JP3747091B2 - Apoptosis inducer - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、アポトーシス誘導剤に関する。具体的にいうと、細胞の新陳代謝等に関係に深いアポトーシスを誘導するアポトーシス誘導剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
セラミドは、次の式２で示されるスフィンゴシンのアミノ基に脂肪酸が酸アミド結合した構造を有しており、このセラミドの末端の水酸基に、糖がグルコシド結合したスフィンゴ糖脂質や、エタノールアミンリン酸がエステル結合したスフィンゴリン脂質（狭義のスフィンゴリン脂質）などとして、あるいは、遊離型として動植物界に広く存在している。

【０００３】
これらのセラミドに関しては、これまで高い保湿能を有することが見いだされ、上記式２で表されるセラミドを１種又は２種以上、薬用外用皮膚剤あるいは化粧料に配合することによって、角質層の水分保持能力を根本的に改善し、荒れた角質層を健常人と同レベルまでに機能回復させることができると報告されている。
【０００４】
しかし、植物や動物によって産生されるセラミドのアポトーシス誘導作用については、これまで数々報告されているが、セラミドを産生する細菌が非常に少なく、細菌より産成されるセラミドについての報告は未だない。
【０００５】
一方、細菌の生産するスフィンゴ糖脂質についても、Ｂ細胞活性化作用についての報告はされているが、これらについてもアポトーシス誘導作用があるとの報告もない。
【０００６】
ここでアポトーシスとは、個体の細胞死の一態様であって、物理的要因や化学的要因で引き起こされるネクローシスと対比される概念であり、ネクローシスとは、一般には、細胞が膨張し、次いで細胞膜が破裂して、細胞死に至る過程を示している。
【０００７】
一方、アポトーシスとは、個体の発生段階などで見られる細胞死を言い、この細胞死では、細胞や核が凝縮して、最終的には細胞の内容物を取り込んだまま細胞自身が断片化して、個体から脱落していく現象をいう。このアポトーシスは、現段階では、あらかじめ死ぬようにようにプログラム化されており、ある一定の分化過程に達すると自らアポトーシスを発揮して、自殺死を遂げると考えられている。つまり、個体の生命を維持するためには、個体を構成する細胞の分化と増殖だけではなく、特定の時期に特定の細胞が死滅することが必要である。
【０００８】
したがって、外部からの細菌やウイルスのアポトーシスを誘導することにより、細菌からの感染治療をうながしたり、あるいは皮膚の表皮細胞のアポトーシスを誘導することにより、皮膚の新陳代謝を促進することができると考えられる。
【０００９】
そこで、本発明者らは、免疫薬理活性に関して生化学的研究、細胞学的研究等を進めた結果、細菌、特に、スフィンゴバクテリウム属から分離されたセラミド類似物質にアポトーシス誘導作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明は叙上の従来例の欠点に鑑みてなされたものであり、その目的とするところは、新規で有効なアポトーシス誘導剤を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明のアポトーシス誘導剤は、次の式１

で示されるセラミド類似物質（ただし、式１中、Ｒ_１基はアシル基、Ｒ_２基は飽和アルキル基、Ｘは、水素、エタノールアミンリン酸基、単糖類リン酸基、イノシトールリン酸基のいずれか１種である。）のうち、前記式３〜式８のいずれかで示されるセラミド類似物質からなることを特徴としている。つまり、本願発明は、式３〜式８のいずれかで示されるセラミド類似物質をアポトーシス誘導剤として使用するものである。
【００１２】
本発明のアポトーシス誘導剤である式１に示されるセラミド類似物質は、主としてスフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属によって産生される物質であって、スフィンゴバクテリウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の細菌を培養することにより、主として菌体中に当該化合物を生成せしめ、かかる菌体から抽出することによって得ることができる。例えば、Ｓ．Ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ、Ｓ．ｍｕｌｔｉｖｏｒｕｍ、Ｓ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｍｉｚｕｔａｅなどの菌種を培養することにより、本発明のセラミド類似物質を得ることができる。また、これらの菌種に限られず、その他の近縁菌、あるいはＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ及びその他の近縁菌からも得ることができる。
【００１３】
これらの細菌から得られるセラミド類似物質は、特に、Ｒ_２基として飽和アルキル基が結合している。これまで、自然界にセラミドにあっては、スフィンゴシンに代表されるように、不飽和のアルキル基がほとんどであったが、本発明においては、例えばスフィンガニン（ジヒドロスフィンゴシン）に代表されるように、飽和のアルキル基を有している。
【００１４】
また、従来のセラミドにあっては、Ｒ_１基、Ｒ_２基ともに、直鎖アルキル基が主たるものであったが、本発明のセラミド類似物質にあっては、Ｒ _１ 基、Ｒ _２ 基ともに分岐鎖を有しており、特に、イソ体であることを特徴としている。
【００１５】
さらに、本発明にあっては、Ｒ_１基に水酸基を有するものが好ましく、具体的には、２位の炭素に水酸基が結合した２−ヒドロキシアシル基が望ましい。
【００１６】
また、自然界においては、Ｒ_１基では偶数個の炭素数を有するアシル基及びＲ_２基では奇数個の炭素数（末端の水酸基までは偶数個の炭素数）を有するものが一般的であるが、本発明に係るセラミド類似物質は、Ｒ _１ 基の炭素数が奇数個であり、Ｒ _２ 基の炭素数が偶数個である。
【００１７】
具体的には、例えば、式１のＸ基が水素である

（以下、「ＬＣＢＦＡ−１」と称す。）
又は、式１のＸ基としてエタノールアミンリン酸がエステル結合した

（以下、「ＣｅｒＰＥ−１」と称す。）
に示すように、Ｒ_１基として、ＣＨ_３ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_１０ＣＨ_２ＣＯ基（炭素数１５）であり、Ｒ_２基として、ＣＨ_３ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_１１基（炭素数１４）であるものを得ることができる。
【００１８】
また、式１のＸ基が水素である

（以下、「ＬＣＢＦＡ−２」と称す。）
又は、式１のＸ基としてエタノールアミンリン酸がエステル結合した

（以下、「ＣｅｒＰＥ−２」と称す。）
に示すように、Ｒ_１基として、ＣＨ_３ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_１０ＣＨ（ＯＨ）ＣＯ基（炭素数１５）であり、Ｒ_２基として、ＣＨ_３ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_１１基（炭素数１４）であるものを得ることができる。
【００１９】
さらに、本発明のセラミド類似物質の単糖類としては、グルコース、マンノース、フルクトースなどが挙げられる。また、スフィンゴバクテリウム属からは、イノシトールが結合したものが得られ、例えば、

（以下、「ＣｅｒＸ−１」と称す。）
又は、

（以下、「ＣｅｒＸ−２」と称す。）
に示すように、ホスホリルイノシトール誘導体が、優れたアポトーシス誘導作用を発揮する。
【００２０】
これらのセラミド類似物質を産生するスフィンゴバクテリウム属の培養法としては、従来から用いられている公知の合成培地および天然培地を用いることができ、特にスフィンゴバクテリウム属に属する細菌の培養に用いられる培地であれば、すべての培地が使用できる。
【００２１】
例えば、生育炭素源としては、グルコース、フルクトース、マンノースなどの単糖類、スクロース、トレハロース等の二糖類等を用いることができる。また、窒素源としては、例えば、硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機窒素化合物、ペプトン、肉エキス、コーンスティーブリカー等の有機窒素化合物を利用できる。また、無機塩として、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛、マグネシウム、マンガン、リン酸等を、さらに、成長因子として、各種ビタミン、アミノ酸類、または、それらを豊富に含む酵母エキスを適宜加えることにしてもよい。
【００２２】
培地のｐＨは５〜９、特に７〜７．５が至適範囲であり、培養温度は１０〜４０℃、好ましくは３０〜３７℃が適している。培養は、液体培養または固体培養で好気的条件下に行うことが好ましい。また、培養時間は、通常１〜７日程度とするのが適当である。
【００２３】
このようにして得られる菌体から、本発明のセラミド類似物質を得るには、菌体成分を採取する通常の方法を用いることができる。例えば、培養液を遠心分離をして集菌したのち、有機溶媒を加えて溶媒抽出すればよい。具体的に言うと、有機溶媒として、クロロホルムとメタノールの混液や、クロロホルムとメタノール、アセトンの混液のように、クロロホルムなどの疎水性溶媒やメタノールやアセトンなどの親水性溶媒とを単独、あるいは混合したものを用いるとよい。
【００２４】
次に、抽出した菌体成分をシリカゲルやモレキュラシーブなどに吸着させ、その後、先に述べたような溶媒で溶出して、さらに精製を加える。そして、溶媒に対する溶解度差やイオン結合力の差などを利用し、それぞれ単独の方法で、または２以上の方法を適当に組み合わせて、あるいは同様な操作を数回繰り返すことにより、本発明のセラミド類似物質等をほぼ純粋な物質として分離精製することができる。
【００２５】
こうして精製されたセラミド類似物質は、そのまま、あるいは適当な溶媒で希釈したり、さらに適当な賦形剤と混合することにより用いることができ、慣用の製剤化手段によって、各種軟膏剤、外用皮膚剤に用いることができる。例えば、クリーム、乳液等に代表される各種の水／油、油／水型乳化化粧料、口紅、ファンデーション、皮膚洗浄剤、育毛剤等として適用することができる。
【００２６】
また、セラミド類似物質としては、菌体から上述した方法により抽出し、純粋なものにまで精製する必要もなく、また、各種のセラミド類似物質の混合物として用いることとしてもよい。また、セラミド類似物質としては、炭素数の異なるものが混合した状態で得られるが、炭素数の異なるものそれぞれにまで分離精製する必要もない。さらに、毒性が発揮されず、適度なアポトーシス誘導作用を発揮する程度に、粗精製した菌体抽出物として用いてもよい。もちろん、合成によってもセラミド誘導体を得ることとしてもよく、合成した場合には純度の高いセラミド類似物質を得ることができる。
【００２７】
【実施例】
以下に本発明の実施例について具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実施例１）
〔菌体の培養〕
スフィンゴバクテリウム属（Ｓ．ｓｐｉｒｉｔｉｖｏｒｕｍ）を１白金耳採り、ハートインフージョンの平面寒天培地（日本製薬社製）に画線し、３０℃で２日間培養する。２日間培養したシャーレから１コロニーを白金耳で採り、ハートインフージョンの斜面寒天培地へ画線し、３０℃で１日間培養する。この斜面培地から培養菌体を１白金耳採り、ｐＨ７．０に調整した、以下に示す組成の培養用ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地２００ｍｌに植菌し、３０℃で１〜２日間、振とう培養法によって前培養した。この前培養菌液１０〜５０ｍｌ（前培養菌液の菌体濃度により、液量を適宜調整する。）を、同じ組成のＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地１．５ｌに加え、３０℃で１〜７日間、本培養した。
【００２８】
〔ＰＹＧ（Ｍ、Ｆ）培地の組成〕
・ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎ（日本製薬製） ０．５％
・ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦＣＯ製） ０．５％
・糖 （Ｄ（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ、
和光純薬製） １％
【００２９】
〔セラミド類似物質の抽出精製〕
こうして得られた培養菌液を、７５００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、菌体を集菌する。次に集菌された菌体を、クロロホルムとメタノールの混液（容積比で２：１）を加え、超音波ホモジナイザーにて１５分間、超音波処理を行う。この処理した溶液を分液ロートに移し、水を加えて２層に分離させ、溶媒相を分取する。そして、分取した溶媒をエバポレーターにて濃縮し、脂質成分を得た。
【００３０】
ついで、この脂質成分を、水酸化カリウムの濃度が０．５Ｎとなるように調整したクロロホルムとメタノール混液（容積比１：２）に溶解させ、３７℃で２時間振盪して加水分解（弱アルカリ水解）を行い、その後、水酸化ナトリウムでｐＨを中性にして、アルカリ安定脂質とする。
【００３１】
さらに、得られたアルカリ安定脂質を薄層クロマトグラフィーにより展開して、分離精製した。つまり、アルカリ安定脂質を少量のクロロホルムなど適当な溶媒に溶かし、シリカゲルからなる分取用薄層板（ＵＮＩＰＬＡＴＥ ＳＩＬＩＣＡ ＧＥＬ Ｇ ＭＥＲＣＫ社製）上に、スポットした。そして、クロロホルムとメタノール、酢酸の混液（容量比１００：１０：５）にて展開した。次に、この薄層板上で分離された各脂質部分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルを、それぞれ、ガラスカラムに充填して、クロロホルムとメタノールの混液（容量比３：１）で溶出し、薄層クロマトグラム上で単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に溶媒を留去して、ＣｅｒＦＡ−１及びＣｅｒＦＡ−２で示すセラミド類似物質を得た。
【００３２】
また、分離されたリン脂質部分（ＣｅｒＰＥ−１、ＣｅｒＰＥ−２、ＣｅｒＸ−１、ＣｅｒＸ−２を含む部分）は、さらにクロロホルムとメタノール、酢酸、水の混液（容量比１００：２０：１２：５）で、３回展開し、薄層板上で分離された各成分を掻き取り、掻き取ったシリカゲルをガラスカラムに充填し、クロロホルムとメタノールの混液（容量比、２：１）で溶出し、薄層クロマトグラム上で単一スポットになるまで繰り返し行う。最後に溶媒を留去して、ＣｅｒＰＥ−１、ＣｅｒＰＥ−２、ＣｅｒＸ−１、ＣｅｒＸ−２をそれぞれ得た。
【００３３】
次に、こうして得られた各種のセラミド類似物質について、本発明の効果を確認するため、以下の試験を行なった。
【００３４】
アポトーシス誘導作用を検出する際には、細胞壊死であるネクローシスとの違いを明らかにする必要がある。アポトーシスが誘導された細胞は、上述したように、まず細胞が縮小し、クロマチンが凝縮し、凝縮した核は断片化する。また、細胞表面の微絨毛は消失して平滑化し、自己認識機構を担う細胞表面分子マーカーを徐々に喪失していく。さらに、細胞表面に大小の突起が出現し、やがてアポトーシス小体に断片化する。このアポトーシス小体は、生体内においてはやがてマクロファージのような貪食細胞によって除去される。
【００３５】
そこで、これらの現象に着目して、ヒト骨髄性白血病細胞ＨＬ−６０に本発明のセラミド類似物質を添加し、数時間後、アポトーシスが誘導されたかどうかを検出するため、以下のような複数の方法を用いて、実験を行った。
【００３６】
〔細胞形態の解析〕
まず、上記実施例で得られたセラミド類似物質、ＬＣＢＦＡ−２を用いて実験を行なった。ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解させ、最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０^５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、洗浄したＨＬ−６０細胞を採取し、７０％エタノールで固定した後、これらの細胞についてフローサイトメトリーで解析を行った。
【００３７】
この解析には、細胞の大きさを表す指標としてｆｏｒｗａｒｄ ｓｃａｔｔｅｒ（ＦＳＣ）、細胞内部の顆粒や構造状態を表すｓｉｄｅ ｓｃａｔｔｅｒ（ＳＳＣ）を用いて、セラミド類似物質（ＬＣＢＦＡ−２）の添加によるＨＬ−６０細胞の形態変化を観察した。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈溶媒として用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を用いて同様に処理を行ったＨＬ−６０細胞を用いて、ＨＬ−６０細胞の形態変化を観察した。その結果を、それぞれ図１（ａ）（ｂ）に示す。なお、フローサイトメトリーには、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦＡＣＳｃａｎを用いた。
【００３８】
図１の各図において、縦軸はＳＳＣ強度（ＳＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔ）を、横軸はＦＳＣ強度（ＦＳＣ−Ｈｅｉｇｈｔ）を示すが、ＦＳＣ強度が大きいほど細胞の大きさは大きく、ＳＳＣ強度が大きいほど細胞の構造状態は複雑であることを示している。図１（ａ）（ｂ）を比較して見るに、ＬＣＢＦＡ−２を加えた系〔図１（ａ）〕の方が、コントロール〔図１（ｂ）〕に比較して、ＦＳＣ強度の小さい領域が増大しており、細胞が縮小していることが分かる。
【００３９】
〔細胞表面抗原の解析〕
アポトーシスが誘導された細胞は、上記に示したように細胞が小片化した後、食細胞によって貪食されるように細胞表面にある自己認識マーカーが消失する。次に、この現象を確認するために、自己認識マーカーであるＭＨＣｃｌａｓｓＩ分子の発現量をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）により蛍光標識した抗体を用いて解析した。
【００４０】
上記形態変化の解析で行なったのと同様、ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解して、ＬＣＢＦＡ−２の最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０^５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、フローサイトメーターによって測定した。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈に用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理を行ない、自己認識マーカの消失した細胞を測定した。その結果を図２に示す。
【００４１】
図２において、横軸にＦＩＴＣが結合した細胞を検出する波長５３０ｎｍにおける蛍光強度を示し、縦軸にはその細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を示した。コントロールにおいては、ほぼ同一の蛍光強度を持った細胞による単一のピークが現れているのに対し、本発明のセラミド類似物質（ＬＣＢＦＡ−２）で処理すると、蛍光強度が小さい細胞数が多くなり、アポトーシスが誘導されたことが確認された。
【００４２】
〔細胞周期の解析〕
ＨＬ−６０のように株化された培養細胞では、細胞周期を解析すると、ＤＮＡ複製を行うＳ期と細胞***の起こるＭ期、そしてその２つの間にあるＧ０／Ｇ１期、Ｇ２期の細胞の割合が一定となる。ここにおいて、アポトーシスが起こると、一定であった細胞周期が乱れる。そこで、ヨウ化プロピジウムにより細胞のＤＮＡを染色し、細胞周期の解析を行った。
【００４３】
上記形態変化の解析で行なったのと同様、ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解して、ＬＣＢＦＡ−２の最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０^５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、７０％の冷エタノールで固定した後、５０μｇ／１のヨウ化プロピジウム水溶液を添加し、１０分後にフローサイトメータを用いて解析を行った。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈に用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理を行い、解析を行なった。その結果を図３に示す。
【００４４】
図３において、横軸にヨウ化プロピジウムを結合した細胞を検出する波長５８５ｎｍにおける蛍光強度を示し、細胞中に存在する染色されたＤＮＡ含量を意味している。また、縦軸にはその細胞数（Ｃｏｕｎｔｓ）を示した。正常な細胞は、コントロールに示すような蛍光強度分布を示すが、アポトーシスが誘導されると、通常の細胞周期からずれ、核の断片化を経て、核の小体を形成するために、ヨウ化プロピジウムによって染色される１細胞当たりのＤＮＡ量が減少し、蛍光強度が減少する。
【００４５】
図３から分かるように、本発明のアポトーシス誘導剤であるＬＣＢＦＡ−２を添加すると、ＤＮＡ含量の少ない細胞が多く見られ、通常の細胞周期からはずれた細胞が多くなった。この減少によっても、ＬＣＢＦＡ−２によりアポトーシスが誘導されたことが分かる。
【００４６】
〔ＤＮＡ断片化の解析〕
アポトーシスが誘導された細胞は、ＤＮＡの断片化が生じている。そこで、細胞よりＤＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動を行い、ＤＮＡの断片化を観察した。
【００４７】
上記形態変化の解析で行なったのと同様、ＬＣＢＦＡ−２をエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）に溶解して、ＬＣＢＦＡ−２の最終濃度が１．５μｇ／ｍｌ、ＨＬ−６０細胞が５×１０^５個／ｍｌとなるように調整した。このものを３７℃、５％炭酸ガス存在下で４時間培養した。そして、１０００ｒｐｍ５分間遠心処理した後、上清液を捨てる。再び、細胞をｐＨ７．１のリン酸緩衝液に浮遊させ、さらに１０００ｒｐｍ５分間遠心処理にて洗浄を行なった。その後、プロテイナーゼＫを加えて３７℃で一晩反応させた後、常法により、フェノールで抽出し、エタノール沈殿法によってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡは、常法に従い、アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロマイドで発色させた。また、コントロールとして、ＬＣＢＦＡ−２の希釈に用いたエタノールとドデカンの混液（容量比４９：１）を添加したＨＬ−６０細胞を用いて同様に処理を行い、解析を行なった。その結果を図４に示す。
【００４８】
図４に示すように、コントロール〔図４（ａ）〕においては、ＤＮＡの断片化はほとんど見られなかったが、ＬＣＢＦＡ−２で処理したＨＬ−６０細胞〔図４（ｂ）〕には、断片化したＤＮＡからなる梯子状の泳動像が見られ、アポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片化が観察された。
【００４９】
以上の各試験から分かるように、本発明のＬＣＢＦＡ−２にはアポトーシス誘導作用があることが確認された。
【００５０】
また、これ以外のセラミド類似物質（ＬＣＢＦＡ−１、ＣｅｒＰＥ−１、ＣｅｒＸ−１等）についても同様に試験を行なったところ、それぞれにアポトーシス誘導作用のあることが確認された。
【００５１】
次に、実施例１で得たＬＣＢＦＡ−２を用いて、各種の化粧品を作製した。
（実施例２）
次に示す処方１にしたがって、油中水型のクリームを作製した。
〔処方１〕クリーム
配合成分 配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２ ０．１
（２）スクワラン ８．０
（３）ミリスチン酸オクチルドデシル １．０
（４）バチルアルコール ５．０
（５）ポリオキシエチレン（１０Ｅ．Ｏ．）硬化ヒマシ油 １．０
（６）モノステアリン酸ソルビタン ０．５
（７）防腐剤 適 量
（８）１、３−ブチレングリコール ５．０
（９）精製水 残 量
上記成分（１）〜（７）を混合し、７５℃で加熱溶解させて油相とする。これとは別に（８）（９）を混合した水相を加え乳化した。この後、撹拌しながら３０℃まで冷却し、クリームを得た。
【００５２】
（実施例３）
次に示す処方２にしたがって、化粧水を作製した。
〔処方２〕化粧水
配合成分 配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２ ０．１
（２）エタノール １０．０
（３）ポリオキシエチレン
ノニルフェニルエーテル（１０Ｅ．Ｏ．） ０．１
（４）グリセリン ２．０
（５）防腐剤 適 量
（６）精製水 残 量
上記成分（１）〜（３）を室温にて混合し、さらに、（４）〜（６）を混合溶解して、化粧水を得た。
【００５３】
（実施例４）
次に示す処方３にしたがって、乳液を作製した。
〔処方３〕乳液
配合成分 配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２ ０．１
（２）ステアリン酸 ２．０
（３）セタノール １．５
（４）スクワラン ５．０
（５）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（６）グリセリン ２．０
（７）１、３−ブチレングリコール ６．０
（８）水酸化ナトリウム ０．０３
（９）防腐剤 適 量
（１０）精製水 残 量
上記成分（１）〜（５）を混合し、７０℃で加熱溶解して油相とする。これとは別に（６）〜（１０）を混合溶解して、７０℃に加熱した水相に、前記油相を加え、ホモミキサーで均一に乳化した。その後、撹拌しながら３０℃まで冷却し、乳液を得た。
【００５４】
（実施例５）
次に示す処方４にしたがって、エッセンスを作製した。
〔処方４〕エッセンス
配合成分 配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２ ０．１
（２）エタノール １０．０
（３）グリセリン １０．０
（４）カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
（５）防腐剤 適 量
（６）精製水 残 量
上記成分（１）（２）を室温にて混合したのち、（３）〜（６）を添加撹拌して、エッセンスを得た。
【００５５】
（実施例６）
次に示す処方５にしたがって、ファンデーションを作製した。
〔処方５〕ファンデーション
配合成分 配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２ ０．１
（２）１、３−ブチレングリコール ５．０
（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム ０．１
（４）ケイ酸アルミニウムマグネシウム ０．５
（５）精製水 残 量
（６）黄酸化鉄 ０．０７
（７）黒酸化鉄 ０．０１
（８）ベンガラ ０．０２
（９）酸化チタン ５．０
（１０）タルク ４．０
（１１）ステアリン酸 ２．０
（１２）セタノール １．０
（１３）スクワラン ５．０
（１４）自己乳化型モノステアリン酸グリセリン ２．０
（１５）防腐剤 適 量
上記成分（１）〜（５）を混合し、７０℃で加熱溶解させた後、（６）〜（１０）を混合したものを加え、充分に撹拌し水相とする。この水相を、（１１）〜（１４）を混合溶解後、加熱し７０℃にした油相に加え、ホモミキサーで均一に乳化した。その後、撹拌しながら３０℃まで冷却し、ファンデーションを得た。
【００５６】
（実施例７）
次に示す処方６にしたがって、パックを作製した。
〔処方６〕パック
配合成分 配合量（重量％）
（１）ＬＣＢＦＡ−２ ０．１
（２）ポリビニルアルコール １０．０
（３）酢酸ビニル樹脂エマルジョン １０．０
（４）エタノール ５．０
（５）カオリン １５．０
（６）グリセリン １．０
（７）防腐剤 適 量
（８）精製水 残 量
上記成分（８）に（６）を混合した後、（３）及び（５）を添加し、更に（４）の一部に湿潤させた（２）を添加し、７０℃に加熱し溶解させた。次に残りの成分（４）に（１）及び（７）を加えて溶解したものを添加した後、冷却し、パックを得た。
【００５７】
【発明の効果】
本発明のアポトーシス誘導剤を用いることにより、細胞サイクルを制御することが可能になり、化粧品や外用剤などとして皮膚への塗布することによって、皮膚の新陳代謝を促進するなどの、細胞賦活化効果が期待できる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention relates to an apoptosis inducer. More specifically, the present invention relates to an apoptosis inducer that induces deep apoptosis related to cell metabolism and the like.
[0002]
[Prior art]
  Ceramide has a structure in which a fatty acid is acid amide-bonded to the amino group of sphingosine represented by the following formula 2, and a glycosphingolipid in which a sugar is glucoside-bonded to the hydroxyl group at the terminal of this ceramide, ethanolamine phosphate Are widely present in the animal and plant kingdoms as sphingophospholipids (sphingophospholipids in a narrow sense) or the like in which an ester bond is formed, or as free forms.

[0003]
  With regard to these ceramides, it has been found that they have a high moisturizing ability so far, and by adding one or more ceramides represented by the above formula 2 to a medicated external skin preparation or cosmetic, It has been reported that the water retention ability can be fundamentally improved, and the rough stratum corneum can be restored to the same level as that of a healthy person.
[0004]
  However, there have been many reports on the apoptosis-inducing action of ceramide produced by plants and animals, but there are very few bacteria that produce ceramide, and no reports have yet been made on ceramide produced from bacteria.
[0005]
  On the other hand, glycosphingolipids produced by bacteria have also been reported for B cell activation, but there are also no reports of apoptosis induction.
[0006]
  Apoptosis is an aspect of cell death of an individual, and is a concept that is contrasted with necrosis caused by physical and chemical factors. Necrosis generally involves cell expansion and then cell membrane. Shows the process of rupture and cell death.
[0007]
  Apoptosis, on the other hand, refers to cell death that occurs at the developmental stage of an individual. In this cell death, cells and nuclei condense and eventually the cells themselves become fragmented while incorporating the contents of the cells. The phenomenon of falling out of an individual. At present, this apoptosis is programmed to die in advance, and when it reaches a certain differentiation process, it is believed that it exerts its own apoptosis and kills itself. That is, in order to maintain the life of an individual, it is necessary not only to differentiate and proliferate the cells that make up the individual, but also to kill a specific cell at a specific time.
[0008]
  Therefore, it is considered that the metabolism of the skin can be promoted by inducing apoptosis of bacteria and viruses from the outside, prompting infection treatment from bacteria, or inducing apoptosis of skin epidermis cells. .
[0009]
  Therefore, the present inventors have conducted biochemical research and cytological research on immunopharmacological activity. As a result, it has been confirmed that ceramide-like substances isolated from bacteria, particularly sphingobacterium, have an apoptosis-inducing action. The headline and the present invention were completed.
[0010]
  The present invention has been made in view of the drawbacks of the above conventional examples, and an object thereof is to provide a novel and effective apoptosis inducer.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
  The apoptosis inducer of the present invention has the following formula 1

A ceramide-like substance represented by (in the formula 1, R₁The group is an acyl group, R₂Group is a saturated alkyl group, X is hydrogen, ethanolamine phosphate group, monosaccharide phosphate group,Inositol phosphate groupAny one of these. )Among them, the ceramide-like substance represented by any one of the above formulas 3 to 8It is characterized by consisting of.That is, the present invention uses a ceramide-like substance represented by any one of formulas 3 to 8 as an apoptosis inducer.
[0012]
  The ceramide-like substance represented by Formula 1 which is an apoptosis inducer of the present invention is a substance mainly produced by the genus Sphingobacterium, and by culturing a bacterium of the genus Sphingobacterium, It can be obtained mainly by producing the compound in the microbial cells and extracting from the microbial cells. For example, S.M. Spiritivorum, S.M. multivorum, S.M. versatilis, S. et al. The ceramide-like substance of the present invention can be obtained by culturing a bacterial species such as mitutae. Moreover, it is not restricted to these microbial species, It can obtain from other related bacteria, Flavobacterium, and other related bacteria.
[0013]
  Ceramide analogues obtained from these bacteria are in particular R₂A saturated alkyl group is bonded as a group. Until now, in ceramides in nature, most of them were unsaturated alkyl groups, as represented by sphingosine. However, in the present invention, for example, as represented by sphinganine (dihydrosphingosine), it is saturated. It has an alkyl group.
[0014]
  Moreover, in the conventional ceramide, R₁Group, R₂Both groups were mainly straight-chain alkyl groups,In the ceramide-like substance of the present invention, R ₁ Group, R ₂ Both groups have a branched chain, and are particularly characterized by being isoforms.
[0015]
  Furthermore, in the present invention, R₁A group having a hydroxyl group is preferable, and specifically, a 2-hydroxyacyl group in which a hydroxyl group is bonded to the carbon at the 2-position is desirable.
[0016]
  In the natural world, R₁In the group an acyl group having an even number of carbon atoms and R₂In general, the group has an odd number of carbon atoms (even number of carbon atoms up to the terminal hydroxyl group).The ceramide-like substance according to the present invention is R ₁ The group has an odd number of carbon atoms and R ₂ The group has an even number of carbon atoms.
[0017]
  Specifically, for example, the X group of Formula 1 is hydrogen

(Hereinafter referred to as “LCBFA-1”.)
Or ethanolamine phosphoric acid ester-bound as the X group of formula 1

  (Hereinafter referred to as “CerPE-1”.)
As shown in₁As a group, CH₃CH (CH₃) (CH₂)₁₀CH₂CO group (15 carbon atoms), R₂As a group, CH₃CH (CH₃) (CH₂)₁₁A group (14 carbon atoms) can be obtained.
[0018]
  Also, the X group of Formula 1 is hydrogen

  (Hereinafter referred to as “LCBFA-2”.)
Or ethanolamine phosphoric acid ester-bound as the X group of formula 1

  (Hereinafter referred to as “CerPE-2”.)
As shown in₁As a group, CH₃CH (CH₃) (CH₂)₁₀CH (OH) CO group (15 carbon atoms), R₂As a group, CH₃CH (CH₃) (CH₂)₁₁A group (14 carbon atoms) can be obtained.
[0019]
  Further, as monosaccharides of the ceramide-like substance of the present invention, glucose, mannose, fructoseEtc. AlsoFrom the genus Sphingobacteria, inositolJoinedFor example,

  (Hereinafter referred to as “CerX-1”.)
Or

  (Hereinafter referred to as “CerX-2”.)
As shown in Fig. 2, the phosphorylinositol derivative exhibits an excellent apoptosis-inducing action.
[0020]
  As a method for culturing Sphingobacteria that produces these ceramide-like substances, conventionally known synthetic and natural media can be used, and in particular, used for culturing bacteria belonging to the genus Sphingobacteria. Any medium can be used as long as it is a medium.
[0021]
  For example, as the growth carbon source, monosaccharides such as glucose, fructose and mannose, disaccharides such as sucrose and trehalose, and the like can be used. As the nitrogen source, for example, inorganic nitrogen compounds such as potassium nitrate, sodium nitrate, ammonium sulfate and ammonium phosphate, and organic nitrogen compounds such as peptone, meat extract and corn steep liquor can be used. In addition, sodium, potassium, calcium, zinc, magnesium, manganese, phosphoric acid and the like as inorganic salts, and various vitamins, amino acids, or yeast extract rich in them as growth factors are added as appropriate. Also good.
[0022]
  The pH of the medium is 5 to 9, particularly 7 to 7.5, and the culture temperature is 10 to 40 ° C, preferably 30 to 37 ° C. Cultivation is preferably performed under aerobic conditions in liquid culture or solid culture. In addition, the culture time is usually about 1 to 7 days.
[0023]
  In order to obtain the ceramide-like substance of the present invention from the thus obtained microbial cells, a usual method for collecting microbial components can be used. For example, the culture solution may be collected by centrifugation and then extracted with a solvent after adding an organic solvent. Specifically, the organic solvent is a mixture of chloroform and methanol, or a hydrophobic solvent such as chloroform or a hydrophilic solvent such as methanol or acetone, such as a mixture of chloroform and methanol or acetone. Use a good one.
[0024]
  Next, the extracted bacterial cell components are adsorbed on silica gel, molecular sieve, or the like, and then eluted with a solvent as described above for further purification. Then, using the difference in solubility in the solvent, the difference in ionic bond strength, etc., each by a single method, by appropriately combining two or more methods, or by repeating the same operation several times, similar to the ceramide of the present invention Substances and the like can be separated and purified as almost pure substances.
[0025]
  The purified ceramide-like substance can be used as it is, or can be used by diluting with an appropriate solvent or mixing with an appropriate excipient. Various ointments and skin preparations for external use can be used by conventional formulation means. Can be used. For example, it can be applied as various water / oil typified by cream, emulsion, etc., oil / water emulsified cosmetics, lipstick, foundation, skin cleanser, hair restorer and the like.
[0026]
  Moreover, as a ceramide-like substance, it is not necessary to extract from a microbial cell by the method mentioned above, and to refine | purify to a pure thing, and it is good also as using the mixture of various ceramide-like substances. The ceramide-like substance can be obtained in a state where substances having different carbon numbers are mixed, but it is not necessary to separate and purify substances having different carbon numbers. Furthermore, it may be used as a crudely purified bacterial cell extract to such an extent that toxicity is not exhibited and moderate apoptosis-inducing action is exhibited. Of course, a ceramide derivative may be obtained by synthesis, and when synthesized, a ceramide-like substance having high purity can be obtained.
[0027]
【Example】
  Examples of the present invention will be specifically described below, but the present invention is not limited to these.
  (Example 1)
  [Culture of bacterial cells]
  One platinum loop of S. spirivorum is picked, streaked onto a heart infusion flat agar medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and cultured at 30 ° C. for 2 days. One colony is picked from a petri dish that has been cultured for 2 days with a platinum loop, streaked onto a sloped agar medium of heart infusion, and cultured at 30 ° C. for 1 day. From this slant culture medium, 1 platinum loop of cultured cells was picked and inoculated into 200 ml of PYG (M, F) medium for culture having the following composition adjusted to pH 7.0 and shaken at 30 ° C. for 1-2 days. Pre-cultured by the culture method. 10 to 50 ml of this precultured bacterial solution (the amount of the liquid is appropriately adjusted according to the cell concentration of the precultured bacterial solution) is added to 1.5 L of PYG (M, F) medium having the same composition, and 1 to 30 ° C. Main culture was performed for 7 days.
[0028]
    [Composition of PYG (M, F) medium]
        ・ Polypepton (Nippon Pharmaceutical) 0.5%
        ・ Yeasttexttract (manufactured by DIFCO) 0.5%
        ・ Sugar (D (+)-Glucose,
                Wako Pure Chemicals) 1%
[0029]
  [Extraction and purification of ceramide-like substances]
  The cultured bacterial solution thus obtained is centrifuged at 7500 rpm for 30 minutes to collect bacterial cells. Next, a mixed solution of chloroform and methanol (2: 1 by volume) is added to the collected cells and subjected to ultrasonic treatment with an ultrasonic homogenizer for 15 minutes. This treated solution is transferred to a separatory funnel, water is added to separate into two layers, and the solvent phase is separated. And the fractionated solvent was concentrated with the evaporator and the lipid component was obtained.
[0030]
  Next, this lipid component is dissolved in a chloroform / methanol mixture (volume ratio 1: 2) adjusted to a potassium hydroxide concentration of 0.5 N, and shaken at 37 ° C. for 2 hours for hydrolysis (weak alkali). Hydrolyzate), and then neutralize the pH with sodium hydroxide to obtain an alkali-stable lipid.
[0031]
  Further, the obtained alkali-stable lipid was developed by thin layer chromatography and separated and purified. That is, the alkali-stable lipid was dissolved in a suitable solvent such as a small amount of chloroform and spotted on a preparative thin layer plate (made by UNIPLATE SILICA GEL G MERCK) made of silica gel. And it developed by the mixed liquid (volume ratio 100: 10: 5) of chloroform, methanol, and acetic acid. Next, each lipid portion separated on this thin layer plate is scraped off, and the silica gel thus scraped is filled in a glass column and eluted with a mixture of chloroform and methanol (volume ratio 3: 1), Repeat until there is a single spot on the thin layer chromatogram. Finally, the solvent was distilled off to obtain ceramide-like substances represented by CerFA-1 and CerFA-2.
[0032]
  In addition, the separated phospholipid part (part containing CerPE-1, CerPE-2, CerX-1 and CerX-2) is further mixed with chloroform, methanol, acetic acid and water (volume ratio 100: 20: 12: 5). ), Developed three times, scraped each component separated on the thin layer plate, packed the silica gel scraped off into a glass column, eluted with a mixture of chloroform and methanol (volume ratio, 2: 1), Repeat until there is a single spot on the thin layer chromatogram. Finally, the solvent was distilled off to obtain CerPE-1, CerPE-2, CerX-1, and CerX-2.
[0033]
  Next, the following tests were performed on the various ceramide-like substances thus obtained in order to confirm the effects of the present invention.
[0034]
  When detecting the apoptosis-inducing action, it is necessary to clarify the difference from necrosis, which is cell necrosis. As described above, the cells in which apoptosis is induced first shrink, the chromatin is condensed, and the condensed nucleus is fragmented. In addition, the microvilli on the cell surface disappear and become smooth, and the cell surface molecular marker responsible for the self-recognition mechanism is gradually lost. Furthermore, large and small protrusions appear on the cell surface and eventually fragment into apoptotic bodies. This apoptotic body is eventually removed by phagocytic cells such as macrophages in vivo.
[0035]
  Therefore, focusing on these phenomena, the ceramide-like substance of the present invention is added to human myeloid leukemia cells HL-60, and after several hours, it is detected whether apoptosis is induced. Experiments were conducted using the method.
[0036]
    [Analysis of cell morphology]
  First, an experiment was conducted using the ceramide-like substance obtained in the above example, LCBFA-2. LCBFA-2 was dissolved in a mixture of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1), the final concentration was 1.5 μg / ml, and HL-60 cells were 5 × 10 5.⁵It adjusted so that it might become a piece / ml. This was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 4 hours. Then, after centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is discarded. Again, the cells were suspended in a phosphate buffer at pH 7.1, and further washed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. Thereafter, the washed HL-60 cells were collected and fixed with 70% ethanol, and then these cells were analyzed by flow cytometry.
[0037]
  In this analysis, forward scatter (FSC) as an index indicating the size of a cell and side scatter (SSC) indicating a granule and a structural state inside the cell are used, and HL- by adding a ceramide-like substance (LCBFA-2) is used. The morphological change of 60 cells was observed. In addition, as a control, HL-60 cells were treated in the same manner using a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1) used as a diluent solvent for LCBFA-2. Was observed. The results are shown in FIGS. 1 (a) and 1 (b), respectively. For flow cytometry, FACScan manufactured by Becton Dickinson was used.
[0038]
  In each figure of FIG. 1, the vertical axis indicates the SSC intensity (SSC-Height) and the horizontal axis indicates the FSC intensity (FSC-Height). The larger the FSC intensity, the larger the cell size, and the higher the SSC intensity. It shows that the structural state of the cell is complex. Compared to FIGS. 1 (a) and 1 (b), the system with LCBFA-2 added (FIG. 1 (a)) has a lower FSC intensity than the control [FIG. 1 (b)]. It can be seen that the area is increasing and the cells are shrinking.
[0039]
    [Analysis of cell surface antigens]
  In cells in which apoptosis is induced, after the cells are fragmented as described above, the self-recognition marker on the cell surface disappears so that the cells are phagocytosed by the phagocytic cells. Next, in order to confirm this phenomenon, the expression level of the MHC class I molecule, which is a self-recognition marker, was analyzed using an antibody fluorescently labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC).
[0040]
  Similarly to the analysis of the above morphological change, LCBFA-2 was dissolved in a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1), and the final concentration of LCBFA-2 was 1.5 μg / ml, HL-60 cells. Is 5 × 10⁵It adjusted so that it might become a piece / ml. This was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 4 hours. Then, after centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is discarded. Again, the cells were suspended in a phosphate buffer at pH 7.1, and further washed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. Then, it measured with the flow cytometer. In addition, as a control, treatment was similarly performed using HL-60 cells to which a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1) used for dilution of LCBFA-2 was added, and cells in which the self-recognition marker disappeared were measured. did. The result is shown in FIG.
[0041]
  In FIG. 2, the horizontal axis represents the fluorescence intensity at a wavelength of 530 nm for detecting cells bound with FITC, and the vertical axis represents the number of cells (Counts). In the control, a single peak due to cells with almost the same fluorescence intensity appears, but when treated with the ceramide-like substance (LCBFA-2) of the present invention, the number of cells with low fluorescence intensity increases. It was confirmed that apoptosis was induced.
[0042]
  [Cell cycle analysis]
  In cultured cells established like HL-60, when the cell cycle is analyzed, cells in the S phase where DNA replication occurs, the M phase where cell division occurs, and the G0 / G1 phase and G2 phase cells between the two The ratio of becomes constant. Here, when apoptosis occurs, a constant cell cycle is disturbed. Therefore, the cell cycle was analyzed by staining cell DNA with propidium iodide.
[0043]
  Similarly to the analysis of the above morphological change, LCBFA-2 was dissolved in a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1), and the final concentration of LCBFA-2 was 1.5 μg / ml, HL-60 cells. Is 5 × 10⁵It adjusted so that it might become a piece / ml. This was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 4 hours. Then, after centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is discarded. Again, the cells were suspended in a phosphate buffer at pH 7.1, and further washed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. Then, after fixing with 70% cold ethanol, 50 μg / 1 aqueous propidium iodide solution was added, and analysis was performed using a flow cytometer after 10 minutes. Further, as a control, analysis was performed in the same manner using HL-60 cells to which a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1) used for dilution of LCBFA-2 was added. The result is shown in FIG.
[0044]
  In FIG. 3, the horizontal axis shows the fluorescence intensity at a wavelength of 585 nm for detecting cells bound with propidium iodide, which means the content of stained DNA present in the cells. The vertical axis indicates the number of cells (Counts). Normal cells show a fluorescence intensity distribution as shown in the control, but when apoptosis is induced, the cells deviate from the normal cell cycle, undergo nuclear fragmentation, and form nuclear bodies. The amount of DNA per cell stained by propidium decreases and the fluorescence intensity decreases.
[0045]
  As can be seen from FIG. 3, when LCBFA-2, which is an apoptosis inducer of the present invention, was added, many cells with a low DNA content were seen, and many cells deviated from the normal cell cycle. This decrease also shows that apoptosis was induced by LCBFA-2.
[0046]
  [Analysis of DNA fragmentation]
  In cells in which apoptosis is induced, DNA fragmentation occurs. Therefore, DNA was extracted from the cells and subjected to agarose gel electrophoresis to observe DNA fragmentation.
[0047]
  Similarly to the analysis of the above morphological change, LCBFA-2 was dissolved in a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1), and the final concentration of LCBFA-2 was 1.5 μg / ml, HL-60 cells. Is 5 × 10⁵It adjusted so that it might become a piece / ml. This was cultured at 37 ° C. in the presence of 5% carbon dioxide for 4 hours. Then, after centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes, the supernatant is discarded. Again, the cells were suspended in a phosphate buffer at pH 7.1, and further washed by centrifugation at 1000 rpm for 5 minutes. Thereafter, proteinase K was added and reacted overnight at 37 ° C., followed by extraction with phenol by a conventional method, and DNA was collected by ethanol precipitation. The recovered DNA was subjected to agarose gel electrophoresis and colored with ethidium bromide according to a conventional method. Further, as a control, analysis was performed in the same manner using HL-60 cells to which a mixed solution of ethanol and dodecane (volume ratio 49: 1) used for dilution of LCBFA-2 was added. The result is shown in FIG.
[0048]
  As shown in FIG. 4, in the control [FIG. 4 (a)], almost no DNA fragmentation was observed, but in the HL-60 cells [FIG. 4 (b)] treated with LCBFA-2, A ladder-like electrophoretic image composed of fragmented DNA was observed, and DNA fragmentation, which is a feature of apoptosis, was observed.
[0049]
  As can be seen from the above tests, it was confirmed that LCBFA-2 of the present invention has an apoptosis-inducing action.
[0050]
  In addition, other ceramide-like substances (LCBFA-1, CerPE-1, CerX-1, etc.) were tested in the same manner, and it was confirmed that each had an apoptosis-inducing action.
[0051]
  Next, various cosmetics were produced using the LCBFA-2 obtained in Example 1.
  (Example 2)
A water-in-oil type cream was prepared according to Formula 1 shown below.
  [Prescription 1] Cream
              Compounding ingredients Compounding amount (% by weight)
(1) LCBFA-2 0.1
(2) Squalane 8.0
(3) Octyldodecyl myristate 1.0
(4) Batyl alcohol 5.0
(5) Polyoxyethylene (10E.O.) hydrogenated castor oil 1.0
(6) Sorbitan monostearate 0.5
(7) Preservative appropriate amount
(8) 1,3-butylene glycol 5.0
(9) Residual amount of purified water
  The said components (1)-(7) are mixed, and it heat-dissolves at 75 degreeC and makes it an oil phase. Separately, an aqueous phase mixed with (8) and (9) was added and emulsified. Then, it cooled to 30 degreeC, stirring, and obtained the cream.
[0052]
  (Example 3)
A skin lotion was prepared according to Formula 2 shown below.
  [Prescription 2] Lotion
              Compounding ingredients Compounding amount (% by weight)
(1) LCBFA-2 0.1
(2) Ethanol 10.0
(3) Polyoxyethylene
          Nonylphenyl ether (10E.O.) 0.1
(4) Glycerin 2.0
(5) Preservative appropriate amount
(6) Residual amount of purified water
  The above components (1) to (3) were mixed at room temperature, and (4) to (6) were further mixed and dissolved to obtain a lotion.
[0053]
    (Example 4)
An emulsion was prepared according to the following formulation 3.
  [Prescription 3] Emulsion
              Compounding ingredients Compounding amount (% by weight)
(1) LCBFA-2 0.1
(2) Stearic acid 2.0
(3) Cetanol 1.5
(4) Squalane 5.0
(5) Self-emulsifying glyceryl monostearate 2.0
(6) Glycerin 2.0
(7) 1,3-butylene glycol 6.0
(8) Sodium hydroxide 0.03
(9) Preservative appropriate amount
(10) Residual amount of purified water
  The above components (1) to (5) are mixed and dissolved by heating at 70 ° C. to obtain an oil phase. Separately, (6) to (10) were mixed and dissolved, and the oil phase was added to the aqueous phase heated to 70 ° C. and uniformly emulsified with a homomixer. Then, it cooled to 30 degreeC, stirring, and obtained the emulsion.
[0054]
  (Example 5)
Essence was prepared according to the following formulation 4.
  [Prescription 4] Essence
              Compounding ingredients Compounding amount (% by weight)
(1) LCBFA-2 0.1
(2) Ethanol 10.0
(3) Glycerin 10.0
(4) Sodium carboxymethyl cellulose 0.1
(5) Preservative appropriate amount
(6) Residual amount of purified water
  The components (1) and (2) were mixed at room temperature, and then (3) to (6) were added and stirred to obtain an essence.
[0055]
  (Example 6)
A foundation was prepared according to Formula 5 shown below.
  [Prescription 5] Foundation
              Compounding ingredients Compounding amount (% by weight)
(1) LCBFA-2 0.1
(2) 1,3-butylene glycol 5.0
(3) Sodium carboxymethyl cellulose 0.1
(4) Aluminum magnesium silicate 0.5
(5) Residual amount of purified water
(6) Yellow iron oxide 0.07
(7) Black iron oxide 0.01
(8) Bengala 0.02
(9) Titanium oxide 5.0
(10) Talc 4.0
(11) Stearic acid 2.0
(12) Cetanol 1.0
(13) Squalane 5.0
(14) Self-emulsifying glyceryl monostearate 2.0
(15) Preservative appropriate amount
  After mixing said component (1)-(5) and making it heat-dissolve at 70 degreeC, what mixed (6)-(10) is added and fully stirred and it is set as an aqueous phase. This aqueous phase was added to the oil phase heated to 70 ° C. after mixing and dissolving (11) to (14), and uniformly emulsified with a homomixer. Then, it cooled to 30 degreeC, stirring, and obtained the foundation.
[0056]
  (Example 7)
A pack was prepared according to the following formulation 6.
  [Prescription 6] Pack
              Compounding ingredients Compounding amount (% by weight)
(1) LCBFA-2 0.1
(2) Polyvinyl alcohol 10.0
(3) Vinyl acetate resin emulsion 10.0
(4) Ethanol 5.0
(5) Kaolin 15.0
(6) Glycerin 1.0
(7) Preservative appropriate amount
(8) Remaining amount of purified water
  (6) is mixed with the above component (8), (3) and (5) are added, and (2) wetted in part of (4) is added, and heated to 70 ° C. to dissolve. It was. Next, the remaining component (4) was dissolved by adding (1) and (7), and then cooled to obtain a pack.
[0057]
【The invention's effect】
  By using the apoptosis-inducing agent of the present invention, it becomes possible to control the cell cycle, and when applied to the skin as a cosmetic or external preparation, cell activation effects such as promoting the metabolism of the skin are achieved. I can expect.

Claims (1)

次の式３〜８のいずれかで示されるセラミド類似物質からなることを特徴とするアポトーシス誘導剤。
【式３】

【式４】

【式５】

【式６】

【式７】

【式８】

An apoptosis inducer comprising a ceramide-like substance represented by any one of the following formulas 3 to 8.
[Formula 3]

[Formula 4]

[Formula 5]

[Formula 6]

[Formula 7]

[Formula 8]

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