JP3768309B2 - D−α−アミノ酸の改良製造法 - Google Patents
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いる5−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的転換によるD−α−アミノ酸の改良製造法であって、プラスミドpSM700で形質転換し20℃〜28℃の温度で培養した微生物を用いることを特徴とする方法に関する。
【0002】
酵素系という用語は、D−ヒダントイナーゼ(hydantoinase)およびD−N−カルバモイラーゼ(carbamoylase)酵素からなる系を表す。
【0003】
【従来の技術】
D−α−アミノ酸は、薬理学的に活性な物質(例えば、D−フェニルグリシンおよびD−パラ−ヒドロキシフェニルグリシンはペニシリンおよび半合成セファロスポリンの合成に用いられる)、農薬(殺虫剤であるフルバニレートの合成のためのD−バリン)、または甘味料(D−アラニン)の製造に用いられる極めて重要な化合物である。
【0004】
対応する5−置換ヒダントインの化学的および/または酵素加水分解によるD−α−アミノ酸の製造法は、当該技術分野で知られている。
【0005】
例えば、仏国特許FR第2,310,986号明細書には、5−置換ヒダントインをD,L−アミノ酸のラセミ混合物中で化学的に加水分解することにより、目的とする異性体を次に分離する方法が記載されている。
【0006】
仏国特許FR第2,317,357号明細書には、5−置換ヒダントインのラセミ混合物を酵素加水分解に付し、この転換の生成物(N−カルバモイル−D−α−アミノ酸)を化学的に酸化して、相当するD−α−アミノ酸とする方法が開示されている。
【0007】
これらの既知の方法は、D−α−アミノ酸の分割(resolution)および精製の工程が複雑なことによる不都合がある。従って、これらの方法は、工業的観点からは経済的に重要性はない。
【0008】
これらの不都合を解決するため、Pseudomonas 、Moraxella 、Agrobacterium 、Hansenula 、Arthrobacterなどの微生物によって産生される酵素系を用いて5−置換ヒダントインから加水分解によって直接D−α−アミノ酸を得る方法が当該技術分野で提案されてきた(欧州特許EP第199,943号明細書、欧州特許EP第309,310号明細書、米国特許US第4,312,948号明細書、仏国特許FR第2,456,728号明細書)。
【0009】
しかしながら、これらの酵素系の調製には、微生物の方ではこれらの酵素の産生を刺激することができる有効な誘発剤を使用する必要がある。実際に、D−ヒダントイナーゼおよびD−N−カルバモイラーゼといった酵素の発現レベルは本質的に極めて低いことが知られている(Syldatk ら、(1990年)、「生化学的エンジニアリング/生物工学の進歩(Advances in Biochem. Engineering/Biotechnology)(Fiechter, A.監修),41,29〜75頁,Springer-Verlag ,ベルリン)。
【0010】
しかしながら、誘発剤の使用は、生産コストの増加および酵素の生産収率の若干の変動といった一連の不都合を生じる。また、誘発後に微生物のほとんどで得ることができる発現レベルは、工業的工程におけるそれらの経済的使用には不適である(Syldatk ら、(1987), Biotechnol. Lett., 9: 25-30; Yokozeki ら、(1987), Agri. Biol. Chem., 51, 715-722)。
【0011】
D−ヒダントイナーゼおよびD−N−カルバモイラーゼ酵素をコードする遺伝子は、最近配列決定され、個々にクローニングされている(米国特許US第4,912,044号明細書および欧州特許EP第515,698号明細書)。
【0012】
更に具体的には、米国特許US第4,912,044号明細書には、発現が温度変化によって誘発されるヒダントイナーゼ遺伝子を含むハイブリッドベクターで形質転換した微生物の発酵によるD−ヒダントイナーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、5−置換ヒダントインに由来するD−N−α−カルバモイルの製造に用いられる。
【0013】
欧州特許出願EP第515,698号明細書には、発現がIPTGによって化学的に誘発されるカルバモイラーゼ遺伝子を含んでなるプラスミドで形質転換した微生物の発酵によるD−N−α−カルバモイラーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、N−カルバモイル誘導体からD−α−アミノ酸の製造に用いられる。
【0014】
工業的関心はラセミ性ヒダントイン(racemic hydantoin)のD−α−アミノ酸への転換にあり、これら2種類の酵素が異なる菌株で発現されるという事実は、両者の使用、従って2種類の異なる発酵工程から出発する手順の展開を伴う。これにより、生産コストが増加し、転換速度(kinetics)が減少する。
【0015】
これらの欠点を解決するため、5−置換ヒダントインのD−α−アミノ酸への転換する方法であって、タンデムに配置されかつ単一プロモーターによって制御されるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した微生物を用いる方法が当該技術分野において提案されてきた。これら2種類の遺伝子は、単一細胞区画で(誘発剤なしで)本質的に発現される(イタリア国特許出願MI94A00726号明細書)。
【0016】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素系の発現およびラセミ混合物の転換率の改良方法を提供することを目的とする。
【0017】
【課題を解決するための手段】
プラスミドpSM700による形質転換および20〜28℃の温度での発酵によって得られた本発明の微生物を用いることによって、上記方法を改良することができることを見いだした。
【0018】
この微生物の存在下にて操作すると、実際に酵素系の発現および5−置換ヒダントインのラセミ混合物の相当するD−α−アミノ酸への転換率を両方共改良することができる。
これによれば、本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いて5−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的な転換によるD−α−アミノ酸の製造法であって、上記微生物が、
(a) 構成プロモーターの制御下およびヒダントイナーゼ遺伝子のSD上流を含んでなる領域が、配列AAGGAGGAAA AATAT
を有する場合でのカルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含んでなるプラスミドpSM700の構築、
(b) 微生物のプラスミドpSM700による形質転換、および
(c) 同化性炭素および窒素源、カチオン、アニオンおよび場合によってビタミンを含む水性培地中での好気性条件下、20〜28℃の温度での形質転換微生物の発酵、
によって得られることを特徴とする、方法に関する。
【0019】
【発明の実施の形態】
図4の制限地図を有するプラスミドpSM700は、プラスミドpSM651CBS 203.94から出発する一般に知られている手法を用いて、酵素系をコードするオペロンにおいてカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ遺伝子の配列を反転し、ヒダントイナーゼ遺伝子のSD上流を含む領域を、配列:
5′AAGGAGGAAA AATAT 3′
を有する領域で置換して得ることができる。
【0020】
特に、pSM700は、
a) プラスミドpSM651を制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化し、
b) a)で得られたプラスミドDNAをT4 DNAリガーゼの存在下にて連結して、ヒダントイナーゼ遺伝子のみを含んでなるプラスミドpSM638を得て、
c) SD、ヒダントイナーゼの最初の2個のアミノ酸をコードするコドン、およびヒダントイナーゼ遺伝子をSDの直ぐ下流に挿入させる2つの部位(EcoRVおよびPstI)を含む2個の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、
d) 2個の相補的オリゴヌクレオチド(リンカー)のアニーリングを行ない、
e) d)で得たリンカーを酵素HindIIIおよびPstIで消化したカルバモイラーゼ遺伝子のみを含むプラスミドpSM637と連結して、リンカーがカルバモイラーゼ遺伝子の下流に正しく挿入されている中間体プラスミドを得て、
f) プラスミドpSM638から最初の2個のN−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当するEcoRV−PstIフラグメントを単離し、
g) f)で得たフラグメントをe)においてEcoRVおよびPstIで消化した中間体プラスミドと連結し、
h) プラスミドpSM700を単離する、
ことを含んでなる方法を用いて調製した。
【0021】
次に、プラスミドpSM700を用いて、従来の方法でコンピテントにしたEscherichia coliおよびBacillus subtilis から選択された微生物の宿主細胞を形質転換する。
【0022】
本発明の酵素系は、プラスミドpSM700で形質転換した菌株E. coli またはB. subtilis を、同化性炭素および窒素源並びに各種カチオン、アニオンおよび場合によって微量のビタミン、例えばビオチン、チアミンまたはアミノ酸を含む水性培地で好気性条件下で培養することによって得ることができる。
【0023】
同化性炭素源は、グルコース、加水分解澱粉、糖蜜、スクロース、または他の通常の炭素源を含む。
【0024】
窒素源の例は、無機アンモニウム塩、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムおよび尿素、または有機もしくは無機窒素を含む材料、例えばペプトン、酵母エキスまたは肉エキスから選択することができる。
【0025】
下記のカチオンおよびアニオンも、同様に本発明の目的に好適である:カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェート、スルフェート、塩化物、マンガン、およびニトレート(nitrate)。
【0026】
発酵は、攪拌下にて、20°〜28℃、好ましくは23°〜26℃の温度で、6〜7.5、好ましくは6.5〜7.0のpHで行なわれる。
【0027】
上記の好ましい条件下で操作すると、カルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ酵素が、高収率およびほぼ完全に可溶性の形態で得られる。
【0028】
遠心分離または濾過のような通常の手法によって培地から回収される細胞(バイオマス)は、5−置換ヒダントインのラセミ混合物の転換相に用いられる。
【0029】
或いは、転換反応は、超音波処理またはフレンチ−プレス(French-Press)による細胞の崩壊から得られる細胞抽出物、または通常の方法で精製したまたは部分的に精製した酵素または不溶性支持体上に固定化した酵素を用いて行なうことができる。
【0030】
5位が置換された多数のヒダントインを本発明の方法に用いることができる。5位の可能な置換基は、炭素原子数が1〜6の線状または分岐アルキル基であって、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロスルフィドまたはアミン基、またはフェニルまたはベンジル基であってオルト、メタおよびパラ位に1個以上の置換基を含むことができるものでモノまたはポリ置換することができる基から選択される。5−置換ヒダントインの例は、下記の通りである:(D,L)−5−フェニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−ヒドロキシフェニルヒダントイン、(D,L)−5−メチルヒダントイン、(D,L)−5−イソプロピルヒダントイン、(D,L)−5−チエニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−メトキシフェニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−クロロフェニルヒダントイン、(D,L)−5−ベンジルヒダントイン。
【0031】
ヒダントインの相当するD−α−アミノ酸への転換は、窒素雰囲気下にて密閉装置中で、20〜60℃、好ましくは30〜45℃の温度で行なわれる。
【0032】
反応媒質のpHは、6〜10、好ましくは7〜8.5の範囲内に保持される。このpHの調節は、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムもしくはカリウムの水溶液のような塩基水溶液を添加することによって行なうことができる。
【0033】
ヒダントインの初期濃度は、一般的には2重量%〜30重量%である。本発明の菌株から産生される酵素の立体特異性の結果として、ヒダントインのD−鏡像異性体だけが加水分解される。しかしながら、ヒダントインは、操作条件下では多少自発的にラセミ化するので、L−鏡像異性体は相当するD−α−アミノ酸へ完全に転換される。
【0034】
反応混合物に加えられるバイオマスの量は、酵素に対する基質の特定の親和性によって変化する。一般的に、バイオマス/ヒダントインが1/1〜1/50の重量比を用いることができる。
【0035】
本発明の方法によって製造されるD−α−アミノ酸は、イオン交換クロマトグラフィまたはアミノ酸の等電点における沈澱のような通常の方法によって反応媒質から回収することができる。
【0036】
プラスミドpSM700はBureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn(オランダ)にE. coli SMC327として寄託され、受託番号CBS 668.95を受けている。
【0037】
下記の実験例により、本発明の更に良好な例示を提供するが、本発明を限定する物では決してない。
【0038】
【実施例】
例1
プラスミドpSM638の構築
ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドpSM651CBS 203.94約1.7μgを、制限酵素HindIII(4単位)(Boehringer)で37℃で60分間消化した後、EcoRIで37℃で10分間消化した。酵素反応を65℃で10分間停止した後、DNAをエタノール2.5容で沈澱し、dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)0.05mMおよびKlenowポリメラーゼ(Boehringer)1単位を含む緩衝溶液12μlに再懸濁し、両末端をブラントにした。反応は、室温で45分間行なった。
【0039】
次に、反応混合物を、1mM ATPおよび6% PEG6000を含むリガーゼ緩衝液で20μlの最終容積まで希釈し、プラスミドDNAをT4 DNAリガーゼ1単位の存在下にて室温で約4時間連結した。リガーゼの混合物を用いて、50mM CaCl2でコンピテントにしたE. coli 71/18 (BRL) の細胞を形質転換した(Dagert, M. およびEhrlich, (1979), Gene, 6:23)。
【0040】
形質転換体を、クロラムフェニコール20μl/mlおよび0.2%の5−メチルヒダントインを添加したLB培地(8g/リットルBactotryptone (DIFCO) 、5g/リットルの食塩、15g/lの寒天(DIFCO) 、0.5g/l酵母エキス)のプレート上で選択した。
【0041】
陽性クローンから抽出したプラスミドDNAを分析して、カルバモイラーゼ遺伝子の除去およびヒダントイナーゼ遺伝子のみの存在を確認した。これらのプラスミドの一つをpSM638と呼び(図2)、このプラスミドを含むクローンはSMC304と呼んだ。
【0042】
例2
プラスミドpSM700の構築
下記のオリゴヌクレオチドを、DNA Synthesizer One Plus (Beckmann) を用いて合成した。
【0043】
これらのオリゴヌクレオチドは、最初の2個のヒダントイナーゼアミノ酸をコードするコドンであるRBS(SD′)と、RBSの直ぐ後にヒダントイナーゼ遺伝子を挿入させる2個の部位(EcoRVおよびPstI)を含む。
【0044】
これらのオリゴヌクレオチドの約1.9μgを、100mM Tris−HCl pH8.0、10mM MgCl2、7mM DTT、1mM ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼ(Promega) 10単位を含む溶液30μl中で、37℃で30分間ホスホリル化した。キナーゼを70℃で10分間不活性化した後、溶液を室温(20〜25℃)まで徐々に30分間放冷し、2種類の相補的鎖のアニーリングを行なった。
【0045】
同時に、カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSM637(イタリア国特許出願MI94A00726号明細書)800ngを、制限酵素HindIIIおよびPstIの2単位で37℃で1時間消化した。アリクウオット(aliquot)を0.8%アガロースゲル上に充填して消化が起きたことをチェックした後、DNAをリンカーと連結した。
【0046】
実際には、上記の方法で消化したプラスミドpSM637の40nmとホスホリル化した二本鎖リンカー120ngとを、T4 DNAリガーゼ1単位の存在下にてリガーゼ混合物中で14℃で16時間連結した。
【0047】
このようにして得たリガーゼ混合物のアリクウオット(2μl)を用いて、CaCl2でコンピテントにしたE. coli TG1 の細胞を形質転換した。
【0048】
次に、形質転換体を、クロラムフェニコール20μl/mlを添加したLB培地(8g/リットルのBactotryptone (DIFCO) 、5g/リットルのNaCl、15g/リットルのAgar (DIFCO)、0.5g/リットルの酵母エキス)のプレート上で選択した。
【0049】
陽性クローンから抽出したプラスミドDNAをEcoRVおよびPstIで消化して分析し、カルバモイラーゼ遺伝子の下流にリンカーが正確に挿入されていることを確認した。
これらのプラスミドの一つをpIntと呼んだ。
【0050】
プラスミドpSM638(2μg)を酵素EcoRVおよびPstI(4単位)で消化し、最初の2個のN−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当する約1380bpのEcoRV−RstIフラグメントを0.8%アガロースゲル上で電気泳動した後、Gelase(商標名)で抽出することによって精製した。
【0051】
このフラグメント(30ng)と、酵素EcoRVおよびPstIで予め消化した中間体プラスミドpInt(約50ng)とを、リガーゼ混合物10μl中でT4 DNAリガーゼ1単位の存在下にて16℃で16時間連結した。
【0052】
リガーゼ混合物を用いて、E. coli 71/18 のコンピテント細胞を形質転換した。次に、形質転換体を、クロラムフェニコール20μl/mlを添加したLB培地(8g/リットルのBactotryptone (DIFCO) 、5g/リットルのNaCl、15g/リットルのAgar (DIFCO)、0.5g/リットルの酵母エキス)のプレート上で選択した。陽性クローンから抽出したプラスミドNDAをEcoRVおよびPstIで消化して分析して、リンカーの下流にヒダントイナーゼ遺伝子が正確に挿入されていることを確認した。
【0053】
これらのプラスミドの一つは、カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンであって、2個の遺伝子の直ぐ上流の領域が下記のようであるオペロンを含んでいた。
AAA GGA GGA ATT CTT ATC...カルバモイラーゼ
AAG GAG GAA AAA TAT ATG...ヒダントイナーゼ
【0054】
このプラスミドをpSM700と呼び、これを含むクローンをSMC327と呼んだ。
【0055】
例3
カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンの発現
A) それぞれプラスミドpSM651およびpSM700を含むE. coli 菌株SMC305およびSMC327の単一コロニーからの前培養物を、クロラムフェニコール20μl/mlを添加したLB培地10mlがそれぞれ入っている2個の50mlフラスコに接種した。これらのフラスコを、攪拌下(220rpm)にて、37℃および25℃で、600nm(光路1cm)で測定した光学濃度が4.0となるまでインキュベーションを行なった。
【0056】
培養ブロス(broth)のアクリウオット(5ml)を16,000rpm(4℃、1分間)遠心分離し、回収した細胞を20%グリセロールを含む20mM NaPO4緩衝液pH8.0の300μlに再懸濁し、超音波処理によって溶解させた(Soniprep 150, MSE 1 分間のパルス、中電圧)。2種類の溶解物のアリクウオット(5μl)を、ポリアクリルアミドゲルに充填した。
【0057】
Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227, 680, 1970) で染色した後、形質転換していないE. coli 71/18 菌株の抽出物には見られない分子量が50,000および34,000ダルトンの2個のタンパク質バンドが現れた。また、Coomassie で染色した同じゲルで行なったデンシトメトリー分析では、これらのタンパク質は37℃で培養したE. coli SMC305よりも25℃で培養したE. coli SMC327での方が多量に発現したことを示していた(図5)。
【0058】
B) 酵素活性の測定
ヒダントイナーゼ活性の測定は、40℃で、20mM D,L−p−ヒドロキシフェニルヒダントインを含む0.2M Na−PO4緩衝液pH8.0の3ml中で行なった。様々な反応時間でのカルバモイルの含量を、反応混合物0.6mlを採取して測定し、これを直ちに15%トリクロロ酢酸/水 0.2mlで処理した。沈澱したタンパク質を遠心分離によって除き、Ehrlich 試薬(10%4−ジメチルアミノベンズアルデヒド)0.25mlを上清0.5mlに加えて、形成されたカルバモイルを438nmで比色法によって測定した。同時に、アミノ酸の含量を、Weatherburn, M.W. (Anal. Chem., vol. 39, 971, 1967) の方法に従ってBerthelot 試薬を用いて反応混合物のアリクウオット(50μl)について625nmで比色法によって測定した。ヒダントイナーゼ活性は、生成したカルバモイルとアミノ酸の量の和から得られる。40℃で上記試験条件下で1分間にヒダントイン1マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。
【0059】
カルバモイラーゼ活性の測定は、0.12M D−カルバモイル−p−ヒドロキシフェニルグリシンを含む0.2M Na−PO4緩衝液pH7.0の0.5ml中で40℃で行なった。アミノ酸の含量は、様々な反応時間に反応混合物50μlを採取して上記のように操作することによって測定した。上記の試験条件下で40℃で1分間にカルバモイル1マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。結果を、下記の表1に示す。
【0060】
これらの結果は、25℃で成育した菌株E. coli 327が37℃で成育した菌株より大きな含量のカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ活性を有することを示している。また、菌株E. coli 327 のカルバモイラーゼ活性の含量は、37℃および25℃で成育した菌株E. coli 305 より大きい。
【0061】
例4
(D,L)−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインのD−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転換
バイオマスの生産性を、40℃で、酸化を防止するため窒素雰囲気下にて、マグネティック・アンカーで攪拌してゴム栓で閉じた15ml反応器を用いて、検討した。
【0062】
それぞれの反応器には、湿ったバイオマス80mgと、0.2M NaPO4、pH8.0の緩衝液中に8%(D,L)−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインを懸濁したもの10mlとを入れた。
【0063】
2.5、15および22時間後に、反応混合物のアリクウオットを採取して、アセトニトリルを5%およびリン酸0.01%を含む水溶液で希釈し、16,000rpmで10分間遠心分離して、含まれている濁りを除去した。
【0064】
このようにして調製した試料をHPLCで分析して、パラ−ヒドロキシ−フェニル−グリシンおよびN−カルバモイル−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンの濃度を測定した。
【0065】
このため、4.6×250mm Ultrasphere ODS Beckmanカラムを用いて、イソクラティク条件(isocratic conditions)下で1ml/分の流速で操作し、272nmで溶出液を監視した。試料の希釈に用いたのと同じ水溶液を移動相として用いた。
【0066】
表2に、カルバモイルおよびアミノ酸の形成速度を示す。
【0067】
これらの結果から、同じバイオマスおよび反応時間では、アミノ酸の蓄積は菌株E. coli SMC327を用いたときの方が大きいことが分かる。
【0068】
図6は、反応混合物の様々な時間で含まれるアミノ酸およびカルバモイルを添加することによって得られた出発ヒダントインに関する転換データーを示す。
【0069】
【配列表】
(1) 配列番号:1についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:15塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(xi) 配列:
AAGGAGGAAA AATAT 15
【0070】
(1) 配列番号:2についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:34塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:Genomic DNA
(xi) 配列:
AGCTTAAGGA GGAAAAATAT ATGGATATCC TGCA 34
【0071】
(1) 配列番号:3についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:26塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(xi) 配列:
ATTCCTCCTT TTTATATACC TATAGG 26
【0072】
(1) 配列番号:4についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:18塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(xi) 配列:
AAAGGAGGAA TTCTTATG 18
【0073】
(1) 配列番号:5についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:18塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:Genomic DNA
(xi) 配列:
AAGGAGGAAA AATATATG 18
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドpSM651の制限地図を示す説明図。Pはプロモーターであり、SDは遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列。
【図2】ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドpSM638の制限地図を示す説明図。
【図3】カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSM637の制限地図を示す説明図。
【図4】カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含むプラスミドpSM700の制限地図を示す説明図。Pはプロモーターであり、SD′はヒダントイナーゼ遺伝子の上流の修飾Shine-Dalgarno配列。
【図5】37℃(A) および25℃(B) で成育した後のSMC305およびSMC327の細胞抽出物におけるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ発現の電気泳動の分析図
【図6】経時的なD,L−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインの転換動向(%)を示す説明図。
横座標は時(hours )で表した時間であり、縦座標は%での転換であり、★は菌株E. coli SMC327を示し、黒い□は菌株E. coli SMC305を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いる5−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的転換によるD−α−アミノ酸の改良製造法であって、プラスミドpSM700で形質転換し20℃〜28℃の温度で培養した微生物を用いることを特徴とする方法に関する。
【0002】
酵素系という用語は、D−ヒダントイナーゼ(hydantoinase)およびD−N−カルバモイラーゼ(carbamoylase)酵素からなる系を表す。
【0003】
【従来の技術】
D−α−アミノ酸は、薬理学的に活性な物質(例えば、D−フェニルグリシンおよびD−パラ−ヒドロキシフェニルグリシンはペニシリンおよび半合成セファロスポリンの合成に用いられる)、農薬(殺虫剤であるフルバニレートの合成のためのD−バリン)、または甘味料(D−アラニン)の製造に用いられる極めて重要な化合物である。
【0004】
対応する5−置換ヒダントインの化学的および/または酵素加水分解によるD−α−アミノ酸の製造法は、当該技術分野で知られている。
【0005】
例えば、仏国特許FR第2,310,986号明細書には、5−置換ヒダントインをD,L−アミノ酸のラセミ混合物中で化学的に加水分解することにより、目的とする異性体を次に分離する方法が記載されている。
【0006】
仏国特許FR第2,317,357号明細書には、5−置換ヒダントインのラセミ混合物を酵素加水分解に付し、この転換の生成物(N−カルバモイル−D−α−アミノ酸)を化学的に酸化して、相当するD−α−アミノ酸とする方法が開示されている。
【0007】
これらの既知の方法は、D−α−アミノ酸の分割(resolution)および精製の工程が複雑なことによる不都合がある。従って、これらの方法は、工業的観点からは経済的に重要性はない。
【0008】
これらの不都合を解決するため、Pseudomonas 、Moraxella 、Agrobacterium 、Hansenula 、Arthrobacterなどの微生物によって産生される酵素系を用いて5−置換ヒダントインから加水分解によって直接D−α−アミノ酸を得る方法が当該技術分野で提案されてきた(欧州特許EP第199,943号明細書、欧州特許EP第309,310号明細書、米国特許US第4,312,948号明細書、仏国特許FR第2,456,728号明細書)。
【0009】
しかしながら、これらの酵素系の調製には、微生物の方ではこれらの酵素の産生を刺激することができる有効な誘発剤を使用する必要がある。実際に、D−ヒダントイナーゼおよびD−N−カルバモイラーゼといった酵素の発現レベルは本質的に極めて低いことが知られている(Syldatk ら、(1990年)、「生化学的エンジニアリング/生物工学の進歩(Advances in Biochem. Engineering/Biotechnology)(Fiechter, A.監修),41,29〜75頁,Springer-Verlag ,ベルリン)。
【0010】
しかしながら、誘発剤の使用は、生産コストの増加および酵素の生産収率の若干の変動といった一連の不都合を生じる。また、誘発後に微生物のほとんどで得ることができる発現レベルは、工業的工程におけるそれらの経済的使用には不適である(Syldatk ら、(1987), Biotechnol. Lett., 9: 25-30; Yokozeki ら、(1987), Agri. Biol. Chem., 51, 715-722)。
【0011】
D−ヒダントイナーゼおよびD−N−カルバモイラーゼ酵素をコードする遺伝子は、最近配列決定され、個々にクローニングされている(米国特許US第4,912,044号明細書および欧州特許EP第515,698号明細書)。
【0012】
更に具体的には、米国特許US第4,912,044号明細書には、発現が温度変化によって誘発されるヒダントイナーゼ遺伝子を含むハイブリッドベクターで形質転換した微生物の発酵によるD−ヒダントイナーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、5−置換ヒダントインに由来するD−N−α−カルバモイルの製造に用いられる。
【0013】
欧州特許出願EP第515,698号明細書には、発現がIPTGによって化学的に誘発されるカルバモイラーゼ遺伝子を含んでなるプラスミドで形質転換した微生物の発酵によるD−N−α−カルバモイラーゼの調製が記載されている。このようにして得られた酵素は、N−カルバモイル誘導体からD−α−アミノ酸の製造に用いられる。
【0014】
工業的関心はラセミ性ヒダントイン(racemic hydantoin)のD−α−アミノ酸への転換にあり、これら2種類の酵素が異なる菌株で発現されるという事実は、両者の使用、従って2種類の異なる発酵工程から出発する手順の展開を伴う。これにより、生産コストが増加し、転換速度(kinetics)が減少する。
【0015】
これらの欠点を解決するため、5−置換ヒダントインのD−α−アミノ酸への転換する方法であって、タンデムに配置されかつ単一プロモーターによって制御されるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドで形質転換した微生物を用いる方法が当該技術分野において提案されてきた。これら2種類の遺伝子は、単一細胞区画で(誘発剤なしで)本質的に発現される(イタリア国特許出願MI94A00726号明細書)。
【0016】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、酵素系の発現およびラセミ混合物の転換率の改良方法を提供することを目的とする。
【0017】
【課題を解決するための手段】
プラスミドpSM700による形質転換および20〜28℃の温度での発酵によって得られた本発明の微生物を用いることによって、上記方法を改良することができることを見いだした。
【0018】
この微生物の存在下にて操作すると、実際に酵素系の発現および5−置換ヒダントインのラセミ混合物の相当するD−α−アミノ酸への転換率を両方共改良することができる。
これによれば、本発明は、微生物によって産生される酵素系を用いて5−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的な転換によるD−α−アミノ酸の製造法であって、上記微生物が、
(a) 構成プロモーターの制御下およびヒダントイナーゼ遺伝子のSD上流を含んでなる領域が、配列AAGGAGGAAA AATAT
を有する場合でのカルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含んでなるプラスミドpSM700の構築、
(b) 微生物のプラスミドpSM700による形質転換、および
(c) 同化性炭素および窒素源、カチオン、アニオンおよび場合によってビタミンを含む水性培地中での好気性条件下、20〜28℃の温度での形質転換微生物の発酵、
によって得られることを特徴とする、方法に関する。
【0019】
【発明の実施の形態】
図4の制限地図を有するプラスミドpSM700は、プラスミドpSM651CBS 203.94から出発する一般に知られている手法を用いて、酵素系をコードするオペロンにおいてカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ遺伝子の配列を反転し、ヒダントイナーゼ遺伝子のSD上流を含む領域を、配列:
5′AAGGAGGAAA AATAT 3′
を有する領域で置換して得ることができる。
【0020】
特に、pSM700は、
a) プラスミドpSM651を制限酵素HindIIIおよびEcoRIで消化し、
b) a)で得られたプラスミドDNAをT4 DNAリガーゼの存在下にて連結して、ヒダントイナーゼ遺伝子のみを含んでなるプラスミドpSM638を得て、
c) SD、ヒダントイナーゼの最初の2個のアミノ酸をコードするコドン、およびヒダントイナーゼ遺伝子をSDの直ぐ下流に挿入させる2つの部位(EcoRVおよびPstI)を含む2個の相補的オリゴヌクレオチドを合成し、
d) 2個の相補的オリゴヌクレオチド(リンカー)のアニーリングを行ない、
e) d)で得たリンカーを酵素HindIIIおよびPstIで消化したカルバモイラーゼ遺伝子のみを含むプラスミドpSM637と連結して、リンカーがカルバモイラーゼ遺伝子の下流に正しく挿入されている中間体プラスミドを得て、
f) プラスミドpSM638から最初の2個のN−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当するEcoRV−PstIフラグメントを単離し、
g) f)で得たフラグメントをe)においてEcoRVおよびPstIで消化した中間体プラスミドと連結し、
h) プラスミドpSM700を単離する、
ことを含んでなる方法を用いて調製した。
【0021】
次に、プラスミドpSM700を用いて、従来の方法でコンピテントにしたEscherichia coliおよびBacillus subtilis から選択された微生物の宿主細胞を形質転換する。
【0022】
本発明の酵素系は、プラスミドpSM700で形質転換した菌株E. coli またはB. subtilis を、同化性炭素および窒素源並びに各種カチオン、アニオンおよび場合によって微量のビタミン、例えばビオチン、チアミンまたはアミノ酸を含む水性培地で好気性条件下で培養することによって得ることができる。
【0023】
同化性炭素源は、グルコース、加水分解澱粉、糖蜜、スクロース、または他の通常の炭素源を含む。
【0024】
窒素源の例は、無機アンモニウム塩、例えば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウムまたは炭酸アンモニウムおよび尿素、または有機もしくは無機窒素を含む材料、例えばペプトン、酵母エキスまたは肉エキスから選択することができる。
【0025】
下記のカチオンおよびアニオンも、同様に本発明の目的に好適である:カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェート、スルフェート、塩化物、マンガン、およびニトレート(nitrate)。
【0026】
発酵は、攪拌下にて、20°〜28℃、好ましくは23°〜26℃の温度で、6〜7.5、好ましくは6.5〜7.0のpHで行なわれる。
【0027】
上記の好ましい条件下で操作すると、カルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ酵素が、高収率およびほぼ完全に可溶性の形態で得られる。
【0028】
遠心分離または濾過のような通常の手法によって培地から回収される細胞(バイオマス)は、5−置換ヒダントインのラセミ混合物の転換相に用いられる。
【0029】
或いは、転換反応は、超音波処理またはフレンチ−プレス(French-Press)による細胞の崩壊から得られる細胞抽出物、または通常の方法で精製したまたは部分的に精製した酵素または不溶性支持体上に固定化した酵素を用いて行なうことができる。
【0030】
5位が置換された多数のヒダントインを本発明の方法に用いることができる。5位の可能な置換基は、炭素原子数が1〜6の線状または分岐アルキル基であって、ヒドロキシ、カルボキシ、ヒドロスルフィドまたはアミン基、またはフェニルまたはベンジル基であってオルト、メタおよびパラ位に1個以上の置換基を含むことができるものでモノまたはポリ置換することができる基から選択される。5−置換ヒダントインの例は、下記の通りである:(D,L)−5−フェニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−ヒドロキシフェニルヒダントイン、(D,L)−5−メチルヒダントイン、(D,L)−5−イソプロピルヒダントイン、(D,L)−5−チエニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−メトキシフェニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−クロロフェニルヒダントイン、(D,L)−5−ベンジルヒダントイン。
【0031】
ヒダントインの相当するD−α−アミノ酸への転換は、窒素雰囲気下にて密閉装置中で、20〜60℃、好ましくは30〜45℃の温度で行なわれる。
【0032】
反応媒質のpHは、6〜10、好ましくは7〜8.5の範囲内に保持される。このpHの調節は、例えばアンモニア、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウムもしくはカリウムの水溶液のような塩基水溶液を添加することによって行なうことができる。
【0033】
ヒダントインの初期濃度は、一般的には2重量%〜30重量%である。本発明の菌株から産生される酵素の立体特異性の結果として、ヒダントインのD−鏡像異性体だけが加水分解される。しかしながら、ヒダントインは、操作条件下では多少自発的にラセミ化するので、L−鏡像異性体は相当するD−α−アミノ酸へ完全に転換される。
【0034】
反応混合物に加えられるバイオマスの量は、酵素に対する基質の特定の親和性によって変化する。一般的に、バイオマス/ヒダントインが1/1〜1/50の重量比を用いることができる。
【0035】
本発明の方法によって製造されるD−α−アミノ酸は、イオン交換クロマトグラフィまたはアミノ酸の等電点における沈澱のような通常の方法によって反応媒質から回収することができる。
【0036】
プラスミドpSM700はBureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn(オランダ)にE. coli SMC327として寄託され、受託番号CBS 668.95を受けている。
【0037】
下記の実験例により、本発明の更に良好な例示を提供するが、本発明を限定する物では決してない。
【0038】
【実施例】
例1
プラスミドpSM638の構築
ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドpSM651CBS 203.94約1.7μgを、制限酵素HindIII(4単位)(Boehringer)で37℃で60分間消化した後、EcoRIで37℃で10分間消化した。酵素反応を65℃で10分間停止した後、DNAをエタノール2.5容で沈澱し、dNTPs(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)0.05mMおよびKlenowポリメラーゼ(Boehringer)1単位を含む緩衝溶液12μlに再懸濁し、両末端をブラントにした。反応は、室温で45分間行なった。
【0039】
次に、反応混合物を、1mM ATPおよび6% PEG6000を含むリガーゼ緩衝液で20μlの最終容積まで希釈し、プラスミドDNAをT4 DNAリガーゼ1単位の存在下にて室温で約4時間連結した。リガーゼの混合物を用いて、50mM CaCl2でコンピテントにしたE. coli 71/18 (BRL) の細胞を形質転換した(Dagert, M. およびEhrlich, (1979), Gene, 6:23)。
【0040】
形質転換体を、クロラムフェニコール20μl/mlおよび0.2%の5−メチルヒダントインを添加したLB培地(8g/リットルBactotryptone (DIFCO) 、5g/リットルの食塩、15g/lの寒天(DIFCO) 、0.5g/l酵母エキス)のプレート上で選択した。
【0041】
陽性クローンから抽出したプラスミドDNAを分析して、カルバモイラーゼ遺伝子の除去およびヒダントイナーゼ遺伝子のみの存在を確認した。これらのプラスミドの一つをpSM638と呼び(図2)、このプラスミドを含むクローンはSMC304と呼んだ。
【0042】
例2
プラスミドpSM700の構築
下記のオリゴヌクレオチドを、DNA Synthesizer One Plus (Beckmann) を用いて合成した。
【0043】
これらのオリゴヌクレオチドは、最初の2個のヒダントイナーゼアミノ酸をコードするコドンであるRBS(SD′)と、RBSの直ぐ後にヒダントイナーゼ遺伝子を挿入させる2個の部位(EcoRVおよびPstI)を含む。
【0044】
これらのオリゴヌクレオチドの約1.9μgを、100mM Tris−HCl pH8.0、10mM MgCl2、7mM DTT、1mM ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼ(Promega) 10単位を含む溶液30μl中で、37℃で30分間ホスホリル化した。キナーゼを70℃で10分間不活性化した後、溶液を室温(20〜25℃)まで徐々に30分間放冷し、2種類の相補的鎖のアニーリングを行なった。
【0045】
同時に、カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSM637(イタリア国特許出願MI94A00726号明細書)800ngを、制限酵素HindIIIおよびPstIの2単位で37℃で1時間消化した。アリクウオット(aliquot)を0.8%アガロースゲル上に充填して消化が起きたことをチェックした後、DNAをリンカーと連結した。
【0046】
実際には、上記の方法で消化したプラスミドpSM637の40nmとホスホリル化した二本鎖リンカー120ngとを、T4 DNAリガーゼ1単位の存在下にてリガーゼ混合物中で14℃で16時間連結した。
【0047】
このようにして得たリガーゼ混合物のアリクウオット(2μl)を用いて、CaCl2でコンピテントにしたE. coli TG1 の細胞を形質転換した。
【0048】
次に、形質転換体を、クロラムフェニコール20μl/mlを添加したLB培地(8g/リットルのBactotryptone (DIFCO) 、5g/リットルのNaCl、15g/リットルのAgar (DIFCO)、0.5g/リットルの酵母エキス)のプレート上で選択した。
【0049】
陽性クローンから抽出したプラスミドDNAをEcoRVおよびPstIで消化して分析し、カルバモイラーゼ遺伝子の下流にリンカーが正確に挿入されていることを確認した。
これらのプラスミドの一つをpIntと呼んだ。
【0050】
プラスミドpSM638(2μg)を酵素EcoRVおよびPstI(4単位)で消化し、最初の2個のN−末端アミノ酸をコードするコドンのないヒダントイナーゼ遺伝子に相当する約1380bpのEcoRV−RstIフラグメントを0.8%アガロースゲル上で電気泳動した後、Gelase(商標名)で抽出することによって精製した。
【0051】
このフラグメント(30ng)と、酵素EcoRVおよびPstIで予め消化した中間体プラスミドpInt(約50ng)とを、リガーゼ混合物10μl中でT4 DNAリガーゼ1単位の存在下にて16℃で16時間連結した。
【0052】
リガーゼ混合物を用いて、E. coli 71/18 のコンピテント細胞を形質転換した。次に、形質転換体を、クロラムフェニコール20μl/mlを添加したLB培地(8g/リットルのBactotryptone (DIFCO) 、5g/リットルのNaCl、15g/リットルのAgar (DIFCO)、0.5g/リットルの酵母エキス)のプレート上で選択した。陽性クローンから抽出したプラスミドNDAをEcoRVおよびPstIで消化して分析して、リンカーの下流にヒダントイナーゼ遺伝子が正確に挿入されていることを確認した。
【0053】
これらのプラスミドの一つは、カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンであって、2個の遺伝子の直ぐ上流の領域が下記のようであるオペロンを含んでいた。
AAA GGA GGA ATT CTT ATC...カルバモイラーゼ
AAG GAG GAA AAA TAT ATG...ヒダントイナーゼ
【0054】
このプラスミドをpSM700と呼び、これを含むクローンをSMC327と呼んだ。
【0055】
例3
カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンの発現
A) それぞれプラスミドpSM651およびpSM700を含むE. coli 菌株SMC305およびSMC327の単一コロニーからの前培養物を、クロラムフェニコール20μl/mlを添加したLB培地10mlがそれぞれ入っている2個の50mlフラスコに接種した。これらのフラスコを、攪拌下(220rpm)にて、37℃および25℃で、600nm(光路1cm)で測定した光学濃度が4.0となるまでインキュベーションを行なった。
【0056】
培養ブロス(broth)のアクリウオット(5ml)を16,000rpm(4℃、1分間)遠心分離し、回収した細胞を20%グリセロールを含む20mM NaPO4緩衝液pH8.0の300μlに再懸濁し、超音波処理によって溶解させた(Soniprep 150, MSE 1 分間のパルス、中電圧)。2種類の溶解物のアリクウオット(5μl)を、ポリアクリルアミドゲルに充填した。
【0057】
Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227, 680, 1970) で染色した後、形質転換していないE. coli 71/18 菌株の抽出物には見られない分子量が50,000および34,000ダルトンの2個のタンパク質バンドが現れた。また、Coomassie で染色した同じゲルで行なったデンシトメトリー分析では、これらのタンパク質は37℃で培養したE. coli SMC305よりも25℃で培養したE. coli SMC327での方が多量に発現したことを示していた(図5)。
【0058】
B) 酵素活性の測定
ヒダントイナーゼ活性の測定は、40℃で、20mM D,L−p−ヒドロキシフェニルヒダントインを含む0.2M Na−PO4緩衝液pH8.0の3ml中で行なった。様々な反応時間でのカルバモイルの含量を、反応混合物0.6mlを採取して測定し、これを直ちに15%トリクロロ酢酸/水 0.2mlで処理した。沈澱したタンパク質を遠心分離によって除き、Ehrlich 試薬(10%4−ジメチルアミノベンズアルデヒド)0.25mlを上清0.5mlに加えて、形成されたカルバモイルを438nmで比色法によって測定した。同時に、アミノ酸の含量を、Weatherburn, M.W. (Anal. Chem., vol. 39, 971, 1967) の方法に従ってBerthelot 試薬を用いて反応混合物のアリクウオット(50μl)について625nmで比色法によって測定した。ヒダントイナーゼ活性は、生成したカルバモイルとアミノ酸の量の和から得られる。40℃で上記試験条件下で1分間にヒダントイン1マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。
【0059】
カルバモイラーゼ活性の測定は、0.12M D−カルバモイル−p−ヒドロキシフェニルグリシンを含む0.2M Na−PO4緩衝液pH7.0の0.5ml中で40℃で行なった。アミノ酸の含量は、様々な反応時間に反応混合物50μlを採取して上記のように操作することによって測定した。上記の試験条件下で40℃で1分間にカルバモイル1マイクロモルを加水分解する酵素の量を、酵素単位として定義する。結果を、下記の表1に示す。
【0060】
これらの結果は、25℃で成育した菌株E. coli 327が37℃で成育した菌株より大きな含量のカルバモイラーゼおよびヒダントイナーゼ活性を有することを示している。また、菌株E. coli 327 のカルバモイラーゼ活性の含量は、37℃および25℃で成育した菌株E. coli 305 より大きい。
【0061】
例4
(D,L)−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインのD−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンへの転換
バイオマスの生産性を、40℃で、酸化を防止するため窒素雰囲気下にて、マグネティック・アンカーで攪拌してゴム栓で閉じた15ml反応器を用いて、検討した。
【0062】
それぞれの反応器には、湿ったバイオマス80mgと、0.2M NaPO4、pH8.0の緩衝液中に8%(D,L)−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインを懸濁したもの10mlとを入れた。
【0063】
2.5、15および22時間後に、反応混合物のアリクウオットを採取して、アセトニトリルを5%およびリン酸0.01%を含む水溶液で希釈し、16,000rpmで10分間遠心分離して、含まれている濁りを除去した。
【0064】
このようにして調製した試料をHPLCで分析して、パラ−ヒドロキシ−フェニル−グリシンおよびN−カルバモイル−パラ−ヒドロキシ−フェニルグリシンの濃度を測定した。
【0065】
このため、4.6×250mm Ultrasphere ODS Beckmanカラムを用いて、イソクラティク条件(isocratic conditions)下で1ml/分の流速で操作し、272nmで溶出液を監視した。試料の希釈に用いたのと同じ水溶液を移動相として用いた。
【0066】
表2に、カルバモイルおよびアミノ酸の形成速度を示す。
【0067】
これらの結果から、同じバイオマスおよび反応時間では、アミノ酸の蓄積は菌株E. coli SMC327を用いたときの方が大きいことが分かる。
【0068】
図6は、反応混合物の様々な時間で含まれるアミノ酸およびカルバモイルを添加することによって得られた出発ヒダントインに関する転換データーを示す。
【0069】
【配列表】
(1) 配列番号:1についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:15塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(xi) 配列:
AAGGAGGAAA AATAT 15
【0070】
(1) 配列番号:2についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:34塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:Genomic DNA
(xi) 配列:
AGCTTAAGGA GGAAAAATAT ATGGATATCC TGCA 34
【0071】
(1) 配列番号:3についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:26塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(xi) 配列:
ATTCCTCCTT TTTATATACC TATAGG 26
【0072】
(1) 配列番号:4についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:18塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(xi) 配列:
AAAGGAGGAA TTCTTATG 18
【0073】
(1) 配列番号:5についての情報
配列の特性:
(A) 長さ:18塩基対
(B) 型:核酸
(C) 鎖の数:一本鎖
(D) トポロジー:直鎖状
(ii) 配列の種類:Genomic DNA
(xi) 配列:
AAGGAGGAAA AATATATG 18
【図面の簡単な説明】
【図1】ヒダントイナーゼ−カルバモイラーゼオペロンを含むプラスミドpSM651の制限地図を示す説明図。Pはプロモーターであり、SDは遺伝子の上流のシャイン・ダルガーノ(Shine-Dalgarno)配列。
【図2】ヒダントイナーゼ遺伝子を含むプラスミドpSM638の制限地図を示す説明図。
【図3】カルバモイラーゼ遺伝子を含むプラスミドpSM637の制限地図を示す説明図。
【図4】カルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含むプラスミドpSM700の制限地図を示す説明図。Pはプロモーターであり、SD′はヒダントイナーゼ遺伝子の上流の修飾Shine-Dalgarno配列。
【図5】37℃(A) および25℃(B) で成育した後のSMC305およびSMC327の細胞抽出物におけるヒダントイナーゼおよびカルバモイラーゼ発現の電気泳動の分析図
【図6】経時的なD,L−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントインの転換動向(%)を示す説明図。
横座標は時(hours )で表した時間であり、縦座標は%での転換であり、★は菌株E. coli SMC327を示し、黒い□は菌株E. coli SMC305を示す。
Claims (17)
- 微生物によって産生される酵素系を用いる5−置換ヒダントインのラセミ混合物の立体選択的転換によるD−α−アミノ酸の改良製造法であって、前記微生物が、
(a) 構成プロモーターの制御下およびヒダントイナーゼ遺伝子のRBS上流を含んでなる領域が、配列
AAGGAGGAAA AATAT
を有する場合でのカルバモイラーゼ−ヒダントイナーゼオペロンを含んでなるプラスミドpSM700 CBS 668.95の構築、
(b) 微生物のプラスミドpSM700による形質転換、および
(c) 同化性炭素および窒素源、カチオン、アニオンおよび場合によってビタミンを含む水性培地中での好気性条件下、20〜28℃の温度での形質転換微生物の発酵、
によって得られることを特徴とする、方法。 - 微生物がEscherichia coliおよびBacillus subtilis から選択される、請求項1に記載の方法。
- 微生物を23〜26℃の温度で培養する、請求項1に記載の方法。
- 同化性炭素源が炭水化物を含んでなる、請求項1に記載の方法。
- 窒素源を無機アンモニウム塩および尿素または有機もしくは無機窒素を含む材料から選択することができる、請求項1に記載の方法。
- カチオンおよびアニオンが、カリウム、ナトリウム、マグネシウム、鉄、カルシウム、酸ホスフェート、スルフェート、塩化物、マンガン、およびニトレートから選択される、請求項1に記載の方法。
- 5−置換ヒダントインが(D,L)−5−フェニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−ヒドロキシ−フェニルヒダントイン、(D,L)−5−メチルヒダントイン、(D,L)−5−イソプロピルヒダントイン、(D,L)−5−チエニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−メトキシフェニルヒダントイン、(D,L)−5−パラ−クロロフェニルヒダントイン、(D,L)−5−ベンジルヒダントインから選択される、請求項1に記載の方法。
- ヒダントインが(D,L)−5−パラ−ヒドロキシフェニルヒダントインである、請求項7に記載の方法。
- ヒダントインが(D,L)−5−フェニルヒダントインである、請求項7に記載の方法。
- 転換反応を20℃〜60℃の温度で行なう、請求項1に記載の方法。
- 温度が30°〜45℃である、請求項10に記載の方法。
- 転換反応を6.0〜10のpHで行なう、請求項1に記載の方法。
- pHが7.0〜8.5である、請求項12に記載の方法。
- 転換反応を1/1〜1/50の湿ったバイオマス/ヒダントインの重量比を用いて行なう、請求項1に記載の方法。
- Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn(オランダ)に寄託し、CBS 668.95の受託番号を受けているプラスミドpSM700。
- 受託番号CBS668.95のプラスミドpSM700で形質転換したBacillus subtilis およびEscherichia coliから選択される微生物。
- Escherichia coli SMC327 CBS 668.95である、請求項16に記載の微生物。
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