ITMI952432A1 - Procedimento migliorato per la preparazione di d-alfa-amminoacidi - Google Patents

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ITMI952432A1
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hydantoinase
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Renata Grifantini
Giuliano Galli
Giovanna Carpani
Luigi Grandi
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Eniricerche Spa
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Abstract

In un procedimento migliorato per la preparazione di D-?-amminoacidi mediante conversione stereoselettiva di miscele raceme di idantoine 5-sostituite con un sistema anzimatico prodotto da un microorganismo, il miglioramento consiste nel fatto che si utilizza un microorganismo trasformato con il plasmide pSM700 coltivato ad una temperatura compresa tra 20°C e 28°C.L'impiego di detto microorganismo consente di migliorare l'espressione del sistema enzimatico o di aumentare la velocità di conversione dell'idantoina racema a D-?-amminoacido.

Description

DESCRIZIONE
La presente invenzione riguarda un procedimento migliorato per la preparazione di D-a-amminoacidi mediante conversione stereoselettiva di miscele Tacerne di idantoine 5-sostituite con un sistema enzimatico prodotto da un microorganismo dove il miglioramento consiste nel fatto che si utilizza un microorganismo trasformato con il plasmide pSM700 coltivato ad una temperatura compresa tra 20°C e 28 °C.
Con il termine sistema enzimatico si fa riferimento ad un sistema costituito dagli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi.
I D-a-amminoacidi sono composti di notevole valore utili per la preparazione di sostanze farmacologicamente attive (ad esempio, la D-fenilglicina e la D-para-idrossifenilglicina sono utilizzate nella sintesi di penicilline e cefalosporine semisintetiche), pesticidi (la D-valina per la sintesi dell'insetticida fluvanilato) o dolcificanti (D-alanina) .
Sono noti nella tecnica procedimenti per la preparazione di D-a-amminoacidi mediante idrolisi chimica e/o enzimatica delle corrispondenti idantoine 5-sostituite.
Così ad esempio nel brevetto FR 2.310.986 si descrive un procedimento in cui idantoine 5-sostituite vengono idrolizzate chimicamente in miscele raceme di D,L amminoacidi dalle quali, successivamente, si separa l'isomero di interesse.
Il brevetto FR 2.317.357 descrive un procedimento in cui miscele raceme di idantoine 5-sostituite vengono sottoposte ad idrolisi enzimatica e, successivamente, i prodotti di tale trasformazione (N-carbamil-D-a-amminoacidi) sono ossidati per via chimica nei corrispondenti D-a-amminoacidi .
Questi procedimenti noti soffrono degli svantaggi derivanti dalle complesse procedure per la risoluzione e purificazione dei D-a-amminoacidi. Ne consegue che tali procedimenti sono economicamente poco interessanti da un punto di vista industriale.
Per superare questi inconvenienti sono stati proposti nella tecnica procedimenti in cui D-a-amminoacidi vengono ottenuti direttamente dalle idantoine 5-sostituite mediante idrolisi con sistemi enzimatici prodotti da microorganismi come Pseudomonas, Moraxella, Agrobacterium, Hansenula, Arthrobacter (EP-199,943, EP-309,310, US 4312948, FR La preparazione di detti sistemi enzimatici richiede, tuttavia, l'utilizzazione di induttori efficienti in grado di stimolare la produzione di tali enzimi da parte dei microorganismi. E' noto, infatti, che il livello di espressione degli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi è costitutivamente molto basso (Syldatk et al. (1990), "Advances in Biochem. Engineering/Biotechnology (Fiechter, A. Ed.), 41, pp.29-75, Springer-Verlag, Berlino).
L'impiego di induttori comporta, tuttavia, una serie di inconvenienti tra cui l'incremento dei costi di produzione ed una certa variabilità nelle rese di produzione degli enzimi. In aggiunta, il livello di espressione ottenibile nella maggior parte dei microorganismi in seguito ad induzione risulta inadeguato per un loro impiego economico in processi industriali (Syldatk et al. (1987), Biotechnol. lett., 9: 25-30; Yokozeki et al. (1987) Agric. Biol. Chem., 51, 715-722).
Di recente sono stati sequenziati e clonati singolarmente i geni che codificano gli enzimi D-idantoinasi e D-N-carbamilasi (US 4,912,044 ed EP-515.698 ).
Più in particolare, il brevetto US 4,912,044 descrive la preparazione di D-idantoinasi mediante fermentazione di un microorganismo trasformato con un vettore ibrido contenente il gene idantoinasi la cui espressione è indotta attraverso variazione della temperatura. L'enzima così ottenuto viene impiegato per la produzione di D-Ν-α—carbamil derivati da idantoine 5-sostituite.
La domanda di brevetto EP-515.698 descrive la preparazione di D-N-a-carbamilasi mediante fermentazione di un microorganismo trasformato con un plasmide comprendente il gene carbamilasi la cui espressione è indotta chimicamente con IPTG. L'enzima cosi ottenuto viene impiegato per la produzione di D-α-amminoacidi da N-carbamil derivati.
Poiché l'interesse industriale è nella conversione delle idantoine raceme a D-α-amminoacidi, il fatto che i due enzimi siano espressi in ceppi diversi comporta l'impiego di entrambi e quindi lo sviluppo di una procedura a partire da due distinti processi fermentativi. Questo aumenta necessariamente i costi di produzione e riduce le cinetiche di conversione.
Per superare tali inconvenienti, è stato proposto nella tecnica un procedimento di conversione di idantoine 5-sostituite in D-α-amminoacidi che utilizza un microorganismo trasformato con un plasmide contenente i geni dell' idantoinasi e della carbamilasi disposti in tandem e regolati da un unico promotore. I due geni sono espressi in modo costitutivo (assenza di induttori) in un unico compartimento cellulare (domanda di brevetto Italia No MI94A00726) .
E' stato ora trovato che è possibile migliorare il procedimento sopra discusso utilizzando un microorganismo della presente invenzione, ottenuto mediante trasformazione con il plasmide pSM700 e fermentazione ad una temperatura compresa tra 20 e 28°C.
Operando in presenza di detto microorganismo è possibile, infatti, migliorare sia l’espressione del sistema enzimatico che la velocità di conversione di miscele raceme di idantoine 5-sostituite nei corrispondenti D-α-amminoacidi.
In accordo con ciò la presente invenzione riguarda un procedimento per la produzione di D-αamminoacidi mediante conversione stereoselettiva di miscele raceme di idantoine 5-sostituite con un sistema enzimatico prodotto da un microorganismo, caratterizzato dal fatto che detto microorganismo è ottenuto mediante:
(a) costruzione del plasmide pSM700 comprendente l'operone carbamilasi-idantoinasl posto sotto il controllo di un promotore costitutivo e dove la regione comprendente la SD a monte del gene indantoinasi ha la sequenza AAGGAGGAAA AATAT;
(b) trasformazione di un microorganismo con il plasmide pSM700;
(c) fermentazione del microorganismo trasformato in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio ed azoto, cationi, anioni ed, eventualmente vitamine, in condizioni aerobiche, ad una temperatura compresa tra 20 e 28°C
Allo scopo di illustrare meglio la presente invenzione si riporta qui di seguito una breve descrizione delle figure.
Figura 1; Mappa di restrizione del plasmide pSM651 contenente l'operone idantoinasi-carbamilasi, dove P è il promotore e SD è la Shine-Dalgarno a monte dei geni.
Figura 2: Mappa di restrizione del plasmide pSM638 contenente il gene idantoinasi
Figura 3: Mappa di restrizione del plasmide pSM637 contenente il gene carbamilasi.
Figura 4: Mappa di restrizione del plasmide pSM700 contenente l'operone carbamilasi-idantoinasi, dove P è il promotore e SD’ è la Shine-Dalgarno modificata a monte del gene idantoinasi.
Figura 5: Analisi elettroforetica dell'espressione di idantoinasi e carbamilasi negli estratti cellulari di SMC305 e SMC327 dopo crescita a 37’C (A) e a 25 "C (B) e dove:
(A) linea 1: frazione cellulare solubile SMC305; linea 2: frazione cellulare insolubile SMC305; linea 3: frazione cellulare solubile SMC327; linea 4: frazione cellulare insolubile SMC327; (B) linea 1: frazione cellulare solubile SMC305; linea 2: frazione cellulare insolubile SMC305; linea 3: frazione cellulare solubile SMC327; linea 4: frazione cellulare insolubile SMC327; Figura 6: mostra l'andamento della conversione (%) della D,L-para-idrossi-fenilidantoina nel tempo. In ascissa si riporta il tempo in ore ed in ordinata la conversione in %. Con * si indica il ceppo E .coli SMC327 e con il ceppo E.coli SMC305.
Il plasmide pSM700, avente la mappa di restrizione in figura 4, può essere ottenuto utilizzando tecniche generali note a partire dal plasmide pSM651 CBS 203.94 invertendo nell’operone che codifica il sistema enzimatico la disposizione dei geni carbamilasi e idantoinasi e sostituendo la regione contenente la SD a monte del gene idantolnasl con una regione avente la sequenza:
5' AAGGAGGAAA AATAT 3'
In particolare, pSM700 è stato preparato mediante un metodo che comprende:
a) il digerire il plasmide pSM651 con gli enzimi di restrizione HindlII ed EcoRI;
b) il ligare il DNA plasmidico ottenuto in a) in presenza di T4 DNA ligasi così da ottenere un plasmide pSM638 comprendente il solo gene idantoinasi; c) il sintetizzare due oligonucleotidi complementari che contengono la SD, le triplette che codificano per i primi due amminoacidi dell’idantoinasi e due siti (EcoRV e PstI) che consentono l'inserimento del gene idantoinasi immediatamente a valle di SD;
d) il favorire l'appaiamento dei due oligonucleotidi complementari (linker);
e) il ligare il linker ottenuto in d) con il plasmide pSM637 contenente il solo gene carbamilasi digerito con gli enzimi HindlII e PstI così da ottenere un plasmide intermedio in cui il linker è inserito correttamente a valle del gene carbamilasi;
f) l'isolare dal plasmide pSM638 un frammento EcoRV-PstI corrispondente al gene idantoinasi privo delle triplette che codificano per i primi due amminoacidi N-terminali;
g) il ligare il frammento ottenuto in f) con il plasmide intermedio come in e) digerito con EcoRV e PstI ;
h) l'isolare il plasmide pSM700.
Il plasmide pSM700 viene quindi impiegato per trasformare cellule ospiti di un microorganismo scelto tra Escherichia coli e Bacillus .quhtilis rese competenti utilizzando tecniche convenzionali.
Il sistema enzimatico secondo la presente invenzione può essere ottenuto coltivando i ceppi E .coli o B.subtilis trasformati con il plasmide pSM700, in condizioni aerobiche, in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio e di azoto nonché diversi cationi, anioni ed, eventualmente, tracce di vitamine, quali biotina o tiamina, o di amminoacidi.
Sorgenti di carbonio assimilabili includono carboidrati come glucosio, amidi idrolizzati, melassa, saccarosio od altre sorgenti di carbonio convenzionali .
Esempi di sorgenti di azoto possono essere scelti, ad esempio, tra sali d’ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne.
I seguenti cationi ed anioni sono ugualmente adatti per gli scopi della presente invenzione: potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese, e nitrati.
La fermentazione è condotta, sotto agitazione, ad una temperatura compresa tra 20°e 28°C, preferibilmente tra 23° e 26°C e ad un pH compreso tra 6 e 7,5, preferibilmente tra 6,5 e 7,0.
Operando nelle condizioni preferite sopra riportate gli enzimi carbamilasi ed idantoinasi vengono ottenuti in rese elevate ed in forma quasi completamente solubile.
Le cellule (biomassa) recuperate dal mezzo di coltura mediante tecniche convenzionali come centrifugazione o filtrazione vengono impiegate nella fase di conversione di miscele raceme di idantoine 5-sostituite .
Alternativamente, la reazione di conversione può essere condotta sia utilizzando l’estratto cellulare ottenuto dalla disintegrazione delle cellule mediante sonicazione o French-Press, sia gli enzimi purificati o parzialmente purificati utilizzando tecniche convenzionali, sia gli enzimi immobilizzati su supporti insolubili.
Numerose idantoine sostituite in posizione 5 possono essere utilizzate nel procedimento della presente invenzione. Possibili sostituenti in posizione 5 sono scelti tra un gruppo alchilico lineare o ramificato con un numero di atomi di carbonio compreso tra 1 e 6, che possono essere mono o polisostituiti con gruppi idrossilici, carbossilici, sulfidrilici o amminici oppure un gruppo fenilico o benzilico che, a loro volta, possono contenere uno o più sostituenti in posizione orto, meta e para. Esempi di idantoine 5-sostituite sono:
(D,L)-5-fenilidantoina, (D,L)-5-para-idrossifenilidantoina, (D,L)-5-metilidantoina, (D,L)-5-isopropilidantolna, D,L-5-tienilidantoina, (D,L)-5-parametossifenilidantoina, (D,L)-5-para-clorofenilidantoina, (D,L)-5-benzilidantoina.
La conversione delle idantoine nei corripondenti D-α-amminoacidi è condotta in atmosfera di azoto in una apparecchiatura ermeticamente chiusa, ad una temperatura compresa tra 20°C e 60°C, preferibilmente tra 30 e 45°.
Il pH del mezzo di reazione è mantenuto entro valori compresi tra 6 e 10 e di preferenza tra 7 e 8,5. Questa regolazione del pH potrà essere effettuata, ad esempio, mediante aggiunta di una soluzione acquosa basica quale una soluzione acquosa di ammoniaca, di idrossido di potassio, di idrossido di sodio, carbonato di sodio oppure di potassio.
La concentrazione iniziale delle idantoine è generalmente compresa tra il 2% e il 30% in peso. Come conseguenza della stereospecificità degli enzimi prodotti dai ceppi secondo la presente invenzione, solo i D-enantiomeri delle idantoine vengono idrolizzati. Comunque, poiché le idantoine racemizzano spontaneamente più o meno velocemente nelle condizioni operative, gli L-enantiomeri vengono convertiti completamente nei corrispondenti D-a-amminoacidi .
La quantità di biomassa che viene addizionata alla miscela di reazione dipenderà dalla particolare affinità del substrato verso gli enzimi. In generale, può essere utilizzato un rapporto in peso biomassa/idantoine compreso tra 1/1 e 1/50.
I D-a-amminoacidi preparati mediante il processo della presente invenzione possono essere recuperati dall'ambiente di reazione mediante metodiche classiche come cromatografia a scambio ionico o precipitazione dell'amminoacido al suo punto isoelettrico.
Il plasmide pSM700 è stato depositato presso Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Olanda) come E.coli SMC327 dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 668.95.
Gli esempi sperimentali che seguono hanno lo scopo di illustrare meglio la presente invenzione senza volerla limitare.
Esempio 1
Costruzione del plasmide PSM638
Circa 1,7 μ$ del plasmide pSM651 CBS 203.94, contenente l'operone idantoinasi-carbamilasi, sono stati digeriti con l'enzima di restrizione HindlII (4 unità) (Boehringer) a 37’C per 60 minuti e successivamente con EcoRI a 37°C per 10 minuti. Dopo aver bloccato la reazione enzimatica a 65°C per 10 minuti, il DNA è stato precipitato con 2,5 volumi di etanolo e risospeso in 12 μl di tampone contenente 0,05 mM dei dNTPs (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) e 1 U di Klenow polimerasi (Boehringer) per rendere piatte (blunt) le estremità. La reazione è stata effettuata a temperatura ambiente per 45 minuti.
Successivamente la miscela di reazione è stata diluita ad un volume finale di 20 μl con tampone di ligasi contenente 1 mM ATP e 6% PEG 6000 ed il DNA plasmidico è stato ligato in presenza di 1 Unità di T4 DNA ligasi a temperatura ambiente per circa 4 ore. La miscela di ligasi è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli 71/18 (BRL) rese competenti con 50 mM CaC12 (Dagert, M. e Ehrlich (1979), Gene, 6:23).
I trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar (DIFCO), 0,5 g/1 estratto di lievito) addizionato con 20 μq/ml di cloramfenicolo e 0,2% 5-metil idantoina.
Il DNA plasmidico estratto dai cloni positivi è stato analizzato per verificare l'eliminazione del gene carbamilasi e la presenza del solo gene idantoinasi. Uno di detti plasmidi è stato denominato pSM638 (figura 2), mentre il clone contenente tale plasmide SMC304.
Esempio 2
Costruzione del plasmide PSM700
Sono stati sintetizzati, mediante DNA Synthesizer One Plus ( Beckmann ), i seguenti oligonucleotidi:
Tali oligonucleotidi contengono un RBS (SD'), le triplette che codificano per i primi due amminoacidi dell'idantoinasi e due siti (EcoRV e PstI) che consentono l'inserimento del gene idantoinasi immediatamente a valle dell'RBS.
Circa 1,9 4g di detti oligonucleotidi sono stati fosforilati in 30 μl di soluzione contenente 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgC12, 7 mM DTT, 1 mM ATP e 10 U di polinucleotide kinasi (Promega) a 37°C per 30 minuti. Dopo inattivazione della Kinasi a 70 °C per 10 minuti, la soluzione è stata lasciata raffreddare lentamente fino a temperatura ambiente (20-25 °C) per 30 minuti, per favorire l'appaiamento (annealing) tra le due eliche complementari.
Parallelamente 800 ng del plasmide pSM637 (domanda di brevetto Italia N. MI94A00726), contenente il gene carbamilasi, sono stati digeriti con 2 U degli enzimi di restrizione HindlII e PstI a 37’C per 1 ora. Dopo aver controllato l'avvenuta digestione caricandone una aliquota su gel di agarosio 0,8%, il DNA è stato ligato con il linker.
In pratica, 40 ng del plasmide pSM637 digerito come sopra riportato e 120 ng del linker a doppia elica fosforilato sono stati ligati in miscela di ligasi in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi a 14°C per 16 ore.
Una aliquota (2 μΐ) della miscela di ligasi cosi ottenuta è stata utilizzata per trasformare cellule di E.coli TG1 rese competenti con CaCl2.
Successivamente i trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar (DIFCO), 0,5 g/1 estratto di lievito) addizionato con 20 pg/ml di cloramfenicolo.
Il DNA plasmidico estratto dai cloni positivi è stato analizzato mediante digestione con EcoRV e PstI per verificare l'esatto inserimento del linker a valle del gene carbamilasi.
Uno di detti plasmidi è stato denominato plnt.
Il plasmide pSM638 (2 μg) è stato digerito con gli enzimi EcoRV e PstI (4 U) ed il frammento EcoR-V-Pstl di circa 1380 bp, corrispondente al gene idantoinasi privo delle triplette che codificano per i primi due amminoacidi N-terminali, è stato purificato mediante elettroforesi su gel di agarosio 0,8% e successiva estrazione con GELase<tm>.
Tale frammento (30 ng) ed il plasmide intermedio plnt (circa 50 ng), previamente digerito con gli enzimi EcoRV e PstI, sono stati ligati in 10 μΐ di miscela di ligasi in presenza di 1 U di T4 DNA ligasi, a 16°C per 16 ore.
La miscela di ligasi è stata impiegata per trasformare cellule competenti di E .coli 71/18. Successivamente i trasformanti sono stati selezionati su piastre di terreno LB (8 g/1 Bacto tryptone (DIFCO), 5 g/1 NaCl, 15 g/1 Agar (DIFCO), 0,5 g/1 estratto di lievito) addizionato con 20 pg/ml di cloramfenicolo. Il DNA plasmidico estratto dai cloni positivi è stato analizzato mediante digestione con EcoRI e PstI per verificare l'esatto inserimento del gene idantoinasi a valle del linker.
Uno di detti plasmidi conteneva l'operone carbamilasi-idantoinasi dove la regione immediatamente a monte dei due geni è la seguente:
AAA GGA GGA ATT CTT ATG ... Carbamilasi
AAG GAG GAA AAA TAT ATG ... Idantoinasi
Detto plasmide è stato denominato pSM700 ed il clone che lo contiene SMC327.
Esempio 3
Espressione dell'perone Carbamilasi-idantoinasi A) Precolture da singole colonie dei ceppi E.coli SMC305 e SMC327, contenenti rispettivamente i plasmidi pSM651 e pSM700, sono state inoculate in due beute da 50 mi contenenti ciascuna 10 mi di terreno LB addizionato con 20 pg/ml di cloramfenicolo. Le beute sono state incubate, sotto agitazione (220 rpm) , a 37° e a 25 °C sino ad una densità ottica di 4,0 determinata a 600 nm (cammino ottico 1 cm) Aliquote (5 mi) delle brodocolture sono state centrifugate a 16.000 rpm (4°C, per 1 minuto) e le cellule recuperate sono state risospese in 300 μl di tampone 20 mM NaP04 pH 8,0 contenente 20% glicerolo e lisate per sonicazione (Soniprepl50, MSE impulsi di 1 minuto, a voltaggio medio). Aliquote (5 μΐ) dei due lisati sono state caricate su gel di poliacrilammide .
Dopo colorazione con Coomassie R-250 (Laemmli, Nature: 227, 680, 1970) si evidenziavano due bande proteiche con un peso molecolare di 50.000 e 34.000 Dalton assenti nell'estratto del ceppo E.coli 71/18 non trasformato. Inoltre, l'analisi densitometrica effettuata sullo stesso gel colorato con Coomassie indicava che queste proteine erano espresse in E.coli SMC327 coltivato a 25°C in quantità superiori rispetto a E.coli SMC305 coltivato a 37°C (Figura 5).
B) Determinazione delle attività enzimatiche
La determinazione dell'attività idantoinasica è stata effettuata a 40°C in 3 mi di tampone Na-P04 0,2 M pH 8,0 contenente D,L-p-idrossifenil idantoina 20 mM. Il contenuto in carbamile ai vari tempi di reazione è stato determinato prelevando 0,6 mi di miscela di reazione che venivano immediatamente trattati con 0,2 mi di acido tricloroacetico al 15% in acqua. Le proteine precipitate sono state rimosse per centrifugazione e 0,5 mi di surnatante sono stati addizionati con 0,25 ml del reattivo di Ehrlich (10% 4-dimetilamminobenzaldeide in HC1 concentrato) per la determinazione colorimetrica a 438 nm del carbamile formatosi. Parallelamente, su una aliquota (50 μΐ) della miscela di reazione è stato determinato colorimetricamente a 625 nm il contenuto dell ’amminoacido utilizzando il reattivo di Berthelot secondo la procedura di Weatherburn, M.W. (Anal. Chem., vol. 39, 971, 1967). L'attività idantoinasica risulta dalla somma dalla quantità di carbamile e di amminoacido prodotto. Con unità enzimatica si definisce la quantità di enzima che idrolizza una micromole di idantoina in un minuto a 40°C nelle condizioni di saggio sopra descritte.
La determinazione dell'attività carbamilasica è stata effettuata a 40°C in 0,5 mi di tampone Na-PO4 0,2 M pH 7,0 contenente D-carbamil-p-idrossifenil glieina 0,12 M. Il contenuto in amminoacido è stato determinato ai vari tempi di reazione prelevando 50 μl della miscela di reazione e operando come sopra descritto. Con unità enzimatica si definisce la quantità di enzima che idrolizza una micromole di carbamile in un minuto a 40°C nelle condizioni di saggio sopra descritte. I risultati sono riportati nella tabella 1 che segue.
Tabella 1
Tali risultati evidenziano che il ceppo E. coli327 cresciuto a 25°C ha un maggior contenuto in attività carbamilasica ed idantoinasica rispetto allo stesso ceppo cresciuto a 37°C. Inoltre, il ceppo E.coli327 ha un maggior contenuto in attività carbamilasica rispetto al ceppo E.coli305 cresciuto sia a 37°C che a 25°C.
Esempio 4
Conversione della (D,L)-para-idrossi-fenilidantoina a D-para-idrossi-fenilqlicina.
La produttività delle biomasse è stata esaminata a 40 °C sotto atmosfera di azoto, così da prevenire l'ossidazione, utilizzando reattori da 15 mi agitati mediante ancoretta magnetica e chiusi con tappi di gomma.
Ciascun reattore conteneva 80 mg di biomassa umida e 10 mi di una sospensione all'8% di (D,L)-para-idrossi-fenilidantoina in tampone NaP040,2 M, pH 8,0.
Dopo 2,5, 15 e 22 ore aliquote delle miscele di reazione sono state prelevate, diluite in una soluzione acquosa contenente il 5% di acetonitrile e 0,01% di acido fosforico e centrifugate a 16.000 rpm per 10 minuti, allo scopo di rimuovere la torbidità presente.
I campioni così preparati sono stati analizzati all'HPLC per determinare la concentrazione della para-idrossi-fenilglicina e della N-carbamil-para -idrossi-fenilglicina.
A tale scopo è stata utilizzata una colonna 4,6 x 250 mm) Ultrasphere ODS Beckman operando in condizioni isocratiche ad un flusso di 1/ml minuto e monitorando l'eluato a 272 nm. Come fase mobile è stata utilizzata la stessa soluzione acquosa impiegata per la diluizione dei campioni.
In tabella 2 sono riportate le cinetiche di comparsa del carbamile e dell1amminoacido.
Tabella 2
Dai risultati si osserva che, a parità di biomassa e di tempo di reazione, l’accumulo di amminoacido è più elevato se si utilizza il ceppo E.coli SMC327 .
In figura 6 si riportano i dati di conversione, rispetto all'idantoina di partenza, ottenuti sommando 1'amminoacido ed il carbamile presenti a diversi tempi nella miscela di reazione.

Claims (9)

  1. RIVENDICAZIONI 1. Procedimento migliorato per la preparazione di D-a-amminoacidi mediante conversione stereospecifica di miscele raceme di idantoine 5-sostituite con un sistema enzimatico prodotto da un microorganismo, caratterizzato dal fatto che detto microorganismo è ottenuto mediante: (a) costruzione del plasmide pSM700 CBS 668.95 comprendente l'operone carbamilasi-idantoinasi posto sotto il controllo di un promotore costitutivo e dove la regione comprendente l'RBS a monte dell'idantoinasi ha la sequenza AAGGAGGAAA AATAT (b) trasformazione di un microorganismo con il plasmide pSM700; e (c) fermentazione del microorganismo trasformato in un mezzo acquoso contenente sorgenti assimilabili di carbonio ed azoto, cationi, anioni ed, eventualmente vitamine, in condizioni aerobiche, ad una temperatura da 20°C a 28 °C.
  2. 2. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che il microorganismo è scelto tra Escherichia coli e Bacillus subtilis .
  3. 3. Il procedimento secondo la rivendicazione 1 caratterizzato dal fatto che il microorganismo è coltivato ad una temperatura da 23 a 26°C.
  4. 4. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, dove sorgenti di carbonio assimilabili includono carboidrati come glucosio, amidi idrolizzati, melassa, saccarosio.
  5. 5. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, dove sorgenti di azoto possono essere scelti, tra sali d'ammonio minerali, quali nitrato di ammonio, solfato di ammonio, cloruro di ammonio o carbonato di ammonio e urea o materiali contenenti azoto organico o inorganico come peptone, estratto di lievito o estratto di carne.
  6. 6. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, dove i cationi ed anioni sono scelti tra potassio, sodio, magnesio, ferro, calcio, fosfati acidi, solfati, cloruri, manganese e nitrati.
  7. 7. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, l'idantoina 5-sostituita è scelta tra (D,L)-5-fenilidantoina, (D,L)-5-para-idrossifenilidantoina, (D,L)-5-metilidantoina, (D,L)-5-isopropilidantoina, (D,L)-5-tienilidantoina, (D,L)-5-parametossifenilidantoina, (D,L)-5-para-clorofenilidantoina, (D,L)-5-benzilidantoina.
  8. 8. Il procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che, l'idantoina è (D,L)-5-para-idrossifenilidantoina.
  9. 9. Il procedimento secondo la rivendicazione 7, caratterizzato dal fatto che, 1'idantoina è (D,L)-5-fenilidantoina 10.11 procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta ad una temperatura compresa tra 20°e 60°C. 11.11 procedimento secondo la rivendicazione 10, caratterizzato dal fatto che, la temperatura è compresa tra 30°e 45°C. 12. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che, la reazione di conversione è condotta ad un pH compreso tra 6,0 e 10. 13. Il procedimento secondo la rivendicazione 12, caratterizzato dal fatto che il pH è compreso tra 7,0 e 8,5. 14. Il procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la reazione di conversione è condotta impiegando un rapporto ponderale biomassa umida/idantoine compreso tra 1/1 e 1/50. 15. Plasmide pSM700 depositato presso il Bureau Voor Schimmelcultures, SK Baarn (Olanda) dove ha ricevuto il numero di deposito CBS 668.95. 16. Un microorganismo scelto tra Bacillus subtilis ed Escherichia coli trasformato con il plasmide PSM700. 17. Il microorganismo della rivendicazione 16, Escherichia coli SMC327 CBS 668.95.
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