JP3671403B2 - プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、哺乳動物のプロスタグランジンＤ受容体、その製造方法、その該受容体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴ）ようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（Annu. Rev. Biochem. 47, 997 (1978)、The Pharmacological Basis of Therapeutics （Gilman, A. G., Good-man, L. S., Rall, T. W., and Murad, F., eds) 7th Ed., pp 660, Macmillan Publishing Co., New York (1985) および Annu. Rev. Pharm. Tox.,10, 213 (1989) 参照のこと）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体によって制御されている（Comprehensive Medicinal Chemistry (Hansch, C., Sammes, P. G., Taylor, J. B. and Emmett, J. C. eds), 3 ,643, Pergamon, Oxford (1990) 参照のこと）。
【０００３】
プロスタノイドの一員であるプロスタグランジンＤ2 （ＰＧＤ2 ）は、哺乳動物の多くの組織や細胞中で、種々の生理学的刺激および病理学的刺激によって、アラキドン酸から合成され（Arch. Biochem. Biophys., 260, 521-531 (1988)）、それらの機能を調節するために種々の生理活性を発揮している（Prostaglandins, 35, 277-300 (1988)）。例えば、ＰＧＤ2 は血小板凝集時に生成され、ネガティブフィードバックモジュレータとして作用している（Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)）。また血管、胃および子宮の平滑筋を弛緩し（Brit. J. Pharmacol.,85 ,367-375 (1985), Circulation Res., 71, 1305-1313 (1992), Eur. J. Pharmacol., 81, 141-143 (1982)）、白血球の活性化を抑制し（Brit. J. Pharmacol., 108, 1051-1054 (1993)）、自律神経または知覚神経の伝達を調節するために末梢神経に作用する（Am. J. Physiol., 260, G904-G910 (1991), Brit. J. Pharmacol., 108, 185-190 (1993)）。さらにＰＧＤ2 は免疫反応で重要な役割を果たすために、肥満細胞やマクロファージ系細胞によって放出される（J. Immunol., 129, 1627-1631 (1982), J. Immunol., 143, 2982-2989 (1989)）。中枢神経系においては、ＰＧＤ2 は、睡眠を生理学的にコントロールしているのではないかと考えられている（FASEB J., 5 ,2575-2581 (1991) ）。
【０００４】
このように、ＰＧＤ2 の生理学的作用については大いに注目されているが、ＰＧＤ2 の受容体を同定し、解析するための薬理学的、生化学的研究は遅れている。その理由としては、ＰＧＤ2 は比較的高濃度（１０ｎＭから１μＭ）でその作用を発揮すること（Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)）、他のプロスタグランジン類（ＰＧｓ）と同様に、他のプロスタノイドの受容体とクロスリアクションすること（Prostaglandins, 35, 277-300 (1988), Comprehensive Medicinal Chemistry, 3, 643-714 (1989)）、およびその顕著な生理作用にもかかわらず組織中の受容体の数が少ないことが挙げられる。従って、ＰＧＤ受容体の性質、分布、局在化については現在まで不明である。
【０００５】
【発明の目的】
最近、多数のプロスタノイド受容体のｃＤＮＡが単離され、それらの一次構造が明らかになった。具体的には、ＴＸＡ2 （Nature, 349, 617-620 (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1197-1203 (1992)）、ＰＧＥ受容体のＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ３サブタイプ（J. Biol. Chem., 267 ,6463-6466 (1992), J. Biol. Chem., 268, 7759-7762 (1993), J. Biol. Chem., 268 , 20175-20178 (1993)）、PGI （J. Biol. Chem., (1994)）、およびＰＧＦ（J. Biol. Chem., 269 , 1356-1360 (1994)）の各受容体である。さらに、ヒトＴＸＡ2 受容体の遺伝子構造も明らかにされた（J. Biol. Chem., 268 , 25253-25259 (1993)）。これらの研究によって、プロスタノイドの受容体は、ロドプシンタイプＧ−プロテイン共役受容体スーパーファミリーのサブファミリーを構成していることが判明した（Annu. Rev. Neurosci., 12, 67-83 (1989)）。これらの研究で得られた情報をもとに、本発明者等は、リバーストランスクリプション−ポリメラーゼチェインリアクション（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR ）法によってマウスＰＧＤ受容体をコードするｃＤＮＡを単離することに成功した。さらに単離されたクローンのシークエンスを解析し、またＣＨＯ細胞で発現させて分析した結果、それがマウスＰＧＤ受容体をコードしていることを明らかにして本発明を完成した。
【０００６】
スイスプロット（Swiss Prot Release 2.0）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが確認された。
【０００７】
【発明の構成】
本発明は、実質的に純粋な形である哺乳動物のＰＧＤ受容体に関する。ここでＰＧＤとは、ＰＧＤ1 、ＰＧＤ2 等のＰＧＤ類似体が挙げられるが、好ましくは、ＰＧＤ2 である。また、哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット等が挙げられる。本発明の一態様としては、マウスのＰＧＤ受容体に関する。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
【０００８】
特に、本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および
（４）配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
【０００９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１で示されるアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
【００１０】
実質的に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
【００１１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明ポリペプチドとして記載される。
【００１２】
さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００１３】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
【００１４】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、遺伝子組換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
【００１６】
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００１７】
さらに、本発明には、配列番号２または３で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
【００１９】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
【００２０】
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２１】
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列番号１で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
【００２２】
（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
【００２３】
（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２４】
配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
(i) 本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
(ii) 該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、
(iii) 該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
(iv) 得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(v) 得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
(vi) 目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
【００２５】
より詳細に説明すると、工程(i) は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ等）の組織中、ＰＧＤ受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは、肺、血管、白血球等の組織細胞より、Okayama, H. 等の方法（Method in Enzymology, 154 , 3(1987) に記載）、Chirgwin, J. M. 等の方法（Biochem., 18, 5294 (1979) に記載）等の方法に従って行なわれる。(ii)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法（Gene, 25, 263(1983) に記載）に準じて行なわれる。(iii) の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するλ−ＺＡＰIIが用いられる。(iv)の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル（Gene, 96, 23(1990)記載の方法により調製される。）である。最近では、各動物の種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが既に市販されている。これらの市販のｃＤＮＡライブラリーも好適に用いられる。工程(v) は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63 (1980) に記載）等によって行われる。また、適当なプローブとしては、異種動物のＰＧＤ受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。工程(vi)はそれ自体公知であり、例えばジデオキシ・ターミネーター（dideoxy terminator）法やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法により行なわれる。
【００２６】
配列番号２または３で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（polymerase chain reaction ）法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
もちろん、本発明のＤＮＡは、以下の実施例に記載した方法によっても製造することができる。
【００２７】
本発明のポリペプチド（配列番号１）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
【００２８】
遺伝子組換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
【００２９】
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.coli ＤＨ１、E.coli ＪＭ１０９、E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
【００３０】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、それ自体、ＰＧＤ、とりわけＰＧＤ2 と特異的に結合するのでＰＧＤ2 の過剰産生によって生ずる疾患の予防あるいは治療剤、例えば、免疫賦活剤、出血傾向の抑制剤等として用いることができる。また、ＰＧＤ2 のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
【００３２】
さらに、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
【００３３】
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic ）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００３４】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】
実施例１：マウスＰＧＤ受容体のｃＤＮＡクローニング
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による、種々のプロスタノイド受容体と相同性を示すマウス胸腺ｃＤＮＡフラグメントの増幅
一本鎖ｃＤＮＡをマウス胸腺由来全ＲＮＡから、ランダムヘキサヌクレオチドをプライマーとして用いて合成した。ＰＣＲのプライマーとしては、種々のプロスタノイド受容体で高度に保存されているアミノ酸配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成して用いた。すなわち、２番目の細胞外ループ領域中のＧｌｙＴｈｒＴｒｐＣｙｓＰｈｅ（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）および７番目の膜貫通領域中のＡｓｐＰｒｏＴｒｐＩｌｅ（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）に相当する、それぞれ以下に示す合成ヌクレオチドを用いた。
【００３６】
【化１】
5´-GG(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)TGGTG(C/T)TT(C/T)(A/T)T-3´ および
5´-A(T/G)(A/G)(A/T)A(A/G/T)ATCCA(A/G/C/T)GG(A/G)TC-3´
【００３７】
増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃＤＮＡフラグメントは、pBluescript SK II (+) (Stratagene 社製) ベクターにサブクローニングした。ランダムにピックアップしたクローンについてシークエンシングした結果、フラグメントＰＧ２５は、他のプロスタノイド受容体の５番目と６番目の膜貫通領域と高い相同性を有するシークエンスを含んでいた。
【００３８】
（２）ハイブリダイゼーションによるマウスジェノミックライブラリーのスクリーニング
マウスジェノミックライブラリー、λＦＩＸII（Stratagene社製）中の２×１０5 のクローンを、32ＰでラベルしたＰＧ２５フラグメントをプローブとしてプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５×Denhardt´s溶液（0.1 ％ Ficoll 、0.1 ％ポリビニルピロリドン（ polyvinylpyrrolidone ）および0.1 ％ウシ血清アルブミン）と0.5 ％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含有する６×ＳＳＣ（９００ｍＭ ＮａＣｌ，９０ｍＭクエン酸ナトリウム）中、５８℃で１５時間行ない、ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６５℃で３０分間、１％ＳＤＳ含有 0.2×ＳＳＣで２回洗浄した。４個のポジティブクローンが単離された。最長クローンのインサートは１３ｋｂであった。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、ふたつのＸｂａＩフラグメント（ 3.3ｋｂｐおよび６ｋｂｐ）がプローブにハイブリダイズすることが見出された。これらのフラグメントはそれぞれサブクローニングし、塩基配列を決定した。核酸の塩基配列は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain termination method）により行なった。
【００３９】
（３）オープンリーディングフレームの構築
前記（１）および（２）より、ＰＧ２５は、ふたつのエクソンにまたがっていることが判った。そこで、ＰＧ２５の５′上流と３′下流の配列を得るために、マウス肺由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）から、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。
【００４０】
【化２】
5´-GGAGTGCTGGCTGTCTCT-3´および
5´-CTTCAGTGCTGATCCCTC-3´
【００４１】
増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃＤＮＡフラグメントを、pBluescript SK II (+) (Stratagene 社製）ベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。得られたクローン（ＰＧｃ１）は、８２４ｂｐからなり、ジェノミッククローンのエクソンに相当することが判った。ＰＧｃ１をＮａｒＩで消化し、消化したフラグメントの３’部分をジェノミッククローンのＰｓｔＩ−ＮａｒＩフラグメントにライゲーションし、 1.2ｋｂｐのフラグメント、ＰＧｃ９を構築した。ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を図１に示す（オープンリーディングフレームは斜線で示される。）。このようにして、完全長ｃＤＮＡに相当するクローンを得た。全長の塩基配列を配列番号３に、また、オープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号２に示す。さらに、オープンリーディングフレームより推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４２】
実施例２：ＣＨＯ細胞によるマウスＰＧＤ受容体の発現と各種リガンドとのバインディングアッセイ
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子（Biochem. Biophys. Res. Commun., 164 , 39 (1989) ）をセレクションマーカーとして含む、真核細胞発現ベクター、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒにＰＧｃ９をサブクローンし、得られたプラスミドＤＮＡ、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒ−ＰＧｃ９をJ. Biol. Chem., 267 , 2437 (1992) に記載の方法に従って、ジヒドロ葉酸還元酵素活性の欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ- ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) に記載）に形質転換した。ジヒドロ葉酸還元酵素を発現する細胞群は、１０％透析ウシ胎児血清を含有するα−ＭＥＭ（−）培地（Cell Culture Laboratories 社製）中で培養し、選択した。特異的な［ 3Ｈ］ＰＧＤ２結合活性を示すクローンがいくつか単離された。それらのクローンのうちの一つ、ＣＨＯ−Ｊを以下の実験に供した。
【００４３】
ＣＨＯ−Ｊ細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（−）培地で培養した後、ホスフェートバッファーセーラインで一度洗浄し、培養プレートから回収した後、８００×ｇで１５分間遠心分離して沈降させた。得られたセルペレットを１０倍量のホモジネート用バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭ ｄ−マンニトール、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、１ｍＭ ベンズアミジン塩酸塩からなる）中に懸濁させ、超音波処理してホモジネートした。得られたホモジネートを、標識しない各リガンドの存在下または非存在下、１０ｎＭ［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 と４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷した洗浄用バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌよりなる）を加えて反応を停止し、素早くワットマン（Whatman ）ＧＦ／Ｃ グラスファイバーフィルターで濾過した。フィルターを氷冷した洗浄用バッファーで４回洗浄した後、フィルター上の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。標識していないＰＧＤ2 を２００倍以上存在させた時の、フィルターに結合した放射活性をもって非特異的な結合とした。
【００４４】
このアッセイの結果、ＰＧＤ２受容体に対するリガンドである［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 は、ＰＧｃ９を発現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することが判った。この結合のスキャッチャード（Scatchard ）分析の結果は、図２に示す。さらに、［ 3Ｈ］ＰＧＤ２の特異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性を図２に示す。種々のプロスタノイドによる結合阻害は、ＰＧＤ2 ＞＞ＢＷ２４５Ｃ＝ＢＷＡ８６８Ｃ＞ＳＴＡ2 であり、Iloprost、ＰＧＥ2 およびＰＧＦ２αには結合しなかった。
【００４５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
【００４６】
配列番号：２
配列の長さ：１０７１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
【００４７】
配列番号：３
配列の長さ：１２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
【００４８】
配列番号：４
配列の長さ：１２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：mouse
組織の種類：肺
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＰ
存在位置：37..1110
特徴を決定した方法：Ｐ
【図面の簡単な説明】
【図１】 ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を示す図である。オープンリーディングフレームは斜線で示される。
【図２】 ［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 の、ＰＧｃ９をトランスフェクトした細胞膜への結合に対する種々のリガンドの阻害活性を示すグラフである。また、図中の図は、［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 のスキャッチャード（Scatchard ）分析の結果を示す。
【産業上の利用分野】
本発明は、哺乳動物のプロスタグランジンＤ受容体、その製造方法、その該受容体をコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなる複製または発現ベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞に関する。
【０００２】
【従来の技術】
プロスタグランジン（ＰＧ）、トロンボキサン（ＴＸ）およびロイコトリエン（ＬＴ）ようなプロスタノイドは、アラキドン酸の酸化代謝物のひとつのファミリーであり、生体内で局所ホメオスタシスを維持するために種々の生理作用を発揮している（Annu. Rev. Biochem. 47, 997 (1978)、The Pharmacological Basis of Therapeutics （Gilman, A. G., Good-man, L. S., Rall, T. W., and Murad, F., eds) 7th Ed., pp 660, Macmillan Publishing Co., New York (1985) および Annu. Rev. Pharm. Tox.,10, 213 (1989) 参照のこと）。それらの生理作用はそれぞれのプロスタノイドに特有の細胞膜受容体によって制御されている（Comprehensive Medicinal Chemistry (Hansch, C., Sammes, P. G., Taylor, J. B. and Emmett, J. C. eds), 3 ,643, Pergamon, Oxford (1990) 参照のこと）。
【０００３】
プロスタノイドの一員であるプロスタグランジンＤ2 （ＰＧＤ2 ）は、哺乳動物の多くの組織や細胞中で、種々の生理学的刺激および病理学的刺激によって、アラキドン酸から合成され（Arch. Biochem. Biophys., 260, 521-531 (1988)）、それらの機能を調節するために種々の生理活性を発揮している（Prostaglandins, 35, 277-300 (1988)）。例えば、ＰＧＤ2 は血小板凝集時に生成され、ネガティブフィードバックモジュレータとして作用している（Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)）。また血管、胃および子宮の平滑筋を弛緩し（Brit. J. Pharmacol.,85 ,367-375 (1985), Circulation Res., 71, 1305-1313 (1992), Eur. J. Pharmacol., 81, 141-143 (1982)）、白血球の活性化を抑制し（Brit. J. Pharmacol., 108, 1051-1054 (1993)）、自律神経または知覚神経の伝達を調節するために末梢神経に作用する（Am. J. Physiol., 260, G904-G910 (1991), Brit. J. Pharmacol., 108, 185-190 (1993)）。さらにＰＧＤ2 は免疫反応で重要な役割を果たすために、肥満細胞やマクロファージ系細胞によって放出される（J. Immunol., 129, 1627-1631 (1982), J. Immunol., 143, 2982-2989 (1989)）。中枢神経系においては、ＰＧＤ2 は、睡眠を生理学的にコントロールしているのではないかと考えられている（FASEB J., 5 ,2575-2581 (1991) ）。
【０００４】
このように、ＰＧＤ2 の生理学的作用については大いに注目されているが、ＰＧＤ2 の受容体を同定し、解析するための薬理学的、生化学的研究は遅れている。その理由としては、ＰＧＤ2 は比較的高濃度（１０ｎＭから１μＭ）でその作用を発揮すること（Prostaglandins, 16, 373-388 (1978)）、他のプロスタグランジン類（ＰＧｓ）と同様に、他のプロスタノイドの受容体とクロスリアクションすること（Prostaglandins, 35, 277-300 (1988), Comprehensive Medicinal Chemistry, 3, 643-714 (1989)）、およびその顕著な生理作用にもかかわらず組織中の受容体の数が少ないことが挙げられる。従って、ＰＧＤ受容体の性質、分布、局在化については現在まで不明である。
【０００５】
【発明の目的】
最近、多数のプロスタノイド受容体のｃＤＮＡが単離され、それらの一次構造が明らかになった。具体的には、ＴＸＡ2 （Nature, 349, 617-620 (1991), Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1197-1203 (1992)）、ＰＧＥ受容体のＥＰ１、ＥＰ２およびＥＰ３サブタイプ（J. Biol. Chem., 267 ,6463-6466 (1992), J. Biol. Chem., 268, 7759-7762 (1993), J. Biol. Chem., 268 , 20175-20178 (1993)）、PGI （J. Biol. Chem., (1994)）、およびＰＧＦ（J. Biol. Chem., 269 , 1356-1360 (1994)）の各受容体である。さらに、ヒトＴＸＡ2 受容体の遺伝子構造も明らかにされた（J. Biol. Chem., 268 , 25253-25259 (1993)）。これらの研究によって、プロスタノイドの受容体は、ロドプシンタイプＧ−プロテイン共役受容体スーパーファミリーのサブファミリーを構成していることが判明した（Annu. Rev. Neurosci., 12, 67-83 (1989)）。これらの研究で得られた情報をもとに、本発明者等は、リバーストランスクリプション−ポリメラーゼチェインリアクション（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR ）法によってマウスＰＧＤ受容体をコードするｃＤＮＡを単離することに成功した。さらに単離されたクローンのシークエンスを解析し、またＣＨＯ細胞で発現させて分析した結果、それがマウスＰＧＤ受容体をコードしていることを明らかにして本発明を完成した。
【０００６】
スイスプロット（Swiss Prot Release 2.0）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を調査したが、本発明のポリペプチドと同一の配列を有しているものはまったく無かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一の配列は見つからなかった。従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが確認された。
【０００７】
【発明の構成】
本発明は、実質的に純粋な形である哺乳動物のＰＧＤ受容体に関する。ここでＰＧＤとは、ＰＧＤ1 、ＰＧＤ2 等のＰＧＤ類似体が挙げられるが、好ましくは、ＰＧＤ2 である。また、哺乳動物としては、ヒト、マウス、ラット等が挙げられる。本発明の一態様としては、マウスのＰＧＤ受容体に関する。具体的には、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、およびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および配列番号２または３で示される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関する。
【０００８】
特に、本発明は、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（２）前記（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、および
（４）配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ
に関する。
【０００９】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドだけでなく、そのポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に、配列番号１で示されるアミノ酸数の２０％、より好ましくは５％以内の別個のポリペプチドを付加したポリペプチドを意味する。
【００１０】
実質的に純粋な形である配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドとは、一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９５、９８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドであることを意味する。
【００１１】
配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのようなホモローグは、以後本発明ポリペプチドとして記載される。
【００１２】
さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのフラグメント、またはそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味する。
【００１３】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡとは、一般に、少なくとも５０個、好ましくは少なくとも１００個、例えば１５０、２００または２５０個の連続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明のＤＮＡとして記載される。
【００１４】
配列番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。
【００１５】
本発明のＤＮＡは、遺伝子組換え法、合成法あるいは当業者に公知の方法によって取得することができる。
【００１６】
さらに、本発明には、本発明のＤＮＡからなる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとしては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子などからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクターが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を含んでいてもよい。
【００１７】
さらに、本発明には、配列番号２または３で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
【００１８】
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。
【００１９】
本発明のポリペプチドとしては、配列番号１で示されたアミノ酸配列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生物活性の発現に必須な部分だけからなるポリペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも含まれる。
【００２０】
よく知られているように、ひとつのアミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、メチオニン（Ｍｅｔ）は１種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基配列を変えることができる。
【００２１】
（２）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列番号１で示されるポリペプチドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
【００２２】
（３）で特定されるＤＮＡは、（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を表わす。
【００２３】
（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。
【００２４】
配列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。
すなわち、
(i) 本発明のポリペプチドが産生される細胞からｍＲＮＡを分離し、
(ii) 該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの作製）、
(iii) 該ｃＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、
(iv) 得られた組換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、
(v) 得られたｃＤＮＡライブラリーより、ハイブリダイゼーション法により目的とするＤＮＡ含有プラスミドを単離し、
(vi) 目的とするＤＮＡの塩基配列を決定することによって作製することができる。
【００２５】
より詳細に説明すると、工程(i) は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ウシ等）の組織中、ＰＧＤ受容体を発現していると考えられる組織、好ましくは、肺、血管、白血球等の組織細胞より、Okayama, H. 等の方法（Method in Enzymology, 154 , 3(1987) に記載）、Chirgwin, J. M. 等の方法（Biochem., 18, 5294 (1979) に記載）等の方法に従って行なわれる。(ii)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法（Gene, 25, 263(1983) に記載）に準じて行なわれる。(iii) の工程で用いられるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機能するλ−ＺＡＰIIが用いられる。(iv)の工程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル（Gene, 96, 23(1990)記載の方法により調製される。）である。最近では、各動物の種々の組織のｃＤＮＡライブラリーが既に市販されている。これらの市販のｃＤＮＡライブラリーも好適に用いられる。工程(v) は、それ自体公知であり、例えば、プラークハイブリダイゼーション法、コロニーハイブリダイゼーション法（Gene, 10, 63 (1980) に記載）等によって行われる。また、適当なプローブとしては、異種動物のＰＧＤ受容体のＤＮＡまたはそのフラグメントまたは該ＤＮＡとホモロジーを有するＤＮＡが用いられる。工程(vi)はそれ自体公知であり、例えばジデオキシ・ターミネーター（dideoxy terminator）法やマキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）法により行なわれる。
【００２６】
配列番号２または３で示される塩基配列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によって、またはＰＣＲ（polymerase chain reaction ）法によって、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができる。
もちろん、本発明のＤＮＡは、以下の実施例に記載した方法によっても製造することができる。
【００２７】
本発明のポリペプチド（配列番号１）を取得する方法としては、
（１）生体または培養細胞から精製単離する方法、
（２）ペプチド合成する方法、または
（３）遺伝子組換え技術を用いて生産する方法、
などが挙げられるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。
【００２８】
遺伝子組換え技術を用いてポリペプチドを生産するための発現系（宿主−ベクター系）としては、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞の発現系が挙げられる。
【００２９】
例えば、大腸菌で発現させる場合には、蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配列番号２で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）を、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.coli ＤＨ１、E.coli ＪＭ１０９、E.coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペプチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドとのヒュージョンプロテイン（fusion protein）を生産することもできる。
【００３０】
また、哺乳動物細胞で発現させる場合には、例えば、配列番号３で示される塩基配列をコードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、その培養液中に目的とするポリペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製することができる。
【００３１】
【発明の効果】
本発明のポリペプチドは、それ自体、ＰＧＤ、とりわけＰＧＤ2 と特異的に結合するのでＰＧＤ2 の過剰産生によって生ずる疾患の予防あるいは治療剤、例えば、免疫賦活剤、出血傾向の抑制剤等として用いることができる。また、ＰＧＤ2 のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を有する物質のスクリーニングに用いられる。
【００３２】
さらに、該ポリペプチドのポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプチドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用することができる。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原として用いて常法により作製することができる。
【００３３】
本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待される本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブとしてジェノミック（genomic ）ＤＮＡを分離できる。同様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離することも可能である。
【００３４】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものではない。
【００３５】
実施例１：マウスＰＧＤ受容体のｃＤＮＡクローニング
（１）ＲＴ−ＰＣＲ法による、種々のプロスタノイド受容体と相同性を示すマウス胸腺ｃＤＮＡフラグメントの増幅
一本鎖ｃＤＮＡをマウス胸腺由来全ＲＮＡから、ランダムヘキサヌクレオチドをプライマーとして用いて合成した。ＰＣＲのプライマーとしては、種々のプロスタノイド受容体で高度に保存されているアミノ酸配列に相当するオリゴヌクレオチドを合成して用いた。すなわち、２番目の細胞外ループ領域中のＧｌｙＴｈｒＴｒｐＣｙｓＰｈｅ（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）および７番目の膜貫通領域中のＡｓｐＰｒｏＴｒｐＩｌｅ（Ｔｙｒ／Ｐｈｅ）（Ｉｌｅ／Ｌｅｕ）に相当する、それぞれ以下に示す合成ヌクレオチドを用いた。
【００３６】
【化１】
5´-GG(A/G/C/T)AC(A/G/C/T)TGGTG(C/T)TT(C/T)(A/T)T-3´ および
5´-A(T/G)(A/G)(A/T)A(A/G/T)ATCCA(A/G/C/T)GG(A/G)TC-3´
【００３７】
増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃＤＮＡフラグメントは、pBluescript SK II (+) (Stratagene 社製) ベクターにサブクローニングした。ランダムにピックアップしたクローンについてシークエンシングした結果、フラグメントＰＧ２５は、他のプロスタノイド受容体の５番目と６番目の膜貫通領域と高い相同性を有するシークエンスを含んでいた。
【００３８】
（２）ハイブリダイゼーションによるマウスジェノミックライブラリーのスクリーニング
マウスジェノミックライブラリー、λＦＩＸII（Stratagene社製）中の２×１０5 のクローンを、32ＰでラベルしたＰＧ２５フラグメントをプローブとしてプラークハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。ハイブリダイゼーションは、５×Denhardt´s溶液（0.1 ％ Ficoll 、0.1 ％ポリビニルピロリドン（ polyvinylpyrrolidone ）および0.1 ％ウシ血清アルブミン）と0.5 ％ＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含有する６×ＳＳＣ（９００ｍＭ ＮａＣｌ，９０ｍＭクエン酸ナトリウム）中、５８℃で１５時間行ない、ハイブリダイゼーション後、フィルターは、６５℃で３０分間、１％ＳＤＳ含有 0.2×ＳＳＣで２回洗浄した。４個のポジティブクローンが単離された。最長クローンのインサートは１３ｋｂであった。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、ふたつのＸｂａＩフラグメント（ 3.3ｋｂｐおよび６ｋｂｐ）がプローブにハイブリダイズすることが見出された。これらのフラグメントはそれぞれサブクローニングし、塩基配列を決定した。核酸の塩基配列は、ジデオキシ塩基配列決定法（dideoxy chain termination method）により行なった。
【００３９】
（３）オープンリーディングフレームの構築
前記（１）および（２）より、ＰＧ２５は、ふたつのエクソンにまたがっていることが判った。そこで、ＰＧ２５の５′上流と３′下流の配列を得るために、マウス肺由来のｃＤＮＡライブラリー（Clontech社製）から、以下のオリゴヌクレオチドを用いて、ＰＣＲを行った。
【００４０】
【化２】
5´-GGAGTGCTGGCTGTCTCT-3´および
5´-CTTCAGTGCTGATCCCTC-3´
【００４１】
増幅は、９５℃で１分間、３８℃で１分間そして７０℃、１分間で３５回行なった。増幅されたｃＤＮＡフラグメントを、pBluescript SK II (+) (Stratagene 社製）ベクターにサブクローニングし、塩基配列を決定した。得られたクローン（ＰＧｃ１）は、８２４ｂｐからなり、ジェノミッククローンのエクソンに相当することが判った。ＰＧｃ１をＮａｒＩで消化し、消化したフラグメントの３’部分をジェノミッククローンのＰｓｔＩ−ＮａｒＩフラグメントにライゲーションし、 1.2ｋｂｐのフラグメント、ＰＧｃ９を構築した。ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を図１に示す（オープンリーディングフレームは斜線で示される。）。このようにして、完全長ｃＤＮＡに相当するクローンを得た。全長の塩基配列を配列番号３に、また、オープンリーディングフレームの塩基配列を配列番号２に示す。さらに、オープンリーディングフレームより推定されるアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００４２】
実施例２：ＣＨＯ細胞によるマウスＰＧＤ受容体の発現と各種リガンドとのバインディングアッセイ
マウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子（Biochem. Biophys. Res. Commun., 164 , 39 (1989) ）をセレクションマーカーとして含む、真核細胞発現ベクター、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒにＰＧｃ９をサブクローンし、得られたプラスミドＤＮＡ、ｐｄＫＣＲ−ｄｈｆｒ−ＰＧｃ９をJ. Biol. Chem., 267 , 2437 (1992) に記載の方法に従って、ジヒドロ葉酸還元酵素活性の欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ- ）（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980) に記載）に形質転換した。ジヒドロ葉酸還元酵素を発現する細胞群は、１０％透析ウシ胎児血清を含有するα−ＭＥＭ（−）培地（Cell Culture Laboratories 社製）中で培養し、選択した。特異的な［ 3Ｈ］ＰＧＤ２結合活性を示すクローンがいくつか単離された。それらのクローンのうちの一つ、ＣＨＯ−Ｊを以下の実験に供した。
【００４３】
ＣＨＯ−Ｊ細胞を、１０％ウシ胎児血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（−）培地で培養した後、ホスフェートバッファーセーラインで一度洗浄し、培養プレートから回収した後、８００×ｇで１５分間遠心分離して沈降させた。得られたセルペレットを１０倍量のホモジネート用バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２５０ｍＭ ｄ−マンニトール、２ｍＭ β−メルカプトエタノール、１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド、１ｍＭ ベンズアミジン塩酸塩からなる）中に懸濁させ、超音波処理してホモジネートした。得られたホモジネートを、標識しない各リガンドの存在下または非存在下、１０ｎＭ［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 と４℃で６０分間インキュベートした。インキュベーション後、氷冷した洗浄用バッファー（２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ・ＮａＯＨ（ｐＨ7.4 ）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌよりなる）を加えて反応を停止し、素早くワットマン（Whatman ）ＧＦ／Ｃ グラスファイバーフィルターで濾過した。フィルターを氷冷した洗浄用バッファーで４回洗浄した後、フィルター上の放射活性を液体シンチレーションカウンターで測定した。標識していないＰＧＤ2 を２００倍以上存在させた時の、フィルターに結合した放射活性をもって非特異的な結合とした。
【００４４】
このアッセイの結果、ＰＧＤ２受容体に対するリガンドである［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 は、ＰＧｃ９を発現したＣＨＯ細胞の細胞膜に特異的に結合することが判った。この結合のスキャッチャード（Scatchard ）分析の結果は、図２に示す。さらに、［ 3Ｈ］ＰＧＤ２の特異的結合に対する種々のプロスタノイドの阻害活性を図２に示す。種々のプロスタノイドによる結合阻害は、ＰＧＤ2 ＞＞ＢＷ２４５Ｃ＝ＢＷＡ８６８Ｃ＞ＳＴＡ2 であり、Iloprost、ＰＧＥ2 およびＰＧＦ２αには結合しなかった。
【００４５】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：３５７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列番号：２
配列の長さ：１０７１
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列番号：３
配列の長さ：１２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
配列番号：４
配列の長さ：１２４０
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：cDNA to mRNA
起源
生物名：mouse
組織の種類：肺
配列の特徴
特徴を表わす記号：ＣＤＰ
存在位置：37..1110
特徴を決定した方法：Ｐ
【図面の簡単な説明】
【図１】 ジェノミッククローン、ＲＴ−ＰＣＲ生成物、ＰＧ２５、ＰＧｃ１およびＰＧｃ９の関係を示す図である。オープンリーディングフレームは斜線で示される。
【図２】 ［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 の、ＰＧｃ９をトランスフェクトした細胞膜への結合に対する種々のリガンドの阻害活性を示すグラフである。また、図中の図は、［ 3Ｈ］ＰＧＤ2 のスキャッチャード（Scatchard ）分析の結果を示す。
Claims (12)
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１で示されるアミノ酸配列中１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、付加または挿入された配列からなるポリペプチドであって、ＰＧＤと特異的に結合する作用を有するポリペプチド。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる請求項１記載のポリペプチド。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列中１もしくは数個のアミノ酸が欠損、置換、付加または挿入された配列からなるポリペプチドであって、ＰＧＤと特異的に結合する作用を有する請求項１に記載のポリペプチド。
- 配列番号１で示されるアミノ酸配列中１個のアミノ酸が欠損、置換、付加または挿入された配列からなるポリペプチドであって、ＰＧＤと特異的に結合する作用を有する請求項３に記載のポリペプチド。
- 請求項１乃至４のいずれかの項に記載されたポリペプチドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有するＤＮＡ。
- 配列番号２で示される塩基配列を有する請求項５記載のＤＮＡ。
- 配列番号３で示される塩基配列を有する請求項５記載のＤＮＡ。
- 請求項５から７のいずれかの項に記載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
- 請求項８記載の複製または発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
- 請求項１乃至４のいずれかの項に記載されたポリペプチドを発現させるための条件下で、請求項９記載の宿主細胞を培養することからなるそのポリペプチドの製造方法。
- 請求項１乃至４のいずれかの項に記載されたポリペプチドに対するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体。
- 請求項１１記載の抗体を用いることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかの項に記載されたポリペプチドの定量方法。
Priority Applications (1)
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| JP07538294A JP3671403B2 (ja) | 1994-03-22 | 1994-03-22 | プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 |
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|---|---|---|---|
| JP07538294A JP3671403B2 (ja) | 1994-03-22 | 1994-03-22 | プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 |
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| JPH07258295A JPH07258295A (ja) | 1995-10-09 |
| JP3671403B2 true JP3671403B2 (ja) | 2005-07-13 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP07538294A Expired - Lifetime JP3671403B2 (ja) | 1994-03-22 | 1994-03-22 | プロスタグランジンｄ受容体、その製造方法、その受容体をコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクターおよびそのベクターで形質転換された宿主細胞 |
Country Status (1)
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| JP (1) | JP3671403B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7183062B2 (en) * | 2003-12-30 | 2007-02-27 | Aventis Pharmaceuticals Inc. | Prostaglandin receptor protein and methods of use thereof |
-
1994
- 1994-03-22 JP JP07538294A patent/JP3671403B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH07258295A (ja) | 1995-10-09 |
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