JP3669880B2 - Diagnostic agent for pancreatic exocrine function - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、膵外分泌機能診断剤として有用な新規化合物およびその用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
膵外分泌機能検査は慢性膵炎、急性膵炎、膵臓癌等の膵臓疾患の診断に有用な検査法である。また、病態の把握や投薬管理、疾患の予後の評価にも有用な検査法である（総説 Arvanitakis and Cooke. Gastroenterology 74:932 (1978)、Niederau and Grendell. Gastroenterology 88:1973 (1985)、Goldberg. Bull. Mol. Biol. Med. 15:1 (1990)、Lankisch. Int. J. Pancreatology 14:9 (1993)、Bank and Chow Gastroenterologist 2:224 (1994)、Steer et al. New Eng. J. Med. 332:1482 (1995)）。
【０００３】
膵外分泌機能検査の標準検査法とされているのは、ゾンデを口から十二指腸まで挿入し十二指腸液を採取する検査法で、現在ではセクレチンを静脈内投与することにより膵液の分泌を誘起してから採取するセクレチン試験が一般的である。この方法は直接膵液の量や成分を分析することから正確度が高い。しかしながら、被験者の負担が非常に大きいため、繰返し試験やスクリーニング試験として用いることのできる検査法ではない。また、験者にも技術的熟練が要求されるため、一部の医療機関でしか実施できない検査法である。さらに、Ｘ線透視下でゾンデの位置を確認しながら十二指腸液を採取するため、Ｘ線被曝の問題もある。
【０００４】
このため、繰返し試験やスクリーニング試験には、ゾンデの挿入を必要としない簡易法が用いられている。その一つが、膵臓から分泌されるコレステロールエステルハイドロラーゼ、エステラーゼの合成基質 FDL (Fluorescein diraulate ）を経口投与した後１０時間蓄尿し、分解産物であるFluoresceinの尿中***率を測定するPancreolauryl test（PLT）である(US Patent No.3917812、Barry et al. Lancet (1982) Oct. 2 p.742、Scharpe and Iliano Clin. Chem. 33:5 (1987)）。
【０００５】
しかしながらこの方法も、検査に長時間を要するため、通院患者に頻繁に実施することはできないし、健康診断等で実施するには適当でない。
かかる状況下、被験者への負担が小さく、かつ結果が短時間で得られる簡易膵外分泌機能検査法の開発が望まれるところである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明は、被験者への負担が小さく、かつ結果が短時間で得られる簡易膵外分泌機能検査を可能にする膵外分泌機能診断剤を提供することを目的とする。
また、本発明は、膵外分泌機能検査に利用できる新規な化合物を提供することも目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、¹³Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物を慢性膵炎ラットに経口投与し、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度を測定することにより、膵外分泌機能検査を行うことができることを見出し、本発明を完成するに到った。
【０００８】
すなわち、本発明は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物またはその塩を提供する。本発明の化合物またはその塩は、フルオレセインの3'位と6'位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に¹³Ｃまたは¹⁴Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩であるとよく、¹³Ｃまたは¹⁴Ｃで標識された酸は、カルボン酸を例示することができ、カルボン酸の中でも脂肪酸、特に炭素数が２から１６の脂肪酸が好ましい。好ましい酸の例としては、酢酸、オクタン酸、ラウリン酸などを挙げることができる。
【０００９】
また、本発明は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を含有する膵外分泌機能診断剤を提供する。
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１０】
【発明の実施の形態】
本発明は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物およびその塩を包含する。
フルオレセイン(CA Name: 3',6'-Dihydroxyspiro[isobenzofuran-1(3H),9'-[9H]xanthen-3-one)は以下の構造式で表される。
【００１１】
【化１】

【００１２】
「フルオレセインエステル化合物」とは、フルオレセインの水酸基に酸がエステル結合した化合物であり、フルオレセインおよび酸に修飾がなされていてもよい。
「¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識」とは、フルオレセインエステル化合物中の少なくとも１個の炭素原子が¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ原子に置換されていることにより、フルオレセインエステル化合物中の¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ原子の存在比が天然存在比より高くなっていることをいう。
【００１３】
本発明の一態様において、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物またはその塩は、フルオレセインの3'位と6'位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に¹³Ｃまたは¹⁴Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩である。
【００１４】
¹³Ｃまたは¹⁴Ｃで標識された酸は、カルボン酸を例示することができるが、カルボン酸の中でも脂肪酸が好ましい。本明細書において、「脂肪酸」とは、Ｒ−ＣＯＯＨ（式中、Ｒは脂肪族基で分枝や２重結合があってもよい。）で表される化合物をいう。脂肪酸の炭素数は、好ましくは２から１６である。
脂肪酸の例としては、酢酸、オクタン酸、ラウリン酸などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
【００１５】
本発明の¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物としては、¹³Ｃ−ジラウリルフルオレセイン、¹³Ｃ−ジアセチルフルオレセイン、¹³Ｃ−ジオクタノイルフルオレセインなどを挙げることができる。
¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物は、以下のようにして製造することができる。
【００１６】
たとえば、フルオレセインをクロロホルムに溶解し、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識脂肪酸クロライドを等モルもしくは２倍モル加える。その後、ピリジンを含むクロロホルム溶液を滴下し遮光下で加熱攪拌する。反応終了後、溶媒を留去しカラムクロマトグラフィー、再結晶により¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物を得ることができる。
上記の¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物は、塩の形で得ることもできる。塩としては、ナトリウム塩やカリウム塩などを挙げることができる。
【００１７】
本発明の膵外分泌機能診断剤は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を単独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、経口剤（錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤等）に製剤化されたものであるとよい。賦形剤または担体としては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容されるものであればよく、その種類及び組成は適宜変更される。例えば、液状担体としてはオリーブ油が用いられる。固体担体としては、ヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。また、凍結乾燥製剤として用いたりすることもできる。
【００１８】
¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩の製剤中における含量は、製剤の種類により異なるが、通常1〜100重量％、好ましくは50〜100 重量％である。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤の場合は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩の製剤中における含量は、約10〜100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は担体である。
【００１９】
本発明の膵外分泌機能診断剤の投与量は、投与による呼気中の¹³ＣＯ₂または¹⁴ＣＯ₂の増加を確認できる量が必要であり、患者の年齢、体重、検査目的により異なるが、例えば1回当たりの投与量は成人の場合、1〜2000mg/kg体重程度である。
【００２０】
本発明の膵外分泌機能診断剤を用いる検査は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を被験者に投与することにより行う。投与後の血中、尿中、便中の¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識化合物濃度を測定する検査も可能であるが、呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度あるいは¹⁴Ｃ濃度の増加を測定する呼気テストが望ましい。¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を被験者に投与する前に、試験食等を投与して、膵酵素の分泌を誘起しておいてもよく、また、試験食等と共に投与してもよい。また、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩の複数種を組み合わせて使用してもよい。¹³Ｃの場合は具体的には、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度を測定し、投与後一定時間（例えば１時間、２時間、３時間）経過後における呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ(‰)）、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ(‰)）の積算または経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから膵外分泌機能の診断を行う。¹⁴Ｃの場合は具体的には、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹⁴Ｃ濃度すなわち放射能を測定し、投与後一定時間（例えば１時間、２時間、３時間）経過後における呼気ＣＯ₂中の放射能量、あるいは投与後一定時間までの呼気ＣＯ₂中の放射能量の増加率の積算または経時変化（立ち上がりの傾き、傾きの変化、ピークの時間等）のデータから膵外分泌機能の診断を行う。
【００２１】
この検査法は、¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩を被験者に投与すると、この化合物が膵外分泌性コレステロールエステルハイドロラーゼ、エステラーゼの作用を受けて分解された後に、消化管から吸収されて体内の代謝作用により脱炭酸され、¹³ＣＯ₂または¹⁴ＣＯ₂を生じ、これが呼気に排出されるという現象を利用するものである。
【００２２】
ここで、呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-MS）、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ（核磁気共鳴）法等で行うことができる。
【００２３】
また、呼気ＣＯ₂中の¹⁴Ｃ濃度すなわち放射能の測定は、呼気を直接あるいは溶媒等にＣＯ₂ をトラップした後、GM計数管、液体シンチレーションカウンター、固体シンチレーションカウンター、オートラジオグラフィー、電離箱法などで行うことができる。
以下に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに何ら影響されることはない。
【００２４】
【実施例】
〔実施例１〕¹³Ｃ-ジラウリルフルオレセイン（¹³C-FDL）の製造
１-¹³Ｃ-ラウリン酸５ｇ（Masstrace社)を乾燥クロロホルムに溶解し、これに２０倍モル量の塩化チオニルを加えた。この溶液を２時間加熱還流した後、クロロホルムをエバポレーターで除いた。さらに、減圧下、塩化チオニルを留去し、残さを直ちに次の反応に用いた。ラウリン酸クロリドの６分の１モル量に相当するフルオレセイン２Ｎａを乾燥アセトン２０ｍｌに溶解し、ピリジンを等モル加えて４５℃で加熱した。これに滴下ロートを用いて、上述の方法で得た酸クロライドを３０分間で滴下した。この間、光を遮蔽し、温度を４５℃に保った。滴下後、２時間反応させた。
【００２５】
反応終了後、アセトンを留去した後、クロロホルムを加えて残さを溶解した。クロロホルムに溶解しないものを濾過で除き、クロロホルムを、水、アルカリ、水、酸、水の順で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。クロロホルムを留去し、残さをシリカゲルカラム（3 cm x 60 cm、クロロホルム／エーテル）と活性炭素により精製し、得られた化合物を冷メタノールで洗浄し、¹³C-FDLを得た。
【００２６】
構造の確認と¹³Ｃの標識位置は、¹³Ｃ−ＮＭＲとマススペクトルで行った。
¹³Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、300MHz） 172.2 ｐｐｍ（¹³ＣＯＯＲ）
マススペクトル（EI-MS） ｍ/ｚ698（Ｍ⁺）、288、287、271
ＬＣ−ＭＳ（APCI） ｍ/ｚ699（Ｍ⁺+H）、516、333
【００２７】
〔実施例２〕¹³C-FDL 呼気テスト
２-１ 方法
慢性膵炎ラットと対照ラットに¹³C-FDLを経口投与し、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の経時変化を測定する¹³C-FDL呼気テストを行った。
慢性膵炎ラットの作成はMundlosらの方法（Mundlos et al.Pancreas 1:29 (1986)）に従い、5 週齢の Wistar 系雄性ラットの膵管へオレイン酸を注入し、３週間飼育した。また、腹部正中切開を実施したラットを対照とした。
【００２８】
一晩絶食した８週齢の慢性膵炎ラット、および対照ラットを、無麻酔のままマイクロ照射装置用ラットホルダー内に固定した。炭酸ガス計（CAPSTER-100）を用いて呼気を約 100〜300 ml/minの速度で吸引し、炭酸ガス濃度をモニターした。炭酸ガス濃度が安定した状態でいったんラットホルダーからラットを出し、オリーブ油に溶解した¹³C-FDL （160 mg/kg, 4 ml/kg）を、経口投与用ゾンデを用いて胃内に投与した。
【００２９】
投与直前と、投与後１時間毎に５時間まで呼気をサンプリングし、呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度をガスクロマトグラフ−質量分析計（GC-MS ）で分析した。GC-MS の分析条件は下記の通りである。吸引呼気中の炭酸ガス濃度は 3± 0.5 %に維持した。
【００３０】
[ＧＣ−ＭＳ条件]
装置 Shimadzu GC-MS QP-5000 [(株) 島津製作所]
カラム 0.32mm×25m (ID ×L) fused silica capillary column PORAPLOT Q (CHROMPACK社)
イオン化法 EI (electron impact) 法
気化室温度 60℃
カラム温度 60℃
GCインターフェース温度 230 ℃
キャリアガス He
キャリアガス圧力 20Kpa
測定モード SIM (selected ion monitoring)
測定イオン m/z=45, 46, 47
試料注入量 25μl
【００３１】
[¹³Ｃ濃度計算方法]
酸素同位体存在比を天然存在比とし、m/z=45, 46のイオンピーク面積より¹³Ｃ濃度を下式により算出した。m/z=45, 46の面積比 (A45/A46)をａとする（特開平7-120434号に基づく）。
【００３２】
【数１】
¹³Ｃ濃度(%) ＝｛(0.004176-0.0007462a)/(0.9944396＋0.0034298a) ｝×100
尚、Δ¹³Ｃ(‰)は各時点の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度 (¹³Ｃ tmin)とＣＯ₂標準ガスの¹³Ｃ濃度( ¹³Ｃ std)から下式により算出した。
【００３３】
【数２】
Δ¹³Ｃ(‰)＝｛(¹³Ｃ tmin-¹³Ｃ 0min)/¹³Ｃ std｝×1000
【００３４】
２-２ 結果
対照ラット、慢性膵炎ラットともに、測定を終了した５時間までΔ¹³Ｃ（‰）値が増加を続けたが、慢性膵炎ラットのΔ¹³Ｃ（‰）値は５時間までの各時間において対照ラットよりも小さかった（図１）。投与後３時間におけるΔ¹³Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 42.0 ± 21.3 に対して対照ラットで 153.3± 22.8 と非常に有意に（p ＜ 0.01）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後５時間におけるΔ¹³Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 95.4 ± 47.1 に対して対照ラットで 236.3± 12.4 と有意に（p ＜ 0.05）慢性膵炎ラットで小さかった。
【００３５】
〔実施例３〕¹³Ｃ-ジオクタノイルフルオレセイン（¹³C-ＦＤＯ）の製造
１-¹³Ｃ-オクタン酸２ｇ（Masstrace社)、フルオレセイン２Ｎａ１.５２ｇをDimethylformamide（DMF）に溶解し、Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphonium hexafluorophosphate（BOP）９.１３ｇ及びDiisopropylethylamine（DIEA）７.２mlを順に添加して室温で１２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後、酢酸エチル抽出した。有機層を乾燥、濃縮後、遮光下カラム精製（溶媒20%酢酸エチル／ヘキサン）し、濃縮後、¹³Ｃ-ＦＤＯ１.０５ｇを得た。
【００３６】
構造の確認と¹³Ｃの標識位置は、¹³Ｃ−ＮＭＲとマススペクトルで行った。
¹³Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、400MHz） 171.9 ｐｐｍ（¹³ＣＯＯＲ）
マススペクトル（EI-MS） ｍ/ｚ586（Ｍ⁺）、542、415、332、288、287、271
【００３７】
〔実施例４〕¹³C-ＦＤＯ呼気テスト
２-１と同様に、慢性膵炎ラットと対照ラットに¹³C-ＦＤＯを200mg/kg経口投与し、投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の経時変化を測定する¹³C-ＦＤＯ呼気テストを行った。
【００３８】
慢性膵炎ラットのΔ¹³Ｃ（‰）値は測定を終了した５時間までの各時間において対照ラットよりも小さかった（図２）。投与後１時間におけるΔ¹³Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 2.7± 3.8に対して対照ラットで 46.3± 11.5 と非常に有意に（p ＜ 0.001）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後３時間におけるΔ¹³Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 18.4 ± 12.1 に対して対照ラットで 60.6 ± 12.7 と非常に有意に（p ＜ 0.01）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後４時間におけるΔ¹³Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 15.2 ± 13.4 に対して対照ラットで 88.7 ± 8.2と非常に有意に（p ＜ 0.001）慢性膵炎ラットで小さかった。投与後５時間におけるΔ¹³Ｃ（‰）値は慢性膵炎ラットで 20.6 ± 11.2 に対して対照ラットで 73.6 ± 14.1 と非常に有意に（p ＜ 0.01）慢性膵炎ラットで小さかった。
【００３９】
〔実施例５〕¹³Ｃ-ジアセチルフルオレセイン（¹³C-ＦＤＡ）の製造
１-¹³Ｃ-酢酸２ｇ（Masstrace社)、フルオレセイン２Ｎａ３.６３ｇをＤＭＦに溶解し、ＢＯＰ１５.９４ｇ及びＤＩＥＡ１７.１mlを順に添加して室温で１２時間攪拌した。ＴＬＣで反応終了を確認後、酢酸エチル抽出した。有機層を乾燥、濃縮後、遮光下カラム精製（溶媒20%酢酸エチル／ヘキサン）し、濃縮後、¹³Ｃ-ＦＤＡ１.０１ｇを得た。
【００４０】
構造の確認と¹³Ｃの標識位置は、¹³Ｃ−ＮＭＲとマススペクトルで行った。
¹³Ｃ−ＮＭＲ（重クロロホルム、400MHz） 168.8 ｐｐｍ（¹³ＣＯＯＲ）
マススペクトル（EI-MS） ｍ/ｚ418（Ｍ⁺）、374、331、314、288、287、271
【００４１】
〔製剤例１〕 （内服液剤）
¹³Ｃ-FDL 4重量部に対し、オリーブ油を加え全量を100重量部として、これを溶解後バイアル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００４２】
【発明の効果】
本発明により、被験者への負担が小さく、かつ結果が短時間で得られる簡易膵外分泌機能検査が可能となった。
この検査法は、集団検診や人間ドッグでの膵炎のスクリーニング検査、さらに、慢性膵炎の重症度の判定、未だに死亡率の高い（30％）劇症膵炎の重症化予知、膵炎の成因の診断、膵臓癌の早期診断にも利用できる。また、一般外来患者の診察において、膵炎を否定する診断法としても有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】¹³C-FDL投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ(‰)）の経時変化。0分で慢性膵炎ラット（●、n=3）、および対照ラット（□、n=3）に¹³C-FDL（160mg/kg）を経口投与した。バーはＳＤを表す。
【図２】 ¹³C-FDO投与後の呼気ＣＯ₂中の¹³Ｃ濃度の増加率（Δ¹³Ｃ(‰)）の経時変化。0分で慢性膵炎ラット（●、n=4）、および対照ラット（□、n=4）に¹³C-FDO（200mg/kg）を経口投与した。バーはＳＤを表す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel compound useful as a diagnostic agent for pancreatic exocrine function and use thereof.
[0002]
[Prior art]
The pancreatic exocrine function test is a test method useful for diagnosis of pancreatic diseases such as chronic pancreatitis, acute pancreatitis, and pancreatic cancer. It is also a useful test method for understanding disease state, medication management, and prognostic evaluation of disease (Review Arvanitakis and Cooke. Gastroenterology 74: 932 (1978), Niederau and Grendell. Gastroenterology 88: 1973 (1985), Goldberg. Bull. Mol. Biol. Med. 15: 1 (1990), Lankisch. Int. J. Pancreatology 14: 9 (1993), Bank and Chow Gastroenterologist 2: 224 (1994), Steer et al. New Eng. J. Med 332: 1482 (1995)).
[0003]
The standard test method for exocrine pancreatic function tests is a test method in which a sonde is inserted from the mouth into the duodenum and the duodenal juice is collected. At present, secretion of pancreatic juice is induced by intravenous administration of secretin. Collected secretin tests are common. This method is highly accurate because it directly analyzes the amount and composition of pancreatic juice. However, it is not a test method that can be used as a repeat test or a screening test because the burden on the subject is very large. In addition, since the tester also requires technical skill, this test method can be performed only at some medical institutions. Furthermore, since duodenal juice is collected while confirming the position of the sonde under fluoroscopy, there is also a problem of X-ray exposure.
[0004]
For this reason, simple methods that do not require the insertion of a sonde are used for repeated tests and screening tests. One of these is the pancreolauryl test (PLT), which measures the urinary excretion rate of fluorescein, a degradation product, after 10 hours of oral administration of cholesterol ester hydrolase secreted from the pancreas and esterase synthetic substrate FDL (Fluorescein diraulate) (US Patent No. 3917812, Barry et al. Lancet (1982) Oct. 2 p.742, Scharpe and Iliano Clin. Chem. 33: 5 (1987)).
[0005]
However, this method also requires a long time for the examination, so it cannot be performed frequently for outpatients, and is not suitable for conducting a medical examination or the like.
Under such circumstances, it is desired to develop a simple pancreatic exocrine function test method that can reduce the burden on the subject and can obtain the results in a short time.
[0006]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide an agent for diagnosing pancreatic exocrine function that enables a simple test of exocrine pancreatic function that can reduce the burden on a subject and can obtain a result in a short time.
Another object of the present invention is to provide a novel compound that can be used for the examination of pancreatic exocrine function.
[0007]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have found that an exocrine pancreatic function test can be performed by orally administering a ¹³ C-labeled fluorescein ester compound to chronic pancreatitis rats and measuring the ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ after administration. The present invention has been completed.
[0008]
That is, the present invention provides a ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a salt thereof. The compound of the present invention or a salt thereof is a compound or a salt thereof in which an acid labeled with ¹³ C or ¹⁴ C is ester-bonded to either or both of the 3′-position and 6′-position hydroxyl group of fluorescein. The acid labeled with ¹³ C or ¹⁴ C can be exemplified by carboxylic acid, and among carboxylic acids, fatty acids, particularly those having 2 to 16 carbon atoms are preferred. Examples of preferred acids include acetic acid, octanoic acid, lauric acid and the like.
[0009]
The present invention also provides a diagnostic agent for pancreatic exocrine function containing a ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0010]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The present invention includes ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compounds and salts thereof.
Fluorescein (CA Name: 3 ′, 6′-Dihydroxyspiro [isobenzofuran-1 (3H), 9 ′-[9H] xanthen-3-one) is represented by the following structural formula.
[0011]
[Chemical 1]

[0012]
The “fluorescein ester compound” is a compound in which an acid is ester-bonded to the hydroxyl group of fluorescein, and the fluorescein and the acid may be modified.
“ ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled” means that at least one carbon atom in the fluorescein ester compound is substituted with a ¹³ C- or ¹⁴ C atom, so that ¹³ C- or ¹⁴ in the fluorescein ester compound is substituted. It means that the abundance ratio of C atoms is higher than the natural abundance ratio.
[0013]
In one embodiment of the present invention, the ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a salt thereof is labeled with ¹³ C or ¹⁴ C on or both of the 3′-position and 6′-position hydroxyl group of fluorescein. Or a salt thereof in which the acid formed is an ester bond.
[0014]
Examples of the acid labeled with ¹³ C or ¹⁴ C include carboxylic acids, but fatty acids are preferred among the carboxylic acids. In the present specification, “fatty acid” refers to a compound represented by R—COOH (wherein R is an aliphatic group and may have a branch or a double bond). The number of carbon atoms of the fatty acid is preferably 2 to 16.
Examples of fatty acids include, but are not limited to, acetic acid, octanoic acid, lauric acid and the like.
[0015]
The ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound of the present invention, mention may be made of ¹³ C- dilauryl fluorescein, ¹³ C- diacetyl fluorescein, and ¹³ C- dioctanoyl fluorescein.
^{The 13} C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound can be produced as follows.
[0016]
For example, fluorescein is dissolved in chloroform and equimolar or double molar of ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fatty acid chloride is added. Thereafter, a chloroform solution containing pyridine is dropped, and the mixture is heated and stirred under light shielding. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound can be obtained by column chromatography and recrystallization.
The ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound can also be obtained in the form of a salt. Examples of the salt include sodium salt and potassium salt.
[0017]
The diagnostic agent for pancreatic exocrine function of the present invention comprises a ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof alone or mixed with an excipient or carrier to give an oral preparation (tablet, capsule) Agents, powders, granules, liquids, etc.). The excipient or carrier may be any one that is conventionally used in the art and is pharmaceutically acceptable, and the type and composition thereof are appropriately changed. For example, olive oil is used as the liquid carrier. As the solid carrier, cellulose derivatives such as hydroxypropyl cellulose, organic acid salts such as magnesium stearate, and the like are used. It can also be used as a lyophilized preparation.
[0018]
The content of the ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof in the preparation varies depending on the kind of preparation, but is usually 1 to 100% by weight, preferably 50 to 100% by weight. . In the case of capsules, tablets, granules, powders, the content of ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or pharmaceutically acceptable salt thereof in the preparation is about 10 to 100% by weight, preferably 50 ˜100% by weight with the balance being the carrier.
[0019]
The dose of the diagnostic agent for exocrine pancreatic function of the present invention needs to be an amount capable of confirming an increase in ¹³ CO ₂ or ¹⁴ CO ₂ in exhaled breath by administration, and varies depending on the age, weight, and purpose of the test of the patient. The dose per administration is about 1 to 2000 mg / kg body weight for adults.
[0020]
The test using the diagnostic agent for exocrine pancreatic function of the present invention is carried out by administering to a subject a ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Although it is possible to test the concentration of ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled compound in blood, urine, or stool after administration, it is also possible to measure the increase in ¹³ C concentration or ¹⁴ C concentration in exhaled CO _2. Testing is desirable. Prior to the administration of the ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject, a test meal or the like may be administered to induce secretion of pancreatic enzymes, It may be administered together with a test meal or the like. Further, a ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof may be used in combination. ¹³ More specifically For C, the measured ¹³ C levels in exhaled CO ₂ after administration, a predetermined time after administration (e.g. 1 hour, 2 hours, 3 hours) ¹³ C in exhaled CO ₂ after the lapse of Accumulation rate increase rate (Δ ¹³ C (‰)), or integration rate of ¹³ C concentration increase in exhaled CO ₂ (Δ ¹³ C (‰)) up to a certain time after administration (rise slope, slope) Diagnosis of pancreatic exocrine function from the data of the change in time, peak time, etc.). ^In the case of ¹⁴ C, specifically, the ¹⁴ C concentration or radioactivity in exhaled CO ₂ after administration is measured, and in exhaled CO ₂ after elapse of a certain time (for example, 1 hour, 2 hours, 3 hours) after administration. Diagnosis of exocrine pancreatic function from data on the cumulative amount of radioactivity or the rate of increase in the amount of radioactivity in exhaled CO ₂ up to a certain time after administration or changes over time (rise slope, slope change, peak time, etc.) .
[0021]
In this test method, when a ¹³ C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a subject, the compound is degraded under the action of exocrine pancreatic cholesterol ester hydrolase or esterase. After that, it is absorbed from the gastrointestinal tract and decarboxylated by metabolic action in the body to produce ¹³ CO ₂ or ¹⁴ CO ₂ , which is discharged into the breath.
[0022]
Here, measurement of ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ is performed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS), infrared spectroscopy, mass spectrometry, photoelectric acoustic spectroscopy, NMR (nuclear magnetic resonance) method, and the like. It can be carried out.
[0023]
In addition, ¹⁴ C concentration in exhaled CO ₂ , that is, radioactivity is measured by trapping CO ₂ directly in the exhaled gas or in a solvent, etc., and then GM counter, liquid scintillation counter, solid scintillation counter, autoradiography, ionization chamber method And so on.
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the scope of the present invention is not affected by these.
[0024]
【Example】
Example 1 ¹³ C- dilauryl fluorescein ⁽¹³ C-FDL) manufacturing ^1-13 C- laurate 5g of (Masstrace, Inc.) was dissolved in dry chloroform, was added 20-fold molar amount of thionyl chloride to this . The solution was heated to reflux for 2 hours, and then chloroform was removed with an evaporator. Further, thionyl chloride was distilled off under reduced pressure, and the residue was immediately used for the next reaction. Fluorescein 2Na corresponding to 1/6 molar amount of lauric acid chloride was dissolved in 20 ml of dry acetone, equimolar pyridine was added and heated at 45 ° C. The acid chloride obtained by the above-mentioned method was dripped in 30 minutes using the dropping funnel. During this time, the light was shielded and the temperature was kept at 45 ° C. After dropping, the reaction was allowed to proceed for 2 hours.
[0025]
After completion of the reaction, acetone was distilled off, and chloroform was added to dissolve the residue. What was not dissolved in chloroform was removed by filtration, and chloroform was washed with water, alkali, water, acid, and water in that order and dried over sodium sulfate. Chloroform was distilled off, the residue was purified with a silica gel column (3 cm x 60 cm, chloroform / ether) and activated carbon, and the resulting compound was washed with cold methanol to obtain ¹³ C-FDL.
[0026]
Labeled position confirmation and ¹³ C of the structure was carried out by ¹³ C-NMR and mass spectra.
¹³ C-NMR (deuterated chloroform, 300 MHz) 172.2 ppm ( ¹³ COOR)
Mass spectrum (EI-MS) m / z 698 (M ⁺ ), 288, 287, 271
LC-MS (APCI) m / z699 (M + + H), 516,333
[0027]
Example 2 The ¹³ C-FDL breath test 2-1 how chronic pancreatitis and control rats in ¹³ C-FDL was orally administered to measure the time course of ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ after administration ¹³ C -An FDL breath test was performed.
Chronic pancreatitis rats were prepared according to the method of Mundlos et al. (Mundlos et al. Pancreas 1:29 (1986)) by injecting oleic acid into the pancreatic duct of 5-week-old male Wistar rats and raising them for 3 weeks. In addition, rats subjected to midline abdominal incision were used as controls.
[0028]
An 8-week-old chronic pancreatitis rat fasted overnight and a control rat were fixed in a rat holder for a microirradiator without anesthesia. Using a carbon dioxide meter (CAPSTER-100), exhaled air was sucked at a rate of about 100 to 300 ml / min, and the carbon dioxide concentration was monitored. Rats were once removed from the rat holder with a stable carbon dioxide concentration, and ¹³ C-FDL (160 mg / kg, 4 ml / kg) dissolved in olive oil was intragastrically administered using an orally administered sonde.
[0029]
Exhalation was sampled immediately before administration and every 5 hours after administration until ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ was analyzed with a gas chromatograph-mass spectrometer (GC-MS). The analytical conditions for GC-MS are as follows. The carbon dioxide concentration in the exhaled breath was maintained at 3 ± 0.5%.
[0030]
[GC-MS conditions]
Equipment Shimadzu GC-MS QP-5000 [Shimadzu Corporation]
Column 0.32mm × 25m (ID × L) fused silica capillary column PORAPLOT Q (CHROMPACK)
Ionization method EI (electron impact) Method Vaporization chamber temperature 60 ℃
Column temperature 60 ° C
GC interface temperature 230 ° C
Carrier gas He
Carrier gas pressure 20Kpa
Measurement mode SIM (selected ion monitoring)
Measurement ion m / z = 45, 46, 47
Sample injection volume 25 μl
[0031]
[ ^13C concentration calculation method]
The oxygen isotope abundance ratio was taken as the natural abundance ratio, and the ¹³ C concentration was calculated from the ion peak area at m / z = 45, 46 by the following equation. The area ratio (A45 / A46) of m / z = 45, 46 is assumed to be a (based on Japanese Patent Laid-Open No. 7-120434).
[0032]
[Expression 1]
¹³ C concentration (%) = {(0.004176-0.0007462a) / (0.9944396 + 0.0034298a)} × 100
Δ ¹³ C (‰) was calculated from the ¹³ C concentration ( ¹³ C tmin) in the exhaled CO ₂ at each time point and the ¹³ C concentration ( ¹³ C std) of the CO ₂ standard gas by the following equation.
[0033]
[Expression 2]
Δ ¹³ C (‰) = {( ¹³ C tmin− ¹³ C 0 min) / ¹³ C std} × 1000
[0034]
2-2 Results Control rats, both chronic pancreatitis rats, values up to 5 hours to complete the measurement Δ ¹³ C (‰) has continued to increase, the chronic pancreatitis rats Δ ¹³ C (‰) values for each of up to 5 hours It was smaller than the control rats in time (Figure 1). The Δ ¹³ C (‰) value at 3 hours after administration was 42.0 ± 21.3 in chronic pancreatitis rats and 153.3 ± 22.8 in control rats, which was very significantly lower (p <0.01) in chronic pancreatitis rats. The Δ ¹³ C (‰) value at 5 hours after administration was 95.4 ± 47.1 in chronic pancreatitis rats and 236.3 ± 12.4 in control rats (p <0.05), which was significantly smaller in chronic pancreatitis rats.
[0035]
Example 3 ¹³ C- dioctanoyl fluorescein ⁽¹³ C-FDO) manufacturing ^1-13 C- octanoic acid 2g (Masstrace, Inc.), fluorescein 2Na1.52g was dissolved in Dimethylformamide (DMF), Benzotriazol-1- 9.13 g of yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonium hexafluorophosphate (BOP) and 7.2 ml of diisopropylethylamine (DIEA) were sequentially added and stirred at room temperature for 12 hours. After confirming the completion of the reaction by TLC, extraction with ethyl acetate was performed. The organic layer was dried and concentrated, followed by column purification under light shielding (solvent 20% ethyl acetate / hexane), and after concentration, 1.05 g of ¹³ C-FDO was obtained.
[0036]
Labeled position confirmation and ¹³ C of the structure was carried out by ¹³ C-NMR and mass spectra.
¹³ C-NMR (deuterated chloroform, 400 MHz) 171.9 ppm ( ¹³ COOR)
Mass spectrum (EI-MS) m / z 586 (M ⁺ ), 542, 415, 332, 288, 287, 271
[0037]
[Example 4] Similar to ¹³ C-FDO breath test 2-1, chronic C pancreatitis rats and control rats were orally administered with ¹³ C-FDO at 200 mg / kg, and the time course of ¹³ C concentration in exhaled CO ₂ after the administration. A ¹³ C-FDO breath test was performed to measure changes.
[0038]
The Δ ¹³ C (‰) value of the chronic pancreatitis rat was smaller than that of the control rat at each time up to 5 hours after the measurement was completed (FIG. 2). The Δ ¹³ C (‰) value at 1 hour after administration was very significant (p <0.001) in chronic pancreatitis rats, compared with 2.7 ± 3.8 in chronic pancreatitis rats and 46.3 ± 11.5 in control rats. The Δ ¹³ C (‰) value at 3 hours after administration was 18.4 ± 12.1 in chronic pancreatitis rats and 60.6 ± 12.7 in control rats, which was very significant (p <0.01) in chronic pancreatitis rats. The Δ ¹³ C (‰) value at 4 hours after the administration was 15.2 ± 13.4 in the chronic pancreatitis rat and 88.7 ± 8.2 in the control rat, which was very significantly lower (p <0.001) in the chronic pancreatitis rat. The Δ ¹³ C (‰) value at 5 hours after administration was 20.6 ± 11.2 in the chronic pancreatitis rat, and 73.6 ± 14.1 in the control rat, which was very significant (p <0.01) in the chronic pancreatitis rat.
[0039]
Example 5 ¹³ C- production of diacetyl fluorescein ^{(13 C-FDA) 1- 13} C- acetate 2g (Masstrace, Inc.), fluorescein 2Na3.63g was dissolved in DMF, added BOP15.94g and DIEA17.1ml sequentially And stirred at room temperature for 12 hours. After confirming the completion of the reaction by TLC, extraction with ethyl acetate was performed. The organic layer was dried and concentrated, followed by column purification under light shielding (solvent 20% ethyl acetate / hexane) and concentration to obtain 1.01 g of ¹³ C-FDA.
[0040]
Labeled position confirmation and ¹³ C of the structure was carried out by ¹³ C-NMR and mass spectra.
¹³ C-NMR (deuterated chloroform, 400 MHz) 168.8 ppm ( ¹³ COOR)
Mass spectrum (EI-MS) m / z 418 (M ⁺ ), 374, 331, 314, 288, 287, 271
[0041]
[Formulation Example 1] (Liquid preparation for internal use)
Olive oil was added to 4 parts by weight of ¹³ C-FDL to make a total amount of 100 parts by weight, and this was dissolved and taken into a vial and sealed to obtain an internal solution.
[0042]
【The invention's effect】
According to the present invention, it is possible to perform a simple exocrine pancreatic function test in which a burden on a subject is small and a result can be obtained in a short time.
This method includes mass screening, screening tests for pancreatitis in human dogs, determining the severity of chronic pancreatitis, predicting the severity of fulminant pancreatitis with a still high mortality rate (30%), diagnosing the cause of pancreatitis, It can also be used for early diagnosis of pancreatic cancer. It is also useful as a diagnostic method to negate pancreatitis in general outpatient examinations.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the time course of the increase rate of ¹³ C concentration (Δ ¹³ C (‰)) in exhaled CO ₂ after ¹³ C-FDL administration. At 0 minutes, ¹³ C-FDL (160 mg / kg) was orally administered to chronic pancreatitis rats (●, n = 3) and control rats (□, n = 3). Bar represents SD.
FIG. 2 shows the time course of the rate of increase in ¹³ C concentration (Δ ¹³ C (‰)) in exhaled CO ₂ after administration of ¹³ C-FDO. At 0 min, chronic pancreatitis rats (●, n = 4) and control rats (□, n = 4) were orally administered with ¹³ C-FDO (200 mg / kg). Bar represents SD.

Claims (12)

フルオレセインの 3' 位と 6' 位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に ¹³ Ｃまたは ¹⁴ Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩。 3 'position and 6' positions of the two hydroxyl groups, or a salt thereof both or labeled acid with either one to ¹³ C or ¹⁴ C has ester bonds of fluorescein. 酸がカルボン酸である請求項１記載の化合物またはその塩。The compound or its salt according to claim 1, wherein the acid is a carboxylic acid. カルボン酸が脂肪酸である請求項２記載の化合物またはその塩。The compound or a salt thereof according to claim 2 , wherein the carboxylic acid is a fatty acid. 脂肪酸の炭素数が２から１６である請求項３記載の化合物またはその塩。The compound or salt thereof according to claim 3 , wherein the fatty acid has 2 to 16 carbon atoms. 脂肪酸がラウリン酸、酢酸およびオクタン酸からなる群より選択される請求項４記載の化合物またはその塩。The compound or a salt thereof according to claim 4 , wherein the fatty acid is selected from the group consisting of lauric acid, acetic acid and octanoic acid. 下記の化合物(a)〜(c)からなる群より選択される請求項１記載の¹³Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物またはその塩。
(a)¹³Ｃ−ジラウリルフルオレセイン
(b)¹³Ｃ−ジアセチルフルオレセイン
(c)¹³Ｃ−ジオクタノイルフルオレセイン。The ¹³ C-labeled fluorescein ester compound or a salt thereof according to claim 1, selected from the group consisting of the following compounds (a) to (c).
(a) ¹³ C-Dilauryl fluorescein
(b) ¹³ C-Diacetylfluorescein
(c) ¹³ C-dioctanoylfluorescein. フルオレセインの 3' 位と 6' 位の二つの水酸基の両方またはどちらか一方に ¹³ Ｃまたは ¹⁴ Ｃで標識された酸がエステル結合した化合物またはその塩を含有する、呼気テスト用の膵外分泌機能診断剤。Diagnosis of pancreatic exocrine function for breath test, containing a compound or a salt thereof in which an acid labeled with ¹³ C or ¹⁴ C is attached to both or one of the 3 ' and 6' hydroxyl groups of fluorescein Agent. 酸がカルボン酸である請求項７記載の膵外分泌機能診断剤。The diagnostic agent for pancreatic exocrine function according to claim 7 , wherein the acid is a carboxylic acid. カルボン酸が脂肪酸である請求項８記載の膵外分泌機能診断剤。The diagnostic agent for pancreatic exocrine function according to claim 8 , wherein the carboxylic acid is a fatty acid. 脂肪酸の炭素数が２から１６である請求項９記載の膵外分泌機能診断剤。The diagnostic agent for pancreatic exocrine function according to claim 9 , wherein the fatty acid has 2 to 16 carbon atoms. ¹³Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物が下記の化合物(a)〜(c)からなる群より選択される請求項７記載の膵外分泌機能診断剤。
(a)¹³Ｃ−ジラウリルフルオレセイン
(b)¹³Ｃ−ジアセチルフルオレセイン
(c)¹³Ｃ−ジオクタノイルフルオレセイン。 ^The diagnostic agent for pancreatic exocrine function according to claim 7, wherein the ¹³ C-labeled fluorescein ester compound is selected from the group consisting of the following compounds (a) to (c).
(a) ¹³ C-Dilauryl fluorescein
(b) ¹³ C-Diacetylfluorescein
(c) ¹³ C-dioctanoylfluorescein. ¹³Ｃ−または¹⁴Ｃ−標識フルオレセインエステル化合物または薬剤学的に許容できるその塩が膵外分泌性コレステロールエステルハイドロラーゼおよび膵外分泌性エステラーゼの作用を受けた後に脱炭酸され、¹³ＣＯ₂または¹⁴ＣＯ₂を生じる請求項７〜１１のいずれかに記載の膵外分泌機能診断剤。 ^{A 13} C- or ¹⁴ C-labeled fluorescein ester compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof is decarboxylated after the action of pancreatic exocrine cholesterol ester hydrolase and pancreatic exocrine esterase, ¹³ CO ₂ or ¹⁴ CO ₂ The diagnostic agent for pancreatic exocrine function according to any one of claims 7 to 11 , which produces

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