JP2003528603A - 植物のアントシアニジンルチノシド芳香族アシルトランスフェラーゼ - Google Patents

植物のアントシアニジンルチノシド芳香族アシルトランスフェラーゼ

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Abstract

(57)【要約】 本発明は一般に、芳香族アシル基転移活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列、ならびにこのような遺伝子配列および／またはそれに対応するポリペプチドの使用に関する。より具体的には、本発明は、ペチュニア（Petunia）、ニーレンベルギア（Nierembergia）、およびスミレ属（Viola spp.）に由来する、芳香族アシル基転移活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を提供する。さらにより具体的には、本発明は、アントシアニジン-ルチノシドに対する芳香族アシル基トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列に関する。本発明はまた、アントシアニジン3-O-ルチノシドに対する芳香族アシル基トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列も提供する。本発明はさらに、本遺伝子配列の全体または一部に対応するアンチセンス分子およびセンス分子のほか、遺伝的に改変された植物、さらにはこのような植物に由来する切花、部分、および繁殖組織にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の分野 本発明は一般に、芳香族アシル基転移活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子配列、ならびにこのような遺伝子配列および／またはそれに対応するポリ
ペプチドの使用に関する。より具体的には、本発明は、ペチュニア（Petunia）
、ニーレンベルギア（Nierembergia）、およびスミレ属（Viola spp.）に由来す
る、芳香族アシル基転移活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子配列を提
供する。さらにより具体的には、本発明は、アントシアニジン-ルチノシドに対
する芳香族アシル基トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
遺伝子配列に関する。本発明はまた、アントシアニジン3-O-ルチノシドに対する
芳香族アシル基トランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする遺伝
子配列も提供する。本発明はさらに、本遺伝子配列の全体または一部に対応する
アンチセンス分子およびセンス分子のほか、遺伝的に改変された植物、さらには
このような植物に由来する切花、部分および繁殖組織(reproductive tissue)に
も関する。
【０００２】発明の背景 本明細書において著者名によって参照した刊行物は、参考文献一覧として明細
書の最後にまとめている。
【０００３】 本明細書におけるあらゆる先行技術に対する言及は、その先行技術がオースト
ラリアまたは任意の他の国において一般的な知識の一部をなすことを承認したも
のではなく、また何らかの形で提案したものでもなく、そのようにみなされるべ
きものでもない。
【０００４】 花および観賞植物の産業界は、花および／または植物の新たな異なる品種を開
発することに力を注いでいる。特に花産業において、このような新たな品種を作
り出すのに効率的な1つの方法として花色の操作が存在し、花および／または植
物の市販の品種のほとんどで、古典的な育種法を用いて広範な色が生み出される
というある程度の成功が得られている。しかし、この方法は特定の種の遺伝子プ
ールに限定されるという制約があり、この理由から、単一の種があらゆる色の品
種を備えていることは稀である。例えば、植物、または花、葉、および茎などの
植物の一部の新たな色の品種を開発することは、切花および観賞植物のいずれの
市場にも大きな好機をもたらすと考えられる。
【０００５】 花産業では、バラ、キク、チューリップ、ユリ、カーネーション、ガーベラ、
ラン、トルコキキョウ、ベゴニア、トレニア、ゼラニウム、ペチュニア、および
ニーレンベルギアなどの重要な種の新たな色の品種の開発に大きな関心を抱いて
いる。さらに具体的な例としては、青色のバラまたは青色のガーベラを切花市場
に向けて開発することであると考えられる。
【０００６】 さらに、野菜、果実、および種子などの植物の部分に関する新たな色の品種の
開発は農業に大きな好機をもたらすと考えられ、例えば、新たな色の種子は植物
に関する権利を示す標識として有用であると考えられる。
【０００７】 花および果実の色は主としてフラボノイドに起因し、これが黄から赤、さらに
は青までに及ぶ範囲の色の原因である。花色の主な原因となるフラボノイド分子
は、シアニジン、デルフィニジン、ペチュニジン、ペオニジン、マルビジン、お
よびペラルゴニジンのグリコシル化誘導体であるアントシアニンであり、これら
は液胞内に位置する。
【０００８】 フラボノイド色素はフェニルプロパノイド経路の二次代謝産物である。フラボ
ノイド色素に関する生合成経路（フラボノイド経路）は明らかにされており（Eb
elおよびHahlbrock、1988；HahlbrockおよびGrisebach、1979；WieringおよびDe
Vlaming、1984；Schramら、1984；Stafford、1990、HoltonおよびCornish、199
5）、図1Aおよび図1Bに示されている。3つの反応および3つの酵素が、フェニル
アラニンからp-クマロイル-CoAへの変換に関与し、これはフラボノイド経路にお
ける最初の重要な基質である。これらの酵素は、フェニルアラニンアンモニアリ
アーゼ（PAL）、桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ（C4H）、および4-クマラート：CoA
リガーゼ（4CL）である。この経路で行われる最初の段階は、マロニル-CoA 3分
子（これはアセチルCoAおよびCO2に対するアセチルCoAカルボキシラーゼ（ACC）
の作用によって生じる）とp-クマロイル-CoA 1分子との縮合にかかわるものであ
る。この反応は、酵素カルコンシンターゼ（CHS）によって触媒される。この反
応の生成物である2',4,4',6'テトラヒドロキシカルコンは、通常、酵素カルコン
フラバノンイソメラーゼ（CHI）によって急速に異性化されてナリンゲニンとな
る。ナリンゲニンはその後、中央の環の3位がフラバノン 3-ヒドロキシラーゼ（
F3H）によりヒドロキシル化されて、ジヒドロケンフェロール（DHK）となる。
【０００９】 DHKのB環は3'位、または3'位と5'位の両方でのヒドロキシル化が可能であり、
これによってそれぞれジヒドロケルセチン（DHQ）およびジヒドロミリセチン（D
HM）となる。B環のヒドロキシル化のパターンは花弁の色の決定に重要な役割を
果たしており、DHKは一般に赤煉瓦色のペラルゴニジンを基とする色素の産生を
もたらし、DHQは一般に赤／ピンクのシアニジンを基とする色素をもたらし、DHM
は一般に青／紫色のデルフィニジンを基とする色素をもたらす。
【００１０】 ジヒドロフラボノール（DHK、DHQおよびDHM）はフラボノール合成酵素による
作用も受けることができ、その結果、フラボノールであるケンフェロール、ケル
セチン、およびミリセチンとなる。フラボノールは無色であるが、アントシアニ
ンに対するコピグメント（copigment）として作用し、花色が強調される。
【００１１】 ジヒドロフラボノールから有色のアントシアニンが生成されるこの経路の次の
段階は、ロイコアントシアニジンの生成にかかわるジヒドロフラボノール-4-レ
ダクターゼ（DFR）が関与する。これらのフラボノイド分子は、通常の生理的条
件下では不安定であり、グリコシルトランスフェラーゼの作用による3位のグリ
コシル化によってアントシアニジン分子が安定化され、このためにアントシアニ
ンの蓄積が可能となる。一般に、グリコシルトランスフェラーゼはUDP糖から糖
部分を転移させるものであり、グリコシル化の位置に対しては高度な特異性を示
すが、糖受容体に対する特異性は比較的低い（SeitzおよびHinderer、1988）。
アントシアニンは、グルコース、ガラクトース、ラムノース、アラビノース、お
よびキシロースなどの糖との3-モノシド、3-ビオシド、および3-トリオシドとし
て存在しうるが、さらに3,5-ジグリコシドおよび3,7-ジグリコシドとしても存在
しうる（StrackおよびWray、1993）。
【００１２】 アントシアニジン分子の安定化にかかわるグリコシルトランスフェラーゼには
、UDPグルコース：フラボノイド3-グルコシルトランスフェラーゼ（3GT）が含ま
れ、これはグルコース部分をUDPグルコースからアントシアニジン分子の3-O位に
転移させてアントシアニジン3-O-グルコシドを生成させる。ペチュニアおよびパ
ンジーでは(特に)、これらのアントシアニンがさらに、別のグリコシルトランス
フェラーゼであるUDPラムノース：アントシアニジン3-グルコシドラムノシルト
ランスフェラーゼ（3RT）によるグリコシル化を受けることができ、アントシア
ニン分子の3-O位に結合したグルコースにラムノース基が付加されてアントシア
ニジン3-ルチノシドが生成されるが、これは一旦アシル化を受けるとUDPグルコ
ース：アントシアニジン3-（p-クマロイル）-ルチノシド5グルコシルトランスフ
ェラーゼ（5GT）によってさらに修飾を受けることができる。
【００１３】 多くのアントシアニジングリコシドはポリアシル化誘導体の形態として存在す
る。ホップ（Hopp）およびザイツ（Seitz）（1987）によって証明された通り、
アシル化は液胞へのアントシアニンの取り込みに重要であると考えられる。アン
トシアニジングリコシドを修飾するアシル基は、その構造に基づいて主に2つの
クラスに分類することができる。これはすなわち、マロン酸またはコハク酸など
の脂肪族アシル基、ならびにp-クマル酸、コーヒー酸、およびフェルラ酸を含む
ヒドロキシ桂皮酸類ならびにp-ヒドロキシ安息香酸などの安息香酸類のような芳
香族クラスである。芳香族アシル基はアントシアニン分子の安定化につながる分
子内および／または分子間のコピグメンテーション（co-pigmentation）の原因
となり、これに伴って深色移動（可視帯の最大吸収波長がプラスに移動すること
）およびその後の色調の青色化が起こることが報告されている（Danglesら、199
3：Luら、1992）（BrouillardおよびDangles、1993）。実際に、青色の花の多く
は芳香族がアシル化されたデルフィニジン色素を含むことが示されている（Goto
およびKondo、1991）。
【００１４】 多くの植物が、グルコースの部位で芳香族によりアシル化されたアントシアニ
ンを含んでおり（BrouillardおよびDangles、1993）、これらのグルコースはC3
、C5、C7、C3'またはC5'位でアントシアニン分子と結合していると考えられてい
る（アントシアニンの構造の図については、StrackおよびWray（1993）を参照の
こと）。例えば、エゴマ（Perilla ocimoides）は、シアニジン3,5-ジグルコシ
ドのC3位のグルコースにクマル酸が結合したシソニンというアントシアニンを含
むことが示されている（Gotoら、1987）。オヤマリンドウ（Gentiana makinoi）
は、C3'位のグルコースに芳香族アシル基が1つ結合し、C5位のグルコースにも芳
香族アシル基が1つ結合したゲンチオデルフィン（gentiodelphin）というアント
シアニンを含むことが示されている（Yoshidaら、1992）。しかし、ペチュニア
・ハイブリダ（Petunia hybrida）の花に存在するアントシアニンは、C3位のグ
ルコース基に結合したラムノース基の箇所でp-クマル酸またはコーヒー酸によっ
てアシル化され、アントシアニジン3-p-クマロイルルチノシド5-グルコシドおよ
びアントシアニジン3-カフェオイルルチノシド5-グルコシドとなる（Griesbach
ら、1991）。アラセイトウ（Silene dioica）の花弁などの他の多くの花でもこ
れは同じであり（Kamsteegら、1980）、ビオラ・トリコロール（Viola tricolou
r）の花はビオラニン（デルフィニジン3-クマロイルルチノシド5-グルコシド）
を含み（Gotoら、1978）、ロベリア・エリナス（Lobelia erinus）の花は3-クマ
ロイルルチノシド基を有するアントシアニンを含み（Kondoら、1989）、ハナシ
ョウブ（Iris ensenta）の花はマルビジン3-クマロイルルチノシド-5-グルコシ
ド、ペチュニジン3-クマロイルルチノシド-5-グルコシドおよびデルフィニジン3
-クマロイルルチノシド-5-グルコシドを含み（Yabuya, T.、1991）、トルコギキ
ョウ（Eustoma grandfiflorum）の花はデルフィニジン3-クマロイルラムノシル
ガラクトシド-5-グルコシドおよびペラルゴニジン3-クマロイルラムノシルガラ
クトシド-5-グルコシドを含む（Asenら、1986）。これらはすべて、アントシア
ニン分子のC3位のグリコシルに結合したラムノース基に芳香族アシル基を結合さ
せることが可能な芳香族アシルトランスフェラーゼを産生することが可能である
と考えられる。
【００１５】 フラボノイド分子に結合したグルコースに芳香族アシル基を転移させるフラボ
ノイド芳香族アシルトランスフェラーゼの単離が、「アシル基転移活性を有する
タンパク質をコードする遺伝子」と題するPCT／JP96／00348号（国際公開公報第
96／25500号）に開示されている。これらの配列には、エゾリンドウ（Gentiana
triflora）由来の5-芳香族アシルトランスフェラーゼ（Fujiwaraら、1998）、エ
ゾリンドウ（pGAT4およびpGAT106）、シネラリア（Senecio cruentus）（pCAT8
）、イングリッシュラベンダー（Lavandula angustifolia）（pLAT21）、エゴマ
（pSAT8）およびペチュニアのホモログ（pPAT48）由来のアントシアニジン-グル
コシド芳香族アシルトランスフェラーゼのコードされたアミノ酸配列が含まれる
。
【００１６】 上記の修飾に加えて、pH、ならびにフラボノールおよびフラボンなどの他のフ
ラボノイドとのコピグメンテーションも花弁の色に影響を及ぼす。フラボノール
およびフラボンも芳香族アシル化を受けることが可能である（Brouillardおよび
Dangles、1993）。
【００１７】 アントシアニジン3-ルチノシドアシルトランスフェラーゼの活性を制御するこ
とができれば、花弁の色を操作し、それによって単一の種により広い範囲の花色
を呈示させることが可能な手段が得られると考えられる。このような制御は、固
有の酵素の産生レベルを調節することによるものであってもよく、または非固有
の酵素を導入することによるものであってもよい。
【００１８】発明の概要 本明細書の全体を通じて、文脈で別に要求されない限り、「含む（comprise）
」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含む（comprising）」
などの変形物は、言及した要素、完全なもの、または要素もしくは完全なものの
群を含むが、他の要素、完全なもの、または要素もしくは完全なものの群を除外
しないことを意味するものとして理解される。
【００１９】 ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列識別番号（配列番号：）によっ
て参照される。「配列番号：」は数値上は配列識別子<400>1、<400>2などに対応
する。配列表は特許請求の範囲の後に提示する。
【００２０】 本発明の1つの局面において、AR-ATもしくはこの酵素の機能的誘導体をコード
するヌクレオチド配列、またはそれらをコードする配列に対して相補的なヌクレ
オチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
【００２１】 本発明のさらにもう1つの局面は、AR-ATまたはAR-ATの機能的変異体、誘導体
、一部、断片、ホモログ、もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列、また
はそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された
核酸分子を対象とする。
【００２２】 本発明のもう1つの局面において、実質的に配列番号：1に記載のヌクレオチド
配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配
列、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：1に記載の配列とハイブ
リダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列を
含む核酸分子が提供される。
【００２３】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：6に記載のヌクレ
オチド配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオ
チド配列、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：6に記載の配列も
しくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相
補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００２４】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：14に記載のヌク
レオチド配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレ
オチド配列、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：14に記載の配列
もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに
相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００２５】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：16に記載のヌク
レオチド配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレ
オチド配列、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：16に記載の配列
もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに
相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００２６】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：22に記載のヌク
レオチド配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレ
オチド配列、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：22に記載の配列
もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに
相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００２７】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：24に記載のヌク
レオチド配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレ
オチド配列、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：24に記載の配列
もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに
相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００２８】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：1、配列番号：6
、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22、もしくは配列番号：24に記載の
ヌクレオチド配列、またはそれらに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌ
クレオチド配列、または低ストリンジェントな条件下で配列番号：1、配列番号
：6、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22、もしくは配列番号：24に記
載の配列もしくはその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列；または
それらに相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子であって、前記ヌ
クレオチド配列がAR-AT活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸
分子が提供される。
【００２９】 本発明のもう1つの局面において、実質的に配列番号：2に記載のアミノ酸配列
、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレ
オチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３０】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：7に記載のアミノ
酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的な
ヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３１】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：15に記載のアミ
ノ酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３２】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：17に記載のアミ
ノ酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３３】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：23に記載のアミ
ノ酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３４】 本発明のさらにもう1つの局面において、実質的に配列番号：25に記載のアミ
ノ酸配列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的
なヌクレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００３５】 本発明のさらにもう1つの局面において、配列番号：1、配列番号：6、配列番
号：14、配列番号：16、配列番号：22もしくは配列番号：24に記載のヌクレオチ
ド配列もしくはそれに相補的な形体(complementary form)を有する分子の一部も
しくは領域に対して実質的な類似性を有する、またはそれらに対して相補的な、
5〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが提供される。
【００３６】 本発明のもう1つの局面は、AR-ATを合成しうるトランスジェニック顕花植物を
作製するための方法であって、前記核酸配列を発現が起こりうる条件下で、前記
AR-ATをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を適した植物細胞に安定に
形質転換する段階、細胞からトランスジェニック植物を再生させる段階、および
核酸配列を発現させるのに十分な時間および条件下で前記トランスジェニック植
物を生育させる段階を含む方法を提供する。このため、このトランスジェニック
植物は、非固有のAR-ATを、比較可能な非トランスジェニック植物で発現される
量よりも高いレベルで産生すると思われる。
【００３７】 本発明のさらにもう1つの局面は、固有または既存のAR-AT活性が低下したトラ
ンスジェニック植物を作製するための方法であって、前記AR-ATをコードするヌ
クレオチド配列またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列
を含む核酸分子を適した植物細胞に安定に形質転換する段階、細胞からトランス
ジェニック植物を再生させる段階、および必要に応じて、核酸を発現させるのに
十分な条件下で前記トランスジェニック植物を生育させる段階を含む方法を意図
している。
【００３８】 本発明のさらにもう1つの局面は、固有または既存のAR-AT活性が低下した遺伝
的に改変された植物を作製するための方法であって、植物細胞に導入された、適
切な改変がなされたAR-AT遺伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換え
を介した固有の配列の改変によってAR-AT遺伝子を改変する段階、および細胞か
ら遺伝的に改変された植物を再生させる段階を含む方法を意図している。
【００３９】 本発明のさらにもう1つの局面は、花序特性の変化を呈するトランスジェニッ
ク顕花植物を作製するための方法であって、本発明の核酸配列を適した植物細胞
に安定に形質転換する段階、細胞からトランスジェニック植物を再生させる段階
、および核酸配列をAR-ATとして発現させるのに十分な時間および条件下で前記
トランスジェニック植物を生育させる段階を含む方法を意図している。
【００４０】 本発明のさらにもう1つの局面は、花序特性の変化を呈する顕花植物を作製す
るための方法であって、植物細胞に導入された、適切な改変がなされたAR-AT遺
伝子またはその誘導体もしくは部分との相同組換えを介した固有の配列の改変に
よってAR-AT遺伝子を改変する段階、および細胞から遺伝的に改変された植物を
再生させる段階を含む方法を意図している。
【００４１】 本発明のさらにもう1つの局面は、AR-ATもしくはその一部をコードする、また
はAR-ATの調節が必要な場合に選択的に転写可能なmRNA分子の全体もしくは一部
に対して実質的に相補的な核酸配列を有する、組換え遺伝子を発現しうるトラン
スジェニック植物を作製するための方法であって、必要に応じて、単離核酸配列
を発現が起こりうる条件下で、AR-ATをコードするヌクレオチド配列またはそれ
をコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子
を適した植物細胞に安定に形質転換する段階、および細胞からトランスジェニッ
ク植物を再生させる段階を含む方法にも関する。
【００４２】 本発明のもう1つの局面は、本発明の核酸配列の全体もしくは一部、またはそ
のアンチセンス形態、および／またはその任意の相同的もしくは関連した形態を
含む、すべてのトランスジェニック植物、トランスジェニック植物の部分、また
はトランスジェニック植物の子孫にも関し、特に花序特性の変化を呈するトラン
スジェニック植物にも関する。
【００４３】 本発明のもう1つの局面は、組換え型のAR-ATを対象とする。
【００４４】 本発明のさらなる局面は、植物中でAR-ATを発現可能である遺伝子構築物(gene
tic construct)、または固有のAR-AT酵素を抑制制御することが可能な遺伝子構
築物の製造における、本明細書に記載の遺伝子配列の使用を意図している。
【００４５】 本発明のさらにもう1つの局面は、AR-ATをコードする遺伝子配列をプラスミド
の形で染色体外に有する原核生物または真核生物を対象とする。
【００４６】 本発明のさらにもう1つの局面は、実質的に配列番号：2、配列番号：7、配列
番号：15、配列番号：17、配列番号：23、もしくは配列番号：25に記載のアミノ
酸配列、または配列番号：2、配列番号：7、配列番号：15、配列番号：17、配列
番号：23、もしくは配列番号：25に対して少なくとも約50％の類似性を有するア
ミノ酸配列を含む組換えポリペプチド、または前記ポリペプチドの誘導体にも関
する。
【００４７】 配列識別子の概要を本明細書に添付する。 配列識別子の概要
【００４８】好ましい態様の詳細な説明 本発明に従って、アントシアニジン・ルチノシドアセチルトランスフェラーゼ
（本明細書において以降「AR-AT」と呼ぶ）をコードする遺伝子配列が同定され
、クローニングされた。組換え配列がフラボノイド分子に結合すると、この組換
え配列はルチノシド（すなわち、グルコース-ラムノース単位で構成される）の
ラムノース部分の芳香族アシル化を調節することができる。基質には、デルフィ
ニジン3-ルチノシド、シアニジン3-ルチノシド、およびペラルゴニジン3-ルチノ
シドのようなアントシアニンの3位に酸素を介して結合したルチノシド基を有す
るアントシアニンが含まれ、それによって花弁の色を操作する手段を提供する。
AR-ATはまた、5位、7位、3'位、4'位、および5'位のようなアントシアニン分子
上の他の位置で酸素を介して結合したルチノシド基を有するアントシアニンを芳
香族アシル化すると考えられる。したがって、本発明は、本発明の配列を導入す
ることによって、既存のAR-AT活性レベルを上昇または減少（すなわち調節）す
ることを含む、植物におけるAR-AT活性を変化させることに関する。AR-AT活性レ
ベルの減少はまた、抑制制御と呼んでもよい。さらに、本発明は、花、種子、野
菜の食用部分、葉、茎等を含む植物体およびその繁殖部分(reproductive part)
または栄養繁殖部分(vegetative part)、より詳しくは観賞用トランスジェニッ
ク植物にも関する。トランスジェニックという用語にはまた、トランスジェニッ
ク植物からの子孫植物が含まれる。
【００４９】 したがって、本発明の一つの局面において、AR-ATもしくはこの酵素の機能的
誘導体をコードするヌクレオチド配列、またはそれらをコードする配列に対して
相補的なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
【００５０】 本発明は、現在まで、特に簡便で、本明細書に開示の本発明を実践するために
有用なフラボノイド芳香族アシル化酵素であるAR-ATをコードする遺伝子配列の
同定、クローニング、および操作を参照することで本明細書に記述および例示さ
れる。しかし、これは、本発明が全ての新規AR-AT酵素およびその機能的誘導体
にも関することを理解して行われるものである。
【００５１】 便宜上および短い表記法のみによって、本明細書においてフラボノイドアシル
化酵素と言う場合、アントシアニン、フラボノール、および／またはフラボンの
ようなフラボノイドに対して作用するAR-ATsが含まれる。好ましくは、フラボノ
イドアシル化酵素はAR-ATである。AR-AT酵素にはまた、AR-AT活性またはAR-AT様
活性を有するポリペプチドまたはタンパク質が含まれると見なしてもよい。後者
は、変化したAR-AT活性を有する誘導体を含む。
【００５２】 したがって、本発明の好ましい局面では、AR-ATまたはAR-ATの機能的変異体、
誘導体、一部、断片、ホモログ、もしくは類似体をコードするヌクレオチド配列
、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む、単離
された核酸分子を対象とする。
【００５３】 「核酸分子」という用語は、天然に存在しない条件における遺伝子配列を意味
する。一般的に、これは、その天然の状態から単離されるか、合成されるか、ま
たは天然には存在しない環境に由来することを意味する。より詳しく述べると、
これには、ゲノムDNA断片、組換え分子または合成分子、および異種核酸と組み
合わせた核酸を含む、インビトロで形成または維持される核酸分子が含まれる。
同様に、これは、そのプロモーターまたは別のプロモーターに対して逆方向にAR
-ATまたはその一部をコードするゲノムDNA、cDNA、またはその一部にも関する。
これはさらに、他の核酸配列と比較して少なくとも部分的に精製した後の天然に
存在する配列にも関する。
【００５４】 遺伝子配列という用語は、本明細書においてその最も一般的な意味において用
いられ、AR-AT酵素におけるアミノ酸配列を直接、または相補的な一連の塩基に
よって特徴付けたヌクレオチド塩基の如何なる連続した配列も含む。そのような
アミノ酸配列は、配列番号：2、配列番号：7、配列番号：15、配列番号：17、配
列番号：23、もしくは配列番号：25に記載のような完全長AR-AT、またはその活
性を有するトランケート型(active truncated form)を含んでもよく、あるいは
酵素のN末端、C末端、または内部部分のような特定の領域に対応してもよい。遺
伝子配列はまた、ヌクレオチドの配列、またはヌクレオチド配列とも呼んでもよ
く、二つまたはそれ以上の配列の組換え的な融合配列を含みうる。
【００５５】 本発明の上記の局面に従って、実質的に配列番号：1に記載のヌクレオチド配
列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配列
、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：1に記載の配列とハイブリ
ダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列を含
む核酸分子が提供される。
【００５６】 本発明に含まれるもう一つの類似性（％）には、少なくとも約60％、少なくと
も約70％、少なくとも約80％、または少なくとも約90％もしくはそれ以上、例え
ば約95％、約96％、約97％、約98％、または約99％が含まれる。
【００５７】 関連する態様において、実質的に配列番号：6に記載のヌクレオチド配列、も
しくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配列、もし
くは低ストリンジェントな条件下で配列番号：6に記載の配列もしくはその相補
鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレオ
チド配列を含む核酸分子が提供される。
【００５８】 もう一つの態様において、実質的に配列番号：14に記載のヌクレオチド配列、
もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配列、も
しくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：14に記載の配列もしくはその相
補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレ
オチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００５９】 さらなる態様において、実質的に配列番号：16に記載のヌクレオチド配列、も
しくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配列、もし
くは低ストリンジェントな条件下で配列番号：16に記載の配列もしくはその相補
鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌクレオ
チド配列を含む核酸分子が提供される。
【００６０】 なおもう一つの態様において、実質的に配列番号：22に記載のヌクレオチド配
列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配列
、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：22に記載の配列もしくはそ
の相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌ
クレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００６１】 なおもう一つの態様において、実質的に配列番号：24に記載のヌクレオチド配
列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配列
、もしくは低ストリンジェントな条件下で配列番号：24に記載の配列もしくはそ
の相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列、またはそれらに相補的なヌ
クレオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００６２】 特に好ましい態様において、実質的に配列番号：1、配列番号：6、配列番号：
14、配列番号：16、配列番号：22、もしくは配列番号：24に記載のヌクレオチド
配列、またはそれらに対して少なくとも約50％の類似性を有するヌクレオチド配
列、または低ストリンジェントな条件下で配列番号：1、配列番号：6、配列番号
：14、配列番号：16、配列番号：22、もしくは配列番号：24に記載の配列もしく
はその相補鎖とハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列；またはそれらに相補的
なヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子であって、前記ヌクレオチド配
列がAR-AT活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供さ
れる。
【００６３】 配列番号：1、配列番号：6、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22、ま
たは配列番号：24に記載の配列とハイブリダイズ可能な核酸分子を定義するスト
リンジェンシーレベルを決定する目的に関して、本明細書において低ストリンジ
ェンシーと言う場合、ハイブリダイゼーションに関して少なくとも約0％v/vから
少なくとも約15％v/vのホルムアミド、および少なくとも約1Mから少なくとも約2
Mの塩が含有および包含され、ならびに洗浄条件に関して少なくとも約1M〜少な
くとも約2Mの塩が含有および包含される。一般的に、低ストリンジェンシーは、
約25〜30℃から約42℃である。温度は変えることができ、ホルムアミドを置換す
るため、および／または代わりのストリンジェント条件を得るため、より高い温
度が用いられる。必要であれば、中等度のストリンジェンシーのような代わりの
ストリンジェント条件を用いてもよく、ハイブリダイゼーションに関して少なく
とも約16％v/vから少なくとも約30％v/vのホルムアミド、および少なくとも約0.
5 M〜少なくとも約0.9 Mの塩が含有および包含され、ならびに洗浄条件に関して
少なくとも約0.5 Mから少なくとも約0.9 Mの塩が含有および包含され、または高
ストリンジェンシーのような代わりのストリンジェント条件を用いてもよく、ハ
イブリダイゼーションに関して少なくとも約31％v/vから少なくとも約50％v/vの
ホルムアミド、および少なくとも約0.01 Mから少なくとも約0.15 Mの塩が含有お
よび包含され、ならびに洗浄条件に関して少なくとも約0.01 Mから少なくとも約
0.15 Mの塩が含有および包含される。一般的に、洗浄は、Tm＝69.3+0.41（G＋C
）％で行う（MarmurおよびDoty、1962）。しかし、二本鎖DNAのTmは、ミスマッ
チ塩基対の数が1％増加する毎に1℃減少する（BonnerおよびLaskey、1974）。こ
れらのハイブリダイゼーション条件ではホルムアミドは任意である。したがって
、特に好ましいレベルのストリンジェンシーは、以下のように定義される：低ス
トリンジェンシーは6×SSC緩衝液、1.0％w/v SDSで25〜42℃の温度範囲；中等度
のストリンジェンシーは2×SSC緩衝液、1.0％w/v SDSで、20℃〜65℃の温度範囲
；高ストリンジェンシーは、0.1×SSC緩衝液、0.1％w/v SDSで少なくとも65℃の
温度である。
【００６４】 本発明のもう一つの局面において、実質的に配列番号：2に記載のアミノ酸配
列、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌク
レオチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００６５】 関連する態様において、実質的に配列番号：7に記載のアミノ酸配列、もしく
はそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配
列を含む核酸分子が提供される。
【００６６】 もう一つの態様において、実質的に配列番号：15に記載のアミノ酸配列、もし
くはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド
配列を含む核酸分子が提供される。
【００６７】 さらなる態様において、実質的に配列番号：17に記載のアミノ酸配列、もしく
はそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配
列を含む核酸分子が提供される。
【００６８】 なおもう一つの態様において、実質的に配列番号：23に記載のアミノ酸配列、
もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオ
チド配列を含む核酸分子が提供される。
【００６９】 さらにもう一つの態様において、実質的に配列番号：25に記載のアミノ酸配列
、もしくはそれに対して少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列をコー
ドするヌクレオチド配列、またはそれをコードする配列に対して相補的なヌクレ
オチド配列を含む核酸分子が提供される。
【００７０】 本明細書において用いられる類似性という用語には、ヌクレオチドまたはアミ
ノ酸レベルで比較した配列間の正確な同一性が含まれる。ヌクレオチドレベルで
同一性が存在しない場合、それにもかかわらず類似性には、構造的、機能的、生
化学的、および／または立体構造レベルで互いに関連する異なるアミノ酸におい
て生じた配列間の差が含まれる。アミノ酸レベルで同一性が存在しない場合、そ
れにもかかわらず類似性には、構造的、機能的、生化学的、および／または立体
構造レベルで互いに関連するアミノ酸が含まれる。特に好ましい態様において、
ヌクレオチドおよび配列の比較は、類似性よりむしろ同一性レベルで行う。
【００７１】 二つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列の関係
を説明するために用いられる用語には、「参照配列」、「比較ウィンドウ」、「
配列類似性」、「配列同一性」、「配列類似性（％）」、「配列同一性（％）」
、「実質的に類似」、および「実質的に同一」が含まれる。「参照配列」は、ヌ
クレオチドおよびアミノ酸残基を含めて、長さが少なくとも12モノマー単位であ
るが、しばしば15〜18モノマー単位、しばしば少なくとも25モノマー単位または
それ以上、例えば30モノマー単位である。二つのポリヌクレオチドは各々が、（
1）2つのポリヌクレオチド間で類似である配列（すなわち、完全なポリヌクレオ
チド配列の一部のみ）；および（2）二つのポリヌクレオチド間で解離している
配列を含んでもよいため、二つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチド間の配列
比較は、典型的に、二つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」を介し
て比較することにより、配列類似性の局所領域を同定および比較することで行わ
れる。「比較ウィンドウ」とは、参照配列と比較して、典型的には12個の連続す
る残基の概念的セグメントを意味する。比較ウィンドウは、二つの配列を最適に
アライメントするために、参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して約
20％またはそれ未満の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。比
較ウィンドウをアライメントするための配列における最適なアラインメントは、
アルゴリズム（ウィスコンシンジェネティクスソフトウェアパッケージ7.0版、
ジェネティクスコンピューターグループ、575 サイエンスドライブ マディソン
、WI、USAにおける、GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）のコンピューターに
よる実行によって、または選択した様々な任意の方法によって作製された検分と
最善のアラインメント（すなわち、比較ウィンドウに対して最高の相同性（％）
が得られる）によって行ってもよい。例えば、アルトシュル（Altschul）ら（19
97）によって開示されたBLASTファミリーのプログラムを参照してもよい。配列
分析の詳細な検討は、オーズーベル（Ausubel）ら（1998）の第19.3章に見出す
ことができる。
【００７２】 本明細書において用いられる「配列類似性」および「配列同一性」という用語
は、比較ウィンドウを介して、配列がヌクレオチドごとまたはアミノ酸ごとに同
一、機能的に同一、または構造的に同一である程度を意味する。従って、例えば
「配列同一性（％）」は、二つの最適にアライメントされた配列を比較ウィンド
ウを介して比較する段階、双方の配列で生じる同一核酸塩基（例えば、A、T、C
、G、I）または同一アミノ酸残基（例えば、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Le
u、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys、およびMet
）の位置の数を決定してマッチした位置の数を得る段階、マッチした位置の数を
比較ウィンドウにおける位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）によって除
する段階、および結果に100を乗じて配列同一性（％）を得る段階によって計算
する。本発明の目的に関して、「配列同一性」は、ソフトウェアに添付の参照マ
ニュアルにおいて用いられる標準的なデフォルト値を用いてDNASISコンピュータ
ープログラム（ウィンドウズ用バージョン2.5；日立ソフトウェアエンジニアリ
ング社、South San Francisco、California、USA）によって計算された「マッチ
（％）」を意味すると理解されよう。同様の注釈は、配列類似性に関しても適用
される。
【００７３】 本明細書において考慮される核酸配列はまた、増幅反応のための遺伝子プロー
ブとして、または植物において対応する遺伝子の発現を調節することが可能なア
ンチセンス分子もしくはセンス分子として、有用なオリゴヌクレオチドを含む。
本明細書において用いられるアンチセンス分子はまた、そのプロモーターまたは
他のプロモーターに対して逆方向に、構造的なゲノム遺伝子もしくはcDNA遺伝子
またはその一部を含む遺伝子構築物を含んでもよい。同様に、相同な遺伝子配列
を含んでもよい。アンチセンス分子またはセンス分子はまた、AR-AT活性を有す
るポリペプチドをコードする遺伝子の末端または内部部分にも向けられてもよい
。
【００７４】 本発明のこの局面に関して、配列番号：1、配列番号：6、配列番号：14、配列
番号：16、配列番号：22もしくは配列番号：24に記載のヌクレオチド配列もしく
はそれに相補的な形体を有する分子の一部または領域に対して実質的な類似性を
有する、またはそれらに対して相補的な、5〜50ヌクレオチドのオリゴヌクレオ
チドが提供される。これに関連して、実質的な類似性または相補性とは、オリゴ
ヌクレオチドハイブリダイゼーションに特異的な、低ストリンジェントな条件、
または好ましくは中等度のストリンジェントな条件、ならびにまたは最も好まし
くは高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能な類似性を意味する（Sa
mbrookら、1989）。そのようなオリゴヌクレオチドは、例えば、様々な起源に由
来するAR-AT遺伝子配列のスクリーニングにおいて、またはトランスジェニック
植物において導入された遺伝子配列をモニターするために有用である。好ましい
オリゴヌクレオチドは、保存されているAR-AT遺伝子配列、または植物の属、植
物種および／または植物の系統もしくは品種において保存されている配列を対象
とする。
【００７５】 本発明の一つの局面において、オリゴヌクレオチドは、AR-AT遺伝子配列の5'
末端または3'末端に対応する。便宜上、5'末端を本明細書において、実質的に構
造遺伝子の開始コドンから遺伝子の中心部分までの領域として定義し、3'末端を
、実質的に遺伝子の中心部分から構造遺伝子の停止コドンまでの領域として定義
するものと見なす。したがって、オリゴヌクレオチドまたはプローブは5'末端も
しくは3'末端、または5'末端および3'末端の双方に対して共通の領域にハイブリ
ダイズしてもよい。本発明は、そのような全てのプローブにも関する。
【００７６】 一つの態様において、AR-ATまたはその様々な機能的誘導体をコードする核酸
配列を用いて、内因性のAR-AT（例えば、コサプレッションにより）レベルを減
少させる。あるいは、この酵素またはその様々な誘導体もしくはその一部をコー
ドする核酸配列をアンチセンス方向に用いて、AR-ATレベルを減少させる。本発
明を如何なる理論または作用機序にも制限する意図はないが、アンチセンスAR-A
T転写物またはその断片もしくはその一部（例えば、オリゴヌクレオチド分子）
は、酵素に対して特異的な天然に存在するmRNAの全てまたは一部と二本鎖を形成
して、mRNAの蓄積またはmRNAから活性な酵素への翻訳を防止する可能性がある。
さらなるもう一つの方法において、標的核酸配列を不活化するためにリボザイム
を用いることができる。
【００７７】 なおさらなる態様は、ポリペプチド材料への翻訳を減少させるための転写後の
阻害を含む。
【００７８】 本明細書においてAR-AT活性を変化させるという用語は、正常な内因性または
既存の活性レベルに比べて上または下に30％まで、より好ましくは30〜50％、さ
らにより好ましくは50〜75％、またはなおより好ましくは75％またはそれ以上の
活性の上昇または減少に関する。そのような上昇または減少は、AR-AT酵素活性
の調節と呼ぶことができる。一般的に、調節は、AR-AT遺伝子配列の転写または
翻訳レベルで行われる。
【００７９】 本発明の核酸は、リボ核酸またはデオキシリボ核酸、一本鎖または二本鎖、お
よび直鎖状の分子または共有結合によって閉環した環状分子であってもよい。好
ましくは、核酸分子はcDNAである。本発明はまた、低ストリンジェントな条件下
、好ましくは中等度のストリンジェントな条件下、および最も好ましくは高スト
リンジェントな条件下で、本発明の核酸分子、特に、配列番号：1、配列番号：6
、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22、または配列番号：24に記載のヌ
クレオチド配列、またはその一部もしくはその領域とハイブリダイズする他の核
酸分子にも関する。その最も好ましい態様において、本発明は、配列番号：1、
配列番号：6、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22、もしくは配列番号
：24に記載のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または配列番号：1、配列番
号：6、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22、もしくは配列番号：24に
記載の配列の少なくとも一つまたは複数の領域に対してヌクレオチドまたはアミ
ノ酸配列レベルで少なくとも40％、より好ましくは少なくとも45％、さらにより
好ましくは少なくとも55％、なおより好ましくは少なくとも65〜70％、およびな
お一層より好ましくは85％以上の類似性を有する分子に及び、核酸はAR-AT活性
を有する酵素をコードする配列をコードしているか、またはそれをコードする配
列に対して相補的である。しかし、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は上記の所
定の割合（％）より低い類似性を有してもよく、なおもAR-AT活性をコードし、
それらが配列保存領域を有する場合には、そのような分子もなお本発明の範囲内
であると見なされることに注意しなければならない。本発明はさらに、先に考慮
した核酸分子、ならびに特に、低ストリンジェントな条件下、好ましくは中等度
のストリンジェントな条件下、および最も好ましくは高ストリンジェントな条件
下で、配列番号：1、配列番号：6、配列番号：14、配列番号：16、配列番号：22
、または配列番号：24に記載の核酸分子において、それらの一部とハイブリダイ
ズ可能なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの形態の核酸分子にも関
する。好ましくはその一部は、遺伝子の5'末端または3'末端に対応する。便宜上
、5'末端を本明細書において、実質的に構造遺伝子配列の開始コドンから遺伝子
の中心部分までの領域として定義し、3'末端を、実質的に遺伝子の中心部分から
構造遺伝子配列の停止コドンまでの領域として定義するものと見なす。したがっ
て、オリゴヌクレオチドまたはプローブは、5'末端もしくは3'末端、または5'末
端および3'末端の両方に対して共通の領域にハイブリダイズしてもよい。本発明
は、そのような全てのプローブにも関する。
【００８０】 遺伝子という用語は、その最も広い意味において用いられ、遺伝子のエキソン
に対応するcDNAが含まれる。したがって、本明細書において遺伝子という場合、
以下のものが含まれると解釈される： （i） 転写および／もしくは翻訳調節配列ならびに／またはコード領域ならび
に／または非翻訳配列（すなわち、イントロン、5'非翻訳配列、および3'非翻訳
配列）を含む古典的なゲノム遺伝子；または （ii） 遺伝子のコード領域（すなわち、エキソン）ならびに5'非翻訳配列およ
び3'非翻訳配列に対応するmRNAまたはcDNA。
【００８１】 遺伝子という用語はまた、発現産物の全てまたは一部をコードする合成分子ま
たは融合分子を説明するために使用される。特定の態様において、核酸分子およ
び遺伝子という用語は、互換的に用いることができる。
【００８２】 核酸またはその相補的な形体は、完全長の酵素またはその一部もしくはその誘
導体をコードしてもよい。「誘導体」とは、天然に存在する酵素に対して、任意
の単一もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失、および／または付加され、且つAR
-AT活性が保持されることを意味する。この点に関して、核酸には、AR-ATをコー
ドする天然に存在するヌクレオチド配列が含まれ、または上記の天然に存在する
配列に対して単一もしくは複数のヌクレオチド置換、欠失、および／または付加
を含んでもよい。本発明の核酸またはその相補的な形体は同様に、活性または不
活性であれ、AR-ATの「一部」をコードしていてもよく、そのような核酸分子は
、オリゴヌクレオチドプローブとして、ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマ
ーとして、様々な変異誘発技術において、またはアンチセンス分子を作製するた
めに、有用となる可能性がある。
【００８３】 本明細書において、核酸分子、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の「一部
」とは、好ましくは、適当であれば少なくとも約10個の連続するヌクレオチドま
たは5個の連続するアミノ酸を含む分子に関する。
【００８４】 本発明のAR-ATのアミノ酸挿入誘導体には、アミノ末端および／またはカルボ
キシル末端の融合、並びに単一または複数のアミノ酸の配列内の挿入が含まれる
。アミノ酸を挿入された配列変種は、一つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク
質における既定の部位に導入される変種であるが、得られた産物に適したスクリ
ーニングを行えば、ランダム挿入も同様に可能である。欠失変種は、配列から一
つまたは複数のアミノ酸が除去されることを特徴とする。アミノ酸を置換された
変種は、配列内で少なくとも一つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿
入されている変種である。典型的な置換は、表1に従って行われるものである。
【００８５】
【表１】 アミノ酸の置換に適した残基
【００８６】 AR-ATをアミノ酸の置換によって誘導体化する場合に、アミノ酸は一般的に、
疎水性、親水性、電気陰性、かさ高い側鎖等の類似の特性を有する他のアミノ酸
によって置換される。アミノ酸の置換は、典型的には単一の残基の置換である。
アミノ酸挿入は通常、約1〜10アミノ酸のオーダーで行われ、欠失は約1〜20残基
の範囲であると考えられる。好ましくは、欠失または挿入は、隣接する対におい
て行われ、すなわち2つの残基の欠失または2つの残基の挿入が行われる。
【００８７】 上記のように言及されるアミノ酸変種は、固相ペプチド合成（Merrifield、19
64）等のような当技術分野で周知のペプチド合成技術、または組換えDNA技術を
用いて容易に作成されうる。既知の配列または部分的に既知の配列を有するDNA
における既定の部位で、置換された変種を作製する技術は周知であり、例えば、
M13変異誘発が含まれる。置換、挿入、または欠失変種として現れる様々なタン
パク質を産生するためのDNA配列の操作は、簡便に、例えばサムブルック（Sambr
ook）ら、（1989））に記載されている。
【００８８】 本発明のAR-AT酵素の組換えまたは合成型の変異体および誘導体に関するその
他の例には、炭水化物、脂質、および／またはタンパク質もしくはポリペプチド
のような、酵素に関連した任意の分子の単一もしくは複数の置換、欠失、および
／または付加が含まれる。
【００８９】 「類似体」または「誘導体」という用語はまた、AR-ATの任意の機能的化学同
等物および上記の任意のアミノ酸誘導体にも関する。便宜上、本明細書において
AR-ATという用語には、任意の機能的変異体、誘導体、その一部、断片、ホモロ
グ、または類似体への言及が含まれる。
【００９０】 本発明は、最も簡便であり、今日まで好ましい材料の供給源であることから、
ペチュニア、ニーレンベルギア（Nierembergia）、またはスミレ属（Viola spp
）に由来する核酸配列を用いて例示される。しかし、当業者は、他の植物または
特定の微生物のような如何なる起源からも類似の配列を単離することができるこ
とを直ちに認識すると思われる。AR-ATを直接または間接的にコードするそのよ
うな核酸配列は全て、その起源にかかわらず本発明に含まれる。アントシアニジ
ン3-ルチノシドアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の他の適した起源
の例には、ビオラ・トリコロール（Viola tricolour）、ロベリア・エリヌス（L
obelia erinus）、トルコギキョウ（Eustoma grandiflorum）、ハナショウブ（I
ris ensenta）、キンギョソウ属（Antirrhinum spp.）、シクラメン、メトロシ
デロス（Metrosideros）、アルストロメリア（Alstroemeria）、ポテンティラ属
（Potentilla spp.）、セントポーリア・イオナンタ（Saintpaulia ionantha）
、ブロメリア属（Bromeliaceae）、およびゼラニウムが含まれるが、これらに限
定されることはない。
【００９１】 本発明に従って、AR-ATをコードする核酸配列をいずれかの方向に導入し、ト
ランスジェニック植物内で発現させることによって（植物細胞内で合成された場
合には）適した基質を最終的にアントシアニジン3-アシルルチノシドに変換する
ための手段、または内因性もしくは既存のAR-AT活性を減少もしくは消失させる
ことによって代謝物のそのような変換を阻害するための代替的な手段のいずれか
が提供される可能性がある。これらのアントシアニンの産生は、花弁の色を改変
し、青色の産生に寄与する可能性がある。植物における核酸配列の発現は、構成
的、誘導的、または発達型であってもよく、同様に組織特異性であってもよい。
発現という用語は、その最も広い意味において用いられ、RNAの産生、またはRNA
とタンパク質の双方の産生が含まれる。同様に、これは核酸分子の部分的発現に
も関する。
【００９２】 本発明のこの局面に従って、核酸配列を発現が起こりうる条件下で、適した植
物細胞にAR-ATをコードするヌクレオチド配列を含む核酸配列を安定に形質転換
する段階、細胞からトランスジェニック植物を再生させる段階、および核酸配列
を発現させるために十分な時間および条件下で上記のトランスジェニック植物を
生育させる段階を含む、AR-ATの合成可能なトランスジェニック顕花植物を産生
する方法が提供される。トランスジェニック植物は、それによって、同等の非ト
ランスジェニック植物において発現される量と比較して、上昇したレベルの非固
有AR-ATを産生する可能性がある。
【００９３】 本発明のもう一つの局面は、AR-AT活性をコードするヌクレオチド配列または
それをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子を適し
た植物細胞に安定に形質転換する段階、細胞からトランスジェニック植物を再生
する段階、および必要な場合には、核酸を発現させるために十分な条件下で上記
のトランスジェニック植物を生育させる段階を含む、固有または既存のAR-AT活
性が減少したトランスジェニック植物を作製する方法を意図する。
【００９４】 本発明のさらにもう一つの局面は、植物細胞に導入された適当に改変されたAR
-AT遺伝子またはその誘導体もしくはその一部からの相同組換えを介した固有の
配列の改変によってAR-AT遺伝子を変化させる段階、および細胞から遺伝的に改
変された植物を再生する段階を含む、固有または既存のAR-AT活性が減少した遺
伝的に改変された植物を作製する方法を意図する。
【００９５】 本明細書において用いられるように、「固有」の酵素は、特定の細胞において
本来または天然に発現される酵素である。「非固有」の酵素は細胞にとって本来
存在しない酵素であるが、植物細胞への遺伝物質の導入、例えば導入遺伝子によ
って発現された酵素である。「内因性」の酵素は、細胞に対して固有であっても
よく、固有でなくてもよい、細胞によって産生された酵素である。
【００９６】 好ましい態様において、本発明は、本発明の核酸配列を適した植物細胞に安定
に形質転換する段階、細胞からトランスジェニック植物を再生する段階、および
核酸配列をAR-ATに発現させるために十分な期間および条件下で上記のトランス
ジェニック植物を生育させる段階を含む、改変された花序特性を示すトランスジ
ェニック顕花植物を作製する方法を意図する。または、本方法は、本発明の核酸
配列またはその相補的な配列を適した植物細胞に安定に形質転換する段階、細胞
からトランスジェニック植物を再生する段階、および固有または既存のAR-AT活
性レベルを変化させるために十分な期間および条件下で上記のトランスジェニッ
ク植物を生育させる段階を含んでもよい。好ましくは、変化したレベルは、比較
可能な非トランスジェニック植物におけるAR-AT活性の固有または既存のレベル
よりも低いと考えられる。本発明を制限する意図はないが、作用機序の一つの理
論では、固有のAR-AT活性の減少は、導入された核酸配列またはそれに相補的な
配列の発現を必要としている。しかし、導入された遺伝子配列またはその相補鎖
の発現は、望ましい活性、すなわち改変された花序特性を示す顕花植物を得るた
めに必要ではない可能性がある。
【００９７】 関連する態様において、本発明は、植物細胞に導入された適当に改変されたAR
-AT遺伝子またはその誘導体もしくはその一部からの相同組換えを介した固有の
配列の改変によってAR-AT遺伝子を変化させる段階、および細胞から遺伝的に改
変された植物を再生する段階を含む、改変された花序特性を示す顕花植物を作製
する方法を意図する。
【００９８】 好ましくは、変化した花序は、レシピエント植物の遺伝子型および生理状態に
応じて、異なる色度である青色もしくは赤色の花、または他の色の花を作製する
段階を含む。
【００９９】 したがって、本発明は、AR-ATもしくはその一部をコードする組換え遺伝子を
発現可能であるトランスジェニック植物、またはAR-ATの調節を行うために必要
な場合に選択的に転写可能なmRNA分子の全てもしくは一部と実質的に相補的であ
る核酸配列を有するトランスジェニック植物を作製する方法であって、単離され
た核酸分子を発現が起こりうる条件において必要な場合には、AR-ATをコードす
るヌクレオチド配列またはAR-ATをコードする配列に対して相補的なヌクレオチ
ド配列を含む単離された核酸分子を適した植物細胞に安定に形質転換する段階、
および細胞からトランスジェニック植物を再生する段階を含む方法にも関する。
適した植物とは、アントシアニジン3-ルチノシドを産生して、所望の色の発達に
必要な適当な生理的特性を有しうる植物を意味する。
【０１００】 当業者は、標的とする植物に本来存在する酵素の発現を増加または減少させて
、青色または赤色等の異なる色度の色を得ることのような、本発明の方法に応用
可能な改変を直ちに認識すると思われる。
【０１０１】 したがって、本発明は、本発明の核酸配列の全てもしくは一部、またはそのア
ンチセンス型および／またはそのホモログまたは関連する形態、特に改変された
花序特性を示すトランスジェニック植物を含む、全てのトランスジェニック植物
、トランスジェニック植物の一部、またはトランスジェニック植物の子孫にも関
する。トランスジェニック植物は、AR-ATをコードするヌクレオチド配列、また
はそれをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含む導入された核
酸分子を含んでもよい。本発明は、植物細胞内で複製可能なDNAまたはRNAウイル
スのような自律的に複製する核酸配列内にAR-ATヌクレオチド配列を導入するこ
とにも関するが、一般的に核酸は、植物ゲノムに安定に導入されると考えられる
。本発明はまた、そのようなトランスジェニック植物の種子にも関する。そのよ
うな種子は、特に着色している場合、植物にとって固有のタグとして有用である
。遺伝物質を植物細胞に導入する如何なるおよび全ての方法も本発明に含まれる
。
【０１０２】 本発明のさらなる局面は、AR-ATの組換え形態を対象とする。酵素の組換え形
態は、例えば、より活性な酵素を開発するための研究材料源を提供し、着色化合
物を産生するためのインビトロ系を開発するために有用となる可能性がある。
【０１０３】 本発明のなおさらなる局面は、植物内でAR-ATを発現することができる遺伝子
構築物、または固有のAR-AT酵素を抑制制御することができる遺伝子構築物の製
造に、本明細書に記載の遺伝子配列を用いることを意図する。
【０１０４】 本発明のもう一つの局面は、プラスミド形態で染色体外にAR-ATをコードする
遺伝子配列を有する原核生物または真核生物を対象とする。
【０１０５】 本発明はさらに、実質的に配列番号：2、配列番号：7、配列番号：15、配列番
号：17、配列番号：23、もしくは配列番号：25に記載のアミノ酸配列、または配
列番号：2、配列番号：7、配列番号：15、配列番号：17、配列番号：23、もしく
は配列番号：25と少なくとも約50％の類似性を有するアミノ酸配列を含む組換え
ポリペプチド、または上記のポリペプチドの誘導体にも関する。
【０１０６】 「組換えポリペプチド」とは、ヒトの介入によって直接もしくは間接的に細胞
に導入されたヌクレオチド配列、または親細胞、近縁細胞、もしくは前駆細胞に
導入されたヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを意味する。ま
た、組換えポリペプチドは無細胞系のインビトロ転写系を用いて合成することが
できる。「組換えポリペプチド」という用語には、単離ポリペプチドが含まれ、
または存在する場合には、細胞または細胞調製物である。同様に、上記のポリペ
プチドを産生する細胞から再生された植物または植物の一部であってもよい。
【０１０７】 「ポリペプチド」には、ペプチドまたはタンパク質が含まれ、これは「酵素」
という用語に含まれる。
【０１０８】 組換えポリペプチドはまた、二つまたはそれ以上の異種アミノ酸配列を含む融
合分子であってもよい。
【０１０９】 以下の非制限的な実施例によって、本発明をさらに説明する。
【０１１０】 実施例1 植物材料 用いた栽培品種ペチュニア・ハイブリダ（Petunia hybrida）を表2に示す。
【０１１１】
【表２】 栽培品種ペチュニア・ハイブリダ INRA＝フランス、Cedexの国立農業研究所 OGBペチュニア植物は、光度10,000ルクス、温度22〜26℃で1日14時間照明の特別
生育室で生育させた。OGBの花は、以下のように定義される生長段階で採取した
： 第1期：無色の閉じたつぼみ（長さ＜25 mm）； 第2期：有色の閉じたつぼみ（長さ25〜35 mm）； 第3期：花冠が現れつつある暗紫色のつぼみ（長さ＞35 mm）； 第4期：葯が裂開する前の暗紫色の開いた花（長さ＞50 mm）； 第5期：全ての葯が裂開した完全に開花した花。
【０１１２】 パンジーの生長段階 一般的に、パンジーの花は、以下のように定義される生長段階で採取した： 第1期：無色の閉じたつぼみ（長さ＜14 mm）； 第2期：強く着色した閉じたつぼみ（長さ14〜16 mm）； 第3期：花弁が現れつつある強く着色したつぼみ（長さ16〜22 mm）； 第4期：花弁が現れつつある強く着色した花（長さ22〜25 mm）； 第5期：完全に開花した花（長さ＞24 mm）。
【０１１３】 実施例2 細菌株 用いた大腸菌株は以下の通りであった：
【０１１４】 実施例3 一般法 一般的に、以下の方法はサムブルック（Sambrook）ら、(1989)に記載されたと
おりであった。
【０１１５】 病原性を除いたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tume
faciens）株、AGL0（Lazoら、1991）を使用した。クローニングベクターpBluesc
ript、pBluescribe、およびPCR scriptは、ストラタジーン社（STRATAGENE）よ
り入手した。pCR7 2.1は、インビトロジェン社（INVITROGEN）から得た。
【０１１６】 大腸菌の形質転換 大腸菌株の形質転換は、イノウエ（Inoue）ら(1990)の方法に従って行った。
【０１１７】 DNAプローブの32P標識 DNA断片（50〜100 ng）を、ギガプライムキット（GENEWORKS）を用いて[α-32 P]-dCTP 50 μCiによって放射性標識した。取り込まれなかった[α-32P]-dCTPは
、セファデックスG-50（ファイン）カラムでのクロマトグラフィーによって除去
した。
【０１１８】 プラスミドの単離 ヘルパーファージR408（STRATAGENE）を用いて、製造元の記載した方法に従っ
て、増幅したλZAP cDNAライブラリーからペチュニアのcDNA挿入物を含むpBlues
criptファージミドを切り出した。大腸菌XL1-Blueにファージミド混合物をトラ
ンスフェクトして、100 μg/mLアンピシリンを含むLBプレート上にコロニーを播
種した（Sambrookら、1989）。アンピシリン（100 μg/mL）を含むLB培地中で増
殖させること（Sambrookら、1989）、アルカリ溶菌法（Sambrookら、1989）また
はウィザードプラスSVミニプレップスDNA精製システム（Promega）を用いてプラ
スミドを単離することにより、cDNA挿入物に関して個々のコロニーを分析した。
cDNA挿入物が存在することが決定された場合には、大量のプラスミドDNAを、QIA
フィルタープラスミドミディキット（QIAGEN）を用いて一晩培養した50 mLの培
養物から調製した。
【０１１９】 DNA配列分析 DNAの配列決定は、アプライドバイオシステムズ社（Applied Biosystems）のP
RISM（商標）レディリアクションダイプライマーサイクルシークエンシングキッ
トを用いて行った。製造元によって提供されたプロトコールに従った。サイクル
シークエンシング反応は、パーキンエルマーPCR機器（GeneAmp PCR system 9600
）を用いて行い、自動373A DNAシークエンサー（Applied Biosystems）により実
行した。
【０１２０】 Genbank、SWISS-PROT、およびEMBLデータベースに対する相同性検索は、FASTA
およびTFASTAプログラム（PearsonおよびLipman、1988）、またはBLASTプログラ
ム（Altschulら、1990）を用いて実施した。配列類似性（％）は、LFASTAプログ
ラム（PearsonおよびLipman、1988）を用いて得た。全ての場合において、特に
明記していない限り、ヌクレオチド配列比較に関してktup値6、アミノ酸配列比
較に関してktup値2を用いた。
【０１２１】 複数の配列アライメントおよびブートストラップツリーをそれぞれ、ClustalW
（Thompsonら、1996）、およびnjplot（[email protected]）を用い
て作製した。
【０１２２】 実施例4 ペチュニア・ハイブリダからの部分的アントシアニジンルチノシドアシルトラン
スフェラーゼ（AR-AT）cDNAクローンの単離 ペチュニア・ハイブリダ品種V26（P. hybrida cv. V26）花弁cDNAライブラリー
の構築およびスクリーニング cDNAライブラリーは、V26株（Anl+）（Kroonら、1994）の花冠周囲組織からの
mRNAに基づいて構築した。約30,000 pfuのV26花cDNAライブラリーを90 mmプレー
ト当たり800 pfuの密度で播種した。ハイボンド-Nメンブレン（Amersham）上に
、1プレートについて2枚の転写を行い、製造元の推奨通りに処理した。フィルタ
ーをAnl+（V26）およびanl-株（W162）からの第一鎖cDNAにハイブリダイズした
。ハイブリダイゼーション条件には、50％v/vホルムアミド、5×SSPE、5×デン
ハルト溶液、0.1％w/v SDS、100 μg/mLニシン***DNA中、42℃で3時間のプレハ
イブリダイゼーション段階が含まれた。ハイブリダイゼーションでは、32P標識
した第一鎖cDNA 1.0×108 cpmとポリ（A）100 μgを加え、42℃で16〜48時間の
インキュベーションを行った。フィルターを1×SSC/0.1％w/v SDSにおいて60℃
で30分間洗浄をし、次いでコダックXARフィルムに3〜4日間露光した。プラーク
形成単位（pfu）30,000個中270個がanl- cDNAプローブに対するよりAnl+ cDNAプ
ローブに対して実質的に強いハイブリダイゼーションを示した。これらのうち、
これまでクローニングされた色素合成系遺伝子（chs、chi、およびdfr）とハイ
ブリダイズしなかった35個を均一になるまで精製した。対毎の相互ハイブリダイ
ゼーションによって、これらの35個のクローンが異なる7つのクラスの遺伝子、
すなわちdifA、difC、difF、difG、difH、およびdifIを表すことが示された。Di
fGは、その後、ペチュニア・ハイブリダのRt遺伝子を表すことが示された（Kroo
nら、1994）。残りの6つのクラスの発現プロフィールは、difGと類似の空間的、
時間的、および遺伝的な制御を示すことが示された（Kroonら、1994）。
【０１２３】 difCクローンは約1kbであることが示され、このプラスミドはpCGP1902として
命名された（図2）。RFLP分析によって、difCクローンが第V染色体上のHf2遺伝
子座に弱く連鎖しており、Gf遺伝子の候補であることが示された。Gf遺伝子座は
、ペチュニアにおけるアントシアニジン3-ルチノシドのアシル化を制御する。di
fCクローンをさらなる分析のために選択した。
【０１２４】 実施例5 ペチュニア・ハイブリダからの完全長のAR-AT cDNAクローンの単離 OGB花弁cDNAライブラリーの構築 ターペン（Turpen）およびグリフィス（Griffith）(1986)の方法を用いて、ペ
チュニア・ハイブリダ品種オールドグローリーブルー（P. hybrida cv. Old Glo
ry Blue(OGB)）の第3期または第4期の花の花弁組織から全RNAを単離した。3サイ
クルのオリゴ-dTセルロースクロマトグラフィーによってポリ(A)+ RNAを全RNAか
ら選択した（AvivおよびLeder、1972）。
【０１２５】 ポリ(A)+ RNA2μgを、10 mMジチオスレイトール、500 μM dATP、500 μM dGT
P、500 μM dTTP、500 μM 5-メチル-dCTP、オリゴヌクレオチド（配列番号：3
）0.75 μg、およびSuperscript（商標）逆転写酵素（BRL）2μLを含む1×Super
script（商標）反応緩衝液20 μL中で逆転写した。反応混合物を37℃で50分、44
℃で10分インキュベートした後、氷上に置いた。
【０１２６】 第二鎖反応混合物（140 μL）を第一鎖反応混合物に加えた。第二鎖反応混合
物は、21 mMトリス塩酸、104 mM KCl、5.3 mM MgCl2、171 μM β-NAD、11.4 mM
(NH4)2SO4、214 μM dATP、642 μM dCTP、214 μM dGTP、214 μM dTTP、4mM
DTT、10 μCi 32P-dCTP（3000 Ci/mMole）、15単位の大腸菌DNAリガーゼ、40単
位の大腸菌DNAポリメラーゼI（Boehringer）、および0.8単位のRNAseHで構成さ
れた。最終混合物を16℃で150分間インキュベートした。二本鎖cDNAを平滑末端
化するために、10単位のT4 DNAポリメラーゼを加え、反応をさらに16℃で15分継
続した。反応を停止させて、cDNAをフェノール／クロロホルム抽出によって精製
した後、クロロホルム抽出およびエタノール沈殿を行った。
【０１２７】 EcoRIアダプター（Promega）をcDNAにライゲーションした後、製造元が推奨す
る条件下でキナーゼ処理した。酵素を熱（70℃、20分）で変性させて、DNAをフ
ェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によって精製した。cDNAを、
製造元が推奨する条件を用いて、反応液容量100 μL中50単位のXhoI（Boehringe
r）によって消化した。酵素を熱処理により不活性化し（70℃、20分）、混合物
をSTE緩衝液で平衡化したS400スピンカラム（Pharmacia）を通過させた（Sambro
okら、1989）。溶出物をフェノール／クロロホルム抽出して、エタノール沈殿さ
せた。4℃で30分間の微量遠心後、cDNAペレットを70％v/vエタノールですすぎ、
風乾して、TE緩衝液10 μLに再懸濁した（1mMトリス塩酸（pH 7.5）、1mM EDTA
）。
【０１２８】 cDNA混合物のアリコート2.5μLを、50 mMトリス塩酸（pH 7.0）、10 mM MgCl2 、10 mMジチオスレイトール、1mM ATP、および2単位のT4 DNAリガーゼを含む反
応緩衝液5μL中で、1μgのλZAPIIをEcoRI/XhoI/CIAP（仔ウシ腸アルカリホスフ
ァターゼ）で処理したベクター（STRATAGENE）にライゲーションした。反応は4
℃で4日間実施した。
【０１２９】 室温で2時間インキュベートした後、ライゲーション反応混合物を、パッカジ
ーンシステム（Promega）を用いてパッケージングした。組換え体の総数は1×106 pfuであった。
【０１３０】 PLK-F'細胞をトランスフェクトした後、パッケージングしたλZAPII/cDNAを50
,000 pfu／直径15 cmプレートで播種した。プレートを37℃で8時間インキュベー
トして、ファージを100 mM NaCl、8mM MgSO4、50 mM トリス塩酸、pH 8.0、0.01
％ゼラチン（ファージ保存緩衝液（PSB））中で溶出した。クロロホルムを加え
て、ファージを増幅ライブラリーとして4℃で保存した。
【０１３１】 40,000 pfuの増幅したライブラリーを、XL1-Blue MRF'細胞をトランスフェク
トした後に、NZYプレートに20,000 pfu／15 cmプレートの密度で播種して、37℃
で8時間インキュベートした。4℃で一晩インキュベートした後、コロニー／プラ
ークスクリーン（商標）フィルター（DuPont）上に、1プレートについて2枚の転
写を行い、製造元の推奨通りに処理した。
【０１３２】 OGBライブラリーのスクリーニング ハイブリダイゼーションの前に、2枚のプラーク転写膜を前洗浄溶液（50 mMト
リス塩酸、pH 7.5、1M NaCl、1mM EDTA、0.1％w/vサルコシン）中で65℃で30分
間洗浄し；0.4 M水酸化ナトリウム中で65℃で30分間剥離させた後、0.2 Mトリス
塩酸pH 8.0、0.1×SSC、0.1％w/v SDSの溶液中で65℃で30分間洗浄し、最後に2
×SSC、1.0％w/v SDS中ですすいだ。
【０１３３】 OGB花弁cDNAライブラリーに由来する2枚の転写膜を、pCGP1902由来の32Pで標
識したEcoRI/XhoI difC断片によりスクリーニングした（図2）。
【０１３４】 ハイブリダイゼーション条件には、50％v/vホルムアミド、1M NaCl、10％w/v
硫酸デキストラン、1％w/v SDS中で42℃で少なくとも1時間のプレハイブリダイ
ゼーション段階が含まれた。32P標識断片（1×106 cpm/mL）をハイブリダイゼー
ション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを42℃でさらに16時間継続した。
フィルターは、2×SSC、1％w/v SDS中で、42℃で30分間、2回の洗浄を行った後
、0.2×SSC、1％w/v SDS中で65℃で30分間洗浄して、増感スクリーンを用いてコ
ダックXARフィルムに−70℃で4時間露光した。
【０１３５】 ハイブリダイズしたプラーク（C1〜C10と命名）10個をPSB中に採取した。これ
らを再度スクリーニングして、cDNAライブラリーの初回スクリーニングに関して
記載したハイブリダイゼーション条件を用いて純粋なクローンを単離した。λZA
Pバクテリオファージベクターに含まれるプラスミドをレスキューし、cDNA挿入
物の3'末端および5'末端から配列データを作製した。これらの中で、C9は最も長
いcDNAクローン（〜1.4 kb）を示し、このプラスミドをpCGP1904と命名した（図
3）。
【０１３６】 C9 cDNAクローンの完全な配列（配列番号：1）（pCGP1904に含まれる）を、ラ
ンダムに重複するクローンの作製に関する標準的な技法を用いて得られた異なる
pUC18サブクローンからの配列の編集によって決定した（Sambrookら、1989）。
配列は、457個のアミノ酸（配列番号：2）の推定ポリペプチドをコードする1371
塩基の推定されるオープンリーディングフレームを含んだ。
【０１３７】 実施例6 酵母において発現されたC9 cDNAクローンのアシルトランスフェラーゼ活性 酵母発現系を用いて、C9 cDNAクローンが、フラボノイド分子に結合したルチ
ノシドをアシル化できるアシルトランスフェラーゼ酵素をコードするか否かを決
定した。
【０１３８】 pCGP1912の構築 プラスミドpCGP1912（図4）を、pCGP1904（図3）由来のC9 cDNA挿入物をpYE22
mの酵母グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターの下流にセ
ンス方向にクローニングすることによって構築した（Tanakaら、1988）。
【０１３９】 1.4 kbのC9 cDNA断片は、プラスミドpCGP1904をAsp718/EcoRIを用いて消化す
ることにより切り出された。cDNA断片をブレサクリーン-キット（Bresaclean ki
t）（Bresatec）を用いて単離および精製し、pYE22mのAsp718/EcoRI末端とライ
ゲーションした。ライゲーションは、製造元の推奨する条件を用いてアマシャム
ライゲーションキットによって行われた。pYE22m中に挿入物が正しくライゲーシ
ョンされたことを、アンピシリン耐性酵母形質転換体から単離されたプラスミド
DNAのAsp718/EcoRI制限エンドヌクレアーゼ消化によって確認した。
【０１４０】 酵母の形質転換 酵母G-1315株（Mat α、trpl）（Ashikariら、1989）を、イトウ（Ito）ら（1
983）に従って、pCGP1912（図4）を用いて形質転換した。形質転換体は、G-1315
のトリプトファン原栄養性への回復能によって選択した。
【０１４１】 アシルトランスフェラーゼ活性のアッセイ法のための酵母抽出物の調製 G-1315/pCGP1912（AT-1〜AT-4）の単一に分離した4株を、改変バークホルダー
（Burkholder）培地（20.0 g/Lデキストロース、2.0 g/L L-アスパラギン、1.5
g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4・7H2O、0.33 g/L CaCl2、2g/L (NH4)2SO4、0.1 mg/
L KI、0.92 g/L (NH4)6Mo7O24・4H2O、0.1 g/Lニトリロ3酢酸、0.99 mg/L FeSO4 ・7H2O、1.25 mg/L EDTA、5.47 mg/L ZnSO4・7H2O、2.5 mg/L FeSO4・7H2O、0.7
7 mg/L MnSO4・7H2O、0.196 mg/L CuSO4・5H2O、0.124 mg/L Co(NH4)2(SO4)2・6
H2O、0.088 mg/L Na2B4O7・10H2O、0.2 mg/Lチアミン、0.2 mg/Lピリドキシン、
0.2 mg/Lニコチン酸、0.2 mg/Lパントテネート、0.002 mg/Lビオチン、10 mg/L
イノシトール）30 mLに接種して、その後緩く攪拌しながら30℃で3晩インキュベ
ートした。細胞を5000 rpmで5分間遠心分離して回収し、50 mM PO4（pH 7.5）、
2mM 2-β-メルカプトエタノール1mLに再懸濁した。次に、細胞をガラス製のダウ
ンス（Dounce）ホモジナイザー中で20回ストロークして（20 strokes）ホモジナ
イズした。ホモジナイズした懸濁液を4℃、13,000 rpmで10分間遠心分離した。
【０１４２】 Br140の花弁抽出物の調製物（AR-ATの供給源） ペチュニアAR-ATの粗ホモジネートを調製するために、Br140由来の花弁組織1
グラムを砂1グラムおよびPVP 0.5 gと共に、100 mM PO4 pH 7.0/5mM 2-βME（β
-メルカプトエタノール）5mL中で乳棒と乳鉢を用いてホモジナイズした。粗ホモ
ジネートをミラクロスで濾過して、次に濾液を4℃、13,000 rpmで10分間遠心分
離した。その後上清を、100 mM PO4 pH 8.0/5mM 2 βMEを用いてNAP-5カラムに
通した。この粗ホモジネートを、以下の表3に記載するアシルトランスフェラー
ゼ活性アッセイ法に用いた。
【０１４３】 酵母抽出物のアシルトランスフェラーゼアッセイ法 反応を表3において詳しく説明するように設定して、30℃で1時間インキュベー
トした。各反応を、5％HCOOHを含むCHCl3：CH3COOH（2：1）25 μLを加え、混合
物を攪拌することによって停止させた。13,000 rpmで5分間遠心分離した後、上
相を回収して、真空チャンバー遠心機において蒸発堅固させた。ペレットをH2O
：CH3COOH（12：1）3μLに再度溶解させ、1.5 μLをTLC（薄層クロマトグラフィ
ー）セルロースプレート上にスポットした。TLCプレートを、CH3COOH：HCl：H2O
（30：3：67）においてクロマトグラフィーにかけた。
【０１４４】
【表３】 粗ペチュニア花弁ホモジネートおよび形質転換された酵母抽出物（AT
-1〜AT-4）のアシルトランスフェラーゼアッセイ法の設定および結果 D3R＝デルフィニジン3-ルチノシド、 Br140＝粗花弁ホモジネート、 AT-1〜AT-4＝pCGP1912で形質転換された酵母の抽出物、 ＋＝TLC上でアシル化されたデルフィニジン3-ルチノシドが観察された（粗ペチ
ュニア花弁ホモジネートを用いる反応から得られた産物と共に移動する）（試験
管1）、 −＝TLC上でデルフィニジン3-ルチノシドのみが検出された。アシル化は観察さ
れなかった。
【０１４５】 結果により、アシル化が、粗Br140抽出物（陽性対照）およびAT-1〜AT-4由来
の酵母抽出物において観察されたが、カフェオイル（caffeoyl）Co-Aが存在する
場合に限って（試験管1、3、5、7、9および11）認められたことを示した。アシ
ル化は、D3RおよびカフェオイルCoAを用いても、粗Br140花弁ホモジネートまた
はpCGP1912（AT-1〜AT-4）で形質転換された酵母由来の抽出物のいずれかを加え
なければ観察されなかった。TLCの結果により、C9 cDNAクローンがカフェオイル
CoAを利用してD3Rをアシル化できるAR-ATをコードする、直接の証拠が提供され
た。
【０１４６】 HPLC分析 試料の残りの1.5 μLを、フェノメネックス・ウルトラカーブ（Phenomenex Ul
tracarb）5ODS（30）カラム（150×4.6 mm）を用いてHPLCによって分析した。用
いた溶媒系はCH3CN：TFA：H2O（21.6：0.1：67）であり、流速1mL/分を用いた。
検出器は520 nmであり、ピークは手動で回収された。
【０１４７】
【表４】 アシルトランスフェラーゼアッセイ法において産生されたピークの保
持時間を示すHPLC結果 D3R＝デルフィニジン3-ルチノシド、 Br140＝粗花弁ホモジネート、 AT-1〜AT-4＝pCGP1912で形質転換された酵母の抽出物、 ＋＝反応に含まれる、 −＝反応に加えられない、 RT＝保持時間（分）
【０１４８】 D3R単独のHPLC分析により、保持時間1.3および1.9の異なる2つのピークが生じ
た。これら2つのピークを回収して、TLC系に供した。2つのピークは同時に移動
したので、D3Rの異性体であると思われる。
【０１４９】 HPLC分析により、D3R、カフェオイルCoA、および、ペチュニアBr140粗ホモジ
ネートまたは形質転換された酵母抽出物のいずれかを含む反応試験管において保
持時間2.2の追加のピークが検出された（試験管2、4および6）（表4）。
【０１５０】 これにより、ペチュニアC9 cDNAクローンが、ペチュニアBr140花弁抽出物（陽
性対照）に含まれるAR-AT酵素と同様に、D3Rをアシル化できるAR-ATをコードす
ることを示唆する証拠が提供された。
【０１５１】 実施例7 大腸菌において発現されたペチュニアAR-AT（C9）cDNAクローンのアシルトラン
スフェラーゼ活性 C9 cDNAクローンをまた、大腸菌発現系において発現させ、AR-AT活性に関して
アッセイした。
【０１５２】 5'末端および3'末端におけるそれぞれNcoI部位およびBamHI部位の作製（pCGP310
5の構築） ペチュニアC9クローン（ペチュニアAR-AT＝PAR-AT）を大腸菌発現ベクターで
あるpQE60（QIAGEN）内にクローニングするためには、開始ATGにおいてNcoI部位
が必要であり、推定停止コドンの直前にBamHI部位が必要であった。開始ATGにお
けるNcoI部位および推定停止コドン直前のBamHI部位を作製するために、以下の
オリゴヌクレオチド（表5）を設計した。
【０１５３】
【表５】
【０１５４】 petatF（配列番号：4）およびpetatR（配列番号：5）のオリゴヌクレオチドを
プライマーとして、鋳型としてのpCGP1904と共に用いて、開始AUGにおけるNcoI
認識部位および推定停止コドン直前にBamHI認識部位を有するペチュニアAR-ATク
ローンを増幅した。得られたPCR産物をゲル中で電気泳動させ、約1.2 kbの断片
を切り出して精製した後、製造元の推奨する技法に従ってPCR-Script（STRATAGE
NE）にクローニングした。得られたプラスミドをpCGP3105（mut PAR-AT）と命名
した。
【０１５５】 PCRにおいて用いられたpetatF（配列番号：4）オリゴヌクレオチドは、ペチュ
ニアのAR-AT配列とは異なる3塩基を含んでいた。したがって、配列は、 から へと変化した。その結果、推定開始メチオニン周辺の翻訳されたアミノ酸は、RY
IMNQからRYTMDQへと変化した。
【０１５６】 pQE60ベクターへのクローニング（pCGP3106の構築） pCGP3105に含まれるクローニングされたPCR産物は、NcoIおよびBamHIによる消
化により切り出された。得られた1.4 kb断片をゲル上で単離して切り出し、精製
した後、製造元の推奨に従ってpQE60ベクター（QIAGEN）のNcoI/BamHI末端にラ
イゲーションした。多くの制限エンドヌクレアーゼ消化物を用いて、特異的な1.
4 kb挿入物の有無に関して形質転換体を分析した。得られたプラスミドをpCGP31
06（pQE60におけるペチュニアAR-AT）と命名した。
【０１５７】 アシルトランスフェラーゼ活性 pCGP3106におけるペチュニアC9クローンの活性を、フジワラ（Fujiwara）ら、
1997に記載されたアッセイ条件を用いて、基質デルフィニジン3-グルコシドおよ
びデルフィニジン3-ルチノシドについて評価した（表6）。
【０１５８】
【表６】 デルフィニジン3-ルチノシドまたはデルフィニジン3-グルコシドを基
質として用いるpCGP3106またはpQE60対照ベクターを含む大腸菌抽出物のアシル
トランスフェラーゼアッセイの結果 D3R＝デルフィニジン3-ルチノシド、 D3G＝デルフィニジン3-グルコシド、 nd＝実施せず、 ＋＝基質のアシル化がHPLCにおける新しいピークによって認められた、 −＝反応が認められず、HPLCにおいて基質のみが認められた。
【０１５９】 大腸菌発現系においてC9 cDNAクローンの発現について得られた結果は、ペチ
ュニア由来のC9 cDNAクローンが、カフェオイルCo-AまたはクマロイルCo-Aのい
ずれかをアシル基供与体として用いてデルフィニジン3-ルチノシドをアシル化で
きるAR-ATをコードすることを示唆するさらなる証拠を提供する。デルフィニジ
ン3-グルコシドを基質として用いた場合には、活性が認められなかった。
【０１６０】 実施例8 植物におけるAR-ATのアンチセンス発現 pCGP40の構築 プラスミドpCGP40は、pCGN7334からBamHI-SacI断片としてGUS遺伝子（Jeffers
onら、1987）を除去して、これをマルチクローニング部位を含むpBluescribe M1
3-由来のBamHI-SacI断片と置換することによって構築した。カルジェンインク（
Calgene Inc.）（CA、USA）から得たプラスミドpCGN7334を、pCGN7329のXhoI部
位にMac-GUS-mas遺伝子融合体を含む断片を挿入することによって構築した（Com
aiら、1990）。
【０１６１】 pCGP1909およびpCGP1917の構築 pCGP1904（図3）からcDNA挿入物をpCGP40のMacプロモーター（Comaiら、1990
）の下流にアンチセンス方向にクローニングすることによってプラスミドpCGP19
09（図5）を構築した。pCGP40におけるGUSコード領域は、SacI/Asp718を用いた
消化時に除去される。Macプロモーターおよびmasターミネーターを含むベクター
を、ジーンクリーン（GeneClean）キット（Bresatec）を用いて精製し、pCGP190
4から切り出されたC9 cDNA断片のSacI/Asp718末端にライゲーションした。ライ
ゲーションは、製造元の推奨する条件を用いてアマシャムライゲーションキット
を用いて行った。pCGP1909中にC9挿入物が正しく挿入されたことを、クロラムフ
ェニコール耐性形質転換体から単離されたDNAのSacI/Asp718制限酵素分析によっ
て確認した。
【０１６２】 プラスミドpCGP1917（図6）は、pCGP1909（図5）由来のMac-C9-mas遺伝子融合
体をバイナリーベクターpWTT2132（DNAP）にクローニングすることによって構築
された。C9キメラ遺伝子は、BglIIによる制限酵素処理によりpCGP1909から単離
され、得られた5'オーバーハングを、DNAポリメラーゼIのクレノー断片を用いて
修復した。C9キメラ遺伝子を、ブレサクリーンキット（Bresatec）を用いて精製
し、SmaIによって制限酵素処理されて脱リン酸化されたpWTT2132にライゲーショ
ンした。pCGP1917中に挿入物が正しく挿入されたことを、テトラサイクリン耐性
大腸菌形質転換体から単離されたDNAのAsp718制限エンドヌクレアーゼ消化によ
って確認した。
【０１６３】 pCGP1917によるA.ツメファシエンスの形質転換 プラスミドDNA5μgをコンピテントAGL0細胞100 μLに加えることによって、プ
ラスミドpCGP1917（図6）をアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacte
rium tumefaciens）AGL0株に導入した。コンピテントAGL0細胞は、MG/L（Garfin
kelおよびNester、1980）培地50 mLに接種し、28℃で振とうしながら16時間増殖
させることによって調製された。次に、細胞をペレットにして、85％v/v 100 mM
CaCl2/15％v/vグリセロール0.5 mLに再懸濁した。
【０１６４】 DNA-アグロバクテリウム混合物を、液体窒素中で2分間インキュベートして凍
結させた後、37℃で5分間インキュベートして融解させた。次にDNA/細菌混合物
をさらに10分間氷上に置いた。細胞をMG/L培地1mLと混合させ、振とうしながら2
8℃で16時間インキュベートした。pCGP1917を有するA.ツメファシエンス細胞を
、50 μg/mLテトラサイクリンを含むMG/L寒天プレート上で選択した。pCGP1917
の存在は、テトラサイクリン耐性A.ツメファシエンス形質転換体から単離された
DNAのサザン分析によって確認した。
【０１６５】 ペチュニア・ハイブリダにおけるAR-AT活性のアンチセンス抑制 ペチュニアのAR-AT活性レベルを低下させ、したがって、蓄積するアントシア
ニンの種類および産生される花色を改変するために、プラスミドpCGP1917（図6
）のT-DNAを、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する形質転換により、
ペチュニア・ハイブリダ品種VR（P. hybrida cv. VR）に導入した。
【０１６６】 ペチュニア・ハイブリダの形質転換 （a）植物材料 ペチュニア・ハイブリダ品種VR（P. hybrida cv. VR）の成熟植物由来の葉組
織を、1.25％w/v次亜塩素酸ナトリウム中で2分間滅菌した後、滅菌水で3回すす
いだ。葉組織を25 mm2平方に切断して、0.05 mg/Lカイネチンおよび1.0 mg/L 2,
4-ジクロロフェノキシ酢酸（2,4-D）を添加したMS培地（MurashigeおよびSkoog
、1962）上で24時間前培養した。
【０１６７】 （b）アグロバクテリウムおよびペチュニア組織の共存培養 バイナリーベクターpCGP1917（図6）を含むA.ツメファシエンスAGL0株（Lazo
ら、1991）を、50 mg/Lテトラサイクリンを含むMG/L（GarfinkelおよびNester、
1980）寒天プレート上で4℃で維持した。1％w/vバクトペプトン、0.5％w/vバク
ト酵母抽出物、および1％w/v NaClを含む液体培地中で単コロニーを一晩増殖さ
せた。翌日、B5ビタミン（Gamborgら、1968）および3％w/vショ糖（BPM）を含む
液体MS培地によって希釈することによって最終濃度5×108個の細胞/mLを調製し
た。先に記述したAGL0/pCGP1917を含むBPMに、葉片を2分間浸した。葉片から吸
い取って乾燥させ、共存培養培地上に4日間おいた。共存培養培地は、0.05 mg/L
カイネチンおよび1.0 mg/L 2,4-Dを添加したSH培地（SchenkおよびHildebrandt
、1972）からなり、タバコ細胞懸濁液の上部に載せた濾紙によって共存培養培地
全体に広げられた、タバコ細胞懸濁液のフィーダー（feeder）層を含んでいた。
【０１６８】 （c）トランスジェニックペチュニア植物の回収 共存培養後、3％w/vショ糖、1mg/L α-ベンジルアミノプリン（BAP）、0.1 mg
/L α-ナフタレン酢酸（NAA）、2μg/Lクロルスルフロン（Chlorsulfron）（Che
m Service）、350 mg/Lセフォタキシム、および0.3％w/vゲルライトゲランガム
（Gelrite Gellan Gum）（Schweizer hall）（選択培地）を添加したMS培地に葉
片を移した。4週間後、再生した外植体を新しい選択培地に移した。クロルスル
フロン選択下で生き残った不定芽（adventitious shoot）を単離して、根の誘導
のために2μg/Lクロルスルホン（Chem Service）および200 mg/Lセフォタキシム
を含むBPMに移した。培養物は全て、23±2℃で16時間光周期（60 μmol.m-2,s-1 、青白色蛍光灯）下で維持された。根の長さが2cm〜3cmに達したら、トランスジ
ェニックペチュニア苗を、オートクレーブ済みのDebco51410/2鉢植え用混合物（
mix）の入った8cm試験管に移した。4週間後、植物を同じ鉢植え用混合物を用い
て15 cmポットに移植し、14時間光周期（300 μmol m-2,s-1、ハロゲン化水銀灯
）下で23℃で維持した。
【０１６９】 pCGP1917/VRペチュニア植物のトランスジェニック分析 22系統の独立したトランスジェニック植物を得て開花させた。植物の選択によ
って、紫色のVR対照とは異なり暗ピンク色のセクターを有する花が得られた。観
察された花の色の選択を表7に示す。トランスジェニック植物の花に蓄積してい
る色素を、TLC（薄層クロマトグラフィー）によって分析した。
【０１７０】
【表７】 VR、SD対照、および1917/VRトランスジェニック花の花弁の色 RHSCC＝王立園芸学会カラーチャート（Kew、UK）。 SD対照＝デルフィニジン系の色素を蓄積するSkr4×Da雑種（Bruglieraら、1994
）。
【０１７１】 コードは王立園芸学会カラーチャート（Kew、UK）から得る。それらは、観察
された色の表現型を記述するための代替的な手段を提供する。しかし、指定され
た数は、認識された色の指標としてのみ見なされるべきであって、得られうる潜
在的な色を限定すると解釈されるべきではない。
【０１７２】 アントシアニンおよびフラボノールの抽出 TLC分析を行う前に、花弁および雄しべの抽出物に存在するアントシアニンお
よびフラボノールの分子を酸加水分解して、アントシアニジンまたはフラボノー
ルコアからグリコシル部分を除去した。アントシアニジンおよびフラボノールの
標準物質を用いて、花の抽出物に存在する化合物を同定する助けとした。
【０１７３】 アントシアニンおよびフラボノールを、花弁周囲（limb）の100 mg〜200 mg、
または雄しべ5個を2M塩酸1mL中で30分間沸騰させることにより抽出して加水分解
した。加水分解したアントシアニンおよびフラボノールをイソアミルアルコール
200 μLによって抽出した。この混合物を減圧乾燥し、少量のメタノール/1％v/v
塩酸に再懸濁した。花弁におけるフラボノイドの相対レベルが評価できるように
、用いたメタノール/1％v/v塩酸の量は花弁の初回新鮮重量に基づいた。雄しべ
由来の抽出物をメタノール/1％v/v塩酸1μLに再懸濁した。VR花弁におけるpCGP1
917由来の抽出物のアリコート1μLをTLCプレートにスポットした。
【０１７４】 花の抽出物のTLC分析 酸加水分解された花の抽出物をフォレスタル（Forestal）溶媒系（HOAc：水：
HCl；30：10：3）（Markham、1982）に供した。酸加水分解された花弁抽出物のT
LC分析によって、22の独立事象のうち8つが、ペチュニジニンおよびマルビジン
と共にデルフィニジンを蓄積する花弁を産生することが示された。VR花弁は主に
マルビジン系の色素を蓄積する（図1b）。ペチュニアにおけるAR-AT活性の抑制
によって、デルフィニジン系の色素の蓄積がもたらされると考えられた。トラン
スジェニックデータにより、ペチュニアのAR-AT配列のアンチセンス発現がAR-AT
活性を抑制し、通常マルビジン色素を産生する株においてデルフィニジン系の色
素の産生をもたらすという証拠が提供される。デルフィニジン系の色素を産生す
る（ペチュニジンおよびマルビジン系の色素と共に）トランスジェニック体の花
は「VR様」の紫色のセクターと、暗ピンク色のセクターを有するまだら模様の外
観を呈した（表7）。
【０１７５】 実施例9 ニーレンベルギア由来のAR-AT cDNAクローンの単離 ニーレンベルギア花弁cDNAライブラリーの調製 λZAPII（EcoRI/XhoI方向性）キット（STRATAGENE）を用いて、ニーレンベル
ギア属品種フェアリーベル（Nierembergia sp. Cv. Fairy Bells）（Suntory Lt
d.）の開きつつある花芽の花弁から単離したRNAから花弁cDNAライブラリーを調
製した。
【０１７６】 約200,000 pfuを、タナカ（Tanaka）ら、1996によって記載された低ストリン
ジェントな条件を用いて、pCGP1904（図3）由来のDIG標識したペチュニアAR-AT
（C9）cDNAクローンでスクリーニングした。ハイブリダイズプラーク20個をPSB
中に採取した。cDNAライブラリーの初回スクリーニングに関して記述されたハイ
ブリダイゼーション条件を用いて、それらを再度スクリーニングして精製プラー
クを単離した。λZAPIIバクテリオファージベクターに含まれるプラスミドをレ
スキューして、cDNA挿入物の3'末端および5'末端から配列データを作製した。こ
れらのうち、NAR-ATが最も長いcDNAクローン（〜1.7 kb）を示し、プラスミドは
pSPB717（図7）と命名された。
【０１７７】 NAR-AT cDNAクローン（配列番号：6）の完全な配列を、ランダムに重複するク
ローンの作製に関する標準的な技法（Sambrookら、1989）を用いて得られた異な
るpUC18サブクローン由来の配列の編集によって決定した。配列は、455アミノ酸
の推定ポリペプチド（配列番号：7）をコードする1365塩基の推定オープンリー
ディングフレームを含んでいた。NAR-ATクローンの推定アミノ酸配列は、ペチュ
ニアAR-ATクローンの配列（配列番号：2）とアミノ酸レベルで85％の同一性を有
した。
【０１７８】 実施例10 スミレ属由来のAR-AT cDNAクローンの単離 パンジー花弁cDNAライブラリーの調製 λZAPII（EcoRI/XhoI方向性）キット（STRATAGENE）を用いて2つの花弁cDNAラ
イブラリーを調製した。一つは、製造元の推奨する条件に従って、スミレ属品種
ブラックパンジー（Viola spp. cv. black pansy）の開きつつある花芽の花弁か
ら単離されたRNAに由来し、もう一つは、スミレ属品種ライトブルーパンジー（V
iola spp. cv. light blue pansy）の開きつつある花芽の花弁から単離されたRN
Aに由来する。組換え体の総数は、1.7×106 pfu（ブラックパンジー）および1.8
×106 pfu（ライトブルーパンジー）であった。
【０１７９】 ブラックパンジーおよびライトブルーパンジー由来のAT配列のPCR パンジー由来のAT配列のPCRのためのプライマーのCODEHOP設計 パンジーからAR-AT配列を単離するために、アントシアニジン3-グルコシドま
たはアントシアニジン3,5-ジグルコシド（国際出願番号PCT/JP96/00348（国際公
開公報第96/25500号））の3-グルコースまたは5-グルコースをアシル化するアシ
ルトランスフェラーゼと、アントシアニジン3-ルチノシド上のラムノース基をア
シル化することができるペチュニアおよびニーレンベルギアのAR-AT配列との間
のアミノ酸配列類似領域に対するオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。
【０１８０】 CODEHOP（コンセンサス縮重ハイブリッド型オリゴヌクレオチドプライマー（C
Onsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers）法（Roseら、1998）（
http://blocks.fhcrc.org/codehop.htmlにて概説）を用いた。CODEHOPプログラ
ムは、3'縮重「コア」領域に対する全ての可能な11量体または12量体を含み、5'
非縮重「クランプ」領域における各位置に関して予測される最も有望なヌクレオ
チドを有するプライマーのプールを設計している（表8）。
【０１８１】
【表８】 CODEHOPプログラムによって同定されるアシルトランスフェラーゼ配
列間の配列類似領域に対して設計されたオリゴヌクレオチド ここで、R＝AまたはG、Y＝CまたはT、M＝AまたはC、K＝GまたはT、S＝GまたはC
、W＝AまたはT、H＝A、C、またはT、B＝G、C、またはT、V＝A、G、またはC、D＝
A、G、またはT、N＝A、G、C、またはT、I＝デオキシイノシンである。
【０１８２】
【表９】 AR-AT配列のPCRにおいて用いるために設計されたその他のオリゴヌク
レオチド I＝デオキシイノシン
【０１８３】 全RNAを、植物RNAeasyキット（QIAGEN）を用いてブラックパンジーの花弁のつ
ぼみ（第3期）から調製した。製造元の推奨する条件を用いて、RNA1μgを鋳型と
して用いて、Superscript II（STRATAGENE）およびdT(17)Ad2Ad1（配列番号：12
）（表9）オリゴヌクレオチドを用いてcDNAを調製した。PCR精製カラム（QIAGEN
）を通過させ、pH 8.5の10 mMトリス塩酸50 μLで溶出させることによってcDNA
を精製した。次に、cDNAを、製造元の推奨する条件を用いてターミナルトランス
フェラーゼ（Boehringer Mannheim）を用いてC末端付加した（C-tailed）。C末
端付加されたcDNAを次にPCR精製カラム（QIAGEN）を通じて精製し、pH 8.5の10
mMトリス塩酸50 μLで溶出した。
【０１８４】 次に、C末端付加されたcDNA（1μL）を、10×ホットスタートキアゲン（HotST
ARTQIAGEN）緩衝液2.5 μL、1.25 mM dNTP4μL、50 ng/μLプライマーAtr3（配
列番号：11）5μL、50 ng/μL GI-アンカープライマー（配列番号：13）（表9）
5μL、純水2μL、およびホットスタート（HotSTART）Taqポリメラーゼ（QIAGEN
）0.5 μLを用いたPCRの鋳型として用いた。95℃までで15分間加熱した後、94℃
で30秒間、50℃で30秒間、72℃で90秒間を35サイクル行い、その後72℃で10分間
により、反応を行った。
【０１８５】 PCR産物を1％w/vアガロースゲルで電気泳動し、予想される1.2 kb産物を切り
出して精製した。1.2 kb断片をpCR7 2.1（Invitrogen）にライゲーションした。
ブラックパンジー花弁のPCR産物の形質転換体18個をランダムに選択し、EcoRIに
よる消化によって挿入物の有無について分析した。予想される大きさ1.2 kbの挿
入物を含む形質転換体7個（BPAR-AT2、BPAR-AT3、BPAR-AT5、BPAR-AT9、BPAR-AT
10、BPAR-AT14、およびBPAR-AT15）を、M13リバースおよびM13フォワード-21プ
ライマーを用いて配列決定を行った。
【０１８６】 BPAR-AT2、BPAR-AT3、BPAR-AT5、BPAR-AT9、BPAR-AT10、BPAR-AT14、およびBP
AR-AT15の推定翻訳配列は全て、今日までに単離されたアシルトランスフェラー
ゼにおいて見出される保存アミノ酸モチーフを含んでいた（St-PierreおよびDe
Luca、2000）。しかし、BPAR-AT2およびBPAR-AT3の推定アミノ酸配列を、ペチュ
ニアAR-AT配列（配列番号：3）のアミノ酸配列と厳密にアライメントして、さら
なる分析のために選択した。
【０１８７】 BPAR-AT2プラスミドをpCGP3074（図8）と命名し、BPAR-AT3プラスミドをpCGP3
075と命名した（図9）。1.2 kb BPAR-AT2（配列番号：14）およびBPAR-AT3（配
列番号：16）のPCR産物の完全な配列を、M13リバースおよびM13-21プライマーに
よって作製された配列に対して設計された特異的オリゴヌクレオチド（配列番号
：18（BPAR-AT2F）、配列番号：19（BPAR-AT2R）、配列番号：20（BPAR-AT3F）
、配列番号：21（BPAR-AT3R））を用いて作製した（表10）。BPAR-AT2およびBPA
R-AT3は、ヌクレオチドレベルで95％の同一性およびアミノ酸レベルで93％の同
一性を有した。
【０１８８】
【表１０】 BPAR-AT2およびBPAR-AT3のクローンの完全な配列を作製するために
設計されたオリゴヌクレオチド
【０１８９】 BPAR-AT2およびBPAR-AT3の推定翻訳配列を、LFASTAを用いてペチュニアのAR-A
T配列と比較した（表11）。
【０１９０】
【表１１】 BPAR-ATPCRクローン2およびBPAR-AT3の推定翻訳配列とペチュニアA
R-ATの翻訳配列との配列同一性％
【０１９１】 ブラックパンジーにおけるBPAR-AT2の発現 ブラックパンジーの花弁および葉における発育上の発現プロフィールを、pCGP
3074（BPAR-AT2）（図8）由来の1.2 kb EcoRI断片の32P標識断片を、ブラックパ
ンジーの葉と同様、ブラックパンジー花弁の5つの発育段階のそれぞれから単離
された全RNA 10 μgを含むRNAブロットに対するプローブとして用いることによ
って決定した。
【０１９２】 全RNAを、ターペン（Turpen）およびグリフィス（Griffith）の方法を用いて
ブラックパンジーの花弁（第1期〜第5期）および葉の組織から単離した。
【０１９３】 RNA試料は、40 mMモルフォリノプロパンスルホン酸（pH 7.0）、5mM酢酸ナト
リウム、0.1 mM EDTA（pH 8.0）を含む泳動緩衝液を用いて2.2 Mホルムアルデヒ
ド/1.2％w/vアガロースゲル中を電気泳動させた。製造元の説明に従って、RNAを
ハイボンド-N（Hybond-N）フィルター（Amersham）に転写した。
【０１９４】 RNAブロットをpCGP3074（BPAR-AT2）（図8）由来の1.2 kb EcoRI断片の32P標
識断片（108 cpm/μg、2×106 cpm/mL）により検索した。プレハイブリダイゼー
ション（42℃で1時間）およびハイブリダイゼーション（42℃で16時間）を、50
％v/vホルムアミド、1M NaCl、1％w/v SDS、10％w/v硫酸デキストラン中で行っ
た。フィルターを2×SSC、1％w/v SDS中で65℃で1時間〜2時間洗浄した後、0.2
×SSC、1％w/v SDS中で65℃で0.5時間〜1時間洗浄した。増感スクリーンを用い
てフィルターをコダックXARフィルムに-70℃で0.5時間露光した後、16時間露光
した。
【０１９５】 BPAR-AT2プローブは、パンジーの花の全ての生長段階において〜1.4 kb転写物
とハイブリダイズして、花の生長段階のほぼ第3期でピークに達した。用いた条
件において、葉から単離された全RNAのノーザン分析では、ハイブリダイズする
転写物は検出されなかった（図10）。
【０１９６】 ブラックパンジーのAR-AT転写物は、花弁において最も豊富に存在すると予想
され、ほとんどのアントシアニン生合成遺伝子の発現プロフィールと一致して、
葉においては全くないか、またはレベルが低い（Bruglieraら、1994；Brugliera
ら、1999；Holtonら、1993を参照のこと）。これらの結果は、BPAR-AT2が、花弁
において最も豊富であり、葉において減少していると考えられるAR-AT転写物を
表すという予測と一致する。
【０１９７】 ライトブルーパンジー由来のAR-AT配列の単離 ブラックパンジーの単離に関して先に記述した条件に従って、PCRを同様にラ
イトブルーパンジーの花弁から単離されたRNAを用いて設定した。1.2 kb PCR産
物をpCR7 2.1（Invitrogen）にライゲーションした。形質転換体を、アンピシリ
ン100 μg/mLを含む新鮮なLBプレートに置いた。コロニー/プラークスクリーン
（登録商標）フィルター（DuPont）上に、コロニーの転写を行い、製造元の推奨
通りに処理した。
【０１９８】 ハイブリダイゼーション前に、2枚のプラーク転写膜を前洗浄溶液（50 mMトリ
ス塩酸、pH 7.5、1M NaCl、1mM EDTA、0.1％w/vサルコシン）中で65℃で30分間
洗浄し、0.4 M水酸化ナトリウム中で65℃で30分間剥離した後、0.2 Mトリス塩酸
、pH 8.0、0.1×SSC、0.1％w/v SDS溶液中で65℃で30分間洗浄して、最後に2×S
SC、1.0％w/v SDS中ですすいだ。
【０１９９】 形質転換体のコロニー転写膜を、pCGP3075（BPAR-AT3）（図9）由来の1.2 kb
EcoRI断片の32P標識断片によってスクリーニングした。
【０２００】 ハイブリダイゼーション条件には、50％v/vホルムアミド、1M NaCl、10％w/v
硫酸デキストラン、1％w/v SDS中で42℃で少なくとも1時間のプレハイブリダイ
ゼーション段階が含まれた。次に32P標識断片（1×106 cpm/mL）をハイブリダイ
ゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを42℃でさらに16時間続けた
。その後フィルターは、2×SSC、1％w/v SDS中で、42℃、30分間、2回の洗浄を
行った後、増感スクリーンを用いてコダックXARフィルムに-70℃で4時間露光し
た。
【０２０１】 コロニー20個（LBAR-AT1〜LBAR-AT20）が陽性であり、さらなる分析のために
選択された。M13リバースおよびM13フォワード-21プライマーを用いて配列デー
タを作製した。LBAR-AT1、LBAR-AT2、LBAR-AT3、LBAR-AT4、LBAR-AT6、LBAR-AT8
、LBAR-AT12、LBAR-AT13、LBAR-AT14、LBAR-AT16、LBAR-AT17、およびLBAR-AT20
から作製されたヌクレオチド配列は、BPAR-AT2（pCGP3074）（配列番号：14）お
よびBPAR-AT3（pCGP3075）（配列番号：16）の配列と非常に類似していた。
【０２０２】 pCGP3076（図11）およびpCGP3077（図12）とそれぞれ呼ばれるLBAR-AT3および
LBAR-AT17クローンを、さらなる分析のために選択した。プライマーBPAT2F（配
列番号：18、表10）およびBPAT3R（配列番号：21、表10）を用いて、LBAR-AT3（
配列番号：22）およびLBAR-AT17（配列番号：24）の1.2 kb PCR産物の完全な配
列を作製した。
【０２０３】 LBAR-AT3およびLBAR-AT17は、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの双
方において97％同一性を示した。BPAR-AT2およびBPAR-AT3のLFASTA比較によって
、ヌクレオチドレベルおよびアミノ酸レベルの双方での93％〜98％同一性が示さ
れた。LBAR-AT3（配列番号：23）およびLBAR-AT17（配列番号：25）とPAR-AT（
配列番号：2）との間のLFASTAアラインメントによって、（400アミノ酸の重複に
わたって）アミノ酸レベルで28％の同一性が示された。
【０２０４】 実施例11 植物のアシルトランスフェラーゼのブートストラップ（Bootstrapped）系統樹 ClustalW（Thompsonら、1996）およびnjplot（[email protected]
）をそれぞれ用いて（ブーストラップの）系統樹を作製した（図13）。ペチュニ
ア、ニーレンベルギア、およびパンジーのAR-AT配列の推定アミノ酸配列を、国
際出願番号PCT/JP96/00348（国際公開公報第96/25500号）に開示されたアントシ
アニンの3'位または5'位上のグルコースを芳香族アシル化することが示された植
物のアシルトランスフェラーゼと共にアライメントした。
【０２０５】 系統樹を用いることによって、BPAR-AT2およびBPAR-AT3ならびにLBAR-AT3およ
びLBAR-AT17がペチュニアAR-ATおよびニーレンベルギアAR-ATとの連鎖群へと分
離し、上記の日本語明細書に開示された他のATとは異なることが強調される（図
13）。これらのデータはこれらのクローンがAR-AT酵素をコードすることを示唆
している。
【０２０６】 実施例12 完全長のパンジーAR-AT cDNAクローンの単離 ブラックパンジー花弁cDNAライブラリーのスクリーニング BPAR-AT2（配列番号：15）およびBPAR-AT3（配列番号：17）のPCR産物（なら
びにLBAR-AT3およびLBAR-AT17のPCR産物）の推定アミノ酸配列は、これらのクロ
ーンがAR-AT配列を表すことを示唆する説得力のある証拠を提供する。アシルト
ランスフェラーゼ活性アッセイ系における試験のために完全長のcDNAクローンを
単離し、トランスジェニック植物において用いるために、ブラックパンジー花弁
cDNAライブラリーをスクリーニングした。
【０２０７】 XL1-Blue MRF'細胞にトランスフェクトした後、増幅されたブラックパンジー
花弁cDNAライブラリー約560,000 pfuを15 cmプレートあたり40,000 pfuの密度で
NZYプレートに播種して（Sambrookら、1989）、37℃で8時間インキュベートした
。4℃で一晩インキュベーションした後、コロニー/プラークスクリーン（登録商
標）フィルター（DuPont）上に、1プレートについて2枚の転写を行い、製造元の
推奨通りに処理した。
【０２０８】 ハイブリダイゼーションの前に、2枚のプラーク転写膜を前洗浄溶液（50 mMト
リス塩酸、pH 7.5、1M NaCl、1mM EDTA、0.1％w/vサルコシン）中で65℃で30分
間洗浄し、0.4 M水酸化ナトリウム中で65℃で30分間剥離させた後、0.2 Mトリス
塩酸、pH 8.0、0.1×SSC、0.1％w/v SDS溶液中で65℃で30分間洗浄して、最後に
2×SSC、1.0％w/v SDS中ですすいだ。
【０２０９】 ブラックパンジー花弁cDNAライブラリー由来の2つ組の転写膜のうちの第1組を
、pCGP3074（BPAR-AT2）（図8）由来の0.45 kb SacI/EcoRI断片の32P標識断片で
スクリーニングし、第2組をpCGP3074（BPAR-AT2）（図8）由来の1.2 kb EcoRI断
片の32P標識断片によってスクリーニングした。
【０２１０】 ハイブリダイゼーション条件には、50％v/vホルムアミド、1M NaCl、10％w/v
硫酸デキストラン、1％w/v SDS中で42℃で少なくとも1時間のプレハイブリダイ
ゼーション段階が含まれた。その後32P標識断片（1×106 cpm/mL）をハイブリダ
イゼーション溶液に加えて、ハイブリダイゼーションを42℃でさらに16時間続け
た。次にフィルターは、2×SSC、1％w/v SDS中で65℃、30分間、2回の洗浄を行
った後、0.2×SSC、1％w/v SDS中で65℃で30分間洗浄し、増感スクリーンを用い
てコダックXARフィルムに-70℃で4時間露光した後、16時間露光した。
【０２１１】 178 pfuが、0.45 kb SacI/EcoRI断片（クローンの5'末端を表す）から作製さ
れたプローブとハイブリダイズしたのに対し、1.2 kb EcoRI断片（全PCR産物を
表す）から作製されたプローブと強くハイブリダイズしたのは357 pfusであった
。
【０２１２】 双方のプローブに強くハイブリダイズする30 pfuをPSBに選択した。cDNAライ
ブラリーの初回スクリーニングの場合に記述したハイブリダイゼーション条件を
用いて、それらを再度スクリーニングして純粋なクローンを単離した。λZAPII
バクテリオファージベクターに含まれるプラスミドをレスキューして、表10に記
載された特異的プライマーと共にM13リバースおよび-20プライマーを用いてcDNA
挿入物の3'末端および5'末端から配列データを作製した。完全長のcDNAクローン
の機能性および特異性は、実施例6、実施例7、実施例8および実施例11に記載さ
れた方法を用いて確認することができる。
【０２１３】 実施例13 他の種からのAR-AT cDNAの単離 アントシアニジン3-アシルルチノシドは、ビオラ・トリコロール（Viola tric
olour）（Gotoら、1978）、ロベリア・エリナス（Lobelia erinus）（Kondoら、
1989）、トルコギキョウ（Eustoma grandiflorum）（Asenら、1986）、およびハ
ナショウブ（Iris ensenta）（Yabuya、1991）において産生される。さらに、ア
ントシアニジン3-ルチノシドの存在は、ペチュニア（Stafford、1990）；Jonsso
nら、1982；MaizonnierおよびMoessner、1980）、キンギョソウ（Antirrhinum）
（Martinら、1991）、シクラメン（Miyajimaら、1990）、メトロシデロス（Metr
osideros）（Andersen、1988）、アルストロメリア（Alstroemeria）（Saitoら
、1988）、ポテンティラ属（Potentilla spp.）（HarborneおよびNash、1984）
、セントポーリア・イオナンタ（Saintpaulia ionantha）（アフリカンバイオレ
ット）（KhoKharら、1982）、ブロメリア属（Bromeliaceae）（SaitoおよびHarb
orne、1983）、およびゼラニウム（Geranium）（AsenおよびGriesbach、1983）
を含む様々な植物において報告されている。これらの植物の多くがアントシアニ
ジン3-ルチノシドアシルトランスフェラーゼ（AR-AT）を含むと予想される。
【０２１４】 上記に列挙した植物およびその他の植物からのAR-AT cDNAの単離は、実施例9
または本明細書の導入部に記載したような、低ストリンジェンシーハイブリダイ
ゼーション条件を用いて、配列番号：1、配列番号：6、配列番号：14、配列番号
：16、配列番号：22、または配列番号：24を用いてそれぞれのcDNAライブラリー
をスクリーニングすることによって行われる。
【０２１５】 または、AR-AT cDNA断片の単離は、表8に記載されたCODEHOPプライマー（実施
例10）または下記の表12に記載された縮重プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖
反応を用いて行われる。用いることができるプライマー対の組み合わせの例を、
下記の表13に示す。増幅産物を細菌プラスミドベクターにクローニングして、DN
A断片をプローブとして用いて、それぞれのcDNAライブラリーをスクリーニング
して、より長い完全長のAR-AT cDNAクローンを単離する。cDNAクローンの機能性
および特異性は、実施例6、実施例7、実施例8および実施例11に記載された方法
を用いて確認する。
【０２１６】
【表１２】 アントシアニンに作用するアシルトランスフェラーゼ間のアミノ酸
配列類似領域に対して設計された縮重プライマー ここで、R＝AまたはG、Y＝CまたはT、M＝AまたはC、K＝GまたはT、S＝GまたはC
、W＝AまたはT、H＝A、C、またはT、B＝G、C、またはT、V＝A、G、またはC、D＝
A、G、またはT、N＝A、G、C、またはT、I＝デオキシイノシンである。
【０２１７】
【表１３】 異なる植物由来のその他のAR-AT cDNA断片の単離において用いられ
るプライマー対
【０２１８】 断片の予想サイズの推定は、ペチュニアAR-AT配列（配列番号：1）に基づく。
異なる種由来のRNAを鋳型として用いる場合に得られる大きさは、変化すること
が予想される。
【０２１９】 当業者は、本明細書に記載の本発明に対して、特に記載した以外の修正および
改変が可能であることを認識すると思われる。本発明にはそのような修正および
改変が全て含まれることが理解されるべきである。また、本明細書において個々
にまたは集合的に言及または示された全ての段階、特徴、組成物、および化合物
、ならびに任意の2つまたはそれ以上の該段階または特徴において任意の組み合
わせおよび全ての組み合わせも、本発明に含まれる。
【０２２０】 参考文献一覧
【図面の簡単な説明】
【図１Ａおよび１Ｂ】 ペチュニアにおけるフラボノイド色素の生合成経路
の概略図である。経路にかかわる酵素は以下の通りに示されている：PAL＝フェ
ニルアラニンアンモニアリアーゼ；C4H＝桂皮酸4-ヒドロキシラーゼ；4CL＝4-ク
マラート：CoAリガーゼ；CHS＝カルコンシンターゼ；CHI＝カルコンフラバノン
イソメラーゼ；F3H＝フラバノン3-ヒドロキシラーゼ；DFR＝ジヒドロフラボノー
ル-4-レダクターゼ；ANS＝アントシアニジンシンターゼ、3GT＝UDP-グルコース
：フラボノイド3-O-グルコシルトランスフェラーゼ；3RT＝UDPラムノース：アン
トシアニジン3-グルコシドラムノシルトランスフェラーゼ、AR-AT＝アントシア
ニジン-ルチノシドアシルトランスフェラーゼ、5GT＝アントシアニン5-グルコシ
ルトランスフェラーゼ；3'OMT＝アントシアニン3'メチルトランスフェラーゼ、3
'5' OMT＝アントシアニン3',5'メチルトランスフェラーゼ。その他の略号には以
下のものが含まれる：DHK＝ジヒドロケンフェロール、DHQ＝ジヒドロケルセチン
、DHM＝ジヒドロミリセチン、P 3-G＝ペラルゴニジン3-グルコシド。ペチュニア
でこれらの反応を制御している遺伝子座のいくつかを、酵素の横側にイタリック
体で示している。ミリセチンおよびペラルゴニジンを基とする色素はペチュニア
では稀である。
【図２】 ペチュニア・ハイブリダ由来のdifC cDNAクローンを含むプラス
ミドpCGP1902の概略図である。1.0kbのEcoRI／XhoI断片の32P標識断片をプロー
ブとして用いて、オールドグローリーブルー（Old Glory Blue）花弁cDNAライブ
ラリーを検索した。略号は以下の通りである：Amp＝アンピシリン耐性遺伝子、f
1 ori (+)＝f1繊維状ファージ複製起点、ColE1ori＝プラスミド複製起点、rev＝
配列解析に用いたM13リバースプライマー部位のおおよその位置、-20＝配列解析
に用いたM13 -20プライマー部位のおおよその位置。制限エンドヌクレアーゼ認
識部位の選択についても表示している。
【図３】 ペチュニア・ハイブリダ由来のC9 cDNAクローンを含むプラスミ
ドpCGP1904の概略図である。略号は以下の通りである：Amp＝アンピシリン耐性
遺伝子、f1 ori (+)＝f1繊維状ファージ複製起点、ColE1ori＝プラスミド複製起
点、rev＝配列解析に用いたM13リバースプライマー部位のおおよその位置、-20
＝配列解析に用いたM13 -20プライマー部位のおおよその位置。制限エンドヌク
レアーゼ認識部位の選択についても表示している。
【図４】 酵母発現プラスミドpCGP1912の概略図である。pCGP1904由来のC9
cDNA挿入物を、発現ベクターpYE22m中の、酵母グリセルアルデヒド3-リン酸デ
ヒドロゲナーゼプロモーター（PGAP）の下流にセンス方向にクローニングした。
略号は以下の通りである：TRP1＝Trp1遺伝子、TGAP＝酵母グリセルアルデヒド3-
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子由来のターミネーター配列、IR1＝2μmプラスミ
ドの逆方向反復配列、pBR322＝大腸菌由来の複製起点。制限エンドヌクレアーゼ
認識部位の選択も表示している。
【図５】 発現プラスミドpCGP1909の概略図である。pCGP1904由来のペチュ
ニアAR-AT cDNA挿入物（C9）を、発現ベクターpCGP40のMacプロモーターの下流
にアンチセンス方向にクローニングした。略号は以下の通りである：chloro＝ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子、mas 3'＝アグロバクテリウムのマンノピンシン
ターゼ（mas）遺伝子由来のターミネーター領域、Mac＝mas遺伝子由来のプロモ
ーターおよびカリフラワーモザイクウイルス35S（CaMV3SS）プロモーター由来の
エンハンサー配列からなるハイブリッド型プロモーター、oriColE1＝コリシンE1
プラスミド由来の高コピー複製起点。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の選択も
表示している。
【図６】 バイナリープラスミドpCGP1917の概略図である。pCGP1909由来の
キメラ型アンチセンスAR-AT遺伝子を、キメラ型surB遺伝子と直列方向となるよ
うにバイナリーベクターpWTT2132（DNA Plant Technology）中にクローニングし
た。略号は以下の通りである：Tet＝テトラサイクリン耐性遺伝子；LB＝左境界
；RB＝右境界；surB＝タバコのアセト酪酸シンターゼ遺伝子由来のコード領域お
よびターミネーター配列；35S＝カリフラワーモザイクウイルス35S遺伝子由来の
プロモーター領域、mas 3'＝アグロバクテリウムのマンノピンシンターゼ遺伝子
由来のターミネーター領域；pVS1＝緑膿菌（Pseuodomonas aeruginosa）由来の
プラスミドの広範宿主域複製起点、pACYCori＝大腸菌由来のpACYC184からの改変
レプリコン。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の選択も表示している。
【図７】 ニーレンベルギア属品種フェアリーベル（Nierembergia spp. cv
. Fairy Bells）由来のNAR-AT cDNAクローンを含むプラスミドpSPB717の概略図
である。略号は以下の通りである：Amp＝アンピシリン耐性遺伝子、f1 ori（+）
＝f1繊維状ファージ複製起点、ColE1ori＝プラスミド複製起点、rev＝配列解析
に用いたM13リバースプライマー部位のおおよその位置、-20＝配列解析に用いた
M13 -20プライマー部位のおおよその位置。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の
選択も表示している。
【図８】 pCR 2.1ベクター中にスミレ属品種ブラックパンジー（Viola spp
. cv. blackpansy）由来のBPAR-AT2 PCR産物を含むプラスミドpCGP3074の概略図
である。略号は以下の通りである：Amp＝アンピシリン耐性遺伝子、Kan＝カナマ
イシン耐性遺伝子、f1 ori＝f1繊維状ファージ複製起点、ColE1ori＝プラスミド
複製起点、rev＝配列解析に用いたM13リバースプライマー部位のおおよその位置
、-20＝配列解析に用いたM13 -20プライマー部位のおおよその位置。制限エンド
ヌクレアーゼ認識部位の選択も表示している。
【図９】 pCR 2.1ベクター中にスミレ属品種ライトブルーパンジー（Viola
spp. cv. light blue pansy）由来のBPAR-AT3 PCR産物を含むプラスミドpCGP30
75の概略図である。略号は以下の通りである：Amp＝アンピシリン耐性遺伝子、K
an＝カナマイシン耐性遺伝子、f1 ori＝f1繊維状ファージ複製起点、ColE1ori＝
プラスミド複製起点、rev＝配列解析に用いたM13リバースプライマー部位のおお
よその位置、-20＝配列解析に用いたM13 -20プライマー部位のおおよその位置。
制限エンドヌクレアーゼ認識部位の選択も表示している。
【図１０】 pCGP3704中に含まれるBPAR-AT2クローンの1.2kb EcoRI断片の3 2 P標識断片をプローブとして検索したRNAブロットのオートラジオグラフを示す
。各レーンは、スミレ属品種ブラックパンジー植物体における花または葉から単
離した全RNAの10μg試料を含む。ブラックパンジーの花弁において1.4kbの転写
物が検出された。用いた条件下ではブラックパンジーの葉に転写物は検出されな
かった（L）。
【図１１】 pCR 2.1ベクター中にスミレ属品種ライトブルーパンジー由来
のLBAR-AT3 PCR産物を含むプラスミドpCGP3076の概略図である。略号は以下の通
りである：Amp＝アンピシリン耐性遺伝子、Kan＝カナマイシン耐性遺伝子、f1 o
ri＝f1繊維状ファージ複製起点、ColE1ori＝プラスミド複製起点、rev＝配列解
析に用いたM13リバースプライマー部位のおおよその位置、-20＝配列解析に用い
たM13 -20プライマー部位のおおよその位置。制限エンドヌクレアーゼ認識部位
の選択も表示している。
【図１２】 pCR 2.1ベクター中にライトブルーパンジー由来のLBAR-AT17 P
CR産物を含むプラスミドpCGP3077の概略図である。略号は以下の通りである：Am
p＝アンピシリン耐性遺伝子、Kan＝カナマイシン耐性遺伝子、f1 ori＝f1繊維状
ファージ複製起点、ColE1ori＝プラスミド複製起点、rev＝配列解析に用いたM13
リバースプライマー部位のおおよその位置、-20＝配列解析に用いたM13 -20プラ
イマー部位のおおよその位置。制限エンドヌクレアーゼ認識部位の選択も表示し
ている。
【図１３】 選択した植物アシルトランスフェラーゼの系統解析を示した概
略図であり、本明細書で開示するAR-AT配列が、アントシアニジン分子に結合し
たグルコースをアシル化するアシルトランスフェラーゼとは別の分枝にあること
を明確に示している。結節点の隣に示した数字は、1,000回反復時のブートスト
ラップ値を表している。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ２３Ｌ 2/02 Ｃ１２Ｇ 1/00 ４Ｂ０６３ 2/52 3/04 ４Ｂ０６４ 2/58 3/10 ４Ｂ０６５ Ｃ１２Ｇ 1/00 Ｃ１２Ｐ 7/06 3/04 Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｚ 3/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 7/06 Ａ２３Ｌ 2/00 Ｆ Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｍ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2B030 AB03 AD11 AD12 AD14 AD15 CA06 CA07 CA17 CA19 CB03 CD03 CD06 CD10 4B015 AG09 BA02 4B017 LC01 LC03 LG04 LG07 LP01 4B018 MA02 MC01 MD08 MD48 MD52 ME01 ME02 MF01 MF14 4B024 AA08 BA10 CA04 DA01 DA05 EA04 EA10 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ26 QR41 QS31 4B064 AC03 CA11 CA19 CC24 4B065 AA11X AA11Y AA88X AA99Y AB01 AC20 BA02 CA29 CA52 CA53

Claims (94)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アントシアニジン-ルチノシドアシルトランスフェラーゼ（A
    R-AT）分子、または該AR-ATの変異体、一部、断片、もしくは部分、または該AR-
    ATの機能的および／もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌク
    レオチド配列、またはそれらをコードする配列に対して相補的なヌクレオチド配
    列を含む、単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 ルチノシドがフラボノイド分子と結合した場合に、AR-AT分
    子がルチノシドのラムノース部分の芳香族アシル化活性を調節するか、または促
    進するものである、請求項1記載の単離された核酸分子。
  3. 【請求項３】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、スミレ属（Viola
    spp.）、ビオラ・トリコロール（Viola tricolour）、ロベリア・エリナス（Lob
    elia erinus）、トルコギキョウ（Eustoma grandiflorum）、またはハナショウ
    ブ（Iris ensenta）に由来する、請求項1または2記載の単離された核酸分子。
  4. 【請求項４】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、またはスミレ属に
    由来する、請求項3記載の単離された核酸分子。
  5. 【請求項５】 分子がペチュニアに由来する、請求項3記載の単離された核
    酸分子。
  6. 【請求項６】 分子がニーレンベルギアに由来する、請求項3記載の単離さ
    れた核酸分子。
  7. 【請求項７】 分子がスミレ属に由来する、請求項3記載の単離された核酸
    分子。
  8. 【請求項８】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2記載の単離
    された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異
    体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等
    価物もしくはホモログをコードする、単離された核酸分子： （i）配列番号：1に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：1に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：1またはその相補的な形体(complementary form)と低ストリン
    ジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：2に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  9. 【請求項９】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2記載の単離
    された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異
    体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等
    価物もしくはホモログをコードする、単離された核酸分子： （i）配列番号：6に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：6に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：6またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：7に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：7に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  10. 【請求項１０】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2記載の単
    離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変
    異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な
    等価物もしくはホモログをコードする、単離された核酸分子： （i）配列番号：14に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：14に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：14またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：15に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：15に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  11. 【請求項１１】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2記載の単
    離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変
    異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な
    等価物もしくはホモログをコードする、単離された核酸分子： （i）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：16に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：16またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：17に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：17に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  12. 【請求項１２】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2記載の単
    離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変
    異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な
    等価物もしくはホモログをコードする、単離された核酸分子： （i）配列番号：22に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：22に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：22またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：23に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：23に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  13. 【請求項１３】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項1または2記載の単
    離された核酸分子であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変
    異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な
    等価物もしくはホモログをコードする、単離された核酸分子： （i）配列番号：24に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：24に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：24またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：25に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：25に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  14. 【請求項１４】 AR-AT分子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部
    分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコー
    ドする、核酸分子を含む遺伝子構築物(genetic construct)。
  15. 【請求項１５】 ルチノシドがフラボノイド分子と結合した場合に、AR-AT
    分子がルチノシドのラムノース部分の芳香族アシル化活性を調節するか、または
    促進するものである、請求項14記載の遺伝子構築物。
  16. 【請求項１６】 AR-AT分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、スミレ属
    、ビオラ・トリコロール、ロベリア・エリナス、トルコギキョウ、またはハナシ
    ョウブに由来する、請求項14または15記載の遺伝子構築物。
  17. 【請求項１７】 AR-AT分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、またはス
    ミレ属に由来する、請求項16記載の遺伝子構築物。
  18. 【請求項１８】 分子がペチュニアに由来する、請求項16記載の遺伝子構築
    物。
  19. 【請求項１９】 分子がニーレンベルギアに由来する、請求項16記載の遺伝
    子構築物。
  20. 【請求項２０】 分子がスミレ属に由来する、請求項16記載の遺伝子構築物
    。
  21. 【請求項２１】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項14ま
    たは15記載の遺伝子構築物であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、また
    はその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは
    構造的な等価物もしくはホモログをコードする、遺伝子構築物： （i）配列番号：1に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：1に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：1またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：2に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  22. 【請求項２２】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項14ま
    たは15記載の遺伝子構築物であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、また
    はその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは
    構造的な等価物もしくはホモログをコードする、遺伝子構築物： （i）配列番号：6に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：6に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：6またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：7に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：7に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  23. 【請求項２３】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項14ま
    たは15記載の遺伝子構築物であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、また
    はその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは
    構造的な等価物もしくはホモログをコードする、遺伝子構築物： （i）配列番号：14に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：14に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：14またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：15に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：15に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  24. 【請求項２４】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項14ま
    たは15記載の遺伝子構築物であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、また
    はその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは
    構造的な等価物もしくはホモログをコードする、遺伝子構築物： （i）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：16に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：16またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：17に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：17に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  25. 【請求項２５】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項14ま
    たは15記載の遺伝子構築物であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、また
    はその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは
    構造的な等価物もしくはホモログをコードする、遺伝子構築物： （i）配列番号：22に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：22に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：22またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：23に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：23に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  26. 【請求項２６】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項14ま
    たは15記載の遺伝子構築物であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、また
    はその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは
    構造的な等価物もしくはホモログをコードする、遺伝子構築物： （i）配列番号：24に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：24に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：24またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：25に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：25に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  27. 【請求項２７】 AR-AT分子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部
    分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコー
    ドする遺伝物質を含む、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれら
    に由来する細胞。
  28. 【請求項２８】 ルチノシドがフラボノイド分子と結合した場合に、AR-AT
    分子がルチノシドのラムノース部分の芳香族アシル化活性を調節するか、または
    促進するものである、 請求項27記載のトランスジェニック植物もしくはその一
    部またはそれらに由来する細胞。
  29. 【請求項２９】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、スミレ属、ビオ
    ラ・トリコロール、ロベリア・エリナス、トルコギキョウ、またはハナショウブ
    に由来する、請求項27または28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部
    またはそれらに由来する細胞。
  30. 【請求項３０】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、またはスミレ属
    に由来する、請求項29記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそ
    れらに由来する細胞。
  31. 【請求項３１】 分子がペチュニアに由来する、請求項29記載のトランスジ
    ェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞。
  32. 【請求項３２】 分子がニーレンベルギアに由来する、請求項29記載のトラ
    ンスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞。
  33. 【請求項３３】 分子がスミレ属に由来する、請求項29記載のトランスジェ
    ニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞。
  34. 【請求項３４】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項27ま
    たは28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する
    細胞であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異体、一部、
    断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしく
    はホモログをコードする、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれ
    らに由来する細胞： （i）配列番号：1に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：1に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：1またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：2に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  35. 【請求項３５】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項27ま
    たは28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する
    細胞であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異体、一部、
    断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしく
    はホモログをコードする、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれ
    らに由来する細胞： （i）配列番号：6に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：6に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：6またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：7に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：7に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  36. 【請求項３６】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項27ま
    たは28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する
    細胞であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異体、一部、
    断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしく
    はホモログをコードする、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれ
    らに由来する細胞： （i）配列番号：14に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：14に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：14またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：15に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：15に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  37. 【請求項３７】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項27ま
    たは28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する
    細胞であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異体、一部、
    断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしく
    はホモログをコードする、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれ
    らに由来する細胞： （i）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：16に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：16またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：17に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：17に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  38. 【請求項３８】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項27ま
    たは28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する
    細胞であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異体、一部、
    断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしく
    はホモログをコードする、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれ
    らに由来する細胞： （i）配列番号：22に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：22に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：22またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：23に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：23に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  39. 【請求項３９】 AR-AT分子が以下のヌクレオチド配列を含む、請求項27ま
    たは28記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する
    細胞であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその変異体、一部、
    断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしく
    はホモログをコードする、トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれ
    らに由来する細胞： （i）配列番号：24に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：24に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：24またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：25に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：25に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  40. 【請求項４０】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞が切花
    種に属するものである、請求項27または28記載のトランスジェニック植物もしく
    はその一部またはそれらに由来する細胞。
  41. 【請求項４１】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞が、バ
    ラ、キク、チューリップ、ユリ、カーネーション、ガーベラ、ラン、トルコキキ
    ョウ、ベゴニア、トレニア、ゼラニウム、ペチュニア、ニーレンベルギア、また
    はスミレ属である、請求項40記載のトランスジェニック植物もしくはその一部ま
    たはそれらに由来する細胞。
  42. 【請求項４２】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞がペチ
    ュニアである、請求項41記載のトランスジェニック植物もしくはその一部または
    それらに由来する細胞。
  43. 【請求項４３】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞がニー
    レンベルギアである、請求項41記載のトランスジェニック植物もしくはその一部
    またはそれらに由来する細胞。
  44. 【請求項４４】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞がスミ
    レ属である、請求項41記載のトランスジェニック植物もしくはその一部またはそ
    れらに由来する細胞。
  45. 【請求項４５】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞が観賞
    植物種に属するものである、請求項27または28記載のトランスジェニック植物も
    しくはその一部またはそれらに由来する細胞。
  46. 【請求項４６】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞が農業
    植物種に属するものである、請求項27または28記載のトランスジェニック植物も
    しくはその一部またはそれらに由来する細胞。
  47. 【請求項４７】 植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞が、非
    形質転換植物と比べて変化した色特性を有する、請求項40、45、または46記載の
    トランスジェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞。
  48. 【請求項４８】 変化した部分が、茎、葉、根、花、種子、果実、または野
    菜の食用部分である、請求項47記載のトランスジェニック植物もしくはその一部
    またはそれらに由来する細胞。
  49. 【請求項４９】 請求項27〜44のいずれか一項に記載の植物から切断または
    切り取られた花。
  50. 【請求項５０】 AR-AT分子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部
    分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコー
    ドするヌクレオチド配列を植物または植物細胞内で発現させる方法であって、 該植物または該植物細胞に、AR-AT分子、またはその変異体、一部、断片、も
    しくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的な等価物もしくはホモロ
    グをコードする核酸分子を含む遺伝子構築物を導入することを含む方法。
  51. 【請求項５１】 ルチノシドがフラボノイド分子と結合した場合に、AR-AT
    分子がルチノシドのラムノース部分の芳香族アシル化活性を調節するか、または
    促進するものである、請求項50記載のヌクレオチド配列を発現させる方法。
  52. 【請求項５２】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、スミレ属、ビオ
    ラ・トリコロール、ロベリア・エリナス、トルコギキョウ、またはハナショウブ
    に由来する、請求項50または51記載のヌクレオチド配列を発現させる方法。
  53. 【請求項５３】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、またはスミレ属
    に由来する、請求項52記載のヌクレオチド配列を発現させる方法。
  54. 【請求項５４】 分子がペチュニアに由来する、請求項52記載のヌクレオチ
    ド配列を発現させる方法。
  55. 【請求項５５】 分子がニーレンベルギアに由来する、請求項52記載のヌク
    レオチド配列を発現させる方法。
  56. 【請求項５６】 分子がスミレ属に由来する、請求項52記載のヌクレオチド
    配列を発現させる方法。
  57. 【請求項５７】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項50または51記載の
    ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌクレオチド配列を発現
    させる方法： （i）配列番号：1に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：1に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：1またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：2に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  58. 【請求項５８】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項50または51記載の
    ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌクレオチド配列を発現
    させる方法： （i）配列番号：6に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：6に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：6またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：7に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：7に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  59. 【請求項５９】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項50または51記載の
    ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌクレオチド配列を発現
    させる方法： （i）配列番号：14に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：14に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：14またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：15に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：15に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  60. 【請求項６０】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項50または51記載の
    ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌクレオチド配列を発現
    させる方法： （i）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：16に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：16またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：17に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：17に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  61. 【請求項６１】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項50または51記載の
    ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌクレオチド配列を発現
    させる方法： （i）配列番号：22に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：22に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：22またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：23に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：23に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  62. 【請求項６２】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項50または51記載の
    ヌクレオチド配列を発現させる方法であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログをコードするヌクレオチド配列を発現
    させる方法： （i）配列番号：24に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：24に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：24またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：25に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：25に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  63. 【請求項６３】 植物または植物細胞の製造における、AR-AT分子、または
    その変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構
    造的な等価物もしくはホモログを含む遺伝子構築物の使用であって、該AR-AT分
    子、またはその変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／
    もしくは構造的な等価物もしくはホモログが、AR-AT分子をコードする遺伝物質
    の発現を増強するか、調節するか、または促進する使用。
  64. 【請求項６４】 ルチノシドがフラボノイド分子と結合した場合に、AR-AT
    分子がルチノシドのラムノース部分の芳香族アシル化活性を調節するか、または
    促進するものである、請求項63記載の遺伝子構築物の使用。
  65. 【請求項６５】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、スミレ属、ビオ
    ラ・トリコロール、ロベリア・エリナス、トルコギキョウ、またはハナショウブ
    に由来する、請求項63または64記載の遺伝子構築物の使用。
  66. 【請求項６６】 分子が、ペチュニア、ニーレンベルギア、またはスミレ属
    に由来する、請求項65記載の遺伝子構築物の使用。
  67. 【請求項６７】 分子がペチュニアに由来する、請求項65記載の遺伝子構築
    物の使用。
  68. 【請求項６８】 分子がニーレンベルギアに由来する、請求項65記載の遺伝
    子構築物の使用。
  69. 【請求項６９】 分子がスミレ属に由来する、請求項65記載の遺伝子構築物
    の使用。
  70. 【請求項７０】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項63または64記載の
    遺伝子構築物の使用であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその
    変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的
    な等価物もしくはホモログをコードするものである遺伝子構築物の使用： （i）配列番号：1に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：1に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：1またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：2に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：2に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  71. 【請求項７１】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項63または64記載の
    遺伝子構築物の使用であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその
    変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的
    な等価物もしくはホモログをコードするものである遺伝子構築物の使用： （i）配列番号：6に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：6に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：6またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下でハ
    イブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：7に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：7に対して少なくとも約20％の類似性
    を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  72. 【請求項７２】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項63または64記載の
    遺伝子構築物の使用であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその
    変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的
    な等価物もしくはホモログをコードするものである遺伝子構築物の使用： （i）配列番号：14に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：14に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：14またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：15に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：15に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  73. 【請求項７３】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項63または64記載の
    遺伝子構築物の使用であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその
    変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的
    な等価物もしくはホモログをコードするものである遺伝子構築物の使用： （i）配列番号：16に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：16に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：16またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：17に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：17に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  74. 【請求項７４】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項63または64記載の
    遺伝子構築物の使用であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその
    変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的
    な等価物もしくはホモログをコードするものである遺伝子構築物の使用： （i）配列番号：22に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：22に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：22またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：23に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：23に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  75. 【請求項７５】 以下のヌクレオチド配列を含む、請求項63または64記載の
    遺伝子構築物の使用であって、該ヌクレオチド配列が、AR-AT分子、またはその
    変異体、一部、断片、もしくは部分、またはその機能的および／もしくは構造的
    な等価物もしくはホモログをコードするものである遺伝子構築物の使用： （i）配列番号：24に記載のヌクレオチド配列； （ii）最適なアライメントの後に配列番号：24に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するヌクレオチド配列； （iii）配列番号：24またはその相補的な形体と低ストリンジェントな条件下で
    ハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列； （iv）配列番号：25に記載のアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （v）最適なアライメントの後に配列番号：25に対して少なくとも約20％の類似
    性を有するアミノ酸配列をコードしうるヌクレオチド配列； （vi）(iv)もしくは(v)のヌクレオチド配列またはその相補的な形体と低ストリ
    ンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なヌクレオチド配列。
  76. 【請求項７６】 請求項27〜48のいずれか一項に記載のトランスジェニック
    植物に由来する増殖物(propagating material)または繁殖物(reproductive mate
    rial)。
  77. 【請求項７７】 増殖物または繁殖物が花粉である、請求項76記載の増殖物
    または繁殖物。
  78. 【請求項７８】 増殖物または繁殖物が根茎である、請求項76記載の増殖物
    または繁殖物。
  79. 【請求項７９】 増殖物または繁殖物が***組織である、請求項76記載の増
    殖物または繁殖物。
  80. 【請求項８０】 増殖物または繁殖物が種子である、請求項76記載の増殖物
    または繁殖物。
  81. 【請求項８１】 改変された部分がブドウである、請求項27〜39または46ま
    たは47のいずれか一項に記載のトランスジェニック植物もしくはその一部または
    それらに由来する細胞。
  82. 【請求項８２】 請求項27〜48または81のいずれか一項に記載のトランスジ
    ェニック植物もしくはその一部またはそれらに由来する細胞に由来する抽出物で
    あって、改変されていない抽出物、改変された抽出物、または処理された抽出物
    。
  83. 【請求項８３】 該抽出物が、色素、着色剤、または添加物である、請求項
    82記載の抽出物。
  84. 【請求項８４】 該抽出物が、塗料、紙、織物、または食物の着色に使用さ
    れるものである、請求項82記載の抽出物。
  85. 【請求項８５】 該抽出物が食品添加物である、請求項82記載の抽出物。
  86. 【請求項８６】 該抽出物が健康製品である、請求項82記載の抽出物。
  87. 【請求項８７】 該抽出物がアルコールまたはジュースである、請求項82記
    載の抽出物。
  88. 【請求項８８】 該抽出物が、スピリッツ、ワイン、またはリキュールであ
    る、請求項87記載の抽出物。
  89. 【請求項８９】 該抽出物が果汁である、請求項82記載の抽出物。
  90. 【請求項９０】 遺伝的に改変された植物を作製するための方法であって、
    請求項1〜13のいずれか一項に記載の核酸分子を該植物細胞に導入する段階、該
    細胞から植物を再生させる段階、および該核酸分子を発現させるために十分な条
    件下で該植物を生育させる段階を含む方法。
  91. 【請求項９１】 遺伝的に改変された植物を作製するための方法であって、
    請求項14〜26のいずれか一項に記載の遺伝子構築物を該植物細胞に導入する段階
    、該細胞から植物を再生させる段階、および該遺伝子構築物を発現させるために
    十分な条件下で該植物を生育させる段階を含む方法。
  92. 【請求項９２】 請求項90または91記載の方法によって作製されたトランス
    ジェニック植物。
  93. 【請求項９３】 請求項92記載のトランスジェニック植物の子孫。
  94. 【請求項９４】 請求項92または93記載の植物の一部。
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