JP3734262B2

JP3734262B2 - 血管内皮細胞増殖因子阻害剤

Info

Publication number: JP3734262B2
Application number: JP52104194A
Authority: JP
Inventors: ケンドール，リチヤード・エル; トーマス，ケネス・エイ・ジユニアー
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1993-03-25
Filing date: 1994-02-25
Publication date: 2006-01-11
Anticipated expiration: 2021-01-11
Also published as: AU6393494A; IL109016A0; US5712380A; EP0694042A1; DE69434115T2; US5861484A; WO1994021679A1; US7071159B2; ATE281469T1; EP0694042A4; EP0694042B1; CA2158745C; CA2158745A1; IL109016A; US20090247460A1; US20030120038A1; PT694042E; ES2230542T3; AU684498B2; US20070010442A1

Description

発明の背景
血管内皮細胞に対する選択性を有する新種の細胞由来二量体マイトジェンが最近同定され、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と命名された。ＶＥＧＦは、マウス神経膠腫細胞のならし増殖培地［Ｃｏｎｎら，（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７，ｐｐ２６２８−２６３２］、ウシ下垂体小胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌｏ）星状細胞のならし増殖培地［Ｆｅｒｒａｒａ及びＨｅｎｚｅｌ，（１９８９），Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１，ｐｐ．８５１−８５８；Ｇｏｚｐａｄｏｒｏｗｉｃｚら、（１９８９），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６，ｐｐ．７３１１−７３１５］、及びヒトＵ９３７細胞のならし増殖培地［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．Ｔ．ら，（１９８９），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６，ｐｐ．１３０９−１３１２］から精製された。ＶＥＧＦは見掛け分子量約４６ｋＤａの二量体であり、各サブユニットの見掛け分子量が約２３ｋＤａである。ＶＥＧＦは、結合組織細胞のマイトジェンであるが大血管の血管内皮細胞のマイトジェンではない血小板由来因子増殖（ＰＤＧＦ）に幾らか類似した構造を有する。
ＦＬＴとして知られている膜結合チロシンキナーゼ受容体は、ＶＥＧＦ受容体であることが判明した［ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｃ．ら，（１９９２），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５，ｐｐ．９８９−９９１］。ＦＬＴ受容体はＶＥＧＦと特異的に結合して有糸***生起を誘発する。ＫＤＲと称する別の形態のＶＥＧＦ受容体も、ＶＥＧＦと結合して有糸***生起を誘発することが知られている。ＫＤＲの部分的ｃＤＮＡ配列及びほぼ全長に及ぶタンパク質配列も知られている［Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら，（１９９１）Ｏｎｃｏｇｎｅ６，ｐｐ．１６７７−１６８３；Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７，ｐｐ．１５７９−１５８６］。
継続性血管形成は、ある種の疾病、例えば乾癬、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症及び血管新生性緑内障を引き起こすか又は悪化させ得る。ＶＥＧＦ活性阻害剤は、この種の疾病、並びに他のＶＥＧＦに起因する異常血管形成及び血管浸透性状態（ｖａｓｃｕｌａｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）、例えば腫瘍血管化（ｔｕｍｏｒｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）の治療に有用であろう。
発明の概要
血管内皮細胞から天然のＦＬＴメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を同定し、クローニングした。このｍＲＮＡは、ＶＥＧＦ受容体ＦＬＴの細胞外又は可溶性部分の大半をコードすることが判明している。このＶＥＧＦ受容体及び別のＶＥＧＦ受容体について、Ｃ末端トランスメンブラン領域含有形態を含む可溶性受容体分子も、組換え操作で形成される。切頭形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｆｏｒｍ）及び改変形態（ｍｏｄｉｆｉｅｄｆｏｒｍ）を含むこれらの可溶性受容体は、組換え宿主細胞内で発現され、ＶＥＧＦ結合特性を有する。可溶性受容体タンパク質は、存在するＶＥＧＦに結合して、該ＶＥＧＦが血管内皮細胞上の機能受容体を活性化するのを阻止し、且つ完全な長さの膜固定ＶＥＧＦ受容体との間で非機能的ヘテロダイマーを形成し得るため、ＶＥＧＦ活性阻害剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、完全長ＶＥＧＦ受容体（ＦＬＴ及びＫＤＲ）、可溶性ＶＥＧＦ受容体（ｓＶＥＧＦ−ＲＩ及びｓＶＥＧＦ−ＲＩI）及びＣ末端トランスメンブラン領域含有可溶性受容体（ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭI及びｓＶＥＧＦ−ＲＴＭII）を各々のタンパク質領域と共に簡単に示す説明図である。
第２図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩ可溶性ＶＥＧＦ受容体／ＶＥＧＦ阻害剤のＤＮＡ配列の説明図である。
第３図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩ可溶性ＶＥＧＦ受容体／ＶＥＧＦ阻害剤のアミノ酸配列の説明図である。
第４図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩと［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦとの高分子量複合体が形成され、サイズ排除クロマトグラフィーによって分離されたことにより、組換え宿主細胞がｓＶＥＧＦ−ＲＩを発現することを実証する説明図である。
第５図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩについて高い純度が得られることを明らかにする１２．５％ポリアクリルアミド電気泳動ゲルの説明図である。
第６図は、約１４５ｋＤａ及び約２４５ｋＤａｓのＶＥＧＦ−ＲＩと［¹²⁵I］ＶＥＧＦとの架橋生成物を示す説明図である。
第７Ａ図及び第７Ｂ図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩへのＶＥＧＦ結合の分析（Ａ）及び対応するスキャッチャードプロット（Ｂ）の説明図である。
第８図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩによるＨＵＶＥＣへの［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦ結合の阻止を示す説明図である。
第９図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩを使用した場合のＨＵＶＥＣ上でのＶＥＧＦ仲介有糸***生起の阻止を示す説明図である。
第１０図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩIをコードするヌクレオチド配列の説明図である。
第１１図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩIのアミノ酸配列の説明図である。
第１２図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIIをコードするヌクレオチド配列の説明図である。
第１３図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIIのアミノ酸配列の説明図である。
第１４図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIをコードするヌクレオチド配列の説明図である。
第１５図は、ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIのアミノ酸配列の説明図である。
第１６図は、ｐｍＦＬＴを示す説明図である。
第１７図はｐＫＤＲＡを示す説明図である。
発明の詳細な説明
本発明は、ＶＥＧＦ受容体産生細胞から単離されるか、又はＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡから組換え操作によって作られる可溶性ＶＥＧＦ受容体タンパク質（ｓＶＥＧＦ−Ｒ）をコードするｃＤＮＡに関する。本明細書中のｓＶＥＧＦ−Ｒとは、血管内皮細胞の有糸***生起を刺激せずに血管内皮細胞増殖因子に特異的に結合できるタンパク質を意味する。
ＦＬＴのアミノ酸配列は公知であり［Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍら，（１９９０），Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，５，ｐｐ．５１９−５２４］、完全長細胞結合ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体に対応する。別のＶＥＧＦ受容体も存在することが知られている。別の公知のＶＥＧＦ受容体の非限定的具体例としては、ＫＤＲが挙げられる［Ｔｅｒｍａｎ（１９９１）、前出文献、及びＴｅｒｍａｎ（１９９２）、前出文献］。ＦＬＴ、ＫＤＲ及び他のＶＥＧＦ受容体を産生することができる哺乳動物細胞の非限定的具体例としては、血管内皮細胞が挙げられる。ＦＬＴ、ＫＤＲ及び他のＶＥＧＦを産生する哺乳動物細胞系の非限定的具体例としては、ヒト内皮細胞が挙げられる。本発明における好ましい細胞としては、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）が挙げられる。
別の細胞及び細胞系も、ｓＶＥＧＦ−ＲｃＤＮＡの単離に使用するのに適当であり得る。適当な細胞の選択は、細胞抽出物もしくはならし培地中での細胞表面のｓＶＥＧＦ−Ｒ結合活性に関するスクリーニング、又はＰＣＲもしくはハイブリダイゼーションによる遺伝子発現に関するスクリーニングによって実施し得る。可溶性受容体活性の検出方法は当業界でよく知られており［Ｄｕａｎ，Ｄ−Ｓ．Ｒ．ら，（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６，ｐｐ．４１３−４１８］、標識ＶＥＧＦの結合の尺度となっている。このアッセイでＶＥＧＦ結合活性を示す細胞は、ｓＶＥＧＦ−ＲｃＤＮＡの単離に適当なものであり得る。
ヒトＨＵＶＥＣ細胞（ＡｍｅＲＩｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＡＴＣＣＣＲＬ１７３０）［Ｈｏｓｈｉ，Ｈ．及びＭｃＫｅｅｈａｎ，Ｗ．Ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８４）８１，ｐｐ．６４１３−６４１７］のような完全長ＦＬＴ産生細胞を、ＡＴＣＣの推奨培養条件に従って増殖させる。完全長ＦＬＴ及びＫＤＲＶＥＧＦ受容体、並びに細胞外領域（ｓＶＥＧＦ−ＲＩ及びｓＶＥＧＦ−ＲＩI）及び細胞外領域＋トランスメンブラン領域形態（ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭI及びｓＶＥＧＦ−ＲＴＭII）を第１図に示す。完全長受容体は、約７個の免疫グロブリン様領域とメンブラン間にまたがる配列（トランスメンブラン領域）と細胞内チロシンキナーゼ領域とからなる細胞外リガンド結合領域を有する。本発明の対象であるこの受容体の阻害性形態（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｆｏｒｍ）も第１図に示した。これらの形態は細胞内キナーゼ領域を欠失しており、ある阻害形態は、トランスメンブラン配列とＣ末端の最もＩｇに類似した細胞外領域とを欠失している。
ｓＶＥＧＦ−ＲｃＤＮＡの分子的クローニングには、種々の方法のうちの任意のものを使用し得る。これらの方法の非限定的具体例としては、適当な発現ベクター系内でｓＶＥＧＦ−Ｒ含有ｃＤＮＡライブラリーを構築した後ｓＶＥＧＦ−Ｒ遺伝子を直接機能的に発現させる方法が挙げられる。
別の方法として、ｓＶＥＧＦ−Ｒの推定アミノ酸配列に基づいて設計した標識オリゴヌクレオチドプローブを用いて、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したｓＶＥＧＦ−Ｒ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法もある。好ましい方法は、完全長ＦＬＴタンパク質の少なくとも一部分をコードする部分的ｃＤＮＡを用いて、バクテリオファージ又はプラスミドシャトルベクター内で構築したｓＶＥＧＦ−Ｒ含有ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることからなる。前記部分的ｃＤＮＡは、完全長ＦＬＴをコードするＤＮＡの既知の配列に基づくオリゴヌクレオチドプライマーの設計を介するｓＶＥＧＦ−ＲＤＮＡフラグメントの特異的ＰＣＲ増幅によって得られる。
当業者には容易に理解されるように、別の種類のライブラリー、並びに別の細胞もしくは細胞型から構築したライブラリーも、ｓＶＥＧＦ−ＲをコードするＤＮＡの単離に有用であり得る。別の種類のライブラリーの非限定的具体例としては、ＨＵＶＥＣ及びゲノムＤＮＡライブラリー以外の別の細胞又は細胞系に由来するｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
当業者には明らかなように、適当なｃＤＮＡライブラリーは、ｓＶＥＧＦ−Ｒ活性を有する細胞又は細胞系から形成し得る。ｓＶＥＧＦ−ＲｃＤＮＡを単離するためのｃＤＮＡライブラリーの製造に使用する細胞又は細胞系の選択は、本明細書で詳述するＶＥＧＦ結合アッセイを用いてまず分泌ｓＶＥＧＦ−Ｒ活性を測定することにより実施し得る。
ｃＤＮＡライブラリーの製造は、当業者によく知られている標準的方法によって実施できる。よく知られたｃＤＮＡライブラリー構築方法は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）に記載されている。
これもまた当業者には明らかなことであるが、ｓＶＥＧＦ−ＲをコードするＤＮＡは、適当なゲノムＤＮＡライブラリーからも単離し得る。ゲノムＤＮＡライブラリーの構築は、当業者に公知の標準的方法によって実施できる。公知のゲノムｃＤＮＡライブラリー構築方法は、例えばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２）に記載されている。
ｓＶＥＧＦ−Ｒ分子を得るための別の方法は、ＶＥＧＦ受容体の部分的又は完全アミノ酸配列をコードするＤＮＡから組換え操作によって前記分子を形成することからなる。別のＶＥＧＦ受容体の非限定的具体例としてはＫＤＲが挙げられる。組換えＤＮＡ技術を用いて、有糸***生起を刺激せずにＶＥＧＦと結合することができるＶＥＧＦ受容体の少なくとも一部分をコードするＤＮＡ分子を構築する。前出のＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らの文献に記載のような標準的組換えＤＮＡ技術を使用する。
本発明の好ましい方法のうちの一つを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をベースとする手法とｃＤＮＡライブラリースクリーニングとを用いる２段階方法で、ｓＶＥＧＦ−ＲをコードするｃＤＮＡクローンを単離する。第一段階では、既知の完全長ＦＬＴ、ＫＤＲ又は他のＶＥＧＦ受容体に基づく細胞外領域配列情報に由来するＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いて、ｓＶＥＧＦ−Ｒ特異的ＤＮＡフラグメントの増幅のための退化オリゴヌクレオチドプライマーを設計する。第二段階では、前記フラグメントをクローニングして、ＨＵＶＥＣ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１７３０）に由来する市販のλｇｔ１０ｃＤＮＡラムダ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から完全ｓＶＥＧＦ−ＲｃＤＮＡを単離するためのプローブとして使用する。
これらのＰＣＲ産物を、ＨＵＶＥＣ由来のλｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）をスクリーニングするためのハイブリダイゼーションプローブとして使用した。ライブラリーのプレーティング及びプラークリフトは標準的方法で実施した（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８２））。プローブを³²Ｐ−ｄＣＴＰで高特異的活性までランダム感作（ｒａｎｄｏｍ−ｐｒｉｍｅｄ）標識し、各プローブごとにライブラリーのスクリーニングを実施した（スクリーン当たり１×１０⁶プラーク）。プローブをハイブリダイゼーション緩衝液（５０％ホルムアミド、５×デンハーツ、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸Ｎａ₃・２Ｈ₂Ｏ、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡ）に１×１０⁶ｃｐｍ／ｍｌで加えた。
４個の確実にハイブリダイズするファージを、ｆｌｔ特異的プローブを用いて検出した。これらの確実にハイブリダイズするファージは、完全長ｆｌｔより短いことが観察された。
長さ約２．０ｋｂ及び２．７ｋｂの二つのｆｌｔｃＤＮＡクローンをｐＧＥＭベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にサブクローニングし、連鎖締結法（Ｓａｎｇｅｒら，（１９７７）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，７４，ｐｐ．５４６３−５４６７）によって全体を双方向から配列決定したところ、アミノ酸約５６９個の単一読取り枠を含んでいた。配列分析の結果、これらのクローンは５’ｆｌｔコード領域の一部を欠失していた。５’末端の残りをＰＣＲでクローニングし、５’末端欠失クローンのＤＮＡと組合わせて、アミノ酸約６８７個の単一読取り枠を得た。
ｆｌｔ由来ｓＶＥＧＦ−ＲＩをコードするｃＤＮＡの配列を表１に示す。この配列はクローン７及び１１で同定された。クローン化ｃＤＮＡに基づくｓＶＥＧＦ−ＲＩの推定アミノ酸配列を表２に示す。該推定アミノ酸配列を見ると、アミノ酸約６８７個の大きな単一読取り枠の存在が明らかになった。完全長ＦＬＴＶＥＧＦ受容体のアミノ酸配列と比較すると、ＦＬＴのそれとは異なる３１個のアミノ酸が、ｃＤＮＡのＣ末端においてコードされる。
本発明の別の好ましい方法を使用して、ＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡ配列から、ｓＶＥＧＦ−ＲをコードするＤＮＡを構築する。説明を分かりやすくするために、ＫＤＲとして知られているＶＥＧＦ受容体をコードするＤＮＡを使用した。受容体ＤＮＡ配列を用いて、受容体の細胞外領域又はＶＥＧＦ結合領域のみをコードするＤＮＡ分子を構築し、ｓＶＥＧＦ−ＲＩIと名付ける。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を受容体ＤＮＡ内で同定し、細胞外コーディング部分の切断に直接使用することができる。また、前述のＰＣＲ技術を使用して所望のＤＮＡ部分を製造し得る。当業者には明らかなように、当業界で標準的な別の技術を使用して、前述の方法と類似の方法でｓＶＥＧＦ−Ｒ分子を製造し得る。この種の技術は、例えば前出のＭａｎｉａｔｉｓらの文献に記載されている。
トランスメンブラン領域を含む、ＶＥＧＦ受容体の別の切頭形態を構築する。トランスメンブランの保持は、標的細胞表面での阻害性分子の配向を容易にし得る。トランスメンブラン領域含有阻害性分子の非限定的具体例としては、第１図に示すものが挙げられる。第１図に示すようなｓＶＥＧＦ−ＲＴＭＩ及びｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIIはそれぞれＦＬＴ関連及びＫＤＲ関連のトランスメンブラン領域含有受容体阻害剤である。ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭＩ及びｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIIのようなトランスメンブラン領域含有分子の構築は、当業界で公知の標準的方法、例えば非限定的具体例として一般的な制限エンドヌクレアーゼ開裂部位又は本明細書に記載のＰＣＲ技術の使用により実施する。当業者には容易に理解されるように、細胞外領域のみを含むか又はトランスメンブラン領域をも含む本明細書に記載の種々の形態のＶＥＧＦ受容体阻害剤は、実質的に同じ活性を有するように構築し得る。
前述の方法で得たクローン化ｓＶＥＧＦ−ＲｃＤＮＡは、適当なプロモーターと別の適当な転写調節エレメントとを含む発現ベクター中への分子クローニングによって組換え操作で発現させ得、原核又は真核宿主細胞中にトランスファーして組換えｓＶＥＧＦ−Ｒを産生し得る。この種の操作を行うための技術は前出のＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．らの文献に記載されており、当業界でよく知られている。
本明細書では、発現ベクターは、遺伝子のクローン化コピーの転写と、適当な宿主内での遺伝子のｍＲＮＡの翻訳とに必要なＤＮＡ配列であると定義される。この種のベクターは、細菌、ラン藻、真菌細胞、酵母細胞、植物細胞、昆虫細胞及び動物細胞といった種々の宿主内で真核生物遺伝子を発現するのに使用できる。
特異的に設計したベクターは、細菌−酵母又は細菌−動物又は細菌−昆虫細胞のような宿主間のＤＮＡシャトリングを可能にする。適当に構築した発現ベクターは、宿主細胞内での自己複製の複製起点と、選択可能マーカーと、限定数の有用な制限酵素部位と、高コピー数の可能性と、活性プロモーターとを有していなければならない。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを制御してＤＮＡと結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列であると定義される。強力なプロモーターとは、ｍＲＮＡを高頻度でイニシエートさせるプロモーターである。発現ベクターの非限定的具体例としては、クローニングベクター、改変クローニングベクター、特異的に設計したプラスミド又はウィルスが挙げられる。
哺乳動物細胞内で組換えｓＶＥＧＦ−Ｒを発現させるためには種々の哺乳動物発現ベクターを使用し得る。組換えｓＶＥＧＦ−Ｒの発現に適当であり得る市販の哺乳動物発現ベクターの非限定的具体例としては、ｐＭＣ１ｎｅｏ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ＥＢＯ−ｐＳＶ２−ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７５９３）、ｐＢＰＶ−１（８−２）（ＡＴＣＣ３７１１０）、ｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅｏ（３４２−１２）（ＡＴＣＣ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣＣ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１９８）、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ３７４６０）及びｇＺＤ３５（ＡＴＣＣ３７５６５）が挙げられる。
ｓＶＥＧＦ−ＲをコードするＤＮＡを、組換え宿主細胞内での発現のために、発現ベクター中にクローニングしてもよい。組換え宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞、非限定的具体例として例えば細菌、酵母、哺乳動物細胞、例えばヒト、ウシ、ブタ、サル及び齧歯類動物由来の細胞系、並びに昆虫細胞、例えばショウジョウバエ、蛾、蚊及びアワヨトウ由来の細胞系が挙げられる。適当であり得る市販の哺乳動物種由来細胞系の非限定的具体例としては、ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣＣＣＬ６１）、３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＣＬ９２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣＣＣＬ２）、Ｃ１２７Ｉ（ＡＴＣＣＣＲＬ１６１６）、ＢＳ−Ｃ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ２６）及びＭＲＣ−５（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１）が挙げられる。適当であり得る市販の昆虫細胞系の非限定的具体例としては、３Ｍ−Ｓ（ＡＴＣＣＣＲＬ８８５１）、蛾（ＡＴＣＣＣＣＬ８０）、蚊（ＡＴＣＣＣＣＬ１９４及び１９５；ＡＴＣＣＣＲＬ１６６０及び１５９１）並びにアワヨトウ（Ｓｆ９、ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１）が挙げられる。
発現ベクターは、非限定的具体例として例えば形質転換、トランスフェクション、リポソームもしくは原形質体融合及び電気穿孔法といったような多数の方法のうち任意のものを用いて宿主細胞中に導入し得る。発現ベクター含有細胞を同種増殖させ、個々に分析して、ｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質を産生するか否かを調べた。ｓＶＥＧＦ−Ｒ発現宿主細胞クローンの同定は、幾つかの方法、例えば非限定的具体例として、抗ｓＶＥＧＦ−Ｒ抗体に対する免疫学的反応性、放射性標識したＶＥＧＦへの結合、及び宿主細胞分泌ｓＶＥＧＦ−Ｒ活性の存在によって実施し得る。
ｓＶＥＧＦ−ＲＤＮＡの発現は、ｉｎｖｉｔｒｏ産生合成ｍＲＮＡを使用して実施してもよい。合成ｍＲＮＡは、種々の無細胞系、例えば非限定的具体例としてコムギ胚芽抽出物及び網状赤血球抽出物中で効率的に翻訳できると共に、細胞をベースとする系、例えば非限定的具体例としてカエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションにより効率的に翻訳できる。好ましいのはカエル卵母細胞中へのマイクロインジェクションである。
宿主細胞によって産生されるｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質の量は、イムノアフィニティ及び／又はリガンドアフィニティ技術によって定量し得る。ｓＶＥＧＦ−Ｒ特異的アフィニティビーズ又はｓＶＥＧＦ−Ｒ特異的抗体を用いて、³⁵Ｓ−メチオニン標識又は非標識ｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質を単離する。標識ｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。非標識ｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質は、ｓＶＥＧＦ−Ｒ特異的抗体を用いるウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡもしくはＲＩＡアッセイ、又は標識ＶＥＧＦでのリガンドブロッティングにより検出する。
組換え宿主細胞内でのｓＶＥＧＦ−Ｒの発現後にｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質を回収し、有糸***生起を刺激せずにＶＥＧＦに結合することができる活性形態のｓＶＥＧＦ−Ｒを取得し得る。幾つかのｓＶＥＧＦ−Ｒ精製手順が存在し、適当なものとして使用できる。ｓＶＥＧＦ−Ｒは、塩分画、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイト吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、ＶＥＧＦリガンドアフィニティクロマトグラフィー及び疎水性相互作用クロマトグラフィーを様々に組み合わせて、又は個々に適用して、細胞溶解物及び抽出物、又はならし培養培地から精製し得る。
また、組換えｓＶＥＧＦ−Ｒは、完全長ｓＶＥＧＦ−Ｒ又はｓＶＥＧＦ−Ｒのポリペプチドフラグメントに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体で形成した免疫アフィニティカラムを使用して、他の細胞タンパク質と分離することができる。
ｓＶＥＧＦ−ＲＩの同定
ＶＥＧＦ受容体ｃＤＮＡ（ｆｌｔ）をクローニングするために、第１図に示すような該受容体の膜結合又は完全長形態の細胞外領域に由来するＤＮＡプローブでＨＵＶＥＣ λｇｔ１０ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。合計１×１０⁶プラークのスクリーニングから、いずれも種々の長さの５’コード配列を欠失している４個の不完全クローンが単離された。これらの単離体のうちの二つは、完全長ｆｌｔと共通する部分的クローンを表し、そのうちの一つは、前出のＳｈｉｂｕｙａらの文献に記載の形態の完全３’コード領域を含んでいた。残りの二つのクローンは塩基番号２２１９までは完全長ｆｌｐと同じであったが（表１及び第２図参照）、そこから先は完全長ｆｌｐと異なっていた。これらのクローン（クローン７及び１１）は、ＴＡＡコドンによって読取り枠が終結されるまでに、更に別の３１個の別のアミノ酸をコードしていた（表２及び第３図参照）。
クローン７及び１１は、１２個の推定Ｎ結合グリコシル化部位を含む予想分子量約７５ｋＤａのタンパク質をコードした。このタイプの受容体は、トランスメンブラン及び細胞内キナーゼ領域を欠失しており、従ってＶＥＧＦ受容体の天然の可溶性形態（ｓＶＥＧＦ−ＲＩ）をコードした。また、ｓＶＥＧＦ−ＲＩによって予想されたタンパク質分子は最初の６個のＩｇ様領域のみを有し、トランスメンブラン配列に最も近い領域を欠失している（第１図）。ｓＶＥＧＦ−ＲＩのＣ末端の３１個のアミノ酸は２個のシステイン残基を含むが、Ｉｇ領域に類似していない。
Ｓｆ９細胞内でのｓＶＥＧＦ−ＲＩの発現
前記受容体の前記形態の結合特性及び生物学的特性を分析するために、バキュロウイルス発現系を用いてタンパク質を発現させた。クローン７は、５’末端で約３５０塩基対のコード配列を欠失していた。この領域を、実施例１にも記載の前述のプライマーを用いるＰＣＲでクローニングした。５’ＰＣＲフラグメントを、ＳａｃＩ部位で重複するｓＶＥＧＦ−ＲＩクローン７と組合わせることにより、ｓＶＥＧＦ−ＲＩの完全コード領域を含むクローンを構築した。次いで、５’ＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変え、完全長ｓＶＥＧＦ−ＲＩをＢａｍＨＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＢｌｕｅｂａｃIII（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングした。次いで、ポリヘドリンプロモーターに対して３’のｓＶＥＧＦ−ＲＩ遺伝子を含む組換えバキュロウイルスＰ−３ストックを本明細書に記載の方法で製造した。
小規模感染の培養培地を、［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦとの高分子量複合体を形成する能力について調べた。標識リガンドと、バキュロウイルス感染細胞の培養培地とを一緒にしてインキュベートした。次いで、サイズ排除クロマトグラフィーで反応を分析した。野生型感染培養培地を放射性リガンドと混合した時には（第４図）、単一の放射性ピークが観察された。しかしながら、ｓＶＥＧＦ−ＲＩ感染培養培地を使用した時は、高分子量複合体が形成された。これは、カラムのボイボリュームの近傍で溶離するこの反応で第二のピークが出現したことから明らかである。この実験は、ＦＬＴＶＥＧＦ受容体の天然可溶性形態ｓＶＥＧＦ−ＲＩが、ＶＥＧＦとの間で高分子量複合体を形成することを明らかにした。
組換え操作によって産生したｓＶＥＧＦ−Ｒを、ｓＶＥＧＦ−Ｒタンパク質に特異的に結合するヘパリン−セファロースカラムクロマトグラフィーを用いて、組換え宿主細胞抽出物又は細胞培養液から精製する。ヘパリン−セファロース結合ＶＥＧＦ−Ｒカラムを、ｓＶＥＧＦ−Ｒの大きな損失を伴わずに汚染タンパク質を除去する０．１Ｍ〜０．６ＭのＮａＣｌを含む適当な緩衝液を用いて洗浄する。約１ＭのＮａＣｌを含む適当な緩衝液を用いて、ｓＶＥＧＦ−Ｒをヘパリン−セファロースカラムから溶離すると、実質的に純粋なｓＶＥＧＦ−Ｒが得られる。
ＶＥＧＦへのｓＶＥＧＦ−ＲＩの結合
ｓＶＥＧＦ−ＲＩへの¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦの結合は、架橋と、９６ウェルプレートに吸収されたｓＶＥＧＦ−ＲＩとの間の複合体の形成とにより解析された。
架橋生成物は第６図に示す。ｓＶＥＧＦ−ＲＩは、非標識ＶＥＧＦの存在下（レーン２）及び非標識ｂＦＧＦの存在下（レーン３）で［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦに架橋した。（レーン１）。ｓＶＥＧＦ−ＲＩ及び［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦ含有反応、並びにｓＶＥＧＦ−ＲＩ及び［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦ＋過剰非標識ｂＦＧＦ反応で、二つの高分子量バンド（約１４５ｋＤａ及び２４５ｋＤａ）が形成された。これら二つの高分子量バンドは、ｓＶＥＧＦ−ＲＩを［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦ＋過剰非標識ＶＥＧＦと共にインキュベートした時には存在しなかった。これは、ＶＥＧＦに対するｓＶＥＧＦ−ＲＩの特異性と、ｓＶＥＧＦ−ＲＩが二量体を形成する能力とを示すものである。１４５ｋＤａバンドはおそらく、一つの受容体分子（約１００ｋＤａ）とＶＥＧＦ二量体（約４６ｋＤａ）とを含む架橋複合体である。第６図に示すように、二つの受容体分子（約２４５ｋＤａ）を含む複合体も観察された。これは、各ＶＥＧＦ二量体が１個又は２個の受容体分子と結合でき、ＶＥＧＦ受容体の可溶性形態がリガンド誘発二量体化（ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄｄｉｍｅｒｉＲＩｚａｔｉｏｎ）にかけられ得ることを示唆するものである。
９６ウェルプレートの表面にｓＶＥＧＦ−ＲＩを吸収させ、次いで非特異的部位を０．５％ゼラチンでブロックすることにより、ＶＥＧＦに対するｓＶＥＧＦ−ＲＩの親和性を評価した。各ウェルに種々の量の標識リガンドを加えた。結果は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩが、約２０ｐＭの見掛けＫｄで大きな親和性をもってＶＥＧＦに結合することを示している（第７図）。該受容体の可溶性形態はトランスメンブランにまたがる領域に最も近いＩｇ領域を欠失していることから、この領域はリガンド結合に必要なものではない。
培養ＨＵＶＥＣを［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦ及び種々の量のｓＶＥＧＦ−ＲＩと共にインキュベートすることにより、ｓＶＥＧＦ−ＲＩがＨＵＶＥＣへのＶＥＧＦの結合を阻止することを明らかにする。前記インキュベーション後に、細胞を洗浄して非結合［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦを除去する。次いで、細胞を可溶化し、細胞結合¹²⁵Iの量をガンマ計数器で測定する。これは、ｓＶＥＧＦ−ＲＩの存在下で細胞ＶＥＧＦ受容体に結合することができた［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦの量を示す。この方法で、ｓＶＥＧＦ−ＲＩがＨＵＶＥＣＶＥＧＦ受容体への［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦの結合を阻止することができたことが明らかにされる（第８図参照）。
ｓＶＥＧＦ−ＲＩが細胞受容体へのＶＥＧＦの結合を阻止できることが判明したため、ｓＶＥＧＦ−ＲＩがＶＥＧＦ誘発有糸***も阻止し得るかどうかを調べた。細胞をｓＶＥＧＦ−ＲＩと共に予備インキュベートし、次いで［³Ｈ］チミジンの存在下でＶＥＧＦと共にインキュベートする。インキュベーションに次いで、細胞ＤＮＡ組込み［³Ｈ］チミジンの量を測定し、これによって、ＶＥＧＦが有糸***を誘起し、［³Ｈ］チミジンを細胞ＤＮＡ中に組込ませたか否かを明らかにする。第９図に示すように、ｓＶＥＧＦ−ＲＩの存在は、ＶＥＧＦが有糸***生起を刺激する能力を阻害する。
本発明の阻害剤は、ＶＥＧＦ活性の阻害に使用できる。該阻害剤は、局所的に又は血管内に適用し得る。局所適用の場合は、配合物を約１０ｎｇ〜約１ｍｇ／ｃｍ²／日の割合で直接適用する。静脈内適用の場合は、阻害剤を約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日の割合で使用する。内部使用の場合は、注入した徐放性ポリマー材料もしくは低速放出ポンプから、又は反復注射により、製剤を処理すべき領域内に直接放出させ得る。放出速度はいずれの場合も約１００ｎｇ〜約１００μｇ／日／ｃｍ³である。
非局所適用の場合は、ＶＥＧＦ阻害剤を医薬的に許容し得る担体又は希釈剤、例えばリン酸塩緩衝液、生理食塩水、リン酸塩緩衝食塩水、リンガー溶液等と組合わせて、医薬組成物形態で、標準的医薬操作に従って投与する。局所適用の場合は、種々の医薬配合物が本発明の活性化合物の投与に適している。この種の配合物の非限定的具体例としては、親水ワセリンもしくはポリエチレングリコール軟膏のような軟膏、キサンタンゴムのようなゴムを含み得る泥膏、アルコール溶液もしくは水溶液のような溶液、水酸化アルミニウムもしくはアルギン酸ナトリウムゲルのようなゲル、ヒトもしくは動物アルブミンのようなアルブミン、ヒトもしくは動物コラーゲンのようなコラーゲン、アルキルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース及びアルキルヒドロキシアルキルセルロースのようなセルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びヒドロキシプロピルセルロース、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ−１２７に代表されるＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）ポリオールのようなポリオキサマー、テトロニク１５０８のようなテトロニク、並びにアルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸塩が挙げられる。
以下に実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１
ｆｌｔ関連ｓＶＥＧＦ−ＲＩのクローニング
プライマー５’ＧＣＡＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣ３’（配列番号：１）及び５’ＴＧＧＡＡＴＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＣＴＧＧＴＣＣ３’（配列番号：２）を用いるＨＵＶＥＣファージライブラリーのＰＣＲにより、ｆｌｔの５８０塩基対ＤＮＡプローブを得た。得られたＤＮＡフラグメントをＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＧＥＭ３Ｚ中にクローニングした。メガプライムキット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を比活性１×１０⁷ｃｐｍ／ｎｇで使用して、ランダムプライミング法［Ｆｅｉｎｂｅｒｇ，Ａ．Ｐ．及びＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．，（１９８３）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３２，ｐｐ．６−１３］によりプローブを形成した。ＨＵＶＥＣｃＤＮＡライブラリーを５×１０⁴プラーク／１５０ｃｍプレートの密度でプレーティングし、次いで約１×１０⁶プラークをハイブリダイゼーションによってスクリーニングした［前出のＭａｎｉａｔｉｓらの文献に記載］。要約すれば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハート溶液、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍｌサケ***ＤＮＡ（ハイブリダイゼーション緩衝液）中、４２℃で２時間予備インキュベートした後、フィルターをハイブリダイゼーション緩衝液中４２℃で１６時間にわたりプローブとハイブリダイズした。フィルターを２×ＳＳＣ中室温で１５分間にわたり一回洗浄し、次いで０．１×ＳＳＣ中５５℃で３回洗浄した。４個の陽性プラークを同定し、更に２回スクリーニングして、均質単離体を得た。ＤＮＡ配列分析のために挿入物をｐＧＥＭ３Ｚ中にクローニングした。これらのクローンのうちの二つが同定され、完全長ｆｌｔコード領域より小さい領域を含んでいた。ＤＮＡ配列分析の結果、これらのクローンはｆｌｔの５’コード領域を欠失していた。該ＤＮＡ配列を表１及び第２図に示し、推定アミノ酸配列を表２及び第３図に示す。プライマー５’ＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣ３’（配列番号：３）及び５’ＴＴＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＧＧＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＣＧ３’（配列番号：４）を用いるＰＣＲにより、ｆｌｔの５’末端をクローニングした。このプライマーセットで産生したＰＣＲフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＳａｃIフラグメントとしてｆｌｔクローン７中にクローニングした。

実施例２
Ｓｆ９昆虫細胞内でのｓＶＥＧＦ−ＲＩの発現
ｓＶＥＧＦ−ＲＩをコードする完全長配列をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩフラグメントとしてｐＧＥＭ３Ｚ中にクローニングした。次いで、ＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変え、ポリヘドリンプロモーター（ｐｓＦＬＴｂｌｕｅ）のｐＢｌｕｅＢａｃIII３’中にクローニングした。このプラスミドを、リポソームを用いてＳｆ９アワヨトウ細胞中にトランスフェクションした。４８時間後、組換えポリヘドリンウイルス粒子を含むトランスフェクションした細胞の培地を回収した。ウイルスの希釈物（１０³〜１０⁴倍）を調製し、プラークを、１５０μｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシドを含む軟寒天中で精製した。組換えプラークを青色によって同定し、１２ウェルプレートでＳｆ９細胞（５×１０⁵細胞／ウェル）に感染させた。ポリヘドリン陰性感染の培地（１００μｌ）を用いて、Ｔ−２５フラスコ内の２．５×１０⁶細胞に感染させることにより、Ｐ−２ウイルスストックを調製した。次いで、Ｓｆ９細胞（２×１０⁶細胞／ｍｌで５００ｍｌ）に５ｍｌのＰ−２ストックを感染させ、その後２７℃で５〜６日間インキュベートすることにより、高力価Ｐ−３ウイルス大量ストックを調製し、培地を遠心分離で回収した。細胞に、２〜２．５×１０⁶細胞／ｍｌの密度で、５〜１０の感染多重度をもって感染させることにより、タンパク質発現を達成した。感染から２４時間後、細胞を無血清培地（ＳＦ９００II、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）に充填し、更に４８時間インキュベートし、培地を回収した。このならし培地は、組換え操作によって発現したｓＶＥＧＦ−ＲＩタンパク質を含んでいる。
実施例３
ＶＥＧＦのヨウ素化
クロラミンＴ方法（Ｈｕｎｔｅｒ，Ｗ．Ｍ．及びＧｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．Ｃ．，（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），１９４，ｐｐ．４９５−４９６）により、¹²⁵Ｉ標識ヒト組換えＶＥＧＦを製造した。要約すれば、３０％アセトニトリル／０．１％トリフルオロ酢酸中１μｇのＶＥＧＦを１／３倍容の０．４Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．１の添加によってｐＨ７．１に調整した。新しく溶解したクロラミンＴ（ｐＨ７．１の０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中２ｍｇ／ｍｌストックで４μｌ）をＶＥＧＦ溶液に加え（総量１５０μｌ）、室温で４５秒間反応させた。５０μｌの１０ｍＭＫＩと５０μｌの２ｍｇ／ｍｌメタ重亜硫酸塩とを加えて反応を停止させた。１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含むＰＢＳ中で平衡化した０．７×１５ｃｍＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラムでのゲル濾過により、標識リガンドを遊離¹²⁵Ｉから分離した。フラクションをパッカードγ計数器で計数し、等分して−７０℃で貯蔵した。ＶＥＧＦを比活性５×１０⁵〜１×１０⁶ｃｐｍ／ｎｇまで標識した。
ゲル濾過クロマトグラフィー
１０μｌの¹²⁵Ｉ標識ＶＥＧＦ（１０⁵ｃｐｍ）を、野生型又はバキュロウイルスｓＶＥＧＦ−ＲＩを含む感染Ｓｆ９細胞の培養培地と共に室温で一晩インキュベートすることにより、受容体−リガンド複合体を形成した。ＰＢＳ及び１ｍｇ／ｍｌゼラチン中で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００ゲル濾過カラム（０．７×２５ｃｍ）で、流速１５ｍｌ／時で、反応生成物を分離した。フラクション（０．７５ｍｌずつ）を回収し、γ計数器で分析した。受容体−リガンド複合体はカラムを高速で通過するが、遊離標識ＶＥＧＦはより低速で通過する。第４図に示すこの実験の結果は、標識ＶＥＧＦとｓＶＥＧＦ−ＲＩタンパク質との間で高分子複合体が形成されたことを示している。これは、ｓＶＥＧＦ−ＲＩがＶＥＧＦに結合することを明らかにするものである。
架橋
精製ｓＶＥＧＦ−ＲＩ（１〜１０ｎｇ）を２５μｌの結合緩衝液（ダルベッコの改質イーグル培地（ＤＭＥ）、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．３％ゼラチン）に加え、１×１０⁵ｃｐｍの［¹²⁵Ｉ］−ＶＥＧＦを（第６図、レーン１）、２００ｎｇの非標識ＶＥＧＦ（レーン２）又はｂＦＧＦ（レーン３）と共に加え、次いで室温で２〜１６時間インキュベートした。ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（Ｐｉｅｒｃｅ）架橋剤を最終濃度１ｍＭで加えた。１５分後、沸騰ＳＤＳＰＡＧＥ試料緩衝液の添加により反応を停止させた。架橋生成物を７．５％アクリルアミドゲル上でＳＤＳＰＡＧＥにより分離し、オートラジオグラフィー又はホスホイメイジャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）によって分析した。結果を第６図に示す。約１４５ｋＤａ及び２４５ｋＤａの二つのバンドの出現により、ｓＶＥＧＦ−ＲＩが標識ＶＥＧＦに結合することが知見される。１４５ｋＤａバンドは、一つのｓＶＥＧＦ−ＲＩ分子と一つのＶＥＧＦ分子（Ｍｏｎｏｍｅｒ，Ｍ．）とからなる。２４５ｋＤａバンドは明らかに、二つのｓＶＥＧＦ−ＲＩ分子と一つのＶＥＧＦ二量体（Ｄ）とからなる。遊離ＶＥＧＦリガンド（Ｌ）二量体は、約４５ｋＤａで移動した。
結合アッセイ
前出のＤｕａｎ，Ｄ−Ｓ．Ｒ．らの文献に記載のような９６ウェルプレートアッセイを用いて、ＶＥＧＦへのｓＶＥＧＦ−ＲＩの結合を分析した。要約すれば、ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で部分的に精製したｓＶＥＧＦ−ＲＩ、５０〜２０μｌを、２５ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１００ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭＮＨ₄ＨＣＯ₃中１０ｍｌに希釈した。アリコート（１００μｌ）を９６ウェルプレートの表面に４℃で１８時間吸収させ、次いでプレートをブロッキング緩衝液（ＤＭＥ、２５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５％ゼラチン）で２回洗浄し、非特異的部位を同じ緩衝液中で４℃で６時間ブロックした。次いで、プレートを結合緩衝液中で２回洗浄した。種々の量の［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦを最終量１００μｌ／ウェルでウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。ウェルを１００μｌの結合緩衝液で３回洗浄し、結合したタンパク質を１００μｌの１％ＳＤＳ、０．５％ＢＳＡで可溶化し、γ計数器で計数した。第７図に示す結果を、スキャッチャードの方法［Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ｇ．，（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１，ｐｐ．６６０−６７２］で分析した。この分析は、ｓＶＥＧＦ−ＲＩが約２０ｐＭのＫ_d値でＶＥＧＦに対する大きなアフィニティ結合を保持することを明らかにしている。これは、トランスメンブラン領域及び隣接Ｉｇ様領域を欠失するｓＶＥＧＦ−ＲＩでも大きな親和性をもってＶＥＧＦと結合し、従って前記領域がＶＥＧＦ結合に必要とされないことを示すものである。
実施例４
ｓＶＥＧＦ−ＲＩによるＶＥＧＦ結合の阻害
ｓＶＥＧＦ−ＲＩが、ＨＵＶＥＣへのＶＥＧＦの結合を阻止する能力を調べた。予めゼラチンでコーティングした２４ウェルプレートにＨＵＶＥＣを５０，０００細胞／ウェルでプレーティングし、集密状態まで増殖させた。一定量の［¹²⁵Ｉ］ＶＥＧＦ（１００，０００ｃｐｍ）を、結合緩衝液中の種々の量の部分精製ｓＶＥＧＦ−ＲＩと総量２００μｌになるように混合し、室温で１時間予備インキュベートした。試料を細胞に加え、振盪しながら４℃で４時間インキュベートした。次いで培地を吸引し、細胞を結合緩衝液で３回洗浄した。結合した放射能を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％ＮＰ４０、１％ＢＳＡで可溶化し、γ計数器で計数した。結果を第８図に示す。最大のｓＶＥＧＦ−ＲＩ濃度では、ＨＵＶＥＣへのＶＥＧＦ結合は７０％低下した。しかしながら、細胞膜結合受容体への結合を完全に阻止するのは困難であり得る。なぜなら、ＶＥＧＦ二量体に結合した一つのｓＶＥＧＦ−Ｒ分子が細胞結合受容体と結合して、不活性（ｓＶＥＧＦ−ＲＩ）−ＶＥＧＦ−（膜にまたがるＶＥＧＦ受容体）複合体を形成し得るからである。
実施例５
ｓＶＥＧＦ−ＲＩによるＶＥＧＦ仲介有糸***生起の阻止有糸***阻止
ｓＶＥＧＦ−ＲＩは内皮細胞へのＶＥＧＦの結合を阻止できるため、該可溶性受容体がＨＵＶＥＣ中でＶＥＧＦ誘発有糸***を阻止し得るかどうかを調べた。ゼラチンでコーティングした９６ウェルプレートに、１０％熱不活性化ウシ胎児血清＋抗生物質（１００単位／ｍｌのペニシリンＧ、１００μｇ／ｍｌの硫酸ストレプトマイシン）を加えた１００μｌのＤＭＥ中で、４０００細胞／ウェルの密度で、ＨＵＶＥＣをプレーティングした。１６時間後、培地を変えて検査試料を加え、細胞を種々の量の精製ｓＶＥＧＦ−ＲＩと共に３７℃で１５分間予備インキュベートし、その後増殖因子（１０ｎｇ／ｍｌ）を加えた。細胞を２４時間インキュベートし、次いで［メチル−³Ｈ］チミジン（０．８μＣｉ／ウェル；２０Ｃｉ／ｍｍｏｌ：１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ、最終比活性０．８μＣｉ／ｎｍｏｌｅ）を加え、次いで５％ＣＯ₂下３７℃で更に７２時間インキュベートした。次いで、２５ｍＭＨｅｐｅｓ、０．１％ＢＳＡでｐＨ７．５に調整したハンクス液で細胞を２回洗浄した。次いで細胞を溶解し、ＤＮＡを０．２ＭＮａ₂ＣＯ₃、０．１ＭＮａＯＨで可溶化し、［³Ｈ］チミジンの組込みをシンチレーション計数によって定量した。結果を第９図に示す。ｓＶＥＧＦ−ＲＩは、ＨＵＶＥＣ内でのＶＥＧＦ誘発［³Ｈ］チミジン組込みを完全に阻止することができた。
実施例６
Ｓｆ９細胞からのバキュロウイルス発現ｓＶＥＧＦ−ＲＩの精製
ｓＶＥＧＦ−ＲＩを発現するように設計したバキュロウイルス構築物を感染させたＳｆ９細胞の培養培地（実施例２）を、ヘパリンＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−６Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラー（０．７×４ｃｍ）でクロマトグラフィーにかけた。カラムを５倍容の１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６．２、０．１ＭＮａＣｌ、及び６ｍｌの１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６．２、０．６ＭＮａＣｌで順次洗浄した。ｓＶＥＧＦ−ＲＩを１０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝液、ｐＨ６．２、１．０ＭＮａＣｌで溶離した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を実施した結果、組換え操作で産生したｓＶＥＧＦ−Ｒの純度は９０％以上（クーマシーブルー染色によって判断）であることが判明した（第５図）。該タンパク質の生成をＮ末端タンパク質配列分析で確認した。該組換えタンパク質の実施のＮ末端（ＳｅｒＬｙｓＬｅｕ．．．）は、前出のＳｈｉｂｕｙａらが予測したもの（Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ．．．）と比べて、アミノ酸二つが異なっている。Ｓｆ９細胞内で産生されたｓＶＥＧＦ−ＲＩのペプチダーゼ開裂部位は、残基ｇｌｙ−２６とｓｅｒ−２７との間に存在していた。
実施例７
ＫＤＲ関連ｓＶＥＧＦ−Ｒの構築
可溶性形態のＫＤＲ（公知のＶＥＧＦ受容体）［Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら，（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６，ｐｐ．１６７７−１６８３；Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら，（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７，ｐｐ．１５７９−１５８６］は天然に存在し得るが、まだ同定されていない。ＫＤＲの可溶性形態の一つを、プライマー１）５’ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＣＴＧＣＡＧＡＣＡＧＡＴＣＴＡＣＧＴＴＴＧＡＧＡＡＣＣ３’（配列番号：７）及び２）５’ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧＣＴＣＴＡＧＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣ３’（配列番号：８）並びに鋳型としてのｐＫＤＲＡ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手したｐＧＥＭ７ＺのＥｃｏＲＩ部位にクローニングしたＫＤＲの細胞外及びトランスメンブラン領域をコードするＸｈｏI／ＥｃｏＲＩフラグメント）（第１７図）を用いるＰＣＲによりコード配列を改変することによって組換え操作で構築する。この操作で、完全長ＫＤＲの細胞外領域に対応するＫＤＲのアミノ酸番号６６３の後に翻訳終結コドンが形成された。この改変フラグメントを用いてｐＫｄＲＡのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを置換し、ｓＶＥＧＦ−ＲII（第１１図）と称する可溶性受容体をコードするＫＤＲ遺伝子（第１０図）の切頭形態を形成する。次いで、標準的クローニング方法により、塩基対番号２５７のＸｈｏＩ部位をＢａｍＨＩ部位に変える。ＫＤＲ受容体の別の切頭形態を前記プライマー１及びプライマー３）５’ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＴＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＡＴＧＡＣ３’（配列番号：９）（第１２図）で形成する。ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIIと称するこのＫＤＲ形態はトランスメンブラン領域のＣ末端側で切頭されており、従ってトランスメンブラン領域を保持する（第１３図）。ＦＬＴ受容体の類似の形態を、プライマー４）５’ＡＧＣＡＣＣＴＴＧＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＣＴＣ３’（配列番号：１０）及び５）５’ＴＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＡＴＡＡＧＧＡＧＧＧＴＴＡＡＴＡＧＧ３’（配列番号：１１）、並びに鋳型としてのプラスミドｐｍＦＬＴ（Ｐｒｏｍｅｇａから入手したｐＧＥＭ３ＺのＥｃｏＲＩ部位にクローニングした完全長ｆｌｔ）（第１６図）を使用するＰＣＲにより形成する。次いで、７８０塩基対ＰＣＲフラグメントを、ｐｍＦＬＴ由来のＥｃｏＲＩ／ＸｂａIフラグメントと共にクローニングして、トランスメンブラン領域を保持するが細胞質領域を欠失しているＦＬＴ切頭形態（ｓＶＥＧＦ−ＲＴＭIと称する）（第１５図）をコードするＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨIフラグメント（第１４図）を形成する。次いで、該遺伝子の５’末端のＥｃｏＲＩ部位をＢａｍＨI部位に変える。得られたＫＤＲ及びＦＬＴ切頭形態をｐＢｌｕｅｂａｃIII（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にクローニングして、Ｓｆ９昆虫細胞内で発現させる。このようにして構築したＶＥＧＦ受容体切頭形態の解析は、実施例２、３、４、５及び６に記載のようなｓＶＥＧＦ−ＲＩの解析に使用した方法で実施する。
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：
直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号：２
配列の長さ：２５
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号：３
配列長さ：２６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号：４
配列の長さ：２７
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号：５
配列の長さ：２３１３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｃＤＮＡ
配列

配列番号：６
配列の長さ：６８７
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号：７
配列の長さ：３６
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：８
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：９
配列の長さ：３１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：１０
配列の長さ：２３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：１１
配列の長さ：３２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：１２
配列の長さ：６６１
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号：１３
配列の長さ：６６８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号：１４
配列の長さ：７８０
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号：１５
配列の長さ：７８８
配列の型：アミノ酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列

配列番号：１６
配列の長さ：２２６４
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：１７
配列の長さ：２３５２
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

配列番号：１８
配列の長さ：２３８３
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）
配列

Claims

下記アミノ酸配列を含む可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質をコードする精製核酸分子。
組換え宿主細胞内において可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質を発現するための発現ベクターであって、請求項１に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
組換え可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（ａ）請求項２に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする工程、および（ｂ）上記発現ベクターからの可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質の発現に適した条件下で上記宿主細胞を培養する工程を含む、可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質の発現方法。
可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質をコードする精製核酸分子であって、下記ヌクレオチド配列から成る核酸分子。
組換え宿主細胞内において可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質を発現させるための発現ベクターであって、請求項５に記載のヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
組換え可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質を発現する宿主細胞であって、請求項６に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
（ａ）請求項６に記載の発現ベクターを適当な宿主細胞にトランスフェクトする工程、および（ｂ）上記発現ベクターからの可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質の発現に適した条件下で上記宿主細胞を培養する工程を含む、可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質の発現方法。
下記アミノ酸配列を含む実質的に精製された形態の可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質。
請求項１に記載のＶＥＧＦ阻害タンパク質および医薬上許容される担体を含む組成物。
下記アミノ酸配列から成る実質的に精製された形態の可溶性ＶＥＧＦ阻害タンパク質。
請求項３に記載のＶＥＧＦ阻害タンパク質および医薬上許容される担体を含む組成物。
ＶＥＧＦ受容体の機能を阻害する方法であって、下記アミノ酸配列を含む実質的に精製された形態のＶＥＧＦ阻害タンパク質を非ヒト動物に投与することを含む前記方法。
ＶＥＧＦ阻害タンパク質が下記アミノ酸配列から成る請求項１３に記載の方法。
下記アミノ酸配列を含む実質的に精製された形態のＶＥＧＦ阻害タンパク質を非ヒト動物に投与することを含む血管形成の阻害方法。
ＶＥＧＦ阻害タンパク質が下記アミノ酸配列から成る請求項１５に記載の方法。