42℃にて、約120,000個のcDNAクローンを32Ｐで標識をつけたpCGP481cDNAフラグメントとハイブリッドを形成させた。それらのフィルターを２×SSC、１％（ｗ／ｖ）SDS中65℃で洗浄し、次いでオートラジオグラフにかけた。ハイブリッドを形成するプラークを取り出してPSBに入れてファージを溶出させた。３個のプラスミドクローンを、一本鎖ヘルパーファージVCSM13を用いてレスキューした。最大のcDNA挿入断片を含有するクローンであるpCGP490は、配列が決定され（配列番号：３）、ペチュニアFLS遺伝子配列に対してヌクレオチドレベルで84％の類似性を示しそしてpCGP481でコードされたペチュニアFLS配列に対し、45個のアミノ酸配列にわたって93％の類似性を示した。
二つのニコチアナcDNAクローン：pCGP489（配列番号：２）およびpCGP490（配列番号：３）のアミノ酸配列を、ペチュニアFLScDNAクローン（配列番号：１）のアミノ酸配列と比べて下記の表７に示す。
cDNAを作製し、ペチュニアライブラリーについて用いたプロトコルにしたがってライブラリーをλZAPII中に構築した。
一次ライブラリー（150,000pfuを含有していた）を、大腸菌SURE細胞にトランスフェクトした後、37,500pfu／15cm直径プレートでプレートした。これらのプレートを37℃で８時間インキュベートし次いで４℃で一夜貯蔵した。ファージを、プレートから、ファージ貯蔵緩衝液（８mM MgSO4、100mM NaCl、0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン、50mMトリス−HCl、pH8.0）中に溶出させて、増幅されたcDNAライブラリーストックを形成させた。
ダイアンサスcDNAライブラリーからのFLS相同体の単離
合計100,000のプラークを、２回、32Ｐで標識を付けた1.1kbのEcoRＩ−HindII pDIOXC3cDNAフラグメント（５×105cpm／μＬ）で選択した。ハイブリッド形成は低ストリンジェンシー緩衝液〔６×SSC、0.5％（ｗ／ｖ）SDS、５×デンハート溶液、0.01Ｍ EDTA、100μｇ／mL〕中42℃で16時間行った。それらのフィルターを２×SSC／１％（ｗ／ｖ）SDS中65℃で洗浄し次にオートラジオグラフにかけた。ハイブリッドを形成したcDNAクローンを一本鎖ヘルパーファージExassist（Stratagene社）を用い、メーカーの指示にしたがってλZAPIIからレスキューした。
配列決定後、単離されたクローンのうちの一つのpCGP777（配列番号：４）は、pCGP481がコードするペチュニアFLSの配列に対してヌクレオチドおよびアミノ酸の両方のレベルで65％の類似性を示した。
実施例12−クリサンセマム属植物からのcDNA相同体の単離
クリサンセマム属植物のcDNAライブラリーの構築
やはりTurpenおよびGriffith（1986年）の文献記載の方法を用い、クリサンセマム・モリホリウムcv. ダークピンクポンポン（参照番号5999）の段階２と３の花の花弁組織から全RNAを単離した。cDNA合成の鋳型として30μｇの量の全RNAを使用した。
分画と連結を行い、続いてcDNA反応混合物をPackagene system（Promega社）を用いてパッケージした。未増幅ライブラリーのタイターは3.7×104pfu／mLであった。
クリサンセマム属植物cDNAライブラリーからのFLS相同体の単離
上記のパッケージされたcDNAの90,000pfu（増幅されたライブラリー；2.6×107pfu／mL）を、XL1-Blue細胞にトランスフェクトした後、10,000pfu／15cm直径プレートでプレートした。これらのプレートを37℃で一夜インキュベートし次いで４℃で貯蔵した。Colony／Plaque Screen（登録商標）（Dupont社）上にプラークを写し取り、メーカーが推奨するとおりに処理し、次に32Ｐで標識を付けたEcoRＩ−XhoＩ pCGP481cDNAフラグメントで選別した。ハイブリッド形成を、低ストリンジェンシー緩衝液〔６×SSC、1.0％（ｗ／ｖ）SDS、20％（ｖ／ｖ）ホルムアミド）中、42℃にて16時間行った。それらフィルターを、２×SSC／１％SDS中、65℃で30分間づつ２回洗浄し次いでオートラジオグラフにかけた。
単離されたクローンpCGP874（配列番号：５）は、配列決定により、pCGP481がコードするペチュニアFLS配列に対し、ヌクレオチドレベルで70％の類似性を示し、そしてアミノ酸レベルで72％の類似性を示した。
実施例13−pCGP874cDNAの酵母中での発現
酵母の発現ベクターpYGA22mおよびpCGP492の構築
酵母発現ベクターpYGA22mを、上記実施例８に記載されているようにして構築した。pCGP874由来の完全cDNA挿入断片を含有する1.3kbのEcoRＩ−XhoＩフラグメントを、前記pCGP631を構築したときと同じ方式で、pYGA22m由来の９kbのEcoRＩ／SalＩフラグメントと連結し、それを図４に示す。得られたプラスミド（pCGP492と命名）は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの後にセンス配向で連結されたpCGP874cDNAフラグメントを含有していた。
酵母の形質転換とFLS活性の検定
酵母の形質転換と、FLS活性の検定するのに用いる抽出物の調製は実施例８にすでに記載したようにして実施した。FLSの活性は、やはり、標識されていないDHKとDHQを基質として用い、改変したForkmannら（1986年）の方法で実施した。その試験結果によって、pCGP874 cDNAがキクの機能的FLS酵素をコードしていることが確認された。
当該技術分野の当業者は、本願に記載された発明は、具体的に記載された発明以外に変形と改変を行うことができることが分かるであろう。本発明にはこのような変形と改変がすべて含まれると解すべきである。また本発明には、本明細書に、個々にもしくはまとめて引用もしくは提示されたステップ、特徴、組成物および化合物のすべて、ならびに前記ステップまたは特徴の二つ以上を組合わせたもののすべてが含まれる。
引用文献
（１）一般情報：
（iii）配列の数：16
（iv）通信の宛先：
（Ａ）受信者：ディビズ・コリソン・ケイブ
（Ｂ）ストリート：リトル・コリンズ・ストリート １
（Ｃ）市：メルボルン
（Ｄ）州：ビクトリア
（Ｅ）国：オーストラリア
（Ｆ）ZIP：3000
（ｖ）コンピュータが読み取り可能な形態：
（Ａ）媒体の種類：フロッピーディスク
（Ｂ）コンピュータ：IBM PC compatible
（Ｃ）オペレーティングシステム：PC-DOS／MS-DOS
（Ｄ）ソフトウエア：PatentIn Release #1.0, Version #1.25
（vi）本出願のデータ：
（Ａ）出願番号：オーストラリア国際特許願
（Ｂ）出願日：1993年８月５日
（Ｃ）分 類：
（viii）弁護士／弁理士の情報：
（Ａ）氏名：スラッタリー，ジョン エム．
（Ｂ）参照／名簿番号：EJH／JMS／EK
（ix）電気通信の情報：
（Ａ）電話：61 3 254 2777
（Ｂ）テレファックス：61 3 254 2770
（Ｃ）テレックス：AA 31787
（２）配列番号：１に関する情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：1211個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：59..1101
（xi）配列の記載：配列番号：１：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：890個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：３．．７２５
（xi）配列の記載：配列番号：２：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：236個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：1..135
（xi）配列の記載：配列番号：３：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：1236個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：70..1068
（xi）配列の記載：配列番号：４：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：1250個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：cDNA
（iii）ハイポセティカル：NO
（ix）特徴：
（Ａ）名称／キー：CDS
（Ｂ）位置：11..1065
（xi）配列の記載：配列番号：５：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：45個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：６：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：26個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：７：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：19個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：８：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：26個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：９：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：10：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（ix）特徴：
（Ａ）（Ｘ，Ｙ）＝ＸまたはＹ
（Ｂ）Ｉ＝イノシン
（xi）配列の記載：配列番号：11：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：20個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：12：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：18個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：13：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：19個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：14：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：18個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：15：
（ｉ）配列の特性：
（Ａ）長さ：34個の塩基対
（Ｂ）種類：核酸
（Ｃ）ストランデッドネス：一本鎖
（Ｄ）トポロジー：線状
（ii）分子の種類：オリゴヌクレオチドDNA
（xi）配列の記載：配列番号：16：
Claims (15)
- 配列番号：１、２、３、４又は５に示されるアミノ酸配列を有するフラボノールシンターゼをコードする核酸分子。
- 配列番号：１、２、３、４又は５に示されるヌクレオチド配列に対して90％以上の類似性を有するヌクレオチド配列を有する、フラボノールシンターゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸分子。
- 配列番号：１、２、３、４又は５に示されるアミノ酸配列において、１〜数個のアミノ酸の付加、除去及び／又は置換により修飾されたアミノ酸配列を有し、フラボノールシンターゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸分子。
- 配列番号：１、２、３、４又は５に示されるヌクレオチド配列またはそれに相補的なヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、フラボノールシンターゼ活性を持つタンパク質をコードする核酸分子。
- ペチュニア、タバコ、カーネーション及びキクからなる群から選択された植物に由来する請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
- ペチュニア、タバコ、カーネーションおよびキクからなる群から選択された植物に由来する請求項５に記載の核酸分子。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子を含んでなるベクター。
- 前記核酸分子が作用可能にプロモーターに連結されている請求項７に記載のベクター。
- 真核細胞内で複製及び発現を行うことができる請求項７又は８に記載のベクター。
- 原核細胞内で複製及び発現を行うことができる請求項７又は８に記載のベクター。
- 請求項７〜10のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換されたトランスジェニック双子葉植物。
- 前記遺伝子配列が発現することができかつ当該発現が任意に調節可能である、請求項11に記載のトランスジェニック双子葉植物。
- 発現が発育中に調節される、請求項12に記載のトランスジェニック双子葉植物。
- ペチュニア及びタバコからなる群から選択される、請求項11〜13のいずれか１項に記載のトランスジェニック双子葉植物。
- 請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子を、ペチュニア又はタバコ植物の細胞内に導入し、その細胞からトランスジェニック植物を再生させ、次いで核酸配列がフラボノールシンターゼを発現できるようにするのに充分な時間および条件下、前記トランスジェニック質転換植物を成長させることを含んでなる、変化した花色特性を示すことができるペチュニア又はタバコ植物の製造方法。
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