JP3758814B2 - サンドイッチ免疫測定法における応答シグナルの増幅方法 - Google Patents
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Description
その存在又は濃度が調べられている分析対象物の第1のエピトープに特異的な第1抗体が固体支持体に固定化されており、かつ分析対象物の第2のエピトープに特異的な第2の標識抗体が存在する、サンドイッチ型免疫測定法は、よく知られている。この型の測定法は、マイクロタイタープレート又はストリップの形で行うことが可能で、後者では分析対象物について試験される流体を多孔性ストリップの一方の端に適用して、毛管現象によりそのストリップの種々の領域にその流体を流す。分析対象物は、固定化抗体及び標識抗体に結合して、「サンドイッチ」を完成する。本明細書で「シグナル発生物質」と呼ばれる標識は、基質と反応して発色応答を与える酵素であってよい。発色剤及び発蛍光剤も既知のシグナル発生物質である。米国特許第4,703,017号明細書において、シグナル発生物質が、分析対象物を介して第1の固定化抗体に結合すると可視的に検出可能になる可視染料を含有するリポソーム又はマイクロカプセルであってもよい粒子標識である、免疫測定法が開示されている。他のシグナル発生物質は、抗体が結合する、金ゾルのようなコロイドサイズの金属粒子を含む。
【0002】
分析対象物結合抗体上の標識により生成するシグナルは、必ずしも十分に強力ではなく、シグナルを増幅するための方法が提案されてきた。米国特許第4,657,853号明細書に開示されている1つのこのような方法は、少なくとも2つの酵素分子を共有結合させてプレポリマー化酵素を生成させ、次にプレポリマー化酵素を抗体又は抗体断片に共有結合させることにより、ポリマー性酵素/抗体結合体を生成させる方法に関する。
【0003】
欧州特許公開第0 516 529号公報(サーチレポートなし)において、測定されるある特異的な抗体に対して3つ以上の結合部位を有する抗体により凝集を増幅して、そのため、抗体の検出感度を改善する、凝集型免疫測定法が開示されている。
【0004】
特開平5−322893号公報において、分析対象物に対して特異的な抗体、及びシグナル発生物質として酵素を有する、分析対象物の異なるエピトープに対して特異的な抗体を溶液中に組合せた増幅系が開示されている。更には、Fab部分が各々酵素シグナル発生物質に特異的であり、これが、抗体に結合した酵素の鎖の形成を促進し、そのため、酵素標識抗体の鎖が適切な基質に接触すると、シグナル増幅が起こる。
【0005】
本発明は、その存在又は濃度が調べられている分析対象物の第1のエピトープに特異的な第1抗体が固体支持体に固定化されている、サンドイッチ型免疫測定法に対する改良である。試験媒体には、分析対象物の第2のエピトープに特異的な少なくとも1つの第2抗体を結合した一次シグナル発生物質が含まれる。本発明の改良により、試験媒体には、一次シグナル発生物質に結合した第2抗体に特異的な少なくとも1つの抗体を結合させている二次シグナル発生物質が含まれる。この二次シグナル発生物質は、一次シグナル発生物質に結合した第2抗体に結合し、そしてこの測定法により生成されるシグナルを増幅する。完全抗体には2つの抗原結合部位があるため、第2抗体に対して特異的な抗体の1つのコピーで、その鎖の形成には十分である。架橋の機会を増加させるため、一次及び二次シグナル発生物質に結合したこれらの抗体は、コピーが複数あるのが好適である。
【0006】
図1に関して、標準的サンドイッチ測定法では、分析対象物の異なるエピトープに対して特異的な別々の抗体を用いて、2つの連続免疫化学反応が行われる。図中で1と表される第1の抗体(Ab1)は、固体支持体5に固定化されている。第2の抗体(Ab2)は、一次シグナル発生物質3により標識されている。抗体1及び2が、これらの別々のエピトープと反応すると、分析対象物は、サンドイッチの配置でこれらの抗体の間に捕捉される。第1の抗体1を分離した捕捉ゾーンに固定化することにより、一次シグナル発生物質3により生成されるシグナルは、この捕捉ゾーンに濃縮され、ここでそれを検出することにより試験流体中の分析対象物の存在が示される。
【0007】
増幅サンドイッチ測定法において、反応媒体には、二次シグナル発生物質が含まれ、この物質は、一次シグナル発生物質9と同一であってよく、一次シグナル発生物質3に結合した第2の抗体に対して特異的な少なくとも1つの抗体(Ab3)11に結合している。この抗体は、抗原結合部位を含むこれらの鎖の部分に特異的でないかぎり、第2の抗体の軽鎖又は重鎖のいずれかに特異的であってよい。軽鎖は、相対的に短く、Ab2とAb3の間の相互作用が、それ以前に形成する分析対象物−Ab2結合により立体的に障害されうるため、重鎖に特異的である抗体の方が好適である。図1において、一次シグナル発生物質は、2つの第2抗体に結合しており、そして典型的には、シグナル発生物質に結合した第2抗体は多数である。しかし、一次シグナル発生物質に結合した抗体がそのFab2 位置により分析対象物に結合することができ、なお十分な露出した重鎖を有し、そのため、二次シグナル発生物質に結合したAb3抗体がここに結合することができるので、ある種の増幅は、各シグナル発生物質にわずか1つの抗体が結合していさえすれば達成される。
【0008】
好適には、一次及び二次シグナル発生物質は両方とも多数の抗体(即ち、各々Ab2及びAb3)を有し、そのため一次及び二次シグナル発生物質両方ともを含む鎖13が形成され、そしてこの鎖が、Ab1、分析対象物及びAb2の間のサンドイッチの形成により固体支持体の検出ゾーンに固定化されると、各分析対象物分子について生成されるシグナルは何倍にも増幅される。
【0009】
この固体支持体は、サンドイッチ免疫測定法を行うのに適切なものとして当該分野で既知の任意の材料であってよい。したがって、第1の抗体は、米国特許第4,313,734号明細書に開示されているように、マイクロタイタープレートのような、免疫化学反応が行われる反応容器の内表面に結合してもよい。あるいは、固体支持体は、米国特許第4,703,017号明細書(ここで、この測定法に使用されるトレーサーは、支持体上の結合物質に結合すると、更なる処理なしに可視となる粒子標識で標識されているリガンドである)に開示されているように、毛管現象により試験流体が流れることの可能な多孔性材料のストリップであってもよい。このように、好適な実施態様において、本発明の増幅測定法は、流体試料の適用のための吸上(wicking)パッドとして第1の領域を有する、濾紙又はニトロセルロースのような材料の多孔性ストリップ上で行われ、この流体試料は、流体試料により捕捉される標識抗分析対象物(AB2)を含有する第2ゾーンを毛管現象により流れる。試料中に存在する分析対象物は、Ab2と反応して、分析対象物/標識抗体結合体を形成し、これが、シグナル発生物質として検出可能な標識を有するAb2に特異的な抗体(Ab3)を含有する第3ゾーンを流れる。抗体Ab3は、Ab2のみに特異的であり、Ab1を認識しない。これは、Ab1バンドが、分析対象物の存在下では常に陽性応答を与えるためであり、もしAb3がAb2と同様にAb1と結合するならば、分析対象物濃度を反映させることができないであろうためである。しかしこの要求は、本実施例における、マウスからのモノクローナル抗体及びマウス以外の種からのポリクローナル抗分析対象物抗体の使用とは対照的な、同一種からの抗分析対象物抗体を利用するサンドイッチ測定法への本増幅方法の適用を排除することはない。本増幅方法は、系の改変により同一種測定法において使用することができる。例えば、Ab1でもAb2でも分析対象物でもない部分をAb2に結合することができ、そしてその部分のみを認識する抗体をAb3として使用することができる。あるいは、抗体全体ではなくAb1のFab又はF(ab)2をアッセイストリップに固定化して、Ab2の重鎖に対して特異的な抗体をAb3として使用する。これらの改変法のいずれにおいても、Ab3はAb2と架橋を形成するが、Ab1には結合しない。したがって本測定法は、いかなる不必要なバックグラウンドシグナルもなく増幅することができる。Ab2とのAb3の特異的な結合により増幅が起こり、少なくとも二倍のシグナルを与える(更に大きな増幅は、複数のシグナル発生物質を含有する鎖の形成を可能にするAb2及びAb3の多数のコピーでシグナル発生物質を使用することにより与えられる)のはこの工程である。分析対象物に結合したシグナル発生物質の鎖は、次にストリップに沿って、特異的な分析対象物のエピトープへの結合により分析対象物を捕捉するAb1が固定化された検出ゾーンへと流れる。捕捉された分析対象物は、これに結合した多数のシグナル発生物質のため増強されたシグナルを生成する。本明細書に使用される、Ab1、Ab2及びAb3という用語は、完全抗体、並びにFab及び/又はF(ab)2断片のいずれかを意味するものである。
【0010】
増幅過程の前にサンドイッチを形成することは可能であるが、これには更に複雑な測定系を要する。Ab1が固定化されている、本発明のこの実施態様を利用する1つの方法では、分析対象物−Ab2がAb1に捕捉された後に、Ab3−シグナル発生物質複合体がストリップに添加される。これは、測定過程でのマニュアルピペット操作、又はAb2とAb3の間の結合を遅延させるため標識Ab3を含有するリポソーム又はマイクロカプセルの使用によるような放出制御法により達成される。別の形では、Ab1は、固定化されていないが、代わりにAb2でコーティングされたシグナル発生物質及びAb3でコーティングされた二次シグナル発生物質を含有するパッドの領域の間に配置される。更に、Ab1に対して特異的な第4の抗体をストリップに固定化して、シグナル発生物質の鎖を捕捉して、アッセイ応答を生成する。
【0011】
本発明における使用に好適なストリップの型は、図2に正面図と側面図の両方で示される。側面図には、ゾーン間の広い接触面積を与え、このためストリップ中の流体の流れを促進するゾーンの重複部分が図示される。試験流体がストリップを容易に流れることの可能なものであるときには、端と端の接する接触のような単純な連結で十分であるため、このことは、本発明の増幅法の操作性に必須というわけではない。尿のような試験流体をヒト血清アルブミン(HSA)について試験する操作において、吸上パッド1、金ゾルで標識されたAb2としてのマウス抗HSAを含有する試薬領域3、及びこれも金ゾルで標識されたヤギ抗マウス抗体(Ab3)を含有する第2試薬領域5を有するニトロセルロース試験ストリップ10が使用される。更にストリップの上には、ウサギ抗HSA(Ab1)が固定化された捕捉ゾーン7がある。試験流体は、ウィッキングパッドに適用され、吸収されて、ストリップを流れ始めて、ゾーン3及び5、そしてついには検出ゾーン7に達して、ここでシグナル発生物質からの検出可能なシグナルが観察される。試薬ゾーン5と検出ゾーン7の間のスペースは、あってもなくてもよいが、マウス抗HSA抗体とヤギ抗マウス抗体の間でインキュベーションして、検出ゾーンに達する前にシグナル増幅複合体が十分に形成されるようにスペースがある方が好適である。場合により、本ストリップは、分析対象物が存在しない場合でも試験が機能したことをユーザーが確認できるように、標識Ab2又はAb3のいずれかに対する固定化された特異的結合パートナーを含有する陽性対照ゾーン9が提供される。
【0012】
上述の金ゾルのような金属ゾルは、好適なシグナル発生物質であるが、分析対象物が検出されたということを装置のユーザーに警報を発するための、検出可能なシグナルを提供する任意の種を利用することができる。即ち、金以外の金属(例えば、銀、パラジウム又はセレン)のゾルは、一次、二次又は両方のシグナル発生物質として使用することができる。色素充填リポソーム若しくは袋状微粒子、着色ラテックス粒子、酵素又は発色剤のような他のシグナル発生物質は、これらのAb2への結合が、Ab2の重鎖を遮蔽するなどして、Ab2とAb3の間の結合を妨害しないかぎり、シグナル発生物質として使用することができる。Ab2及びAb3の別々のコピーの使用は、増幅作用を増強するのに好適である。
【0013】
試験ストリップを調製するために使用される吸収性担体は、好適には濾紙である。吸収性担体として有用な他の材料は、米国特許第3,846,247号明細書に記載されているような、ガラス繊維織物又はガラス繊維マット(matted glass fibers)、フェルト及び多孔性セラミックストリップを含む。また、米国特許第3,552,928号明細書に記載されているような、粘土物質、木、布及びスポンジ材料も適している。この吸収性担体は、毛管作用により試験流体が拡散することができるように多孔性材料であるとよい。このストリップの調製において、吸収性担体は、直接ピペット操作により、各々標識Ab2及びAb3で浸漬することができ、そして空気乾燥、続いて両面接着テープによるtrycite の裏板への接着が行われる。十分な試薬が利用可能であれば、浸漬法を使用することができる。本発明の実施方法は、以下の実施例により更に説明される。
【0014】
【実施例】
実施例I
本発明の増幅方法は、ヒト血清アルブミン(HSA)を使用するモデル系により証明した。この系は、毛管現象により流体試料の流れに適した多孔性ニトロセルロースストリップを含み、このストリップは、以下の領域よりなる:a)吸上パッド;b)金ゾル標識モノクローナル抗体を含有するゾーン;c)次のゾーンの金ゾル標識ポリクローナルヤギ抗マウス抗体、及び最後にd)固定化されたポリクローナルウサギ抗HSA抗体を含む、ゾーンcから流れてくるゾーン。
【0015】
この測定法は、ストリップのウィッキングパッドを、HSAを含有するリン酸緩衝化生理食塩水中に浸漬して、ストリップが完全に濡れるまでストリップをその溶液に接触させておくことにより行った。アッセイ応答を得るために、ストリップを空気乾燥後、クリニテク(CLINITEK)(商標)100分光光度計の使用により固定化抗体範囲(読みゾーン)の反射率を測定した。金ゾル標識を有するヤギ抗マウス抗体は、シグナル増幅物質として作用した。増幅測定法との比較のために、ヤギ抗マウス抗体を含まない同様の測定法(増幅なし)を行った。
【0016】
これらの測定法から得られた結果を図3に示したが、これらにより、本発明の増幅法の実行可能性と以下の利点を証明した:
1) 増幅測定法の応答は、増幅なしの測定法の応答より有意に高かった;
2) 増幅法によるバックグラウンドシグナルの増大は起きなかった;そして
3) 応答シグナルの改善により、増幅測定法はその対照法よりも高感度であった。
【0017】
図3に、増幅あり及び増幅なしのHSAサンドイッチ法の用量作用曲線を表した。K/S=(1−R)2/2R〔ここで、R=反射率%である〕。図3に示したデータは、3回測定の平均を表している。
【0018】
実施例II
HSAサンドイッチ法と同様に、モノクローナル抗hCG抗体(hCGアルファ鎖に特異的)を金ゾルにより標識して、ポリクローナル抗hCG抗体(hCGベータ鎖に対して作製)をニトロセルロース膜に固定化した。抗マウス抗体を再度金ゾル上にコーティングして、シグナル増幅に使用した。測定法の構成と測定手順は、hCGの活性を保護するため測定溶液に0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)を添加した他は、実施例Iと同じであった。この実験の結果は、図4に表した。
【図面の簡単な説明】
【図1】従来法のサンドイッチ免疫測定法及び本発明の増幅サンドイッチ測定法を図示する。
【図2】本発明に使用するのに適切なアッセイストリップを表す。
【図3】本発明の増幅法を用いた場合と用いない場合両方の、HSAの分析において得られた結果をグラフにより表したものである。
【図4】本発明の増幅法を用いた場合と用いない場合両方の、hCGの測定法を表すグラフである。
Claims (25)
- 液体試験媒体中のその存在又は濃度が調べられている分析対象物の第1のエピトープに特異的な第1抗体が固体支持体に固定化されており、かつ分析対象物の第2のエピトープに特異的な少なくとも1つの第2抗体に結合した一次シグナル発生物質が存在する、サンドイッチ型免疫測定法において、
液体試験媒体中に、一次シグナル発生物質に結合した第2抗体に特異的な少なくとも1つの抗体に結合した二次シグナル発生物質(これは、第2抗体に特異的に結合して、第1抗体が分析対象物の第1のエピトープに特異的に結合して、それにより分析対象物を固体支持体に捕捉し、そして一次シグナル発生物質が分析対象物の第2のエピトープに結合して、それにより固体支持体上に検出可能なシグナルを与えるときに生成されるシグナルを増幅する)を含むことを特徴とする方法。 - 一次及び二次シグナル発生物質が、同一である、請求項1記載の方法。
- 一次及び二次シグナル発生物質が、着色した、コロイドサイズの粒子である、請求項2記載の方法。
- コロイドサイズの粒子が、金属ゾルを含む、請求項3記載の方法。
- 金属が、金である、請求項4記載の方法。
- 二次シグナル発生物質に結合した該抗体が、一次シグナル発生物質に結合した第2抗体の重鎖に特異的である、請求項1記載の方法。
- 二次シグナル発生物質が、一次シグナル発生物質に結合した第2抗体に特異的な少なくとも2つの該抗体と結合しており、かつ一次シグナル発生物質が、少なくとも2つの第2抗体と結合しており、その結果、分析対象物の第2のエピトープに結合すると、鎖中にシグナル発生物質の数に比例したシグナル増幅を与える、一次及び二次シグナル発生物質が交互に連なる鎖が形成される、請求項1記載の方法。
- 試験流体が、尿であり、かつ分析対象物が、hCGである、請求項1記載の方法。
- 1つ以上の該抗体が、完全抗体である、請求項1記載の方法。
- 1つ以上の該抗体が、Fab又はF(ab)2断片である、請求項1記載の方法。
- 毛管現象により試験流体がそこを通って流れることの可能な吸収性材料から製造され;分析対象物のエピトープに特異的な抗体を固定化し;そして固定化抗体が特異的であるものとは異なる分析対象物のエピトープに特異的な第1の標識抗体及び第1の標識抗体に特異的な第2の標識抗体を吸収しており、その結果、試験流体がストリップに適用されると、毛管現象によりストリップに沿って流体が流れ、試験流体に含まれる分析対象物が第1の標識抗体及び固定化抗体と結合し、固定化抗体と第1の標識抗体の間の分析対象物のサンドイッチを形成し、このサンドイッチが第1の標識抗体上の標識により検出可能なシグナルを与え、このシグナルが第1の標識抗体への第2の標識抗体の結合により増幅される、試験流体中の分析対象物の検出用試験ストリップ。
- 第1及び第2の標識抗体が、着色したコロイドサイズの粒子で標識されたものである、請求項11記載のストリップ。
- コロイドサイズの粒子が、金属ゾルを含む、請求項12記載のストリップ。
- 金属が、金である、請求項13記載のストリップ。
- 第2の標識抗体が、第1の標識抗体の重鎖に特異的である、請求項11記載のストリップ。
- 固定化抗体が、分離した捕捉ゾーンに固定化されている、請求項11記載のストリップ。
- 第1の標識抗体及び固定化抗体が特異的である分析対象物が、ヒト血清アルブミンである、請求項11記載のストリップ。
- 第1の標識抗体及び固定化抗体が特異的である分析対象物が、hCGである、請求項11記載のストリップ。
- 1つ以上の抗体が、完全抗体である、請求項11記載のストリップ。
- 1つ以上の抗体が、Fab又はF(ab)2断片である、請求項11記載のストリップ。
- a) 分析対象物のエピトープに特異的な第1の標識抗体を含有する第1の試薬領域;
b) 第1の標識抗体に特異的である第2の標識抗体を含有する第2の試薬領域;及び
c) 第1の標識抗体が特異的であるものとは異なる分析対象物のエピトープに特異的な抗体が固定化されている捕捉ゾーンを含む、毛管現象により試験流体が流れることの可能な吸収性担体材料を含むことを特徴とする、試験流体中の分析対象物の検出用試験ストリップ。 - 試験流体の適用のための、第1の試薬領域に隣り合う吸上(wicking)領域を更に含む、請求項21記載のストリップ。
- 第1又は第2の標識抗体に対する固定化された特異的結合パートナーを含有する、捕捉ゾーンの下流に位置する陽性対照ゾーンを更に含む、請求項21記載のストリップ。
- 1つ以上の抗体が、完全抗体である、請求項21記載のストリップ。
- 1つ以上の抗体が、Fab又はF(ab)2断片である、請求項21記載のストリップ。
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