JP3773339B2

JP3773339B2 - 免疫分析用クロマトグラフィストリップ

Info

Publication number: JP3773339B2
Application number: JP30521197A
Authority: JP
Inventors: 宏育新井; 永治小林; 俊次片岩; 譲小林
Original assignee: アボットジャパン株式会社
Priority date: 1997-11-07
Filing date: 1997-11-07
Publication date: 2006-05-10
Anticipated expiration: 2017-11-07
Also published as: JPH11142405A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
この発明は、被検試料液中の分析対象物の有無又は量を免疫反応を利用して検出又は測定するための免疫分析用クロマトグラフィストリップに関する。詳しくは、上記免疫分析用クロマトグラフィストリップの検出領域における分析対象物の検出又は測定結果の有効性を調べるために設けられている対照領域の改良に関する。
【０００２】
【従来の技術】
よく知られているように、免疫分析用クロマトグラフィストリップは、一方の端に分析対象物を含む可能性がある被検試料液が添加される試料添加領域を有する。添加された被検試料液は、クロマトグラフィストリップ中を毛細管流により移動し、この被検試料液の移動に伴って、分析対象物及び分析対象物と特異的に結合する化合物が着色微粒子により標識されてなるトレーサーが、クロマトグラフィストリップの下流方向に移動する。
【０００３】
上記試料添加領域の下流には、分析対象物と特異的に結合する化合物が固定されている検出領域が設けられている。分析対象物は検出領域に固定されている化合物とトレーサーが有する化合物の両方に特異的に結合するので、分析対象物が検出領域に到着すると分析対象物の量に比例してトレーサーが検出領域に蓄積される。
【０００４】
トレーサーは着色微粒子を有するので、検出領域はトレーサーの蓄積量に応じて発色する。すなわち、検出領域の発色程度により、被検試料液中の分析対象物の有無又は量を検出又は測定することができる。
【０００５】
このような免疫分析用クロマトグラフィーストリップは、特開昭６１−１４５４５９、特開昭６４−３２１６９、特開平１−１１３６６２、特開平１−２４４３７０、特開平１−６３８６５及び特表平１−５０３１７４等に記載されていて、これらの記載も、本明細書の記載の一部とする。
【０００６】
上記免疫分析用クロマトグラフィーストリップにおいては、もちろん、検出領域を被検試料液が通過しないと、被検試料液中に分析対象物が存在していても検出領域は発色しない。そこで、試料液体が検出領域を通過したことを知るために、検出領域の下流に対照領域を設けて、被検試料液が対照領域に到達したら、対照領域が発色するようにされている。例えば、対照領域にはｐＨ指示薬を固定し、試料液のｐＨにより発色させる。あるいは、対照領域にトレーサーが有する化合物と特異的に結合する化合物を固定し、トレーサーを対照領域に蓄積させ、対照領域を発色させる。
【０００７】
しかし、従来の免疫分析装置においては、例えば、ｐＨ指示薬を使用した場合、被検試料液のｐＨにより、色合いが変動したり、あるいは充分な発色が得られないこともある。また、ｐＨ指示薬を使用した場合には、トレーサーの劣化又は失活を知ることができない。トレーサーが有する化合物と特異的に結合する化合物を固定した場合、被検試料液中の分析対象物の量によって対照領域のトレーサーの蓄積量が変動し、対照領域の発色が変動するという欠点があった。
【０００８】
このように、従来の対照領域は改善する必要があった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
この発明の目的は、上記従来のクロマトグラフィーストリップの対照領域における問題を解決し、被検試料液のｐＨや分析対象物の量に影響されることなく被検試料液が検出領域を通過したことを判定でき、かつトレーサーが有する化合物の劣化又は失活を、もしあれば、同時に知ることができる対照領域を有するクロマトグラフィーストリップを提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、対照領域に、分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄが着色微粒子により標識されているトレーサーの化合物Ｄと特異的に結合する化合物Ｂと、分析対象物に特異的に結合する化合物Ｃの両方を固定することにより、被検試料液が検出領域を通過したことを被検試料液のｐＨや分析対象物の量に影響されることなく知ることができ、かつトレーサーの劣化又は失活を同時に知ることができることを、見いだした。すなわちこの発明は、分析対象物と特異的に結合する化合物Ａが固定されている検出領域の下流に設けられていて、化合物Ｂと化合物Ｃとが固定されている対照領域を有し、化合物Ｂは該分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄが着色微粒子により標識されてなるトレーサーの化合物Ｄと特異的に結合するものであり、化合物Ｃは該分析対象物と特異的に結合するものである、免疫分析用クロマトグラフィストリップである。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップは、以下に説明する特定の対照領域を有する以外は、通常のものである。
【００１２】
すなわち、クロマトグラフィストリップは、よく知られているように、分析対象物及び後記トレーサー等の分析試薬を、分析対象物を含む可能性がある被検試料液のクロマトグラフィストリップ中の毛細管流による移動により、下流に移動させることができるものである。本発明のクロマトグラフィストリップのクロマトグラフィ担体として、このような性質を有する知られているいずれの担体も使用できる。
【００１３】
また、本発明のクロマトグラフィストリップは、通常のものと同様、被検試料液が添加される試料添加領域、及び分析対象物と特異的に結合する化合物Ａが固定されている検出領域を、少なくとも有する。試料添加領域はクロマトグラフィストリップの一端（最上流）に配置され、検出領域は試料添加領域の下流に配置される。
【００１４】
さらに、クロマトグラフィストリップは、試料添加領域と検出領域との間に、トレーサーが毛細管流により移動可能なように置かれている標識領域を有することがある。クロマトグラフィストリップが標識領域を有しない場合には、トレーサーは、被検試料液と共に試料添加領域に添加される。
【００１５】
通常の免疫分析用クロマトグラフィストリップと同様、本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップも、試料添加領域の反対の端（最下流）に、添加された被検試料液の全部を吸収するのに充分な容量の吸収領域を有する。
【００１６】
本発明の分析対象物には、生体試料中等に含まれている抗原又は抗体等、通常の免疫反応を利用したクロマトグラフィストリップにより検出又は測定される分析対象物のいずれも含まれる。
【００１７】
化合物Ａは、よく知られているように、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体、又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又は分析対象物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。ここで「異種動物」とは、分析対象物の抗体を産生した動物種と異なる種の動物をいう。
【００１８】
化合物Ａをクロマトグラフィ担体に固定するには、知られているいずれの方法も使用できる。例えば、微小ビーズに化合物Ａを固定して、このビーズをクロマトグラフィ担体に固定したり、又は化合物Ａをクロマトグラフィ担体に直接あるいはリンカーを介して結合させたりする。
【００１９】
トレーサーは、分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄを着色微粒子で標識したものである。
【００２０】
着色微粒子としては、セレニウムコロイド等の非金属コロイド、金コロイド等の金属コロイド、着色樹脂粒子、染料コロイド及び着色リポソーム等が知られている。
【００２１】
化合物Ｄもよく知られているように、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又は分析対象物の抗体により異種動物を感作して得た抗体である。また、化合物Ｄは、化合物Ａと同じものであっても良いが、異なるものであってもよい。
【００２２】
化合物Ｄを着色微粒子で標識するには、知られている通常の方法が使用できる。
【００２３】
本発明の対照領域は、検出領域の下流に配置され、化合物Ｄと特異的に結合する化合物Ｂと分析対象物と特異的に結合する化合物Ｃとが固定されている領域である。
【００２４】
化合物Ｂは、化合物Ｄが抗原又はその誘導体等である場合には、その抗原又は抗原誘導体等と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントであり、化合物Ｄが抗体又はそのフラグメントである場合には、その抗体又は抗体フラグメントと特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又はその抗体により異種動物を感作して得た抗体である。
【００２５】
化合物Ｃは、分析対象物が抗原である場合には、その抗原と特異的に結合する、抗体又はその抗体のフラグメントである。分析対象物が抗体である場合には、その抗体と特異的に結合する、抗原、又はその抗原の誘導体、その抗原のフラグメント若しくはそのフラグメントの誘導体、又はその抗体により異種動物を感作して得た抗体である。また、化合物Ｃは、化合物ＡとＤのいずれか一方又は両方と同じものであっても良いが、異なるものであってもよい。
【００２６】
対照領域に化合物Ｂ及びＣを固定する方法は、検出領域に化合物Ａを固定する方法と同じ方法であってもよいし、異なる方法であってもよい。例えば、リンカーを介してクロマトグラフィ担体に抗体及び抗原を共有結合させる方法、微粒子表面に抗体または抗原を吸着させてその微粒子を対照領域に置く方法等がある。
【００２７】
本発明の免疫分析用クロマトグラフィストリップを用いて分析対象物を検出又は測定する方法は、従来の免疫分析用クロマトグラフィストリップを用いる場合と変わるところはない。ただし、対照領域の発色が、被検試料のｐＨや被検試料中の分析対象物の量に影響されることがないので、検出領域は被検試料液が通過したことを判定するために、被検試料のｐＨや被検試料中の分析対象物の量を管理する必要はない。
【００２８】
以下、実施例により、さらに本発明を説明する。
【００２９】
【実施例】
トレーサーを次のように調製した。９１ｍＭのＬ−アスコルビン酸ナトリウムと３２ｍＭの酸化セレニウムとを、約４℃で１５分、次いで約４２℃で７０時間攪拌して、セレニウムコロイドを調製した。得られたセレニウムコロイドを５５０ｎｍにおける吸光度が３０になるように１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈した。この希釈液にＨＩＶ―１ｐ４１抗原（１％）を添加し（トレーサーＡ）、又は添加せずに（トレーサーＢ、トレーサー劣化のモデル）、室温で１時間攪拌した。それぞれに、アルカリカゼイン（０．２％）を加えて室温で１時間攪拌して、セレニウムコロイドをアルカリカゼインで被覆し、次いで１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）で洗浄した。
【００３０】
標識領域を次のように調製した。上記トレーサーＡ又はトレーサーＢを１％カゼイン含有１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）に入れ、波長５５０ｎｍの吸光度が３．０になるようにしてトレーサー懸濁液を得た。この懸濁液中にガラス繊維膜（米国ＬＹＤＡＬＬ社製「Ｌｙｐｏｒｅ９５２４」を浸し懸濁液を充分しみ込ませた後、ガラス繊維膜を乾燥した。
【００３１】
検出領域を次のように調製した。ＨＩＶ―１ｐ４１抗原を、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度になるように調製した。一方、クロマトグラフィ担体として０．４ｘ４．５ｃｍの長方形の細孔５μｍのニトロセルロース膜（米国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を、０．４ｘ６．０ｃｍの水不透性のストリップ支持体に長い辺を縦としたときに上端が揃うように貼付した。ストリップ支持体に貼付したニトロセルロース膜の下端から約１ｃｍのところに線状にＨＩＶ−１ｐ４１抗原の溶液を滴下した後、充分乾燥させ、ＨＩＶ―１ｐ４１抗原を固定した。
【００３２】
対照領域として、抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体とＨＩＶ―１ｐ４１抗原の両方が固定されている対照領域Ｃ、及び抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体のみが固定されている対照領域Ｄを調製した。抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体及びＨＩＶ―１ｐ４１抗原の両方又は抗ＨＩＶ―１ｐ４１抗体を、０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に各１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようにし、これを上記ニトロセルロース膜の検出領域から約１ｃｍ離れた上端側に線状に滴下した後、ニトロセルロース膜を充分乾燥させた。ｐＨ指示薬を固定した対照領域Ｅは次のように調製した。０．１３％ブロモチモールブルー、４．０％ヒドロキシエチルセルロース、０．５％ビニルブチラール樹脂を含む１２０ｍＭニトリロートリス（メチレンスルホン酸）溶液をニトロセルロース膜の検出領域から約１ｃｍ離れた上端側に線状に滴下し、ニトロセルロース膜を充分乾燥した。
【００３３】
クロマトグラフィストリップを次のように調製した。上記検出領域としたニトロセルロース膜の下端部のストリップ支持体上に、０．４ｘ０．４ｃｍの正方形に切断した上記標識領域（トレーサーＡ及びＢ）を、ニトロセルロース膜と僅かに接するように貼付した。標識領域下端のストリップ支持体上に試料添加領域として、０．４ｘ１．３ｃｍの不織布（米国Ｄｕｐｏｎｔ社製「Ｓｏｎｔａｒａ８８０１」）を標識領域と接するように貼付した。さらに、０．４ｘ５．１ｃｍの長方形の保護膜フィルム（Ｌｉｎｔｅｃ社製「ＰＥＴ２５ＰＥＬＲ００７４Ａ」）を長い辺を縦としたときに上辺がニトロセルロース膜の上端に揃うように貼付し、これをクロマトグラフィストリップとした。
【００３４】
使用された被検試料液は、ＨＩＶ抗体強陽性であることが予め確認されているヒト血清０．５ｍｌと２０ｍＭリン酸ｐＨ緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍｌとが混合された被検試料液Ｆ及び上記ヒト血清０．１ｍｌと上記ｐＨ緩衝液９．９ｍｌとが混合された被検試料液Ｇである。
【００３５】
各被検試料液５０μＬを上記クロマトグラフィストリップの試料添加領域に添加し、１５分後に検出領域及び対照領域の発色を目視により測定した。
【００３６】
結果を下表に示す。
【００３７】
【表１】

【００３８】
表から明らかなように、本発明の対照領域である対照領域Ｃを用いた場合には（実験番号１及び２）、被検試料中の分析対象物の濃度とは無関係に対照領域は強く発色したが、対照領域がＤである場合には（実験番号３、４）、分析対象物の濃度に依存して対照領域の発色程度が異なった。また、トレーサーが分析対象物と結合できない場合、本発明の対照領域の場合は（実験番号５）、対照領域は発色しなく異常があることを知らせたが、ｐＨ指示薬を固定した対照領域Ｅでは（実験番号６）、対照領域が発色し異常を知らせなかった。
【００３９】
【発明の効果】
以上述べたように、本発明の免疫分析用クロマトグラフィーストリップを用いることにより、被検試料液が検出領域を通過したことを、被検試料のｐＨや被検試料液中分析対象物の濃度に影響されることなく判定することができる。加えて、トレーサーの劣化又は失活があれば、同時に知ることができる。

Claims

分析対象物と特異的に結合する化合物Ａが固定されている検出領域の下流に設けられていて、化合物Ｂと化合物Ｃとが固定されている対照領域を有し、化合物Ｂは該分析対象物と特異的に結合する化合物Ｄが着色微粒子により標識されてなるトレーサーの化合物Ｄと特異的に結合するものであり、化合物Ｃは該分析対象物と特異的に結合するものである、免疫分析用クロマトグラフィストリップ。