JP3779048B2 - コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、コリンエステラーゼを定量するための乾式分析素子に関する。
【0002】
【従来の技術】
血液などの生物体液中の活性成分(例、グルコース、各種酵素、蛋白質、免疫成分、および中性脂肪)の定量分析は、医療診断の際に有用な情報を提供するものであり、その分析方法は古くから開発されている。
そして、最近では、その分析方法は大別して、湿式法、すなわち試験管などの容器中で血清などの生物体液試料を適当な試薬と液相にて反応させ、その反応により発生する主として発色などの化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行なう方法、そして乾式法、すなわちシート状透明支持体上に、生物体液試料中の分析対象の成分の特性を考慮して予め決められた反応試薬を含浸させた層状物(反応層)を積層させた多層分析要素を用意し、これに血清などの生物体液試料を点着させ、次いで加温(インキュベーション)することにより発色などの化学変化を発生させ、その化学変化を比色法などの方法を利用して読み取り、目的の成分の定量分析を行う方法の二つの方法に分けられている。これらの湿式法と乾式法とは、それぞれ異なる利点を持つため、分析の目的に応じて適宜使い分けられて利用されている。
【0003】
なかでも、多層分析要素(通常は、乾式分析要素と同じ意味で用いられる)を用いる乾式法は、その分析操作に熟練を必要とせず、また分析結果を得るまでの操作が簡単で、かつ短時間で終了するため、特に迅速を要する医療診断や、比較的小規模の分析箇所で多用されている。
【0004】
上記のようにこれまでに多数の生物体液中の活性成分の定量分析方法が湿式、乾式を問わず開発され、確立されてきた。血液に存在し、同じく有用な医療情報を提供する活性成分であるコリンエステラーゼについても同様である。即ち、血液中のコリンエステラーゼの含有量は生体の肝機能の指標になり、従って、その含有量を検知することは、肝疾患の医療診断と治療のために非常に重要である。しかし、湿式法によるコリンエステラーゼの定量方法は、精度は高いが、定量結果の入手までに時間のかかるという問題がある。
【0005】
たとえば、特開昭54−136895号公報には、p−メチルシンナモイルコリン・塩酸塩やp−メトキシシンナモイルコリン・塩酸塩などの、置換フェニル基を置換基として有するアルケニルカルボキシコリン誘導体を基質として用いることを特徴とする湿式法によるコリンエステラーゼの活性測定法が記載されている。
【0006】
また、特開昭57−213152号公報には、下記式:
【0007】
【化2】
【0008】
[上記式において、R1 及びR2 は低級アルコキシ基又は水素を表わし、Xはハロゲン原子を表わす。]
を基質として用いる湿式法によるコリンエステラーゼ活性測定方法が記載されている。この測定方法では、上記の基質の分解により生成するp−ヒドロキシ安息香酸またはその誘導体を酸化剤の存在下に4−アミノアンチピリンと酸化縮合させて着色化合物に導き、その着色を比色定量する方法が利用される。
【0009】
特開平5−211894号公報には、乾式によるコリンエステラーゼの定量方法が記載されている。しかし、この方法では、検出に405nmの波長の光を用いるため、一般的にピルビン酸の影響をうけやすく、かつアナライザーに厳しい精度が要求されると云う問題がある。また、特開平6−166662号にも、別のシステムを利用する乾式法の記載があるが、用いている基質の加水分解速度が大きいため、精度の点で問題がある。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、血液などの生物体液に含まれているコリンエステラーゼを乾式法を利用して高精度に分析するために有利に使用することのできるコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を提供することを目的とする。
【0011】
【課題を解決するための手段】
本発明は、透明支持体シート上に、下記一般式(I)で表わされるベンゾイルコリン誘導体、コリンオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと色素前駆体(発色成分)とからなる呈色性指示薬組成物を含む反応層を備えてなり、該反応層が、該呈色性指示薬組成物を含む支持体側に設けられた発色層、およびその上に積層されたベンゾイルコリン誘導体含有試料展開層とからなるコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子:
【0012】
【化3】
【0013】
[上記一般式(I)において、R1 とR2 とは、それぞれ独立に、水素原子もしくは炭素数1〜6のアルコキシ基を表わし、Xはハロゲン原子を表わす。]
【0014】
一般式(I)のベンゾイルコリン誘導体としては、p−ヒドロキシベンゾイルコリンのハロゲン化物が好ましい。また、本発明の乾式分析素子に於いては、反応層が、ペルオキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む支持体側に設けられた発色層、およびその上に積層されたベンゾイルコリン誘導体含有試料展開層とからなることが好ましい。
【0015】
【発明の実施の形態】
本発明のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の構造は、これまでに多数の形態で知られている乾式分析素子(乾式分析要素或は乾式分析材料とも呼ばれている)と同様である。すなわち、乾式分析素子の構造は、透明なシート状支持体と、この支持体上に設けられている反応層とからなるものである。
【0016】
透明なシート状支持体としては、たとえばポリエチレンテレフタレートシートなどのような無色で透明性の高いポリマー製シートが用いられる。
支持体の上に、次に反応層が設けられる。この反応層は、所望により、支持体上にゼラチンあるいは水溶性ポリマーからなる下塗り層を設けたのち、その上に設けてもよい。
【0017】
反応層は、コリンエステラーゼと接触して反応を起こし、ついで呈色反応を示すまでに必要な反応試薬が含まれる発色層(試薬層)と、所望によって設けられる別の機能層とからなる。発色層は、ポリマーマトリックスに反応に関与する試薬の少なくとも一部が溶解もしくは分散されている層である。
【0018】
試薬層に付設することのできる別の機能層の代表例としては、試料展開層(展開層:表面に点着された液体試料を単位面積当り均一な量に分配して、下層の試薬層に供給する機能を有する多孔性の層)及び光反射層を挙げることができる。試料展開層および光反射層のいずれも、試薬層の上側(支持体側とは反対の側)に設けられる。試薬層の上に光反射層と試料展開層とをこの順に重ねて設けてもよい。また、光反射層と試薬層、試料展開層と試薬層、光反射層と試料展開層の間に、所望により、ゼラチンや水溶性ポリマーなどからなる接着層を設けてもよい。なお、反応に関与する試薬を任意の割合で試薬層と試料展開層とに分けて含有させることもできる。
【0019】
本発明の分析素子においてコリンエステラーゼの検出に用いる検出試薬系は、本発明は、前記一般式(I)で表わされるベンゾイルコリン誘導体、コリンオキシダーゼ、およびペルオキシダーゼと色素前駆体とからなる呈色性指示薬組成物を含む。これらの試薬成分のそれぞれは、すでに各種の乾式分析素子の反応系において知られているものである。従って、これらの試薬成分について、次に簡単に記載する。
【0020】
(1)前記一般式(I)で表わされるベンゾイルコリン誘導体は、前述の特開昭57−21352号公報に記載されている。好ましいベンゾイルコリン誘導体としては、p−ヒドロキシベンゾイルコリンのハロゲン化物、特にヨウ化物を挙げることができる。
【0021】
(2)コリンオキシダーゼについては、前述の特開昭54−136895号公報に記載がある。
【0022】
(3)ペルオキシダーゼと色素前駆体(呈色性指示薬組成物)
コリンオキシダーゼによるコリンの酸化によって発生する過酸化水素は、ペルオキシダーゼの存在下で、色素前駆体に発色をもたらす。このような発色を示す色素前駆体(過酸化水素検出呈色指示薬成分)としては、4−アミノアンチピリンなどのN,N−ジ置換アニリン、及びロイコ色素が知られている。
【0023】
反応層は通常、ゼラチンなどの親水性ポリマーあるいはラテックスを構造形成マトリックスとして構成される。
【0024】
また、試料展開層には、セルロース誘導体のような親水性ポリマーを導入することが好ましい。この親水性ポリマーは、試料展開層に点着された液体試料の展開を制御し、微量の反応を均等かる高感度にするために、有用である。
【0025】
本発明の乾式分析素子は、支持体シートの上(或は、その表面に設けた下塗り層の上)に、試薬層形成材料の水溶液を均一に塗布し、乾燥させることにより形成する。試薬層は一層のみでもよく、所望により二層以上とすることもできる。試料展開層は、一旦乾燥した試薬層の表面を濡らした状態にして、その表面に織物あるいは編物を押しつけるなどして接合して形成する。必要により、接着層や光反射層などの補助層を介在させてもよい。この試料展開層に任意に、試薬の一部を溶解した水溶液を含浸させるて試薬含有展開層とすることもできる。また、試料展開層は、親水性樹脂中に微粒子が分散されて多孔性層であってもよい。
【0026】
本発明の乾式分析素子は通常、長尺状の透明プラスチックシートの上に、試薬層と、試料展開層を順に形成させ、ついで、これを所定のサイズに切断する方法を利用して工業的に製造する。この所定のサイズに切断された乾式分析素子は通常、プラスチック材料製のマウントに収容されて、医療診断にてコリンエステラーゼの定量分析に使用される。
【0027】
本発明の乾式分析素子を利用してのコリンエステラーゼの定量分析は、乾式分析素子を利用する、グルコース、中性脂肪、トランスアミナーゼ、蛋白質などの生体内活性成分の分析方法と同様にして行なわれる。具体的には、反応層(通常は、その最上層にある試料展開層)の表面に、血清などの試料溶液をピペットなどを用いて点着し、その後、37℃附近の温度で一定時間保存し(インクベーション)、次いでそのインクベーションにより生成した発色を比色法により測定する方法が用いられる。そして、この測定値を、別に標準試料(コリンエステラーゼ含有量が予め確認されている試料)を用いて作製した検量線と照合させることにより、測定試料中のコリンエステラーゼ含有量を高精度で定量することができる。
【0028】
【発明の効果】
本発明のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いることにより、湿式法では必須の分析操作の実施時における試薬液の調整などが不必要になり、特に熟練を必要とすることなく、短時間のうちに、湿式法と同様な高精度で、かつ広いダイナミックレンジでのコリンエステラーゼの定量が可能となる。
【0029】
【実施例】
[実施例1]コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
下記の方法により、支持体表面に試薬層(発色層)と試料展開層(試薬の一部を含有するもの)とが積層された本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した。
【0030】
(1)支持体表面への試薬層の形成
下記組成の試薬を水溶液(水溶液のpH:7.6)とし、ゼラリン下塗りが施されていて、表面が平滑で厚さが180μmの無色透明なポリエチレンテレフタレート(PET)フィルムの表面に、各試薬成分が下記塗布量になるように塗布乾燥させた。
【0031】
【表1】
【0032】
(2)試薬層上への試料展開層の形成
上記の試薬層を乾燥させた後、30g/m2 の割合でp−ノニルフェノキシポリグリシドール(グリシドールサーファクタント10G)水溶液を全面に供給して湿潤させた後、その上に、別に用意した編布(ゲージ数40)を載せ、圧力を均一にかけてラミネートし、乾燥させた。次いで、その編布層に、下記組成物の水溶液(水溶液のpH:7.6)を、各成分の塗布量がそれぞれ下記の量となるように、均一に塗布浸透させたのち、乾燥して試料展開層を形成して、本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した。
【0033】
【表2】
【0034】
[比較例1] コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
p−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨウ化物(基質)0.3gをヨウ化ベンゾイルコリン1.26gに変えた以外は、実施例1と同様な操作を行ない、比較用のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した
【0035】
[実施例2] コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
2−(3,5−ジメトキシ−4−ヒドロキシフェニル)−4−(4−ジメチルアミノフェニル)−5−(2−フェニルエチル)イミダゾール・酢酸塩(発色試薬)0.3gを、4−メトキシ−1−ナフトール0.42gに変えた以外は、実施例1と同様な操作を行ない、本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した。
【0036】
[比較例2] コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子の製造
p−ヒドロキシベンゾイルコリン・ヨウ化物(基質)0.3gをヨウ化ベンゾイルコリン1.26gに変えた以外は、実施例2と同様な操作を行ない、比較用のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を製造した
【0037】
[実施例3]コリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いての測定例
コリンエステラーゼ濃度がそれぞれ、1U/L、64U/L、154U/L、245U/Lそして335U/Lの5レベルのコリンエステラーゼ活性(ChE活性)を有するヒト血清を用意し、それぞれを10μL採り、実施例1〜2と比較例1〜2のそれぞれで製造したコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子に点着し、37℃にてインキュベートし、2分後そして5分後に、乾式分析素子に発生した発色の反射光学濃度(ODr)を、600nmの波長で支持体側から反射濃度測定法により測定した。それぞれの測定データにおけるコリンエステラーゼ濃度(検定値)と反射光学濃度(ODr)との関係を調べた。その結果を下記の第1表と第2表に示す。
【0038】
【表3】
【0039】
【表4】
【0040】
上記の第1表と第2表に示した結果から、実施例1と実施例2で得られた本発明に従うコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いた場合には、被検液(ヒト血清)中のコリンエステラーゼ濃度が335U/Lと高濃度の場合でも充分な感度で測定でき、その測定のダイナミックレンジが広いことが分る。一方、比較例1と比較例2で得られたコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子を用いた場合には、被検液中のコリンエステラーゼ濃度が245U/L以上の高濃度となった場合には、極端な感度の低下や測定値の逆転が発生することから、その測定のダイナミックレンジが狭いことが分る。
Claims (3)
- 一般式(I)のベンゾイルコリン誘導体がp−ヒドロキシベンゾイルコリンのハロゲン化物である請求項1に記載のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子。
- 反応層が、さらにアスコルビン酸オキシダーゼを含有する請求項1および2の内のいずれかの項に記載のコリンエステラーゼ定量用乾式分析素子。
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