JP3768309B2 - Ｄ−α−アミノ酸の改良製造法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いる５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的転換によるＤ−α−アミノ酸の改良製造法であって、プラスミドｐＳＭ７００で形質転換し２０℃〜２８℃の温度で培養した微生物を用いることを特徴とする方法に関する。
【０００２】
酵素系という用語は、Ｄ−ヒダントイナーゼ（hydantoinase）およびＤ−Ｎ−カルバモイラーゼ（carbamoylase）酵素からなる系を表す。
【０００３】
【従来の技術】
Ｄ−α−アミノ酸は、薬理学的に活性な物質（例えば、Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−パラ−ヒドロキシフェニルグリシンはペニシリンおよび半合成セファロスポリンの合成に用いられる）、農薬（殺虫剤であるフルバニレートの合成のためのＤ−バリン）、または甘味料（Ｄ−アラニン）の製造に用いられる極めて重要な化合物である。
【０００４】
対応する５−置換ヒダントインの化学的および／または酵素加水分解によるＤ−α−アミノ酸の製造法は、当該技術分野で知られている。
【０００５】
例えば、仏国特許ＦＲ第２，３１０，９８６号明細書には、５−置換ヒダントインをＤ，Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物中で化学的に加水分解することにより、目的とする異性体を次に分離する方法が記載されている。
【０００６】
仏国特許ＦＲ第２，３１７，３５７号明細書には、５−置換ヒダントインのラセミ混合物を酵素加水分解に付し、この転換の生成物（Ｎ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸）を化学的に酸化して、相当するＤ−α−アミノ酸とする方法が開示されている。
【０００７】
これらの既知の方法は、Ｄ−α−アミノ酸の分割（resolution）および精製の工程が複雑なことによる不都合がある。従って、これらの方法は、工業的観点からは経済的に重要性はない。
【０００８】
これらの不都合を解決するため、Pseudomonas 、Moraxella 、Agrobacterium 、Hansenula 、Arthrobacterなどの微生物によって産生される酵素系を用いて５−置換ヒダントインから加水分解によって直接Ｄ−α−アミノ酸を得る方法が当該技術分野で提案されてきた（欧州特許ＥＰ第１９９，９４３号明細書、欧州特許ＥＰ第３０９，３１０号明細書、米国特許ＵＳ第４，３１２，９４８号明細書、仏国特許ＦＲ第２，４５６，７２８号明細書）。
【０００９】
しかしながら、これらの酵素系の調製には、微生物の方ではこれらの酵素の産生を刺激することができる有効な誘発剤を使用する必要がある。実際に、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバモイラーゼといった酵素の発現レベルは本質的に極めて低いことが知られている（Syldatk ら、（１９９０年）、「生化学的エンジニアリング／生物工学の進歩(Advances in Biochem. Engineering/Biotechnology)（Fiechter, A.監修），４１，２９〜７５頁，Springer-Verlag ，ベルリン）。
【００１０】
しかしながら、誘発剤の使用は、生産コストの増加および酵素の生産収率の若干の変動といった一連の不都合を生じる。また、誘発後に微生物のほとんどで得ることができる発現レベルは、工業的工程におけるそれらの経済的使用には不適である（Syldatk ら、(1987), Biotechnol. Lett., 9: 25-30; Yokozeki ら、(1987), Agri. Biol. Chem., 51, 715-722）。
【００１１】
Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバモイラーゼ酵素をコードする遺伝子は、最近配列決定され、個々にクローニングされている（米国特許ＵＳ第４，９１２，０４４号明細書および欧州特許ＥＰ第５１５，６９８号明細書）。
【００１２】
更に具体的には、米国特許ＵＳ第４，９１２，０４４号明細書には、発現が温度変化によって誘発されるヒダントイナーゼ遺伝子を含むハイブリッドベクターで形質転換した微生物の発酵によるＤ−ヒダントイナーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、５−置換ヒダントインに由来するＤ−Ｎ−α−カルバモイルの製造に用いられる。
【００１３】
欧州特許出願ＥＰ第５１５，６９８号明細書には、発現がＩＰＴＧによって化学的に誘発されるカルバモイラーゼ遺伝子を含んでなるプラスミドで形質転換した微生物の発酵によるＤ−Ｎ−α−カルバモイラーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、Ｎ−カルバモイル誘導体からＤ−α−アミノ酸の製造に用いられる。
【００１４】
工業的関心はラセミ性ヒダントイン（racemic hydantoin）のＤ−α−アミノ酸への転換にあり、これら２種類の酵素が異なる菌株で発現されるという事実は、両者の使用、従って２種類の異なる発酵工程から出発する手順の展開を伴う。これにより、生産コストが増加し、転換速度（kinetics）が減少する。
【００１５】
これらの欠点を解決するため、５−置換ヒダントインのＤ−α−アミノ酸への転換する方法であって、タンデムに配置されかつ単一プロモーターによって制御されるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した微生物を用いる方法が当該技術分野において提案されてきた。これら２種類の遺伝子は、単一細胞区画で（誘発剤なしで）本質的に発現される（イタリア国特許出願ＭＩ９４Ａ００７２６号明細書）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素系の発現およびラセミ混合物の転換率の改良方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
プラスミドｐＳＭ７００による形質転換および２０〜２８℃の温度での発酵によって得られた本発明の微生物を用いることによって、上記方法を改良することができることを見いだした。
【００１８】
この微生物の存在下にて操作すると、実際に酵素系の発現および５−置換ヒダントインのラセミ混合物の相当するＤ−α−アミノ酸への転換率を両方共改良することができる。
これによれば、本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いて５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的な転換によるＤ−α−アミノ酸の製造法であって、上記微生物が、
(a) 構成プロモーターの制御下およびヒダントイナーゼ遺伝子のＳＤ上流を含んでなる領域が、配列ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＡＴＡＴ
を有する場合でのカルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含んでなるプラスミドｐＳＭ７００の構築、
(b) 微生物のプラスミドｐＳＭ７００による形質転換、および
(c) 同化性炭素および窒素源、カチオン、アニオンおよび場合によってビタミンを含む水性培地中での好気性条件下、２０〜２８℃の温度での形質転換微生物の発酵、
によって得られることを特徴とする、方法に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
図４の制限地図を有するプラスミドｐＳＭ７００は、プラスミドｐＳＭ６５１ＣＢＳ ２０３．９４から出発する一般に知られている手法を用いて、酵素系をコードするオペロンにおいてカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ遺伝子の配列を反転し、ヒダントイナーゼ遺伝子のＳＤ上流を含む領域を、配列：
５′ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＡＴＡＴ ３′
を有する領域で置換して得ることができる。
【００２０】
特に、ｐＳＭ７００は、
a) プラスミドｐＳＭ６５１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、
b) a)で得られたプラスミドＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下にて連結して、ヒダントイナーゼ遺伝子のみを含んでなるプラスミドｐＳＭ６３８を得て、
c) ＳＤ、ヒダントイナーゼの最初の２個のアミノ酸をコードするコドン、およびヒダントイナーゼ遺伝子をＳＤの直ぐ下流に挿入させる２つの部位（ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ）を含む２個の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、
d) ２個の相補的オリゴヌクレオチド（リンカー）のアニーリングを行ない、
e) d)で得たリンカーを酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したカルバモイラーゼ遺伝子のみを含むプラスミドｐＳＭ６３７と連結して、リンカーがカルバモイラーゼ遺伝子の下流に正しく挿入されている中間体プラスミドを得て、
f) プラスミドｐＳＭ６３８から最初の２個のＮ−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当するＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩフラグメントを単離し、
g) f)で得たフラグメントをe)においてＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化した中間体プラスミドと連結し、
h) プラスミドｐＳＭ７００を単離する、
ことを含んでなる方法を用いて調製した。
【００２１】
次に、プラスミドｐＳＭ７００を用いて、従来の方法でコンピテントにしたEscherichia coliおよびBacillus subtilis から選択された微生物の宿主細胞を形質転換する。
【００２２】
本発明の酵素系は、プラスミドｐＳＭ７００で形質転換した菌株E. coli またはB. subtilis を、同化性炭素および窒素源並びに各種カチオン、アニオンおよび場合によって微量のビタミン、例えばビオチン、チアミンまたはアミノ酸を含む水性培地で好気性条件下で培養することによって得ることができる。
【００２３】
同化性炭素源は、グルコース、加水分解澱粉、糖蜜、スクロース、または他の通常の炭素源を含む。
【００２４】
窒素源の例は、無機アンモニウム塩、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムおよび尿素、または有機もしくは無機窒素を含む材料、例えばペプトン、酵母エキスまたは肉エキスから選択することができる。
【００２５】
下記のカチオンおよびアニオンも、同様に本発明の目的に好適である：カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェート、スルフェート、塩化物、マンガン、およびニトレート（nitrate）。
【００２６】
発酵は、攪拌下にて、２０°〜２８℃、好ましくは２３°〜２６℃の温度で、６〜７．５、好ましくは６．５〜７．０のｐＨで行なわれる。
【００２７】
上記の好ましい条件下で操作すると、カルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ酵素が、高収率およびほぼ完全に可溶性の形態で得られる。
【００２８】
遠心分離または濾過のような通常の手法によって培地から回収される細胞（バイオマス）は、５−置換ヒダントインのラセミ混合物の転換相に用いられる。
【００２９】
或いは、転換反応は、超音波処理またはフレンチ−プレス(French-Press)による細胞の崩壊から得られる細胞抽出物、または通常の方法で精製したまたは部分的に精製した酵素または不溶性支持体上に固定化した酵素を用いて行なうことができる。
【００３０】
５位が置換された多数のヒダントインを本発明の方法に用いることができる。５位の可能な置換基は、炭素原子数が１〜６の線状または分岐アルキル基であって、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロスルフィドまたはアミン基、またはフェニルまたはベンジル基であってオルト、メタおよびパラ位に１個以上の置換基を含むことができるものでモノまたはポリ置換することができる基から選択される。５−置換ヒダントインの例は、下記の通りである：（Ｄ，Ｌ）−５−フェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−ヒドロキシフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−メチルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−イソプロピルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−チエニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−メトキシフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−クロロフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−ベンジルヒダントイン。
【００３１】
ヒダントインの相当するＤ−α−アミノ酸への転換は、窒素雰囲気下にて密閉装置中で、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で行なわれる。
【００３２】
反応媒質のｐＨは、６〜１０、好ましくは７〜８．５の範囲内に保持される。このｐＨの調節は、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムもしくはカリウムの水溶液のような塩基水溶液を添加することによって行なうことができる。
【００３３】
ヒダントインの初期濃度は、一般的には２重量％〜３０重量％である。本発明の菌株から産生される酵素の立体特異性の結果として、ヒダントインのＤ−鏡像異性体だけが加水分解される。しかしながら、ヒダントインは、操作条件下では多少自発的にラセミ化するので、Ｌ−鏡像異性体は相当するＤ−α−アミノ酸へ完全に転換される。
【００３４】
反応混合物に加えられるバイオマスの量は、酵素に対する基質の特定の親和性によって変化する。一般的に、バイオマス／ヒダントインが１／１〜１／５０の重量比を用いることができる。
【００３５】
本発明の方法によって製造されるＤ−α−アミノ酸は、イオン交換クロマトグラフィまたはアミノ酸の等電点における沈澱のような通常の方法によって反応媒質から回収することができる。
【００３６】
プラスミドｐＳＭ７００はBureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn（オランダ）にE. coli SMC327として寄託され、受託番号CBS 668.95を受けている。
【００３７】
下記の実験例により、本発明の更に良好な例示を提供するが、本発明を限定する物では決してない。
【００３８】
【実施例】
例１
プラスミドｐＳＭ６３８の構築
ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドｐＳＭ６５１ＣＢＳ ２０３．９４約１．７μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（４単位）(Boehringer)で３７℃で６０分間消化した後、ＥｃｏＲＩで３７℃で１０分間消化した。酵素反応を６５℃で１０分間停止した後、ＤＮＡをエタノール２．５容で沈澱し、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）０．０５ｍＭおよびKlenowポリメラーゼ(Boehringer)１単位を含む緩衝溶液１２μｌに再懸濁し、両末端をブラントにした。反応は、室温で４５分間行なった。
【００３９】
次に、反応混合物を、１ｍＭ ＡＴＰおよび６％ ＰＥＧ６０００を含むリガーゼ緩衝液で２０μｌの最終容積まで希釈し、プラスミドＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下にて室温で約４時間連結した。リガーゼの混合物を用いて、５０ｍＭ ＣａＣｌ２でコンピテントにしたE. coli 71/18 (BRL) の細胞を形質転換した(Dagert, M. およびEhrlich, (1979), Gene, 6:23)。
【００４０】
形質転換体を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌおよび０．２％の５−メチルヒダントインを添加したＬＢ培地（８ｇ／リットルBactotryptone (DIFCO) 、５ｇ／リットルの食塩、１５ｇ／ｌの寒天(DIFCO) 、０．５ｇ／ｌ酵母エキス）のプレート上で選択した。
【００４１】
陽性クローンから抽出したプラスミドＤＮＡを分析して、カルバモイラーゼ遺伝子の除去およびヒダントイナーゼ遺伝子のみの存在を確認した。これらのプラスミドの一つをｐＳＭ６３８と呼び（図２）、このプラスミドを含むクローンはＳＭＣ３０４と呼んだ。
【００４２】
例２
プラスミドｐＳＭ７００の構築
下記のオリゴヌクレオチドを、DNA Synthesizer One Plus (Beckmann) を用いて合成した。
【００４３】
これらのオリゴヌクレオチドは、最初の２個のヒダントイナーゼアミノ酸をコードするコドンであるＲＢＳ（ＳＤ′）と、ＲＢＳの直ぐ後にヒダントイナーゼ遺伝子を挿入させる２個の部位（ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ）を含む。
【００４４】
これらのオリゴヌクレオチドの約１．９μｇを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ(Promega) １０単位を含む溶液３０μｌ中で、３７℃で３０分間ホスホリル化した。キナーゼを７０℃で１０分間不活性化した後、溶液を室温（２０〜２５℃）まで徐々に３０分間放冷し、２種類の相補的鎖のアニーリングを行なった。
【００４５】
同時に、カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３７（イタリア国特許出願ＭＩ９４Ａ００７２６号明細書）８００ｎｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの２単位で３７℃で１時間消化した。アリクウオット（aliquot）を０．８％アガロースゲル上に充填して消化が起きたことをチェックした後、ＤＮＡをリンカーと連結した。
【００４６】
実際には、上記の方法で消化したプラスミドｐＳＭ６３７の４０ｎｍとホスホリル化した二本鎖リンカー１２０ｎｇとを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下にてリガーゼ混合物中で１４℃で１６時間連結した。
【００４７】
このようにして得たリガーゼ混合物のアリクウオット（２μｌ）を用いて、ＣａＣｌ２でコンピテントにしたE. coli TG1 の細胞を形質転換した。
【００４８】
次に、形質転換体を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌを添加したＬＢ培地（８ｇ／リットルのBactotryptone (DIFCO) 、５ｇ／リットルのＮａＣｌ、１５ｇ／リットルのAgar (DIFCO)、０．５ｇ／リットルの酵母エキス）のプレート上で選択した。
【００４９】
陽性クローンから抽出したプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化して分析し、カルバモイラーゼ遺伝子の下流にリンカーが正確に挿入されていることを確認した。
これらのプラスミドの一つをｐＩｎｔと呼んだ。
【００５０】
プラスミドｐＳＭ６３８（２μｇ）を酵素ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ（４単位）で消化し、最初の２個のＮ−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当する約１３８０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＲｓｔＩフラグメントを０．８％アガロースゲル上で電気泳動した後、Gelase（商標名）で抽出することによって精製した。
【００５１】
このフラグメント（３０ｎｇ）と、酵素ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで予め消化した中間体プラスミドｐＩｎｔ（約５０ｎｇ）とを、リガーゼ混合物１０μｌ中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下にて１６℃で１６時間連結した。
【００５２】
リガーゼ混合物を用いて、E. coli 71/18 のコンピテント細胞を形質転換した。次に、形質転換体を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌを添加したＬＢ培地（８ｇ／リットルのBactotryptone (DIFCO) 、５ｇ／リットルのＮａＣｌ、１５ｇ／リットルのAgar (DIFCO)、０．５ｇ／リットルの酵母エキス）のプレート上で選択した。陽性クローンから抽出したプラスミドＮＤＡをＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化して分析して、リンカーの下流にヒダントイナーゼ遺伝子が正確に挿入されていることを確認した。
【００５３】
これらのプラスミドの一つは、カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンであって、２個の遺伝子の直ぐ上流の領域が下記のようであるオペロンを含んでいた。
ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＴＣ．．．カルバモイラーゼ
ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＧ．．．ヒダントイナーゼ
【００５４】
このプラスミドをｐＳＭ７００と呼び、これを含むクローンをＳＭＣ３２７と呼んだ。
【００５５】
例３
カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンの発現
A) それぞれプラスミドｐＳＭ６５１およびｐＳＭ７００を含むE. coli 菌株SMC305およびSMC327の単一コロニーからの前培養物を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌを添加したＬＢ培地１０ｍｌがそれぞれ入っている２個の５０ｍｌフラスコに接種した。これらのフラスコを、攪拌下（２２０ｒｐｍ）にて、３７℃および２５℃で、６００ｎｍ（光路１ｃｍ）で測定した光学濃度が４．０となるまでインキュベーションを行なった。
【００５６】
培養ブロス（broth）のアクリウオット（５ｍｌ）を１６，０００ｒｐｍ（４℃、１分間）遠心分離し、回収した細胞を２０％グリセロールを含む２０ｍＭ ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ８．０の３００μｌに再懸濁し、超音波処理によって溶解させた（Soniprep 150, MSE 1 分間のパルス、中電圧）。２種類の溶解物のアリクウオット（５μｌ）を、ポリアクリルアミドゲルに充填した。
【００５７】
Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227, 680, 1970) で染色した後、形質転換していないE. coli 71/18 菌株の抽出物には見られない分子量が５０，０００および３４，０００ダルトンの２個のタンパク質バンドが現れた。また、Coomassie で染色した同じゲルで行なったデンシトメトリー分析では、これらのタンパク質は３７℃で培養したE. coli SMC305よりも２５℃で培養したE. coli SMC327での方が多量に発現したことを示していた（図５）。
【００５８】
B) 酵素活性の測定
ヒダントイナーゼ活性の測定は、４０℃で、２０ｍＭ Ｄ，Ｌ−ｐ−ヒドロキシフェニルヒダントインを含む０．２Ｍ Ｎａ−ＰＯ４緩衝液ｐＨ８．０の３ｍｌ中で行なった。様々な反応時間でのカルバモイルの含量を、反応混合物０．６ｍｌを採取して測定し、これを直ちに１５％トリクロロ酢酸／水 ０．２ｍｌで処理した。沈澱したタンパク質を遠心分離によって除き、Ehrlich 試薬（１０％４−ジメチルアミノベンズアルデヒド）０．２５ｍｌを上清０．５ｍｌに加えて、形成されたカルバモイルを４３８ｎｍで比色法によって測定した。同時に、アミノ酸の含量を、Weatherburn, M.W. (Anal. Chem., vol. 39, 971, 1967) の方法に従ってBerthelot 試薬を用いて反応混合物のアリクウオット（５０μｌ）について６２５ｎｍで比色法によって測定した。ヒダントイナーゼ活性は、生成したカルバモイルとアミノ酸の量の和から得られる。４０℃で上記試験条件下で１分間にヒダントイン１マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。
【００５９】
カルバモイラーゼ活性の測定は、０．１２Ｍ Ｄ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンを含む０．２Ｍ Ｎａ−ＰＯ４緩衝液ｐＨ７．０の０．５ｍｌ中で４０℃で行なった。アミノ酸の含量は、様々な反応時間に反応混合物５０μｌを採取して上記のように操作することによって測定した。上記の試験条件下で４０℃で１分間にカルバモイル１マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。結果を、下記の表１に示す。
【００６０】
これらの結果は、２５℃で成育した菌株E. coli 327が３７℃で成育した菌株より大きな含量のカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ活性を有することを示している。また、菌株E. coli 327 のカルバモイラーゼ活性の含量は、３７℃および２５℃で成育した菌株E. coli 305 より大きい。
【００６１】
例４
（Ｄ，Ｌ）−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインのＤ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転換
バイオマスの生産性を、４０℃で、酸化を防止するため窒素雰囲気下にて、マグネティック・アンカーで攪拌してゴム栓で閉じた１５ｍｌ反応器を用いて、検討した。
【００６２】
それぞれの反応器には、湿ったバイオマス８０ｍｇと、０．２Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ８．０の緩衝液中に８％（Ｄ，Ｌ）−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインを懸濁したもの１０ｍｌとを入れた。
【００６３】
２．５、１５および２２時間後に、反応混合物のアリクウオットを採取して、アセトニトリルを５％およびリン酸０．０１％を含む水溶液で希釈し、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、含まれている濁りを除去した。
【００６４】
このようにして調製した試料をＨＰＬＣで分析して、パラ−ヒドロキシ−フェニル−グリシンおよびＮ−カルバモイル−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンの濃度を測定した。
【００６５】
このため、４．６×２５０ｍｍ Ultrasphere ODS Beckmanカラムを用いて、イソクラティク条件(isocratic conditions)下で１ｍｌ／分の流速で操作し、２７２ｎｍで溶出液を監視した。試料の希釈に用いたのと同じ水溶液を移動相として用いた。
【００６６】
表２に、カルバモイルおよびアミノ酸の形成速度を示す。
【００６７】
これらの結果から、同じバイオマスおよび反応時間では、アミノ酸の蓄積は菌株E. coli SMC327を用いたときの方が大きいことが分かる。
【００６８】
図６は、反応混合物の様々な時間で含まれるアミノ酸およびカルバモイルを添加することによって得られた出発ヒダントインに関する転換データーを示す。
【００６９】
【配列表】
(1) 配列番号：１についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：１５塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi) 配列：
AAGGAGGAAA AATAT 15
【００７０】
(1) 配列番号：２についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：３４塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：Genomic DNA
(xi) 配列：
AGCTTAAGGA GGAAAAATAT ATGGATATCC TGCA 34
【００７１】
(1) 配列番号：３についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：２６塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi) 配列：
ATTCCTCCTT TTTATATACC TATAGG 26
【００７２】
(1) 配列番号：４についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：１８塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi) 配列：
AAAGGAGGAA TTCTTATG 18
【００７３】
(1) 配列番号：５についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：１８塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：Genomic DNA
(xi) 配列：
AAGGAGGAAA AATATATG 18
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドｐＳＭ６５１の制限地図を示す説明図。Ｐはプロモーターであり、ＳＤは遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列。
【図２】ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３８の制限地図を示す説明図。
【図３】カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３７の制限地図を示す説明図。
【図４】カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含むプラスミドｐＳＭ７００の制限地図を示す説明図。Ｐはプロモーターであり、ＳＤ′はヒダントイナーゼ遺伝子の上流の修飾Shine-Dalgarno配列。
【図５】３７℃(A) および２５℃(B) で成育した後のＳＭＣ３０５およびＳＭＣ３２７の細胞抽出物におけるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ発現の電気泳動の分析図
【図６】経時的なＤ，Ｌ−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインの転換動向（％）を示す説明図。
横座標は時（hours ）で表した時間であり、縦座標は％での転換であり、★は菌株E. coli SMC327を示し、黒い□は菌株E. coli SMC305を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いる５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的転換によるＤ−α−アミノ酸の改良製造法であって、プラスミドｐＳＭ７００で形質転換し２０℃〜２８℃の温度で培養した微生物を用いることを特徴とする方法に関する。
【０００２】
酵素系という用語は、Ｄ−ヒダントイナーゼ（hydantoinase）およびＤ−Ｎ−カルバモイラーゼ（carbamoylase）酵素からなる系を表す。
【０００３】
【従来の技術】
Ｄ−α−アミノ酸は、薬理学的に活性な物質（例えば、Ｄ−フェニルグリシンおよびＤ−パラ−ヒドロキシフェニルグリシンはペニシリンおよび半合成セファロスポリンの合成に用いられる）、農薬（殺虫剤であるフルバニレートの合成のためのＤ−バリン）、または甘味料（Ｄ−アラニン）の製造に用いられる極めて重要な化合物である。
【０００４】
対応する５−置換ヒダントインの化学的および／または酵素加水分解によるＤ−α−アミノ酸の製造法は、当該技術分野で知られている。
【０００５】
例えば、仏国特許ＦＲ第２，３１０，９８６号明細書には、５−置換ヒダントインをＤ，Ｌ−アミノ酸のラセミ混合物中で化学的に加水分解することにより、目的とする異性体を次に分離する方法が記載されている。
【０００６】
仏国特許ＦＲ第２，３１７，３５７号明細書には、５−置換ヒダントインのラセミ混合物を酵素加水分解に付し、この転換の生成物（Ｎ−カルバモイル−Ｄ−α−アミノ酸）を化学的に酸化して、相当するＤ−α−アミノ酸とする方法が開示されている。
【０００７】
これらの既知の方法は、Ｄ−α−アミノ酸の分割（resolution）および精製の工程が複雑なことによる不都合がある。従って、これらの方法は、工業的観点からは経済的に重要性はない。
【０００８】
これらの不都合を解決するため、Pseudomonas 、Moraxella 、Agrobacterium 、Hansenula 、Arthrobacterなどの微生物によって産生される酵素系を用いて５−置換ヒダントインから加水分解によって直接Ｄ−α−アミノ酸を得る方法が当該技術分野で提案されてきた（欧州特許ＥＰ第１９９，９４３号明細書、欧州特許ＥＰ第３０９，３１０号明細書、米国特許ＵＳ第４，３１２，９４８号明細書、仏国特許ＦＲ第２，４５６，７２８号明細書）。
【０００９】
しかしながら、これらの酵素系の調製には、微生物の方ではこれらの酵素の産生を刺激することができる有効な誘発剤を使用する必要がある。実際に、Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバモイラーゼといった酵素の発現レベルは本質的に極めて低いことが知られている（Syldatk ら、（１９９０年）、「生化学的エンジニアリング／生物工学の進歩(Advances in Biochem. Engineering/Biotechnology)（Fiechter, A.監修），４１，２９〜７５頁，Springer-Verlag ，ベルリン）。
【００１０】
しかしながら、誘発剤の使用は、生産コストの増加および酵素の生産収率の若干の変動といった一連の不都合を生じる。また、誘発後に微生物のほとんどで得ることができる発現レベルは、工業的工程におけるそれらの経済的使用には不適である（Syldatk ら、(1987), Biotechnol. Lett., 9: 25-30; Yokozeki ら、(1987), Agri. Biol. Chem., 51, 715-722）。
【００１１】
Ｄ−ヒダントイナーゼおよびＤ−Ｎ−カルバモイラーゼ酵素をコードする遺伝子は、最近配列決定され、個々にクローニングされている（米国特許ＵＳ第４，９１２，０４４号明細書および欧州特許ＥＰ第５１５，６９８号明細書）。
【００１２】
更に具体的には、米国特許ＵＳ第４，９１２，０４４号明細書には、発現が温度変化によって誘発されるヒダントイナーゼ遺伝子を含むハイブリッドベクターで形質転換した微生物の発酵によるＤ−ヒダントイナーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、５−置換ヒダントインに由来するＤ−Ｎ−α−カルバモイルの製造に用いられる。
【００１３】
欧州特許出願ＥＰ第５１５，６９８号明細書には、発現がＩＰＴＧによって化学的に誘発されるカルバモイラーゼ遺伝子を含んでなるプラスミドで形質転換した微生物の発酵によるＤ−Ｎ−α−カルバモイラーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、Ｎ−カルバモイル誘導体からＤ−α−アミノ酸の製造に用いられる。
【００１４】
工業的関心はラセミ性ヒダントイン（racemic hydantoin）のＤ−α−アミノ酸への転換にあり、これら２種類の酵素が異なる菌株で発現されるという事実は、両者の使用、従って２種類の異なる発酵工程から出発する手順の展開を伴う。これにより、生産コストが増加し、転換速度（kinetics）が減少する。
【００１５】
これらの欠点を解決するため、５−置換ヒダントインのＤ−α−アミノ酸への転換する方法であって、タンデムに配置されかつ単一プロモーターによって制御されるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した微生物を用いる方法が当該技術分野において提案されてきた。これら２種類の遺伝子は、単一細胞区画で（誘発剤なしで）本質的に発現される（イタリア国特許出願ＭＩ９４Ａ００７２６号明細書）。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素系の発現およびラセミ混合物の転換率の改良方法を提供することを目的とする。
【００１７】
【課題を解決するための手段】
プラスミドｐＳＭ７００による形質転換および２０〜２８℃の温度での発酵によって得られた本発明の微生物を用いることによって、上記方法を改良することができることを見いだした。
【００１８】
この微生物の存在下にて操作すると、実際に酵素系の発現および５−置換ヒダントインのラセミ混合物の相当するＤ−α−アミノ酸への転換率を両方共改良することができる。
これによれば、本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いて５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的な転換によるＤ−α−アミノ酸の製造法であって、上記微生物が、
(a) 構成プロモーターの制御下およびヒダントイナーゼ遺伝子のＳＤ上流を含んでなる領域が、配列ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＡＴＡＴ
を有する場合でのカルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含んでなるプラスミドｐＳＭ７００の構築、
(b) 微生物のプラスミドｐＳＭ７００による形質転換、および
(c) 同化性炭素および窒素源、カチオン、アニオンおよび場合によってビタミンを含む水性培地中での好気性条件下、２０〜２８℃の温度での形質転換微生物の発酵、
によって得られることを特徴とする、方法に関する。
【００１９】
【発明の実施の形態】
図４の制限地図を有するプラスミドｐＳＭ７００は、プラスミドｐＳＭ６５１ＣＢＳ ２０３．９４から出発する一般に知られている手法を用いて、酵素系をコードするオペロンにおいてカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ遺伝子の配列を反転し、ヒダントイナーゼ遺伝子のＳＤ上流を含む領域を、配列：
５′ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＡＴＡＴ ３′
を有する領域で置換して得ることができる。
【００２０】
特に、ｐＳＭ７００は、
a) プラスミドｐＳＭ６５１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、
b) a)で得られたプラスミドＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼの存在下にて連結して、ヒダントイナーゼ遺伝子のみを含んでなるプラスミドｐＳＭ６３８を得て、
c) ＳＤ、ヒダントイナーゼの最初の２個のアミノ酸をコードするコドン、およびヒダントイナーゼ遺伝子をＳＤの直ぐ下流に挿入させる２つの部位（ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ）を含む２個の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、
d) ２個の相補的オリゴヌクレオチド（リンカー）のアニーリングを行ない、
e) d)で得たリンカーを酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩで消化したカルバモイラーゼ遺伝子のみを含むプラスミドｐＳＭ６３７と連結して、リンカーがカルバモイラーゼ遺伝子の下流に正しく挿入されている中間体プラスミドを得て、
f) プラスミドｐＳＭ６３８から最初の２個のＮ−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当するＥｃｏＲＶ−ＰｓｔＩフラグメントを単離し、
g) f)で得たフラグメントをe)においてＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化した中間体プラスミドと連結し、
h) プラスミドｐＳＭ７００を単離する、
ことを含んでなる方法を用いて調製した。
【００２１】
次に、プラスミドｐＳＭ７００を用いて、従来の方法でコンピテントにしたEscherichia coliおよびBacillus subtilis から選択された微生物の宿主細胞を形質転換する。
【００２２】
本発明の酵素系は、プラスミドｐＳＭ７００で形質転換した菌株E. coli またはB. subtilis を、同化性炭素および窒素源並びに各種カチオン、アニオンおよび場合によって微量のビタミン、例えばビオチン、チアミンまたはアミノ酸を含む水性培地で好気性条件下で培養することによって得ることができる。
【００２３】
同化性炭素源は、グルコース、加水分解澱粉、糖蜜、スクロース、または他の通常の炭素源を含む。
【００２４】
窒素源の例は、無機アンモニウム塩、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムおよび尿素、または有機もしくは無機窒素を含む材料、例えばペプトン、酵母エキスまたは肉エキスから選択することができる。
【００２５】
下記のカチオンおよびアニオンも、同様に本発明の目的に好適である：カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェート、スルフェート、塩化物、マンガン、およびニトレート（nitrate）。
【００２６】
発酵は、攪拌下にて、２０°〜２８℃、好ましくは２３°〜２６℃の温度で、６〜７．５、好ましくは６．５〜７．０のｐＨで行なわれる。
【００２７】
上記の好ましい条件下で操作すると、カルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ酵素が、高収率およびほぼ完全に可溶性の形態で得られる。
【００２８】
遠心分離または濾過のような通常の手法によって培地から回収される細胞（バイオマス）は、５−置換ヒダントインのラセミ混合物の転換相に用いられる。
【００２９】
或いは、転換反応は、超音波処理またはフレンチ−プレス(French-Press)による細胞の崩壊から得られる細胞抽出物、または通常の方法で精製したまたは部分的に精製した酵素または不溶性支持体上に固定化した酵素を用いて行なうことができる。
【００３０】
５位が置換された多数のヒダントインを本発明の方法に用いることができる。５位の可能な置換基は、炭素原子数が１〜６の線状または分岐アルキル基であって、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロスルフィドまたはアミン基、またはフェニルまたはベンジル基であってオルト、メタおよびパラ位に１個以上の置換基を含むことができるものでモノまたはポリ置換することができる基から選択される。５−置換ヒダントインの例は、下記の通りである：（Ｄ，Ｌ）−５−フェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−ヒドロキシフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−メチルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−イソプロピルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−チエニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−メトキシフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−クロロフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−ベンジルヒダントイン。
【００３１】
ヒダントインの相当するＤ−α−アミノ酸への転換は、窒素雰囲気下にて密閉装置中で、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４５℃の温度で行なわれる。
【００３２】
反応媒質のｐＨは、６〜１０、好ましくは７〜８．５の範囲内に保持される。このｐＨの調節は、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムもしくはカリウムの水溶液のような塩基水溶液を添加することによって行なうことができる。
【００３３】
ヒダントインの初期濃度は、一般的には２重量％〜３０重量％である。本発明の菌株から産生される酵素の立体特異性の結果として、ヒダントインのＤ−鏡像異性体だけが加水分解される。しかしながら、ヒダントインは、操作条件下では多少自発的にラセミ化するので、Ｌ−鏡像異性体は相当するＤ−α−アミノ酸へ完全に転換される。
【００３４】
反応混合物に加えられるバイオマスの量は、酵素に対する基質の特定の親和性によって変化する。一般的に、バイオマス／ヒダントインが１／１〜１／５０の重量比を用いることができる。
【００３５】
本発明の方法によって製造されるＤ−α−アミノ酸は、イオン交換クロマトグラフィまたはアミノ酸の等電点における沈澱のような通常の方法によって反応媒質から回収することができる。
【００３６】
プラスミドｐＳＭ７００はBureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn（オランダ）にE. coli SMC327として寄託され、受託番号CBS 668.95を受けている。
【００３７】
下記の実験例により、本発明の更に良好な例示を提供するが、本発明を限定する物では決してない。
【００３８】
【実施例】
例１
プラスミドｐＳＭ６３８の構築
ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドｐＳＭ６５１ＣＢＳ ２０３．９４約１．７μｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ（４単位）(Boehringer)で３７℃で６０分間消化した後、ＥｃｏＲＩで３７℃で１０分間消化した。酵素反応を６５℃で１０分間停止した後、ＤＮＡをエタノール２．５容で沈澱し、ｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ）０．０５ｍＭおよびKlenowポリメラーゼ(Boehringer)１単位を含む緩衝溶液１２μｌに再懸濁し、両末端をブラントにした。反応は、室温で４５分間行なった。
【００３９】
次に、反応混合物を、１ｍＭ ＡＴＰおよび６％ ＰＥＧ６０００を含むリガーゼ緩衝液で２０μｌの最終容積まで希釈し、プラスミドＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下にて室温で約４時間連結した。リガーゼの混合物を用いて、５０ｍＭ ＣａＣｌ２でコンピテントにしたE. coli 71/18 (BRL) の細胞を形質転換した(Dagert, M. およびEhrlich, (1979), Gene, 6:23)。
【００４０】
形質転換体を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌおよび０．２％の５−メチルヒダントインを添加したＬＢ培地（８ｇ／リットルBactotryptone (DIFCO) 、５ｇ／リットルの食塩、１５ｇ／ｌの寒天(DIFCO) 、０．５ｇ／ｌ酵母エキス）のプレート上で選択した。
【００４１】
陽性クローンから抽出したプラスミドＤＮＡを分析して、カルバモイラーゼ遺伝子の除去およびヒダントイナーゼ遺伝子のみの存在を確認した。これらのプラスミドの一つをｐＳＭ６３８と呼び（図２）、このプラスミドを含むクローンはＳＭＣ３０４と呼んだ。
【００４２】
例２
プラスミドｐＳＭ７００の構築
下記のオリゴヌクレオチドを、DNA Synthesizer One Plus (Beckmann) を用いて合成した。
これらのオリゴヌクレオチドは、最初の２個のヒダントイナーゼアミノ酸をコードするコドンであるＲＢＳ（ＳＤ′）と、ＲＢＳの直ぐ後にヒダントイナーゼ遺伝子を挿入させる２個の部位（ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ）を含む。
【００４４】
これらのオリゴヌクレオチドの約１．９μｇを、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、７ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＡＴＰおよびポリヌクレオチドキナーゼ(Promega) １０単位を含む溶液３０μｌ中で、３７℃で３０分間ホスホリル化した。キナーゼを７０℃で１０分間不活性化した後、溶液を室温（２０〜２５℃）まで徐々に３０分間放冷し、２種類の相補的鎖のアニーリングを行なった。
【００４５】
同時に、カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３７（イタリア国特許出願ＭＩ９４Ａ００７２６号明細書）８００ｎｇを、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｓｔＩの２単位で３７℃で１時間消化した。アリクウオット（aliquot）を０．８％アガロースゲル上に充填して消化が起きたことをチェックした後、ＤＮＡをリンカーと連結した。
【００４６】
実際には、上記の方法で消化したプラスミドｐＳＭ６３７の４０ｎｍとホスホリル化した二本鎖リンカー１２０ｎｇとを、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下にてリガーゼ混合物中で１４℃で１６時間連結した。
【００４７】
このようにして得たリガーゼ混合物のアリクウオット（２μｌ）を用いて、ＣａＣｌ２でコンピテントにしたE. coli TG1 の細胞を形質転換した。
【００４８】
次に、形質転換体を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌを添加したＬＢ培地（８ｇ／リットルのBactotryptone (DIFCO) 、５ｇ／リットルのＮａＣｌ、１５ｇ／リットルのAgar (DIFCO)、０．５ｇ／リットルの酵母エキス）のプレート上で選択した。
【００４９】
陽性クローンから抽出したプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化して分析し、カルバモイラーゼ遺伝子の下流にリンカーが正確に挿入されていることを確認した。
これらのプラスミドの一つをｐＩｎｔと呼んだ。
【００５０】
プラスミドｐＳＭ６３８（２μｇ）を酵素ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩ（４単位）で消化し、最初の２個のＮ−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当する約１３８０ｂｐのＥｃｏＲＶ−ＲｓｔＩフラグメントを０．８％アガロースゲル上で電気泳動した後、Gelase（商標名）で抽出することによって精製した。
【００５１】
このフラグメント（３０ｎｇ）と、酵素ＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで予め消化した中間体プラスミドｐＩｎｔ（約５０ｎｇ）とを、リガーゼ混合物１０μｌ中でＴ４ ＤＮＡリガーゼ１単位の存在下にて１６℃で１６時間連結した。
【００５２】
リガーゼ混合物を用いて、E. coli 71/18 のコンピテント細胞を形質転換した。次に、形質転換体を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌを添加したＬＢ培地（８ｇ／リットルのBactotryptone (DIFCO) 、５ｇ／リットルのＮａＣｌ、１５ｇ／リットルのAgar (DIFCO)、０．５ｇ／リットルの酵母エキス）のプレート上で選択した。陽性クローンから抽出したプラスミドＮＤＡをＥｃｏＲＶおよびＰｓｔＩで消化して分析して、リンカーの下流にヒダントイナーゼ遺伝子が正確に挿入されていることを確認した。
【００５３】
これらのプラスミドの一つは、カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンであって、２個の遺伝子の直ぐ上流の領域が下記のようであるオペロンを含んでいた。
ＡＡＡ ＧＧＡ ＧＧＡ ＡＴＴ ＣＴＴ ＡＴＣ．．．カルバモイラーゼ
ＡＡＧ ＧＡＧ ＧＡＡ ＡＡＡ ＴＡＴ ＡＴＧ．．．ヒダントイナーゼ
【００５４】
このプラスミドをｐＳＭ７００と呼び、これを含むクローンをＳＭＣ３２７と呼んだ。
【００５５】
例３
カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンの発現
A) それぞれプラスミドｐＳＭ６５１およびｐＳＭ７００を含むE. coli 菌株SMC305およびSMC327の単一コロニーからの前培養物を、クロラムフェニコール２０μｌ／ｍｌを添加したＬＢ培地１０ｍｌがそれぞれ入っている２個の５０ｍｌフラスコに接種した。これらのフラスコを、攪拌下（２２０ｒｐｍ）にて、３７℃および２５℃で、６００ｎｍ（光路１ｃｍ）で測定した光学濃度が４．０となるまでインキュベーションを行なった。
【００５６】
培養ブロス（broth）のアクリウオット（５ｍｌ）を１６，０００ｒｐｍ（４℃、１分間）遠心分離し、回収した細胞を２０％グリセロールを含む２０ｍＭ ＮａＰＯ４緩衝液ｐＨ８．０の３００μｌに再懸濁し、超音波処理によって溶解させた（Soniprep 150, MSE 1 分間のパルス、中電圧）。２種類の溶解物のアリクウオット（５μｌ）を、ポリアクリルアミドゲルに充填した。
【００５７】
Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227, 680, 1970) で染色した後、形質転換していないE. coli 71/18 菌株の抽出物には見られない分子量が５０，０００および３４，０００ダルトンの２個のタンパク質バンドが現れた。また、Coomassie で染色した同じゲルで行なったデンシトメトリー分析では、これらのタンパク質は３７℃で培養したE. coli SMC305よりも２５℃で培養したE. coli SMC327での方が多量に発現したことを示していた（図５）。
【００５８】
B) 酵素活性の測定
ヒダントイナーゼ活性の測定は、４０℃で、２０ｍＭ Ｄ，Ｌ−ｐ−ヒドロキシフェニルヒダントインを含む０．２Ｍ Ｎａ−ＰＯ４緩衝液ｐＨ８．０の３ｍｌ中で行なった。様々な反応時間でのカルバモイルの含量を、反応混合物０．６ｍｌを採取して測定し、これを直ちに１５％トリクロロ酢酸／水 ０．２ｍｌで処理した。沈澱したタンパク質を遠心分離によって除き、Ehrlich 試薬（１０％４−ジメチルアミノベンズアルデヒド）０．２５ｍｌを上清０．５ｍｌに加えて、形成されたカルバモイルを４３８ｎｍで比色法によって測定した。同時に、アミノ酸の含量を、Weatherburn, M.W. (Anal. Chem., vol. 39, 971, 1967) の方法に従ってBerthelot 試薬を用いて反応混合物のアリクウオット（５０μｌ）について６２５ｎｍで比色法によって測定した。ヒダントイナーゼ活性は、生成したカルバモイルとアミノ酸の量の和から得られる。４０℃で上記試験条件下で１分間にヒダントイン１マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。
【００５９】
カルバモイラーゼ活性の測定は、０．１２Ｍ Ｄ−カルバモイル−ｐ−ヒドロキシフェニルグリシンを含む０．２Ｍ Ｎａ−ＰＯ４緩衝液ｐＨ７．０の０．５ｍｌ中で４０℃で行なった。アミノ酸の含量は、様々な反応時間に反応混合物５０μｌを採取して上記のように操作することによって測定した。上記の試験条件下で４０℃で１分間にカルバモイル１マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。結果を、下記の表１に示す。
これらの結果は、２５℃で成育した菌株E. coli 327が３７℃で成育した菌株より大きな含量のカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ活性を有することを示している。また、菌株E. coli 327 のカルバモイラーゼ活性の含量は、３７℃および２５℃で成育した菌株E. coli 305 より大きい。
【００６１】
例４
（Ｄ，Ｌ）−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインのＤ−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転換
バイオマスの生産性を、４０℃で、酸化を防止するため窒素雰囲気下にて、マグネティック・アンカーで攪拌してゴム栓で閉じた１５ｍｌ反応器を用いて、検討した。
【００６２】
それぞれの反応器には、湿ったバイオマス８０ｍｇと、０．２Ｍ ＮａＰＯ４、ｐＨ８．０の緩衝液中に８％（Ｄ，Ｌ）−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインを懸濁したもの１０ｍｌとを入れた。
【００６３】
２．５、１５および２２時間後に、反応混合物のアリクウオットを採取して、アセトニトリルを５％およびリン酸０．０１％を含む水溶液で希釈し、１６，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、含まれている濁りを除去した。
【００６４】
このようにして調製した試料をＨＰＬＣで分析して、パラ−ヒドロキシ−フェニル−グリシンおよびＮ−カルバモイル−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンの濃度を測定した。
【００６５】
このため、４．６×２５０ｍｍ Ultrasphere ODS Beckmanカラムを用いて、イソクラティク条件(isocratic conditions)下で１ｍｌ／分の流速で操作し、２７２ｎｍで溶出液を監視した。試料の希釈に用いたのと同じ水溶液を移動相として用いた。
【００６６】
表２に、カルバモイルおよびアミノ酸の形成速度を示す。
これらの結果から、同じバイオマスおよび反応時間では、アミノ酸の蓄積は菌株E. coli SMC327を用いたときの方が大きいことが分かる。
【００６８】
図６は、反応混合物の様々な時間で含まれるアミノ酸およびカルバモイルを添加することによって得られた出発ヒダントインに関する転換データーを示す。
【００６９】
【配列表】
(1) 配列番号：１についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：１５塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi) 配列：
AAGGAGGAAA AATAT 15
【００７０】
(1) 配列番号：２についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：３４塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：Genomic DNA
(xi) 配列：
AGCTTAAGGA GGAAAAATAT ATGGATATCC TGCA 34
【００７１】
(1) 配列番号：３についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：２６塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi) 配列：
ATTCCTCCTT TTTATATACC TATAGG 26
【００７２】
(1) 配列番号：４についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：１８塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(xi) 配列：
AAAGGAGGAA TTCTTATG 18
【００７３】
(1) 配列番号：５についての情報
配列の特性：
(A) 長さ：１８塩基対
(B) 型：核酸
(C) 鎖の数：一本鎖
(D) トポロジー：直鎖状
(ii) 配列の種類：Genomic DNA
(xi) 配列：
AAGGAGGAAA AATATATG 18
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドｐＳＭ６５１の制限地図を示す説明図。Ｐはプロモーターであり、ＳＤは遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ（Shine-Dalgarno）配列。
【図２】ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３８の制限地図を示す説明図。
【図３】カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドｐＳＭ６３７の制限地図を示す説明図。
【図４】カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含むプラスミドｐＳＭ７００の制限地図を示す説明図。Ｐはプロモーターであり、ＳＤ′はヒダントイナーゼ遺伝子の上流の修飾Shine-Dalgarno配列。
【図５】３７℃(A) および２５℃(B) で成育した後のＳＭＣ３０５およびＳＭＣ３２７の細胞抽出物におけるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ発現の電気泳動の分析図
横座標は時（hours ）で表した時間であり、縦座標は％での転換であり、★は菌株E. coli SMC327を示し、黒い□は菌株E. coli SMC305を示す。
Claims (17)
- 微生物によって産生される酵素系を用いる５−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的転換によるＤ−α−アミノ酸の改良製造法であって、前記微生物が、
(a) 構成プロモーターの制御下およびヒダントイナーゼ遺伝子のＲＢＳ上流を含んでなる領域が、配列
ＡＡＧＧＡＧＧＡＡＡ ＡＡＴＡＴ
を有する場合でのカルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含んでなるプラスミドｐＳＭ７００ ＣＢＳ ６６８．９５の構築、
(b) 微生物のプラスミドｐＳＭ７００による形質転換、および
(c) 同化性炭素および窒素源、カチオン、アニオンおよび場合によってビタミンを含む水性培地中での好気性条件下、２０〜２８℃の温度での形質転換微生物の発酵、
によって得られることを特徴とする、方法。 - 微生物がEscherichia coliおよびBacillus subtilis から選択される、請求項１に記載の方法。
- 微生物を２３〜２６℃の温度で培養する、請求項１に記載の方法。
- 同化性炭素源が炭水化物を含んでなる、請求項１に記載の方法。
- 窒素源を無機アンモニウム塩および尿素または有機もしくは無機窒素を含む材料から選択することができる、請求項１に記載の方法。
- カチオンおよびアニオンが、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェート、スルフェート、塩化物、マンガン、およびニトレートから選択される、請求項１に記載の方法。
- ５−置換ヒダントインが（Ｄ，Ｌ）−５−フェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−メチルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−イソプロピルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−チエニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−メトキシフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−クロロフェニルヒダントイン、（Ｄ，Ｌ）−５−ベンジルヒダントインから選択される、請求項１に記載の方法。
- ヒダントインが（Ｄ，Ｌ）−５−パラ−ヒドロキシフェニルヒダントインである、請求項７に記載の方法。
- ヒダントインが（Ｄ，Ｌ）−５−フェニルヒダントインである、請求項７に記載の方法。
- 転換反応を２０℃〜６０℃の温度で行なう、請求項１に記載の方法。
- 温度が３０°〜４５℃である、請求項１０に記載の方法。
- 転換反応を６．０〜１０のｐＨで行なう、請求項１に記載の方法。
- ｐＨが７．０〜８．５である、請求項１２に記載の方法。
- 転換反応を１／１〜１／５０の湿ったバイオマス／ヒダントインの重量比を用いて行なう、請求項１に記載の方法。
- Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn（オランダ）に寄託し、CBS 668.95の受託番号を受けているプラスミドｐＳＭ７００。
- 受託番号ＣＢＳ６６８．９５のプラスミドｐＳＭ７００で形質転換したBacillus subtilis およびEscherichia coliから選択される微生物。
- Escherichia coli SMC327 CBS 668.95である、請求項１６に記載の微生物。
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