KR100710561B1 - Silent mark for oil product and detection method thereto - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유류 제품에 은닉 표지를 가하는 방법 그리고 은닉 표지를 검출하는 방법 및 이에 사용되는 표지 물질과 검출 물질들에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 유류 제품에 형광 물질과 중합체가 결합된 표지 물질을 첨가하여 유류 제품을 은닉 표지하는 방법; 그리고 이렇게 은닉 표지된 유류 제품에 표지 물질로부터 형광 물질을 도출시키는 기능을 수행하는 검출 물질인 효소 조성물을 가한 후에, 유류 제품의 형광을 측정하여 은닉 표지를 검출하는 방법 및 이러한 방법에 사용되는 은닉 표지 물질과 은닉 표지 검출 물질에 대한 것이다.The present invention relates to a method for applying a hidden label to an oil product, a method for detecting a hidden label, and a labeling material and detection materials used therein. More specifically, a labeling material in which a fluorescent material and a polymer are combined is added to an oil product. Concealing and labeling oil products; And adding an enzyme composition, which is a detection substance that performs a function of deriving a fluorescent substance from the labeling substance, to the hidden labeled oil product, and then detecting the hidden label by measuring the fluorescence of the oil product and the secret label used in the method. For substances and hidden label detection substances.

은닉 표지 Cover

Description

유류 제품 은닉 표지 물질 및 이를 검출하는 방법 {Silent mark for oil product and detection method thereto}Silent mark for oil product and detection method

도 1은 휴대용 형광분석계를 사용하여 석유 속의 100ppb 농도의 레소루핀 디팔미테이트를 정량 분석한 그래프이고,1 is a graph quantitatively analyzing the resorupin dipalmitate concentration of 100ppb in petroleum using a portable fluorescence spectrometer,

도 2는 휴대용 형광분석계를 사용하여 석유 속의 100ppb 농도의 플루오레세인 디팔미테이트를 정량 분석한 그래프이며, 2 is a graph quantitatively analyzing fluorescein dipalmitate at a concentration of 100 ppb in petroleum using a portable fluorometer.

도 3은 휴대용 형광분석계를 사용하여 석유 속의 100ppb 농도의 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트를 정량 분석한 그래프이고,3 is a graph quantitatively analyzing 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate at 100 ppb concentration in petroleum using a portable fluorescence spectrometer,

도 4는 형광 광도계를 사용하여 석유속의 형광 물질를 정량 분석한 그래프(350nm 파장으로 들뜨게 하여 측정한 발광도)이고,4 is a graph (quantitative luminescence measured by excitation at 350 nm wavelength) of fluorescent material in petroleum using a fluorescence photometer.

도 5는 도 4에서 최대 발광도를 나타낸 그래프이다.FIG. 5 is a graph showing maximum luminescence in FIG. 4.

본 발명은 유류 제품에 은닉 표지를 가하는 방법 그리고 은닉 표지를 검출하는 방법 및 이에 사용되는 표지 물질과 검출 물질들에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 유류 제품에 형광 물질과 중합체가 결합된 표지 물질을 첨가하여 유류 제품 을 은닉 표지하는 방법; 그리고 이렇게 은닉 표지된 유류 제품에 표지 물질로부터 형광 물질을 도출시키는 기능을 수행하는 검출 물질인 효소 조성물을 가한 후에, 유류 제품의 형광을 측정하여 은닉 표지를 검출하는 방법 및 이러한 방법에 사용되는 은닉 표지 물질과 은닉 표지 검출 물질에 대한 것이다.The present invention relates to a method for applying a hidden label to an oil product, a method for detecting a hidden label, and a labeling material and detection materials used therein. More specifically, a labeling material in which a fluorescent material and a polymer are combined is added to an oil product. Concealing and labeling oil products; And adding an enzyme composition, which is a detection substance that performs a function of deriving a fluorescent substance from the labeling substance, to the hidden labeled oil product, and then detecting the hidden label by measuring the fluorescence of the oil product and the secret label used in the method. For substances and hidden label detection substances.

최근, 국제 원유가격의 상승등으로 인하여 휘발유 가격이 폭등함에 따라 가짜 휘발유의 불법 사용이 증가하고 있다. 자동차의 수명과 환경에 미치는 영향을 감안할 때 가짜 휘발유에 대한 사용의 근절이 필요하나 정품과의 구별이 육안으로는 매우 어려우며 복잡한 화학적 분석과정을 거쳐야만 가능하므로 가짜 휘발유를 구별해 낸다는 것은 매우 어려운 실정이다. Recently, as gasoline prices soar due to the rise in international oil prices, the illegal use of fake gasoline is increasing. It is necessary to eradicate the use of fake gasoline in consideration of the life of the car and the environmental impact, but it is very difficult to distinguish fake gasoline because it is very difficult to visually distinguish from genuine products and only through complicated chemical analysis process. .

본 명세서에서의 "형광 물질"란, 특정 파장의 빛을 조사하였을 때 전자 공명 구조를 나타내어 조사광과 다른 특정 파장의 빛(형광)을 방출하는 염료를 말한다. 형광 물질는 매우 적은 양이라 할지라도 자외선 또는 가시광선을 조사함으로써 쉽게 검출될 수 있다. 이러한 형광 물질는 석유에 거의 녹지 않는 성질을 가지고 있다.As used herein, the "fluorescent material" refers to a dye that exhibits an electron resonance structure when irradiated with light of a specific wavelength and emits light (fluorescence) having a specific wavelength different from that of irradiated light. Fluorescent materials can be easily detected by irradiating ultraviolet or visible light even in very small amounts. These fluorescent materials are insoluble in petroleum.

본 명세서에서의 "표지물질"이란, 상기의 형광 물질의 분자 구조 중 반응성이 큰 활성기에 탄화수소(C4-C18)중합체를 에스테르 결합으로 결합물질을 포괄하는 개념이다. 이러한 표지물질은 석유에 매우 잘 녹게 되고, 특정 파장의 빛을 조사하여도 전자 공명 구조를 갖지 않아 형광을 띄지 않게 된다. 또한, 상기 표지물질로부터 탄화수소중합체를 분리해 내면 다시 수용액 층에 녹으며 형광을 띠게 된다. 따라서, 이러한 성질을 이용하여 표지 물질을 추출 및 검출할 수 있게 된다. As used herein, the term "labeled substance" is a concept in which a hydrocarbon (C 4 -C 18 ) polymer is used as an ester bond to encompass a binding substance in an active group having high reactivity in the molecular structure of the fluorescent substance. These markers are very soluble in petroleum and do not have fluorescence because they do not have an electron resonance structure even when irradiated with light of a specific wavelength. Also, when the hydrocarbon polymer is separated from the labeling substance, the hydrocarbon polymer is dissolved in the aqueous solution layer and fluoresces. Thus, this property can be used to extract and detect labeling substances.

그러므로, 이러한 표지물질을 석유제품 제조 회사에서 제품을 유통시키기 전에 석유에 일정 농도의 표지 물질을 첨가해 놓으면 유통 중에 형광을 정량적으로 검출하여 표지물질의 농도를 확인함으로써 다른 회사의 저가품 또는 세금을 내지 않은 탈세품과 바꿔 치기 되었는가의 여부를 알 수 있고, 효능이 확인되지 않은 저급의 석유와의 혼합 여부를 확인할 수 있게 된다. Therefore, if a certain concentration of labeling material is added to petroleum before petroleum product manufacturing company distributes the product, fluorescence is quantitatively detected during distribution to check the concentration of labeling material, thereby reducing other companies' low-cost goods or taxes. It will be able to know whether it is replaced with a tax evasion product which has not been used, and it will be possible to check whether it is mixed with low-grade oil whose efficacy has not been confirmed.

석유제품을 표지하기 위한 형광염료에 대해서는 미국특허 제5,980,593호에 개시된 바 있다. 그러나, 상기 형광염료는 그 가격이 매우 고가이고 수입품이어서 실질적으로 사용하기에는 적지 않은 부담이 있다. Fluorescent dyes for labeling petroleum products have been disclosed in US Pat. No. 5,980,593. However, since the fluorescent dye is very expensive and imported, there is a considerable burden for practical use.

현재까지는 석유제품으로부터 형광염료를 검출하는 방법에 있어서는 알칼리 용액을 사용하여 에스테르 결합을 분해하는 화학적인 방법이 사용되고 있다. 그러나, 상기 방법을 통해 특정 염료를 검출하는 과정에 있어서, 염료가 파괴되어 정량이 불가능한 경우도 있어 선택할 수 있는 염료의 폭이 매우 좁다. 또한, 표지물질로서의 형광염료 이외에 석유 자체에 이미 함유되어 있는 염료가 알칼리 용액에 의하여 형광 물질와 함께 추출되어 나오게 되므로 형광 물질의 정확한 정량이 불가능하다. Until now, in the method of detecting fluorescent dyes from petroleum products, chemical methods of decomposing ester bonds using alkaline solutions have been used. However, in the process of detecting a specific dye through the above method, the dye may be destroyed and quantitatively impossible, so the width of the dye that can be selected is very narrow. In addition, since the dye already contained in petroleum itself as the labeling substance is extracted with the fluorescent substance by alkaline solution, accurate quantification of the fluorescent substance is impossible.

게다가, 상기 알칼리 용액을 사용한 검출 방법에서는 별도로 가열 장치 및 촉매제가 필요하게 되므로, 형광 물질의 검출 과정이 길어지고 그 효율성에 문제가 있다. 또한, 상기 에스테르 결합은 매우 안정한 결합이므로, 알칼리 용액을 사용하는 방법으로는 에스테르 결합보다 덜 안정한 화학결합은 모두 분해되므로 형광마 커로서 사용될 수 있는 표지물질은 상기 명세서에 개시된 것만으로 제한될 수 밖에 없다.In addition, since the heating method and the catalyst are required separately in the detection method using the alkaline solution, the detection process of the fluorescent material is lengthened and there is a problem in the efficiency thereof. In addition, since the ester bond is a very stable bond, by using an alkaline solution, all of the less stable chemical bonds than the ester bond are decomposed, so that the labeling material that can be used as a fluorescent marker can only be limited to those disclosed in the above specification. none.

본 발명의 목적은 형광 물질에 중합체가 결합된 형광 표지 물질을 유류 제품에 첨가하여 표지하고, 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리하여 분리된 형광 물질로부터 특정 파장의 형광을 검출할 수 있는 유류 제품 식별 방법을 제공하는 것이다.An object of the present invention is to add and label a fluorescent labeling substance in which a polymer is bound to a fluorescent substance to an oil product, and to detect an fluorescence of a specific wavelength from the separated fluorescent substance by separating an fluorescent substance and a polymer using an enzyme. To provide an identification method.

본 발명의 또 다른 목적은 유류 제품에 형광 물질와 중합체가 결합된 형광 표지 물질을 첨가하여 표지하고, 중합체가 결합된 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리하여 분리된 형광 물질로부터 특정 파장의 형광을 검출할 수 있는 유류 제품 식별 방법을 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to label fluorescent oil by adding a fluorescent labeling substance combined with a fluorescent substance and a polymer to an oil product, and to detect fluorescence of a specific wavelength from the separated fluorescent substance by separating the fluorescent substance and the polymer using an enzyme having a polymer bound thereto. To provide a way to identify oil products that can be done.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 또 다른 목적은 유류 제품에 형광 물질와 중합체가 결합된 형광 물질을 첨가하여 표지하고, 효소 또는 중합체가 결합된 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리하여 발생된 특정파장의 형광을 검출하는 것으로 이루어지는 유류제품의 식별 방법에 있어서, 특정 탄화수소 중합체가 결합된 은닉 표지 물질을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is another object of the present invention is to label by adding a fluorescent material and a polymer conjugated fluorescent material to the oil product, and the specific substance generated by separating the fluorescent material and the polymer using an enzyme or polymer-bound enzyme In the oil product identification method which consists of detecting the fluorescence of a wavelength, it is providing the hidden label material which specific hydrocarbon polymer couple | bonded.

본 발명의 또 다른 목적은 유류 제품에 형광 물질와 중합체가 결합된 형광 물질을 첨가하여 표지하고, 효소 또는 중합체가 결합된 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리하여 발생된 특정 파장의 형광을 검출하는 것으로 이루어지는 유류제품의 식별 방법에 있어서, 상기의 형광 물질와 중합체가 결합된 표지물질을 형 광 물질과 중합체를 분리할 수 있는 효소를 제공하는 것이다.It is still another object of the present invention to add a fluorescent material combined with a fluorescent material and a polymer to label an oil product, and to detect fluorescence of a specific wavelength generated by separating the fluorescent material and the polymer using an enzyme or an enzyme combined with a polymer. In the identification method of the oil product which consists of these, it is providing the label | marker which the said fluorescent substance and polymer couple | bonded, and the enzyme which can separate a fluorescent substance and a polymer.

본 발명의 또 다른 목적은 유류 제품에 형광 물질과 중합체가 결합된 형광 물질을 첨가하여 표지하고, 효소 또는 중합체가 결합된 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리하여 발생된 특정 파장의 형광을 검출하는 것으로 이루어지는 유류제품의 식별 방법에 있어서, 상기의 형광 물질와 중합체가 결합된 표지물질을 형광 물질와 중합체와 분리할 수 있는 중합체가 결합된 효소를 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to add a fluorescent material and a fluorescent material combined with a fluorescent material to an oil product, and to detect fluorescence of a specific wavelength generated by separating the fluorescent material and the polymer using an enzyme or an enzyme combined with a polymer. An oil product identification method comprising: an enzyme in which a polymer capable of separating a labeling substance in which the fluorescent substance and a polymer are bound to a fluorescent substance and a polymer is bound.

본 발명의 목적은 유류 제품에 형광 물질에 중합체가 결합된 형광 표지 물질은 첨가하여 표지하는 단계, 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리시키는 단계, 분리된 형광 물질로부터 특정 파장의 형광을 검출하는 단계를 포함하는 유류 제품 식별 방법을 제공함으로써 달성된다.An object of the present invention is to add and label a fluorescent labeling material in which a polymer is bound to a fluorescent material in an oil product, to separate the fluorescent material and the polymer using an enzyme, and to detect fluorescence of a specific wavelength from the separated fluorescent material. It is achieved by providing an oil product identification method comprising a.

본 발명의 또 다른 목적은 유류 제품에 형광 물질에 중합체가 결합된 형광 표지 물질은 첨가하여 표지하는 단계, 중합체가 결합된 효소를 사용하여 형광 물질와 중합체를 분리시키는 단계, 분리된 형광 물질로부터 특정 파장의 형광을 검출하는 단계를 제공하는 것이다.Still another object of the present invention is to add and label a fluorescent labeling substance in which a polymer is bound to a fluorescent substance in an oil product, to separate the fluorescent substance and the polymer using an enzyme to which the polymer is bound, and to obtain a specific wavelength from the separated fluorescent substance. It is to provide a step of detecting the fluorescence of.

본 발명의 방법에 있어서, 표지 물질이라 함은 형광 물질의 분자 구조에서 수산기와 같은 반응성이 있는 반응기에 탄화수소 중합체를 에스테르 결합을 통하여 결합한 형광 물질의 유도체를 말한다. 상기 형광 물질은 형광을 내는 화합물이라면 어떠한 것이라도 사용될 수 있으며, 특히, 본 발명에서 표지 물질의 검출은 에스테르 결합만을 특이적으로 분해하는 효소를 이용하기 때문에 표지 물질로서는 형 광을 나타내는 물질이라면 어떠한 것이라도 제한되지 않는다. 특히, 수산화기를 가지는 레소루핀 계통의 형광염료, 플루오레세인 또는 쿠마린 계통의 형광염료가 사용될 수 있다. In the method of the present invention, the labeling substance refers to a derivative of the fluorescent substance in which a hydrocarbon polymer is bonded via an ester bond to a reactive reactor such as a hydroxyl group in the molecular structure of the fluorescent substance. The fluorescent material may be any compound as long as it is a fluorescent compound. In particular, since the detection of the labeling material in the present invention uses an enzyme that specifically decomposes only an ester bond, any labeling material may be used as long as it is a fluorescent material. Nor is it limited. In particular, fluorescent dyes of the resorupine-based fluorescent dyes, fluorescein or coumarin-based fluorescent dyes may be used.

상기 형광 물질을 에스테르 결합을 통하여 결합시킨 표지 물질들은 다음과 같은 일반식을 갖는다.Labeling materials in which the fluorescent material is bound through an ester bond have the following general formula.

a) 하기의 구조식을 갖는 표지물질 쿠마린 에스테르 a) Labeling substance coumarin ester having the following structural formula

Figure 112001013776267-pat00014
Figure 112001013776267-pat00014

상기 식에서, R3은 C4-C18의 알킬이며, R4는 수소 또는 메틸 또는 트리플루오로메틸이며, R5은 수소 또는 할로겐 원소 또는 시아노기(-CN)이다. 바람직하게는, R3은 C15H31이며, R4는 메틸, R5는 염소이다. 상기 식에서 R3은 표지물질이 유기용매에 잘 녹도록 해주는 역할을 한다.Wherein R 3 is alkyl of C 4 -C 18 , R 4 is hydrogen or methyl or trifluoromethyl, and R 5 is hydrogen or a halogen element or a cyano group (—CN). Preferably, R 3 is C 15 H 31 , R 4 is methyl and R 5 is chlorine. In the above formula R 3 serves to make the labeling material well soluble in the organic solvent.

b) 하기의 구조식을 갖는 표지 물질 레소루핀 에스테르b) a labeling substance resorupine ester having the structure

Figure 112001013776267-pat00015
Figure 112001013776267-pat00015

상기식에서, R3 는 C4-C18의 알킬이며, R4는 수소 또는 메틸 또는 트리플루오 로메틸이며, R5는 수소 또는 할로겐 원소 또는 시아노기(-CN)이다.Wherein R 3 is C 4 -C 18 alkyl, R 4 is hydrogen or methyl or trifluoromethyl, and R 5 is hydrogen or halogen or cyano group (—CN).

c) 하기의 구조식을 갖는 표지 물질 플루오레세인 에스테르c) Labeling substance fluorescein ester having the structure

Figure 112001013776267-pat00016
Figure 112001013776267-pat00016

상기 식에서, R6 및 R7은 같거나 다를 수 있으며 C19-C24의 알킬이다. 상기 식에서, R6 및 R7은 상기 표지물질이 유기용매에 잘 녹도록 해주는 역할을 한다.Wherein R 6 and R 7 may be the same or different and are C 19 -C 24 alkyl. In the above formula, R 6 and R 7 serves to make the labeling material well soluble in the organic solvent.

상기의 표지 물질은 7-하이드록시-4-트리플루오로메틸 쿠마린(7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin), 7-하이드록시 쿠마린(7-hydroxy coumarin), 3-시아노-7-하이드록시-4-메틸 쿠마린(3-cyano-7-hydroxy-4-methyl coumarin), 4-하이드록시 쿠마린(4-hydroxy coumarin), 7-하이드록시-4-메틸 쿠마린(7-hydroxyl-4-methyl coumarin), 3-클로로-7-하이드록시-4-메틸 쿠마린(3-chloro-7-hydroxy-4-methyl coumarin, US 5980593), 레소루핀, 플루오레세인(fouorescein. US 5498808)를 포함하는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 한다.The labeling substance is 7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin, 7-hydroxy coumarin, 3-cyano-7-hydroxy- 4-methyl coumarin (3-cyano-7-hydroxy-4-methyl coumarin), 4-hydroxy coumarin (4-hydroxy coumarin), 7-hydroxy-4-methyl coumarin , 3-chloro-7-hydroxy-4-methyl coumarin (3-chloro-7-hydroxy-4-methyl coumarin, US 5980593), lesorupine, fouorescein. US 5498808 It is characterized by being.

본 발명의 방법에 있어서, 상기의 표지 물질이 첨가될 수 있는 유류 제품은 자동차용 휘발유, 자동차용 액화천연가스, 액화석유가스 또는 각종 원동기용 중유등이 있으며, 나아가 각종 연료용 석유(등유), 연료용 액화천연가스, 액화석유가스 및 연료용 중유 제품에까지 확대될 수 있다. 다시 말해, 본 발명의 방법을 통해서 벤젠, 톨루엔, 솔벤트등의 화공약품을 혼합하여 제조하는 가짜 휘발유 이외에도, 유류 제품의 상표권자를 포함한 적법한 공급자 이외의 자가 생산 공급하는 휘발유를 포함하여 각종 원동기용, 연료용 모든 유류 제품을 식별해 낼 수 있게 된다.In the method of the present invention, the oil product to which the labeling substance may be added is gasoline for automobile, liquefied natural gas for automobile, liquefied petroleum gas or heavy oil for various prime movers, and the like. It can be extended to liquefied natural gas for fuel, liquefied petroleum gas and heavy oil products for fuel. In other words, in addition to fake gasoline produced by mixing chemicals such as benzene, toluene, and solvent through the method of the present invention, various prime movers, fuels, including gasoline produced and supplied by a non-legal supplier including a trademark owner of oil products All oil products can be identified.

본 발명에서 표지물질은 유류 제품에 0.01ppm 내지 30ppm, 바람직하게는 0.05ppm 내지 10ppm 첨가하는 것이 적당하다. 유류 제품속의 상기 표지 물질들은 검출시에 각각 다른 빛의 형광을 발생시키기 때문에, 2종의 표지 물질을 적절한 비율로 섞어서 유류 제품를 표지하고 두 가지 표지 물질이 동시에 형광을 내도록 하면 서로 다른 빛이 혼합된 제 3의 빛을 볼 수 있게 되므로, 예를 들면 휘발유와 경유 제품을 각각 서로 다른 색으로 표지하는 것이 가능하게 된다. In the present invention, the labeling material is suitably added to the oil product 0.01ppm to 30ppm, preferably 0.05ppm to 10ppm. Since the labeling substances in the oil product generate different light fluorescence upon detection, the labeling of the oil product by mixing two labeling substances in an appropriate ratio and allowing the two labeling substances to fluoresce at the same time may cause different light to be mixed. Since the third light can be seen, for example, it is possible to label gasoline and diesel products in different colors, respectively.

또한, 상기 표지 물질들은 미리 정해진 농도로 유류 제품에 첨가되기 때문에, 표지 물질의 정량적인 검출이 가능하여, 시료 속에 표지된 유류제품이 어떤 농도로 들어 있는지 알 수 있다. 상기 표지 물질들을 정량으로 정품 휘발유에 미리 넣으면 표지 물질로부터 발생되는 형광을 통하여 정품여부 및 그 형광의 밝기를 비교하여 가짜 휘발유와의 혼합 여부를 쉽게 확인할 수 있다. In addition, since the labeling substances are added to the oil product at a predetermined concentration, quantitative detection of the labeling substance is possible, so that the concentration of the labeled oil product in the sample can be known. When the labeling substances are quantitatively added to the gasoline in advance, it is easy to check whether the labeling is mixed with the fake gasoline by comparing the brightness of the genuine substance and the brightness of the fluorescence through the fluorescence generated from the labeling substance.

본 발명의 방법에 있어서, 표지 물질을 검출하기 위하여 에스테르 결합을 가수분해할 수 있는 효소를 사용한다. 일정 농도의 효소가 함유된 pH 7이상의 수성 조성물을 각 검출키트 용기에 정량 분주한 후 동결건조 하여 유기용매와의 접촉성과 검출 반응의 재현성을 증가시켰다. 효소를 동결 건조하여 반응의 재현성을 증가시키는 방법은 대한민국특허 제162270호에 개시된 바 있다. In the method of the present invention, enzymes capable of hydrolyzing ester bonds are used to detect labeling substances. Aqueous compositions of pH 7 or higher containing a certain concentration of enzyme were quantitatively dispensed into each detection kit container and lyophilized to increase the contact with the organic solvent and the reproducibility of the detection reaction. The method of increasing the reproducibility of the reaction by freeze drying the enzyme has been disclosed in Korean Patent No. 162270.

상기 효소는 에스테르 결합을 특이적으로 가수분해할 수 있는 효소로서, 리 파아제(lipase), 에스테라아제(esterase), 셀룰라아제 (cellulase)등에서 선택된다. 이는 여러 미생물이나 가축의 내장으로부터 생산하여 사용할 수 있다. 이들은 대부분 50℃이상의 비교적 고온에서 작용하는 효소들로 열에 안정하여 보관이 용이하고 특히, 리파아제는 생명체 내에서 지방에 대한 소화효소로 작용하는 만큼 다른 효소에 비하여 유기 용매에서 안정하다. The enzyme is an enzyme capable of specifically hydrolyzing an ester bond, and is selected from lipase, esterase, cellulase and the like. It can be produced and used from the intestines of various microorganisms or livestock. Most of them are enzymes that operate at relatively high temperatures of 50 ° C. or higher and are thermally stable for easy storage. In particular, lipases are stable in organic solvents compared to other enzymes as they function as digestive enzymes for fats in living organisms.

또한, 본 발명의 방법에 있어서, 표지물질을 검출하기 위하여 중합체가 결합된 효소를 사용할 수 있다. 이는 효소의 유기 용매에 대한 용해도를 높이고 안정화시키기 위한 것이다.  In addition, in the method of the present invention, an enzyme in which a polymer is bound may be used to detect a label. This is to increase and stabilize the solubility of the enzyme in the organic solvent.

효소와 결합되는 탄화수소중합체로는 분자량이 2000달톤 이상인 것이 사용될 수 있으며, 특히 폴리에틸렌글리콜(PEG), 트리톤 엑스(Triton X)등이 사용될 수 있다. As the hydrocarbon polymer combined with the enzyme, a molecular weight of 2000 Daltons or more may be used, and in particular, polyethylene glycol (PEG), Triton X, or the like may be used.

상기 효소와 중합체의 연결체로 쓰이는 화합물은 아미노산의 아민기 또는, 황화수소기 또는 수산화기와 반응할 수 있는 부분 및 중합체의 수산화기와 반응할 수 있는 부분을 모두 가지고 있는 화합물들이 바람직하게 사용될 수 있다. 시아누릭 클로라이드(Cyanuric Chloride)와 같은 연결체를 사용하여 중합체를 결합시킨 효소는 하기의 구조식을 갖는다.The compound used as the linkage between the enzyme and the polymer may preferably be used as a compound having both an amine group of an amino acid or a part capable of reacting with a hydrogen sulfide group or a hydroxyl group and a part capable of reacting with a hydroxyl group of the polymer. An enzyme bound to a polymer using a linker such as cyanuric chloride has the following structural formula.

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효소와 중합체의 결합 반응은 효소에 있어서는 아미노산인 리신이 1:1로 결합할 수도 있고, 2:1로도 결합할 수도 있다. 이는 효소를 구성하고 있는 리신의 갯수에 따라서 중합체와 효소의 혼합 비율이 달라진다.In the binding reaction between the enzyme and the polymer, lysine, which is an amino acid, may be 1: 1 in the enzyme or 2: 1 in the enzyme. The mixing ratio of the polymer and the enzyme varies depending on the number of lysines constituting the enzyme.

효소와 중합체를 결합하여 생성된 검출 물질용 조성물은 첫째, 효소의 기능을 상실시키는 프로테아제(protease)의 접근을 막아주고, 둘째, 수용액 내에서 물분자와 수소결합을 통하여 3차원적 구조를 이룰 수 있는 환경을 유기 용매내에서도 형성하여 유기 용매에서의 효소 활성이 크게 향상되며, 셋째, 온도 상승에 의하여 효소의 소수성 부분이 외부 용액에 노출됨으로써 야기되는 단백질의 3차원 구조의 파괴를 탄화수소중합체가 막아 주어 유기 용매에 상온 보관하여도 3개월이상 활성을 갖는 이점이 있다(Inada, Y. et al.1986.)The composition for the detection substance produced by combining the enzyme and the polymer firstly prevents the access of the protease that loses the function of the enzyme, and secondly, it can form a three-dimensional structure through hydrogen bonding with water molecules in an aqueous solution. Enzymatic activity in organic solvents is greatly improved by forming an environment in organic solvents. Third, hydrocarbon polymers prevent the breakdown of the three-dimensional structure of proteins caused by exposure of hydrophobic portions of enzymes to external solutions due to temperature rise. Even when stored at room temperature in an organic solvent there is an advantage that the activity has more than three months (Inada, Y. et al. 1986.)

상기 중합체 결합 효소가 함유된 pH7이상의 수성 조성물이 표지물질 검출용 조성물로서 사용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 수용액을 동결건조시켜 사용한다.An aqueous composition having a pH of 7 or more containing the polymer binding enzyme may be used as a composition for detecting a label, and preferably, the aqueous solution is lyophilized.

표지물질이 함유되어 있는 유류제품에 상기 효소 함유 수성 조성물을 적당한 비율로 가하여 잘 섞어준 후 수용액 층에 특정 파장의 빛을 조사하면 다시 특정 파장의 빛을 발하게 된다. 이때 방출되는 빛은 가시광선의 것이 많은데, 레소루핀은 붉은빛을 내고 플루오레세인은 초록빛, 쿠마린은 푸른빛을 낸다. 형광 발생은 에스테르 결합 분해 효소가 표지물질의 에스테르 결합을 가수분해함으로써 발생된다. 효소는 물에 녹아 있는 상태에서 물을 이용하여 오일층에 녹아있는 표지물질의 에스테르 결합을 끊어야 하므로 물과 석유 층의 계면에서 반응이 일어나게 되어 탄화 수소 사슬이 끊어진 형광염료는 물층으로 녹아 나오게 되고 형광 광도계를 이용하여 물층에서 형광을 검출한다. 더욱이, 휴대용 형광 광도계 같은 기기를 사용하게 되면 석유 속의 형광염료 농도를 정확하게 정량할 수 있다.The enzyme-containing aqueous composition is added to the oil product containing the labeling agent at an appropriate ratio, mixed well, and then irradiated with light of a specific wavelength to the aqueous solution layer to emit light of a specific wavelength. At this time, the emitted light is a lot of visible light, Lesorupin is red, fluorescein green, coumarin blue. Fluorescence is generated by the ester bond degrading enzyme hydrolyzing the ester bond of the label. Since the enzyme must dissolve the ester bonds of the labeling substance dissolved in the oil layer by using water in the state dissolved in water, the reaction occurs at the interface between the water and the oil layer. Fluorescence is detected in the water layer using a photometer. Moreover, using a device such as a portable fluorescence photometer can accurately quantify the concentration of fluorescent dyes in petroleum.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만 본 발명의 범위가 하기의 실기예로 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to preferred examples, but the scope of the present invention is not limited to the following practical examples.

실시예 1Example 1

레소루핀 디팔미테이트(resorufin dipalmitate) 표지물질 합성Synthesis of Resorufin Dipalmitate Marker

250mL 플라스크에 레소루핀 1.6g을 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofurane) 40mL에 녹인 후 탄산 칼륨 3.1g 과 트리에틸아민 (triethylamine) 3.1ml 넣는다. 30분 후 팔미토일 클로라이드 (palmitoyl chloride) 7.0mL을 넣고 상온에서 2시간 교반한 다음 증류수 50ml 와 에틸아세테이트(ethyl acetate)250ml 넣고 에틸아세테이트 층으로 추출해 내었다. 에틸 아세테이트를 소금물 200ml로 씻은후 유기층을 무수망간으로 건조한다. 용매를 증발 증류하고 남은 잔유물을 핵산(Hexane)과 에틸아세테이트로 재결정하여 붉은색의 목적물질을 얻었다. In a 250 mL flask, 1.6 g of resorphine was dissolved in 40 mL of tetrahydrofurane, and then 3.1 g of potassium carbonate and 3.1 ml of triethylamine were added thereto. After 30 minutes, add 7.0 mL of palmitoyl chloride and stir at room temperature for 2 hours. 250 ml of ethyl acetate was added and extracted with an ethyl acetate layer. The ethyl acetate was washed with 200 ml of brine and the organic layer was dried over anhydrous manganese. The solvent was evaporated and distilled, and the residue was recrystallized from nucleic acid (Hexane) and ethyl acetate to obtain a red target substance.

실시예 2Example 2

플루오레세인 디팔미테이트(resorufin dipalmitate) 표지물질 합성Synthesis of Fluorescein Dipalmitate Marker

250 mL 플라스크에 플루오레세인 2.5g을 테트라하이드로퓨란 (tetrahydrofurane) 40mL에 녹인 후 탄산 칼륨 3.1g 과 트리에틸아민 (triethylamine) 3.1ml 넣는다. 30분 후 팔미토일 클로라이드 (palmitoyl chloride) 7.0mL을 넣고 상온에서 2시간 교반한 다음 증류수 50ml 와 에틸아세테이 트(ethyl acetate)250ml 넣고 에틸아세테이트 층으로 추출해 내었다. 에틸 아세테이트를 소금물 200ml로 씻은후 유기층을 무수망간으로 건조한다. 용매를 증발 증류하고 남은 잔유물을 핵산(Hexane)과 에틸아세테이트로 재결정하여 살색의 목적물질을 얻었다. In a 250 mL flask, 2.5 g of fluorescein was dissolved in 40 mL of tetrahydrofurane, followed by 3.1 g of potassium carbonate and triethylamine. Add 3.1ml. After 30 minutes, 7.0 mL of palmitoyl chloride was added, stirred at room temperature for 2 hours, and 50 ml of distilled water and 250 ml of ethyl acetate were added and extracted with an ethyl acetate layer. The ethyl acetate was washed with 200 ml of brine and the organic layer was dried over anhydrous manganese. The solvent was evaporated and distilled, and the residue was recrystallized from nucleic acid (Hexane) and ethyl acetate to obtain a fleshy target substance.

실시예 3 Example 3

3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린팔미테이트(3-chloro-4-methyl-7-hydroxy coumarin palmitate) 표지물질 합성Synthesis of 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate labeling substance

250 mL 플라스크에 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 2.5g을 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofurane) 60mL에 녹인 후 탄산 칼륨 3.6g 과 트리에틸아민 (triethylamine) 3.6ml 넣는다. 30분 후 팔미토일 클로라이드 (palmitoyl chloride) 10.0mL을 넣고 상온에서 2시간 교반한 다음 증류수 50ml 와 에틸아세테이트(ethyl acetate) 250ml 넣고 에틸아세테이트 층으로 추출해 내었다. 에틸 아세테이트를 소금물 200ml로 씻은후 유기층을 무수망간으로 건조한다. 용매를 증발 증류하고 남은 잔유물을 핵산(Hexane)과 에틸아세테이트으로 재결정하여 흰색의 목적물질을 얻었다.In a 250 mL flask, 2.5 g of 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin was dissolved in 60 mL of tetrahydrofurane, and 3.6 g of potassium carbonate and 3.6 ml of triethylamine were added thereto. After 30 minutes, 10.0 mL of palmitoyl chloride was added, stirred at room temperature for 2 hours, and then 50 ml of distilled water. 250 ml of ethyl acetate was added and extracted with ethyl acetate layer. The ethyl acetate was washed with 200 ml of brine and the organic layer was dried over anhydrous manganese. The solvent was evaporated and distilled, and the residue was recrystallized from nucleic acid (Hexane) and ethyl acetate to obtain a white target substance.

실시예 4Example 4

7-하이드록시쿠마린 팔미테이트(7-hydroxy coumarin palmitate) 표지물질 합성Synthesis of 7-hydroxy coumarin palmitate marker

500 mL 플라스크에 7-하이드록시쿠마린 1.0g을 피리딘(pyridine) 100mL에 녹인 후 과량의 팔미토일 클로라이드(palmitoyl chloride) 2.9mL을 넣고 상온에서 섞 어 주었다. 3시간 반응 후 진공 속에서 피리딘을 증발시켜 제거한 후 증류수와 메틸렌 클로라이드(methylene chloride)를 1:1의 비율로 넣어 메틸렌 클로라이드 층으로 추출해 내었다. 메틸렌 클로라이드만를 용매로 사용하여 크로마토그래피를 거쳐 가장 먼저 나오는 합성물을 취하였다. 이 합성물의 용매를 제거하여 흰색의 목적물질을 얻었다. 1.0 g of 7-hydroxycoumarin was dissolved in 100 mL of pyridine in a 500 mL flask, and 2.9 mL of excess palmitoyl chloride was added and mixed at room temperature. After the reaction for 3 hours, pyridine was removed by evaporation in vacuo, and distilled water and methylene chloride were added in a ratio of 1: 1 to extract the methylene chloride layer. Chromatography was taken first using methylene chloride alone as solvent. The solvent of this compound was removed to obtain a white target substance.

실시예 5Example 5

3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 라우레이트(3-chloro-4-methyl-7-hydroxy coumarin laurate) 표지물질 합성Synthesis of 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin laurate

250 mL 플라스크에 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 2.5g을 테트라하이드로퓨란(tetrahydrofurane) 60mL에 녹인 후 탄산 칼륨 3.6g 과 트리에틸아민 (triethylamine) 3.6ml 넣는다. 30분 후 라우로일 클로라이드 (Lauroyl chloride) 8.0mL을 넣고 상온에서 2시간 교반한 다음 증류수 50ml 와 에틸아세테이트(ethyl acetate) 250ml로 넣고 에틸아세테이트 층으로 추출해 내었다. 에틸 아세테이트를 소금물 200ml 씻은후 유기층을 무수망간으로 건조한다. 용매를 증발 증류하고 남은 잔유물을 핵산(Hexane)과 에틸아세테이트으로 재결정하여 흰색의 목적물질을 얻었다.In a 250 mL flask, 2.5 g of 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin was dissolved in 60 mL of tetrahydrofurane, and 3.6 g of potassium carbonate and 3.6 ml of triethylamine were added thereto. After 30 minutes, 8.0mL of lauroyl chloride was added, stirred at room temperature for 2 hours, and 50ml of distilled water and 250ml of ethyl acetate were added thereto, followed by extraction with an ethyl acetate layer. After 200 ml of ethyl acetate was washed with brine, the organic layer was dried over anhydrous manganese. The solvent was evaporated and distilled, and the residue was recrystallized from nucleic acid (Hexane) and ethyl acetate to obtain a white target substance.

실시예 6Example 6

검출물질으로서 리파아제 함유 시약 제조Preparation of lipase-containing reagents as detection substances

슈도모나스 세파치아(Pseudomonas cepacia)로부터 정제된 리파아제 1g, 염산으로 pH8.0으로 조정된 100mM 트리스(Tris) 완충액 25mL을 넣고 4℃에서 완전히 녹 인다. 2mL 튜브에 20μL씩 분주하여 Centra evaporatorTM (㈜바이오니아)로 건조시킨 후 냉장 보관하였다. Add 1 g of purified lipase from Pseudomonas cepacia, 25 mL of 100 mM Tris buffer adjusted to pH8.0 with hydrochloric acid, and dissolve completely at 4 ° C. 20 μL was dispensed into 2 mL tubes, dried with Centra evaporator ™ (Bionia), and stored in refrigeration.

실시예 7Example 7

검출물질으로서 폴리에틸렌글리콜이 결합된 리파아제 제조Preparation of Lipase with Polyethylene Glycol as Detection Material

500mL플라스크에 모노메톡시폴리에틸렌글리콜(분자량:약4,500) 20.00g, 연결체로서 시아누릭 클로라이드(cyanuric chloride) 0.37g, 및 벤전 100mL을 넣고 잘 녹인 후 NaCO3 6.5g을 넣어 80℃에서 40시간 반응 시켰다. 상기 모노메톡시폴리에틸렌글리콜은 폴리에틸렌글리콜의 양쪽 말단에 있는 반응성 수산화가 중 하나를 메톡시기로 치환함으로써 한쪽만 반응성을 가지도록 한 탄화수소중합체이다. 염을 걸러내고 용매를 제거하여 하얀 고체를 얻은 후 500mL 플라스크에 상기 얻은 고체 5g, 슈도모나스 세파치아(Pseudodomonas cepacia)로부터 정제된 리파이제 78mg, 염산으로 pH8.0으로 조정된 100mL 트리스(Tris) 완충액 25mL을 넣고 4℃에서 2시간 반응시켰다. 상기 용액을 10000달톤(dalton)이하의 물질이 빠지도록 되어 있는 필터로 걸러 반응하지 않은 폴리에틸렌글리콜을 제거한 후 1.5mL 튜브에 20mL씩 분주하여 Centra evaporatorTM((주)바이오니아)로 건조시킨 후 냉장 보관하였다. 그 후, 이것을 다음 실험에서 검출 물질로서 사용하였다.Into a 500 mL flask, 20.00 g of monomethoxypolyethylene glycol (molecular weight: about 4,500), 0.37 g of cyanuric chloride, and 100 mL of benzene were dissolved. . The monomethoxy polyethylene glycol is a hydrocarbon polymer in which only one of the reactive groups is reactive by substituting one of the reactive hydroxyl groups at both ends of the polyethylene glycol with a methoxy group. The salt was filtered off and the solvent was removed to give a white solid, then 5 g of the solid obtained in a 500 mL flask, 78 mg of purified lipase from Pseudodomonas cepacia, 25 mL of 100 mL Tris buffer adjusted to pH8.0 with hydrochloric acid. Was added and reacted at 4 ° C. for 2 hours. The solution was filtered through a filter that removes less than 10000 daltons of material, and the unreacted polyethylene glycol was removed. The solution was dispensed in 20 mL portions in a 1.5 mL tube, dried with Centra evaporator TM (Bionia), and then refrigerated. It was. This was then used as detection material in the next experiment.

실시예 8Example 8

석유 속의 레소루핀 디팔미테이트 검출 - 정성적인 검출Lesorupine dipalmitate detection in petroleum-qualitative detection

실시예 6에서 얻은 검출용 효소 혼합물에, 실시예 1에서 얻은 레소루핀 디팔 미테이트가 1ppm의 농도로 녹아 있는 석유와 증류수를 각각 1mL, 0.5mL 가하고 잘 섞어준 후, 분리된 두 층 중 수용액에서 자연광에 의해 발광되는 붉은빛을 눈으로 확인하였다.To the enzyme mixture for detection obtained in Example 6, 1 mL and 0.5 mL of petroleum and distilled water dissolved in the concentration of 1 ppm of the resorphin dipalmitate obtained in Example 1 were added and mixed well, followed by mixing in an aqueous solution of the two separated layers. The red light emitted by natural light was visually confirmed.

실시예 9Example 9

석유 속의 플루오레세인 디팔미테이트 검출 - 정성적인 검출Fluorescein dipalmitate detection in petroleum-qualitative detection

실시예 6에서 얻은 검출용 효소 혼합물에, 실시예 2에서 얻은 플루오레세인 디팔미테이트가 1ppm의 농도로 녹아 있는 석유와 증류수를 각각 1mL, 0.5mL 가하고 잘 섞어준 후, 분리된 두 층 중 수용액에서 자연광에 의해 발광되는 초록빛을 눈으로 확인하였다.To the enzyme mixture for detection obtained in Example 6, 1 mL and 0.5 mL of petroleum and distilled water in which the fluorescein dipalmitate obtained in Example 2 was dissolved at a concentration of 1 ppm were added and mixed well. Green light emitted by natural light at was visually confirmed.

실시예 10Example 10

석유 속의 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트 검출-정성적인 검출3-Chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate detection in petroleum-qualitative detection

실시예 6에서 얻은 검출용 효소 혼합물에, 실시예 3에서 얻은 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트가 10ppm의 농도로 녹아 있는 석유와 증류수를 각각 1mL, 0.5mL 가하고 잘 섞어 준 후, 분리된 두 층 중 수용액 층을 365nm 파장의 자외선을 조사하여 발광되는 푸른빛을 눈으로 확인하였다.To the enzyme mixture for detection obtained in Example 6, 1 mL and 0.5 mL of petroleum and distilled water in which 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate obtained in Example 3 was dissolved at a concentration of 10 ppm were added and mixed well. After giving, the aqueous layer of the two separated layers was irradiated with ultraviolet light of 365nm wavelength to visually confirm the blue light emitted.

실시예 11Example 11

레소루핀 디팔미테이트와 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트가 섞여 있는 석유에서의 검출- 정성적인 검출Detection in petroleum with resolupine dipalmitate and 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate-qualitative detection

실시예 1 및 3에서 얻은 레소루핀 디팔미테이트와 3-클로로-4-메틸-7-하이드 록시쿠마린 팔미테이트를 석유에 각각 1ppm, 10ppm의 농도로 녹였다. 실시예 6에서 얻은 검출용 효소 혼합물에 상기 표지물질이 녹아있는 석유와 증류수를 각각 1mL과 0.5mL 넣고 잘 섞어 준 후, 분리된 두 층 중 수용액 층을 365nm 파장의 자외선을 조사하여 발광되는 보랏빛을 눈으로 확인하였다.Resorphin dipalmitate and 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate obtained in Examples 1 and 3 were dissolved in petroleum at concentrations of 1 ppm and 10 ppm, respectively. 1 mL and 0.5 mL of petroleum and distilled water in which the labeling substance was dissolved were added to the detection enzyme mixture obtained in Example 6, respectively, and the mixture was mixed well. It was checked visually.

실시예 12Example 12

석유 속의 레소루핀 디팔미테이트 검출 - 정량적인 검출Lesorupine dipalmitate detection in petroleum-quantitative detection

실시예 1에서 얻은 표지물질을 100ppb(w/v)의 농도로 만든 실내등유를 0/100, 1/100, 2/100, 5/100, 10/100, 20/100, 50/100, 100/100배의 농도로 희석하여 각각 0ppb, 1ppb, 2ppb, 5ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb, 100ppb의 농도로 만든 후 실시예 6에서 얻은 효소 혼합물에 각각 1mL씩 분주한 후 증류수를 1.5mL씩 분주하여 잘 섞어주고, 수용액 층에 형광광도계(fluorometer)로 570nm의 빛을 조사하여 585nm에서 방출되는 빛의 양을 측정하여 그 결과를 도 1로 나타내었다. Indoor kerosene made with the labeling material obtained in Example 1 at a concentration of 100 ppb (w / v) was prepared by 0/100, 1/100, 2/100, 5/100, 10/100, 20/100, 50/100, 100 Dilute to 100 times the concentration of 0ppb, 1ppb, 2ppb, 5ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb, 100ppb, and then dispense 1mL each of the enzyme mixture obtained in Example 6, and then dispense 1.5mL of distilled water. Mix well, irradiate 570 nm light to the aqueous layer with a fluorometer (fluorometer) to measure the amount of light emitted at 585nm and the results are shown in Figure 1.

실시예 13Example 13

석유 속의 플루오레세인 디팔미테이트 검출 - 정량적인 검출Fluorescein dipalmitate detection in oil-quantitative detection

100ppb(w/v) 표지물질 석유용액을 0/100, 1/100, 2/100, 5/100, 10/100, 20/100, 50/100, 100/100배의 농도로 희석하여 각각 0ppb, 1ppb, 2ppb, 5ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb, 100ppb의 농도로 만든 후 실시 예 6에서 얻은 효소 혼합물에 각각 1mL씩 분주한 후 증류수를 1.5mL씩 분주하여 잘 섞어주고, 수용액층에 형광광도계(fluorometer)로 490nm의 빛을 조사하여 514nm에서 방출되는 빛의 양을 측정하여 그 결과를 도 2로 나타내었다. 100 ppb (w / v) labeling substance Dilute to 0/100, 1/100, 2/100, 5/100, 10/100, 20/100, 50/100, 100/100 , 1ppb, 2ppb, 5ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb, 100ppb, and then 1mL each of the enzyme mixture obtained in Example 6, and then distilled water and 1.5mL aliquots are mixed well, and the fluorescence spectrometer ( The amount of light emitted at 514 nm was measured by irradiating light of 490 nm with a fluorometer), and the results are shown in FIG. 2.                     

실시예 14 Example 14

석유 속의 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트 검출-정량적인 검출3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate detection in petroleum-quantitative detection

100ppb(w/v) 표지물질 석유용액을 0/10, 1/10, 2/10, 5/10, 10/10배의 농도로 희석하여 각각 0ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb, 100ppb의 농도로 만든 후 실시예 6에서 얻은 효소 혼합물에 1mL씩 분주하고 증류수를 1.5mL씩 분주하여 잘 섞어주고, 수용액층에 형광광도계로 350nm의 빛을 조사하여 방출되는 470nm의 빛의 세기를 측정하여 정량적인 값을 얻었다. 100 ppb (w / v) labeling substance was diluted to 0/10, 1/10, 2/10, 5/10 and 10/10 times to make 0ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb and 100ppb concentration, respectively. After dispensing 1mL by the enzyme mixture obtained in Example 6 and 1.5mL by distilled water and mix well, and quantitative value by measuring the light intensity of 470nm emitted by irradiating 350nm light with a fluorophotometer to the aqueous layer Got it.

실시예 15Example 15

석유 속의 4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트 검출-정량적인 검출4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate detection in petroleum-quantitative detection

100ppb(w/v) 표지물질 석유용액을 0/10, 1/10, 2/10, 5/10, 10/10배의 농도로 희석하여 각각 0ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb, 100ppb의 농도로 만든 후 실시예 6에서 얻은 효소 혼합물에 1mL씩 분주하고 증류수를 1.5mL씩 분주하여 잘 섞어주고, 수용액층에 형광광도계로 365nm의 빛을 조사하여 방출되는 470nm의 빛의 세기를 측정하여 정량적인 값을 얻었다. 100 ppb (w / v) labeling substance was diluted to 0/10, 1/10, 2/10, 5/10 and 10/10 times to make 0ppb, 10ppb, 20ppb, 50ppb and 100ppb concentration, respectively. After dispensing 1mL to each of the enzyme mixture obtained in Example 6 and 1.5mL each of distilled water and mix well, and quantitative value by measuring the light intensity of 470nm emitted by irradiating 365nm light to the aqueous solution layer with a fluorophotometer Got it.

실시예 16Example 16

석유 속의 플루오레세인 디팔미테이트 검출-정성적인 검출Fluorescein dipalmitate detection in petroleum-qualitative detection

실시예 7에서 얻은 검출용 효소 조성물에, 실시예 2에서 얻은 플로오레세인 디팔미테이트가 10ppm의 농도로 녹아 있는 석유와 증류수를 동일한 비율로 가하고 잘 섞어 준 후, 분리된 두 층 수용액 층을 365nm 파장의 자외선을 조사하여 발광되 는 푸른 빛을 눈으로 확인하였다.To the enzyme composition for detection obtained in Example 7, petroleum and distilled water in which the fluorescein dipalmitate obtained in Example 2 was dissolved at a concentration of 10 ppm was added at the same ratio and mixed well, and then the separated two aqueous layers were separated by 365 nm. The blue light emitted by irradiating the ultraviolet light of the wavelength was visually confirmed.

실시예 17Example 17

석유 속의 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트 검출-정성적인 검출3-Chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate detection in petroleum-qualitative detection

실시예 7에서 얻은 검출용 효소 혼합물에, 실시예 3에서 얻은 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트가 10ppm의 농도로 녹아 있는 석유와 증류수를 동일한 비율로 가하고 잘 섞어준 후, 분리된 두 충 중 수용액 층을 365nm 파장의 자외선을 조사하여 발광되는 푸른 빛을 눈으로 확인하였다.To the enzyme mixture for detection obtained in Example 7, 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate obtained in Example 3 was dissolved in 10 ppm of petroleum and distilled water in the same ratio and mixed well. In addition, the two aqueous layers of the packed aqueous solution were irradiated with ultraviolet light of 365 nm wavelength, and blue light emitted was visually confirmed.

실시예 18Example 18

플루오레세인 디팔미테이트와 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트가 섞여 있는 석유에서의 검출-정성적인 검출Detection in petroleum with fluorescein dipalmitate and 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate-qualitative detection

실시예 2 및 3에서 얻은 플루오레세인 디팔미테이트와 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트를 석유에 각각 10ppm의 농도로 녹였다. 실시예 7에서 얻은 검출용 효소 혼합물에 상기 표지물질이 녹아 있는 석유와 증류슈를 동일한 비율로 넣고 잘 섞어준 후, 분리된 두 층 중 수용액 층을 365nm 파장의 자외선을 조사하여 발광되는 연두빛을 눈으로 확인하였다.Fluorescein dipalmitate and 3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate obtained in Examples 2 and 3 were dissolved in petroleum at a concentration of 10 ppm each. After mixing the petroleum and distilled shoe in which the labeling substance is dissolved in the same ratio in the detection enzyme mixture obtained in Example 7 and mixing well, the light green color is emitted by irradiating UV light of 365 nm wavelength to the aqueous layer of the two separated layers. It was confirmed.

실시예 19Example 19

석유속의 플루오레세인 디팔미테이트 검출-정량적인 검출Fluorescein dipalmitate detection in petroleum-quantitative detection

250ppm(w/v) 표지 물질 석유 용액을 1, 1/2, 1/4, 1/8,1/16, 1/32배의 농도로 희석하여 각각 250ppm, 125ppm, 62.5ppm, 31.3ppm, 15.6ppm, 7.8ppm 농도로 만 든 후 실시예 7에서 얻은 효소 혼합물에 각각 0.5mL씩 분주한 후 증류수를 0.6mL씩 분주하여 잘 섞어 주고, 수용액 층의 0.5mL을 4배 희석한 후, JASCO사의 FP-750 형광광도계(spectrofluorometer)로 방출되는 빛의 양을 측정하여 그 결과를 도 4 및 도 5로 나타내었다. 480nm의 빛을 조사하여 농도에 따른 밝기의 선형적인 데이터를 얻었다.Dilute 250 ppm (w / v) labeling petroleum solution to concentrations of 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, and 1/32 times, respectively, at 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm, 31.3 ppm, 15.6 After making the concentration of ppm, 7.8ppm, 0.5mL each of the enzyme mixture obtained in Example 7 was added, and 0.6mL of distilled water was mixed and mixed well.After diluting 0.5mL of the aqueous layer 4 times, FP of JASCO Co., Ltd. The amount of light emitted by the -750 spectrofluorometer was measured and the results are shown in FIGS. 4 and 5. The light of 480nm was irradiated to obtain linear data of brightness according to the concentration.

실시예 20Example 20

석유 속의 3-클로로-4-메틸-7-하이드록시쿠마린 팔미테이트 검출-정량적인 검출3-chloro-4-methyl-7-hydroxycoumarin palmitate detection in petroleum-quantitative detection

250ppm(w/v) 표지 물질 석유 용액을 1, 1/2, 1/4, 1/8,1/16, 1/32배의 농도로 희석하여 각각 250ppm, 125ppm, 62.5ppm, 31.3ppm, 15.6ppm, 7.8ppm 농도로 만든 후 실시예 7에서 얻은 효소 혼합물에 각각 0.5mL씩 분주한 후 증류수를 0.6mL씩 분주하여 잘 섞어 주고, 수용액 층의 0.5mL을 4배 희석한 후, JASCO사의 FP-750 형광광도계(spectrofluorometer)로 방출되는 빛의 양을 측정하였다. 350nm의 빛을 조사하여 470nm에서 최대 방출도를 얻었다. (도 4 및 도 5)Dilute 250 ppm (w / v) labeling petroleum solution to concentrations of 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, and 1/32 times, respectively, at 250 ppm, 125 ppm, 62.5 ppm, 31.3 ppm, 15.6 After making the concentration of ppm and 7.8ppm, each 0.5mL was added to the enzyme mixture obtained in Example 7, and then 0.6mL of distilled water was mixed and mixed well.After diluting 0.5mL of the aqueous layer 4 times, FP- The amount of light emitted by the 750 spectrofluorometer was measured. Irradiation at 350 nm gave maximum emission at 470 nm. (Figures 4 and 5)

본 발명의 방법은 에스테르 결합만을 특이적으로 분해할 수 있는 효소를 사용하여 표지물질을 검출하기 때문에 유류제품에 내재된 형광물질에 의한 배경 신호(background signal)을 현저하게 줄일 수 있으므로 매우 높은 감도를 가지게 된다. 또한, 에스테르 결합 분해효소는 에스테르 결합만 특이적으로 분해시키기 때문에 단순히 유류제품에 효소 용액만을 가하면 되므로 처리공정이 매우 간단하고 쉽게 검출이 가능하고, 본 발명의 효소를 표지물질의 검출에 사용할 경우 석유중의 여러 가지 표지물질을 동시에 간편하게 검출할 수 있다. Since the method of the present invention detects a label using an enzyme capable of specifically decomposing only ester bonds, the background signal due to the fluorescent material inherent in an oil product can be remarkably reduced. Have. In addition, since the ester bond degrading enzyme specifically decomposes only the ester bond, it is only necessary to add the enzyme solution to the oil product, so the process is very simple and easily detectable. Various labeling substances in can be detected easily at the same time.

본 발명의 방법을 정품 휘발유에 적용시키면 정품 휘발유에만 형광이 나타나게 되므로 정품과 가짜 휘발유를 구별할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 복잡한 화학적 분석을 거치지 않는 매우 간단한 방법으로서 유통 현장에서 소비자가 직접 시행해 볼 수 있다. 예를 들면, 건조된 효소 수용액이 함유된 키트에, 표지물질 함유 석유와 물을 넣고 흔들어 섞은 후 눈으로 형광을 확인함으로써 정품여부를 확인할수있다. When the method of the present invention is applied to genuine gasoline, fluorescent light appears only in genuine gasoline so that genuine gas and fake gasoline can be distinguished. In addition, the method of the present invention is a very simple method that does not undergo complex chemical analysis, and can be directly performed by a consumer at a distribution site. For example, a kit containing dried aqueous solution of enzyme can be added to the petroleum and water containing the labeling material, shaken, and checked for fluorescence with eyes.

Claims (36)

삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 1)탄소수 4 내지 24인 중합체와 에스테르 결합된 쿠마린계, 레소루핀계 또는 플루오레세인계 형광 물질로 이루어진 은닉 표지 물질을 유류 제품에 첨가하는 단계;1) adding a hidden labeling substance consisting of a coumarin-based, resorufine-based or fluorescein-based fluorescent substance ester-bonded with a polymer having 4 to 24 carbon atoms to the oil product; 2)상기 은닉 표지 물질의 에스테르 결합만을 선택적으로 분해시키기 위하여 에스테라아제, 셀룰라아제, 리파아제 및 이들 중 어느 하나에 분자량 2000달톤 이상의 탄화수소 중합체가 결합된 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 효소를 상기 은닉 표지된 유류 제품에 첨가하는 단계와 2) The secretively labeled oil product comprising an enzyme selected from the group consisting of esterases, cellulases, lipases and compounds in which a hydrocarbon polymer having a molecular weight of at least 2000 Daltons is bound to any one of them to selectively decompose only the ester bonds of the hidden labeling substance. Adding to the 3)상기 효소를 함유하는 물질이 첨가된 유류 제품의 형광을 측정하는 단계를 3) measuring the fluorescence of the oil product to which the substance containing the enzyme is added 포함하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.An oil product concealment label detection method comprising a. 제 13항에 있어서, 상기 은닉표지 물질이 하기의 구조식을 갖는 것임을 특징으로 하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.The method of claim 13, wherein the hidden label material has the following structural formula.
Figure 112007005359463-pat00030
Figure 112007005359463-pat00030
 상기식에서 R1 및 R2는 서로 같거나 다르며, C4-C18의 알킬이다. Wherein R 1 and R 2 are the same as or different from each other and are C 4 -C 18 alkyl. 제 13항에 있어서, 상기 은닉표지 물질이 하기의 구조식을 갖는 것임을 특징으로 하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.The method of claim 13, wherein the hidden label material has the following structural formula.
Figure 112007005359463-pat00031
Figure 112007005359463-pat00031
 상기식에서, R3 는 C4-C18의 알킬이며, R4는 수소 또는 메틸 또는 트리플루오로메틸이며, R5는 수소 또는 할로겐 원소 또는 시아노기(-CN)이다.Wherein R 3 is C 4 -C 18 alkyl, R 4 is hydrogen or methyl or trifluoromethyl, and R 5 is hydrogen or a halogen element or cyano group (—CN). 제 13항에 있어서, 상기 은닉표지 물질이 하기의 구조식을 갖는 것임을 특징으로 하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.The method of claim 13, wherein the hidden label material has the following structural formula.
Figure 112007005359463-pat00032
Figure 112007005359463-pat00032
 상기식에서 R6 및 R7는 서로 같거나 다르며, C19-C24의 알킬이다.Wherein R 6 and R 7 are the same or different from each other and are C 19 -C 24 alkyl. 제 13항에 있어서, 상기 은닉표지 물질이 7-하이드록시-4-트리플루오로메틸 쿠마린, 7-하이드록시 쿠마린, 3-시아노-7-하이드록시-4-메틸 쿠마린, 4-하이드록시 쿠마린, 7-하이드록시-4-메틸 쿠마린, 3-클로로-7-하이드록시-4-메틸 쿠마린, 레소루핀 및 플루오레세인으로 이루어진 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.The method of claim 13, wherein the hidden label material is 7-hydroxy-4-trifluoromethyl coumarin, 7-hydroxy coumarin, 3-cyano-7-hydroxy-4-methyl coumarin, 4-hydroxy coumarin And 7-hydroxy-4-methyl coumarin, 3-chloro-7-hydroxy-4-methyl coumarin, resorphine and fluorescein. 제 15항에 있어서, R4 가 메틸기이고, R5 가 염소인 것임을 특징으로 하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.16. The method of claim 15, wherein R 4 is a methyl group and R 5 is chlorine. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, R1, R2 및 R3가 C15H31 인 것임을 특징으로 하는 유류 제품 은닉 표지 검출 방법.16. The method of claim 14 or 15, wherein R 1 , R 2 and R 3 are C 15 H 31 . 제 13항에 있어서, 상기의 표지 물질을 유류 제품에 0.01ppm 내지 30ppm 가 하는 것임을 특징으로 하는 유류 제품의 은닉 표지 검출 방법.The method of detecting a hidden label of an oil product according to claim 13, wherein the labeling substance is added in an amount of 0.01 ppm to 30 ppm in the oil product. 제 13항에 있어서, 상기 유류 제품이 자동차용 휘발유, 자동차용 액화 천연 가스, 액화석유가스, 원동기용 중유 또는 연료용 석유로 이루어지는 군에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 유류 제품의 은닉 표지 검출 방법.The method of detecting a hidden label of an oil product according to claim 13, wherein the oil product is selected from the group consisting of gasoline for automobiles, liquefied natural gas for automobiles, liquefied petroleum gas, heavy oil for prime movers, or petroleum for fuels. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 제 13항에 있어서, 상기 에스테라아제, 셀룰라아제 또는 리파아제와와 상기 중합체는 연결체를 통하여 결합된 것임을 특징으로 하는 유류 제품의 은닉 표지 검출 방법.The method of claim 13, wherein the esterase, cellulase or lipase and the polymer are linked through a linker. 제 26항에 있어서, 상기 연결체가 시아누릭 클로라이드인 것임을 특징으로 하는 유류 제품의 은닉 표지 검출 방법.27. The method of claim 26, wherein the linker is cyanuric chloride. 제 13항에 있어서, 상기 중합체와 결합된 효소가 하기 일반식의 효소인 것임을 특징으로 하는 유류 제품의 은닉 표지 검출 방법.The method of detecting a hidden label of an oil product according to claim 13, wherein the enzyme bound to the polymer is an enzyme of the following general formula.
Figure 112007005359463-pat00033
Figure 112007005359463-pat00033
 제 13항에 있어서, 상기 효소와 결합하는 상기 중합체가 폴리에틸렌글리콜인것을 특징으로 하는 유류 제품의 은닉 표지 검출 방법.The method of detecting hidden labels of oil products according to claim 13, wherein the polymer which binds the enzyme is polyethylene glycol. 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete 삭제delete
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