JP3672036B2 - 無機リン酸、ピロリン酸及び核酸の検出方法並びにｄｎａのｓｎｐ配列をタイピングする方法 - Google Patents
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、無機リン酸もしくはピロリン酸を検出する方法に関する。さらに、前記検出により、試料中の目的核酸を簡易かつ高感度で検出する方法、特にＳＮＰを判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきている。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。
【０００３】
これらの遺伝子情報の中でも、遺伝子多型は特に重要である。我々の顔や体型などが様々であるように、一人一人の遺伝子情報もかなりの部分で異なっている。これらの遺伝情報の違いのうち、塩基配列の変化が人口の１％以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。これらの遺伝子多型が、個人の顔かたちだけでなく、様々な遺伝子疾患の原因や、体質、薬剤応答性、薬剤の副作用などに関連していると言われ、現在この遺伝子多型と疾患などとの関連が急速に調べられている。
【０００４】
この遺伝子多型の中で、近年、特に注目されているのがＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である。ＳＮＰは、遺伝子情報の塩基配列の中で、一塩基のみが異なっている遺伝子多型のことを指す。ＳＮＰはヒトゲノムＤＮＡ内に２〜３百万あると言われており、遺伝子多型のマーカーとして利用しやすく、臨床への応用が期待されている。現在では、ＳＮＰ関連技術として、ゲノム中のＳＮＰの位置同定およびＳＮＰｓと疾患との関連性等の研究とともに、ＳＮＰ部位の塩基を判別するＳＮＰｓタイピング技術の開発が行われている。
【０００５】
一般的にＤＮＡの塩基配列の違いを判別する手段としては、サンガー（ダイデオキシ）法、ＤＮＡチップ法などが用いられている。サンガー法は、ヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法で増幅したのち、所望の部位の塩基配列を読み取ってシーケンスを行い、塩基配列を直接決定してＳＮＰタイピングを行う。ＤＮＡチップ法は、ｃＤＮＡのＰＣＲ産物もしくは１５〜２０塩基程度のオリゴヌクレオチドプローブを基板上に固定し、そこに蛍光標識した試料ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせるものである。温度等のハイブリダイゼーション条件を厳しく制御することで、ＳＮＰをプローブと試料ＤＮＡの親和性の差、つまり蛍光強度の差によって検出するものである。
【０００６】
さらに、大量のＳＮＰタイピングを可能にするために、特表平１０−５１０９８２号（ＴａｑＭａｎＰＣＲ法）（特許文献１）や特表２００１−５１８８０５号（Ｉｎｖａｄｅｒ法）（特許文献２）などが開示されている。特表平１０−５１０９８２号に示されている方法の概略図を図１に示す。特表平１０−５１０９８２号では、蛍光分子および該蛍光分子の蛍光を消光できる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブが提供されている。標的ポリヌクレオチドの「下流領域」（すなわち、プライマー結合部位の伸長方向）に特異的にアニールされる報知分子−消光分子対を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いる。この消光分子および報知分子は互いに十分接近して配置され、それによって報知分子が励起されると、常にこの励起状態エネルギーは消光分子に非放射性に伝えられ、該エネルギーは非放射性に消失するか、または報知分子の発光周波数と異なる周波数で放出される。ＤＮＡポリメラーゼによって鎖が伸長している間プローブは鋳型とアニールし、このプローブはポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって消化される。プローブが消化される結果、この報知分子は効果的に消光分子から分離され、それによって消光分子はもはや報知分子の蛍光を消光できるほど十分に報知分子に接近することができない。したがって、増幅時にプローブが消化されればされるほど、溶液中の報知分子数は増加し、結果として非消光報知分子数が増す結果となり蛍光シグナルはますます強くなる。
【０００７】
特表２００１−５１８８０５号では、標的核酸分子の存在を検出する方法が示されている。この方法の概略図を図２に示す。構造特異的ヌクレアーゼ、第１標的核酸の源（ただし、第１標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を有し、第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置する）、５’部分と３’部分を有する第１オリゴヌクレオチド（ただし、第１オリゴヌクレオチドの５’部分は第１標的核酸の第２領域に相補的な配列を含み、第１オリゴヌクレオチドの３’部分は第１標的核酸の第３領域に相補的な配列を含む）、５’部分と３’部分を有する第２オリゴヌクレオチド（ただし、第２オリゴヌクレオチドの５’部分は第１標的核酸の第１領域に相補的な配列を含み、第２オリゴヌクレオチドの３’部分は第１標的核酸の第２領域に相補的な配列を含む）、第２標的核酸の源（ただし、第２標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を有し、第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置する）、５’部分と３’部分を有する第３オリゴヌクレオチド（ただし、第３オリゴヌクレオチドの５’部分は第２標的核酸の第２領域に相補的な配列を含み、第３オリゴヌクレオチドの３’部分は第２標的核酸の第３領域に相補的な配列を含む）を用意し、第１オリゴヌクレオチドの少なくとも３’部分が第１標的核酸にアニーリングし、かつ第２オリゴヌクレオチドの少なくとも５’部分が第１標的核酸にアニーリングしている第１開裂構造体を形成し、第１開裂構造体の開裂を構造特異的ヌクレアーゼにより起こすことにより第１オリゴヌクレオチドを開裂して第４オリゴヌクレオチドを生成させ、この第４オリゴヌクレオチドは５’部分と３’部分を有し、第４オリゴヌクレオチドの５’部分が第２標的核酸の第１領域に相補的な配列を含み、第４オリゴヌクレオチドの３’部分が第２標的核酸の第２領域に相補的な配列を含むものであり、第３オリゴヌクレオチドの少なくとも３’部分が第２標的核酸にアニーリングし、かつ第４オリゴヌクレオチドの少なくとも５’部分が第２標的核酸にアニーリングしている第２開裂構造体を形成し、第２開裂構造体の開裂を起こして第５オリゴヌクレオチドを生成させ、この第５オリゴヌクレオチドは３’−ヒドロキシル基を有するものであり、そして上記第５オリゴヌクレオチドを検出することを含んでなる方法を開示している。
【０００８】
しかしながら、これらの方法はいずれも、プローブに蛍光標識を用いているため、試薬などが大変高価であり、かつ蛍光検出にレーザ照射等の光源が必要となるため測定装置も大型となってしまい、医療機関で臨床用途として使用することを考えた場合、多くの問題点が残っている。
【０００９】
一方、新たなＤＮＡ塩基配列の決定方法として、特表２００１−５０６８６４号（特許文献３）では、ＤＮＡの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸をＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に変換し、ＡＴＰを基質として、ルシフェラーゼの作用によるルシフェリンの発光を検出する方式が開示されている。この方法の概略図を図３に示す。標的位置のすぐ隣で試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料ＤＮＡおよび伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、それが標的位置の塩基と相補的である場合にのみ、取り込まれてピロリン酸（ＰＰｉ）を放出するようにし、ＰＰｉ放出を酵素的に検出し、異なるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、または同じ試料−プライマー混合物のアリコートに連続的に添加して、ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方法であって、ＰＰｉ検出酵素がポリメラーゼ反応工程に包含されること、およびデオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）またはジデオキシアデノシントリホスフェート（ｄｄＡＴＰ）の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用することができるが前記ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用することができないｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログを用いることを特徴とする方法を提供する。特表２００１−５０６８６４号においては、有利にも、大規模の非電気泳動的固相ＤＮＡ配列決定を可能にし、それにより時間に伴う重合反応の進行の連続的決定が可能になる方法が開示されている。
【００１０】
しかしながら、この方法においても、ルシフェラーゼの発光を検出する等、大がかりな装置が必要であり、病院のベッドサイドや薬剤供給の際の簡易型システムとしては、適したものではなかった。
【００１１】
特開昭６３−４９１００号（特許文献４）には、無機リン酸の測定方法が開示されている。この方法では、無機リン酸が関わる３段階の反応を利用しており、最終的に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）が還元されてＮＡＤＨとなり、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）が還元されてＮＡＤＰＨとなり、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を紫外線吸収法等により測定する。この方法では３段階の反応を用いているため、反応の素過程が多く、全素過程が進行する反応条件を設定することは煩雑な上、必ずしも効率良い条件にできるとは限らない。さらに、分光高度計などの比較的大がかりな測定装置を用いる必要があり、簡便性に欠けるという問題点があった。
【００１２】
また、上記特開昭６３−４９１００号に記載されている方法と同様に、目的試料の反応に伴って補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋が還元されることを利用して、目的試料を検出する方法が国際公開パンフレットＷＯ００／０４３７８号（特許文献５）に記載されている。しかしながら、ここでの検出目的試料はＬ−フェニルアラニンであるため、かかる方法を標的核酸分子の存在の検出に適用することはできない。
【特許文献１】
特表平１０−５１０９８２号
【特許文献２】
特表２００１−５１８８０５号
【特許文献３】
特表２００１−５０６８６４号
【特許文献４】
特開昭６３−４９１００号
【特許文献５】
国際公開パンフレットＷＯ００／０４３７８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、迅速、簡便な方法で、かつ高感度の検出が可能な無機リン酸、ピロリン酸及び核酸の検出方法を提供する。また、大量のＳＮＰタイピングを、高感度かつ安価に実現できるＳＮＰタイピング法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、無機リン酸を検出する方法を提供する。本方法は、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に試料を供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中の無機リン酸の濃度を示す。
【００１５】
１つの実施形態では、上記電子メディエータは、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である。
【００１６】
１つの実施形態では、上記測定系はジアホラーゼをさらに含む。
【００１７】
１つの実施形態では、上記測定系はアデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼをさらに含む。
【００１８】
さらに、本発明は、ピロリン酸を検出する方法を提供する。本方法は、試料中のピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；上記試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中のピロリン酸の濃度を示す。
【００１９】
１つの実施形態では、上記ピロリン酸の無機リン酸への変換が、ピロフォスファターゼを用いて行われる。
【００２０】
さらに、本発明は、核酸を検出する方法を提供する。本方法は、上記核酸の配列に相補的な配列を持つＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供し、上記ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸が上記ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される工程；試料中の生成されたピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；上記試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中の特定配列を有する核酸の濃度を示す。
【００２１】
１つの実施形態では、上記ＤＮＡプローブの伸長反応はＰＣＲ反応である。
【００２２】
さらに、本発明は、ＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法を提供する。本方法は、上記ＤＮＡの配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供し、上記ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸が上記ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される工程；試料中の生成されたピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；上記試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中の特定配列を有するＤＮＡの存在を示す。
【００２３】
１つの実施形態では、上記ＤＮＡプローブの伸長反応はＰＣＲ反応である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、電気化学的手法を用いる試料中の無機リン酸の高感度、高速、かつ定量的な検出が提供される。さらに、ピロリン酸を無機リン酸に変換することにより、ピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が提供される。また、本発明によれば、核酸の伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の核酸のＳＮＰ部位における塩基判定を、高感度かつ高速に測定することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２６】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１では、酵素反応を用いて簡便な無機リン酸の定量的検出を行う。本発明の実施の形態１は、無機リン酸を検出する方法に関し、この方法は、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に試料を供する工程；およびこの測定系において電流値を測定する工程を包含する。本明細書中では、「測定系」は、無機リン酸の検出に関する機構に関与する一連の反応全体、およびこのような一連の反応が実施される場をいう。「測定系」には、一連の反応が実施されるのに必要な成分が存在する。「測定系」は、通常、上記成分が適切な溶媒（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のような緩衝液）中に溶解された溶液の形態で提供され得る。グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼとは、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とし、グリセルアルデヒド−３−リン酸を酸化的にリン酸化する酵素であり、本明細書においては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとも示す。
【００２７】
本発明の実施の形態１について反応式（I）〜反応式（IV）を用いて説明する。
【００２８】
まず、反応式（I）に示すように、無機リン酸は、グリセルアルデヒド−３−リン酸とともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤ（Ｐ）＋の触媒作用を受け、１，３−ビスホスホグリセリン酸に変換される。このとき、ＮＡＤ（Ｐ）＋はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元される。
【００２９】
【化１】
次に、反応式（I）の反応において生成されたＮＡＤ（Ｐ）Ｈからの電子移動により、反応式（II）に示すように、電子メディエータの酸化体（反応式（II）中Ｍｅｄ（Ｏｘ））が還元され還元体（反応式（II）中Ｍｅｄ（Ｒｅ））となる。このときＮＡＤ（Ｐ）ＨはＮＡＤ（Ｐ）＋に酸化される。
【００３０】
【化２】
この反応は、適切な電子メディエータを用いた場合、自発的に進行する。適切な電子メディエータとは、その酸化体がＮＡＤ（Ｐ）Ｈとともに酸化還元反応を起こし、かつそれにより生成された還元体が一定以上の電位が印加された作用極において電気化学的に酸化される電子メディエータである。本実施の形態において用いる電子メディエータとしては、フェリシアン化カリウム、チオニン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート、２，６−ジメチル−Ｐ−ベンゾキノン、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸カリウム、メルドラブルー、ガロシアニン、メチレンブルー、インジゴカーミン、アントラキノン−１，５−ジスルホン酸、サフラニンなどが挙げられる。しかし、その酸化体がＮＡＤ（Ｐ）Ｈとともに酸化還元反応を起こし、かつそれにより生成された還元体が一定以上の電位が印加された作用極において電気化学的に酸化される電子メディエータであれば、上記に限定されない。反応式（II）に示される反応を触媒する酵素もまた、反応の進行を促進するために使用され得る。このような酵素としては、ジアホラーゼが挙げられる。
【００３１】
最後に、反応式（III）に示すように、反応式（II）の反応の結果生成された電子メディエータの還元体が、一定以上の電位が印加された作用極において電気化学的に酸化される。
【００３２】
【化３】
この酸化により、電子が放出され、このような電子の放出は、電流値として示され得る。このような電流の測定は、一般の電気化学的検出器を用いてなされ得る。
【００３３】
より具体的には、電気化学的酸化の測定は、図９に示す測定装置系を用いて行われ得る。本測定装置系は、以下のように構成されている。図中、６はガラスセルであり、内部に攪拌子７を入れ、スタラーマシン１３上に固定されている。ガラスセル６には、電極固定器具８により、測定極９、対極１０、および参照極１１がセットされている。測定極９は金電極で、また対極１０は白金線でそれぞれ構成されている。参照極１１は、銀／塩化銀電極で構成され、表面に塩化銀がコートされた銀線と飽和ＫＣｌ溶液が多孔性ガラスを介してガラスセルに接続されている。これらの電極は、それぞれポテンショスタット、ファンクションジェネレータなどが一体化された電気化学測定システム１４に接続されており、パソコン１５により制御およびデータの記録を行っている。
【００３４】
上記ガラスセル６中には、反応溶液１２が満たされており、反応溶液１２は攪拌子７によって攪拌される。電気化学測定システム１４を用いて、参照極１１に対して一定以上の電位を測定極９に印加すると、反応溶液中のメディエータが酸化し、この酸化による電子の放出により測定極９と対極１０との間に電流が流れる。上記電位は、メディエータ種によって異なる。そのメディエータ種の酸化還元電位よりも高い電位が測定極９に加えられ得る。例えば、メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いた場合、参照極１１に対して＋５００ｍＶ程度の電位が測定極９に加えられる。このときの電流値が、電気化学測定システム１４を用いて測定され得る。
【００３５】
電流値は、最初の無機リン酸の存在に依存するので、この酸化電流値をもとにして無機リン酸が検出され得る。
【００３６】
尚、反応式（II）において、電子メディエータが還元されることによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈが消費され、ＮＡＤ（Ｐ）＋が生成される。従って、反応式（I）の反応は、１，３−ホスホグリセリン酸及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される方向に促進される。すなわち、本実施の形態において、電子メディエータは、酸化されることにより、無機リン酸の濃度に対応した電流値の測定に寄与するのみならず、無機リン酸の濃度を高感度に検出することに寄与する。
【００３７】
また、上記の通り、本実施の形態において、無機リン酸が関わる反応の素過程は、反応式（I）に示す一過程のみである。したがって、かかる素過程が効率良く進行するよう制御することは容易である。
【００３８】
以上に示される反応式（I）〜反応式（III）の一連の反応を用いた検出方法は、電気化学的な手法による無機リン酸の定性検出を可能にする。また、その結果得られる電流値は最初の無機リン酸の量に依存するため、その検出は定量的なものである。
【００３９】
本実施の形態においては、反応式（I）に示されるように、無機リン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋とがまず反応し、その結果１，３−ビスホスホグリセリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成する。この反応は吸エルゴン反応である。一方、反応式（IV）に示すように、１，３−ビスホスホグリセリン酸をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とともにホスホグリセレートキナーゼの触媒作用により反応させ、３−ホスホグリセリン酸およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成する反応がある。この反応を進行させるために、Ｍｇ２＋もまた添加され得る。Ｍｇ２＋は、これが反応系中で反応に関与できる状態で存在し得る限り、いかなる形態でも添加され得る。塩化マグネシウムが好ましく用いられ得る。添加される濃度は、各反応基質が１ｍＭで添加される場合、１０ｍＭであり得る。この反応は発エルゴン反応である。従って、本実施の形態において、この反応式（IV）の反応を共役させることで、反応式（I）の反応の平衡を１，３−ビスホスホグリセリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される方向に傾けてもよい。
【００４０】
【化４】
上記の通り、本実施の形態においては、被験試料中の無機リン酸が検出されるためには、測定系は、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む必要がある。この測定系は、ジアホラーゼもまた含み得、これにより反応式（II）の反応を促進し得る。この測定系はまた、必要に応じて、アデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼを含み得る。アデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼは、本測定系において、反応式（IV）に示されるように作用し、無機リン酸の検出を促進し得る。
【００４１】
測定系は、上述した成分のそれぞれを適切な濃度で含む反応溶液であり得る。反応式（I）〜反応式（IV）から明らかなように、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、および電子メディエータ、ならびにアデノシン二リン酸が含まれる場合、アデノシン二リン酸は、それらの終濃度が実質的に同一の濃度となるように、この反応溶液中に含まれ得る。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、およびホスホグリセレートキナーゼのような酵素は、反応を進行させるのに適切な濃度で含まれ得る。このような濃度は、例えば、各反応物質を約１ｍＭの終濃度で添加する場合、０．５〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌであり得、好ましくは、１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、最も好ましくは、５〜５０ｕｎｉｔ／ｍｌであり得る。無機リン酸を定量的に検出するために、試料を上記反応溶液に添加して反応式（I）〜反応式（III）（および反応式（IV））に示されるような反応を生じさせ、そしてこの反応により生成される電流値を測定し得る。
【００４２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２では、酵素反応を用いた簡便なピロリン酸の定量的検出を行う。
【００４３】
本発明の実施の形態２について反応式（V）を用いて説明する。
【００４４】
まず、反応式（V）に示すようにピロリン酸（反応式（V）中のＰＰｉ）を加水分解して無機リン酸（反応式（V）中のＰｉ）にする。
【００４５】
【化５】
この加水分解反応は、反応温度を高温にして行っても構わないし、この反応を触媒する酵素であるピロフォスファターゼを用いて行っても構わない。
【００４６】
次に、反応式（V）の反応により生成された無機リン酸を、実施の形態１と同様に検出することにより、定量的にピロリン酸を検出することが可能である。
【００４７】
本実施の形態において、反応式（V）の反応は、実施の形態１に示した無機リン酸の検出における反応と別個に行う必要はない。従って、被験試料中のピロリン酸を検出するために、上記実施の形態１で説明したような無機リン酸を検出するための測定系に、さらにピロフォスファターゼを含ませ得る。例えば、被験試料中のピロリン酸を検出するために、無機リン酸の検出のための測定系に含まれる上述の成分のそれぞれに加えて、ピロフォスファターゼを適切な濃度で含む反応溶液が使用され得る。このピロフォスファターゼもまた、反応を進行させるのに適切な濃度で含まれ得る。このピロフォスファターゼの濃度は、例えば、各反応物質を約１ｍＭの終濃度で添加する場合、０．００１〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌであり得、好ましくは、０．０１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、最も好ましくは、０．１〜１ｕｎｉｔ／ｍｌであり得る。ピロリン酸を定量的に検出するために、試料を上記反応溶液に添加して反応式（V）ならびに反応式（I）〜反応式（III）（および反応式（IV））に示されるような反応を生じさせ、そしてこの反応により生成される電流値を測定し得る。
【００４８】
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３では、特定配列を持つＤＮＡを高感度に検出する方法が実施される。
【００４９】
本実施の形態においては、まず、目的とするＤＮＡの配列に相補的な配列を持つＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料が供せられる。ここで「反応系」とは、以下に説明するような一連の核酸伸長反応およびこのような反応が実施される場をいう。「反応系」には、一連の反応が実施されるのに必要な成分が存在する。「反応系」は、通常、上記成分が適切な溶媒（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、核酸伸長反応または核酸増幅反応で通常使用され得るいずれもの緩衝液（市販による入手可能なキット中の緩衝液を含む））中に溶解された溶液の形態で提供され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、市販により入手可能な、または当業者により調製可能な、任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼが使用され得るが、これに限定されない。デオキシヌクレオチドは、各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰとも称される：デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシアデニン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸を含む）であり得、通常、ＤＮＡ合成の直接の前駆物質として使用され得る物質である。これにより、ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸がこのＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される。この反応について、反応式（VI）を用いて説明する。
【００５０】
このＤＮＡプローブは目的のＤＮＡとハイブリダイズすると、反応系中に存在するＤＮＡポリメラーゼによって、反応系中の１つのデオキシヌクレオチド（反応式（VI）中のｄＮＴＰ）を取り込んで伸長され、ピロリン酸が１つ生成される。
【００５１】
【化６】
反応式（VI）中、添え字のｎ及びｎ＋１はＤＮＡプローブの塩基数を示す。したがって、反応式（VI）は、この反応によってｎベースのＤＮＡプローブがｎ＋１ベースに伸長したことを示す。このようにして生成したピロリン酸を、実施の形態２と同様に無機リン酸へと分解し、次いで無機リン酸を実施の形態１と同様に検出することにより、試料中の特定配列を持つＤＮＡを検出することが可能となる。
【００５２】
本実施の形態で使用されるＤＮＡプローブは、検出を目的とされるＤＮＡの配列に対して相補的な配列を有するように設計される。このＤＮＡプローブは、検出を目的とされるＤＮＡの配列とハイブリダイズした場合に、当該ＤＮＡプローブの伸長のためのプライマーとして働く。したがって、ＤＮＡプローブの長さは、伸長反応のためのプライマーとして働くのに十分な長さである。例えば、少なくとも１０塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基の長さであり得る。ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を十分に行い得、かつその調製の容易さを考慮すると、１５〜５０塩基の長さが好ましい。本発明の方法で使用されるＤＮＡプローブは、検出を目的とされるＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、かつ当該ＤＮＡプローブの伸長のためのプライマーとして働く限り、いずれの長さでもあり得る。
【００５３】
ＤＮＡプローブは、試料中の目的のＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、かつプライマーとして働くため、検出しようとする配列が既知である場合、この配列に対して完全に相補的である、すなわち、配列中の塩基に対して正確に対応する（Ａ−ＴまたはＣ−Ｇペア）配列を有するように設計され得る。試料中に目的の特定配列を有するＤＮＡが存在しない場合、当然のことながらＤＮＡプローブとのハイブリダイズは起こらない。したがって、本反応系を使用することにより、検出しようとする配列が既知または未知であるに関わらず、このＤＮＡプローブに完全に相補的である配列の存在を検出し得る。
【００５４】
ハイブリダイゼーションおよび伸長反応は、好ましくは以下の実施例４と本質的に同様の条件下で行われ得るが、ＤＮＡのハイブリダイゼーション、ならびにＤＮＡポリメラーゼの作用によるプライマーおよびデオキシヌクレオチドによるＤＮＡの伸長反応が行われる任意の条件下で実施され得る。ＤＮＡプローブと目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの実験書に記載される方法によって行なわれ、本方法は当業者に公知である。代表的には、ハイブリダイゼーション条件は、通常ＡとＴとのペアが２℃、ＧとＣとのペアが４℃としてその合計に２℃を加えた値をＴｍ値としてとり、そこから５℃下げたくらいの温度条件を設定し得る。本発明の実施の形態では特異性が高いことが望ましいので、ハイブリダイゼーションは、５０〜６０℃約１秒間で行い得る。ポリメラーゼによる伸長反応は、この酵素が最適に反応する条件を考慮して条件が設定され得る。Ｔａｑポリメラーゼが使用される場合、７０〜７４℃で実施され得る。反応時間は、１０秒〜３分程度であり得る。
【００５５】
反応系中に含み得るＤＮＡプローブ、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドの量は、当業者によって適宜決定され得る。
【００５６】
また、反応式（VI）に示すように、デオキシヌクレオチドが１つ伸長する度にピロリン酸が１つ生成されるので、目的の特定配列を持つＤＮＡおよびＤＮＡプローブの両方の長さ（ベース）が既知であれば、目的の特定配列を持つＤＮＡを定量的に検出することが可能である。
【００５７】
さらに、反応式（VI）の反応をＰＣＲ等の核酸増幅反応と置き換えることにより、試料中の目的の特定配列を持つＤＮＡの量を飛躍的に増加させることができる。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いることにより、極微量のＤＮＡの検出も可能である。
【００５８】
尚、本実施の形態では、特定配列をもつＤＮＡを高感度に検出する方法を示したが、特定配列をもつＲＮＡについても同様の方法により検出することが可能である。
【００５９】
（実施の形態４）
本発明の実施の形態４では、測定系のＤＮＡのＳＮＰを高速にタイピングする方法が実施される。
【００６０】
本発明の実施の形態４について図４および図５を用いて説明する。図４は、検出を目的とするＤＮＡとＤＮＡプローブとにおいてＳＮＰ部位が一致した場合の反応系を示し、図５は、検出を目的とするＤＮＡとＤＮＡプローブとにおいてＳＮＰ部位が一致しない場合の反応系を示す。図４および図５中、１はＤＮＡプローブ、２は目的の特定配列を持つＤＮＡ、３ａは一致したＳＮＰ部位、３ｂは一致しないＳＮＰ部位、４はＤＮＡポリメラーゼ、そして５はｄＮＴＰを表す。
【００６１】
本実施の形態においては、まず、目的とするＤＮＡの配列に相補的な配列を持ち、かつ３’末端がＳＮＰ部位であるＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料が供せられる。これにより、ＤＮＡプローブが伸長され、ここでピロリン酸が、このＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される。
【００６２】
本実施の形態で使用されるＤＮＡプローブは、目的の配列に相補的であり、かつ３’末端がＳＮＰ部位であるように設計される。本実施の形態において、ＤＮＡプローブは、３’末端がＳＮＰ部位であることを除いては、上述の実施の形態３と同様に設計され得る。本実施の形態において使用されるＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドは、上述の実施の形態３と同様であり得る。本実施の形態におけるハイブリダイゼーションおよび伸長の条件もまた、上述の実施の形態３と同様であり得る。
【００６３】
試料中の目的のＤＮＡおよびＤＮＡプローブの塩基配列が、ＳＮＰ部位も含めて完全に相補する場合、当該ＤＮＡプローブは目的のＤＮＡにハイブリダイズし、かつ当該プローブのさらなる伸長のためのプライマーとして働く。この場合、図４に示されるように、反応系中に存在するＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡプローブにデオキシヌクレオチドが１つ伸長されて、ピロリン酸が１つ生成される。一方、試料中の目的のＤＮＡおよびＤＮＡプローブの塩基配列が、ＳＮＰ部位において相補的でない場合（たとえ他の部分において相補的であったとしても）、ＤＮＡプローブは、目的のＤＮＡとハイブリダイズは行い得るが、ＤＮＡプローブの３’末端がミスマッチとなるため、当該プローブの伸長のためのプライマーとして働かない。この場合、図５に示されるように、反応系中にＤＮＡポリメラーゼおよび必要なデオキシヌクレオチドが存在しても、反応式（VI）の反応は起こらず、ピロリン酸は生成されない。
【００６４】
よって、核酸の伸長反応後の試料中のピロリン酸を、実施の形態２と同様に無機リン酸へと分解し、次いで無機リン酸を実施の形態１と同様に検出することにより、試料中の目的の特定配列を持つＤＮＡおよびＤＮＡプローブは、ＳＮＰ部位も含め完全に一致していると判別できる。ＳＮＰ部位における塩基の種類が異なる多くとも４種類のプローブを用いれば、試料中の特定配列を持つＤＮＡのＳＮＰを４種類の塩基についてタイピングすることが可能である。
【００６５】
なお、ＳＮＰ部位における塩基の種類が既知の場合、そのタイピングに必ずしも４種類のプローブが必要でないことは言うまでもない。
【００６６】
本実施の形態においては、３’末端がＳＮＰ部位であるＤＮＡプローブを用いたが、３’末端でない塩基にＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブを用いてもＤＮＡのＳＮＰをタイピングすることは可能である。
【００６７】
本発明で使用される「試料」とは、最終的に無機リン酸を含み得るいずれの試料をもいう。実施の形態２においては、無機リン酸に変換されるピロリン酸を含み得る試料であり、実施の形態３および４においては、伸長反応により、無機リン酸に変換されるピロリン酸が生成するためのＤＮＡを含み得る試料である。特にＤＮＡの検出に関する方法（実施の形態３または４）においては、「試料」は、目的とするＤＮＡを含み得る任意の被分析物に由来し得る。このような被分析物は、目的とするＤＮＡが疾患と関連し得る場合、疾患によって罹患された細胞、組織、器官、または血液であり得る。もちろん、本発明の方法は、臨床用途に限定されることなく、あらゆる分野において使用され得、従って、このような被分析物は、目的とするＤＮＡが発現しているかまたはその存在が確認されている細胞、組織、器官、または血液であり得る。ＤＮＡは、このような被分析物から、フェノール抽出法およびアルコール沈殿のような常法を用いて抽出され得る。ＤＮＡの純度は反応の効率に影響を与え得、ＤＮＡの精製の手順もまた当業者に公知である。
【００６８】
以上説明したように、本発明によれば、測定系にグリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび、電子メディエータ、必要に応じてジアホラーゼを含むことにより、試料中の無機リン酸を高感度かつ定量的に、電気化学的手法を用いて検出することが可能である。さらに、上記測定系にアデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼを含むことより、より高速に測定することが可能となる。
【００６９】
また、ピロフォスファターゼを用いてピロリン酸を無機リン酸に分解することにより、上記の手法を用いてピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が可能となる。
【００７０】
また、本発明によれば、核酸の伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の核酸のＳＮＰ部位における塩基判定を、高感度かつ高速に測定することが出来る。
【００７１】
このように、本発明によれば、試料中の目的核酸を標識することなく、簡便かつ迅速に目的の核酸のＳＮＰをタイピングすることが可能になる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明の無機リン酸の検出、ピロリン酸の検出、ＤＮＡの検出、およびＳＮＰのタイピングについてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００７３】
（実施例１）
以下の手順で反応溶液を作製した。２８２ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１．８μｌ（終濃度１ｍＭ）、５０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および５０ｍＭフェリシアン化カリウム１０μｌ（終濃度１ｍＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整して総量を５００μｌとした。この反応溶液に、５０ｍＭリン酸を１μｌ加えた（終濃度０．１ｍＭ）。この反応溶液を図９に示すように構成した測定装置系中に供した。本測定装置系は、次のような構成である。ガラスセル６を、内部に攪拌子７を入れて、スタラーマシン１３上に固定した。ガラスセル６に、電極固定器具８により、測定極９、対極１０、および参照極１１をセットした。測定極９は金電極で、また対極１０は白金線でそれぞれ構成した。参照極１１は、銀／塩化銀電極で構成し、表面に塩化銀がコートされた銀線と飽和ＫＣｌ溶液とを多孔性ガラスを介してガラスセルに接続した。これらの電極を、それぞれ電気化学測定システム（北斗電工製；図中、１４で示される）に接続して、パソコン１５で制御およびデータの記録を行った。上記ガラスセル６中に、上記の反応溶液を満たした。この反応溶液を攪拌子７によって攪拌した。電気化学測定システムを用いて、参照極１１に対して＋５００ｍＶの電位を測定極９に印加した。これにより、反応溶液中のメディーエータが酸化し、この酸化による電子の放出により測定極９と対極１０との間に電流が流れた。流れた電流値を電気化学測定システムを用いて測定した。この電流値の変化を図６に示す。図６中、縦軸に電流Ｉ（μＡ）および横軸に時間ｔ（秒）を示す。図６より、この反応は約１００秒で定常値に達していることが分かった。次にリン酸の量を変化させたときの１００秒後の電流値を図７に示す。図７中、縦軸に電流値の絶対値（μＡ）および横軸にリン酸濃度（μＭ）を示し、各リン酸濃度における電流値を黒丸で示す。図７に示すように、１００秒後の電流値は、加えたリン酸の量に対して良好な直線関係を示した。
【００７４】
（実施例２）
以下の手順で反応溶液を作製した。２８２ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１．８μｌ（終濃度１ｍＭ）、５０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、５０ｍＭアデノシン二リン酸１０μｌ（終濃度１ｍＭ）および１ｕｎｉｔ／μｌホスホグリセレートキナーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、５０ｍＭフェリシアン化カリウム１０μｌ（終濃度１ｍＭ）および５０ｍＭ塩化マグネシウム１０μｌ（終濃度１０ｍＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整して総量を５００μｌとした。このようにして作製した反応溶液に５０ｍＭリン酸を１μｌ（終濃度０．１ｍＭ）を加え、実施例１と同様に電流値を測定した。本実施例では、約６０秒で定常値に達した。このように、アデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼを加えることによって、反応が促進されることが確認された。
【００７５】
（実施例３）
以下の手順で反応溶液を作製した。１ｕｎｉｔ／μｌピロフォスファターゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、２８２ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１．８μｌ（終濃度１ｍＭ）、５０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ １０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および５０ｍＭフェリシアン化カリウム１０μｌ（終濃度１ｍＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整して総量を５００μｌとした。このようにして作製した反応溶液に５０ｍＭピロリン酸を１μｌ（終濃度０．１ｍＭ）加え、実施例１と同様に１００秒後の電流値を測定した（結果は示さず）。ピロリン酸の量を変化させたときの１００秒後の電流値を図８に示す。図８中、縦軸に電流値の絶対値（μＡ）および横軸にピロリン酸濃度（μＭ）を示し、各ピロリン酸濃度における電流値を黒丸で示す。図８に示すように、電流値は、加えたピロリン酸の濃度に対して良好な直線関係を示した。
【００７６】
（実施例４）
測定系にＣｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（λＤＮＡ）（寶酒造製）を加えた試料を試料１、加えなかった試料を試料２とし、ＰＣＲ反応を行った。テンプレートとしてλＤＮＡを用い、プライマーとしてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｉｍｅｒ１（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：１））およびＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：２））を用いて実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。２．５ｕｎｉｔ／μｌ ＴａＫａＲａ Ｚ−ＴａｑＴＭ ０．５μｌ、１０×Ｚ−ＴａｑＴＭＢｕｆｆｅｒ５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３各０．５μｌをそれぞれ試料１および試料２に加えた後、試料１にのみ１μｇ／ｍｌ λＤＮＡ１μｌを加え、次いで試料１および試料２にそれぞれ蒸留水を加えて総量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃１０秒を３０サイクル行った。ＰＣＲ反応が終了した溶液１μｌを、実施例３で作製した反応溶液（ピロリン酸添加前）に加え、実施例１と同様に１００秒後の電流値を測定した結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
テンプレートとしてλＤＮＡを加えた試料１では、ＰＣＲ反応の進行によって生成されたピロリン酸を発端とした酵素反応の進行により、フェロシアン化カリウムの酸化電流が観察されたが、試料２においてはＰＣＲ反応が進行せず、よって電流は観察されなかった。
【００７８】
（実施例５）
測定系にＣｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（λＤＮＡ）（同上）を加えてＰＣＲ反応を行った。テンプレートとしてλＤＮＡを用い、プライマーとしてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｉｍｅｒ１（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：１））およびＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：２））を用いた試料を試料１、改変Ｐｒｉｍｅｒ１’（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＡ−３’（配列番号：３））およびＰｒｉｍｅｒ３を用いた試料を試料２として実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。２．５ｕｎｉｔ／μｌ ＴａＫａＲａ Ｚ−ＴａｑＴＭ ０．５μｌ、１０×Ｚ−ＴａｑＴＭＢｕｆｆｅｒ５μｌ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌおよび試料１には２０ｐｍｏｌ／μｌ Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３各０．５μｌ、試料２には２０ｐｍｏｌ／μｌ Ｐｒｉｍｅｒ１’およびＰｒｉｍｅｒ３各０．５μｌをそれぞれ加えた後、それぞれ１μｇ／ｍｌ λＤＮＡ１μｌおよび蒸留水を加えて総量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃１０秒を３０サイクル行った。ＰＣＲ反応が終了した溶液１μｌを、実施例３で作製した反応溶液（ピロリン酸添加前）に加え、実施例１と同様に１００秒後の電流値を測定した結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
プライマーとして鋳型であるλＤＮＡの塩基配列と完全に相補的なＰｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３を用いた試料１では、ＰＣＲ反応の進行によって生成されたピロリン酸を発端とした酵素反応の進行により、フェロシアン化カリウムの酸化電流が観察されたが、試料２においては、Ｐｒｉｍｅｒ１’の３’末端側が、鋳型であるλＤＮＡの塩基配列と相補的でないため、テンプレートλＤＮＡを鋳型としたＰｒｉｍｅｒ３による伸長反応が行われただけで、ＰＣＲによる増幅反応は進行せず、よって電流はほとんど観察されなかった。
【００８０】
（実施例６）
以下の手順で反応溶液を作製した。１ｍＭピロリン酸５０μｌ（終濃度１００μＭ）、３０ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１７．５μｌ（終濃度１ｍＭ）、１０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド５０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１０ｍＭフェリシアン化カリウム５０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１００ｍＭ塩化マグネシウム８．０μｌ（終濃度１．６ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ５μｌ（終濃度１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および０．２ｕｎｉｔ／μｌピロフォスファターゼ１μｌ（終濃度０．４ｕｎｉｔ／ｍｌ）、を５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液に溶解し、ｐＨ８．８に調整して総量を４８０μｌとした。
【００８１】
このようにして作製した反応溶液を実施例１と同様に電流値を測定しながら、測定開始から６０秒後に０．８ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２０μｌ（終濃度３２ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加えた。また、上記１ｍＭピロリン酸を、それぞれ０．８ｍＭ（終濃度８０μＭ）、０．６ｍＭ（終濃度６０μＭ）、０．４ｍＭ（終濃度４０μＭ）、０．２ｍＭ（終濃度２０μＭ）としたときに観察される電流値をそれぞれ同様に測定した。この電流値の変化を図１０に示す。図１０中、縦軸に電流値Ｉ（μＡ）および横軸に時間ｔ（秒）を示す。図１０より、この反応は反応開始から約１００秒（測定開始から約１６０秒後）で定常値に達していることが分かった。
【００８２】
次にピロリン酸の量を変化させたときの反応開始１００秒後の電流値を図１１に示す。図１１中、縦軸に電流値の絶対値（μＡ）および横軸にピロリン酸終濃度（μＭ）を示し、各ピロリン酸濃度における電流値を黒丸で示す。図１１に示すように、加えたピロリン酸の量と反応開始１００秒後の電流値は良好な相関関係を示した。
【００８３】
尚、本実施例によって得られた図１１のデータと、実施例３によって得られた図８のデータを比較すると、本実施例の方が、高感度にピロリン酸が検出されていることがわかる。したがって、本実施例で採用した条件の方が、実施例３で採用した条件より高感度でピロリン酸を検出することができる。
【００８４】
本発明によれば、電気化学的手法を用いる試料中の無機リン酸の高感度、高速、かつ定量的な検出が提供される。さらに、ピロリン酸を無機リン酸に変換することにより、ピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が提供される。また、本発明によれば、核酸の伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の核酸のＳＮＰ部位における塩基判定を、高感度かつ高速に測定することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
以上のように、本発明は、臨床用途、創薬用途、系統分類学への応用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるＳＮＰタイピングの方法を示す概略図である。
【図２】Ｉｎｖａｄｅｒ法によるＳＮＰタイピングの方法を示す概略図である。
【図３】パイロシーケンシング法によるＳＮＰタイピングの方法を示す概略図である。
【図４】ＳＮＰ部位一致プローブの使用によるピロリン酸生成を示す模式図である。
【図５】ＳＮＰ部位不一致プローブの使用による様子を示す模式図である。
【図６】実施例１におけるリン酸の検出反応時間を示すグラフである。
【図７】実施例１におけるリン酸濃度と電流値の関係を示すグラフである。
【図８】実施例３におけるピロリン酸濃度と電流値の関係を示すグラフである。
【図９】電流値を測定するための例示の測定装置系を示す模式図である。
【図１０】実施例６におけるピロリン酸の検出反応時間を示すグラフである。
【図１１】実施例６におけるピロリン酸濃度と電流値の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８７】
１ ＤＮＡプローブ
２ 特定配列を持つＤＮＡ
４ ＤＮＡポリメラーゼ
５ ｄＮＴＰ
６ ガラスセル
９ 測定極
１０ 対極
１１ 参照極
１４ 電気化学測定システム
【配列表のフリーテキスト】
【００８８】
配列番号１の<223>：プライマー
配列番号２の<223>：プライマー
配列番号３の<223>：プライマー
【配列表】
【０００１】
本発明は、無機リン酸もしくはピロリン酸を検出する方法に関する。さらに、前記検出により、試料中の目的核酸を簡易かつ高感度で検出する方法、特にＳＮＰを判別する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子情報に関する技術が盛んに開発されている。医療分野では、疾患関連遺伝子を解析することにより、疾患の分子レベルでの治療が可能となってきている。また、遺伝子診断により、患者個人ごとに対応したテーラーメード医療も可能となってきている。製薬分野においては、遺伝子情報を使用して、抗体やホルモンなどのタンパク分子を特定し、薬品として利用している。農業や食品分野などにおいても、多くの遺伝子情報を利用した製品が作り出されている。
【０００３】
これらの遺伝子情報の中でも、遺伝子多型は特に重要である。我々の顔や体型などが様々であるように、一人一人の遺伝子情報もかなりの部分で異なっている。これらの遺伝情報の違いのうち、塩基配列の変化が人口の１％以上の頻度で存在するものを遺伝子多型と呼んでいる。これらの遺伝子多型が、個人の顔かたちだけでなく、様々な遺伝子疾患の原因や、体質、薬剤応答性、薬剤の副作用などに関連していると言われ、現在この遺伝子多型と疾患などとの関連が急速に調べられている。
【０００４】
この遺伝子多型の中で、近年、特に注目されているのがＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）である。ＳＮＰは、遺伝子情報の塩基配列の中で、一塩基のみが異なっている遺伝子多型のことを指す。ＳＮＰはヒトゲノムＤＮＡ内に２〜３百万あると言われており、遺伝子多型のマーカーとして利用しやすく、臨床への応用が期待されている。現在では、ＳＮＰ関連技術として、ゲノム中のＳＮＰの位置同定およびＳＮＰｓと疾患との関連性等の研究とともに、ＳＮＰ部位の塩基を判別するＳＮＰｓタイピング技術の開発が行われている。
【０００５】
一般的にＤＮＡの塩基配列の違いを判別する手段としては、サンガー（ダイデオキシ）法、ＤＮＡチップ法などが用いられている。サンガー法は、ヒトの遺伝子の解析したい領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法で増幅したのち、所望の部位の塩基配列を読み取ってシーケンスを行い、塩基配列を直接決定してＳＮＰタイピングを行う。ＤＮＡチップ法は、ｃＤＮＡのＰＣＲ産物もしくは１５〜２０塩基程度のオリゴヌクレオチドプローブを基板上に固定し、そこに蛍光標識した試料ＤＮＡをハイブリダイゼーションさせるものである。温度等のハイブリダイゼーション条件を厳しく制御することで、ＳＮＰをプローブと試料ＤＮＡの親和性の差、つまり蛍光強度の差によって検出するものである。
【０００６】
さらに、大量のＳＮＰタイピングを可能にするために、特表平１０−５１０９８２号（ＴａｑＭａｎＰＣＲ法）（特許文献１）や特表２００１−５１８８０５号（Ｉｎｖａｄｅｒ法）（特許文献２）などが開示されている。特表平１０−５１０９８２号に示されている方法の概略図を図１に示す。特表平１０−５１０９８２号では、蛍光分子および該蛍光分子の蛍光を消光できる消光分子を含むオリゴヌクレオチドプローブが提供されている。標的ポリヌクレオチドの「下流領域」（すなわち、プライマー結合部位の伸長方向）に特異的にアニールされる報知分子−消光分子対を含むオリゴヌクレオチドプローブを用いる。この消光分子および報知分子は互いに十分接近して配置され、それによって報知分子が励起されると、常にこの励起状態エネルギーは消光分子に非放射性に伝えられ、該エネルギーは非放射性に消失するか、または報知分子の発光周波数と異なる周波数で放出される。ＤＮＡポリメラーゼによって鎖が伸長している間プローブは鋳型とアニールし、このプローブはポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性によって消化される。プローブが消化される結果、この報知分子は効果的に消光分子から分離され、それによって消光分子はもはや報知分子の蛍光を消光できるほど十分に報知分子に接近することができない。したがって、増幅時にプローブが消化されればされるほど、溶液中の報知分子数は増加し、結果として非消光報知分子数が増す結果となり蛍光シグナルはますます強くなる。
【０００７】
特表２００１−５１８８０５号では、標的核酸分子の存在を検出する方法が示されている。この方法の概略図を図２に示す。構造特異的ヌクレアーゼ、第１標的核酸の源（ただし、第１標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を有し、第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置する）、５’部分と３’部分を有する第１オリゴヌクレオチド（ただし、第１オリゴヌクレオチドの５’部分は第１標的核酸の第２領域に相補的な配列を含み、第１オリゴヌクレオチドの３’部分は第１標的核酸の第３領域に相補的な配列を含む）、５’部分と３’部分を有する第２オリゴヌクレオチド（ただし、第２オリゴヌクレオチドの５’部分は第１標的核酸の第１領域に相補的な配列を含み、第２オリゴヌクレオチドの３’部分は第１標的核酸の第２領域に相補的な配列を含む）、第２標的核酸の源（ただし、第２標的核酸は第１領域、第２領域および第３領域を有し、第１領域は第２領域に隣接してその下流に位置し、第２領域は第３領域に隣接してその下流に位置する）、５’部分と３’部分を有する第３オリゴヌクレオチド（ただし、第３オリゴヌクレオチドの５’部分は第２標的核酸の第２領域に相補的な配列を含み、第３オリゴヌクレオチドの３’部分は第２標的核酸の第３領域に相補的な配列を含む）を用意し、第１オリゴヌクレオチドの少なくとも３’部分が第１標的核酸にアニーリングし、かつ第２オリゴヌクレオチドの少なくとも５’部分が第１標的核酸にアニーリングしている第１開裂構造体を形成し、第１開裂構造体の開裂を構造特異的ヌクレアーゼにより起こすことにより第１オリゴヌクレオチドを開裂して第４オリゴヌクレオチドを生成させ、この第４オリゴヌクレオチドは５’部分と３’部分を有し、第４オリゴヌクレオチドの５’部分が第２標的核酸の第１領域に相補的な配列を含み、第４オリゴヌクレオチドの３’部分が第２標的核酸の第２領域に相補的な配列を含むものであり、第３オリゴヌクレオチドの少なくとも３’部分が第２標的核酸にアニーリングし、かつ第４オリゴヌクレオチドの少なくとも５’部分が第２標的核酸にアニーリングしている第２開裂構造体を形成し、第２開裂構造体の開裂を起こして第５オリゴヌクレオチドを生成させ、この第５オリゴヌクレオチドは３’−ヒドロキシル基を有するものであり、そして上記第５オリゴヌクレオチドを検出することを含んでなる方法を開示している。
【０００８】
しかしながら、これらの方法はいずれも、プローブに蛍光標識を用いているため、試薬などが大変高価であり、かつ蛍光検出にレーザ照射等の光源が必要となるため測定装置も大型となってしまい、医療機関で臨床用途として使用することを考えた場合、多くの問題点が残っている。
【０００９】
一方、新たなＤＮＡ塩基配列の決定方法として、特表２００１−５０６８６４号（特許文献３）では、ＤＮＡの伸長反応に伴って生成されるピロリン酸をＡＴＰ（アデノシン三リン酸）に変換し、ＡＴＰを基質として、ルシフェラーゼの作用によるルシフェリンの発光を検出する方式が開示されている。この方法の概略図を図３に示す。標的位置のすぐ隣で試料ＤＮＡにハイブリダイズする伸長プライマーを用意し、試料ＤＮＡおよび伸長プライマーを、デオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドの存在下でポリメラーゼ反応に供し、それによりデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、それが標的位置の塩基と相補的である場合にのみ、取り込まれてピロリン酸（ＰＰｉ）を放出するようにし、ＰＰｉ放出を酵素的に検出し、異なるデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドを、試料−プライマー混合物の別個のアリコートに、または同じ試料−プライマー混合物のアリコートに連続的に添加して、ポリメラーゼ反応に供し、どのデオキシヌクレオチドまたはジデオキシヌクレオチドが取り込まれたかを示す方法であって、ＰＰｉ検出酵素がポリメラーゼ反応工程に包含されること、およびデオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）またはジデオキシアデノシントリホスフェート（ｄｄＡＴＰ）の代わりに、ポリメラーゼの基質として作用することができるが前記ＰＰｉ検出酵素の基質としては作用することができないｄＡＴＰまたはｄｄＡＴＰアナログを用いることを特徴とする方法を提供する。特表２００１−５０６８６４号においては、有利にも、大規模の非電気泳動的固相ＤＮＡ配列決定を可能にし、それにより時間に伴う重合反応の進行の連続的決定が可能になる方法が開示されている。
【００１０】
しかしながら、この方法においても、ルシフェラーゼの発光を検出する等、大がかりな装置が必要であり、病院のベッドサイドや薬剤供給の際の簡易型システムとしては、適したものではなかった。
【００１１】
特開昭６３−４９１００号（特許文献４）には、無機リン酸の測定方法が開示されている。この方法では、無機リン酸が関わる３段階の反応を利用しており、最終的に、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）が還元されてＮＡＤＨとなり、又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）が還元されてＮＡＤＰＨとなり、生成したＮＡＤ（Ｐ）Ｈの量を紫外線吸収法等により測定する。この方法では３段階の反応を用いているため、反応の素過程が多く、全素過程が進行する反応条件を設定することは煩雑な上、必ずしも効率良い条件にできるとは限らない。さらに、分光高度計などの比較的大がかりな測定装置を用いる必要があり、簡便性に欠けるという問題点があった。
【００１２】
また、上記特開昭６３−４９１００号に記載されている方法と同様に、目的試料の反応に伴って補酵素ＮＡＤ（Ｐ）＋が還元されることを利用して、目的試料を検出する方法が国際公開パンフレットＷＯ００／０４３７８号（特許文献５）に記載されている。しかしながら、ここでの検出目的試料はＬ−フェニルアラニンであるため、かかる方法を標的核酸分子の存在の検出に適用することはできない。
【特許文献１】
特表平１０−５１０９８２号
【特許文献２】
特表２００１−５１８８０５号
【特許文献３】
特表２００１−５０６８６４号
【特許文献４】
特開昭６３−４９１００号
【特許文献５】
国際公開パンフレットＷＯ００／０４３７８号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、上記従来の問題点を解決することを目的とするものであり、迅速、簡便な方法で、かつ高感度の検出が可能な無機リン酸、ピロリン酸及び核酸の検出方法を提供する。また、大量のＳＮＰタイピングを、高感度かつ安価に実現できるＳＮＰタイピング法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、無機リン酸を検出する方法を提供する。本方法は、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に試料を供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中の無機リン酸の濃度を示す。
【００１５】
１つの実施形態では、上記電子メディエータは、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である。
【００１６】
１つの実施形態では、上記測定系はジアホラーゼをさらに含む。
【００１７】
１つの実施形態では、上記測定系はアデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼをさらに含む。
【００１８】
さらに、本発明は、ピロリン酸を検出する方法を提供する。本方法は、試料中のピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；上記試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中のピロリン酸の濃度を示す。
【００１９】
１つの実施形態では、上記ピロリン酸の無機リン酸への変換が、ピロフォスファターゼを用いて行われる。
【００２０】
さらに、本発明は、核酸を検出する方法を提供する。本方法は、上記核酸の配列に相補的な配列を持つＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供し、上記ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸が上記ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される工程；試料中の生成されたピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；上記試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中の特定配列を有する核酸の濃度を示す。
【００２１】
１つの実施形態では、上記ＤＮＡプローブの伸長反応はＰＣＲ反応である。
【００２２】
さらに、本発明は、ＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法を提供する。本方法は、上記ＤＮＡの配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供し、上記ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸が上記ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される工程；試料中の生成されたピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；上記試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；および上記測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、上記電流値が、上記試料中の特定配列を有するＤＮＡの存在を示す。
【００２３】
１つの実施形態では、上記ＤＮＡプローブの伸長反応はＰＣＲ反応である。
【発明の効果】
【００２４】
本発明によれば、電気化学的手法を用いる試料中の無機リン酸の高感度、高速、かつ定量的な検出が提供される。さらに、ピロリン酸を無機リン酸に変換することにより、ピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が提供される。また、本発明によれば、核酸の伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の核酸のＳＮＰ部位における塩基判定を、高感度かつ高速に測定することが出来る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
【００２６】
（実施の形態１）
本発明の実施の形態１では、酵素反応を用いて簡便な無機リン酸の定量的検出を行う。本発明の実施の形態１は、無機リン酸を検出する方法に関し、この方法は、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、および電子メディエータを含む測定系に試料を供する工程；およびこの測定系において電流値を測定する工程を包含する。本明細書中では、「測定系」は、無機リン酸の検出に関する機構に関与する一連の反応全体、およびこのような一連の反応が実施される場をいう。「測定系」には、一連の反応が実施されるのに必要な成分が存在する。「測定系」は、通常、上記成分が適切な溶媒（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液のような緩衝液）中に溶解された溶液の形態で提供され得る。グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼとは、ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を補酵素とし、グリセルアルデヒド−３−リン酸を酸化的にリン酸化する酵素であり、本明細書においては、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとも示す。
【００２７】
本発明の実施の形態１について反応式（I）〜反応式（IV）を用いて説明する。
【００２８】
まず、反応式（I）に示すように、無機リン酸は、グリセルアルデヒド−３−リン酸とともに、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼとＮＡＤ（Ｐ）＋の触媒作用を受け、１，３−ビスホスホグリセリン酸に変換される。このとき、ＮＡＤ（Ｐ）＋はＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元される。
【００２９】
【化１】
【００３０】
【化２】
【００３１】
最後に、反応式（III）に示すように、反応式（II）の反応の結果生成された電子メディエータの還元体が、一定以上の電位が印加された作用極において電気化学的に酸化される。
【００３２】
【化３】
【００３３】
より具体的には、電気化学的酸化の測定は、図９に示す測定装置系を用いて行われ得る。本測定装置系は、以下のように構成されている。図中、６はガラスセルであり、内部に攪拌子７を入れ、スタラーマシン１３上に固定されている。ガラスセル６には、電極固定器具８により、測定極９、対極１０、および参照極１１がセットされている。測定極９は金電極で、また対極１０は白金線でそれぞれ構成されている。参照極１１は、銀／塩化銀電極で構成され、表面に塩化銀がコートされた銀線と飽和ＫＣｌ溶液が多孔性ガラスを介してガラスセルに接続されている。これらの電極は、それぞれポテンショスタット、ファンクションジェネレータなどが一体化された電気化学測定システム１４に接続されており、パソコン１５により制御およびデータの記録を行っている。
【００３４】
上記ガラスセル６中には、反応溶液１２が満たされており、反応溶液１２は攪拌子７によって攪拌される。電気化学測定システム１４を用いて、参照極１１に対して一定以上の電位を測定極９に印加すると、反応溶液中のメディエータが酸化し、この酸化による電子の放出により測定極９と対極１０との間に電流が流れる。上記電位は、メディエータ種によって異なる。そのメディエータ種の酸化還元電位よりも高い電位が測定極９に加えられ得る。例えば、メディエータとしてフェリシアン化カリウムを用いた場合、参照極１１に対して＋５００ｍＶ程度の電位が測定極９に加えられる。このときの電流値が、電気化学測定システム１４を用いて測定され得る。
【００３５】
電流値は、最初の無機リン酸の存在に依存するので、この酸化電流値をもとにして無機リン酸が検出され得る。
【００３６】
尚、反応式（II）において、電子メディエータが還元されることによってＮＡＤ（Ｐ）Ｈが消費され、ＮＡＤ（Ｐ）＋が生成される。従って、反応式（I）の反応は、１，３−ホスホグリセリン酸及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される方向に促進される。すなわち、本実施の形態において、電子メディエータは、酸化されることにより、無機リン酸の濃度に対応した電流値の測定に寄与するのみならず、無機リン酸の濃度を高感度に検出することに寄与する。
【００３７】
また、上記の通り、本実施の形態において、無機リン酸が関わる反応の素過程は、反応式（I）に示す一過程のみである。したがって、かかる素過程が効率良く進行するよう制御することは容易である。
【００３８】
以上に示される反応式（I）〜反応式（III）の一連の反応を用いた検出方法は、電気化学的な手法による無機リン酸の定性検出を可能にする。また、その結果得られる電流値は最初の無機リン酸の量に依存するため、その検出は定量的なものである。
【００３９】
本実施の形態においては、反応式（I）に示されるように、無機リン酸とグリセルアルデヒド−３−リン酸とＮＡＤ（Ｐ）＋とがまず反応し、その結果１，３−ビスホスホグリセリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成する。この反応は吸エルゴン反応である。一方、反応式（IV）に示すように、１，３−ビスホスホグリセリン酸をアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）とともにホスホグリセレートキナーゼの触媒作用により反応させ、３−ホスホグリセリン酸およびアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成する反応がある。この反応を進行させるために、Ｍｇ２＋もまた添加され得る。Ｍｇ２＋は、これが反応系中で反応に関与できる状態で存在し得る限り、いかなる形態でも添加され得る。塩化マグネシウムが好ましく用いられ得る。添加される濃度は、各反応基質が１ｍＭで添加される場合、１０ｍＭであり得る。この反応は発エルゴン反応である。従って、本実施の形態において、この反応式（IV）の反応を共役させることで、反応式（I）の反応の平衡を１，３−ビスホスホグリセリン酸およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈが生成される方向に傾けてもよい。
【００４０】
【化４】
【００４１】
測定系は、上述した成分のそれぞれを適切な濃度で含む反応溶液であり得る。反応式（I）〜反応式（IV）から明らかなように、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、および電子メディエータ、ならびにアデノシン二リン酸が含まれる場合、アデノシン二リン酸は、それらの終濃度が実質的に同一の濃度となるように、この反応溶液中に含まれ得る。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、およびホスホグリセレートキナーゼのような酵素は、反応を進行させるのに適切な濃度で含まれ得る。このような濃度は、例えば、各反応物質を約１ｍＭの終濃度で添加する場合、０．５〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌであり得、好ましくは、１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、最も好ましくは、５〜５０ｕｎｉｔ／ｍｌであり得る。無機リン酸を定量的に検出するために、試料を上記反応溶液に添加して反応式（I）〜反応式（III）（および反応式（IV））に示されるような反応を生じさせ、そしてこの反応により生成される電流値を測定し得る。
【００４２】
（実施の形態２）
本発明の実施の形態２では、酵素反応を用いた簡便なピロリン酸の定量的検出を行う。
【００４３】
本発明の実施の形態２について反応式（V）を用いて説明する。
【００４４】
まず、反応式（V）に示すようにピロリン酸（反応式（V）中のＰＰｉ）を加水分解して無機リン酸（反応式（V）中のＰｉ）にする。
【００４５】
【化５】
【００４６】
次に、反応式（V）の反応により生成された無機リン酸を、実施の形態１と同様に検出することにより、定量的にピロリン酸を検出することが可能である。
【００４７】
本実施の形態において、反応式（V）の反応は、実施の形態１に示した無機リン酸の検出における反応と別個に行う必要はない。従って、被験試料中のピロリン酸を検出するために、上記実施の形態１で説明したような無機リン酸を検出するための測定系に、さらにピロフォスファターゼを含ませ得る。例えば、被験試料中のピロリン酸を検出するために、無機リン酸の検出のための測定系に含まれる上述の成分のそれぞれに加えて、ピロフォスファターゼを適切な濃度で含む反応溶液が使用され得る。このピロフォスファターゼもまた、反応を進行させるのに適切な濃度で含まれ得る。このピロフォスファターゼの濃度は、例えば、各反応物質を約１ｍＭの終濃度で添加する場合、０．００１〜１，０００ｕｎｉｔ／ｍｌであり得、好ましくは、０．０１〜１００ｕｎｉｔ／ｍｌ、最も好ましくは、０．１〜１ｕｎｉｔ／ｍｌであり得る。ピロリン酸を定量的に検出するために、試料を上記反応溶液に添加して反応式（V）ならびに反応式（I）〜反応式（III）（および反応式（IV））に示されるような反応を生じさせ、そしてこの反応により生成される電流値を測定し得る。
【００４８】
（実施の形態３）
本発明の実施の形態３では、特定配列を持つＤＮＡを高感度に検出する方法が実施される。
【００４９】
本実施の形態においては、まず、目的とするＤＮＡの配列に相補的な配列を持つＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料が供せられる。ここで「反応系」とは、以下に説明するような一連の核酸伸長反応およびこのような反応が実施される場をいう。「反応系」には、一連の反応が実施されるのに必要な成分が存在する。「反応系」は、通常、上記成分が適切な溶媒（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、核酸伸長反応または核酸増幅反応で通常使用され得るいずれもの緩衝液（市販による入手可能なキット中の緩衝液を含む））中に溶解された溶液の形態で提供され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、市販により入手可能な、または当業者により調製可能な、任意のＤＮＡポリメラーゼであり得る。好ましくは、Ｔａｑポリメラーゼが使用され得るが、これに限定されない。デオキシヌクレオチドは、各デオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰとも称される：デオキシシトシン三リン酸、デオキシグアニン三リン酸、デオキシアデニン三リン酸、およびデオキシチミジン三リン酸を含む）であり得、通常、ＤＮＡ合成の直接の前駆物質として使用され得る物質である。これにより、ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸がこのＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される。この反応について、反応式（VI）を用いて説明する。
【００５０】
このＤＮＡプローブは目的のＤＮＡとハイブリダイズすると、反応系中に存在するＤＮＡポリメラーゼによって、反応系中の１つのデオキシヌクレオチド（反応式（VI）中のｄＮＴＰ）を取り込んで伸長され、ピロリン酸が１つ生成される。
【００５１】
【化６】
【００５２】
本実施の形態で使用されるＤＮＡプローブは、検出を目的とされるＤＮＡの配列に対して相補的な配列を有するように設計される。このＤＮＡプローブは、検出を目的とされるＤＮＡの配列とハイブリダイズした場合に、当該ＤＮＡプローブの伸長のためのプライマーとして働く。したがって、ＤＮＡプローブの長さは、伸長反応のためのプライマーとして働くのに十分な長さである。例えば、少なくとも１０塩基、少なくとも１２塩基、少なくとも１５塩基、少なくとも２０塩基、少なくとも３０塩基、少なくとも４０塩基、少なくとも５０塩基の長さであり得る。ハイブリダイゼーションおよびプライマー伸長を十分に行い得、かつその調製の容易さを考慮すると、１５〜５０塩基の長さが好ましい。本発明の方法で使用されるＤＮＡプローブは、検出を目的とされるＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、かつ当該ＤＮＡプローブの伸長のためのプライマーとして働く限り、いずれの長さでもあり得る。
【００５３】
ＤＮＡプローブは、試料中の目的のＤＮＡと特異的にハイブリダイズし、かつプライマーとして働くため、検出しようとする配列が既知である場合、この配列に対して完全に相補的である、すなわち、配列中の塩基に対して正確に対応する（Ａ−ＴまたはＣ−Ｇペア）配列を有するように設計され得る。試料中に目的の特定配列を有するＤＮＡが存在しない場合、当然のことながらＤＮＡプローブとのハイブリダイズは起こらない。したがって、本反応系を使用することにより、検出しようとする配列が既知または未知であるに関わらず、このＤＮＡプローブに完全に相補的である配列の存在を検出し得る。
【００５４】
ハイブリダイゼーションおよび伸長反応は、好ましくは以下の実施例４と本質的に同様の条件下で行われ得るが、ＤＮＡのハイブリダイゼーション、ならびにＤＮＡポリメラーゼの作用によるプライマーおよびデオキシヌクレオチドによるＤＮＡの伸長反応が行われる任意の条件下で実施され得る。ＤＮＡプローブと目的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの実験書に記載される方法によって行なわれ、本方法は当業者に公知である。代表的には、ハイブリダイゼーション条件は、通常ＡとＴとのペアが２℃、ＧとＣとのペアが４℃としてその合計に２℃を加えた値をＴｍ値としてとり、そこから５℃下げたくらいの温度条件を設定し得る。本発明の実施の形態では特異性が高いことが望ましいので、ハイブリダイゼーションは、５０〜６０℃約１秒間で行い得る。ポリメラーゼによる伸長反応は、この酵素が最適に反応する条件を考慮して条件が設定され得る。Ｔａｑポリメラーゼが使用される場合、７０〜７４℃で実施され得る。反応時間は、１０秒〜３分程度であり得る。
【００５５】
反応系中に含み得るＤＮＡプローブ、ポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドの量は、当業者によって適宜決定され得る。
【００５６】
また、反応式（VI）に示すように、デオキシヌクレオチドが１つ伸長する度にピロリン酸が１つ生成されるので、目的の特定配列を持つＤＮＡおよびＤＮＡプローブの両方の長さ（ベース）が既知であれば、目的の特定配列を持つＤＮＡを定量的に検出することが可能である。
【００５７】
さらに、反応式（VI）の反応をＰＣＲ等の核酸増幅反応と置き換えることにより、試料中の目的の特定配列を持つＤＮＡの量を飛躍的に増加させることができる。ＰＣＲ増幅の方法は、当該分野で周知である（ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＨＡ Ｅｒｌｉｃｈ編、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ、ＮＹ（１９９２）；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆｌａｎｄ、Ｓｎｉｓｋｙ、およびＷｈｉｔｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９０）；Ｍａｔｔｉｌａら（１９９１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９： ４９６７；Ｅｃｋｅｒｔ、Ｋ．Ａ．およびＫｕｎｋｅｌ、Ｔ．Ａ．（１９９１）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １： １７；ＰＣＲ、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｑｕｉｒｋｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）。ＰＣＲ等の核酸増幅反応を用いることにより、極微量のＤＮＡの検出も可能である。
【００５８】
尚、本実施の形態では、特定配列をもつＤＮＡを高感度に検出する方法を示したが、特定配列をもつＲＮＡについても同様の方法により検出することが可能である。
【００５９】
（実施の形態４）
本発明の実施の形態４では、測定系のＤＮＡのＳＮＰを高速にタイピングする方法が実施される。
【００６０】
本発明の実施の形態４について図４および図５を用いて説明する。図４は、検出を目的とするＤＮＡとＤＮＡプローブとにおいてＳＮＰ部位が一致した場合の反応系を示し、図５は、検出を目的とするＤＮＡとＤＮＡプローブとにおいてＳＮＰ部位が一致しない場合の反応系を示す。図４および図５中、１はＤＮＡプローブ、２は目的の特定配列を持つＤＮＡ、３ａは一致したＳＮＰ部位、３ｂは一致しないＳＮＰ部位、４はＤＮＡポリメラーゼ、そして５はｄＮＴＰを表す。
【００６１】
本実施の形態においては、まず、目的とするＤＮＡの配列に相補的な配列を持ち、かつ３’末端がＳＮＰ部位であるＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料が供せられる。これにより、ＤＮＡプローブが伸長され、ここでピロリン酸が、このＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される。
【００６２】
本実施の形態で使用されるＤＮＡプローブは、目的の配列に相補的であり、かつ３’末端がＳＮＰ部位であるように設計される。本実施の形態において、ＤＮＡプローブは、３’末端がＳＮＰ部位であることを除いては、上述の実施の形態３と同様に設計され得る。本実施の形態において使用されるＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチドは、上述の実施の形態３と同様であり得る。本実施の形態におけるハイブリダイゼーションおよび伸長の条件もまた、上述の実施の形態３と同様であり得る。
【００６３】
試料中の目的のＤＮＡおよびＤＮＡプローブの塩基配列が、ＳＮＰ部位も含めて完全に相補する場合、当該ＤＮＡプローブは目的のＤＮＡにハイブリダイズし、かつ当該プローブのさらなる伸長のためのプライマーとして働く。この場合、図４に示されるように、反応系中に存在するＤＮＡポリメラーゼによって、ＤＮＡプローブにデオキシヌクレオチドが１つ伸長されて、ピロリン酸が１つ生成される。一方、試料中の目的のＤＮＡおよびＤＮＡプローブの塩基配列が、ＳＮＰ部位において相補的でない場合（たとえ他の部分において相補的であったとしても）、ＤＮＡプローブは、目的のＤＮＡとハイブリダイズは行い得るが、ＤＮＡプローブの３’末端がミスマッチとなるため、当該プローブの伸長のためのプライマーとして働かない。この場合、図５に示されるように、反応系中にＤＮＡポリメラーゼおよび必要なデオキシヌクレオチドが存在しても、反応式（VI）の反応は起こらず、ピロリン酸は生成されない。
【００６４】
よって、核酸の伸長反応後の試料中のピロリン酸を、実施の形態２と同様に無機リン酸へと分解し、次いで無機リン酸を実施の形態１と同様に検出することにより、試料中の目的の特定配列を持つＤＮＡおよびＤＮＡプローブは、ＳＮＰ部位も含め完全に一致していると判別できる。ＳＮＰ部位における塩基の種類が異なる多くとも４種類のプローブを用いれば、試料中の特定配列を持つＤＮＡのＳＮＰを４種類の塩基についてタイピングすることが可能である。
【００６５】
なお、ＳＮＰ部位における塩基の種類が既知の場合、そのタイピングに必ずしも４種類のプローブが必要でないことは言うまでもない。
【００６６】
本実施の形態においては、３’末端がＳＮＰ部位であるＤＮＡプローブを用いたが、３’末端でない塩基にＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブを用いてもＤＮＡのＳＮＰをタイピングすることは可能である。
【００６７】
本発明で使用される「試料」とは、最終的に無機リン酸を含み得るいずれの試料をもいう。実施の形態２においては、無機リン酸に変換されるピロリン酸を含み得る試料であり、実施の形態３および４においては、伸長反応により、無機リン酸に変換されるピロリン酸が生成するためのＤＮＡを含み得る試料である。特にＤＮＡの検出に関する方法（実施の形態３または４）においては、「試料」は、目的とするＤＮＡを含み得る任意の被分析物に由来し得る。このような被分析物は、目的とするＤＮＡが疾患と関連し得る場合、疾患によって罹患された細胞、組織、器官、または血液であり得る。もちろん、本発明の方法は、臨床用途に限定されることなく、あらゆる分野において使用され得、従って、このような被分析物は、目的とするＤＮＡが発現しているかまたはその存在が確認されている細胞、組織、器官、または血液であり得る。ＤＮＡは、このような被分析物から、フェノール抽出法およびアルコール沈殿のような常法を用いて抽出され得る。ＤＮＡの純度は反応の効率に影響を与え得、ＤＮＡの精製の手順もまた当業者に公知である。
【００６８】
以上説明したように、本発明によれば、測定系にグリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼおよび、電子メディエータ、必要に応じてジアホラーゼを含むことにより、試料中の無機リン酸を高感度かつ定量的に、電気化学的手法を用いて検出することが可能である。さらに、上記測定系にアデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼを含むことより、より高速に測定することが可能となる。
【００６９】
また、ピロフォスファターゼを用いてピロリン酸を無機リン酸に分解することにより、上記の手法を用いてピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が可能となる。
【００７０】
また、本発明によれば、核酸の伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の核酸のＳＮＰ部位における塩基判定を、高感度かつ高速に測定することが出来る。
【００７１】
このように、本発明によれば、試料中の目的核酸を標識することなく、簡便かつ迅速に目的の核酸のＳＮＰをタイピングすることが可能になる。
【実施例】
【００７２】
以下、本発明の無機リン酸の検出、ピロリン酸の検出、ＤＮＡの検出、およびＳＮＰのタイピングについてさらに具体的に説明する。本発明は以下の実施例によって限定されるものではない。実施例で使用した材料、試薬などは、他に特定のない限り、商業的な供給源から入手可能である。
【００７３】
（実施例１）
以下の手順で反応溶液を作製した。２８２ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１．８μｌ（終濃度１ｍＭ）、５０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および５０ｍＭフェリシアン化カリウム１０μｌ（終濃度１ｍＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整して総量を５００μｌとした。この反応溶液に、５０ｍＭリン酸を１μｌ加えた（終濃度０．１ｍＭ）。この反応溶液を図９に示すように構成した測定装置系中に供した。本測定装置系は、次のような構成である。ガラスセル６を、内部に攪拌子７を入れて、スタラーマシン１３上に固定した。ガラスセル６に、電極固定器具８により、測定極９、対極１０、および参照極１１をセットした。測定極９は金電極で、また対極１０は白金線でそれぞれ構成した。参照極１１は、銀／塩化銀電極で構成し、表面に塩化銀がコートされた銀線と飽和ＫＣｌ溶液とを多孔性ガラスを介してガラスセルに接続した。これらの電極を、それぞれ電気化学測定システム（北斗電工製；図中、１４で示される）に接続して、パソコン１５で制御およびデータの記録を行った。上記ガラスセル６中に、上記の反応溶液を満たした。この反応溶液を攪拌子７によって攪拌した。電気化学測定システムを用いて、参照極１１に対して＋５００ｍＶの電位を測定極９に印加した。これにより、反応溶液中のメディーエータが酸化し、この酸化による電子の放出により測定極９と対極１０との間に電流が流れた。流れた電流値を電気化学測定システムを用いて測定した。この電流値の変化を図６に示す。図６中、縦軸に電流Ｉ（μＡ）および横軸に時間ｔ（秒）を示す。図６より、この反応は約１００秒で定常値に達していることが分かった。次にリン酸の量を変化させたときの１００秒後の電流値を図７に示す。図７中、縦軸に電流値の絶対値（μＡ）および横軸にリン酸濃度（μＭ）を示し、各リン酸濃度における電流値を黒丸で示す。図７に示すように、１００秒後の電流値は、加えたリン酸の量に対して良好な直線関係を示した。
【００７４】
（実施例２）
以下の手順で反応溶液を作製した。２８２ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１．８μｌ（終濃度１ｍＭ）、５０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、５０ｍＭアデノシン二リン酸１０μｌ（終濃度１ｍＭ）および１ｕｎｉｔ／μｌホスホグリセレートキナーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、５０ｍＭフェリシアン化カリウム１０μｌ（終濃度１ｍＭ）および５０ｍＭ塩化マグネシウム１０μｌ（終濃度１０ｍＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整して総量を５００μｌとした。このようにして作製した反応溶液に５０ｍＭリン酸を１μｌ（終濃度０．１ｍＭ）を加え、実施例１と同様に電流値を測定した。本実施例では、約６０秒で定常値に達した。このように、アデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼを加えることによって、反応が促進されることが確認された。
【００７５】
（実施例３）
以下の手順で反応溶液を作製した。１ｕｎｉｔ／μｌピロフォスファターゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、２８２ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１．８μｌ（終濃度１ｍＭ）、５０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド１０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ １０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ１０μｌ（終濃度２０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および５０ｍＭフェリシアン化カリウム１０μｌ（終濃度１ｍＭ）を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液に溶解し、ｐＨ７．５に調整して総量を５００μｌとした。このようにして作製した反応溶液に５０ｍＭピロリン酸を１μｌ（終濃度０．１ｍＭ）加え、実施例１と同様に１００秒後の電流値を測定した（結果は示さず）。ピロリン酸の量を変化させたときの１００秒後の電流値を図８に示す。図８中、縦軸に電流値の絶対値（μＡ）および横軸にピロリン酸濃度（μＭ）を示し、各ピロリン酸濃度における電流値を黒丸で示す。図８に示すように、電流値は、加えたピロリン酸の濃度に対して良好な直線関係を示した。
【００７６】
（実施例４）
測定系にＣｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（λＤＮＡ）（寶酒造製）を加えた試料を試料１、加えなかった試料を試料２とし、ＰＣＲ反応を行った。テンプレートとしてλＤＮＡを用い、プライマーとしてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｉｍｅｒ１（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：１））およびＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：２））を用いて実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。２．５ｕｎｉｔ／μｌ ＴａＫａＲａ Ｚ−ＴａｑＴＭ ０．５μｌ、１０×Ｚ−ＴａｑＴＭＢｕｆｆｅｒ５μｌ、２．５ｍＭ各ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌ、２０ｐｍｏｌ／μｌ Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３各０．５μｌをそれぞれ試料１および試料２に加えた後、試料１にのみ１μｇ／ｍｌ λＤＮＡ１μｌを加え、次いで試料１および試料２にそれぞれ蒸留水を加えて総量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃１０秒を３０サイクル行った。ＰＣＲ反応が終了した溶液１μｌを、実施例３で作製した反応溶液（ピロリン酸添加前）に加え、実施例１と同様に１００秒後の電流値を測定した結果を表１に示す。
【００７７】
【表１】
【００７８】
（実施例５）
測定系にＣｏｎｔｒｏｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ（λＤＮＡ）（同上）を加えてＰＣＲ反応を行った。テンプレートとしてλＤＮＡを用い、プライマーとしてＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（寳酒造製）のＣｏｎｔｒｏｌ Ｐｒｉｍｅｒ１（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＴ−３’（配列番号：１））およびＰｒｉｍｅｒ３（５’−ＧＧＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＣＡＧＣＣＡＣＡＧＣＧＣＣ−３’（配列番号：２））を用いた試料を試料１、改変Ｐｒｉｍｅｒ１’（５’−ＧＡＴＧＡＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＴＡＣＡＡＣＡ−３’（配列番号：３））およびＰｒｉｍｅｒ３を用いた試料を試料２として実験を行った（５００ｂｐ増幅用）。２．５ｕｎｉｔ／μｌ ＴａＫａＲａ Ｚ−ＴａｑＴＭ ０．５μｌ、１０×Ｚ−ＴａｑＴＭＢｕｆｆｅｒ５μｌ、２．５ｍＭ ｅａｃｈ ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌおよび試料１には２０ｐｍｏｌ／μｌ Ｐｒｉｍｅｒ１およびＰｒｉｍｅｒ３各０．５μｌ、試料２には２０ｐｍｏｌ／μｌ Ｐｒｉｍｅｒ１’およびＰｒｉｍｅｒ３各０．５μｌをそれぞれ加えた後、それぞれ１μｇ／ｍｌ λＤＮＡ１μｌおよび蒸留水を加えて総量を５０μｌとした。ＰＣＲ反応は、９８℃１秒、５５℃１秒、７２℃１０秒を３０サイクル行った。ＰＣＲ反応が終了した溶液１μｌを、実施例３で作製した反応溶液（ピロリン酸添加前）に加え、実施例１と同様に１００秒後の電流値を測定した結果を表２に示す。
【００７９】
【表２】
【００８０】
（実施例６）
以下の手順で反応溶液を作製した。１ｍＭピロリン酸５０μｌ（終濃度１００μＭ）、３０ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸１７．５μｌ（終濃度１ｍＭ）、１０ｍＭ酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド５０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１０ｍＭフェリシアン化カリウム５０μｌ（終濃度１ｍＭ）、１００ｍＭ塩化マグネシウム８．０μｌ（終濃度１．６ｍＭ）、１ｕｎｉｔ／μｌジアホラーゼ５μｌ（終濃度１０ｕｎｉｔ／ｍｌ）および０．２ｕｎｉｔ／μｌピロフォスファターゼ１μｌ（終濃度０．４ｕｎｉｔ／ｍｌ）、を５０ｍＭＴｒｉｃｉｎｅ−ＮａＯＨ緩衝液に溶解し、ｐＨ８．８に調整して総量を４８０μｌとした。
【００８１】
このようにして作製した反応溶液を実施例１と同様に電流値を測定しながら、測定開始から６０秒後に０．８ｕｎｉｔ／μｌグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ２０μｌ（終濃度３２ｕｎｉｔ／ｍｌ）を加えた。また、上記１ｍＭピロリン酸を、それぞれ０．８ｍＭ（終濃度８０μＭ）、０．６ｍＭ（終濃度６０μＭ）、０．４ｍＭ（終濃度４０μＭ）、０．２ｍＭ（終濃度２０μＭ）としたときに観察される電流値をそれぞれ同様に測定した。この電流値の変化を図１０に示す。図１０中、縦軸に電流値Ｉ（μＡ）および横軸に時間ｔ（秒）を示す。図１０より、この反応は反応開始から約１００秒（測定開始から約１６０秒後）で定常値に達していることが分かった。
【００８２】
次にピロリン酸の量を変化させたときの反応開始１００秒後の電流値を図１１に示す。図１１中、縦軸に電流値の絶対値（μＡ）および横軸にピロリン酸終濃度（μＭ）を示し、各ピロリン酸濃度における電流値を黒丸で示す。図１１に示すように、加えたピロリン酸の量と反応開始１００秒後の電流値は良好な相関関係を示した。
【００８３】
尚、本実施例によって得られた図１１のデータと、実施例３によって得られた図８のデータを比較すると、本実施例の方が、高感度にピロリン酸が検出されていることがわかる。したがって、本実施例で採用した条件の方が、実施例３で採用した条件より高感度でピロリン酸を検出することができる。
【００８４】
本発明によれば、電気化学的手法を用いる試料中の無機リン酸の高感度、高速、かつ定量的な検出が提供される。さらに、ピロリン酸を無機リン酸に変換することにより、ピロリン酸の高感度、高速、かつ定量的な測定が提供される。また、本発明によれば、核酸の伸長反応に伴って生成されるピロリン酸を測定することによって、目的の核酸の有無を定量的に測定することが出来る。さらには、目的の核酸のＳＮＰ部位における塩基判定を、高感度かつ高速に測定することが出来る。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
以上のように、本発明は、臨床用途、創薬用途、系統分類学への応用に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】ＴａｑＭａｎＰＣＲ法によるＳＮＰタイピングの方法を示す概略図である。
【図２】Ｉｎｖａｄｅｒ法によるＳＮＰタイピングの方法を示す概略図である。
【図３】パイロシーケンシング法によるＳＮＰタイピングの方法を示す概略図である。
【図４】ＳＮＰ部位一致プローブの使用によるピロリン酸生成を示す模式図である。
【図５】ＳＮＰ部位不一致プローブの使用による様子を示す模式図である。
【図６】実施例１におけるリン酸の検出反応時間を示すグラフである。
【図７】実施例１におけるリン酸濃度と電流値の関係を示すグラフである。
【図８】実施例３におけるピロリン酸濃度と電流値の関係を示すグラフである。
【図９】電流値を測定するための例示の測定装置系を示す模式図である。
【図１０】実施例６におけるピロリン酸の検出反応時間を示すグラフである。
【図１１】実施例６におけるピロリン酸濃度と電流値の関係を示すグラフである。
【符号の説明】
【００８７】
１ ＤＮＡプローブ
２ 特定配列を持つＤＮＡ
４ ＤＮＡポリメラーゼ
５ ｄＮＴＰ
６ ガラスセル
９ 測定極
１０ 対極
１１ 参照極
１４ 電気化学測定システム
【配列表のフリーテキスト】
【００８８】
配列番号１の<223>：プライマー
配列番号２の<223>：プライマー
配列番号３の<223>：プライマー
【配列表】
Claims (9)
- 無機リン酸を検出する方法であって、
グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、および電子メディエータを含む測定系に試料を供する工程；
および該測定系において電流値を測定する工程を包含し、
ここで、該電流値が、該試料中の無機リン酸の濃度を示し、
前記測定系に試料を供してから１００秒以内に無機リン酸が検出される、無機リン酸の検出方法。 - 前記電子メディエータが、フェリシアン化物、１，２−ナフトキノン−４−スルホン酸、２，６−ジクロロフェノールインドフェノール、ジメチルベンゾキノン、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウムサルフェート、メチレンブルー、ガロシアニン、チオニン、フェナジンメトサルフェート、およびメルドラブルーからなる群より選択される少なくとも一種である、請求項１に記載の無機リン酸の検出方法。
- 前記測定系がアデノシン二リン酸およびホスホグリセレートキナーゼをさらに含む、請求項１に記載の無機リン酸の検出方法。
- ピロリン酸を検出する方法であって、
試料中のピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；
該試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；
および該測定系において電流値を測定する工程を包含し、
ここで、該電流値が、該試料中のピロリン酸の濃度を示し、
前記測定系に試料を供してから１００秒以内にピロリン酸が検出される、
ピロリン酸の検出方法。 - 前記ピロリン酸の無機リン酸への変換が、ピロフォスファターゼを用いて行われる、請求項４に記載のピロリン酸の検出方法。
- 核酸を検出する方法であって、
該核酸の配列に相補的な配列を持つＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供し、該ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸が該ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される工程；
試料中の生成されたピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；
該試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；
および該測定系において電流値を測定する工程を包含し、ここで、該電流値が、該試料中の特定配列を有する核酸の濃度を示し、
前記測定系に試料を供してから１００秒以内に核酸が検出される、
核酸の検出方法。 - 前記ＤＮＡプローブの伸長反応がＰＣＲ反応である、請求項６に記載の核酸の検出方法。
- ＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法であって、
該ＤＮＡの配列に相補的な配列を持ち、かつＳＮＰ部位を有するＤＮＡプローブ、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシヌクレオチドを含む反応系に試料を供し、該ＤＮＡプローブを伸長させ、ここでピロリン酸が該ＤＮＡプローブの伸長反応に伴って生成される工程；
試料中の生成されたピロリン酸を無機リン酸に変換する工程；
該試料を、グリセルアルデヒド−３−リン酸、酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド又は酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸、グリセルアルデヒドリン酸デヒドロゲナーゼ、ジアホラーゼ、および電子メディエータを含む測定系に供する工程；
および該測定系において電流値を測定する工程を包含し、
ここで、該電流値が、該試料中の特定配列を有するＤＮＡの存在を示し、
前記測定系に試料を供してから１００秒以内にＤＮＡのＳＮＰ配列がタイピングされる、ＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法。 - 前記ＤＮＡプローブの伸長反応がＰＣＲ反応である、請求項８に記載のＤＮＡのＳＮＰ配列をタイピングする方法。
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