JP3723591B2 - 急性肝不全治療薬 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、ヒト組織因子凝固系インヒビター(Tissue Factor Pathway Inhibitor:TFPI)を有効成分として含有する急性肝不全の治療剤に関するものである。さらに、詳細には、本発明はTFPIを有効成分として含有する劇症肝炎治療剤に関するものである。
【0002】
【発明の背景及び従来技術】
劇症肝炎は、肝炎のうち肝細胞群の広範ないし亜広範壊死に基づく肝機能不全により、肝炎の症状発現後8週間以内に急速に進展する肝性昏睡を主な徴候としている。経過中にしばしば消化管出血、腎不全、感染症等の重篤な合併症を伴い、予後不良の疾患である。また、上記定義に当てはまらない重症かつ急激に悪化する肝不全患者及び肝部分切除等の手術後に重症かつ急激に悪化する肝不全患者も存在する。
劇症肝炎等の急性肝不全の発症機序は充分に解明されていないが、患者病理形態解析から、(1) 凝固亢進状態、汎発性血管内凝固症候群(Disseminated Intravascular Coagulation:DIC)による出血、(2) 肝局所に発症したDIC(local DIC)により生じた肝類洞内フィブリン血栓が血流障害による細胞壊死を惹起する事等が病態の悪化につながると考えられている[Rake, M., Lancet ii, p1215(1971)]。
【0003】
本症におけるDICの発症機序は、(1) 肝細胞壊死による組織因子(TF:tissue factor)様物質の放出、(2) 肝網内系機能不全による腸管由来のエンドトキシン血症及び活性化凝固因子の除去能低下、(3) ウイルス・免疫複合体による凝固活性化、(4) アンチトロンビンIII(ATIII)やプロテインC(PC)等の抗凝固物質の産生低下等の準備状態があり、これにショック、感染、脱水、対外循環などの引き金が加わると容易に成立すると考えられている。さらに、最近の動物モデルを用いた解析により、肝細胞壊死を惹起する類洞内血管での凝固亢進状態が、スーパーオキサイドによる内皮細胞の障害や内皮細胞とクッパー細胞でのTF発現の亢進、内皮細胞でのトロンボモジュリン(TM)の低下に関連していることが明らかとなっている[Arai, M., Transplantation Proceeding, 26,p913(1994)]。
【0004】
血液凝固の反応は内因系凝固系と外因系凝固系の2経路の開始反応を中心としたカスケード反応により構成され、最終的にフィブリンネットワークを形成する事によって終了する反応である。また、近年の血液凝固の開始機構に関する研究から、TFと活性型第VII因子複合体(TF−F.VIIa)により第X因子及び第IX因子が活性化される反応、いわゆる外因系凝固反応が血液凝固の開始反応として非常に重要である事が明らかにされている[Davie, E.V., Biochem., 30, p10363(1991)]。よって、TFがさまざまな病態で、血管損傷やサイトカイン等の刺激により、血管内皮細胞、平滑筋細胞や単球/マクロファージ等で過剰に発現されると、容易に凝固亢進状態になることが予想されている。
【0005】
一方で、生体にはこれらの凝固反応が過剰に起こらないように調節している機構も当然存在している。その代表的な機構がプロテアーゼインヒビターによる凝固因子活性の阻害機構とトロンボモジュリン−プロテインC(TM−PC)による制御機構である。これらの阻害及び調節機構はその関連因子の量的及び質的変化が重篤な血栓症を誘発する事から、非常に重要視されている。
【0006】
その中で、特に凝固因子の阻害因子としては、トロンビンや活性型第X因子等を阻害するATIIIとTF−F.VIIaを阻害するTFPIが重要と考えられている[Broze, G.J., Blood, 82, p1679(1993)]。実際に、ATIIIはその濃縮製剤が血栓形成の予防やDICの治療剤としてひろく用いられている。また、本劇症肝炎においてもATIII使用による生存率等の改善効果が認められている事からその生理的重要性が再確認されている[Fujiwara, K., Gastroenterol. Jpn., 23, p423(1988)]。
【0007】
TM−PCによる制御機構は、TM−トロンビン複合体によりPCが活性化された後に生じる活性型PC(APC)が活性型第VIII及びV因子を不活化することによりトロンビン産生を抑制して、抗凝固作用を示す事が知られている。この制御機構も、実際にモデル動物や臨床例で、APCが抗血栓作用、抗DIC作用[Okajima, K., Am.J.Haematol., 33, p277(1990)]や急性肝不全治療効果[藤原ら、特願平5-233289号]を発揮していることから、その重要性は周知となっている。
【0008】
TFPIはアプロチニン等と同じクニッツ型プロテアーゼインヒビターに属し、活性型第X因子を介してTF−F.VIIaに結合して、その活性を抑制すると考えられている。蛋白構造的には主にクニッツ1、クニッツ2、クニッツ3の3つの領域から構成されており、クニッツ1が活性型第VII因子との結合部位、クニッツ2が活性型第X因子との結合部位である事が明らかとなっている[Girard, T.J.,Nature, 338, p518(1989)]。生体中のTFPIは主に血管内皮細胞で合成された後、内皮細胞のヘパリン様物質に結合し、抗血栓作用に重要な機能を果たしている事が推定されている[Novotny, W.F., Blood, 78, p394(1991)]。
【0010】
【発明が解決しようとする課題】
劇症肝炎等の急性肝不全の治療は、血漿交換などの全身管理、肝再生を期待してグルカゴン−インシュリン療法等が行われているが、いずれも対処療法が主体であり、より有効な治療法が求められている。その中で、近年、急性肝不全の治療法として、DICへの抗凝固療法を目的として、ATIIIやAPC、さらに合成プロテアーゼインヒビター等の薬剤の臨床応用が検討されている。しかし、現状では肝臓への特異性の低さに起因すると考えられるが、これらの薬剤だけでは十分な治療が行なえていない状況がある。よって、より十分な治療を行なうためには、local DICを対象した肝臓特異的な薬剤の開発が最も望まれている。
【0011】
【課題を解決するための手段】
このような状況において、本発明者らは劇症肝炎等の急性肝不全治療薬剤を開発すべく鋭意研究を重ねた結果、TFPIが肝臓のlocal DICの主たる要因である肝類洞内凝固亢進に対して特異的抗DIC作用を持つ事を明らかとし、TFPI製剤が劇症肝炎などの急性肝不全の治療剤として、人間その他の動物に適応できる事を見いだし、本発明を完成するに至った。すなわち本発明は、有効成分として実質的にTFPIを含有する急性肝不全治療剤に関するものである。
【0012】
本発明におけるTFPIとはヒト、その他の哺乳動物の血液から得られるTFPI及び遺伝子組換え技術によって製造されるヒト、その他の哺乳動物由来のTFPIを含むものをいう。本発明のTFPIとしては、これらTFPIの中でもヒト血液由来のTFPI又は遺伝子組換え技術によって製造されるヒトTFPIをあげる事ができる。なお、本発明の目的とする急性肝不全の治療剤としての効果を得られる限り、血液由来及び遺伝子組換え技術によって製造されるTFPIと生理学的に同等の活性を有するTFPIの全アミノ酸配列の一部が欠損、置換、挿入、追加等の誘導体も本発明のTFPIに含まれる。
【0013】
本発明におけるTFPIの製造方法は特に限定されないが、ヒト血液より分離したTFPI、あるいは遺伝子組換え技術によって製造されるTFPIが含まれる。特に、血液由来のTFPIについては血液中の含量が非常に少なく(約100ng/ml)、殆どのTFPIがリポ蛋白質と結合している事から、比活性の高い遊離型のTFPIを大量に製造する事は非常に困難である。よって、遺伝子組換え技術によって遺伝子組換え型TFPI(rTFPI)を調製する事が好ましいと考えられる。そのrTFPIの製法としては、特願平5-188746号(亀井ら)や特願平6-239532号(神窪ら)に記載された以下の方法がある。
【0014】
例えば、ヒトTFPIのcDNAを導入したCHO細胞の培養上清から、
(1) Pedersen等の方法[J.Biol.Chem.,265,p16786(1990)]に従って、ヘパリンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーを行なった後、MonoQ HR5/5カラム(Pharmacia-LKB)とMonoS HR5/5カラム(Pharmacia-LKB)によるイオン交換クロマトグラフィーで精製する方法、または、
(2) 抗TFPI抗体(好ましくはモノクローナル抗体)を結合させたゲルによるアフィニティークロマトグラフィーを行なった後、ヘパリンゲル(Pharmacia-LKB)によるアフィニティークロマトグラフィーで精製する方法である。
なお、上記の方法で得られるrTFPIは、アミノ酸配列分析やSDS-PAGE等の分析より、殆どが分解を受けていない比活性の高いFull-length型のTFPIである。
【0015】
また、血液から調製する方法としては、
(1) Novotnyらの報告[J.Biol.Chem.,264,p18832(1989)]に従って、Phenyl-Sepharose(Pharmacia-LKB)、Q-Sepharose(Pharmacia-LKB)と活性型第X因子によるアフィニティークロマトグラフィーを併用して調製する方法、
(2) 抗TFPI抗体ゲルによるアフィニティークロマトグラフィーとヘパリンゲルによるアフィニティークロマトグラフィーを併用する方法がある。
【0016】
上述の方法で調製されたTFPIの活性を最大限に維持するためには、本発明のTFPIが新鮮であるか、凍結保存しておく方が好ましい。あるいは、好適な安定化剤と共に凍結乾燥して保存する事も可能である。
本発明では、有効成分としてのTFPIと公知の適当な賦形剤(人血清アルブミン等)を組み合わせ、公知の方法で経口投与剤、非経口投与剤、好ましくは静脈投与用製剤とする事により本発明の急性肝不全の治療剤とする事ができる。
【0017】
本発明により、TFPIが劇症肝炎の動物モデルを用いた実験により、優れた肝臓障害抑制能を有することが明らかとなった。このように、本発明のTFPIを含有する製剤の使用は、劇症肝炎等の急性肝不全の治療に対して極めて有効な手段となることが期待される。
【0018】
以下、本発明の理解を深めるために実施例に添って説明するが、本発明はこれらの実施例に必ずしも限定されるものではない。
【0019】
【実施例】
《参考例1》 TFPIの調製
ヒト組換えTFPI(rTFPI)は、ヒトTFPIのcDNAを導入したCHO細胞の培養上清から、Pedersenらの方法[J.Biol.Che., 265, p16786(1990)]に従い、ヘパリンゲル(Pharmacia-LKB)によるアフィニティークロマトグラフィーを行った後、MonoQ HR5/5カラム(Pharmacia-LKB)とMonoS HR5/5カラム(Pharmacia-LKB)によるイオン交換クロマトグラフィーを用いて精製することにより得られた。
【0020】
《実施例1》 劇症肝炎モデル動物を用いたTFPIの治療効果
本実験は劇症肝炎モデルとして確立されている方法を参考にして実施した[Gastroenterology,99, p771-p888(1990)]。
Sprague-Dawley系ラットの肝臓を軽麻酔下にて70%を切除し、その48時間後にエンドトキシン(E. Coli 026; B6由来Difco社)200μg/kgを静脈内に投与する。この時同時に大腿静脈よりrTFPI(1mg/kg, 2.5mg/kg)を投与した。対照群には生理食塩液を投与した。なお、各群7匹のラットを用いた。
5時間後に麻酔下で頸静脈より採血し、肝臓障害の指標として、血清ALT(アラニンアミノトランスフェラーゼ)を測定した。その結果を表1に示す。表1より、肝部分切除+エンドトキシン誘発による劇症肝炎モデルにおいて、rTFPIが肝障害を抑制する事が確認された。また、スチューデントt検定による統計解析を行った結果、本試験結果は、危険率が5%以下で有意差が確認された。
【0021】
【表1】
【0022】
《実施例2》 TFPIの臓器集積性検討
本発明のTFPIが肝臓特異的な作用を発揮していることを明らかにするために、上述のモデル動物に投与したヒトrTFPIの臓器集積性を調べた。具体的には、ヒトrTFPIを投与後速やかに肝臓、腎臓等の臓器を摘出して、固定後抗ヒトTFPI抗体による免疫組織染色法により臓器での分布を検討した。
【0023】
(1) TFPIに対する特異ポリクローナル抗体の調製
TFPIに対するポリクローナル抗体を調製するために、常法に従いフロイントの完全アジュバンドと混合したTFPIを2〜3週間の間隔でウサギ等のヒト以外の動物種に皮下投与し、抗血清を調製した。抗TFPI免疫グロブリンは抗血清からプロテインAゲル(Pharmacia-LKB)によるアフィニティ−クロマトグラフィーで常法に従って精製した。さらに、免疫グロブリン画分からTFPIに対する特異抗体を調製するために、TFPIを結合させたゲル(2mgTFPI/mlゲル)によるアフィニティ−クロマトグラフィーを行なった。TFPIを結合させたゲルはBrCN化活性化ゲル(Pharmacia-LKB)とTFPIを反応させて調製した。なお、得られた特異抗体はウエスタンブロッティングの結果より、クニッツ1、クニッツ2、クニッツ3のどの領域とも結合する事が明らかとなった。
【0024】
(2) 免疫組織染色法による臓器内分布の解析
組織染色に供与した試料は、各臓器を摘出して4%パラホルムアルデヒドと0.05%グルタルアルデヒド混合液で固定した後、パラフィン包埋後切片化して調製した。臓器中のTFPIは抗TFPI抗体を反応させた後、ABC-PO法により検出した。その結果、別添の参考写真より明らかなように、投与したrTFPIの殆どが肝臓の類洞内皮細胞に結合して存在している事が確認された。これより、投与されたrTFPIは、肝臓に集積し、類洞血管に発現したTFに起因するlocal DICを抑制していると考えられた。
Claims (4)
- 有効成分として実質的に組織因子凝固系インヒビター(TFPI)を含有する急性肝不全治療剤。
- 急性肝不全が、劇症肝炎である請求項1記載の治療剤。
- TFPIが遺伝子組換え技術によって製造されるTFPIである請求項1または請求項2記載の治療剤。
- TFPIがヒト血液由来のTFPIである請求項1または請求項2記載の治療剤。
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