JP3678539B2 - Flow-through cell for electrochemical analysis - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、電気化学法又は電気化学発光法により試料水溶液中の極微量のホルモン、腫瘍マーカー、薬物、酵素、サイトカイン、核酸等を定量するのに好適な免疫分析用のフロースルーセルに関する。
【０００２】
【従来の技術】
免疫分析の分野では、試料中の極微量（１０^-14ｍｏｌ・ｄｍ^-3以下）の測定対象分析物の存在及び濃度を、発光ラベルを利用して測定するための分析法として、蛍光法、化学発光法及び電気化学発光法が利用されている。蛍光法は光励起により試料から発せられる発光を検出し、電気化学発光法は試料に電圧を印加したときに試料から発せられる発光を検出する。これらの方法は、ホルモン等の測定対象分析物に抗原抗体反応により発光試薬を結合させ、発光試薬由来の発光を定量するものである。なかでも電気化学発光法は原理上検出感度が高い。
【０００３】
この電気化学発光法では、測定対象試料に電極を接触させることが必要であるため、一般にフロースルーセル内に試料を流しながら測定が行われる。一般には、特公平７−６９１２号公報に記載されているように、このフロースルーセルの発光面となる作用電極を構成する壁面の外部に磁石を配置し、磁性ビーズを用いてＢ／Ｆ分離を行って測定精度を向上させる方法が採用されている。Ｂ／Ｆ分離とは、抗原抗体反応により測定対象分析物と発光試薬が結合した結合成分と測定対象物質と結合していない発光試薬であるフリー成分とを分離することである。
【０００４】
一方、表面に抗体を塗布した導電性ビーズを流路内に導入して、作用電極と対電極の間に配置させた後、電極間に電圧を印加して電極間の電流値又は電気抵抗値の変化を測定することで、ビーズ表面に抗原抗体反応により結合した測定対象物質を定量するフロースルーセルも考案されている〔M.Mayer, J.Ruzicka, Anal.Chem., 68, 3808-3814(1996) 参照〕。
【０００５】
本明細書では、前記電気化学発光法で用いられるフロースルーセルと、電極間の電流値又は電気抵抗値を測定して分析を行うフロースルーセルとを総称して電気化学分析用フロースルーセルと呼ぶ。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従来用いられてきた電気化学分析用フロースルーセルでは、測定対象分析物に対して過剰量の発光試薬を加えている。これは極微量の測定対象分析物に高確率で発光試薬を結合させるためである。しかしＢ／Ｆ分離が十分になされないと、測定対象分析物と結合していない発光試薬（フリー成分）由来の発光がノイズとなり、Ｓ／Ｎ比が低下する。
【０００７】
例えば磁性ビーズを用いたＢ／Ｆ分離法では、特公平７−６９１２号公報に記載されているように、測定対象分析物と発光試薬が結合したもの（結合成分）を更に磁性ビーズに結合させ、磁石により磁性ビーズを捕捉したまま、水流の力でフリー成分を洗い流している。しかし、Ｐｔ等で構成される作用電極表面にフリー成分が吸着してしまう非特異吸着と呼ばれる現象が知られており、水流の力だけではＢ／Ｆ分離の時間が長くかかるのが現状である。また、作用電極と対電極の間に流れる電流値や電気抵抗を測定するタイプの電気化学分析用フロースルーセルでも、作用電極又は対電極表面に非特異吸着するフリー成分が電流値を乱す原因となっている。
【０００８】
一方、従来用いられてきた電気化学分析用フロースルーセルの形状は平面型である。そして、光出射面である作用電極からの光は、作用電極から見て対電極の裏側にある光検出器で測定される形状となっている。このため、従来形のフロースルーセル内の作用電極上から発生した発光の全てが、実際にフォトマル、フォトダイオード等の光検出器で検出されている訳ではない。
【０００９】
この第１の理由は、作用電極と光検出器の中間に配置された対電極に光の一部が遮られるためである。またフロースルーセル内部で生じた発光は、セルの一部分を構成する透明窓、及び光検出器とフロースルーセルの隙間としての空気層を経て、光検出器の受光面に入射する。光がガラス等から構成される透明窓を抜けて空気層に入る際、すなわち屈折率の大きい物質から小さい物質に光が入射する際には、その界面での反射率が高く、臨界角を越えると全反射が生じる。従ってフロースルーセル内の作用電極上での発光が光検出器に到達しない第２の理由は、透明窓と空気層との界面での光反射である。
【００１０】
本発明は、このような従来技術の問題点に鑑みてなされたもので、その第１の目的は、Ｂ／Ｆ分離の効率を高めて、短時間でＢ／Ｆ分離を行うことで、装置のスループットを向上させることが出来る電気化学分析用フロースルーセルを提供することにある。
また、本発明の第２の目的は、試料からの極微量な発光を漏れなく検出することが出来る電気化学分析用フロースルーセルを提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
前記第１の目的は、電気化学反応を起こして測定を行う電極の流路上流側において、試料流体中のフリーなタンパク質を除去するか、あるいは減少させる機構を備えることで達成される。また、前記第１の目的は、電極表面に非特異吸着したフリー成分は、界面活性剤やアルカリ性の洗浄液を加えつつ水を流すとより短時間で洗浄される性質を利用することで達成される。前記第２の目的は、作用電極の表面から発生した光を反射させつつ光検出器へと導く役割を有する光ガイドをフロースルーセルの内部に組み込むことで達成される。
【００１２】
すなわち、本発明は、試料流体が流入する試料流入部と、試料流体が流出する試料流出部と、試料流入部と試料流出部とを接続する試料流路部と、試料流路部の壁面の一部を構成する作用電極と、作用電極に対する対電極とを備える電気化学分析用フロースルーセルにおいて、作用電極の上流側に、試料流体中のフリーなタンパク質を除去する手段を備え、フリーなタンパク質を除去する手段は、第２の作用電極と第２の対電極とで構成することを特徴とする。
【００１３】
フリーなタンパク質を除去する手段は、前述した現状のフロースルーセルにおいて問題となっている非特異吸着現象そのものを逆に利用して、フリー成分を流路上流側において除去、あるいは減少させる方法である。上記の作用電極と対電極は、電気化学法あるいは電気化学発光法により、測定対象分析物を測定するための分析用の電極である。そして、その上流側に位置する第２の作用電極と第２の対電極は、分析用の作用電極又は対電極のいずれか、あるいは両方に吸着して測定ノイズの原因となる非特異吸着を、自らに吸着させるための電極である。
【００１４】
本発明の電気化学分析用フロースルーセルは、内部の水流が層流となるように流速を制御することが出来る。水流が層流である場合、作用電極あるいは対電極に非特異吸着するフリー成分は、その上流の流路内部でも、分析用の作用電極あるいは対電極を内包する壁面の近傍を通過していると考えられる。従って、壁面近傍を通過するフリー成分を直前に配置された第２の作用電極あるいは第２の対電極で吸着することで取り除き、分析用の作用電極及び対電極に吸着するフリー成分を減少させることが出来る。なお流路内で壁面から離れた部分を通過するフリー成分は、電極に吸着されることがないので、そもそも測定ノイズの原因とはなりにくい。従って、壁面近傍を流れるフリー成分のみを取り除けば良い。しかし、壁面近傍を流れていないフリー成分についても除去効果があることも期待できる。
【００１５】
いったん分析用の作用電極や対電極、あるいは第２の作用電極や対電極に吸着したフリー成分は、測定終了後に、界面活性剤やアルカリ性溶液等の洗浄液を流すといった現状のフロースルーセルの技術で十分短時間に洗い流すことができる。そこで、再度計測する際の問題点はない。
また、前記フリーなタンパク質を除去する手段は、フリーなタンパク質が吸着しやすい多孔質セラミックスや疎水性の大きい材料、あるいは抗原固定化膜などからなるフリータンパク質吸着板とすることもできる。
【００１６】
前記フリーなタンパク質を除去する手段は、試料流入部の上流側の流路の途中に設けてもよいし、フロースルーセル内部の試料流路部に設けてもよい。
電気化学法を利用する場合は、作用電極と対電極間の電流値又は電気抵抗値の変化を計測する手段、具体的には電流計や抵抗計を備えることができる。また、電気化学発光法を利用する場合は、対電極を内包する壁面を光透過性材料で構成するのが好ましい。
【００１７】
前記フリーなタンパク質を除去する手段を試料流路部に設けた第２の作用電極と第２の対電極とで構成する場合、作用電極に対向する壁面を光透過性とし、第２の作用電極に対向する壁面を遮光性とするのが好ましい。
作用電極に近接する壁面の外部に磁石を配置することで、磁性ビーズを用い、Ｂ／Ｆ分離を行って測定精度を向上させることもできる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。
図１〜図３は、本発明の一形態である、電気化学発光法を用いた電気化学分析用フロースルーセルの概略図である。図１は試料流れに対して横方向から見た側面図、図２は試料流入側から見た側面図、図３は図１のＡ−Ａ方向から見た平面断面図である。
【００２５】
この電気化学分析用フロースルーセルは、光透過性構造材７、非吸水性構造材８、及び支持材９を積層して構成され、中間の非吸水性構造材８をくり抜いて試料流体の流路が形成されている。光透過性構造材７にはガラスやアクリル、ポリメタクリル酸メチル等の材料を用いることができ、非吸水性構造材８や支持材９にはプラスチック等の高分子化合物、Ａｌやステンレス等の金属、あるいはセラミックを用いることが出来る。非吸水性構造材８の試料流体と接する面を曲面とすることで、試料流体の流れをスムーズにすることが出来る。
【００２６】
試料流路には分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂが配置されており、これらの電極から試料流体に対して電圧を印加して発光を生じさせる。その水流の上流側に、フリー成分吸着用の作用電極３と対電極４が設置されている。分析用の作用電極１や対電極２，２ｂを構成する材料には、対腐食性の高いＰｔや、電極として一般に用いられているＡｌ，Ａｇ等の金属を用いることが出来る。また、フリー成分吸着用の作用電極３や対電極４を構成する材料にも、電極として一般に用いられているＰｔ，Ａｌ，Ａｇ等の金属を用いることが出来る。あるいは炭素電極等の有機導電性物質を用いてもよい。そして、作用電極３及び対電極４の表面は滑らかであっても、適当な凸凹があっても、フリー成分を捕らえるためには支障がない。
【００２７】
作用電極１に近い側のフロースルーセル外部側壁には磁石１１が配置されている。このように光出射面を構成する試料流路の壁面の外部に磁石１１を配置することで、磁性ビーズを用い、Ｂ／Ｆ分離を行って測定精度を向上させる方法を採用することが出来る。この磁石１１は、電磁石であってもよいし、永久磁石であっても良い。磁石１１の磁力によって作用電極１上に捕捉されている磁性ビーズは、分析終了後、電磁石への通電を遮断して、あるいは永久磁石を機械的にフロースルーセルより遠ざけて磁力を弱めることにより、フロースルーセルから排出する。
【００２８】
試料流体は試料流入口５からセル内部に導入され、まずフリー成分吸着用の作用電極３と対電極４の間を通過する。このとき、フリー成分はフリー成分吸着用の作用電極３及び／又は対電極４に吸着して試料流体中の濃度が減少する。その後、分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間で、磁石１１により捕捉される。続いて作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間に電圧を印加して生じた発光を、光透過性構造材７を介してフォトマルやフォトダイオード等の光検出器１０で検出する。
【００２９】
測定終了後の試料は、試料流出口６から排出される。また洗浄液を試料流入口５から導入して、分析用の作用電極１及び対電極２ａ，２ｂ、フリー成分吸着用の作用電極３及び対電極４の表面を洗浄する。フリー成分吸着用の作用電極３あるいは対電極４上でも、フリー成分由来の発光が生じるが、図１〜３に示すように、光検出器１０に対して、フリー成分由来の発光が届きにくいか、届かない配置をとることで、あるいはフリー成分吸着用の作用電極３あるいは対電極４と光検出器１０との間を遮光することで、測定対象分析物由来の発光を含む分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂからの発光のみを計測することが出来る。
【００３０】
図４は、分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間にかかる電圧を、フリー成分吸着用の作用電極３と対電極４の間にかかる電圧に等しくした場合のポテンショスタット回路図である。後述するように、−０．５Ｖから＋０．５Ｖの範囲内で、Ｂ／Ｆ分離の間に電圧を印加しても、発光強度は変化せずに非特異吸着のみが増加する条件が存在する。この条件で電圧をコントロールすれば、分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間にかかる電圧を、フリー成分吸着用の作用電極３と対電極４の間にかかる電圧に等しても、本発明の目的を達成することが出来る。図４中、１２，１３は参照電極であり、１４は増幅器である。
【００３１】
図５は、２個の増幅器１４ａ，１４ｂを用いて、フリー成分吸着用の作用電極３と対電極４の間にかかる電圧を、分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間にかかる電圧と独立して制御する場合のポテンショスタット回路図である。この回路構成の場合は、フリー成分吸着用の作用電極３と対電極４の電圧を発光が生じない電圧で増減させることで、ノイズの減少をより低く押さえることが可能となる。
【００３２】
〔実験例１〕
Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺（ｂｐｙはビピリジルを意味する）で標識されたビオチンがＰｔ電極表面に吸着する量を電気化学発光法によって検出した。Ｂ／Ｆ分離時の印加電圧を変化させることで、フリー成分の吸着量がどのように変化するかを調べた。
【００３３】
Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺は、電気化学発光する代表的な物質である。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺標識したビオチンタンパク質（０．１３３マイクログラム／マイクロリットル）を用いて、Ｐｔ電極に吸着するビオチンタンパク質を、電気化学発光法で測定した。実験に用いたビオチンタンパク質の量は２３．９４マイクログラムである。Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺標識したビオチンタンパク質は、抗体と結合していないフリー成分に相当するとした。Ｂ／Ｆ分離の際に１８秒間、一定電圧を、フリー成分除去用Ｐｔ電極３，４に印加している。Ｂ／Ｆ分離の際の印加電圧とフリー成分の増加率との関係を〔表１〕に示す。但し、吸着増加率は、［電圧印加した場合のビオチンの吸着量（発光量）］／［電圧印加しない場合のビオチンの吸着量（発光量）］の比率である。
【００３４】
【表１】

【００３５】
このように＋０．４Ｖ以上、あるいは−０．１Ｖ以下の電圧を１８秒間印加することでフリー成分（ここではビオチン）が電極上に吸着する量が増えること、及びその吸着量が電圧の大きさに依存することが分かる。
【００３６】
〔実験例２〕
Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺で標識された磁性ビーズを磁石によりＰｔ電極表面で捕捉して電気化学発光法によって検出した。Ｂ／Ｆ分離時の印加電圧を変化させることで、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺で標識された磁性ビーズの発光がどのように変化するかを調べた。
【００３７】
Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺標識したビオチンタンパク質（２３．９４マイクログラム）と、ストレプトアビジンで表面をコートした磁性ビーズを常温で１時間インキュベートする。すると、アビジン−ビオチン結合が起こり、磁性ビーズがＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺で標識される。しかし、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺標識したビオチンタンパク質の中には、ストレプトアビジンと結合しない成分があり、これを実験例１と同様にフリー成分とみなす。また、アビジン−ビオチン結合により磁性ビーズと結合したビオチンタンパク質を結合成分とみなす。
【００３８】
磁石を用いて、Ｐｔ電極上に捕捉される磁性ビーズの量を、電気化学発光法で測定した。そのＢ／Ｆ分離の際に１８秒間、一定電圧を、フリー成分除去用Ｐｔ電極３，４に印加した。なお、結合成分の量は、フリー成分の量と比較して桁違いに大きいので、測定された発光量は結合成分の量と比例する。Ｂ／Ｆ分離の際の印加電圧と結合成分の増加率との関係を〔表２〕に示す。但し、結合成分の増加率は、（電圧印加した場合の発光量）／（電圧印加しない場合の発光量）の比率である。
【００３９】
【表２】

【００４０】
このようにＲｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺を用いた系では、−０．１Ｖから＋０．５Ｖ程度の電圧をＢ／Ｆ分離時に印加しても、発光値に悪影響は生じない。しかし、その範囲を超えて電圧をＢ／Ｆ分離時に印加すると、結合成分の電気化学発光そのものを阻害することになる。これは、Ｒｕ（ｂｐｙ）₃ ²⁺が電気化学発光する際に必要となる還元剤（実験で用いたのはトリプロピルアミン）が電極上で過剰に消費されるためであると考えられる。
【００４１】
実験例１の結果と総合すると、＋０．３Ｖ〜＋０．５Ｖの電圧をフリー成分除去用電極に十数秒程度印加することで、結合成分由来の発光を阻害することなく、フリー成分除去用電極にフリー成分タンパク質を吸着させることができる。その結果、電気化学発光のＳ／Ｎ比を向上させることができる。
図６は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図である。図６は、図３に相当する平面断面図である。この例では、分析用の作用電極１と対電極２ａ，２ｂの水流の上流側に、フリー成分除去用のフリータンパク質吸着板１５を設置する。その他の構造は、先に説明した図１〜３の例と同様である。
【００４２】
フリータンパク質吸着板１５としては、ハイドロキシアパタイト等の多孔質セラミックスの細孔径を利用する。ハイドロキシアパタイト単体により、タンパク質、アミノ酸の吸着を行うことができる。また、ポリエチレンやシリコンゴムのように疎水性の大きい（表面エネルギー中の分散力成分の割合の大きい）材料を用いることができる。これらの材料は、タンパク質の吸着を受けやすいことが知られている〔先端技術材料応用辞典編集委員会編「先端技術材料応用辞典」（１９９０）第１１７頁、第３８８頁参照〕。フリータンパク質の成分が分かっている場合には、その物質と抗原抗体反応を生じる物質を、細孔制御チタニア、細孔制御アルミナ、細孔制御シリカ等の担体に固定化して用いてもよい。例えば、フリータンパク質としてビオチンが含まれる場合には、ストレプトアビジンを固定化して用いる。フリータンパク質吸着板１５を用いる場合には、使用を続けると吸着板１５の吸着性能が飽和してくるので、使い捨て式のセルとするのが好ましい。
【００４３】
図７〜図９は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図である。図７は試料流れに対して横方向から見た側面図、図８は試料流入側から見た側面図、図９は図７のＡ−Ａ方向から見た平面断面図である。説明を簡単にするため、図７〜図９において、図１〜図３と同様の機能部分には図１〜図３と同じ番号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００４４】
この電気化学分析用フロースルーセルは、作用電極１と対電極２ａ，２ｂにより、試料流体に対して電圧を印加して発光を生じさせる。その水流の上流側に洗浄剤を導入する側道２１を設け、側道２１に接続して洗浄液タンク２２及び弁２３を設置する。試料流体は試料流入口５からフロースルーセル内部に導入され、作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間で、磁石１１により捕捉される。
【００４５】
続いて、水流を継続させたまま、側道２１より洗浄液を導入して、作用電極１及び対電極２ａ，２ｂの表面に吸着したフリー成分を洗浄する。その後、作用電極１と対電極２ａ，２ｂの間に電圧を印加して生じた発光を、光検出器１０で検出する。測定終了後の試料は、試料流出口６から排出される。また、洗浄液を試料流入口５からも導入して、作用電極１と対電極２ａ，２ｂの表面を洗浄することで次の測定に備える。
【００４６】
側道２１から導入する洗浄液としては、ドデシルポリ（エチレングリコールエーテル）、オクチルフェノールポリ（エチレングリコールエーテル）、ポリオキシエチレンソルビタン等の非イオン性界面活性剤、あるいはソディウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）等の陰イオン性界面活性剤を用いることができる。
洗浄液の濃度を、抗原抗体反応が切断されない濃度にしておくことで、測定対象物質の定量には支障がない条件で、非特異吸着したフリー成分をより短時間で洗浄することが出来る。抗原抗体反応が切断されない濃度は、洗浄液を加える時間により異なる。例えば、洗浄液を１秒間しか加えないのであれば、界面活性剤やアルカリ性の洗浄液の濃度は、体積比にして３％程度でよい。しかし、１０秒間以上加える場合は、体積比にして０．０５％程度が限度となる。
【００４７】
試料流体は、例えばシリンジをパルスモータで駆動することによってフロースルーセル内に導入される。そして、シリンジを駆動するモータの回転方向を一方向とすることで、電気化学分析用セル内部の溶液の流れを一方向とすることができる。また、パルスモータの回転方向を時計回り、反時計回りに交互に変えることで、水の流れを反転して逆方向にした後、再び反転して順方向にする動作を加えることができる。試料流体に洗浄液を導入した後、セル中を流れる水の流れを反転する動作を加えることにより、作用電極１と対電極２ａ，２ｂの表面の洗浄効果を更に高めることができる。
【００４８】
続いて、図１０〜図１４を参照して、試料からの発光を検出する効率を高めることのできる電気化学分析用フロースルーセルについて説明する。図１０〜図１４において、図１〜図３と同様の機能部分には図１〜図３と同じ番号を付して、その詳細な説明を省略する。また、図１０〜図１４における平面断面図は、いずれも図３の平面断面図に相当する図である。
【００４９】
図１０は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図であり、（ａ）は平面断面図、（ｂ）は側面図である。この電気化学分析用フロースルーセルは、平板型の対電極２ａ，２ｂの外側に、対電極２ａ，２ｂと平行した平板形状の光ガイド（光反射面）３１ａ，３１ｂを備えている。
この電気化学分析用フロースルーセルは作用電極１と平板形対電極２ａ，２ｂにより、試料流体に対して電圧を印加して発光を生じさせる。作用電極を構成する壁面に磁石を配置し、磁性ビーズを用い、Ｂ／Ｆ分離を行って測定精度を向上させる方法を採用した場合、作用電極１が光出射面となる。作用電極１上からの発光は、光検出器１０に入射してはじめて信号として検出される。
【００５０】
そこで、作用電極１と光検出器１０の中間に配置される対電極２ａ，２ｂの遮光面積を減少させ、作用電極１から光検出器１０に向かう発光を妨げないようにする。そのために、平板型対電極２ａ，２ｂを用い、平板型対電極２ａ，２ｂの平面が作用電極１の平面にほぼ直交するように配置することで、対電極２ａ，２ｂの遮光面積を小さくし、対電極２ａ，２ｂに光ガイド機能（光を反射して光検出器１０へと光を導く機能）を持たせることができる。
【００５１】
対電極２ａ，２ｂの遮光面積を小さくするために電極幅を減少させた際、対電極２ａ，２ｂの断面積が小さくなることにより発生するジュール熱を低く押さえるために、対電極２ａ，２ｂの高さを大きくする必要があるが、このような平板型、あるいは後述する円筒型、楕円筒型、矩形型の電極はこの目的とも合致した形状である。
【００５２】
この平板形対電極２ａ，２ｂだけでも光反射を行うが、更に光反射板（光ガイド）３１ａ，３１ｂを設けることで、平板形対電極２ａ，２ｂで反射して外縁方向へ逃げていく光を、再度光検出器１０へと導く機能を持たせている。電気化学分析用フロースルーセルと光検出器１０の接続部に光反射性ソケット３２も備えれば、光のロスを更に減少させることが出来る。
【００５３】
光ガイド３１ａ，３１ｂを構成する材料としては、化学反応による劣化が生じない場合は、Ａｌ，Ａｇ，Ａｕ等の金属材料によるメッキや蒸着等の鏡面処理、あるいはそれらの金属そのものを用いることができる。試料流体と接する面が腐食を受ける場合は、その試料流体と接触する面にＰｔ等の腐食に強い金属材料をメッキや蒸着するのが好ましい。
【００５４】
また、光ガイド３１ａ，３１ｂの製作は、光透過性構造材７としてアクリルを用いる場合は、例えば、アクリル板へスルーホールを形成し、Ｃｕメッキにより埋めた後、試料流体との接触面に白金メッキで保護膜を作ることで行うことができる。あるいは光ガイド３１ａ，３１ｂとして作用する白金板をアクリルに挟み、接着剤で固定後研磨するなどの一般的な方法で製作することもできる。
【００５５】
図１１は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図であり、（ａ）は平面断面図、（ｂ）は側面図である。この電気化学分析用フロースルーセルは、平板型の対電極２ａ，２ｂの周囲に、光ガイドとして円筒形状の光反射面３３を配置している。円筒形状の光反射面３３は、作用電極１からの発光を反射して光検出器１０へと集光する機能を有する。図１０では平板形状の光反射面（光ガイド）３１ａ，３１ｂを用いたが、それを円筒形状とすることで３６０度方向で、集光することが出来る。
【００５６】
図１２は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図であり、（ａ）は平面断面図、（ｂ）は側面図である。この電気化学分析用フロースルセルは、矩形の断面形状を有する筒状の対電極３４を備えている。対電極と別個の光反射板を有していない点で図１０、図１１に示した電気化学分析用フロースルーセルと異なっている。
【００５７】
この例の場合、矩形対電極３４を、試料流路の外縁部で、試料流体と接するようにすることで、作用電極１からの発光を外部に逃がすことなく光検出器１０に集光することができる。すなわち、光反射板の機能を対電極３４が単独で果たすような構造である。光反射板を省略したことにより、構成がより単純になり、加工コストを更に低減することが出来る。
【００５８】
図１３は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図であり、（ａ）は平面断面図、（ｂ）は側面図である。この電気化学分析用フロースルセルは、光ガイドとして光ファイバ３５を用いる。作用電極１からの発光を光検出器１０へと集光するために、対電極２ａ，２ｂを光ファイバ３５中に埋め込んでいる。この場合、光ファイバのコアとクラッドの境界が光ガイドに相当し、３６０度方向で集光することが出来る。
【００５９】
図１４は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する図であり、（ａ）は平面断面図、（ｂ）は側面図である。この電気化学分析用フロースルセルは、透明な作用電極４１と光ガイドとしての光ファイバ３６を用いている。透明な作用電極４１は、酸化スズ（ＳｎＯ₂）やインジウムティンオキサイド（Indium Tin Oxide）等によって作られる。
【００６０】
作用電極４１を透明とした場合には、光検出器１０を対電極２の裏側に配置する必要はない。この例では、光検出器１０を作用電極４１の下部に配置している。支持材９中に埋め込んだ光ファイバ３６は、作用電極における発光を３６０度方向で集光して、光検出器１０に導く。他の例と異なり、対電極２を作用電極４１と平行な平板電極とすることで、対電極２の方向に進んだ光を反射して光ファイバ３６に入射させ、集光効率を高めることができる。光ファイバ３６の代わりに、作用電極４１の周囲を囲むような円筒形状、楕円筒形状、あるいは矩形形状の光ガイドを備えても同様に集光効率を向上することができる。
【００６１】
これまで説明してきた試料流体のフリーなタンパク質を除去する方法、洗浄液による洗浄方法、及び電気化学発光の集光効率を向上する方法は、各々単独で用いても良いがそれらを組み合わせて用いるといっそう効果を高めることができる。
図１５〜図１７は、本発明による電気化学分析用フロースルーセルの他の例を説明する概略図である。図１５は試料流れに対して横方向から見た側面図、図１６は試料流入側から見た側面図、図１７は図１５のＡ−Ａ方向から見た平面断面図である。説明を簡単にするため、図１５〜図１７において、図１〜図１４と同様の機能部分には図１〜図１４と同じ番号を付して、その詳細な説明を省略する。
【００６２】
この例の電気化学分析用フロースルーセルは、電気化学発光分析用の作用電極１及び対電極２ａ，２ｂの上流側に、フリータンパク質除去用の手段（この例では、図１〜図３で説明したフリー成分吸着用の作用電極３や対電極４）、及び分析用の作用電極１及び対電極２ａ，２ｂに付着したフリータンパク質を洗浄するための洗浄液を導入する側道２１を設け、さらに分析用の対電極２ａ，２ｂの近傍に光ガイド３１ａ，３１ｂを設けて集光力を高めたものである。この改良により、電気化学発光を用いた免疫分析装置のＳ／Ｎ向上、スループット向上を図る。なお、各手段の組み合わせの例は、ここに示したものに限られないのは明らかである。
【００６３】
以上、本発明の実施の形態について主に電気化学発光法を例として説明してきたが、化学発光を用いたものや、発光を用いない電気化学分析用セルについても、本発明は同様に適用することが可能できる。電気化学法を利用する場合は、光検出器に代えて、検出手段として電流計や抵抗計を用いることが出来る。
【００６４】
【発明の効果】
本発明によると、電気化学分析用フロースルーセルの測定対象分析物を測定するための電極の上流側に、非特異吸着をして測定ノイズの原因となっているフリー成分を除去するかあるいは減少させる機構を設けることで、Ｂ／Ｆ分離の効率を高めて、短時間でＢ／Ｆ分離を行い、装置のスループットを向上させることが出来る。
【００６５】
また、電気化学分析用フロースルーセルの測定対象分析物を測定するための電極の上流側に、非特異吸着をして測定ノイズの原因となっているフリー成分を除去するための、洗浄液の導入口を設けることで、より短時間でＢ／Ｆ分離を行い、装置のスループットを向上させることが出来る。
さらに、フロースルーセルの構造を集光性に優れた形状としたことで、電気化学発光法の測定感度を向上することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【図１】第２の作用電極と対電極のペアを用いた電気化学分析用フロースルーセルを試料流れに対して横方向から見た側面図。
【図２】図１の電気化学分析用フロースルーセルを試料流入側から見た側面図。
【図３】図１のＡ−Ａ方向から見た平面断面図。
【図４】分析用の作用電極と対電極の間にかかる電圧をフリー成分吸着用の作用電極と対電極の間にかかる電圧に等しくした場合のポテンショスタット回路図。
【図５】分析用の作用電極と対電極の間にかかる電圧をフリー成分吸着用の作用電極と対電極の間にかかる電圧と独立して制御する場合のポテンショスタット回路図。
【図６】フリータンパク質吸着板を用いた電気化学分析用フロースルーセルの概略図。
【図７】本発明による他の例の電気化学分析用フロースルーセルを試料流れに対して横方向から見た側面図。
【図８】図７の電気化学分析用フロースルーセルを試料流入側から見た側面図。
【図９】図７のＡ−Ａ方向から見た平面断面図。
【図１０】対電極と平行した平板形状の光反射面を備えた電気化学分析用フロースルーセルの説明図。
【図１１】対電極の周囲に円筒形状の光反射面を配置した電気化学分析用フロースルーセルの説明図。
【図１２】矩形対電極電気化学分析用フロースルセルの説明図。
【図１３】光ファイバ埋め込み型対電極を有する電気化学分析用フロースルーセルの説明図。
【図１４】透明な作用電極と光ファイバを用いた電気化学分析用フロースルーセルの説明図。
【図１５】本発明による他の例の電気化学分析用フロースルーセルを試料流れに対して横方向から見た側面図。
【図１６】図１５の電気化学分析用フロースルーセルを試料流入側から見た側面図。
【図１７】図１５のＡ−Ａ方向から見た平面断面図。
【符号の説明】
１…作用電極、２ａ，２ｂ…平板形対電極、３…第２の作用電極、４…第２の対電極、５…試料流入口、６…試料流出口、７…光透過性構造材、８…非吸水性構造材、９…支持材、１０…光検出器、１１…磁石、１２，１３…参照電極、１４，１４ａ，１４ｂ…アンプ、１５…フリータンパク質吸着板、２１…側道、２２…洗浄液タンク、２３…弁、３１ａ，３１ｂ…光反射板（光ガイド）、３２…光反射性ソケット、３３…円筒状光反射面、３４…矩形対電極、３５，３６…光ファイバ[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a flow-through cell for immunoassay suitable for quantifying trace amounts of hormones, tumor markers, drugs, enzymes, cytokines, nucleic acids and the like in a sample aqueous solution by an electrochemical method or an electrochemiluminescence method.
[0002]
[Prior art]
In the field of immunoassay, trace amounts in samples (10^-14mol · dm^-3Fluorescence, chemiluminescence, and electrochemiluminescence methods are used as analytical methods for measuring the presence and concentration of analytes to be measured (below) using luminescent labels. The fluorescence method detects light emitted from the sample by photoexcitation, and the electrochemiluminescence method detects light emitted from the sample when a voltage is applied to the sample. In these methods, a luminescent reagent is bound to an analyte to be measured such as a hormone by an antigen-antibody reaction, and luminescence derived from the luminescent reagent is quantified. In particular, the electrochemiluminescence method has high detection sensitivity in principle.
[0003]
In this electrochemiluminescence method, since it is necessary to bring an electrode into contact with the sample to be measured, the measurement is generally performed while flowing the sample in the flow-through cell. In general, as described in Japanese Examined Patent Publication No. 7-6912, a magnet is disposed outside the wall that forms the working electrode serving as the light emitting surface of the flow-through cell, and B / F separation is performed using magnetic beads. The method of improving the measurement accuracy by performing is adopted. B / F separation is the separation of a binding component in which an analyte to be measured and a luminescent reagent are bound by an antigen-antibody reaction and a free component that is a luminescent reagent that is not bound to a substance to be measured.
[0004]
On the other hand, after introducing conductive beads coated with antibodies on the surface into the flow path and placing them between the working electrode and the counter electrode, a voltage is applied between the electrodes to provide a current value or electrical resistance value between the electrodes. A flow-through cell has also been devised to measure the measurement target substance bound to the bead surface by an antigen-antibody reaction [M. Mayer, J. Ruzicka, Anal. Chem., 68, 3808-3814. (1996)].
[0005]
In this specification, the flow-through cell used in the electrochemiluminescence method and the flow-through cell for measuring and analyzing the current value or the electrical resistance value between the electrodes are collectively referred to as a flow-through cell for electrochemical analysis. Call.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
In conventional flow-through cells for electrochemical analysis, an excessive amount of luminescent reagent is added to the analyte to be measured. This is because the luminescent reagent is bound to a very small amount of the analyte to be measured with a high probability. However, if B / F separation is not sufficiently performed, luminescence derived from a luminescent reagent (free component) that is not bound to the analyte to be measured becomes noise, and the S / N ratio decreases.
[0007]
For example, in the B / F separation method using magnetic beads, as described in Japanese Examined Patent Publication No. 7-6912, a substance to be measured and a luminescent reagent bonded (binding component) are further bonded to the magnetic beads. The free components are washed away by the force of water flow while the magnetic beads are captured by the magnet. However, a phenomenon called non-specific adsorption in which free components are adsorbed on the surface of the working electrode composed of Pt or the like is known, and the current situation is that it takes a long time for B / F separation only with the force of water flow. . In addition, even in the flow-through cell for electrochemical analysis that measures the current value and electric resistance flowing between the working electrode and the counter electrode, free components that non-specifically adsorb on the surface of the working electrode or the counter electrode disturb the current value. It has become.
[0008]
On the other hand, the shape of a flow-through cell for electrochemical analysis that has been conventionally used is a planar type. And the light from the working electrode which is a light emission surface becomes a shape measured with the photodetector in the back side of a counter electrode seeing from a working electrode. For this reason, not all light emitted from the working electrode in the conventional flow-through cell is actually detected by a photodetector such as a photomultiplier or a photodiode.
[0009]
The first reason is that a part of the light is blocked by the counter electrode disposed between the working electrode and the photodetector. The light emitted inside the flow-through cell is incident on the light-receiving surface of the photodetector through a transparent window forming a part of the cell and an air layer as a gap between the photodetector and the flow-through cell. When light enters the air layer through a transparent window made of glass, etc., that is, when light enters a small material from a material with a high refractive index, the reflectance at the interface is high and exceeds the critical angle. Total reflection occurs. Therefore, the second reason why the light emission on the working electrode in the flow-through cell does not reach the photodetector is light reflection at the interface between the transparent window and the air layer.
[0010]
The present invention has been made in view of such problems of the prior art, and a first object of the present invention is to improve the efficiency of B / F separation and perform B / F separation in a short period of time. It is an object of the present invention to provide a flow-through cell for electrochemical analysis capable of improving the throughput.
A second object of the present invention is to provide a flow-through cell for electrochemical analysis capable of detecting a very small amount of luminescence from a sample without omission.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
The first object is achieved by providing a mechanism for removing or reducing free protein in the sample fluid on the upstream side of the flow path of the electrode that performs measurement by causing an electrochemical reaction. Further, the first object is achieved by utilizing the property that the free component non-specifically adsorbed on the electrode surface is washed in a shorter time when flowing water while adding a surfactant or an alkaline washing liquid. . The second object is achieved by incorporating a light guide having a role of guiding the light generated from the surface of the working electrode to the photodetector while reflecting the light, inside the flow-through cell.
[0012]
  That is, the present invention includes a sample inflow portion into which a sample fluid flows in, a sample outflow portion through which the sample fluid flows out, a sample channel portion connecting the sample inflow portion and the sample outflow portion, and a wall surface of the sample channel portion. In a flow-through cell for electrochemical analysis comprising a working electrode constituting a part and a counter electrode with respect to the working electrode, a means for removing free protein in the sample fluid is provided upstream of the working electrode.The means for removing free protein comprises a second working electrode and a second counter electrodeIt is characterized by that.
[0013]
  The means to remove free protein is,PreviousThis is a method of removing or reducing free components on the upstream side of the flow path by reversely utilizing the non-specific adsorption phenomenon itself which is a problem in the current flow-through cell described above. The working electrode and the counter electrode are analytical electrodes for measuring the analyte to be measured by an electrochemical method or an electrochemiluminescence method. Then, the second working electrode and the second counter electrode located on the upstream side thereof absorb non-specific adsorption that causes adsorption to either the working electrode or the counter electrode for analysis, or both, and cause measurement noise. It is an electrode to be adsorbed by itself.
[0014]
The flow-through cell for electrochemical analysis of the present invention can control the flow velocity so that the internal water flow becomes a laminar flow. When the water flow is a laminar flow, the free component that is non-specifically adsorbed on the working electrode or counter electrode passes through the vicinity of the wall containing the working electrode or counter electrode for analysis, even in the upstream flow path. Conceivable. Therefore, the free component that passes near the wall surface is removed by being adsorbed by the second working electrode or the second counter electrode disposed immediately before, and the free component adsorbed on the working electrode and the counter electrode for analysis is reduced. I can do it. In addition, since the free component which passes through the part away from the wall surface in the flow path is not adsorbed by the electrode, it is unlikely to cause measurement noise in the first place. Therefore, only the free component flowing in the vicinity of the wall surface may be removed. However, it can also be expected that a free component that does not flow in the vicinity of the wall surface has a removal effect.
[0015]
Once the analysis is completed, the free component adsorbed on the working electrode or counter electrode, or the second working electrode or counter electrode is washed with a surfactant or alkaline solution after the measurement. It can be washed out in a sufficiently short time. Therefore, there is no problem when measuring again.
The means for removing free protein may be a free protein adsorbing plate made of porous ceramics, a highly hydrophobic material, or an antigen-immobilized film that easily adsorbs free protein.
[0016]
The means for removing the free protein may be provided in the middle of the flow channel upstream of the sample inflow portion, or may be provided in the sample flow channel portion inside the flow-through cell.
When the electrochemical method is used, a means for measuring a change in current value or electrical resistance value between the working electrode and the counter electrode, specifically, an ammeter or resistance meter can be provided. Moreover, when utilizing an electrochemiluminescence method, it is preferable to comprise the wall surface which encloses a counter electrode with a light-transmitting material.
[0017]
When the means for removing the free protein is constituted by the second working electrode and the second counter electrode provided in the sample flow path section, the wall facing the working electrode is made light transmissive, and the second working electrode It is preferable to make the wall surface facing the light shielding property.
By arranging the magnet outside the wall surface close to the working electrode, it is possible to improve the measurement accuracy by performing B / F separation using magnetic beads.
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Embodiments of the present invention will be described below with reference to the drawings.
1 to 3 are schematic views of a flow-through cell for electrochemical analysis using an electrochemiluminescence method, which is an embodiment of the present invention. 1 is a side view as viewed from the lateral direction with respect to the sample flow, FIG. 2 is a side view as viewed from the sample inflow side, and FIG. 3 is a plan sectional view as viewed from the AA direction in FIG.
[0025]
This flow-through cell for electrochemical analysis is constituted by laminating a light-transmitting structural material 7, a non-water-absorbing structural material 8, and a support material 9. The intermediate non-water-absorbing structural material 8 is cut out to flow the sample fluid. A road is formed. Materials such as glass, acrylic and polymethyl methacrylate can be used for the light transmissive structural material 7, and polymer compounds such as plastic, metals such as Al and stainless steel are used for the non-water-absorbing structural material 8 and the support material 9. Alternatively, ceramic can be used. By making the surface of the non-water-absorbing structural member 8 in contact with the sample fluid a curved surface, the flow of the sample fluid can be made smooth.
[0026]
A working electrode 1 for analysis and counter electrodes 2a and 2b are arranged in the sample channel, and light is emitted by applying a voltage to the sample fluid from these electrodes. A working electrode 3 and a counter electrode 4 for adsorbing free components are installed on the upstream side of the water flow. As the material constituting the working electrode 1 and the counter electrodes 2 and 2b for analysis, Pt having high anti-corrosive property and metals such as Al and Ag generally used as electrodes can be used. In addition, metals such as Pt, Al, and Ag that are generally used as electrodes can be used for the materials constituting the working electrode 3 and the counter electrode 4 for adsorbing free components. Alternatively, an organic conductive material such as a carbon electrode may be used. Even if the surfaces of the working electrode 3 and the counter electrode 4 are smooth or have appropriate irregularities, there is no problem in capturing the free component.
[0027]
A magnet 11 is disposed on the outer side wall of the flow-through cell on the side close to the working electrode 1. In this way, by arranging the magnet 11 outside the wall surface of the sample flow path constituting the light emitting surface, it is possible to employ a method of improving measurement accuracy by performing B / F separation using magnetic beads. The magnet 11 may be an electromagnet or a permanent magnet. The magnetic beads captured on the working electrode 1 by the magnetic force of the magnet 11 are cut off from energization to the electromagnet after the analysis is completed, or mechanically moved away from the flow-through cell to weaken the magnetic force. Drain from the flow-through cell.
[0028]
The sample fluid is introduced into the cell from the sample inlet 5 and first passes between the working electrode 3 for free component adsorption and the counter electrode 4. At this time, the free component is adsorbed on the working electrode 3 and / or the counter electrode 4 for adsorbing the free component, and the concentration in the sample fluid decreases. Thereafter, the magnet 11 captures the working electrode 1 for analysis and the counter electrodes 2a and 2b. Subsequently, light emission generated by applying a voltage between the working electrode 1 and the counter electrodes 2 a and 2 b is detected by a photodetector 10 such as a photomultiplier or a photodiode through the light-transmitting structural member 7.
[0029]
The sample after the measurement is discharged from the sample outlet 6. A cleaning liquid is introduced from the sample inlet 5 to clean the surfaces of the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b for analysis, the working electrode 3 for free component adsorption and the counter electrode 4. Although the light emission derived from the free component occurs also on the working electrode 3 or the counter electrode 4 for adsorbing the free component, is it difficult for the light emission derived from the free component to reach the photodetector 10 as shown in FIGS. The working electrode for analysis including light emission derived from the analyte to be measured by taking an arrangement that does not reach, or shielding between the working electrode 3 for free component adsorption or the counter electrode 4 and the photodetector 10 1 and the light emission from the counter electrodes 2a and 2b can be measured.
[0030]
FIG. 4 is a potentiostat circuit diagram in the case where the voltage applied between the working electrode 1 for analysis and the counter electrodes 2a, 2b is equal to the voltage applied between the working electrode 3 for free component adsorption and the counter electrode 4. is there. As will be described later, there is a condition in which only non-specific adsorption increases without changing the emission intensity even when a voltage is applied during B / F separation within the range of −0.5 V to +0.5 V. . If the voltage is controlled under these conditions, the voltage applied between the working electrode 1 for analysis and the counter electrodes 2a, 2b may be equal to the voltage applied between the working electrode 3 for free component adsorption and the counter electrode 4. The object of the present invention can be achieved. In FIG. 4, 12 and 13 are reference electrodes, and 14 is an amplifier.
[0031]
In FIG. 5, the voltage applied between the working electrode 3 for free component adsorption and the counter electrode 4 is applied between the working electrode 1 for analysis and the counter electrodes 2a and 2b by using two amplifiers 14a and 14b. It is a potentiostat circuit diagram in the case of controlling independently from a voltage. In the case of this circuit configuration, the reduction in noise can be suppressed to a lower level by increasing / decreasing the voltages of the working electrode 3 for free component adsorption and the counter electrode 4 at a voltage at which no light emission occurs.
[0032]
[Experimental Example 1]
Ru (bpy)_Three ²⁺The amount of biotin labeled with (bpy means bipyridyl) was detected by the electrochemiluminescence method. It was examined how the amount of adsorbed free component changes by changing the applied voltage during B / F separation.
[0033]
Ru (bpy)_Three ²⁺Is a representative substance that emits electrochemiluminescence. Ru (bpy)_Three ²⁺Using labeled biotin protein (0.133 microgram / microliter), biotin protein adsorbed on the Pt electrode was measured by electrochemiluminescence method. The amount of biotin protein used in the experiment is 23.94 micrograms. Ru (bpy)_Three ²⁺The labeled biotin protein was assumed to correspond to a free component not bound to the antibody. During the B / F separation, a constant voltage is applied to the free component removal Pt electrodes 3 and 4 for 18 seconds. Table 1 shows the relationship between the applied voltage and the increase rate of the free component during B / F separation. However, the adsorption increase rate is a ratio of [adsorption amount of biotin when a voltage is applied (emission amount)] / [adsorption amount of biotin when no voltage is applied (emission amount)].
[0034]
[Table 1]

[0035]
Thus, by applying a voltage of +0.4 V or more or −0.1 V or less for 18 seconds, the amount of free components (here, biotin) adsorbed on the electrode increases, and the amount of adsorption is the magnitude of the voltage. It turns out that it depends on.
[0036]
[Experimental example 2]
Ru (bpy)_Three ²⁺The magnetic beads labeled with were captured on the surface of the Pt electrode with a magnet and detected by electrochemiluminescence. By changing the applied voltage during B / F separation, Ru (bpy)_Three ²⁺It was investigated how the luminescence of the magnetic beads labeled with <1> changes.
[0037]
Ru (bpy)_Three ²⁺Labeled biotin protein (23.94 micrograms) and magnetic beads coated with streptavidin are incubated at room temperature for 1 hour. Then, an avidin-biotin bond occurs, and the magnetic beads become Ru (bpy)_Three ²⁺Labeled with However, Ru (bpy)_Three ²⁺Among the labeled biotin proteins, there is a component that does not bind to streptavidin, and this is regarded as a free component as in Experimental Example 1. In addition, a biotin protein bound to magnetic beads by an avidin-biotin bond is regarded as a binding component.
[0038]
The amount of magnetic beads trapped on the Pt electrode was measured by an electrochemiluminescence method using a magnet. During the B / F separation, a constant voltage was applied to the free component removing Pt electrodes 3 and 4 for 18 seconds. Since the amount of the binding component is orders of magnitude greater than the amount of the free component, the measured light emission amount is proportional to the amount of the binding component. [Table 2] shows the relationship between the applied voltage during B / F separation and the increase rate of the coupling component. However, the increase rate of the binding component is a ratio of (amount of light emission when voltage is applied) / (amount of light emission when voltage is not applied).
[0039]
[Table 2]

[0040]
In this way Ru (bpy)_Three ²⁺In the system using, even if a voltage of about −0.1 V to +0.5 V is applied during B / F separation, the light emission value is not adversely affected. However, when a voltage is applied beyond the range during B / F separation, the electrochemiluminescence of the binding component itself is inhibited. This is Ru (bpy)_Three ²⁺It is considered that the reducing agent (tripropylamine used in the experiment) necessary for electrochemiluminescence is excessively consumed on the electrode.
[0041]
When combined with the results of Experimental Example 1, a voltage of +0.3 V to +0.5 V is applied to the free component removal electrode for about ten seconds, so that the free component removal electrode is not inhibited without inhibiting light emission from the binding component. Free component proteins can be adsorbed. As a result, the S / N ratio of electrochemiluminescence can be improved.
FIG. 6 is a diagram illustrating another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention. 6 is a cross-sectional plan view corresponding to FIG. In this example, a free protein adsorption plate 15 for removing free components is installed on the upstream side of the water flow of the working electrode 1 for analysis and the counter electrodes 2a, 2b. The other structure is the same as that of the example of FIGS. 1-3 demonstrated previously.
[0042]
As the free protein adsorbing plate 15, the pore diameter of porous ceramics such as hydroxyapatite is used. Protein and amino acid can be adsorbed by hydroxyapatite alone. Further, a material having high hydrophobicity (a large proportion of the dispersion force component in the surface energy) such as polyethylene or silicon rubber can be used. These materials are known to be susceptible to protein adsorption [see Advanced Technology Materials Application Dictionary, “Advanced Technology Materials Application Dictionary” (1990), pages 117 and 388]. When the component of the free protein is known, a substance that causes an antigen-antibody reaction with the substance may be used by immobilizing it on a carrier such as pore control titania, pore control alumina, or pore control silica. For example, when biotin is included as a free protein, streptavidin is immobilized and used. When the free protein adsorbing plate 15 is used, the adsorption performance of the adsorbing plate 15 is saturated when the free protein adsorbing plate 15 is used. Therefore, it is preferable to use a disposable cell.
[0043]
7 to 9 are diagrams for explaining other examples of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention. 7 is a side view as seen from the lateral direction with respect to the sample flow, FIG. 8 is a side view as seen from the sample inflow side, and FIG. 9 is a plan sectional view as seen from the AA direction in FIG. For simplification of description, in FIGS. 7 to 9, the same functional parts as those in FIGS. 1 to 3 are denoted by the same reference numerals as those in FIGS. 1 to 3, and detailed description thereof will be omitted.
[0044]
This flow-through cell for electrochemical analysis generates light by applying a voltage to a sample fluid by the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b. A side path 21 for introducing a cleaning agent is provided on the upstream side of the water flow, and a cleaning liquid tank 22 and a valve 23 are installed in connection with the side path 21. The sample fluid is introduced into the flow-through cell from the sample inlet 5, and is captured by the magnet 11 between the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b.
[0045]
Subsequently, with the water flow continued, a cleaning liquid is introduced from the side path 21 to clean the free components adsorbed on the surfaces of the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b. Thereafter, the light emitted by applying a voltage between the working electrode 1 and the counter electrodes 2 a and 2 b is detected by the photodetector 10. The sample after the measurement is discharged from the sample outlet 6. In addition, a cleaning liquid is also introduced from the sample inlet 5 to clean the surfaces of the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b to prepare for the next measurement.
[0046]
The cleaning liquid introduced from the side passage 21 is a nonionic surfactant such as dodecyl poly (ethylene glycol ether), octylphenol poly (ethylene glycol ether), polyoxyethylene sorbitan, or anionic such as sodium dodecyl sulfate (SDS). A surfactant can be used.
By setting the concentration of the washing solution to a concentration at which the antigen-antibody reaction is not cleaved, non-specifically adsorbed free components can be washed in a shorter time under conditions that do not hinder the determination of the substance to be measured. The concentration at which the antigen-antibody reaction is not cleaved varies depending on the time for adding the washing solution. For example, if the cleaning liquid is added only for 1 second, the concentration of the surfactant or alkaline cleaning liquid may be about 3% in volume ratio. However, when added for 10 seconds or more, the limit is about 0.05% in volume ratio.
[0047]
The sample fluid is introduced into the flow-through cell, for example, by driving a syringe with a pulse motor. And the flow of the solution inside the cell for electrochemical analysis can be made into one direction by making the rotation direction of the motor which drives a syringe into one direction. In addition, by alternately changing the rotation direction of the pulse motor clockwise and counterclockwise, it is possible to reverse the water flow and reverse the flow, and then reverse the flow to make it forward again. After introducing the cleaning liquid into the sample fluid, the effect of cleaning the surfaces of the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b can be further enhanced by adding an operation of reversing the flow of water flowing in the cell.
[0048]
Next, a flow-through cell for electrochemical analysis that can increase the efficiency of detecting luminescence from a sample will be described with reference to FIGS. 10 to 14, the same functional parts as those in FIGS. 1 to 3 are denoted by the same reference numerals as those in FIGS. 1 to 3, and detailed description thereof is omitted. 10 to 14 are diagrams corresponding to the plan sectional view of FIG.
[0049]
FIG. 10 is a view for explaining another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention, wherein (a) is a plan sectional view and (b) is a side view. This flow-through cell for electrochemical analysis includes plate-shaped light guides (light reflecting surfaces) 31a and 31b parallel to the counter electrodes 2a and 2b outside the plate-type counter electrodes 2a and 2b.
This flow-through cell for electrochemical analysis generates light by applying a voltage to the sample fluid by the working electrode 1 and the flat counter electrodes 2a and 2b. When a method is adopted in which a magnet is arranged on the wall surface constituting the working electrode, magnetic beads are used, and B / F separation is performed to improve measurement accuracy, the working electrode 1 becomes a light emitting surface. Light emitted from the working electrode 1 is detected as a signal only after entering the photodetector 10.
[0050]
Therefore, the light shielding area of the counter electrodes 2a and 2b arranged between the working electrode 1 and the photodetector 10 is reduced so as not to prevent light emission from the working electrode 1 toward the photodetector 10. For this purpose, flat plate counter electrodes 2a and 2b are used, and the flat plate electrodes 2a and 2b are arranged so that the plane of the counter electrodes 2a and 2b is substantially perpendicular to the plane of the working electrode 1. The counter electrodes 2a and 2b can have a light guide function (a function of reflecting light and guiding the light to the photodetector 10).
[0051]
When the electrode width is reduced in order to reduce the light-shielding area of the counter electrodes 2a and 2b, in order to suppress the Joule heat generated by reducing the cross-sectional area of the counter electrodes 2a and 2b, the counter electrodes 2a and 2b Although it is necessary to increase the height, such flat plate-type or cylindrical, elliptical, and rectangular electrodes described later have shapes that match this purpose.
[0052]
Light is reflected only by the flat counter electrodes 2a and 2b, but by further providing light reflecting plates (light guides) 31a and 31b, light that is reflected by the flat counter electrodes 2a and 2b and escapes toward the outer edge. Has a function of guiding the light to the photodetector 10 again. If a light reflective socket 32 is also provided at the connection between the flow-through cell for electrochemical analysis and the photodetector 10, light loss can be further reduced.
[0053]
As a material constituting the light guides 31a and 31b, in the case where deterioration due to a chemical reaction does not occur, mirror surface treatment such as plating or vapor deposition with a metal material such as Al, Ag, Au, or the metal itself can be used. . When the surface in contact with the sample fluid is subject to corrosion, it is preferable to deposit or vapor-deposit a metal material resistant to corrosion, such as Pt, on the surface in contact with the sample fluid.
[0054]
Further, when the light guides 31a and 31b are manufactured using acrylic as the light-transmitting structural member 7, for example, a through hole is formed in the acrylic plate and filled with Cu plating, and then the contact surface with the sample fluid is whitened. This can be done by making a protective film with gold plating. Alternatively, it can be manufactured by a general method such as sandwiching a platinum plate acting as the light guides 31a, 31b between acrylics, fixing with an adhesive, and polishing.
[0055]
FIG. 11 is a view for explaining another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention, wherein (a) is a plan sectional view and (b) is a side view. In this electrochemical analysis flow-through cell, a cylindrical light reflection surface 33 is disposed as a light guide around the flat counter electrodes 2a and 2b. The cylindrical light reflecting surface 33 has a function of reflecting the light emitted from the working electrode 1 and condensing it on the photodetector 10. In FIG. 10, flat light reflecting surfaces (light guides) 31a and 31b are used. However, by forming the light reflecting surfaces 31a and 31b into a cylindrical shape, light can be condensed in a 360-degree direction.
[0056]
FIG. 12 is a view for explaining another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention, wherein (a) is a plan sectional view and (b) is a side view. This electrochemical flow-through cell includes a cylindrical counter electrode 34 having a rectangular cross-sectional shape. This is different from the flow-through cell for electrochemical analysis shown in FIGS. 10 and 11 in that it does not have a light reflector separate from the counter electrode.
[0057]
In this example, the rectangular counter electrode 34 is brought into contact with the sample fluid at the outer edge of the sample flow path, thereby condensing the light emitted from the working electrode 1 to the photodetector 10 without letting it escape to the outside. Can do. That is, the structure is such that the counter electrode 34 alone functions as a light reflector. By omitting the light reflecting plate, the configuration becomes simpler and the processing cost can be further reduced.
[0058]
FIG. 13 is a view for explaining another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention, wherein (a) is a plan sectional view and (b) is a side view. This electrochemical flow-through cell uses an optical fiber 35 as a light guide. The counter electrodes 2 a and 2 b are embedded in the optical fiber 35 in order to condense light emitted from the working electrode 1 onto the photodetector 10. In this case, the boundary between the core and the clad of the optical fiber corresponds to the light guide, and light can be condensed in the 360 degree direction.
[0059]
14A and 14B are diagrams for explaining another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention. FIG. 14A is a plan sectional view, and FIG. 14B is a side view. This flow-through cell for electrochemical analysis uses a transparent working electrode 41 and an optical fiber 36 as a light guide. The transparent working electrode 41 is tin oxide (SnO₂) And Indium Tin Oxide.
[0060]
When the working electrode 41 is transparent, it is not necessary to arrange the photodetector 10 on the back side of the counter electrode 2. In this example, the photodetector 10 is disposed below the working electrode 41. The optical fiber 36 embedded in the support member 9 condenses the light emitted from the working electrode in the 360 degree direction and guides it to the photodetector 10. Unlike the other examples, the counter electrode 2 is a flat plate electrode parallel to the working electrode 41, so that light traveling in the direction of the counter electrode 2 is reflected and incident on the optical fiber 36, thereby improving the light collection efficiency. it can. Condensing efficiency can be similarly improved by providing a cylindrical, elliptical, or rectangular light guide surrounding the working electrode 41 instead of the optical fiber 36.
[0061]
The methods for removing free protein in the sample fluid, the washing method with the washing liquid, and the method for improving the electrochemiluminescence concentration efficiency described so far may be used alone or in combination. The effect can be enhanced.
15 to 17 are schematic views for explaining another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention. 15 is a side view seen from the lateral direction with respect to the sample flow, FIG. 16 is a side view seen from the sample inflow side, and FIG. 17 is a plan sectional view seen from the AA direction of FIG. In order to simplify the description, in FIG. 15 to FIG. 17, the functional parts similar to those in FIG. 1 to FIG.
[0062]
The flow-through cell for electrochemical analysis in this example is provided with a means for removing free protein (in this example, FIG. 1 to FIG. 3) on the upstream side of the working electrode 1 and the counter electrodes 2a and 2b for electrochemical chemiluminescence analysis. And a side path 21 for introducing a washing solution for washing free protein adhering to the working electrode 1 for analysis and the counter electrode 4), and the working electrode 1 for analysis and the counter electrodes 2a and 2b. Light guides 31a and 31b are provided in the vicinity of the counter electrodes 2a and 2b for increasing the light collecting power. By this improvement, S / N improvement and throughput improvement of the immunoanalyzer using electrochemiluminescence are aimed at. Obviously, examples of combinations of means are not limited to those shown here.
[0063]
As described above, the embodiment of the present invention has been described mainly using the electrochemiluminescence method as an example. However, the present invention is similarly applied to a cell using chemiluminescence and a cell for electrochemical analysis that does not use luminescence. Can be possible. When the electrochemical method is used, an ammeter or an ohmmeter can be used as a detection means instead of the photodetector.
[0064]
【The invention's effect】
According to the present invention, non-specific adsorption is performed on the upstream side of the electrode for measuring the analyte to be measured in the flow-through cell for electrochemical analysis to remove or reduce the free component that causes measurement noise. By providing such a mechanism, the efficiency of B / F separation can be increased, B / F separation can be performed in a short time, and the throughput of the apparatus can be improved.
[0065]
In addition, a cleaning solution is introduced upstream of the electrode for measuring the analyte to be measured in the flow-through cell for electrochemical analysis to remove free components that cause non-specific adsorption and cause measurement noise. By providing the mouth, B / F separation can be performed in a shorter time and the throughput of the apparatus can be improved.
Furthermore, the measurement sensitivity of the electrochemiluminescence method can be improved by making the structure of the flow-through cell excellent in light collecting properties.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a side view of a flow-through cell for electrochemical analysis using a pair of a second working electrode and a counter electrode as viewed from the side with respect to a sample flow.
2 is a side view of the electrochemical analysis flow-through cell of FIG. 1 as viewed from the sample inflow side.
3 is a cross-sectional plan view seen from the direction AA in FIG. 1. FIG.
FIG. 4 is a potentiostat circuit diagram when the voltage applied between the working electrode for analysis and the counter electrode is equal to the voltage applied between the working electrode for free component adsorption and the counter electrode.
FIG. 5 is a potentiostat circuit diagram in the case where the voltage applied between the working electrode for analysis and the counter electrode is controlled independently of the voltage applied between the working electrode for free component adsorption and the counter electrode.
FIG. 6 is a schematic view of a flow-through cell for electrochemical analysis using a free protein adsorption plate.
FIG. 7 is a side view of another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention as viewed from the lateral direction with respect to the sample flow.
8 is a side view of the electrochemical analysis flow-through cell of FIG. 7 as viewed from the sample inflow side.
9 is a plan sectional view as seen from the AA direction in FIG. 7;
FIG. 10 is an explanatory view of a flow-through cell for electrochemical analysis provided with a flat light reflecting surface parallel to a counter electrode.
FIG. 11 is an explanatory view of a flow-through cell for electrochemical analysis in which a cylindrical light reflecting surface is arranged around a counter electrode.
FIG. 12 is an explanatory diagram of a flow-through cell for rectangular counter electrode electrochemical analysis.
FIG. 13 is an explanatory diagram of a flow-through cell for electrochemical analysis having an optical fiber embedded counter electrode.
FIG. 14 is an explanatory view of a flow-through cell for electrochemical analysis using a transparent working electrode and an optical fiber.
FIG. 15 is a side view of another example of the flow-through cell for electrochemical analysis according to the present invention as viewed from the lateral direction with respect to the sample flow.
16 is a side view of the electrochemical analysis flow-through cell of FIG. 15 as viewed from the sample inflow side.
17 is a plan sectional view as seen from the direction AA in FIG. 15;
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Working electrode, 2a, 2b ... Flat plate type counter electrode, 3 ... 2nd working electrode, 4 ... 2nd counter electrode, 5 ... Sample inlet, 6 ... Sample outlet, 7 ... Light-transmitting structural material, 8 ... Non-water-absorbing structural material, 9 ... Support material, 10 ... Photo detector, 11 ... Magnet, 12, 13 ... Reference electrode, 14, 14a, 14b ... Amplifier, 15 ... Free protein adsorption plate, 21 ... Side road, DESCRIPTION OF SYMBOLS 22 ... Cleaning liquid tank, 23 ... Valve, 31a, 31b ... Light reflecting plate (light guide), 32 ... Light reflecting socket, 33 ... Cylindrical light reflecting surface, 34 ... Rectangular counter electrode, 35, 36 ... Optical fiber

Claims (8)

試料流体が流入する試料流入部と、試料流体が流出する試料流出部と、前記試料流入部と試料流出部とを接続する試料流路部と、前記試料流路部の壁面の一部を構成する作用電極（１）と、前記作用電極（１）に対する対電極（２ａ、２ｂ）とを備える電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記作用電極（１）の上流側に、試料流体中のフリーなタンパク質を除去する手段を備え、
前記フリーなタンパク質を除去する手段は、第２の作用電極（３）と第２の対電極（４）とを有する
ことを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。 A sample inflow part into which the sample fluid flows in, a sample outflow part from which the sample fluid flows out, a sample channel part that connects the sample inflow part and the sample outflow part, and a part of the wall surface of the sample channel part acting on the electrodes (1), counter electrode (2a, 2b) with respect to the working electrode (1) and the electrochemical analysis flow-through cell comprising, upstream of the working electrode (1), free in the sample fluid comprising means for removing a protein,
The flow-through cell for electrochemical analysis, wherein the means for removing free protein has a second working electrode (3) and a second counter electrode (4) . 請求項１記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記フリーなタンパク質を除去する手段は、フリータンパク質吸着板であることを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。  The flow-through cell for electrochemical analysis according to claim 1, wherein the means for removing free protein is a free protein adsorbing plate. 請求項１又は２記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記フリーなタンパク質を除去する手段を前記試料流入部の上流側の流路の途中に設けたことを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。In claim 1 or electrochemical analysis for flow-through cell 2, for electrochemical analysis characterized in that a means for removing the free protein in the middle of the upstream side of the flow path of the sample inlet Flow-through cell. 請求項１又は２記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記フリーなタンパク質を除去する手段を前記試料流路部に設けたことを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。In claim 1 or electrochemical analysis for flow-through cell 2, an electrochemical analytical flow-through cell, characterized in that a means for removing the free protein in said sample flow channel portion. 請求項１〜４のいずれか１項記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記作用電極と対電極間の電流値又は電気抵抗値の変化を計測する手段を備えることを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。The flow-through cell for electrochemical analysis according to any one of claims 1 to 4 , further comprising means for measuring a change in a current value or an electric resistance value between the working electrode and the counter electrode. Flow-through cell for analysis. 請求項１〜４のいずれか１項記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記対電極を内包する壁面を光透過性材料で構成したことを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。The flow-through cell for electrochemical analysis according to any one of claims 1 to 4 , wherein a wall surface including the counter electrode is made of a light-transmitting material. 請求項１記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記作用電極（１）に対向する壁面は光透過性であり、前記第２の作用電極（３）に対向する壁面は遮光性であることを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。In claim 1 electrochemical analytical flow-through cell according, opposed wall surfaces before Symbol working electrode (1) is light transmissive, the wall facing the second working electrode (3) is a light-shielding A flow-through cell for electrochemical analysis. 請求項１〜８のいずれか１項記載の電気化学分析用フロースルーセルにおいて、前記作用電極に近接する壁面の外部に磁石を配置したことを特徴とする電気化学分析用フロースルーセル。 The flow-through cell for electrochemical analysis according to any one of claims 1 to 8, wherein a magnet is disposed outside a wall surface close to the working electrode.

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