JP3717535B2 - 新規微生物およびL−α−アミノ酸の製法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、D−又はL−又はD,L−5−モノ置換ヒダントイン又はD−又はL−又はD,L−N−カルバモイル−α−アミノ酸を相応するエナンチオマー純粋なL−α−アミノ酸に変換する能力を高い特異的活性で有する新規微生物に関する。
【0002】
【従来の技術】
従来、N−5−モノ置換ヒダントインのエナンチオマー純粋なL−α−アミノ酸への発酵による、もしくは酵素による変換のための多くの方法が文献中に記載されているか、又は特許申請されている(Syldatk,C.、Mueller,R.、Pietzsch,M.、Wagner,F.著、MICROBIAL AND ENZYMATIC PRODUCTION OF L−AMINO ACIDS FROM D,L−5−MONOSUBSTITUTED HYDANTOINS、Biocatalytic production ofamino acids and derivates(Rozell,J.D.及び Wagner,F.,編集)、Hanser Verlag社,Muenchen、1992、第129〜176頁参照)。
【0003】
フラボバクター種(Flavobacter sp.)AJ−3912からの精製されたヒダントイナーゼでの5−アリールアルキルヒダントイン、例えば5−ベンジルヒダントインの加水分解に関する反応機構は文献に記載されている(ヨコゼキ,K.、サノ,K.、エグチ,C.、イワガミ,H.及びミスギ,K.(1986):OPTIMAL CONDITIONS FOR THE ENZYMATIC PRODUCTION OF L−AROMATIC AMINO ACIDS FROM THE CORRESPONDING 5−SUBSTITUTED HYDANTOINS、Agric.Biol.Chem.、第51巻、第729〜736頁及びヨコゼキ,K.、ヒロセ,Y.及びクボタ,K.(1986):MECHANISM OF ASYMMETRIC PRODUKTION OF L−AROMATIC AMINO ACIDS FROM THE CORRESPONDING HYDANTOINS BY FLAVOBACTERIUM SP.、Agric.Biol.Chem.、第51巻、第737〜746頁参照)。この際、往復反応の相対速度が調べられ、かつD−5−ベンジルヒダントインのN−カルバモイル−D−フェニルアラニンへの往反応がL−5−ベンジルヒダントインのN−カルバモイル−L−フェニルアラニンへの加水分解より明らかにゆっくりと進むことが示された。ここでは、D,L−5−メチルチオエチルヒダントインは痕跡程度にしかN−カルバモイル−L−メチオニンに変換することはできなかったために、5−アルキルヒダントインのエナンチオマー選択加水分解の機構に関しては全く何も供述していない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は簡単に培養することができ、かつ比較的大量に、もしくは比較的高速でD−、L−及び/又はD,L−5−モノ置換ヒダントイン及び/又はD−、L−及び/又はD,L−N−カルバモイル−α−アミノ酸からL−α−アミノ酸を製造することのできる酵素を製造する新規微生物を提供することである。更に、L−α−アミノ酸の相応する製法並びにカルバモイラーゼ及び/又はヒダントイナーゼ及び/又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の獲得法、及びカルバモイラーゼ及び/又はヒダントイナーゼ及び/又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の微生物又は細胞中への挿入法も課題である。
【0005】
【課題を解決するための手段】
この課題は微生物DSM7329及びDSM7330で解決する。これらの微生物は1992年11月17日にドイツ微生物保存機関(DSM−Deutsche Sammlung von Mikroorganisumen undZellkulturen GmbH、Mascheroder Weg 1B、D−3300 Braunschweig)に寄託した。相当する寄託書を添付する。
【0006】
新規に単離し、ドイツ微生物保存機関に寄託した微生物はアルトロバクター種の新規な種類である。
【0007】
D−、L−及び/又はD,L−5−モノ置換ヒダントイン及び/又はD−、L−及び/又はD,L−N−カルバモイル−α−アミノ酸から酵素によるL−α−アミノ酸の製法は、変換を微生物DSM7329及び/又はDSM7330を用いてかつ/又はこれらの微生物の生産する酵素を用いて行う。
【0008】
この方法を微生物自体を用いて行う場合、この方法はこれらの微生物が自体でこの基質を使用しないように、有利に静止又は死滅微生物を用いて行う。
【0009】
この方法をこれらの微生物が生産した酵素を用いて行う場合、この方法を微生物の原汁(例えばフレンチプレス又はガラスビーズミルを用いて得られる)、粗抽出液を用いて又は多少でも精製した微生物の酵素を用いて行うことができる。
【0010】
本発明は微生物DSM7329及び/又はDSM7330を、
これらの微生物の突然変異種または変体の培養、
又はカルバモイラーゼ又はヒダントイナーゼ及び/又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の獲得、
又は微生物又は細胞中へのカルバモイラーゼ又はヒダントイナーゼ及び/又はヒダントインラセマーゼをコードする遺伝子の挿入、
又はL−α−アミノ酸の製造、
への使用にも関する。
【0011】
これらの微生物の突然変異種又は変体の培養は例えば自然に起きる突然変異の選択により行うことができる。その他の可能性は、例えば化学物質及び/又は放射線及び/又はUV−光の作用による突然変異である。
【0012】
これらの微生物からの1種又はそれ以上の遺伝子の獲得は、例えば酵素に関する遺伝子の配列分析又は微生物中への挿入のために用いられ、この際この遺伝子を挿入する微生物の選択により前記方法に重要な酵素を多量に生産する微生物を得ることができる。場合によってはこの遺伝子を動物の、又は植物の細胞に組み込むこともできる。遺伝子の組込は微生物学的に常用の方法で、例えばベクターを用いて行う。
【0013】
記載した新規微生物は一連の酵素を、この細胞塊が前記方法にとって非常に高い活性を有するような量で製造する。従来、この方法のために高い活性を有する菌株は全く知られていない。
【0014】
前記のL−α−アミノ酸の製法は本発明の微生物もしくはそれらの酵素で実質的に立体特異的に進み、この際種々の5−置換ヒダントインを変換することができる。あとで示す反応工程(反応工程1)により相応するアミノ酸が得られる。本発明において、ヒダントイン中の基はアルキル基であってよく、分枝、環状であってよく、1種又はそれ以上のヘテロ原子によって置換されていてよく、芳香族であっても、ヘテロ芳香族であってもよい、等々。困難であるのは、5−メチルヒダントイン、5,5−ジ置換ヒダントイン、複数置換されたフェニルヒダントイン、例えば5−3´−メチル−4´−アミノメチルフェニルヒダントイン、ヒダントインに直接嵩高い基を有する、例えば5−t−ブチルヒダントイン並びにヒダントインに隣接して荷電した置換基を有する残基を有する、例えば5−β−カルボキシエチルヒダントイン、5−γ−アミノプロピルヒダントイン、5−δ−アミノブチルヒダントインである。これに対して多くの化合物、例えば置換基、イソプロピル、N−プロピル、N−ブチル、メチルチオエチル、イソブチル、インドリルメチル、シクロヘキシルメチル、ベンジル、ナフチルメチル、フェニルで5−置換されたヒダントインは変換することができ、この際、非常に多種の置換基が可能である、例えばベンジルに、p−フルオル、p−クロル、p−アミノ、p−メトキシ、p−カルボキシ。こうしてヒダントインもしくはN−カルバモイルアミノ酸中の5−置換基は基本的には全く制限されない、それというのも可能な置換基が多いこと及び置換基もしくはアミノ酸残基の官能化の可能性が多いことから基本的に全ての典型的な5−置換ヒダントイン又は相応するN−カルバモイルアミノ酸を基質として考慮することができる。
【0015】
ヨーロッパ特許第0159866B1号明細書には、相応する5−アリールアルキルヒダントイン及び/又は相応するN−カルバモイルアミノ酸からL−α−アミノ酸を形成することのできるアルトロバクター(Arthrobacter)sp.DK−200のバクテリアが記載されている。ここでは単にL−フェニルアラニン、L−トリプトファン及びL−チロシンの合成のみ記載されている。特異的酵素活性又は酵素的機構に関しては全く記載されていない。アルトロバクター sp.DK−200は明らかに新規微生物アルトロバクター sp.DSM7329及びDSM7330とは異なる:アルトロバクター sp.DK−200はデンプンを加水分解することができない、このことはアルトロバクター属の中の種を同定するための決定的な生理学的特徴である。更に、この菌株はウレアーゼ活性を全く示さず、脱窒素に関してはこの菌株はプラスとしてグループ分けされている。更に、菌株アルトロバクターDK−200の成長は33.2℃を越える温度ではもはや観察されない。更に、第1表から明らかなように炭素源としての乳糖の利用並びに糖からの酸の形成(L−アラビノースはマイナス、グリセリンはプラス)のような生理学的特徴に差がある。
【0016】
***特許第3712539C2号明細書中には、非病原性で、かつ好気性のコリネフォルム(Coryneforme)バクテリアに属する3種の微生物、DW3(DSM3745)、CW4(DSM3746)及びCW5(DSM3747)が記載されている。これらの微生物は相応する5−アリールアルキルヒダントイン及びN−カルバモイル−α−アミノ酸から相応する芳香族L−α−アミノ酸を遊離する能力を有する。更に、この明細書はD−、L−5−メチルチオエチルヒダントインをD−N−カルバモイルメチオニンを介してL−メチオニンに変換することを記載している。この変換に関しては使用した有機体に関する特異的な生産性に関する記載はない。D−N−カルバモイルアミノ酸のL−アミノ酸への変換はN−カルバモイル中間化合物の面にラセマーゼが存在することに起因する(***特許第3712539号明細書、第2頁、第42〜44行)。菌株DSM3747に関する最新の刊行物中には相応するD,L−5−モノ置換ヒダントインからL−アミノ酸の獲得の際にD−N−カルバモイルアミノ酸の関与に関して記載されていない(Syldatk,C.、Mueller,R.、Pietzsch,M.、Wagner,F.、MICROBIAL AND ENZYMATIC PRODUCTION OF L−AMINO ACIDS FROM D,L−5−MONOSUBSTITUTED HIDANTOINS:Biocatalytic production of amino acids and derivates(Rozell,J.D.and Wagner,F.出版)Hanser Verlag、Muenchen、1992、第129〜176頁参照)。両方の微生物DSM7329及びDSM7330に対して***特許第3711539号明細書に記載された微生物DSM3745〜DSM3747の差異は生理学的な面において明らかである。このことは第2表の記載から明らかである。
【0017】
5−アルキルヒダントイン又は相応するN−カルバモイルアミノ酸から出発して、脂肪族L−α−アミノ酸を製造するための一連の方法が公知である。
【0018】
***特許第3702384A1号明細書(米国特許第5071752号明細書)中には相応する5−置換ヒダントインからL−アミノ酸、例えばL−ロイシン、L−バリン及びL−システインの微生物ノカルディア種(Nocardia spec.)DSM3306を用いる形成が記載されている。しかしながら特異的な活性に関しても記載されていないし、ヒダントイン加水分解に関する機構も提案されていない。
【0019】
特開昭55−29678号公報によればコリネバクター セペドニクム(Corynebacter sepedonicum)をL−またはD,L−N−
カルバモイルメチオニンに作用させ、その際基質混合物中に含有するL−N−カルバモイルメチオニンがL−メチオニンに変換される。しかしながら、この方法によればL−エナンチオマー基質のみがL−メチオニンに変換され、D−N−カルバモイルメチオニンは変換されない。同様にして特公昭65−29678号公報には微生物の酵素を用いてD,L−N−カルバモイルメチオニンからL−メチオニンを形成する方法が記載されている。この反応の後、未反応のD−N−カルバモイルメチオニンからL−メチオニンの分離が必要である。
【0020】
アルトロバクター ウレアファシエンス(Arthrobacter ureafaciens)を用いてD,L−5−メチルチオエチルヒダントインからのL−メチオニンの形成が記載されており(Guivarch,M.、Gillonnier,C.及びBrunie,J.−C.(1980):OBTENTION D´AMINO ACIDES OPTIQUEMENT ACTIFSA L´AIDE D´HYDANTOINASES、Bull.Soc.Chim.Fr.No.1−2,91−95)、この際D−及びL−N−カルバモイルメチオニン中間工程でラセミ化が生じる。この反応工程は新規DSM7329及びDSM7330では起きない。
【0021】
特公平4−39316号明細書には2種の新規のアルトロバクター種(Artrobacter spec.)DP−B−1001及びDP−B−1002が記載されており、これらは5−置換ヒダントインから、及びN−カルバモイルアミノ酸から、これらがD−、L−、D,L−型で存在するか又は混合物として存在するかに依存せずに、相応するL−アミノ酸を形成する。反応機構に関しては全く記載されていない。しかしながら、これらの新規微生物は主にその生理学的特徴において微生物DSM7329およびDSM7330に対して異なっている。このことは第3表から明らかである。更に、D−N−カルバモイルメチオニンのL−メチオニンへの変換の比活性において、第4表に記載するように明らかな差異がある。
【0022】
全ての細胞の比活性の計算を次の式により行う:
第4表:
特公平4−39316により、日本の菌株DP−B−1001はD−N−カルバモイルメチオニンに関する次の比活性を提供する。
【0023】
同じ条件下に、菌株DSM7330はD−N−カルバモイルメチオニンに関する次の比活性を提供する:
すなわち、前記特公平、例1に記載された条件下のD−CMに関する比活性の上昇は(g/g BFM×h)に関してファクター3.3である。
【0024】
他の緩衝液(0.1M Na−炭酸塩−緩衝液、pH:8.5)及び2倍の基質投与の使用下に次の比活性が得られる:
すなわち、ファクター 6.5への更なる上昇が得られた。
【0025】
条件の変更下に(0.2M Tris/HCl−緩衝液、pH:8.0、30℃、通気及びその他の添加物なしに)次の比活性が得られた:
すなわち、更にファクター12への上昇!
BMF:湿ったバクテリア塊;
D−CM:D−N−カルバモイルメチオニン
本発明で2種の新規アルトロバクター種DSM7329及びDSM7330の単離が行われた、これらは公知技術に対して明らかに高められた生産性を示し、主に脂肪族L−アミノ酸、例えばL−メチオニンを5−モノ置換ヒダントインのD−、及び/又はL−、及び/又はD,L−型及び/又は相応するN−カルバモイルアミノ酸及び/又はこれら両方の物質群からなる混合物から、反応工程1に示された新しく解明された反応機構により製造する。“アルキル”はここでは単に前記基質スペクトルに関する例として挙げられている。見出された速度に関しては矢印の太さで示す。
【0026】
【化1】
【0027】
【実施例】
次に実施例につき本発明を詳細に説明する。
【0028】
例1: 微生物の単離
唯一の窒素源としてD,L−5−メチルチオエチルヒダントインを含有する次の組成:
KH2PO4 1.0 g/l
K2HPO4 1.816 g/l
MgSO4・7H2O 0.123 g/l
CaCl2・2H2O 0.017 g/l
FeSO4・7H2O 0.006 g/l
グルコース 5.0 g/l
D,L−メチルチオエチルヒダントイン 1.0 g/l
痕跡成分溶液 10 ml/l
pH:7.0
の合成培地各50mlを、
〔この際、痕跡成分溶液は次の組成を有する;
エチレンジアミンテトラ酢酸塩(Na+) 500mg/l
FeSO4・7H2O 200mg/l
ZnSO4・7H2O 10 mg/l
MnCl2・4H2O 3 mg/l
H3BO3 30 mg/l
CoCl2・4H2O 1 mg/l
CuCl2・2H2O 1 mg/l
NiCl2・6H2O 1 mg/l
Na2MoO4・2H2O 3 mg/l、〕
種々異なる場所の土壌試料1gと共にじゃま板を有する500mlエルレンマイヤーフラスコ中で、30℃、pH:7.0及び100r.p.mで回転振盪装置(Braun、Melsungen)上で4日間恒温保持する。引き続き、これらの懸濁液各1mlを新たに滅菌した前記培養液中に接種し、改めて30℃、pH7及び100r.p.mで回転振盪装置上で4日間恒温保持する。培養工程を10回行なった後にそれぞれ懸濁培養液を複合培地に基づく寒天培地上に希釈列により塗布し、30℃で恒温保持し、3日後に単独のコロニーが成長する様にする。個々の単独のコロニーを公知法で純粋培養にする。
【0029】
個々の微生物菌株に関する複合培地の組成は次のとおりである:
グルコース 10.0g/l
工業用酵母抽出液 0.5g/l
クエン酸 0.5g/l
MgSO4・7H2O 0.1g/l
CaCl2・2H2O 0.05g/l
KH2PO4 1.0g/l
K2HPO4 1.816g/l
痕跡成分溶液 10.0ml/l
寒天 20.0g/l
pH:7.0
D,L−5−モノ置換ヒダントインからL−α−アミノ酸を獲得するための酵素活性に関する検査のためにこのようにして得られた純粋培養をサブマーズ培養(Submerskulture)中で次のように培養した:
じゃま板を有する500mlエルレンマイヤーフラスコ中で、滅菌栄養培地I 100mlを新規にえられた純粋な培養の洗出液で接種し、かつ30℃、pH:7.0及び100r.p.mで回転振盪装置上で24時間恒温保持する。このようにして得られた懸濁培養から、じゃま板を有する2000mlエルレンマイヤーフラスコ中の滅菌栄養培地II 500mlを予培養10mlで接種する。新たに、培養を30℃、pH7.2及び100r.p.mで回転振盪装置上で36時間行なう。その後細胞を遠心分離し、0.9%のNaCl溶液で2回洗浄する。このようにして得られた湿った細胞塊は、すぐに酵素活性を試験することも、又は−18℃で数週間の間、中間的に貯蔵することもできる。
【0030】
栄養培地 Iは次の組成を有する:
グルコース 10.0g/l
(NH4)2SO4 6.50g/l
クエン酸 0.32g/l
MgSO4・7H2O 0.20g/l
CaCl2・2H2O 0.02g/l
MnCl2・4H2O 0.02g/l
FeSO4・7H2O 0.02g/l
KH2PO4 4.54g/l
K2HPO4 7.61g/l
栄養培地IIは次の組成を有する:
グルコース 15.0g/l
工業用酵母抽出物 1.0g/l
(NH4)2SO4 6.50g/l
クエン酸 0.62g/l
MgSO4・7H2O 0.40g/l
CaCl2・2H2O 0.04g/l
MnCl2・4H2O 0.04g/l
FeSO4・7H2O 0.04g/l
KH2PO4 3.40g/l
Na2HPO4・2H2O 4.42g/l
D,L−5−インドリルメチル−N−3−メチルヒダントイン0.25g/l
このようにして得られた湿潤細胞塊(BFM)の酵素活性を次の反応条件下に比較テストを行なう:
0.2Mのトリス/HCl−緩衝液 pH:8.0 50ml中にD,L−5−メチルチオエチルヒダントイン50mg及びBMF2.5gを添加し、24時間30℃で恒温保持する。その後、細胞懸濁液を遠心分離し、透明の上澄をHPLC−分析で調べる。特に活性な物として2種の菌株が見出され、これらをドイツ微生物保存機関(DSM)にDSM7329及びDSM7330として寄託した。これらの菌株は次に第5表の記載した生理学的及び細菌学的特性を有する。
【0031】
化学的及び/又は物理学的突然変異により、又は連続的な培養における選択によりこれらの微生物から突然変異種又は変体が高められた及び/又はより安定化した酵素活性で富化する。
【0032】
本発明による微生物でN−カルバモイル−α−アミノ酸を介してL−α−アミノ酸に、示した反応機構に相応して加水分解することのできるD,L−5−モノ置換ヒダントイン変換に関する例を第6表に示す、両方の菌株で測定精度の範囲において同じ結果が見出された。
【0033】
【表1】
【0034】
例2:バイオマスの培養
滅菌栄養培地I 100mlを有する500mlエルレンマイヤーフラスコを傾斜培養の菌株DSM7330の白金輪で接種し、円形振盪装置上100r.p.m.及び30℃で培養する。24時間の恒温保持時間の後、この懸濁培養を第2の予培養のための接種材料として使用する。滅菌栄養培地I 500mlを含有する2000mlエルレンマイヤ−フラスコ10コにそれぞれ第1の予培養10mlで接種し、新たに100r.p.m.及び30℃で恒温保持する。恒温保持の後、この予培地IIを接種材料としてバイオ反応器50 lに使用する。この反応器は強化装置を備えており、これに栄養培地IIの組成に相応する栄養培地45 lを挿入し、pH6.5及び温度121℃及び約1バールの加圧で30分間滅菌する。30℃に冷却後、10%のNaOHでpH7.0に調節し、引き続き予培養IIからなる懸濁培養で接種する。培養を30℃及び回転数400r.p.m.及び通気速度0.8V/V/mで行なった。18時間後、湿潤細胞塊を遠心分離し、引き続き0.9%食塩溶液で2回洗浄する。このようにして得られた湿潤細胞塊はすぐに又は後の反応の時点まで−18℃で中間貯蔵した後に、酵素反応に使用することができる。湿潤細胞塊1.725kgが得られる。
【0035】
同様にして、菌株DSM7329を培養すると、この際湿潤細胞塊1.69kgが得られ、これは乾燥細胞塊0.34kgに相当する。
【0036】
例3:
DSM7330の湿潤細胞塊83g及びD,L−メチルチオエチルヒダントイン20g(115mmol)を0.1Mソエレンセン(Soerensen)緩衝液pH:8.0 1000ml中に懸濁させ、2 l撹拌反応器中で35℃、N2−通気、及び撹拌下に、28時間恒温保持する。引き続き、細胞を遠心分離し、上澄を高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析する。上澄中に、L−メチオニン16.4g(110mmol)が検出された。
【0037】
収量=理論値の95.6%
例4:
DSM7330の湿潤細胞塊100g及びD−カルバモイルメチオニン10g(52mmol)を0.2Mトリス(Tris)/HCl緩衝液、pH:8.01000ml中に30℃で懸濁させ、かつ通気することなしに2 l撹拌反応器中で撹拌下に9時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にL−メチオニン6.6g(44mmol)が検出された。
【0038】
収量=理論値の84.6%
例5:
DSM7329の湿潤細胞塊100g及びL−カルバモイルメチオニン10g(52mmol)を0.2Mトリス(Tris)/HCl緩衝液、pH:8.01000ml中に30℃で懸濁させ、かつ通気することなしに2 l撹拌反応器中で撹拌下に3.5時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にL−メチオニン7.68g(51.5mmol)が検出された。
【0039】
収量=理論値の99%
例6:
DSM7330の湿潤細胞塊100g及びD,L−カルバモイルメチオニン10g(52mmol)を0.2Mトリス(Tris)/HCl緩衝液、pH:8.0 1000ml中に30℃で懸濁させ、かつ通気することなしに2 l撹拌反応器中で撹拌下に9時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にL−メチオニン7.16g(48mmol)が検出された。
【0040】
収量=理論値の92%
例7:
DSM7330の湿潤細胞塊100g及びD,L−カルバモイルメチオニン10.4mmol及びD,L−メチルチオエチルヒダントイン41.6mmolからなる工業用ヒダントイン10gを0.2Mトリス(Tris)/HCl緩衝液、pH:8.0 1000ml中に30℃で懸濁させ、かつ通気することなしに2 l撹拌反応器中で撹拌下に15時間恒温保持する。遠心分離後、上澄中にL−メチオニン7.01g(47mmol)が検出された。
【0041】
収量=理論値の90.3%
例8:
粗抽出物及び精製酵素溶液の製造
微生物DSM7329もしくはDSM7330をガラスビーズミル中で約15分砕壊し、引き続きバイオマスを遠心分離により分離する。上澄は酵素−粗抽出物であり、蛋白質約21g/lを含有する。粗抽出物中に含有されるヒダントイナーゼの単離のためにこれを常法で処理する。ここでの場合、上昇する分割沈殿を、1.7M硫酸アンモニウムで開始し、引き続き硫酸プロタミン(3g/l)分離、引き続き2.5M硫酸アンモニウムによる蛋白質の沈殿により行なう。このようにして得られた予精製生産物をカラムクロマトグラフィーにより更に精製するが、この際、順次ブチルセファロース、フェニルセファロース及び2回アニオン交換クロマトグラフィー(pH7.8、pH6.6)を行なう。菌株DSM7329は第1のアニオン交換クロマトグラフィーの後、蛋白質含量0.12g/lを有し、菌株DSM7330は第2のアニオン交換クロマトグラフィーの後蛋白質含量0.1g/lを有する(Bredfordによる)。蛋白質純度はゲル電気泳動により決定する。
【0042】
酵素−粗抽出物(21g/l)及び精製した酵素溶液(ヒダントイナーゼ0.1g/l)を次の例に使用する。
【0043】
例9:
D−メチルチオエチルヒダントイン0.00575mmolを酵素100 lと共に0.1Mトリス/HCl−緩衝液pH8.5 900 l中で42℃で1時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にD−カルバモイルメチオニン0.00351mmolが測定され、このことは変換率61mol%に相応する。
【0044】
例10:
L−メチルチオエチルヒダントイン0.00575mmolを酵素100 lと共に0.1Mトリス/HCl−緩衝液pH8.5 900 l中で42℃で1時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にL−カルバモイルメチオニン0.000863mmolが測定され、このことは変換率15mol%に相応する。
【0045】
例11:
D−カルバモイルメチオニン0.00521mmolを酵素100 lと共に0.1Mトリス/HCl−緩衝液pH8.5 900 l中で42℃で1時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にD−メチルチオエチルヒダントイン0.000162mmolが測定され、このことは変換率3.1mol%に相応する。
【0046】
例12:
L−カルバモイルメチオニン0.00521mmolを酵素100 lと共に0.1Mトリス/HCl−緩衝液pH8.5 900 l中で42℃で1時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にL−メチルチオエチルヒダントイン0.0000521mmolが測定され、このことは変換率1.0mol%に相応する。
【0047】
例13:
L−カルバモイルメチオニン0.00521mmolを酵素−粗抽出物100lと共に0.1Mトリス/HCl−緩衝液pH8.5 900 l中で42℃で0.5時間恒温保持した。活性テストの終了後、上澄中にL−メチオニン0.00521mmolが測定された。
Claims (2)
- 微生物DSM7329及びDSM7330。
- D−、L−及び/又はD,L−5−モノ置換ヒダントイン及び/又はD−、L−及び/又はD,L−N−カルバモイル−α−アミノ酸からL−α−アミノ酸を製造する方法において、この変換を微生物DSM7329及び/又はDSM7330を用いて及び/又はこれらの微生物が生産したカルバモイラーゼ及び/又はヒダントイナーゼ及び/又はヒダントインラセマーゼを用いて行うことを特徴とするL−α−アミノ酸の製法。
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