JP3773339B2 - 免疫分析用クロマトグラフィストリップ - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
この発明は、被検試料液中の分析対象物の有無又は量を免疫反応を利用して検出又は測定するための免疫分析用クロマトグラフィストリップに関する。詳しくは、上記免疫分析用クロマトグラフィストリップの検出領域における分析対象物の検出又は測定結果の有効性を調べるために設けられている対照領域の改良に関する。
【0002】
【従来の技術】
よく知られているように、免疫分析用クロマトグラフィストリップは、一方の端に分析対象物を含む可能性がある被検試料液が添加される試料添加領域を有する。添加された被検試料液は、クロマトグラフィストリップ中を毛細管流により移動し、この被検試料液の移動に伴って、分析対象物及び分析対象物と特異的に結合する化合物が着色微粒子により標識されてなるトレーサーが、クロマトグラフィストリップの下流方向に移動する。
【0003】
上記試料添加領域の下流には、分析対象物と特異的に結合する化合物が固定されている検出領域が設けられている。分析対象物は検出領域に固定されている化合物とトレーサーが有する化合物の両方に特異的に結合するので、分析対象物が検出領域に到着すると分析対象物の量に比例してトレーサーが検出領域に蓄積される。
【0004】
トレーサーは着色微粒子を有するので、検出領域はトレーサーの蓄積量に応じて発色する。すなわち、検出領域の発色程度により、被検試料液中の分析対象物の有無又は量を検出又は測定することができる。
【0005】
このような免疫分析用クロマトグラフィーストリップは、特開昭61−145459、特開昭64−32169、特開平1−113662、特開平1−244370、特開平1−63865及び特表平1−503174等に記載されていて、これらの記載も、本明細書の記載の一部とする。
【0006】
上記免疫分析用クロマトグラフィーストリップにおいては、もちろん、検出領域を被検試料液が通過しないと、被検試料液中に分析対象物が存在していても検出領域は発色しない。そこで、試料液体が検出領域を通過したことを知るために、検出領域の下流に対照領域を設けて、被検試料液が対照領域に到達したら、対照領域が発色するようにされている。例えば、対照領域にはpH指示薬を固定し、試料液のpHにより発色させる。あるいは、対照領域にトレーサーが有する化合物と特異的に結合する化合物を固定し、トレーサーを対照領域に蓄積させ、対照領域を発色させる。
【0007】
しかし、従来の免疫分析装置においては、例えば、pH指示薬を使用した場合、被検試料液のpHにより、色合いが変動したり、あるいは充分な発色が得られないこともある。また、pH指示薬を使用した場合には、トレーサーの劣化又は失活を知ることができない。トレーサーが有する化合物と特異的に結合する化合物を固定した場合、被検試料液中の分析対象物の量によって対照領域のトレーサーの蓄積量が変動し、対照領域の発色が変動するという欠点があった。
【0008】
このように、従来の対照領域は改善する必要があった。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、上記従来のクロマトグラフィーストリップの対照領域における問題を解決し、被検試料液のpHや分析対象物の量に影響されることなく被検試料液が検出領域を通過したことを判定でき、かつトレーサーが有する化合物の劣化又は失活を、もしあれば、同時に知ることができる対照領域を有するクロマトグラフィーストリップを提供することにある。
【0010】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、対照領域に、分析対象物と特異的に結合する化合物Dが着色微粒子により標識されているトレーサーの化合物Dと特異的に結合する化合物Bと、分析対象物に特異的に結合する化合物Cの両方を固定することにより、被検試料液が検出領域を通過したことを被検試料液のpHや分析対象物の量に影響されることなく知ることができ、かつトレーサーの劣化又は失活を同時に知ることができることを、見いだした。すなわちこの発明は、分析対象物と特異的に結合する化合物Aが固定されている検出領域の下流に設けられていて、化合物Bと化合物Cとが固定されている対照領域を有し、化合物Bは該分析対象物と特異的に結合する化合物Dが着色微粒子により標識されてなるトレーサーの化合物Dと特異的に結合するものであり、化合物Cは該分析対象物と特異的に結合するものである、免疫分析用クロマトグラフィストリップである。
【0011】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップは、以下に説明する特定の対照領域を有する以外は、通常のものである。
【0012】
すなわち、クロマトグラフィストリップは、よく知られているように、分析対象物及び後記トレーサー等の分析試薬を、分析対象物を含む可能性がある被検試料液のクロマトグラフィストリップ中の毛細管流による移動により、下流に移動させることができるものである。本発明のクロマトグラフィストリップのクロマトグラフィ担体として、このような性質を有する知られているいずれの担体も使用できる。
【0013】
また、本発明のクロマトグラフィストリップは、通常のものと同様、被検試料液が添加される試料添加領域、及び分析対象物と特異的に結合する化合物Aが固定されている検出領域を、少なくとも有する。試料添加領域はクロマトグラフィストリップの一端(最上流)に配置され、検出領域は試料添加領域の下流に配置される。
【0014】
さらに、クロマトグラフィストリップは、試料添加領域と検出領域との間に、トレーサーが毛細管流により移動可能なように置かれている標識領域を有することがある。クロマトグラフィストリップが標識領域を有しない場合には、トレーサーは、被検試料液と共に試料添加領域に添加される。
【0015】
通常の免疫分析用クロマトグラフィストリップと同様、本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップも、試料添加領域の反対の端(最下流)に、添加された被検試料液の全部を吸収するのに充分な容量の吸収領域を有する。
【0016】
本発明の分析対象物には、生体試料中等に含まれている抗原又は抗体等、通常の免疫反応を利用したクロマトグラフィストリップにより検出又は測定される分析対象物のいずれも含まれる。
【0017】
化合物Aは、よく知られているように、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体、又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又は分析対象物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。ここで「異種動物」とは、分析対象物の抗体を産生した動物種と異なる種の動物をいう。
【0018】
化合物Aをクロマトグラフィ担体に固定するには、知られているいずれの方法も使用できる。例えば、微小ビーズに化合物Aを固定して、このビーズをクロマトグラフィ担体に固定したり、又は化合物Aをクロマトグラフィ担体に直接あるいはリンカーを介して結合させたりする。
【0019】
トレーサーは、分析対象物と特異的に結合する化合物Dを着色微粒子で標識したものである。
【0020】
着色微粒子としては、セレニウムコロイド等の非金属コロイド、金コロイド等の金属コロイド、着色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等が知られている。
【0021】
化合物Dもよく知られているように、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又は分析対象物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。また、化合物Dは、化合物Aと同じものであっても良いが、異なるものであってもよい。
【0022】
化合物Dを着色微粒子で標識するには、知られている通常の方法が使用できる。
【0023】
本発明の対照領域は、検出領域の下流に配置され、化合物Dと特異的に結合する化合物Bと分析対象物と特異的に結合する化合物Cとが固定されている領域である。
【0024】
化合物Bは、化合物Dが抗原又はその誘導体等である場合には、その抗原又は抗原誘導体等と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントであり、化合物Dが抗体又はそのフラグメントである場合には、その抗体又は抗体フラグメントと特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又はその抗体により異種動物を感作して得た抗体である。
【0025】
化合物Cは、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又はその抗体により異種動物を感作して得た抗体である。また、化合物Cは、化合物AとDのいずれか一方又は両方と同じものであっても良いが、異なるものであってもよい。
【0026】
対照領域に化合物B及びCを固定する方法は、検出領域に化合物Aを固定する方法と同じ方法であってもよいし、異なる方法であってもよい。例えば、リンカーを介してクロマトグラフィ担体に抗体及び抗原を共有結合させる方法、微粒子表面に抗体または抗原を吸着させてその微粒子を対照領域に置く方法等がある。
【0027】
本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップを用いて分析対象物を検出又は測定する方法は、従来の免疫分析用クロマトグラフィストリップを用いる場合と変わるところはない。ただし、対照領域の発色が、被検試料のpHや被検試料中の分析対象物の量に影響されることがないので、検出領域は被検試料液が通過したことを判定するために、被検試料のpHや被検試料中の分析対象物の量を管理する必要はない。
【0028】
以下、実施例により、さらに本発明を説明する。
【0029】
【実施例】
トレーサーを次のように調製した。91mMのL−アスコルビン酸ナトリウムと32mMの酸化セレニウムとを、約4℃で15分、次いで約42℃で70時間攪拌して、セレニウムコロイドを調製した。得られたセレニウムコロイドを550nmにおける吸光度が30になるように10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で希釈した。この希釈液にHIV―1p41抗原(1%)を添加し(トレーサーA)、又は添加せずに(トレーサーB、トレーサー劣化のモデル)、室温で1時間攪拌した。それぞれに、アルカリカゼイン(0.2%)を加えて室温で1時間攪拌して、セレニウムコロイドをアルカリカゼインで被覆し、次いで10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)で洗浄した。
【0030】
標識領域を次のように調製した。上記トレーサーA又はトレーサーBを1%カゼイン含有10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.4)に入れ、波長550nmの吸光度が3.0になるようにしてトレーサー懸濁液を得た。この懸濁液中にガラス繊維膜(米国LYDALL社製「Lypore9524」を浸し懸濁液を充分しみ込ませた後、ガラス繊維膜を乾燥した。
【0031】
検出領域を次のように調製した。HIV―1p41抗原を、0.1M炭酸緩衝液(pH7.4)中に0.15mg/mlの濃度になるように調製した。一方、クロマトグラフィ担体として0.4x4.5cmの長方形の細孔5μmのニトロセルロース膜(米国Millipore社製)を、0.4x6.0cmの水不透性のストリップ支持体に長い辺を縦としたときに上端が揃うように貼付した。ストリップ支持体に貼付したニトロセルロース膜の下端から約1cmのところに線状にHIV−1p41抗原の溶液を滴下した後、充分乾燥させ、HIV―1p41抗原を固定した。
【0032】
対照領域として、抗HIV―1p41抗体とHIV―1p41抗原の両方が固定されている対照領域C、及び抗HIV―1p41抗体のみが固定されている対照領域Dを調製した。抗HIV―1p41抗体及びHIV―1p41抗原の両方又は抗HIV―1p41抗体を、0.01M炭酸緩衝液(pH7.4)中に各1mg/mlの濃度になるようにし、これを上記ニトロセルロース膜の検出領域から約1cm離れた上端側に線状に滴下した後、ニトロセルロース膜を充分乾燥させた。pH指示薬を固定した対照領域Eは次のように調製した。0.13%ブロモチモールブルー、4.0%ヒドロキシエチルセルロース、0.5%ビニルブチラール樹脂を含む120mMニトリロートリス(メチレンスルホン酸)溶液をニトロセルロース膜の検出領域から約1cm離れた上端側に線状に滴下し、ニトロセルロース膜を充分乾燥した。
【0033】
クロマトグラフィストリップを次のように調製した。上記検出領域としたニトロセルロース膜の下端部のストリップ支持体上に、0.4x0.4cmの正方形に切断した上記標識領域(トレーサーA及びB)を、ニトロセルロース膜と僅かに接するように貼付した。標識領域下端のストリップ支持体上に試料添加領域として、0.4x1.3cmの不織布(米国Dupont社製「Sontara8801」)を標識領域と接するように貼付した。さらに、0.4x5.1cmの長方形の保護膜フィルム(Lintec社製「PET25 PE LR0074A」)を長い辺を縦としたときに上辺がニトロセルロース膜の上端に揃うように貼付し、これをクロマトグラフィストリップとした。
【0034】
使用された被検試料液は、HIV抗体強陽性であることが予め確認されているヒト血清0.5mlと20mMリン酸pH緩衝液(pH7.4)0.5mlとが混合された被検試料液F及び上記ヒト血清0.1mlと上記pH緩衝液9.9mlとが混合された被検試料液Gである。
【0035】
各被検試料液50μLを上記クロマトグラフィストリップの試料添加領域に添加し、15分後に検出領域及び対照領域の発色を目視により測定した。
【0036】
結果を下表に示す。
【0037】
【表1】
【0038】
表から明らかなように、本発明の対照領域である対照領域Cを用いた場合には(実験番号1及び2)、被検試料中の分析対象物の濃度とは無関係に対照領域は強く発色したが、対照領域がDである場合には(実験番号3、4)、分析対象物の濃度に依存して対照領域の発色程度が異なった。また、トレーサーが分析対象物と結合できない場合、本発明の対照領域の場合は(実験番号5)、対照領域は発色しなく異常があることを知らせたが、pH指示薬を固定した対照領域Eでは(実験番号6)、対照領域が発色し異常を知らせなかった。
【0039】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の免疫分析用クロマトグラフィーストリップを用いることにより、被検試料液が検出領域を通過したことを、被検試料のpHや被検試料液中分析対象物の濃度に影響されることなく判定することができる。加えて、トレーサーの劣化又は失活があれば、同時に知ることができる。
Claims (1)
- 分析対象物と特異的に結合する化合物Aが固定されている検出領域の下流に設けられていて、化合物Bと化合物Cとが固定されている対照領域を有し、化合物Bは該分析対象物と特異的に結合する化合物Dが着色微粒子により標識されてなるトレーサーの化合物Dと特異的に結合するものであり、化合物Cは該分析対象物と特異的に結合するものである、免疫分析用クロマトグラフィストリップ。
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JP30521197A JP3773339B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | 免疫分析用クロマトグラフィストリップ |
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JP30521197A Expired - Lifetime JP3773339B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | 免疫分析用クロマトグラフィストリップ |
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- 1997-11-07 JP JP30521197A patent/JP3773339B2/ja not_active Expired - Lifetime
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