DE10115000C2 - Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten alpha-substituierten Carbonsäuren - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten alpha-substituierten Carbonsäuren

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Description

Die vorliegende Erfindung ist auf die Herstellung α- substituierter Carbonsäuren gerichtet. Insbesondere betrifft die Erfindung die enzymatische Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I) oder (II)
worin X O, S oder CH2 sein kann, im System Hydantoinase/Carbamoylase zu enantiomerenangereicherten α-substituierten Carbonsäuren und die Verwendung dieser Verbindungen.
Erfindungsgemäße enantiomerenangereicherte α-substituierte Carbonsäuren sind wichtige Intermediate für die organische Synthese, können aus ihnen doch eine Reihe wichtiger weiterer optisch hoch reiner Verbindungsklassen gewonnen werden, wie z. B. Aminosäuren, Diole etc, die in der organischen Synthese zur Herstellung bioaktiver Wirkstoffe oder als Katalysatoren Verwendung finden können.
Die enzymatische Reaktion von Hydantoinen zu enantiomer angereicherten Aminosäuren ist in der organischen Synthese wohl bekannt (WO 0058449 sowie dort zitierte Literatur).
Nicht bekannt war, daß mit diesen Enzymen auch Hydantoinanaloge der oben angegebene Struktur in ähnlicher Weise zu α-substituierten enantiomerenangereicherten Carbonsäuren umzusetzen sind.
α-Substituierte Carbonsäuren der gegenständlichen Art können prinzipiell nach dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden. So gelangt man beispielsweise zu den optischen Antipoden der betrachteten Verbindungen durch klassische Racematspaltung der racemischen Gemische oder deren Chromatographie an chiralen Phasen. Die racemischen Gemische wiederum sind mitunter wohlfeile Verbindungen. Die Enantiomere der α-substituierten Carbonsäuren können teilweise auch dem chiral Pool entnommen werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war deshalb die Angabe eines weiteren Verfahrens zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-substituierten Carbonsäuren. Insbesondere sollte das Verfahren geeignet sein, eine breite Palette von derartigen Verbindungen in möglichst hohen optischen Reinheiten und in möglichst kostengünstiger Weise in einem technisch robusten Prozeß zur Verfügung zu stellen.
Diese und weitere sich aus dem Stand der Technik ergebende Aufgaben werden durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 bzw. 2 gelöst. Bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens werden in den von Anspruch 1 oder 2 abhängigen Unteransprüchen geschützt. Anspruch 9 richtet sich auf eine bevorzugte Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen.
Dadurch, daß man in einem Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-substituierten Carbonsäuren Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
unter enzymatischer Ringspaltung mit einer Hydantoinase und Umsetzung des aus der Hydantoinasereaktion hervorgehenden Zwischenprodukts der allgemeinen Formel (II)
mit einer Carbamoylase, wobei
X bedeutet O, S, CH2,
R einen organischen Rest bedeutet, der die Umsetzung mit den beiden Enzymen gestattet, transformiert, gelangt man in sehr guten Ausbeuten und mit hohen optischen Reinheiten in einem technisch leicht durchführbaren und damit wenig anfälligen Prozeß zu den gewünschten Carbonsäuren.
In einem weiteren Aspekt gilt gleiches für ein Verfahren, bei dem zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α- substituierten Carbonsäuren die Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
mit einer Carbamoylase, wobei
X bedeutet O, S, CH2,
R einen organischen Rest bedeutet, der die Umsetzung mit dem Enzym gestattet, durchgeführt wird.
Als Rest R kommen bei diesen Verfahren im Prinzip alle diejenigen organischen Reste in Betracht, welche die Umsetzung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) bzw. (II) im betrachteten Enzymsystem gestatten. Dies ist durch Routineexperimente vom Fachmann leicht herauszufinden. Insbesondere sind solche Reste R bevorzugt, die bedeuten (C1-C8)-Alkyl, (C1-C8)-Alkoxy, (C2-C8)-Alkoxyalkyl, (C6-C18)-Aryl, (C7-C19)-Aralkyl, (C3-C18)-Heteroaryl, (C4-C19)-Heteroaralkyl, (C1-C8)-Alkyl-(C6-C18)-Aryl, (C1-C8)-Alkyl-(C3-C18)-Heteroaryl, (C3-C6)-Cycloalkyl, (C1-C8)-Alkyl-(C3-C8)-Cycloalkyl, (C3-C8)-Cycloalkyl-(C1-C8)-Alkyl, (C1-C8)-Acyl, (C1-C8)-Acyloxy.
Ganz besonders bevorzugt sind die Reste, welche mit den entsprechenden α-Resten von proteinogenen Aminosäuren übereinstimmen. Der Rest R kann jedoch auch den Resten nicht-proteinogener Aminosäuren entsprechen. Natürliche bzw. proteinogene α-Aminosäure sind beispielsweise in Bayer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag, Stuttgart, 22. Auflage, S. 822 ff dargestellt. Bevorzugte unnatürliche oder nicht-proteinogene α- Aminosäuren sind solche aus der DE 199 03 268. Die Seitenkettenreste können von den dort dargestellten α- Aminosäure abgeleitet werden.
Weiters bevorzugt ist eine Reaktion, bei der zusätzlich zum Einsatz einer Hydantoinase und/oder einer Carbamoylase auch eine Racemase verwendet wird. Es wird dabei die Verbindung (I) und/oder (II) mit einer Racemase behandelt. Dies führt dazu, daß aus racemischem Ausgangsprodukt gemäß unten stehendem Schema fast vollständig ein Enantiomer der erfindungsgemäßen α-substituierten Carbonsäuren gebildet werden kann. Die Racemisierung kann, sofern möglich auch durch andere Maßnahmen, insbesondere durch chemische Verfahren erfolgen. Geeignete Verfahren zur Racemisierung und Racemasen sind in EP 0542098, DE 100 50 124, DE 100 50 123, DE 199 35 268 und DE 195 29 211 beispielhaft beschrieben.
Als Racemasen eignen sich vor allem Hydantoin-, Carbamoylaminosäure- oder N-Acetylaminosäureracemasen in diesem Zusammenhang.
Ganz besonders bevorzugt ist ein Verfahren bei dem man die eingesetzten Enzyme in rekombinanter Weise durch Expression aus Wirtsorganismen zur Verfügung stellt (Dissertation von Martin Hils: Mutanten der D-Carbamoylase zur Bildung aktiven Enzyms bei Expression des Gens in Escherichia coli und Analyse eines Genclusters für die Enzyme des Hydantoin- Abbaus aus Agrobacterium sp IP I-671; Verlag Ulrich E. Grauer Stuttgart 1998).
Die Umsetzung kann so mithilfe eines Wirtsorganismus durchgeführt werden, der zur Expression der entsprechenden Enzyme befähigt ist. Bei diesem werden vorzugsweise alle eingesetzten Enzyme durch einen einzigen Wirtsorganismus exprimiert (Ganzzellkatalysator WO 0058449).
Der Wirtsorganismus kann dabei in jedweder Form in die Reaktion eingesetzt werden (nicht aufgeschlossen, teilweise oder ganz aufgeschlossen). In manchen Fällen kann es sich auch anbieten, den Wirtsorganismus nur zur Produktion der Enzyme zu benutzen und diese in möglichst homogen aufgereinigter Form für die Umsetzung einzusetzen. Als Wirtsorganismen kommen hierfür insbesondere E. coli- Stämme in Frage (z. B. NM 522, JM109, RR1, DH5α, TOP 10- oder HB101).
Prinzipiell können alle dem Fachmann für den erfindungsgemäßen Zweck in Frage kommenden Enzyme für die Reaktion eingesetzt werden. Hydantoinasen bzw. Carbamoylasen oder Racemasen, welche bevorzugt Verwendung finden, können der Literatur entnommen werden ("Enzyme Catalysis in Organic Synthesis", Eds.: Drauz, Waldmann, VCH, 1st and 2nd Ed.). Vorzugsweise finden Hydantoinasen des Organismus Bacillus sp., Agrobacterium sp., oder Arthrobacter sp. hierfür Anwendung. Eine besonders bevorzugte Hydantoinase ist die kommerziell erhältliche Hydantoinase 1 der Firma Roche Diagnostics GmbH oder die Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM3747 (Seq. 4) oder DSM3745 (Seq. 3). Als Carbamoylase kommen vorzugsweise diejenige aus Agrobacterium radiobacter IP I-671 (Seq. 1) oder DSM 20117 (Seq. 2) zum Einsatz. Die als bevorzugt einzusetzenden Racemasen sind diejenigen der Gruppe der Hydantoin-, Carbamoylaminosäure- oder N- Acetylaminosäureracemasen zu entnehmen (DE 100 50 124, DE 100 50 123, EP 960557, WO 0058449).
Die erfindungsgemäße Reaktion wird vorzugsweise in einem Enzym-Membran-Reaktor durchgeführt (DE 199 10 691).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung beschäftigt sich mit der Verwendung der enantiomerenangereicherten α-substituierten Carbonsäuren als Substrate in der organischen Synthese, u. a. zur Synthese von Katalysatoren, oder zur Herstellung von bioaktiven Verbindungen.
Die bei der erfindungsgemäßen Reaktion einzusetzenden Verbindungen der allgemeinen Formel (I) können nach Methoden des Fachmanns hergestellt werden. So lassen sich die oxa- oder thia-analogen Hydantoinstrukturen aus den entsprechenden racemischen α-Hydroxy oder α- Mercaptocarbonsäuren durch Umsetzung mit Phosgen oder Methoxy- oder Benzyloxycarbonylchlorid herstellen (analog H. Leuchs. Ber. 39, 857 (1906)). Ein alternatives Verfahren wäre in der Kondensation von 2,4-Dioxo-thiazolidinen oder 2,4-Dioxo-oxazolidinen mit Aldehyden und anschließender Reduktion der Doppelbindung analog den Hydantoinsynthesen zu sehen (Beyer-Walter, Lehrbuch der organischen Chemie, S. Hirzel Verlag, Stuttgart, 22. Auflage, S. 744). Eine weitere Übersicht bietet die Dissertation von T. Waniek, Universität Stuttgart 1999.
Wie schon erwähnt können die genannten Enzyme in freier Form als homogen aufgereinigte Verbindungen oder als rekombinant hergestellte Enzyme zusammen oder nacheinander verwendet werden. Weiterhin können die Enzyme auch als Bestandteil eines Gastorganismus (Ganzzellkatalysator wie in EP 960557, WO 0058449) eingesetzt werden oder in Verbindung mit der aufgeschlossenen Zellmasse des Wirtsorganismus. Möglich ist ebenfalls die Verwendung der Enzyme in immobilisierter Form (Bhavender P. Sharma, Lorraine F. Bailey and Ralph A. Messing, "Immobilisierte Biomaterialiern - Techniken und Anwendungen", Angew. Chem. 1982, 94, 836-852). Vorteilhafterweise erfolgt die Immobilisierung durch Lyophilisation (Dordick et al. J. Am. Chem. Soc. 194, 116, 5009-5010; Okahata et al. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 1971-1974; Adlercreutz et al. Biocatalysis 1992, 6, 291-305). Ganz besonders bevorzugt ist die Lyophilisation in Gegenwart von oberflächenaktiven Substanzen, wie Aerosol OT oder Polyvinylpyrrolidon oder Polyethylenglycol (PEG) oder Brij 52 (Diethylenglycol-mono­ cetylether) (Goto et al. Biotechnol. Techniques 1997, 11, 375-378.
Als (C1-C8)-Alkylreste sind anzusehen Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Hexyl, Heptyl oder Octyl samt aller ihrer Bindungsisomeren. Der Rest (C1-C8)-Alkoxy entspricht dem Rest (C1-C8)-Alkyl mit der Maßgabe, daß dieser über ein Sauerstoffatom an das Molekül gebunden ist. Als (C2-C8)- Alkoxyalkyl sind Reste gemeint, bei denen die Alkylkette durch mindestens eine Sauerstoffunktion unterbrochen ist, wobei nicht zwei Sauerstoffatome miteinander verbunden sein können. Die Anzahl der Kohlenstoffatome gibt die Gesamtzahl der im Rest enthaltenen Kohlenstoffatome an.
Die eben beschriebenen Reste können einfach oder mehrfach mit Halogenen und/oder N-, O-, P-, S-, Si-atomhaltigen Resten substituiert sein. Dies sind insbesondere Alkylreste der oben genannten Art, welche eines oder mehrere dieser Heteroatome in ihrer Kette aufweisen bzw. welche über eines dieser Heteroatome an das Molekül gebunden sind.
Unter (C3-C8)-Cycloalkyl versteht man Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl bzw. Cycloheptylreste etc. Diese können mit einem oder mehreren Halogenen und/oder N-, O-, P-, S-, Si-atomhaltige Reste substituiert sein und/oder N-, O-, P-, S-Atome im Ring aufweisen, wie z. B. 1-, 2-, 3-, 4-Piperidyl, 1-, 2-, 3-Pyrrolidinyl, 2-, 3-Tetrahydrofuryl, 2-, 3-, 4-Morpholinyl.
Ein (C3-C8)-Cycloalkyl-(C1-C8)-Alkylrest bezeichnet einen wie oben dargestellten Cycloalkylrest, welcher über einen wie oben angegebenen Alkylrest an das Molekül gebunden ist.
(C1-C8)-Acyloxy bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine COO-Funktion an das Molekül gebunden ist.
(C1-C8)-Acyl bedeutet im Rahmen der Erfindung einen wie oben definierten Alkylrest mit max. 8 C-Atomen, welcher über eine CO-Funktion an das Molekül gebunden ist.
Unter einem (C6-C18)-Arylrest wird ein aromatischer Rest mit 6 bis 18 C-Atomen verstanden. Insbesondere zählen hierzu Verbindungen wie Phenyl-, Naphthyl-, Anthryl-, Phenanthryl-, Biphenylreste oder an das betreffende Molekül annelierte Systeme der vorbeschriebenen Art, wie z. B. Indenylsysteme, welche ggf. mit (C1-C8)-Alkyl, (C1-C8)- Alkoxy, N(C1-C8)-Alkyl, (C1-C8)-Acyl, (C1-C8)-Acyloxy substituiert sein können.
Ein (C7-C19)-Aralkylrest ist ein über einen (C1-C8)-Alkylrest an das Molekül gebundener (C6-C18)-Arylrest.
Ein (C3-C18)-Heteroarylrest bezeichnet im Rahmen der Erfindung ein fünf-, sechs- oder siebengliedriges aromatisches Ringsystem aus 3 bis 18 C-Atomen, welches Heteroatome wie z. B. Stickstoff, Sauerstoff oder Schwefel im Ring aufweist. Als solche Heteroaromaten werden insbesondere Reste angesehen, wie 1-, 2-, 3-Furyl, wie 1-, 2-, 3-Pyrrolyl, 1-, 2-, 3-Thienyl, 2-, 3-, 4-Pyridyl, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-Indolyl, 3-, 4-, 5-Pyrazolyl, 2-, 4-, 5-Imidazolyl, Acridinyl, Chinolinyl, Phenanthridinyl, 2-, 4-, 5-, 6-Pyrimidinyl.
Unter einem (C4-C19)-Heteroaralkyl wird ein dem (C7-C19)-Aralkylrest entsprechendes heteroaromatisches System verstanden.
Als Halogene (Hal) kommen Fluor, Chlor, Brom und Iod in Frage.
Die gezeigten Strukturen der Verbindungen beziehen sich auf beide optische Isomere.
Enantiomerenangereichert oder enantiomer angereichert bezeichnet die Tatsache, daß eine optische Antipode im Gemisch mit ihrer anderen zu < 50% vorhanden ist.
Die genannten Organismen A. r. DSM 20117, A. r. IP-I-671 und Hydantoinase I sind käuflich erhältlich.
SEQUENZPROTOKOLL
Beispiele
Regio- und Enantiospezifische Hydrolyse von BnBHA mit D-Carbamoylasen (Hydantoinasereaktion s. Diss. von T. Waniek, Stuttgart 1999)
Eine Mischung aus D,L-2-BnBHA und D,L-3-BnBHA (44 : 56, HPLC) wurde in einer Konzentration von 2 g/l (9,6 mM) in 200 µl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7.0 gelöst und mit 80 µl Enzymlösung versetzt. Inkubiert wurde im Thermomixer bei 37°C für die D-Carbamoylase aus Agrobacterium radiobacter IP I-671 und bei 30°C für die D-Carbamoylase aus Arthrobacter DSM 20117. Zum Abstoppen der Reaktion wurden 280 µl Reaktionslösung mit 100 µl 10%-iger Phosphorsäure versetzt. Der Reaktionsansatz wurde zentrifugiert, und der Überstand 1 : 10 mit HPLC-Laufmittel verdünnt und analysiert.
RP18-HPLC zeigte nach 10 min Reaktionsdauer einen auf 3- BnBHA bezogenen Umsatz von 50%, 2-BnBHA wurde nicht umgesetzt.
In einer Chiral-HPLC-Analyse (Cyclodextrin-Phase) erwies sich die entstandene D-BnBS als enantiomerenrein.
Die spezifische Enzymaktivität wurde zu mindestens 3,2 U/mg ermittelt.
Enantiospezifische Hydrolyse von CPhM mit einer D- Carbamoylase (Hydantoinasereaktion s. Diss. von T. Waniek, Stuttgart, 1999)
Die Substrate wurden sowohl mit der D-Carbamoylase aus Agrobacterium sp. IP I-671 als auch mit der aus Arthrobacter crystallopoietes DSM 20117 getestet. Die Bedingungen für Arthrobacter sind bei Abweichungen von den Reaktionsbedingungen mit der D-Carbamoylase im folgenden in Klammern angegeben.
Das D,L-CPhM wurde in einer Konzentration von 2 g/l in 400 µl 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7.0 gelöst und mit 200 µl Enzymlösung versetzt. Inkubiert wurde im Thermomixer bei 37 °C (30°C). Zum Abstoppen der Reaktion wurden 600 µl Reaktionslösung mit 200 µl 10%-iger Phosphorsäure versetzt. Der Reaktionsansatz wurde zentrifugiert, und der Überstand 1 : 10 mit HPLC-Laufmittel verdünnt und analysiert.
RP18-HPLC zeigte nach 60 min (10 min) Reaktionsdauer einen Umsatz von 33% (2,8%).
In einer Chiral-HPLC-Analyse (Cyclodextrin-Phase) erwies sich, daß als enzymatisches Reaktionsprodukt nur D-PhM entstanden war.
Die spezifische Enzymaktivität wurde zu 0,2 U/mg (0,05 U/mg) ermittelt.
Eintopfreaktion
Das D,L-BOD wurden mit einer Konzentration von 2 g/l in 1 ml 0.1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7.0 gelöst, mit 200 µl an Eupergit immobilisierter L-Hydantoinase aus Arthrobacter aurescens DSM 3747 und mit 200 µl D-Carbamoylaselösung (Agrobacterium sp. IP I-671) versetzt. Inkubiert wurde im Thermomixer bei 37°C. Zum Abstoppen der Reaktion wurde das Immobilisat mit 200 µl 10%-iger Phosphorsäure versetzt, abzentrifugiert und der Überstand 1 : 10 in HPLC-Laufmittel verdünnt und analysiert.
Die RP18-HPLC zeigte nach 24 h Reaktionsdauer, daß sowohl CPhM (~20%) als auch PhM (~5%) entstanden war.

Claims (10)

1. Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-substituierten Carbonsäuren durch Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)
unter enzymatischer Ringspaltung mit einer Hydantoinase und Umsetzung des aus der Hydantoinasereaktion hervorgehenden Zwischenprodukts der allgemeinen Formel (II)
mit einer Carbamoylase, wobei
X bedeutet O, S, CH2,
R einen organischen Rest bedeutet, der die Umsetzung mit den beiden Enzymen gestattet.
2. Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten α-substituierten Carbonsäuren durch Umsetzung von Verbindungen der allgemeinen Formel (II)
mittels einer Carbamoylase, wobei
X bedeutet O, S, CH2,
R einen organischen Rest bedeutet, der die Umsetzung mit dem Enzym gestattet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindung (I) und/oder (II) mit einer Racemase behandelt.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung mithilfe eines Wirtsorganismus durchführt, der zur Expression der entsprechenden Enzyme befähigt ist.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 3 und/oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Hydantoinase aus Bacillus thermoglucosidasius einsetzt.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Carbamoylase aus Agrobacterium radiobacter einsetzt.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Racemase eine Hydantoin-, Carbamoylaminosäure- oder N-Acetylaminosäureracemase einsetzt.
8. Verfahren nach einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion im Enzym-Membran-Reaktor durchführt.
9. Verwendung der enantiomerenangereicherten α- substituierten Carbonsäuren hergestellt nach Anspruch 1 oder 2 als Substrate in der organischen Synthese.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Synthese von Katalysatoren oder zur Herstellung von bioaktiven Verbindungen dienen.
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