JP3660966B2 - 植物の感光性遺伝子およびその利用 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、植物の感光性に関与する遺伝子および該遺伝子を利用した植物の感光性の改変に関する。植物の感光性の改変は、植物の品種改良などの文野において有用である。
背景技術
イネは一般に短日で出穂が促進され、逆に長日では出穂が遅延する。従来の品種では、一般に九州や本州南部の品種は強い感光性をもち、東北や北海道の品種は感光性がないか極めて弱い。イネは感光性を失うと日長の変化によって出穂時期が変化せず、一定の生育期間を経ると、出穂する特徴を示す。このようにイネは感光性の有無により、栽培地域や栽培時期などに関する適応性が大きく変化するため、イネの感受性の改変は、イネの品種改良において重要な課題となっている。
従来、イネの品種改良における出穂期の改変は、（1）交雑による早生・晩生系統の選抜や（2）放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。しかしながら、これらの作業には長期間を要し、また変異の程度や方向性を予測できないなど多くの問題が存在していた。
ところで、イネの遺伝学の分野においては、イネの感光性を強くする遺伝子を総称して「感光性遺伝子」と呼んでいる。これまでいくつかの感光性遺伝子の存在が、突然変異や品種に内在する変異として見出されており、例えば、Se1座(第６染色体；Yokoo and Fujimaki（1971）Japan. J. Breed. 21:35-39)、E1座（第７染色体；Tsai, K.H.（1976）Jpn. J. Genet. 51:115-128、Okumoto, Y. et al.（1992）Jpn. J. Breed. 42:415-429）、E2座（不明）、E3座（第３染色体？；奥本ら、日本育種学会第９１回講演会育雑47（別１）：31）等において感光性遺伝子の存在が示唆されている（Yamagata et al.（1986）In Rice Genetics, International Rice Research Institute, Manilla, pp351-359）。
イネ感光性遺伝子が単離されれば、これを形質転換法により任意の品種に導入することによって、それらの系統の感光性を改変させ、これによりイネの出穂期を調節することが可能であると考えられる。このため、該遺伝子を利用した品種改良は、簡便性や確実性の面で、従来の方法と比して極めて有利であると言える。
しかしながら、イネにおいてその感光性に関与する遺伝子を単離したという報告は、いまだなされていない。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な植物の感光性遺伝子、特にイネ由来の感光性遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変し、これにより植物の開花時期を改変することを目的とする。さらに、本発明は、植物の感光性の評価方法を提供することをも目的とする。
本発明者等は、植物の中でも、特に出穂時期を改変する簡便な方法の開発が望まれているイネに着目し、その感光性に関与する遺伝子を単離すべく鋭意研究を行なった。
イネにおいては、日本晴とKasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座（QTL）の一つであるHd6が、第３染色体上に座乗することが知られている。また日本晴の遺伝的背景をもつHd6領域の準同質遺伝子系統を利用した解析から、Hd6遺伝子座が感光性遺伝子座であることが明かとなっている（Yamamoto et al.（1996）Abstract for Plant Genome IV. p124）。
本発明者らは、このようにその存在自体は知られているが、いまだ同定されていない感光性遺伝子Hd6を単離するために、まず、連鎖解析および酵母人工染色体（YAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化を行なった。
具体的には、Hd6遺伝子単離に不可欠である、大規模分離集団（200+980=1180個体）の連鎖解析を行い、その際、CAPSマーカーを利用して作業効率を高めた。また、イネゲノム解析研究において作出されたYACクローンの整列化地図を利用して、Hd6遺伝子の候補領域に存在するYACクローンの正確な物理地図を作成した。YACクローンの末端DNA断片や該当YACクローン上に存在するcDNAクローンをRFLPマーカーとして利用することにより、Hd6遺伝子領域をマーカーE11893とY3626Lに挟み込まれる領域に絞り込んだ。
次いで、本発明者等は、P1由来人工染色体（PAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化を行なった。具体的には、上記解析により見出されたHd6遺伝子の存在領域に近接するDNAクローンを利用して、それらの塩基配列を含むと考えられるPACクローンを日本晴のゲノムライブラリーから７個選抜した。さらに、それらのクローンの整列化状況を調べ、PACクローンP0689D1がHd6の候補遺伝子領域を含むことを明らかにした（図１）。
本発明者等は、PACクローンP0689D1の塩基配列解析を行なった結果、Hd6候補遺伝子が存在すると考えられる領域を約26.4kbにまで絞り込むことに成功した。この候補領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行い、アラビドプシスのCKIIα遺伝子と他界類似性を示す領域を見い出した（図２および図３）。このCKIIα遺伝子はアラビドプシスではCCA1（体内時計）遺伝子の活性化に関与していることなどが報告さている。
日本晴のCKIIα遺伝子の塩基配列情報を利用して、KasalathのCKIIα遺伝子のゲノム塩基配列を調べ、両者を比較したところ、日本晴のタンパク質をコードする領域には終止コドンが認められるが、Kasalathではその終止コドンは認められなかった（図４から図１３）。感光性遺伝子Hd6をもたないと考えられる日本晴と、KasalathのHd6遺伝子を有する日本晴の準同質遺伝子系統について、候補遺伝子CKIIαの発現の違いをRT-PCR法により解析したところ、Hd6候補遺伝子であるCKIIα遺伝子の転写量が、Hd6の準同質遺伝子系統に比較して著しく少ないことが見出された（図１４）。これらの結果から、KasalathのCKIIα遺伝子がイネ感光性遺伝子Hd6であると判断した。
こうしてイネに感光性を付与するHd6遺伝子が単離されたことから、Hd6遺伝子やこれと同様の機能を有する植物遺伝子を利用して、イネの出穂時期の改変を初め、広く植物の開花時期を改変することが可能となった。これにより、栽培地域や栽培時期などに関する適応性が改変された植物品種の育成が可能となる。
また、本発明者等は、日本晴とKasalathのHd6遺伝子間のORFにおける１塩基の相違が、Kasalathに特異的な制限酵素HindIIIの認識部位を生じさせていることを見い出した。この塩基の相違を基に、イネ品種における、制限酵素断片多型分析を利用した感受性遺伝子の有無の判定に利用できる可能性が示唆された。一方、感光性遺伝子E3は第３染色体に座乗し、その位置がHd6に相当することが示唆されていた。そこで本発明者等は、これまで遺伝解析によって感光性遺伝子E3の存在の有無が判明している品種群（Okumoto et al. International Rice Research Institute, Rice Genetics II pp.778-780 1991）に対して、この制限酵素断片多型分析の有効性を検証した。その結果、E3を保持しないと判定された品種ではHd6遺伝子の増幅断片は切断されず、一方、E3を保持すると判断された８品種で切断された。このため、本発明者等は、このHd6遺伝子における特定の位置の終止コドンの有無を識別する手法が、イネ品種における感光性を評価する有効な手段となることを見出した。
即ち、本発明者らは、植物の感光性に関与する遺伝子を単離することに成功すると共に、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変させることが可能であること、さらには該遺伝子を利用して植物の感光性を評価することが可能であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には、
（１） 植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
（２） イネ由来である、（１）に記載のDNA、
（３） （１）または（２）に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
（４） （１）または（２）にDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
（５） 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）または（２）に記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
（６） 植物の感光性を増加させるために用いる、（１）または（２）に記載のDNA、
（７） 植物の感光性を低下させるために用いる、（３）から（５）のいずれかに記載のDNA、
（８） （１）から（５）のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
（９） （８）に記載のベクターが導入された植物細胞、
（１０） （９）に記載の植物細胞を含む形質転換植物体、
（１１） イネである、（１０）に記載の形質転換植物体、
（１２） （１０）または（１１）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（１３） （１０）から（１２）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（１４） （１０）または（１１）に記載の形質転換植物体の製造方法であって、（１）または（２）に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
（１５） （１）または（２）に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の感光性を増加させる方法、
（１６） 植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期を遅延させる、（１５）に記載の方法、
（１７） 植物体の細胞内における、内因性の（１）または（２）のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の感光性を低下させる方法、
（１８） （３）から（５）のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させる、（１７）に記載の方法、
（１９） 植物の感光性を低下させることにより、日長に依存した植物の開花時期を早める、（１７）または（１８）に記載の方法、
（２０） 植物がイネである、（１５）から（１９）のいずれかに記載の方法、
（２１） 植物の感光性を評価する方法であって、該植物における（１）に記載のDNAの存在の有無を検出することを特徴とする方法、
（２２） 植物がイネである、（２１）に記載の方法、
（２３） 配列番号：２に記載の塩基配列における第2815位の塩基AのTへの置換を検出する、（２２）に記載の方法。
（２４）
（ａ） 配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に対するプライマー対であって、配列番号：２に記載の塩基配列の第2815位の塩基Aを挟みこむように設計されたプライマー対を用いて、イネのゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（ｂ） 工程（ａ）のポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA断片に対して、制限酵素HindIIIを作用させる工程、および
（ｃ） 制限酵素HindIIIの作用により該DNA断片が切断されたか否かを検出する工程、を含む、（２３）に記載の方法、
（２５） （１）または（２）に記載のDNAを含むベクターが導入された宿主細胞、
（２６） （１）または（２）に記載のDNAによりコードされるタンパク質、
（２７） （２５）に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、（２６）に記載のタンパク質の製造方法、
（２８） （２６）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（２９） 配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNA、を提供するものである。
本発明は、イネ由来のHd6タンパク質をコードするDNAを提供する。本発明者らにより単離されたKasalathのHd6ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：２に、Hd6 cDNAの塩基配列を配列番号：３に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。また、日本晴のHd6ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：５に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
Hd6は日本晴とKasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座（QTL）の一つであり、第３染色体上に座乗することが明かとなっていた。また日本晴の遺伝的背景をもつHd6領域の準同質遺伝子系統を利用した実験から、Hd6遺伝子座は感光性遺伝子座であることが知られていた。この準同質遺伝子系統は、播種から出穂までに必要な日数（到穂日数）が日本晴と比較して、５日〜７日程度増加する。すなわちHd6感光性を強めて、晩生化させる作用をもつ。このようにHd6遺伝子は、植物の感光性に関する遺伝子として、これまでイネ第３染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていたが、その同定および単離には至っていなかった。本発明者らは、複雑なステップを経て遂にその存在領域を解明し、単一の遺伝子として該遺伝子を単離することに初めて成功した。
現在、日本のイネの品質改良においては、出穂期の調節は重要な育種目標である。特に寒冷地では秋の低温が早く到来することから、出穂期の調節は冷害の回避のために重要であり、一方、西南暖地においては、大規模稲作地帯における収穫作業の集中を回避するためにも早生化あるいは晩生化が期待されている。
Hd6タンパク質は、植物の感光性を強める作用を有していることから、該タンパク質をコードするDNAで植物を形質転換することにより、植物の晩生化（開花時期の遅延化）を引き起こすことが可能である。一方、アンチセンス法やリボザイム法などを利用して該DNAの発現制御を行うことにより、感光性を低下させ、植物の開花時期を早めることが可能である。従って、Hd6タンパク質をコードするDNAを有していない品種には、遺伝子組換えにより該DNAを導入し、有している品種にはアンチセンスやリボザイム等を利用して該DNAの発現を制御することにより、植物の開花時期の多様化を図り、植物の新品種育成を行なうことができる。
本発明のHd6タンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、感光性遺伝子を有するイネ品種（例えば、Kasalath）からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、感光性遺伝子を有するイネ品種（例えば、Kasalath）から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを生成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
本発明は、配列番号：１に記載のHd6タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「Hd6タンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質が植物の感光性を増加させる機能を有することを指す。このようなDNAには、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154:350-367, 1987)が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のHd6タンパク質をコードするアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のHd6タンパク質（配列番号：１）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、例え、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
あるDNAが植物の感光性を増加させるタンパク質をコードするか否かは以下のようにして評価することができる。最も一般的な方法としては、該DNAが導入された植物を、日長が変更できるグロースチャンバーで栽培して調べる手法である。すなわち短日（一般的には9〜10時間）条件と長日（14〜16時間）条件で栽培し、播種から開花するまで（イネであれば播種から穂が出るまで）に必要な日数を比較する方法である。該日数が長日と短日で変わらないかほとんど同じ場合は感光性がないと判断する。感光性がある場合は、長日での開花までの日数は短日より大きくなり、その差の大きさを感光性の程度とみなすことができる。グロースチャンバーが利用できない場合には、自然日長の圃場あるいは温室における栽培試験で検定可能である。すなわち温室に20日おきに播種し、温度を保って自然日長下で栽培し、それぞれの開花日を測定する。イネにおいては、一般に８月〜２月に播種した場合は、感光性の大きな品種の出穂は促進され、逆に４月から７月では遅延する。一方、感光性の小さな品種では到穂日数は播種期の移動に影響されずに変化が小さい。
配列番号：１に記載のHd6タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション（Southern, E.M.:Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. Science, vol.230, 1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491, 1988）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Hd6遺伝子の塩基配列（配列番号：２、３）もしくはその一部をプローブとして、またHd6遺伝子（配列番号：２、３）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からHd6遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるHd6タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件はまたはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、Hd6タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本発明のDNAは、例えば、組み換えタンパク質の調製や感光性が改変された形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, Vol.53, 158-162,(1970)、Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, Vol.166, 557-580,(1983)）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間のにちに血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
本発明のDNAを利用して感光性が増加した形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明者等により単離された感光性遺伝子Hd6は、イネの感光性を強める作用を有し、その結果、出穂期を遅らせる効果を有するが、この遺伝子を任意の品種に導入し発現させることによりそれらの系統の出穂期を調節することが可能である。この形質転換に要する期間は、従来のような交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。イネにおいて、出穂期を調節する遺伝子はこれまで単離・同定はされておらず、このような手法は本発明により初めて可能となった。
一方、感光性が低下した形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAの発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のタンパク質をコードするDNAの発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている、植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, Proc.Natl.Acad.USA.83:5372,1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der KrolらNature 333:866,1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発言を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編, 東京化学同人, pp.319-347, 1993）。
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するDNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素, 35:2191. 1990)。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,FEBS Lett.288:225,1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら, FEBS Lett. 239:285, 1988, 小泉誠および大塚栄子,蛋白質核酸酵素, 35:2191, 1990, M.Koizumiら, Nucleic Acids Res. 17:7059, 1989)。例えば、Hd6遺伝子のコード領域（配列番号：３）中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349, 1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.KikuchiおよびN.Sasaki Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992, 菊池洋, 化学と生物30:112, 1992)。
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物栽培中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら, Protein Eng. 3:733, 1990, A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823, 1989, C.A.GrosshansおよびR.T.Cech Nucleic Acids Res. 19:3875, 1991, K.TairaらNucleic Acids Res. 19:5125, 1991)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.YuyamaらBiochem.Biophys.Res.Commun. 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr.Biol. 7:R793, 1997, Curr.Biol. 6:810, 1996)。例えば、Hd6遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、Hd6遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からHd6変異体の形質を有する植物、即ち感光性が低下した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は上記の手法により決定できる。
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Tokiら（1995）Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K.（1995）In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al（1992）Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al.（1991）Bio/technology, 9:957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al.（1994）Plant J. 6:271-282.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これら方法を好適に用いることができる。
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
このようにして作出された感光性が改変された植物体は、野生型植物体と比較して、その開花時期が変化している。例えば、Hd6蛋白質をコードするDNAが導入された植物体は、その感光性の増加により、開花時期が遅延し、一方、アンチセンスDNAなどの導入によりHd6タンパク質をコードするDNAの発現が抑制された植物体は、その感光性の低下により、開花時期が早まる。このようにHd6遺伝子の発現を制御することにより、植物の開花時期を調節することができる。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、その出穂時期を調製することができ、生育環境に適応したイネ品種の育成の上で非常に有益である。
本発明は、また、植物の感光性を評価する方法を提供する。本発明者等は、イネにおいて、感光性品種であるKasalathのHd6遺伝子と感光性品種でない日本晴のHd6遺伝子を比較したところ、そのORF内における違いは、ひとつの塩基置換のみであり、これによりKasalathでリジンをコードする部位が日本晴では終止コドンとなっていることを見出した。日本晴ではこの終止コドンの存在により機能的な産物の翻訳ができなくなっている。このことは、植物における感光性の程度が、機能的なHd6タンパク質を発現するか否かが一つの要因となって決定されていることを示すものである。本発明の植物の感光性を評価する方法は、この知見に基づくものであり、植物が機能的なHd6タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かを検出することを特徴とする。
機能的なHd6タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かを基準とする植物の感光性の評価は、イネにおいては、配列番号：２に記載の塩基配列の第2815位の塩基Aの変異を検出することにより行なうことができる。また、本発明において、Kasalathと日本晴のHd6遺伝子のORF内の塩基の相違により、KasalathにおけるDNAにおいて制限酵素HindIIIの認識部位となっている領域が、日本晴では制限酵素HindIIIによる認識を受けないように変化していることが見出された。また、この知見を基に、感光性遺伝子E3遺伝子の有無により感光性の有無が特徴付けられたイネ品種に対し、この制限酵素認識部位の存在を検出したところ、感光性品種で特異的にその存在が検出された。従って、上記の塩基の変異は、制限酵素HindIIIによる認識の有無により検出することが可能である（CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。制限酵素HindIIIを利用した方法は、具体的には（ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に対するプライマ対であって、配列番号：２に記載の塩基配列の第2815位の塩基Aを挟みこむように設計されたプライマー対を用いて、イネのゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、（ｂ）工程（ａ）のポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA断片に対して、制限酵素HindIIIを作用させる工程、および（ｃ）制限酵素HindIIIの作用により該DNA断片が切断されたか否かを検出する工程、を含む方法である。この方法において用いるプライマー対としては、例えば、配列番号：20および配列番号：21に記載のプライマーを用いることが可能である。制限酵素HindIIIの作用によりPCR産物が切断されたか否かは、制限酵素を作用させた後のDNAを電気泳動し、その泳動パターンを検出することで判定することができる。その結果、PCR産物が該制限酵素により切断されない場合には、被検植物は、感光性を有しないと評価される。
また、本発明の方法においては、上記のCAPS（Cleaved Amplified Polumorphic Sequence）法以外に、dCAPS法（Neff et al. The Plant Journal 14:387-392 1998）を利用することも可能である。この方法は、塩基置換の部位が特定の制限酵素部位と対応していない場合、塩基置換に近接する領域にプライマーを設計し、かつプライマーの一部の塩基にミスマッチを導入することによって増幅産物内に新たな制限酵素部位を作出する方法である。本発明者等は、実際にミスマッチの導入されたプライマーとしての「配列番号：22/5'-CTTTGTGGAGGTCCAAACATTGTC-3'」およびCAPSマーカーと共通のプライマー「配列番号：21/5'-CTACAGATCCACAGAACAGG-3'」を該方法に利用している。
また、本発明の方法においては、塩基置換が生じている位置に片方のプライマーの3'端が対応するようなプライマー設計を行い、どちらかの品種においては増幅産物が得られないように工夫するASPCR（allele-specific PCR）法（Dan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2757-2760 1989）を利用することも可能である。
本発明の方法による植物の感光性の評価は、例えば、植物の交配による品種改良を行なう場合において利点を有する。例えば、感光性の形質の導入を望まない場合に、感光性を有する品種との交配を避けることができ、逆に、感光性の形質の導入を望む場合に、感光性を有する品種との交配を行なうことができる。また交雑後代個体から望ましい個体を選抜する際にも有効である。植物の感光性の有無を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本発明の感光性の評価方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得ると言える。
また、本発明は、配列番号：２に記載の塩基配列からなる本発明のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNAを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列が相補配列であればよい。このようなDNAは、本発明のDNAの検出や単離を行なうためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、Hd6領域の連鎖地図、YACならびにPAC整列化地図を示す図である。
図２は、候補ゲノム領域の遺伝子予測の結果を示す図である。
図３は、Hd6領域の詳細な遺伝地図を示す。
図４は、日本晴とKasalathの候補遺遺伝子CKIIの塩基配列の違いを示す図である。
図５は、候補遺伝子領域のゲノム塩基配列の日本晴とKasalathのアラインメントを示す図である。
図６は、図４の続きである。
図７は、図５の続きである。
図８は、図６の続きである。
図９は、図７の続きである。
図１０は、図８の続きである。
図１１は、図９の続きである。
図１２は、図１０の続きである。
図１３は、推定されるアミノ酸配列の日本晴とKasalathのアラインメントを示す図である。
図１４は、候補遺伝子CKIIαの発現パターンをRT-PCR法により解析した結果を示す電気泳動写真である。図中、「Ｍ」はマーカー（λ/HindIII+φX174/HaeIII）を示す。鋳型は、レーン1,6,11が日本晴全DNA、レーン2,7,12がHd6 NIL全DNA、レーン3,8,13が日本晴全RNA、レーン4,5,9,10,14,15がHd6 NIL全RNAである。PCRプライマーは、レーン1〜5がアクチン遺伝子を増幅するためのプライマー、レーン6〜10がC10214を増幅するためのプライマー（Hd6と同座のCKIIα）、レーン11〜15がR2856を増幅するためのプライマー（Hd6と同座でないCKIIα）である。
図１５は、CAPS法により日本晴およびKasalathのゲノムDNA間の多型を検出した結果を示す電気泳動写真である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］連鎖解析および酵母人工染色体（YAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化
Hd6領域が分離する日本晴とKasalathの戻し交雑後代集団（1180個体）を圃場に栽培し、Hd6近傍に生じた組み換え染色体をもつ個体を選抜した。選抜には、作業の効率化を図るためにCAPSマーカーを利用した（Koniezny and Ausubel, Plant J. 4:403-410（1993））。
まず、Hd6遺伝子領域を挟み込むRFLPマーカーR2404およびC1329のCAPSマーカー化を行った。R2404はこのcDNAクローンに特異的なプライマー「配列番号：6/5'-GCAAAATGCCACTTTGTGGC-3'」と「配列番号：7/5'-AACTTACGCTCAAATCAAAA-3'（アンチセンス）」を用いて94度で２分、「94度で30秒、58度で30秒、72度で1分」を40サイクル、72度で7分の条件でPCR反応を行うと、産物の大きさが多型を示す。C1329は特異的なプライマー「配列番号：8/5'-TGTTGCCCTCATTATCTGCT-3'」と「配列番号：9/5'-GGAGGTCGGAGTAAAGGAAA-3'（アンチセンス）」を用いて94度で２分、「94度で1分、60度で2分、72度で3分」を35サイクル、72度で7分の条件でPCR反応を行い、得られた産物を制限酵素EcoT22Iで切断することにより多型を示す。また、PCRの鋳型とするDNAは、MannerとTenningの方法（Plant Mol. Biol. Reptr. 15:38-45（1997））を改良した方法で抽出を行った。すなわち2、3cm程度の長さの葉を抽出バッファー(100mM Tris-HCl pH8.0、50mM Na-EDTA、1.25％ SDS、0.38% 重硫酸ナトリウム、200μg/mlプロテイナーゼK)中で叩きつぶし、65度で2時間保温後、遠心を行い、その上清をイソプロパノール沈殿後、乾燥し、適当量の水に溶かした。CAPSマーカーR2404およびC1329の間の組み換え個体は合計40個体選抜された。
選抜された個体からDNAを抽出しさらにHd6近傍のRFLPマーカーで解析して、詳細な連鎖地図を作成した。Hd6遺伝子座の遺伝子型の決定は後代検定によって行った。すなわち選抜個体の自殖後代を圃場に展開し、各系統内の出穂期の分離状況から遺伝子型を判定した。その結果、Hd6はRFLPマーカーR2404およびG1015の間に位置づけられ、R2856とは共分離することが明らかとなった。
この詳細連鎖地図を利用して、イネゲノム研究において作出されたYACクローンの整列化地図の情報をもとにより詳細な整列化地図を作成した。連鎖地図の作成に用いた各マーカーをサザンハイブリダイゼーション及び、各マーカーのSTS化プライマーを用いたPCRにより、各YACクローン上に含まれているかどうか確認を行なった。また、Hd6領域に存在するYACクローンの末端DNA断片や該当YACクローン上に存在するcDNAクローンも同様に解析を行った。
この解析の過程において、他のすべてのマーカーとは異なり、R2856については、サザンハイブリダイゼーションではHd6領域に存在するYACクローンに対してシグナルが検出されたが、PCRでは当該YAC上にはR2856は存在しないという結果が得られた。このことは、Hd6遺伝子の候補領域にR2856と極めて高い相同性を示す領域が存在し、そこにR2856はハイブリダイズする塩基配列は存在するが、cDNAクローンR2856をコードする遺伝子は存在しない事を示している。つまり、RFLPマーカーとしてのR2856は、Hd6領域内のこれと極めて高い相同性を示す領域を表すが、本来はゲノム上の別の領域に存在する遺伝子によってコードされているのである。
PCR解析は、R2856に対する特異的プライマー「配列番号：10/ 5'-AGCACTCAAAAACACCAAGC-3'」と「配列番号：11/ 5'-AACAAAGATACAAACAGCAC-3'（アンチセンス）」を用いて94度で２分、「94度で1分、60度で2分、72度で3分」を30サイクル、72度で7分の条件で行った。
イネゲノム研究プログラムで解析された日本晴のESTクローンを検索したところ（DDBJ(DNA Data Bank of Japan)）、R2856と高い相同性を示すC10214（Ac.No.D22035）が見いだされた。このクローンをコードする遺伝子がHd6領域に存在することを確認するために、C10214に対する特異的プライマー「配列番号：12/ 5'-CTTGATCCTCAGCTTGAAGCT-3'」と「配列番号：13/ 5'-TGCAAGGCTACAAGCACATTC-3'（アンチセンス）」を用いて、上述と同じ条件でPCRを行った。その結果、該クローンがコードする遺伝子がHd6領域に存在することが判明した。
この詳細なYACクローンの整列化地図に基づき、各YAC末端DNA断片やYACクローン上のcDNAクローンをRFLPマーカーとして利用して、連鎖地図をさらに詳細なものとした。この結果、Hd6遺伝子領域をマーカーE11893とY3626Lに挟み込まれる領域に絞り込んだ（図１）。
［実施例２］P1由来人工染色体（PAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化
Hd6に近接するESTやYAC端末、C10214、E11893、Y3626L、C63403、C11482およびC60478の塩基配列からSTS化プライマーを作成して、日本晴のPACゲノムクローンライブラリー(8352クローン、平均インサート長112kb)のスクリーニングを行った。STS化に用いたプライマーは、C10214については上述の配列番号:12及び13を、E11893については「配列番号：14/ 5'-TCGTCGCGCTCATAGCTAGA-3'」と「配列番号：15/ 5'-ACTTCCTCGCTATGCCACAG-3'（アンチセンス）」、Y3626Lについては「配列番号：16/ 5'-GCCCATAATGATACGATATACT-3'」と「配列番号：17/ 5'-TGGTGGTGGTTGCTGTTCGA-3'」を用いた。C63403、C11482及びC60478については、イネゲノム解析研究において作出されたESTマッピング用のプライマーを用いた。PCRの条件は94度で2分、「94度で30秒、60度で1分、72度で1分」を35サイクル、72度で7分である。その結果、Hd6近辺のゲノム断片を持つと考えられるPACクローンを7個選抜した。さらにそれらのクローンの末端断片をRFLPマーカーとして利用して調べたところ、PACクローンP0689D1がHd6の候補遺伝子領域をすべて含むことが明かとなった（図１）。
［実施例３］塩基配列解析による候補遺伝子領域の特定
Hd6遺伝子を含むと考えられるPACクローンP0689D1の塩基配列解析を行なった。塩基配列の解析はP0689D1のインサートDNA（ベクターを含む）を超音波で断片化し、2kbおよび5kbの平均インサート長のサブライブラリーを作成した。このサブライブラリーから任意に選んだ2000個のクローンの塩基配列を解析し、コンピューターソフトPhred/Phrapによりアセンブルを行った。連鎖解析により特定された候補遺伝子領域内の塩基配列情報を利用して、さらに新たなCAPSマーカーを作成し、候補領域の絞り込みを行ったところ、候補遺伝子が存在すると考えられる領域を約47kbにまで絞り込むことができた。この候補領域の塩基配列に対してコンピュータープログラムGENSCANによる遺伝子予測ならびに類似性検索BLASTを行ったところ、アラビドプシスのCKIIα遺伝子と非常に高い類似性を示す領域が見い出された。また領域の塩基配列はESTクローンC10214と一致した（図２）。アラビドプシスのCKIIα遺伝子はいくつかの光により発現が調節されている遺伝子の発現に影響を与えることが示されており（Lee et al. Plant Physiol. 119:989-1000(1999)）、また、体内時計遺伝子CCA1タンパク質をリン酸化することにより活性化させるることが明かとなっている（Sugano et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11020-11025(1998)）。
［実施例４］高精度連鎖解析
Hd6遺伝子の候補領域をさらに絞り込むために、大規模集団の連鎖解析を再度行った。前述の方法に従って、新たに1627個体の分離集団からHd6遺伝子を挟み込むCAPSマーカーR2404およびG1015のマーカー間の組み換え個体を選抜した。G1015は特異的なプライマー「配列番号：１８/ 5'-CTGCAAGTTCAAGCCGATCA-3'」と「配列番号：１９/ 5'-TTGCAATTGGCTAAGCAAGAC-3'」を用いて「94度40秒、65度40秒、72度90秒」の40サイクルの後、72度で7分の条件でPCR反応を行い、得られた産物を制限酵素HaeIIIで切断することにより多型解析を行った。選抜した個体についてHd6候補遺伝ゲノム領域（E11893およびY3626Lの間）の組み換え個体を新たに11個体選抜した。それらの個体のDNAを抽出し、前述の連鎖解析によって見い出されていた4つの組み換え個体と合わせてCAPSマーカーを用いて詳細な遺伝地図を作成した。用いたCAPSマーカーは後述の塩基配列解析結果に基づいて作成した。Hd6遺伝子座の遺伝子型は前述と同様に後代検定によって行った。その結果、Hd6遺伝子はCAPSマーカーcnt13GNheIおよびcnt13BBglIIの間に位置づけられ、cnt13CRsaI、cnt912HindIIIおよびA5M7AluIとは共分離した（図３）。この結果、Hd6遺伝子の候補領域は26.4kbのゲノム領域に絞り込むことができた。
［実施例５］Kasalathと日本晴のCKIIα遺伝子の塩基配列の比較
PACクローンの解析により得られた日本晴のCKIIα遺伝子の塩基配列情報を利用して、KasalathのCKIIα遺伝子のゲノム塩基配列を調べた。すなわち候補遺伝子内の特定の領域が増幅できるプライマーを作成して、KasalathのゲノムDNAを鋳型にして増幅した断片を獲得し、クローン化して、塩基配列を解析した。プライマーの位置を少しづつずらしながら解析を行い、CKIIα遺伝子周辺全領域の塩基配列を決定した。両者を比較すると、多数の塩基置換や欠失および挿入が認められたが、ORF内における違いは、ひとつの塩基置換のみであり、これにより、Kasalathではリジンをコードする部位が日本晴では終止コドンとなっていた（図４〜１３、配列番号：２）。Kasalathでは333アミノ酸からなる機能的なタンパク質がコードされていると考えられるのに対して、日本晴ではこの終始コドンの存在により機能的な産物の翻訳できなくなっている。
［実施例６］候補遺伝子CKIIαの発現パターンの解析
感光性遺伝子Hd6をもたないと考えられる日本晴とKasalathのHd6遺伝子を有する日本晴の準同質遺伝子系統について、候補遺伝子CKIIαの発現の違いをRT-PCR法により明らかにした。プライマーには上述の配列番号7及び8を用い、94度で2分、「94度で30秒、62度で40秒、72度で1分」を25サイクル、72度で7分の条件でPCRを行った。その結果、アクチン遺伝子および、Hd6とは異なる領域に存在するCKIIα遺伝子の発現に差は見られなかったのに対して、候補遺伝子であるCKIIα遺伝子の発現量はHd6の準同質遺伝子系統に比較して日本晴では著しく少ないことが明らかとなった（図１４）。
［実施例７］イネ品種の感光性の評価方法の確立
従来その存在が遺伝学的に示されきた感光性遺伝子のうち、E3遺伝子は第3染色体上に存在する可能性が示唆されていた。そこで日本晴とKasalathのHd6のコード領域における塩基配列の差を簡易に識別する方法をもとに、E3とHd6の相互関係を明らかにした。日本晴とKasalathのHd6遺伝子内に存在する変異（配列番号：２の2815番目の塩基AのTへの置換）が制限酵素HindIIIの認識部位となっており、Kasalathでは切断され、日本晴では切断されないことを見い出した。そこでこの変異部位を含む543bpのDNA断片をプライマー「配列番号：20/5'-ACCTGGCAGCATGTTATGAC-3'（センス、第1イントロン））および「配列番号：21/5'-CTACAGATCCACAGAACAGG-3'（アンチセンス、第3イントロン））を用いて増幅した。この増幅断片を制限酵素HindIIIで処理した場合、Kasalathと同じ配列をもつ場合（終止コドンを持たない）には329bpと214bpの二つの断片に切断され、それ以外の場合は切断されなかった（図１５）。従って、感光性を付与できる遺伝子かどうかの判断に利用できる可能性が示唆された。そこで、これまで遺伝解析によってE3遺伝子を持つか持たないかが判明している品種群（Okumoto et al. International Rice Research Institute, Rice Genetics II pp. 778-780 1991）に対して、その有効性を検証した。その結果、E3をもたないと判定された8品種では増幅断片は切断されず、E3を持つと判断された8品種では切断された（表１）。
従って、Hd6遺伝子がE3遺伝子に対応する可能性が極めて高いと考えられるとともに、今回開発した終止コドンの有無を識別する手法は、感光性遺伝子Hd6若しくはE3の感光性を評価する有効な手段と考えられた。
［実施例８］Hd6遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作出とその到穂日数
Hd6の候補遺伝子とみなしたKasalathのCK2遺伝子を含むゲノム断片（Nhe1-BglII 8.9kb）をバイナリーベクターpPZP2H-lacに組み込んだプラスミドpPZPCKII-10Aを日本晴にアグロバクテリウムを介して導入した。その形質転換当代(T0)では、ベクターのみとpPZPCKII-10Aとを導入した個体間で、再分化後の植物体の生育量がそろわなかったために、明瞭な出穂期の違いは観察されなかった。そこで形質転換2個体の自殖後代を日本晴、Hd6の準同質遺伝子系統［NIL(Hd6)］ならびにベクターのみの形質転換体自殖後代とともに閉鎖系温室（茨城県つくば市）において5月16日に播種し、それらの到穂日数を調査した。最初の穂がでた個体の数を2日おきに観測した（表２）。
その結果、候補遺伝子の導入個体後代では到穂日数に大きな分離が生じ、早生個体および晩生個体の出穂期はそれぞれ日本晴およびNIL(Hd6)とほぼ同じであった。またベクターのみの導入個体後代では、全て個体の出穂期が日本晴と同じであった。以上の結果は、候補遺伝子CK2が自然日長条件において出穂期を遅延させるHd6遺伝子の機能をもことを強く示している。
産業上の利用の可能性
本発明によりイネの感光性遺伝子が提供された。本発明の遺伝子はイネに感光性を付与し、これにより出穂期を調節する機能を有するため、イネの品種育成に大きく貢献し得る。特に、本発明の遺伝子を用いればイネの出穂期を変化させることができ、栽培地域や栽培時期に適応したイネ品種育成に有用である。また、本発明の遺伝子を用いるイネの品種育成は、短期間で高い確実性をもって目的の植物体を得ることができる点で、従来の方法より有利である。
また、本発明により植物の感光性の評価方法が提供された。従来の評価方法は、特定の遺伝子の存在を調べるための検定系統に対象品種を交配して、それらの後代の出穂期の分離から、遺伝子の有無を推定するものであり、1品種について結論を出すために、2〜3年と多大な労力を要した。本発明の方法では、播種後2週間程度経過した苗の一部を採種して、DNAを抽出し、そのDNAを鋳型にしたPCR反応と制限酵素処理だけで判定できる。感光性遺伝子をもつかどうかが判定できれば、その品種の後代における感光性の程度を交配の前に推定でき、交配母本の選定や選抜のための有用な情報となる。また、このマーカーは選抜集団の各個体の感光性遺伝子の有無を上記の方法で容易に判定できることから選抜マーカーとしても利用できる。
【配列表】
本発明は、植物の感光性に関与する遺伝子および該遺伝子を利用した植物の感光性の改変に関する。植物の感光性の改変は、植物の品種改良などの文野において有用である。
背景技術
イネは一般に短日で出穂が促進され、逆に長日では出穂が遅延する。従来の品種では、一般に九州や本州南部の品種は強い感光性をもち、東北や北海道の品種は感光性がないか極めて弱い。イネは感光性を失うと日長の変化によって出穂時期が変化せず、一定の生育期間を経ると、出穂する特徴を示す。このようにイネは感光性の有無により、栽培地域や栽培時期などに関する適応性が大きく変化するため、イネの感受性の改変は、イネの品種改良において重要な課題となっている。
従来、イネの品種改良における出穂期の改変は、（1）交雑による早生・晩生系統の選抜や（2）放射線や化学物質による突然変異誘起などによって行われてきた。しかしながら、これらの作業には長期間を要し、また変異の程度や方向性を予測できないなど多くの問題が存在していた。
ところで、イネの遺伝学の分野においては、イネの感光性を強くする遺伝子を総称して「感光性遺伝子」と呼んでいる。これまでいくつかの感光性遺伝子の存在が、突然変異や品種に内在する変異として見出されており、例えば、Se1座(第６染色体；Yokoo and Fujimaki（1971）Japan. J. Breed. 21:35-39)、E1座（第７染色体；Tsai, K.H.（1976）Jpn. J. Genet. 51:115-128、Okumoto, Y. et al.（1992）Jpn. J. Breed. 42:415-429）、E2座（不明）、E3座（第３染色体？；奥本ら、日本育種学会第９１回講演会育雑47（別１）：31）等において感光性遺伝子の存在が示唆されている（Yamagata et al.（1986）In Rice Genetics, International Rice Research Institute, Manilla, pp351-359）。
イネ感光性遺伝子が単離されれば、これを形質転換法により任意の品種に導入することによって、それらの系統の感光性を改変させ、これによりイネの出穂期を調節することが可能であると考えられる。このため、該遺伝子を利用した品種改良は、簡便性や確実性の面で、従来の方法と比して極めて有利であると言える。
しかしながら、イネにおいてその感光性に関与する遺伝子を単離したという報告は、いまだなされていない。
発明の開示
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、新規な植物の感光性遺伝子、特にイネ由来の感光性遺伝子を提供することにある。また、本発明は、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変し、これにより植物の開花時期を改変することを目的とする。さらに、本発明は、植物の感光性の評価方法を提供することをも目的とする。
本発明者等は、植物の中でも、特に出穂時期を改変する簡便な方法の開発が望まれているイネに着目し、その感光性に関与する遺伝子を単離すべく鋭意研究を行なった。
イネにおいては、日本晴とKasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座（QTL）の一つであるHd6が、第３染色体上に座乗することが知られている。また日本晴の遺伝的背景をもつHd6領域の準同質遺伝子系統を利用した解析から、Hd6遺伝子座が感光性遺伝子座であることが明かとなっている（Yamamoto et al.（1996）Abstract for Plant Genome IV. p124）。
本発明者らは、このようにその存在自体は知られているが、いまだ同定されていない感光性遺伝子Hd6を単離するために、まず、連鎖解析および酵母人工染色体（YAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化を行なった。
具体的には、Hd6遺伝子単離に不可欠である、大規模分離集団（200+980=1180個体）の連鎖解析を行い、その際、CAPSマーカーを利用して作業効率を高めた。また、イネゲノム解析研究において作出されたYACクローンの整列化地図を利用して、Hd6遺伝子の候補領域に存在するYACクローンの正確な物理地図を作成した。YACクローンの末端DNA断片や該当YACクローン上に存在するcDNAクローンをRFLPマーカーとして利用することにより、Hd6遺伝子領域をマーカーE11893とY3626Lに挟み込まれる領域に絞り込んだ。
次いで、本発明者等は、P1由来人工染色体（PAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化を行なった。具体的には、上記解析により見出されたHd6遺伝子の存在領域に近接するDNAクローンを利用して、それらの塩基配列を含むと考えられるPACクローンを日本晴のゲノムライブラリーから７個選抜した。さらに、それらのクローンの整列化状況を調べ、PACクローンP0689D1がHd6の候補遺伝子領域を含むことを明らかにした（図１）。
本発明者等は、PACクローンP0689D1の塩基配列解析を行なった結果、Hd6候補遺伝子が存在すると考えられる領域を約26.4kbにまで絞り込むことに成功した。この候補領域の塩基配列に対して遺伝子予測ならびに類似性検索を行い、アラビドプシスのCKIIα遺伝子と他界類似性を示す領域を見い出した（図２および図３）。このCKIIα遺伝子はアラビドプシスではCCA1（体内時計）遺伝子の活性化に関与していることなどが報告さている。
日本晴のCKIIα遺伝子の塩基配列情報を利用して、KasalathのCKIIα遺伝子のゲノム塩基配列を調べ、両者を比較したところ、日本晴のタンパク質をコードする領域には終止コドンが認められるが、Kasalathではその終止コドンは認められなかった（図４から図１３）。感光性遺伝子Hd6をもたないと考えられる日本晴と、KasalathのHd6遺伝子を有する日本晴の準同質遺伝子系統について、候補遺伝子CKIIαの発現の違いをRT-PCR法により解析したところ、Hd6候補遺伝子であるCKIIα遺伝子の転写量が、Hd6の準同質遺伝子系統に比較して著しく少ないことが見出された（図１４）。これらの結果から、KasalathのCKIIα遺伝子がイネ感光性遺伝子Hd6であると判断した。
こうしてイネに感光性を付与するHd6遺伝子が単離されたことから、Hd6遺伝子やこれと同様の機能を有する植物遺伝子を利用して、イネの出穂時期の改変を初め、広く植物の開花時期を改変することが可能となった。これにより、栽培地域や栽培時期などに関する適応性が改変された植物品種の育成が可能となる。
また、本発明者等は、日本晴とKasalathのHd6遺伝子間のORFにおける１塩基の相違が、Kasalathに特異的な制限酵素HindIIIの認識部位を生じさせていることを見い出した。この塩基の相違を基に、イネ品種における、制限酵素断片多型分析を利用した感受性遺伝子の有無の判定に利用できる可能性が示唆された。一方、感光性遺伝子E3は第３染色体に座乗し、その位置がHd6に相当することが示唆されていた。そこで本発明者等は、これまで遺伝解析によって感光性遺伝子E3の存在の有無が判明している品種群（Okumoto et al. International Rice Research Institute, Rice Genetics II pp.778-780 1991）に対して、この制限酵素断片多型分析の有効性を検証した。その結果、E3を保持しないと判定された品種ではHd6遺伝子の増幅断片は切断されず、一方、E3を保持すると判断された８品種で切断された。このため、本発明者等は、このHd6遺伝子における特定の位置の終止コドンの有無を識別する手法が、イネ品種における感光性を評価する有効な手段となることを見出した。
即ち、本発明者らは、植物の感光性に関与する遺伝子を単離することに成功すると共に、該遺伝子を利用して植物の感光性を改変させることが可能であること、さらには該遺伝子を利用して植物の感光性を評価することが可能であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
本発明は、より具体的には、
（１） 植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA、
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA、
（ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
（２） イネ由来である、（１）に記載のDNA、
（３） （１）または（２）に記載のDNAの転写産物と相補的なアンチセンスRNAをコードするDNA、
（４） （１）または（２）にDNAの転写産物を特異的に開裂するリボザイム活性を有するRNAをコードするDNA、
（５） 植物細胞における発現時に、共抑制効果により、（１）または（２）に記載のDNAの発現を抑制させるRNAをコードするDNA、
（６） 植物の感光性を増加させるために用いる、（１）または（２）に記載のDNA、
（７） 植物の感光性を低下させるために用いる、（３）から（５）のいずれかに記載のDNA、
（８） （１）から（５）のいずれかに記載のDNAを含むベクター、
（９） （８）に記載のベクターが導入された植物細胞、
（１０） （９）に記載の植物細胞を含む形質転換植物体、
（１１） イネである、（１０）に記載の形質転換植物体、
（１２） （１０）または（１１）に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体、
（１３） （１０）から（１２）のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料、
（１４） （１０）または（１１）に記載の形質転換植物体の製造方法であって、（１）または（２）に記載のDNAを植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法、
（１５） （１）または（２）に記載のDNAを植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の感光性を増加させる方法、
（１６） 植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期を遅延させる、（１５）に記載の方法、
（１７） 植物体の細胞内における、内因性の（１）または（２）のいずれかに記載のDNAの発現を抑制することを特徴とする、植物の感光性を低下させる方法、
（１８） （３）から（５）のいずれかに記載のDNAを植物体の細胞内で発現させる、（１７）に記載の方法、
（１９） 植物の感光性を低下させることにより、日長に依存した植物の開花時期を早める、（１７）または（１８）に記載の方法、
（２０） 植物がイネである、（１５）から（１９）のいずれかに記載の方法、
（２１） 植物の感光性を評価する方法であって、該植物における（１）に記載のDNAの存在の有無を検出することを特徴とする方法、
（２２） 植物がイネである、（２１）に記載の方法、
（２３） 配列番号：２に記載の塩基配列における第2815位の塩基AのTへの置換を検出する、（２２）に記載の方法。
（２４）
（ａ） 配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に対するプライマー対であって、配列番号：２に記載の塩基配列の第2815位の塩基Aを挟みこむように設計されたプライマー対を用いて、イネのゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（ｂ） 工程（ａ）のポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA断片に対して、制限酵素HindIIIを作用させる工程、および
（ｃ） 制限酵素HindIIIの作用により該DNA断片が切断されたか否かを検出する工程、を含む、（２３）に記載の方法、
（２５） （１）または（２）に記載のDNAを含むベクターが導入された宿主細胞、
（２６） （１）または（２）に記載のDNAによりコードされるタンパク質、
（２７） （２５）に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、（２６）に記載のタンパク質の製造方法、
（２８） （２６）に記載のタンパク質に結合する抗体、
（２９） 配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNA、を提供するものである。
本発明は、イネ由来のHd6タンパク質をコードするDNAを提供する。本発明者らにより単離されたKasalathのHd6ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：２に、Hd6 cDNAの塩基配列を配列番号：３に、これらDNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：１に示す。また、日本晴のHd6ゲノムDNAの塩基配列を配列番号：５に、該DNAがコードするタンパク質のアミノ酸配列を配列番号：４に示す。
Hd6は日本晴とKasalathの交雑後代を利用して検出された量的形質遺伝子座（QTL）の一つであり、第３染色体上に座乗することが明かとなっていた。また日本晴の遺伝的背景をもつHd6領域の準同質遺伝子系統を利用した実験から、Hd6遺伝子座は感光性遺伝子座であることが知られていた。この準同質遺伝子系統は、播種から出穂までに必要な日数（到穂日数）が日本晴と比較して、５日〜７日程度増加する。すなわちHd6感光性を強めて、晩生化させる作用をもつ。このようにHd6遺伝子は、植物の感光性に関する遺伝子として、これまでイネ第３染色体という広大な領域のいずれかの場所に存在するものとして知られていたが、その同定および単離には至っていなかった。本発明者らは、複雑なステップを経て遂にその存在領域を解明し、単一の遺伝子として該遺伝子を単離することに初めて成功した。
現在、日本のイネの品質改良においては、出穂期の調節は重要な育種目標である。特に寒冷地では秋の低温が早く到来することから、出穂期の調節は冷害の回避のために重要であり、一方、西南暖地においては、大規模稲作地帯における収穫作業の集中を回避するためにも早生化あるいは晩生化が期待されている。
Hd6タンパク質は、植物の感光性を強める作用を有していることから、該タンパク質をコードするDNAで植物を形質転換することにより、植物の晩生化（開花時期の遅延化）を引き起こすことが可能である。一方、アンチセンス法やリボザイム法などを利用して該DNAの発現制御を行うことにより、感光性を低下させ、植物の開花時期を早めることが可能である。従って、Hd6タンパク質をコードするDNAを有していない品種には、遺伝子組換えにより該DNAを導入し、有している品種にはアンチセンスやリボザイム等を利用して該DNAの発現を制御することにより、植物の開花時期の多様化を図り、植物の新品種育成を行なうことができる。
本発明のHd6タンパク質をコードするDNAには、ゲノムDNA、cDNA、および化学合成DNAが含まれる。ゲノムDNAおよびcDNAの調製は、当業者にとって常套手段を利用して行うことが可能である。ゲノムDNAは、例えば、感光性遺伝子を有するイネ品種（例えば、Kasalath）からゲノムDNAを抽出し、ゲノミックライブラリー（ベクターとしては、プラスミド、ファージ、コスミド、BACなどが利用できる）を作成し、これを展開して、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２）を基に調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより調製することが可能である。また、本発明タンパク質をコードするDNA（例えば、配列番号：２）に特異的なプライマーを作成し、これを利用したPCRをおこなうことによって調製することも可能である。また、cDNAは、例えば、感光性遺伝子を有するイネ品種（例えば、Kasalath）から抽出したmRNAを基にcDNAを合成し、これをλZAP等のベクターに挿入してcDNAライブラリーを生成し、これを展開して、上記と同様にコロニーハイブリダイゼーションあるいはプラークハイブリダイゼーションを行うことにより、また、PCRを行うことにより調製することが可能である。
本発明は、配列番号：１に記載のHd6タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを包含する。ここで「Hd6タンパク質と同等の機能を有する」とは、対象となるタンパク質が植物の感光性を増加させる機能を有することを指す。このようなDNAには、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および/または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする変異体、誘導体、アレル、バリアントおよびホモログが含まれる。
アミノ酸配列が改変されたタンパク質をコードするDNAを調製するための当業者によく知られた方法としては、例えば、site-directed mutagenesis法（Kramer, W.& Fritz,H.-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.Methods in Enzymology, 154:350-367, 1987)が挙げられる。また、塩基配列の変異によりコードするタンパク質のアミノ酸配列が変異することは、自然界においても生じ得る。このように天然型のHd6タンパク質をコードするアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするDNAであっても、天然型のHd6タンパク質（配列番号：１）と同等の機能を有するタンパク質をコードする限り、本発明のDNAに含まれる。また、例え、塩基配列が変異した場合でも、それがタンパク質中のアミノ酸の変異を伴わない場合（縮重変異）もあり、このような縮重変異体も本発明のDNAに含まれる。
あるDNAが植物の感光性を増加させるタンパク質をコードするか否かは以下のようにして評価することができる。最も一般的な方法としては、該DNAが導入された植物を、日長が変更できるグロースチャンバーで栽培して調べる手法である。すなわち短日（一般的には9〜10時間）条件と長日（14〜16時間）条件で栽培し、播種から開花するまで（イネであれば播種から穂が出るまで）に必要な日数を比較する方法である。該日数が長日と短日で変わらないかほとんど同じ場合は感光性がないと判断する。感光性がある場合は、長日での開花までの日数は短日より大きくなり、その差の大きさを感光性の程度とみなすことができる。グロースチャンバーが利用できない場合には、自然日長の圃場あるいは温室における栽培試験で検定可能である。すなわち温室に20日おきに播種し、温度を保って自然日長下で栽培し、それぞれの開花日を測定する。イネにおいては、一般に８月〜２月に播種した場合は、感光性の大きな品種の出穂は促進され、逆に４月から７月では遅延する。一方、感光性の小さな品種では到穂日数は播種期の移動に影響されずに変化が小さい。
配列番号：１に記載のHd6タンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードするDNAを調製するために、当業者によく知られた他の方法としては、ハイブリダイゼーション（Southern, E.M.:Journal of Molecular Biology, Vol. 98, 503, 1975.）やポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術（Saiki, R. K. et al. Science, vol.230, 1350-1354, 1985、Saiki, R. K. et al. Science, vol.239, 487-491, 1988）を利用する方法が挙げられる。即ち、当業者にとっては、Hd6遺伝子の塩基配列（配列番号：２、３）もしくはその一部をプローブとして、またHd6遺伝子（配列番号：２、３）に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドをプライマーとして、イネや他の植物からHd6遺伝子と高い相同性を有するDNAを単離することは通常行いうることである。このようにハイブリダイズ技術やPCR技術により単離しうるHd6タンパク質と同等の機能を有するタンパク質をコードするDNAもまた本発明のDNAに含まれる。
このようなDNAを単離するためには、好ましくはストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーション反応を行なう。本発明においてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、6M尿素、0.4%SDS、0.5xSSCの条件はまたはこれと同等のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を指す。よりストリンジェンシーの高い条件、例えば、6M尿素、0.4%SDS、0.1xSSCの条件を用れば、より相同性の高いDNAの単離を期待することができる。これにより単離されたDNAは、アミノ酸レベルにおいて、Hd6タンパク質のアミノ酸配列（配列番号：１）と高い相同性を有すると考えられる。高い相同性とは、少なくとも50%以上、さらに好ましくは70％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95%以上）の配列の同一性を指す。アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Karlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST（Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:5873-5877, 1993）によって決定することができる。このアルゴリズムに基づいて、BLASTNやBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている(Altschul et al. J. Mol. Biol.215:403-410, 1990)。BLASTに基づいてBLASTNによって塩基配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=100、wordlength=12とする。また、BLASTに基づいてBLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメーターはたとえばscore=50、wordlength=3とする。BLASTとGapped BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である(http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)。
本発明のDNAは、例えば、組み換えタンパク質の調製や感光性が改変された形質転換植物体の作出などに利用することが可能である。
組み換えタンパク質を調製する場合には、通常、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当な発現ベクターに挿入し、該ベクターを適当な細胞に導入し、形質転換細胞を培養して発現させたタンパク質を精製する。組み換えタンパク質は、精製を容易にするなどの目的で、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。例えば、大腸菌を宿主としてマルトース結合タンパク質との融合タンパク質として調製する方法（米国New England BioLabs社発売のベクターpMALシリーズ）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として調製する方法（Amersham Pharmacia Biotech社発売のベクターpGEXシリーズ）、ヒスチジンタグを付加して調製する方法（Novagen社のpETシリーズ）などを利用することが可能である。宿主細胞としては、組み換えタンパク質の発現に適した細胞であれば特に制限はなく、上記の大腸菌の他、例えば、酵母、種々の動植物細胞、昆虫細胞などを用いることが可能である。宿主細胞へのベクターの導入には、当業者に公知の種々の方法を用いることが可能である。例えば、大腸菌への導入には、カルシウムイオンを利用した導入方法（Mandel, M. & Higa, A. Journal of Molecular Biology, Vol.53, 158-162,(1970)、Hanahan, D. Journal of Molecular Biology, Vol.166, 557-580,(1983)）を用いることができる。宿主細胞内で発現させた組み換えタンパク質は、該宿主細胞またはその培養上清から、当業者に公知の方法により精製し、回収することが可能である。組み換えタンパク質を上記したマルトース結合タンパク質などとの融合タンパク質として発現させた場合には、容易にアフィニティー精製を行うことが可能である。
得られた組換えタンパク質を用いれば、これに結合する抗体を調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、精製した本発明のタンパク質若しくはその一部のペプチドをウサギなどの免疫動物に免疫し、一定期間のにちに血液を採取し、血ぺいを除去することにより調製することが可能である。また、モノクローナル抗体は、上記タンパク質若しくはペプチドで免疫した動物の抗体産生細胞と骨腫瘍細胞とを融合させ、目的とする抗体を産生する単一クローンの細胞（ハイブリドーマ）を単離し、該細胞から抗体を得ることにより調製することができる。これにより得られた抗体は、本発明のタンパク質の精製や検出などに利用することが可能である。本発明には、本発明のタンパク質に結合する抗体が含まれる。
本発明のDNAを利用して感光性が増加した形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。本発明者等により単離された感光性遺伝子Hd6は、イネの感光性を強める作用を有し、その結果、出穂期を遅らせる効果を有するが、この遺伝子を任意の品種に導入し発現させることによりそれらの系統の出穂期を調節することが可能である。この形質転換に要する期間は、従来のような交配による遺伝子移入に比較して極めて短期間であり、また、他の形質の変化を伴わない点で有利である。イネにおいて、出穂期を調節する遺伝子はこれまで単離・同定はされておらず、このような手法は本発明により初めて可能となった。
一方、感光性が低下した形質転換植物体を作製する場合には、本発明のタンパク質をコードするDNAの発現を抑制するためのDNAを適当なベクターに挿入して、これを植物細胞に導入し、これにより得られた形質転換植物細胞を再生させる。「本発明のタンパク質をコードするDNAの発現の抑制」には、遺伝子の転写の抑制およびタンパク質への翻訳の抑制が含まれる。また、DNAの発現の完全な停止のみならず発現の減少も含まれる。
植物における特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法としては、アンチセンス技術を利用する方法が当業者に最もよく利用されている、植物細胞におけるアンチセンス効果は、エッカーらが一時的遺伝子発現法を用いて、電気穿孔法で導入したアンチセンスRNAが植物においてアンチセンス効果を発揮することで初めて実証した(J.R.EckerおよびR.W.Davis, Proc.Natl.Acad.USA.83:5372,1986)。その後、タバコやペチュニアにおいても、アンチセンスRNAの発現によって標的遺伝子の発現を低下させる例が報告されており(A.R.van der KrolらNature 333:866,1988)、現在では植物における遺伝子発現を抑制させる手段として確立している。アンチセンス核酸が標的遺伝子の発言を抑制する作用としては、以下のような複数の要因が存在する。すなわち、三重鎖形成による転写開始阻害、RNAポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造がつくられた部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるRNAとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエキソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、mRNAとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ(Ａ)付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、mRNAの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、および核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制などである。これらは、転写、スプライシング、または翻訳の過程を阻害して、標的遺伝子の発現を抑制する(平島および井上「新生化学実験講座2核酸IV遺伝子の複製と発現」,日本生化学会編, 東京化学同人, pp.319-347, 1993）。
本発明で用いられるアンチセンス配列は、上記のいずれの作用で標的遺伝子の発現を抑制してもよい。一つの態様としては、遺伝子のmRNAの5'端近傍の非翻訳領域に相補的なアンチセンス配列を設計すれば、遺伝子の翻訳阻害に効果的であろう。しかし、コード領域もしくは3'側の非翻訳領域に相補的な配列も使用し得る。このように、遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含むDNAも、本発明で利用されるアンチセンスDNAに含まれる。使用されるアンチセンスDNAは、適当なプロモーターの下流に連結され、好ましくは3'側に転写終結シグナルを含む配列が連結される。このようにして調製されたDNAは、公知の方法で、所望の植物へ形質転換できる。アンチセンスDNAの配列は、形質転換する植物が持つ内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に阻害できる限り、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的とする遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、最も好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンス配列を用いて、効果的に標的遺伝子の発現を阻害するには、アンチセンスDNAの長さは、少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。通常、用いられるアンチセンスDNAの長さは5kbよりも短く、好ましくは2.5kbよりも短い。
内在性遺伝子の発現の抑制は、また、リボザイムをコードするDNAを利用して行うことも可能である。リボザイムとは触媒活性を有するDNA分子のことをいう。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、中でもRNAを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、RNAの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となった。リボザイムには、グループIイントロン型や、RNasePに含まれるM1RNAのように400ヌクレオチド以上の大きさのものもあるが、ハンマーヘッド型やヘアピン型と呼ばれる40ヌクレオチド程度の活性ドメインを有するものもある(小泉誠および大塚栄子, 蛋白質核酸酵素, 35:2191. 1990)。
例えば、ハンマーヘッド型リボザイムの自己切断ドメインは、G13U14C15のC15の3'側を切断するが、活性にはU14が９位のAと塩基対を形成することが重要とされ、15位の塩基はCの他にＡまたはUでも切断されることが示されている(M.Koizumiら,FEBS Lett.288:225,1988)。リボザイムの基質結合部を標的部位近傍のRNA配列と相補的になるように設計すれば、標的RNA中のUC、UUまたはUAという配列を認識する制限酵素的なRNA切断リボザイムを作出することが可能である(M.Koizumiら, FEBS Lett. 239:285, 1988, 小泉誠および大塚栄子,蛋白質核酸酵素, 35:2191, 1990, M.Koizumiら, Nucleic Acids Res. 17:7059, 1989)。例えば、Hd6遺伝子のコード領域（配列番号：３）中には標的となりうる部位が複数存在する。
また、ヘアピン型リボザイムも、本発明の目的のために有用である。ヘアピン型リボザイムは、例えばタバコリングスポットウイルスのサテライトRNAのマイナス鎖に見出される(J.M.Buzayan Nature 323:349, 1986)。このリボザイムも、標的特異的なRNA切断を起こすように設計できることが示されている(Y.KikuchiおよびN.Sasaki Nucleic Acids Res. 19:6751, 1992, 菊池洋, 化学と生物30:112, 1992)。
標的を切断できるよう設計されたリボザイムは、植物栽培中で転写されるようにカリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーターなどのプロモーターおよび転写終結配列に連結される。しかし、その際、転写されたRNAの5'末端や3'末端に余分な配列が付加されていると、リボザイムの活性が失われてしまうことがある。このようなとき、転写されたリボザイムを含むRNAからリボザイム部分だけを正確に切り出すために、リボザイム部分の5'側や3'側に、トリミングを行うためのシスに働く別のトリミングリボザイムを配置させることも可能である(K.Tairaら, Protein Eng. 3:733, 1990, A.M.DzianottおよびJ.J.Bujarski Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 86:4823, 1989, C.A.GrosshansおよびR.T.Cech Nucleic Acids Res. 19:3875, 1991, K.TairaらNucleic Acids Res. 19:5125, 1991)。また、このような構成単位をタンデムに並べ、標的遺伝子内の複数の部位を切断できるようにして、より効果を高めることもできる(N.YuyamaらBiochem.Biophys.Res.Commun. 186:1271, 1992)。このようなリボザイムを用いて本発明で標的となる遺伝子の転写産物を特異的に切断し、該遺伝子の発現を抑制することができる。
内在性遺伝子の発現の抑制は、さらに、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有するDNAの形質転換によってもたらされる共抑制によっても達成されうる。「共抑制」とは、植物に標的内在性遺伝子と同一若しくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入すると、導入する外来遺伝子および標的内在性遺伝子の両方の発現が抑制される現象のことをいう。共抑制の機構の詳細は明らかではないが、植物においてはしばしば観察される(Curr.Biol. 7:R793, 1997, Curr.Biol. 6:810, 1996)。例えば、Hd6遺伝子が共抑制された植物体を得るためには、Hd6遺伝子若しくはこれと類似した配列を有するDNAを発現できるように作製したベクターDNAを目的の植物へ形質転換し、得られた植物体からHd6変異体の形質を有する植物、即ち感光性が低下した植物を選択すればよい。共抑制に用いる遺伝子は、標的遺伝子と完全に同一である必要はないが、少なくとも70％以上、好ましくは80％以上、さらに好ましくは90％以上（例えば、95％以上）の配列の同一性を有する。配列の同一性は上記の手法により決定できる。
さらに、本発明における内在性遺伝子の発現の抑制は、標的遺伝子のドミナントネガティブの形質を有する遺伝子を植物へ形質転換することによっても達成することができる。ドミナントネガティブの形質を有する遺伝子とは、該遺伝子を発現させることによって、植物体が本来持つ内在性の野生型遺伝子の活性を消失もしくは低下させる機能を有する遺伝子のことをいう。
植物細胞の形質転換に用いられるベクターとしては、該細胞内で挿入遺伝子を発現させることが可能なものであれば特に制限はない。例えば、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルスの35Sプロモーター）を有するベクターや外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターを有するベクターを用いることも可能である。ここでいう「植物細胞」には、種々の形態の植物細胞、例えば、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれる。
植物細胞へのベクターの導入は、ポリエチレングリコール法、電気穿孔法（エレクトロポーレーション）、アグロバクテリウムを介する方法、パーティクルガン法など当業者に公知の種々の方法を用いることができる。形質転換植物細胞からの植物体の再生は、植物細胞の種類に応じて当業者に公知の方法で行うことが可能である（Tokiら（1995）Plant Physiol. 100:1503-1507参照）。例えば、イネにおいては、形質転換植物体を作出する手法については、ポリエチレングリコールによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（インド型イネ品種が適している）を再生させる方法（Datta,S.K.（1995）In Gene Transfer To Plants(Potrykus I and Spangenberg Eds.)pp66-74）、電気パルスによりプロトプラストへ遺伝子導入し、植物体（日本型イネ品種が適している）を再生させる方法（Toki et al（1992）Plant Physiol. 100, 1503-1507）、パーティクルガン法により細胞へ遺伝子を直接導入し、植物体を再生させる方法（Christou et al.（1991）Bio/technology, 9:957-962.）およびアグロバクテリウムを介して遺伝子を導入し、植物体を再生させる方法（Hiei et al.（1994）Plant J. 6:271-282.）など、いくつかの技術が既に確立し、本願発明の技術分野において広く用いられている。本発明においては、これら方法を好適に用いることができる。
一旦、ゲノム内に本発明のDNAが導入された形質転換植物体が得られれば、該植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることが可能である。また、該植物体やその子孫あるいはクローンから繁殖材料（例えば、種子、果実、切穂、塊茎、塊根、株、カルス、プロトプラスト等）を得て、それらを基に該植物体を量産することも可能である。本発明には、本発明のDNAが導入された植物細胞、該細胞を含む植物体、該植物体の子孫およびクローン、並びに該植物体、その子孫、およびクローンの繁殖材料が含まれる。
このようにして作出された感光性が改変された植物体は、野生型植物体と比較して、その開花時期が変化している。例えば、Hd6蛋白質をコードするDNAが導入された植物体は、その感光性の増加により、開花時期が遅延し、一方、アンチセンスDNAなどの導入によりHd6タンパク質をコードするDNAの発現が抑制された植物体は、その感光性の低下により、開花時期が早まる。このようにHd6遺伝子の発現を制御することにより、植物の開花時期を調節することができる。本発明の手法を用いれば、有用農作物であるイネにおいては、その出穂時期を調製することができ、生育環境に適応したイネ品種の育成の上で非常に有益である。
本発明は、また、植物の感光性を評価する方法を提供する。本発明者等は、イネにおいて、感光性品種であるKasalathのHd6遺伝子と感光性品種でない日本晴のHd6遺伝子を比較したところ、そのORF内における違いは、ひとつの塩基置換のみであり、これによりKasalathでリジンをコードする部位が日本晴では終止コドンとなっていることを見出した。日本晴ではこの終止コドンの存在により機能的な産物の翻訳ができなくなっている。このことは、植物における感光性の程度が、機能的なHd6タンパク質を発現するか否かが一つの要因となって決定されていることを示すものである。本発明の植物の感光性を評価する方法は、この知見に基づくものであり、植物が機能的なHd6タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かを検出することを特徴とする。
機能的なHd6タンパク質をコードするDNAを保持しているか否かを基準とする植物の感光性の評価は、イネにおいては、配列番号：２に記載の塩基配列の第2815位の塩基Aの変異を検出することにより行なうことができる。また、本発明において、Kasalathと日本晴のHd6遺伝子のORF内の塩基の相違により、KasalathにおけるDNAにおいて制限酵素HindIIIの認識部位となっている領域が、日本晴では制限酵素HindIIIによる認識を受けないように変化していることが見出された。また、この知見を基に、感光性遺伝子E3遺伝子の有無により感光性の有無が特徴付けられたイネ品種に対し、この制限酵素認識部位の存在を検出したところ、感光性品種で特異的にその存在が検出された。従って、上記の塩基の変異は、制限酵素HindIIIによる認識の有無により検出することが可能である（CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）法）。制限酵素HindIIIを利用した方法は、具体的には（ａ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAまたはその相補鎖に対するプライマ対であって、配列番号：２に記載の塩基配列の第2815位の塩基Aを挟みこむように設計されたプライマー対を用いて、イネのゲノムDNAを鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、（ｂ）工程（ａ）のポリメラーゼ連鎖反応により増幅されたDNA断片に対して、制限酵素HindIIIを作用させる工程、および（ｃ）制限酵素HindIIIの作用により該DNA断片が切断されたか否かを検出する工程、を含む方法である。この方法において用いるプライマー対としては、例えば、配列番号：20および配列番号：21に記載のプライマーを用いることが可能である。制限酵素HindIIIの作用によりPCR産物が切断されたか否かは、制限酵素を作用させた後のDNAを電気泳動し、その泳動パターンを検出することで判定することができる。その結果、PCR産物が該制限酵素により切断されない場合には、被検植物は、感光性を有しないと評価される。
また、本発明の方法においては、上記のCAPS（Cleaved Amplified Polumorphic Sequence）法以外に、dCAPS法（Neff et al. The Plant Journal 14:387-392 1998）を利用することも可能である。この方法は、塩基置換の部位が特定の制限酵素部位と対応していない場合、塩基置換に近接する領域にプライマーを設計し、かつプライマーの一部の塩基にミスマッチを導入することによって増幅産物内に新たな制限酵素部位を作出する方法である。本発明者等は、実際にミスマッチの導入されたプライマーとしての「配列番号：22/5'-CTTTGTGGAGGTCCAAACATTGTC-3'」およびCAPSマーカーと共通のプライマー「配列番号：21/5'-CTACAGATCCACAGAACAGG-3'」を該方法に利用している。
また、本発明の方法においては、塩基置換が生じている位置に片方のプライマーの3'端が対応するようなプライマー設計を行い、どちらかの品種においては増幅産物が得られないように工夫するASPCR（allele-specific PCR）法（Dan et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2757-2760 1989）を利用することも可能である。
本発明の方法による植物の感光性の評価は、例えば、植物の交配による品種改良を行なう場合において利点を有する。例えば、感光性の形質の導入を望まない場合に、感光性を有する品種との交配を避けることができ、逆に、感光性の形質の導入を望む場合に、感光性を有する品種との交配を行なうことができる。また交雑後代個体から望ましい個体を選抜する際にも有効である。植物の感光性の有無を、その表現型により判断することに比して、遺伝子レベルで判断することは簡便で確実であるため、本発明の感光性の評価方法は、植物の品種改良において大きく貢献し得ると言える。
また、本発明は、配列番号：２に記載の塩基配列からなる本発明のDNAまたはその相補鎖に相補的な少なくとも15ヌクレオチドからなるDNAを提供する。ここで「相補鎖」とは、A:T、G:Cの塩基対からなる2本鎖DNAの一方の鎖に対する他方の鎖を指す。また、「相補的」とは、少なくとも15個の連続したヌクレオチド領域で完全に相補配列である場合に限られず、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、より好ましくは90%、さらに好ましくは95%以上の塩基配列が相補配列であればよい。このようなDNAは、本発明のDNAの検出や単離を行なうためのプローブとして、また、増幅を行うためのプライマーとして有用である。
【図面の簡単な説明】
図１は、Hd6領域の連鎖地図、YACならびにPAC整列化地図を示す図である。
図２は、候補ゲノム領域の遺伝子予測の結果を示す図である。
図３は、Hd6領域の詳細な遺伝地図を示す。
図４は、日本晴とKasalathの候補遺遺伝子CKIIの塩基配列の違いを示す図である。
図５は、候補遺伝子領域のゲノム塩基配列の日本晴とKasalathのアラインメントを示す図である。
図６は、図４の続きである。
図７は、図５の続きである。
図８は、図６の続きである。
図９は、図７の続きである。
図１０は、図８の続きである。
図１１は、図９の続きである。
図１２は、図１０の続きである。
図１３は、推定されるアミノ酸配列の日本晴とKasalathのアラインメントを示す図である。
図１４は、候補遺伝子CKIIαの発現パターンをRT-PCR法により解析した結果を示す電気泳動写真である。図中、「Ｍ」はマーカー（λ/HindIII+φX174/HaeIII）を示す。鋳型は、レーン1,6,11が日本晴全DNA、レーン2,7,12がHd6 NIL全DNA、レーン3,8,13が日本晴全RNA、レーン4,5,9,10,14,15がHd6 NIL全RNAである。PCRプライマーは、レーン1〜5がアクチン遺伝子を増幅するためのプライマー、レーン6〜10がC10214を増幅するためのプライマー（Hd6と同座のCKIIα）、レーン11〜15がR2856を増幅するためのプライマー（Hd6と同座でないCKIIα）である。
図１５は、CAPS法により日本晴およびKasalathのゲノムDNA間の多型を検出した結果を示す電気泳動写真である。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
［実施例１］連鎖解析および酵母人工染色体（YAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化
Hd6領域が分離する日本晴とKasalathの戻し交雑後代集団（1180個体）を圃場に栽培し、Hd6近傍に生じた組み換え染色体をもつ個体を選抜した。選抜には、作業の効率化を図るためにCAPSマーカーを利用した（Koniezny and Ausubel, Plant J. 4:403-410（1993））。
まず、Hd6遺伝子領域を挟み込むRFLPマーカーR2404およびC1329のCAPSマーカー化を行った。R2404はこのcDNAクローンに特異的なプライマー「配列番号：6/5'-GCAAAATGCCACTTTGTGGC-3'」と「配列番号：7/5'-AACTTACGCTCAAATCAAAA-3'（アンチセンス）」を用いて94度で２分、「94度で30秒、58度で30秒、72度で1分」を40サイクル、72度で7分の条件でPCR反応を行うと、産物の大きさが多型を示す。C1329は特異的なプライマー「配列番号：8/5'-TGTTGCCCTCATTATCTGCT-3'」と「配列番号：9/5'-GGAGGTCGGAGTAAAGGAAA-3'（アンチセンス）」を用いて94度で２分、「94度で1分、60度で2分、72度で3分」を35サイクル、72度で7分の条件でPCR反応を行い、得られた産物を制限酵素EcoT22Iで切断することにより多型を示す。また、PCRの鋳型とするDNAは、MannerとTenningの方法（Plant Mol. Biol. Reptr. 15:38-45（1997））を改良した方法で抽出を行った。すなわち2、3cm程度の長さの葉を抽出バッファー(100mM Tris-HCl pH8.0、50mM Na-EDTA、1.25％ SDS、0.38% 重硫酸ナトリウム、200μg/mlプロテイナーゼK)中で叩きつぶし、65度で2時間保温後、遠心を行い、その上清をイソプロパノール沈殿後、乾燥し、適当量の水に溶かした。CAPSマーカーR2404およびC1329の間の組み換え個体は合計40個体選抜された。
選抜された個体からDNAを抽出しさらにHd6近傍のRFLPマーカーで解析して、詳細な連鎖地図を作成した。Hd6遺伝子座の遺伝子型の決定は後代検定によって行った。すなわち選抜個体の自殖後代を圃場に展開し、各系統内の出穂期の分離状況から遺伝子型を判定した。その結果、Hd6はRFLPマーカーR2404およびG1015の間に位置づけられ、R2856とは共分離することが明らかとなった。
この詳細連鎖地図を利用して、イネゲノム研究において作出されたYACクローンの整列化地図の情報をもとにより詳細な整列化地図を作成した。連鎖地図の作成に用いた各マーカーをサザンハイブリダイゼーション及び、各マーカーのSTS化プライマーを用いたPCRにより、各YACクローン上に含まれているかどうか確認を行なった。また、Hd6領域に存在するYACクローンの末端DNA断片や該当YACクローン上に存在するcDNAクローンも同様に解析を行った。
この解析の過程において、他のすべてのマーカーとは異なり、R2856については、サザンハイブリダイゼーションではHd6領域に存在するYACクローンに対してシグナルが検出されたが、PCRでは当該YAC上にはR2856は存在しないという結果が得られた。このことは、Hd6遺伝子の候補領域にR2856と極めて高い相同性を示す領域が存在し、そこにR2856はハイブリダイズする塩基配列は存在するが、cDNAクローンR2856をコードする遺伝子は存在しない事を示している。つまり、RFLPマーカーとしてのR2856は、Hd6領域内のこれと極めて高い相同性を示す領域を表すが、本来はゲノム上の別の領域に存在する遺伝子によってコードされているのである。
PCR解析は、R2856に対する特異的プライマー「配列番号：10/ 5'-AGCACTCAAAAACACCAAGC-3'」と「配列番号：11/ 5'-AACAAAGATACAAACAGCAC-3'（アンチセンス）」を用いて94度で２分、「94度で1分、60度で2分、72度で3分」を30サイクル、72度で7分の条件で行った。
イネゲノム研究プログラムで解析された日本晴のESTクローンを検索したところ（DDBJ(DNA Data Bank of Japan)）、R2856と高い相同性を示すC10214（Ac.No.D22035）が見いだされた。このクローンをコードする遺伝子がHd6領域に存在することを確認するために、C10214に対する特異的プライマー「配列番号：12/ 5'-CTTGATCCTCAGCTTGAAGCT-3'」と「配列番号：13/ 5'-TGCAAGGCTACAAGCACATTC-3'（アンチセンス）」を用いて、上述と同じ条件でPCRを行った。その結果、該クローンがコードする遺伝子がHd6領域に存在することが判明した。
この詳細なYACクローンの整列化地図に基づき、各YAC末端DNA断片やYACクローン上のcDNAクローンをRFLPマーカーとして利用して、連鎖地図をさらに詳細なものとした。この結果、Hd6遺伝子領域をマーカーE11893とY3626Lに挟み込まれる領域に絞り込んだ（図１）。
［実施例２］P1由来人工染色体（PAC）クローンによるHd6遺伝子領域の整列化
Hd6に近接するESTやYAC端末、C10214、E11893、Y3626L、C63403、C11482およびC60478の塩基配列からSTS化プライマーを作成して、日本晴のPACゲノムクローンライブラリー(8352クローン、平均インサート長112kb)のスクリーニングを行った。STS化に用いたプライマーは、C10214については上述の配列番号:12及び13を、E11893については「配列番号：14/ 5'-TCGTCGCGCTCATAGCTAGA-3'」と「配列番号：15/ 5'-ACTTCCTCGCTATGCCACAG-3'（アンチセンス）」、Y3626Lについては「配列番号：16/ 5'-GCCCATAATGATACGATATACT-3'」と「配列番号：17/ 5'-TGGTGGTGGTTGCTGTTCGA-3'」を用いた。C63403、C11482及びC60478については、イネゲノム解析研究において作出されたESTマッピング用のプライマーを用いた。PCRの条件は94度で2分、「94度で30秒、60度で1分、72度で1分」を35サイクル、72度で7分である。その結果、Hd6近辺のゲノム断片を持つと考えられるPACクローンを7個選抜した。さらにそれらのクローンの末端断片をRFLPマーカーとして利用して調べたところ、PACクローンP0689D1がHd6の候補遺伝子領域をすべて含むことが明かとなった（図１）。
［実施例３］塩基配列解析による候補遺伝子領域の特定
Hd6遺伝子を含むと考えられるPACクローンP0689D1の塩基配列解析を行なった。塩基配列の解析はP0689D1のインサートDNA（ベクターを含む）を超音波で断片化し、2kbおよび5kbの平均インサート長のサブライブラリーを作成した。このサブライブラリーから任意に選んだ2000個のクローンの塩基配列を解析し、コンピューターソフトPhred/Phrapによりアセンブルを行った。連鎖解析により特定された候補遺伝子領域内の塩基配列情報を利用して、さらに新たなCAPSマーカーを作成し、候補領域の絞り込みを行ったところ、候補遺伝子が存在すると考えられる領域を約47kbにまで絞り込むことができた。この候補領域の塩基配列に対してコンピュータープログラムGENSCANによる遺伝子予測ならびに類似性検索BLASTを行ったところ、アラビドプシスのCKIIα遺伝子と非常に高い類似性を示す領域が見い出された。また領域の塩基配列はESTクローンC10214と一致した（図２）。アラビドプシスのCKIIα遺伝子はいくつかの光により発現が調節されている遺伝子の発現に影響を与えることが示されており（Lee et al. Plant Physiol. 119:989-1000(1999)）、また、体内時計遺伝子CCA1タンパク質をリン酸化することにより活性化させるることが明かとなっている（Sugano et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:11020-11025(1998)）。
［実施例４］高精度連鎖解析
Hd6遺伝子の候補領域をさらに絞り込むために、大規模集団の連鎖解析を再度行った。前述の方法に従って、新たに1627個体の分離集団からHd6遺伝子を挟み込むCAPSマーカーR2404およびG1015のマーカー間の組み換え個体を選抜した。G1015は特異的なプライマー「配列番号：１８/ 5'-CTGCAAGTTCAAGCCGATCA-3'」と「配列番号：１９/ 5'-TTGCAATTGGCTAAGCAAGAC-3'」を用いて「94度40秒、65度40秒、72度90秒」の40サイクルの後、72度で7分の条件でPCR反応を行い、得られた産物を制限酵素HaeIIIで切断することにより多型解析を行った。選抜した個体についてHd6候補遺伝ゲノム領域（E11893およびY3626Lの間）の組み換え個体を新たに11個体選抜した。それらの個体のDNAを抽出し、前述の連鎖解析によって見い出されていた4つの組み換え個体と合わせてCAPSマーカーを用いて詳細な遺伝地図を作成した。用いたCAPSマーカーは後述の塩基配列解析結果に基づいて作成した。Hd6遺伝子座の遺伝子型は前述と同様に後代検定によって行った。その結果、Hd6遺伝子はCAPSマーカーcnt13GNheIおよびcnt13BBglIIの間に位置づけられ、cnt13CRsaI、cnt912HindIIIおよびA5M7AluIとは共分離した（図３）。この結果、Hd6遺伝子の候補領域は26.4kbのゲノム領域に絞り込むことができた。
［実施例５］Kasalathと日本晴のCKIIα遺伝子の塩基配列の比較
PACクローンの解析により得られた日本晴のCKIIα遺伝子の塩基配列情報を利用して、KasalathのCKIIα遺伝子のゲノム塩基配列を調べた。すなわち候補遺伝子内の特定の領域が増幅できるプライマーを作成して、KasalathのゲノムDNAを鋳型にして増幅した断片を獲得し、クローン化して、塩基配列を解析した。プライマーの位置を少しづつずらしながら解析を行い、CKIIα遺伝子周辺全領域の塩基配列を決定した。両者を比較すると、多数の塩基置換や欠失および挿入が認められたが、ORF内における違いは、ひとつの塩基置換のみであり、これにより、Kasalathではリジンをコードする部位が日本晴では終止コドンとなっていた（図４〜１３、配列番号：２）。Kasalathでは333アミノ酸からなる機能的なタンパク質がコードされていると考えられるのに対して、日本晴ではこの終始コドンの存在により機能的な産物の翻訳できなくなっている。
［実施例６］候補遺伝子CKIIαの発現パターンの解析
感光性遺伝子Hd6をもたないと考えられる日本晴とKasalathのHd6遺伝子を有する日本晴の準同質遺伝子系統について、候補遺伝子CKIIαの発現の違いをRT-PCR法により明らかにした。プライマーには上述の配列番号7及び8を用い、94度で2分、「94度で30秒、62度で40秒、72度で1分」を25サイクル、72度で7分の条件でPCRを行った。その結果、アクチン遺伝子および、Hd6とは異なる領域に存在するCKIIα遺伝子の発現に差は見られなかったのに対して、候補遺伝子であるCKIIα遺伝子の発現量はHd6の準同質遺伝子系統に比較して日本晴では著しく少ないことが明らかとなった（図１４）。
［実施例７］イネ品種の感光性の評価方法の確立
従来その存在が遺伝学的に示されきた感光性遺伝子のうち、E3遺伝子は第3染色体上に存在する可能性が示唆されていた。そこで日本晴とKasalathのHd6のコード領域における塩基配列の差を簡易に識別する方法をもとに、E3とHd6の相互関係を明らかにした。日本晴とKasalathのHd6遺伝子内に存在する変異（配列番号：２の2815番目の塩基AのTへの置換）が制限酵素HindIIIの認識部位となっており、Kasalathでは切断され、日本晴では切断されないことを見い出した。そこでこの変異部位を含む543bpのDNA断片をプライマー「配列番号：20/5'-ACCTGGCAGCATGTTATGAC-3'（センス、第1イントロン））および「配列番号：21/5'-CTACAGATCCACAGAACAGG-3'（アンチセンス、第3イントロン））を用いて増幅した。この増幅断片を制限酵素HindIIIで処理した場合、Kasalathと同じ配列をもつ場合（終止コドンを持たない）には329bpと214bpの二つの断片に切断され、それ以外の場合は切断されなかった（図１５）。従って、感光性を付与できる遺伝子かどうかの判断に利用できる可能性が示唆された。そこで、これまで遺伝解析によってE3遺伝子を持つか持たないかが判明している品種群（Okumoto et al. International Rice Research Institute, Rice Genetics II pp. 778-780 1991）に対して、その有効性を検証した。その結果、E3をもたないと判定された8品種では増幅断片は切断されず、E3を持つと判断された8品種では切断された（表１）。
［実施例８］Hd6遺伝子を発現するトランスジェニック植物の作出とその到穂日数
Hd6の候補遺伝子とみなしたKasalathのCK2遺伝子を含むゲノム断片（Nhe1-BglII 8.9kb）をバイナリーベクターpPZP2H-lacに組み込んだプラスミドpPZPCKII-10Aを日本晴にアグロバクテリウムを介して導入した。その形質転換当代(T0)では、ベクターのみとpPZPCKII-10Aとを導入した個体間で、再分化後の植物体の生育量がそろわなかったために、明瞭な出穂期の違いは観察されなかった。そこで形質転換2個体の自殖後代を日本晴、Hd6の準同質遺伝子系統［NIL(Hd6)］ならびにベクターのみの形質転換体自殖後代とともに閉鎖系温室（茨城県つくば市）において5月16日に播種し、それらの到穂日数を調査した。最初の穂がでた個体の数を2日おきに観測した（表２）。
その結果、候補遺伝子の導入個体後代では到穂日数に大きな分離が生じ、早生個体および晩生個体の出穂期はそれぞれ日本晴およびNIL(Hd6)とほぼ同じであった。またベクターのみの導入個体後代では、全て個体の出穂期が日本晴と同じであった。以上の結果は、候補遺伝子CK2が自然日長条件において出穂期を遅延させるHd6遺伝子の機能をもことを強く示している。
本発明によりイネの感光性遺伝子が提供された。本発明の遺伝子はイネに感光性を付与し、これにより出穂期を調節する機能を有するため、イネの品種育成に大きく貢献し得る。特に、本発明の遺伝子を用いればイネの出穂期を変化させることができ、栽培地域や栽培時期に適応したイネ品種育成に有用である。また、本発明の遺伝子を用いるイネの品種育成は、短期間で高い確実性をもって目的の植物体を得ることができる点で、従来の方法より有利である。
また、本発明により植物の感光性の評価方法が提供された。従来の評価方法は、特定の遺伝子の存在を調べるための検定系統に対象品種を交配して、それらの後代の出穂期の分離から、遺伝子の有無を推定するものであり、1品種について結論を出すために、2〜3年と多大な労力を要した。本発明の方法では、播種後2週間程度経過した苗の一部を採種して、DNAを抽出し、そのDNAを鋳型にしたPCR反応と制限酵素処理だけで判定できる。感光性遺伝子をもつかどうかが判定できれば、その品種の後代における感光性の程度を交配の前に推定でき、交配母本の選定や選抜のための有用な情報となる。また、このマーカーは選抜集団の各個体の感光性遺伝子の有無を上記の方法で容易に判定できることから選抜マーカーとしても利用できる。
【配列表】
Claims (26)
- 植物の感光性を増加させる機能を有する植物由来のタンパク質をコードする、下記（ａ）から（ｃ）のいずれかに記載のDNA。
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１または複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、および／または挿入されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするDNA。
（ｃ）配列番号：２に記載の塩基配列からなるDNAと6M 尿素、 0.4%SDS 、 0.1xSSC の条件下でハイブリダイズするDNA。 - イネ由来である、請求項１に記載のDNA。
- 請求項１または２に記載のDNAの転写産物と完全に相補的な少なくとも 500 塩基の鎖長を有するアンチセンスRNAを発現するDNA。
- 植物の感光性を増加させるために用いる、請求項１または２に記載の DNA 。
- 植物の感光性を低下させるために用いる、請求項３に記載の DNA 。
- 請求項１から３のいずれかに記載の DNA を含むベクター。
- 請求項６に記載のベクターが導入された植物細胞。
- 請求項７に記載の植物細胞を含む形質転換植物体。
- イネである、請求項８に記載の形質転換植物体。
- 請求項８または９に記載の形質転換植物体の子孫またはクローンである、形質転換植物体。
- 請求項８から１０のいずれかに記載の形質転換植物体の繁殖材料。
- 請求項８または９に記載の形質転換植物体の製造方法であって、請求項１または２に記載の DNA を植物細胞に導入し、該植物細胞から植物体を再生させる工程を含む方法。
- 請求項１または２に記載の DNA を植物体の細胞内で発現させることを特徴とする、植物の感光性を増加させる方法。
- 植物の感光性を増加させることにより日長に依存した植物の開花時期を遅延させる、請求項１３に記載の方法。
- 請求項３に記載の DNA を植物体の細胞内で発現させ、植物体の細胞内における、内因性の請求項１または２のいずれかに記載の DNA の発現を抑制することを特徴とする、植物の感光性を低下させる方法。
- 植物の感光性を低下させることにより、日長に依存した植物の開花時期を早める、請求項１５に記載の方法。
- 植物がイネである、請求項１３から１６のいずれかに記載の方法。
- 植物の感光性を評価する方法であって、該植物における請求項１に記載の DNA の存在の有無を検出することを特徴とする方法。
- 植物がイネである、請求項１８に記載の方法。
- 配列番号：２に記載の塩基配列における第 2815 位の塩基 A の T への置換を検出する、請求項１９に記載の方法。
- （ａ） 配列番号：２に記載の塩基配列からなる DNA またはその相補鎖に対するプライマー対であって、配列番号：２に記載の塩基配列の第 2815 位の塩基 A を挟みこむように設計されたプライマー対を用いて、イネのゲノム DNA を鋳型にポリメラーゼ連鎖反応を行なう工程、
（ｂ） 工程（ａ）のポリメラーゼ連鎖反応により増幅された DNA 断片に対して、制限酵素 HindIII を作用させる工程、および
（ｃ） 制限酵素 HindIII の作用により該 DNA 断片が切断されたか否かを検出する工程、を含む、請求項２０に記載の方法。 - 請求項１または２に記載の DNA を含むベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項１または２に記載の DNA によりコードされるタンパク質。
- 請求項２２に記載の宿主細胞を培養し、該細胞またはその培養上清から組換えタンパク質を回収する工程を含む、請求項２３に記載のタンパク質の製造方法。
- 請求項２３に記載のタンパク質に結合する抗体。
- 配列番号：２に記載の塩基配列からなる DNA またはその相補鎖に相補的な少なくとも 15 ヌクレオチドからなる DNA 。
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