JP3646461B2

JP3646461B2 - Magnetic polymer particles and method for producing the same

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Publication number: JP3646461B2
Application number: JP06976297A
Authority: JP
Inventors: 澄笠井; 可君范
Original assignee: JSR Corp
Current assignee: JSR Corp
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2005-05-11
Anticipated expiration: 2017-03-24
Also published as: JPH10270233A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、磁性ポリマー粒子およびその製造方法に関し、更に詳しくは、診断薬担体、細菌分離単体、細胞分離担体、核酸分離精製担体、蛋白分離精製担体、固定化酵素担体、ドラッグデリバリー担体、磁性トナー、磁性インク、磁性塗料などとして有用な磁性ポリマー粒子およびその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
磁性ポリマーラテックスは、磁力を利用することによりラテックス粒子を容易に分離回収することができるなどの利点から、診断薬担体、細胞、蛋白または核酸の分離精製担体などとして、優れた取扱性が得られるものと期待されている。
また、乾燥や加熱することによって成膜する磁性ポリマーラテックスは、磁性トナー、磁性インク、磁性塗料などの用途に適用することも期待される。
斯かる磁性ポリマーラテックスを構成する磁性ポリマー粒子の合成法としては、粒子内部に磁性体が存在するタイプの粒子を得る方法として、下記（１）〜（３）に示す方法が知られている。
【０００３】
（１）磁化処理および親油化処理が施された超常磁性体ではない磁性体を重合性モノマーに分散させ、この重合性モノマーを懸濁重合して磁性ポリマー粒子を得る方法（特開昭５９−２２１３０２号公報参照）。
【０００４】
（２）親油化処理が施された磁性体をビニル芳香族モノマーを含む有機相に分散させ、この分散体を、ホモジナイザーを用いて水性相へ均質に分散させた後重合することにより、比較的小粒径の磁性ポリマー粒子を得る方法（特公平４−３０８８号公報参照）。
【０００５】
（３）特定の官能基を有する多孔ポリマー粒子の存在下に鉄化合物を析出させ、この鉄化合物を酸化することで、当該多孔ポリマー粒子の内部に磁性体を導入し、２μｍ以上の大粒径かつ均一径の磁性ポリマー粒子を得る方法（特公平５−１０８０８号公報）。
【０００６】
しかしながら、上記（１）の方法では、超常磁性体ではない保磁力を有する磁性体を磁化処理するために、重合の際に分散粒子が凝集融着し、得られる磁性ポリマー粒子は、過大な粒径を有するものとなり、そのような磁性ポリマー粒子は、水性媒体中で沈降しやすいという問題がある。また、特定物質の吸着剤として用いる場合に、粒子の表面積が小さいために十分な量の目的物質を吸着することができないという問題もある。
また、上記（１）の方法を開示する特開昭５９−２２１３０２号公報においては、スチレンを主体とする重合性モノマーが使用されている。然るに、スチレン系の重合体は、磁性体との親和性が低いために、重合反応系（モノマー）において良好に分散されていた磁性体が、重合後のポリマー粒子内部において分離凝集したり、ポリマー粒子表面に析出したりするという問題がある。
また、スチレンを主体とする重合性モノマーを用いて合成された磁性ポリマー粒子は、多量に導入された芳香環構造のために紫外線を吸収して蛍光発色する。この結果、当該磁性ポリマー粒子を生理活性物質の同定検知に使用する場合には、多くの制約が生じるという問題もある。
さらに、スチレンを主体とする重合性モノマーを用いて得られる磁性ポリマー粒子は、蛋白に対する吸着性が高く非特異吸着性が大きいため、当該磁性ポリマー粒子を用いた診断系ではバックグランドが大きいという問題がある。
【０００７】
上記（２）の方法により得られる磁性ポリマー粒子は、粒子内部における磁性体の均一分散性に劣るものとなり、当該磁性体は、粒子表面近傍に局在化される。このため、磁性ポリマー粒子から鉄イオンが溶出したり、酸性条件下において磁性体が溶解流出したりして磁性ポリマー粒子としての特性が損なわれるという問題がある。
【０００８】
上記（３）の方法は、磁性ポリマー粒子の製造工程が複雑であり、また、磁性体がポリマーによってカプセル化されていないため、鉄イオンが溶出するという問題がある。
【０００９】
一方、ポリマー粒子エマルジョンの中で鉄化合物を析出させることにより、当該ポリマー粒子の表面をフェライト化する方法が開示されている（特開平３−１１５８６２号公報および特開平５−１３８００９号公報参照）。しかしながら、この方法により得られる磁性ポリマー粒子は、粒子表面に磁性体が存在するために、鉄イオンの溶出が顕著に発生するという問題がある。
上記のような従来の合成法によって得られる磁性ポリマー粒子を、例えば診断薬担体として用いると、十分な感度が得られなかったり、非特異酵素反応を示して良好な実用性能が得られなかったりする。この理由は、磁性ポリマー粒子の粒子表面に磁性体が部分的に露出し、あるいは粒子表面と粒子内部に存在する磁性体との間にミクロパスが形成されているため、鉄イオンが外部に溶出して実用性能に悪影響を及ぼすからであると考えられる。
【００１０】
鉄イオンの外部への溶出をある程度抑制するものとして、磁性体粒子を芯材として疎水性の架橋モノマーを水相中で重合することにより、磁性体粒子を内包した磁性ポリマー粒子を得る技術が開示されているが（特開平２−２８６７２９号公報参照）、この技術によっても、鉄イオンの溶出を十分に抑制することはできない。また、磁性ポリマー粒子の表面に、磁性体を含まないポリマーからなる被覆層を形成する技術が開示されているが（特公平５−１６１６４号公報参照）、その具体的な方法は、界面重縮合法とスプレードライ噴霧法のみしか示されておらず適用範囲が限られている。
【００１１】
また、乳化重合法によって磁性ポリマー粒子を合成する技術が開示されているが（特公平３−５７９２１号公報）、乳化重合法によっては粒径の大きい粒子を合成することが困難であり、従って、磁気沈降性の良好な磁性ポリマー粒子を再現性よく得るには至っていない。
【００１２】
以上のように、従来の合成法により得られる磁性ポリマー粒子は、鉄イオンの外部への溶出という問題を有するために、鉄イオンの溶出による影響を受けない用途・分野にしか適用することができないのが現状である。このため、磁性体の分散性に優れ、鉄イオンを外部に溶出させない磁性ポリマー粒子の開発が望まれている。
また、実用上の観点から、磁性ポリマー粒子が、水性媒体中で沈降しにくく、均質な分散状態を維持していることが必要である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の第１の目的は、超常磁性体の均一分散性に優れた新規な磁性ポリマー粒子を提供することにある。本発明の第２の目的は、水性媒体中で沈降しにくい磁性ポリマー粒子を提供することにある。本発明の第３の目的は、磁気応答性に優れているとともに、磁性体に由来する鉄イオンが外部に溶出されにくく、種々の用途・分野に広く適用することのできる磁性ポリマー粒子を提供することにある。本発明の第４の目的は、生理活性物質に対して良好な結合性を有する磁性ポリマー粒子を提供することにある。本発明の第５の目的は、上記のような優れた特性を有する磁性ポリマー粒子を確実に製造することのできる方法を提供することにある。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の磁性ポリマー粒子は、（Ａ）２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールアクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールメタクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールアクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールメタクリレート、シクロヘキセンジアクリレート、シクロヘキセンジメタクリレート、並びに、シクロヘキシル基の水素原子の一部が炭素数１〜５のアルキル基により置換された置換シクロアルキルアクリレートおよび置換シクロアルキルメタクリレートから選ばれた、アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレートに由来する構造単位（以下「構造単位Ａ」という）３０〜９９重量％、（Ｂ）不飽和カルボン酸に由来する構造単位（以下「構造単位Ｂ」という）１〜２０重量％、並びに（Ｃ）前記アルキル（メタ）アクリレートおよび前記不飽和カルボン酸と共重合可能な芳香族ビニル化合物に由来する構造単位（以下「構造単位Ｃ」という）０〜６９重量％からなる共重合体（以下「特定重合体」という）１００重量部に対して、超常磁性体１〜１００重量部を含有してなり、数平均粒子径が０．０２〜３０μｍであることを特徴とする。また、（Ａ）アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレートに由来する構造単位３０〜９９重量％、（Ｂ）不飽和カルボン酸に由来する構造単位１〜２０重量％、並びに（Ｃ）前記アルキル（メタ）アクリレートおよび前記不飽和カルボン酸と共重合可能なビニルモノマーに由来する構造単位０〜６９重量％からなる共重合体１００重量部に対して、超常磁性体１〜１００重量部を含有してなり、数平均粒子径が０．０２〜３０μｍである粒子にオリゴヌクレオチドまたは生理活性蛋白質を固定してなる磁性ポリマー粒子が好ましい。
【００１５】
本発明の磁性ポリマー粒子の製造方法は、（Ａ）２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールアクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールメタクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールアクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールメタクリレート、シクロヘキセンジアクリレート、シクロヘキセンジメタクリレート、並びに、シクロヘキシル基の水素原子の一部が炭素数１〜５のアルキル基により置換された置換シクロアルキルアクリレートおよび置換シクロアルキルメタクリレートから選ばれた、アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレートを３０〜９９重量％、
（Ｂ）不飽和カルボン酸を１〜２０重量％、並びに
（Ｃ）前記アルキル（メタ）アクリレートおよび前記不飽和カルボン酸と共重合可能な芳香族ビニル化合物を０〜６９重量％の割合で含有するモノマー中に超常磁性体を分散させてモノマー組成物を調製し、
このモノマー組成物を水性媒体中に分散させて懸濁液を得、
この懸濁液中において、前記モノマーを重合させることを特徴とする。
【００１６】
【作用】
（１）超常磁性体は、ポリマー（特定重合体）中において均一に分散され、好適な粒子径の磁性ポリマー粒子を構成することができる。
（２）超常磁性体が分散されて構成される磁性ポリマー粒子は、その合成の際に、分散粒子の凝集融着が生じにくく、好適な粒子径を有するものとなる。従って、当該磁性ポリマー粒子は、水性媒体中で沈降されにくく、当該水性媒体中において均質な分散状態で存在することができる。
（３）本発明の磁性ポリマー粒子には、超常磁性体が特定の割合で含有されているので、優れた磁気応答性が発現されるとともに、当該超常磁性体に由来する金属イオンが外部に溶出することが防止される。
（４）特定の構造単位よりなる特定重合体は、本発明の磁性ポリマー粒子に、生理活性物質に対する良好な結合性を付与することができる。
【００１７】
【発明の実施の形態】
＜本発明の磁性ポリマー粒子＞
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明の磁性ポリマー粒子は、特定共重合体よりなる粒子中に超常磁性体が分散含有（内包）されて構成されている。
【００１８】
＜特定重合体＞
本発明の磁性ポリマー粒子を構成する特定重合体は、前記構造単位Ａと前記構造単位Ｂとを必須成分として含有し、前記構造単位Ｃを任意成分として含有する共重合体である。
【００１９】
前記構造単位Ａを構成するアルキル（メタ）アクリレート〔以下「単量体（Ａ）」ともいう〕におけるアルキル基の炭素数は、通常４〜２０とされ、好ましくは６〜１８とされる。このアルキル基は、直鎖状、分岐状、環状の何れのものであってもよい。
斯かる単量体（Ａ）の具体例としては、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート；シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールアクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールメタクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールアクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールメタクリレート、シクロヘキセンジアクリレート、シクロヘキセンジメタクリレート；メチル置換シクロヘキシルアクリレート、メチル置換シクロヘキシルメタクリレートなど「シクロヘキシル基」の水素原子の一部が炭素数１〜５のアルキル基により置換された置換シクロアルキルアクリレート、置換シクロアルキルメタクリレートなどが挙げられ、これらは、単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレートが好ましい。
【００２０】
特定重合体中における構造単位Ａの含有割合は、通常３０〜９９重量％とされ、好ましくは５０〜９９重量％とされる。構造単位Ａの含有割合が３０重量％未満である場合には、重合安定性と磁性体の分散性が不良になるほか、得られる磁性ポリマー粒子の抗体等の生理活性蛋白質に対する吸着性が不良となり、非特異吸着現象が顕著になる。一方、構造単位Ａの含有割合が９９重量％を超える場合には、得られる共重合体の疎水性が過大となり、当該共重合体によるポリマー粒子の表面は、蛋白に対する物理的吸着性が小さくなると共に、蛋白、酵素、核酸など生理活性物質に対する化学結合性にも劣るものとなる。
【００２１】
前記構造単位Ｂを構成する不飽和カルボン酸〔以下「単量体（Ｂ）」ともいう〕は、ラジカル重合性の不飽和結合およびカルボキシル基を分子中に有する重合性単量体である。斯かる単量体（Ｂ）の具体例としては、アクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、フマル酸、マレイン酸などを挙げることができる。
特定重合体中における構造単位Ｂの含有割合は、通常１〜２０重量％とされ、好ましくは２〜１５重量％とされる。構造単位Ｂの含有割合が１重量％未満である場合には、得られる共重合体の疎水性が過大となり、当該共重合体によるポリマー粒子の表面は、蛋白に対する物理的吸着性が小さくなると共に、蛋白、酵素、核酸など生理活性物質に対する化学結合性にも劣るものとなる。一方、構造単位Ｂの含有割合が２０重量％を超える場合には、得られる共重合体の親水性が過大となり、当該共重合体によるポリマー粒子の表面は、蛋白に対する良好な結合性を得ることができない。
【００２２】
前記構造単位Ｃを構成するビニルモノマー〔以下「単量体（Ｃ）」ともいう〕の具体例としては、スチレン、α−メチルスチレンなどの芳香族ビニル化合物；メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレートなど、アルキル基の炭素数が１〜３であるアルキル（メタ）アクリレート；アクリロニトリルなどのシアン化ビニル化合物；エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ポリエチレングリコールジアクリレート、ポリエチレングリコールジメタクリレート、ジアリルフタレート、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどの多官能（メタ）アクリレート化合物；ジビニルベンゼンなどの多官能芳香族ビニル化合物などの多官能ビニル化合物を挙げることができ、これらは、単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。これらのうち、アルキル基の炭素数が１〜３であるアルキル（メタ）アクリレートが好ましい。また、前記単量体（Ａ）として２−エチルヘキシル（メタ）アクリレートのみを用いる場合には、単量体（Ｃ）として多官能ビニル化合物を用いることが好ましい。
【００２３】
特定重合体中における構造単位Ｃの含有割合は、通常０〜６９重量％とされる。なお、芳香族ビニル化合物に由来する構造単位Ｃの含有割合は０〜４９重量％であることが好ましく、更に好ましくは０〜２０重量％とされる。
また、前記単量体（Ａ）として２−エチルヘキシル（メタ）アクリレートのみを用いる場合において、好適に使用される多官能ビニル化合物に由来する構造単位Ｃの含有割合は０．５〜３０重量％であることが好ましく、更に好ましくは１〜２０重量％とされる。多官能ビニル化合物に由来する構造単位の割合が０．５重量％未満である場合には、得られる磁性ポリマー粒子が十分な硬度を有するものとならず、粒子の変形および粒子同士の融合を招くことがある。一方、多官能ビニル化合物に由来する構造単位の割合が３０重量％を超える場合には、得られる磁性ポリマー粒子が脆くなって実用的な強度を有するものとならないことがある。
【００２４】
本発明の磁性ポリマー粒子を構成する特定重合体の分子量（ポリスチレン換算の重量平均分子量）は、通常１０，０００以上とされ、好ましくは２０，０００〜１，０００，０００とされる。
【００２５】
＜超常磁性体＞
本発明の磁性ポリマー粒子においては、粒子中に分散含有されている磁性体が「超常磁性体」である点に特徴を有するものであり、超常磁性体が含有されていることにより、良好な磁気吸引性を有しながら、磁気吸引を繰り返しても粒子には実質的に磁気履歴が残らず良好な再分散性を維持することができる。
なお、本発明での超常磁性体とは、磁性粒子に５０００エールステッドの強い磁場をかけた後、ゼロ磁場に戻したときの磁化（残留磁化）が５０００エールステッドの磁場のときの磁化（飽和磁化）の１／３以下である磁性体を言う。
本発明の磁性ポリマー粒子を構成する超常磁性体としては、例えば四三酸化鉄（Ｆｅ₃Ｏ₄）、γ−重三二酸化鉄（γ−Ｆｅ₂Ｏ₃）、各種フェライト、鉄、マンガン、コバルト、クロムなどの金属、コバルト、ニッケル、マンガンなどの合金を挙げることができ、これらのうち、四三酸化鉄およびフェライトが特に好ましい。
本発明の磁性ポリマー粒子を構成する超常磁性体の一次粒子の粒子径は、４０〜３００Åであることが好ましく、更に好ましくは５０〜２００Å、特に好ましくは６０〜１５０Åとされる。超常磁性体の一次粒子の粒子径が４０Å未満である場合には、当該超常磁性体を親油化処理するための処理剤（脂肪酸、シランカップリング剤、チタンカップリング剤）が多量に必要となり、過剰量の処理剤によって超常磁性体による良好な磁気応答性が損なわれることがある。一方、超常磁性体の一次粒子の粒子径が３００Åを超える場合には、得られる磁性ポリマー粒子が磁化されたものとなり、当該磁性ポリマー粒子が相互に凝集して水性媒体中で沈降しやすくなる。なお、球状でない超常磁性体の一次粒子の粒子径としては、それぞれの超常磁性体の最長径と最短径との平均値をとるものとする。
【００２６】
本発明の磁性ポリマー粒子を構成する超常磁性体の含有割合としては、特定重合体１００重量部に対して、通常１〜１００重量部とされ、好ましくは５〜８０重量部、更に好ましくは１０〜６０重量部とされる。超常磁性体の含有割合が１重量部未満である場合には、得られる粒子が十分な磁気応答性を発現することができず、一方、超常磁性体の含有割合が１００重量部を超える場合には、得られる磁性ポリマー粒子の粒子表面に超常磁性体が露出して金属イオンの溶出などの問題を招き、また、当該磁性ポリマー粒子が脆くなって実用的な強度を有するものとならない。
【００２７】
本発明の磁性ポリマー粒子においては、▲１▼ 粒子内部を構成する特定重合体中に超常磁性体が均一に分散されていることが好ましく、さらに、▲２▼ 粒子表面および表面近傍に超常磁性体が殆ど存在していないことが好ましい。
ここに、粒子表面および表面近傍に超常磁性体が殆ど存在していないか否かの判定方法としては、磁性ポリマー粒子０．１ｇを、７０℃に加熱された純水１０ミリリットル中に２時間浸漬させた後、当該純水中に溶出した金属含有率を測定する。そして、この金属含有率が１０ｐｐｍ以下である場合に、前記磁性ポリマー粒子は「粒子表面および表面近傍に超常磁性体が殆ど存在していない状態である」と判定することができる。
【００２８】
＜磁性ポリマー粒子の数平均粒子径＞
本発明の磁性ポリマー粒子の数平均粒子径は、通常０．０２〜３０μｍとされ、好ましくは０．１〜２０μｍ、更に好ましくは０．２〜１５μｍ、特に好ましくは０．３〜１０μｍとされる。数平均粒子径が０．０２μｍ未満である場合には、十分な磁気応答性を発現することができない。一方、数平均粒子径が３０μｍを超える場合には、当該磁性ポリマー粒子が水性媒体中で沈降しやすくなり、また、当該磁性ポリマー粒子は粒子表面積が小さいものとなり、特定物質の吸着剤としてこれを用いる場合に、十分な量の目的物質を吸着することができない。
【００２９】
本発明の磁性ポリマー粒子は、水性媒体中で沈降しにくく、当該水性媒体中において均質な分散状態で存在することができる（以下、この特性を「静置安定性」という。）。従って、本発明の磁性ポリマー粒子は取扱性の観点からも優れている。
ここに、静置安定性の評価方法としては、磁性ポリマー粒子を水性媒体に分散させて固形分濃度が１重量％の磁性ポリマーラテックスを調製し、この磁性ポリマーラテックスを液相の高さが２ｃｍになるよう容器内に収容し、磁性ポリマー粒子が均一に分散されるまで容器を振盪した後、１０分間静置したときに、液面から液面下１ｃｍに至る液相の上層部分の固形分濃度を測定する。そして、この固形分濃度が０．１重量％以上であれば静置安定性に優れているとされる。
本発明の磁性ポリマー粒子においては、この固形分濃度が、通常０．１重量％以上であり、好ましいものは０．３重量％以上、更に好ましいものは０．６重量％以上である。
【００３０】
また、本発明の磁性ポリマー粒子は、その表面に、超常磁性体を含まないポリマーからなる層（以下「表面被覆層」ともいう）が形成されていることが好ましい。このような構成とすることにより、粒子内部に存在する超常磁性体による優れた取扱性が損なわれることなく、磁性ポリマー粒子からの鉄イオンの溶出を確実に防止することができる。ここで、表面被覆層の厚さは、使用する超常磁性体の最長径よりも大きいことが好ましく、例えば１００Å以上とされる。
【００３１】
＜本発明の磁性ポリマー粒子の製造方法＞
本発明の製造方法は、アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレート〔前記単量体（Ａ）〕を３０重量％以上の割合で含有するモノマー中に超常磁性体を分散させてモノマー組成物を調製し、このモノマー組成物を水性媒体中に乳化分散（微粒子化）させて油滴分散体である懸濁液を得、この懸濁液中において、前記モノマーを重合させる点に特徴を有するものである。
上記のような方法によれば、本発明の磁性ポリマー粒子が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を確実に製造することができる。
【００３２】
本発明の製造方法においては、親油化処理が施された超常磁性体を好適に使用することができる。親油化処理が施されていない超常磁性体を使用して磁性ポリマー粒子を製造すると、当該超常磁性体が磁性ポリマー粒子の粒子表面近傍に偏在し、更には粒子表面に超常磁性体が露出して、鉄イオンの水性媒体への溶出を招くことがある。
超常磁性体を親油化処理する方法としては、シランカップリング剤、チタンカップリング剤などの表面処理剤により処理する方法、超常磁性体に脂肪酸塩などを吸着させる方法など特に限定されるものではない。また、市販の磁性流体から分散媒を除去することにより得られる超常磁性体を使用することもできる。
【００３３】
本発明の製造方法において、超常磁性体の分散媒として使用されるモノマーは、疎水性のモノマーである。
疎水性のモノマーを使用することにより、親油化処理が施された超常磁性体を当該モノマー中に均一に分散させることができる。そして、このようにして得られるモノマー組成物には、超常磁性体の凝集による粗大粒子などが生成されず、従って、当該モノマー組成物を、水性媒体中に均一に乳化分散させることが可能となる。
【００３４】
ここに、この明細書において「疎水性のモノマー」とは、２０℃における水への溶解度が０．１重量％未満であるモノマーをいうものとし、この溶解度が０．１重量％以上であるモノマーを、以下「親水性のモノマー」というものとする。
なお、超常磁性体の分散媒として使用されるモノマーが２種以上の混合物である場合は、そのうち６０重量％以上が疎水性モノマーであれば当該混合モノマー中に親水性のモノマーが含有されていてもよい。
【００３５】
ここに、分散媒の一部を構成する親水性のモノマーとしては、例えばアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、フマル酸などの不飽和カルボン酸〔前記単量体（Ｂ）〕、メチルアクリレート、メチルメタクリレート、エチルアクリレート、エチルメタクリレート、エチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、ジエチレングリコールジアクリレート、ジエチレングリコールジメタクリレート、テトラエチレングリコールジアクリレート、テトラエチレングリコールジメタクリレート、ジアリルフタレート、酢酸ビニルなどを挙げることができる。
【００３６】
モノマー組成物を水性媒体中に乳化分散させるために使用する分散機としては、従来公知の超音波分散機、高圧ホモジナイザーおよび高剪断速度の分散機などを使用することができる。
超音波分散機の形式は特に制限されるものではなく、例えば、ホーン型発振子を備えてなる分散機、プレート型発振子を備えてなる分散機、発振部に液を流通させる連続式の分散機などを例示することができる。また、高剪断速度の分散機としては、例えばホモミキサー、コロイドミル、ジェットホモジナイザー、高圧ホモジナイザーなどを例示することができ、これらの分散機は、目的とする分散粒子径に応じて適宜選択することができる。
さらに、多孔膜または多孔フィルターを介してモノマー組成物を水性媒体中に押し出すことによって有モノマー組成物を水性媒体中に乳化分散させる膜乳化法、あるいはノズルから加圧、振動または高電圧等を加えてモノマー組成物を吐出するノズル法を採用することもできる。
【００３７】
本発明の製造方法において、モノマー組成物の分散媒である水性媒体としては水を用いることが好ましい。
また、水性媒体中には、アニオン系界面活性剤、ノニオン系界面活性剤、水溶性高分子、無機系懸濁保護剤などの界面活性剤、乳化剤または懸濁保護剤が添加されていてもよい。これらのうち、幅広い粒子径の粒子を得る場合に適用することができ、正負いずれの表面荷電の粒子も合成できるという点から部分ケン化ポリビニルアルコールが好ましい。
【００３８】
本発明の磁性ポリマー粒子の製造方法において、モノマーを重合するための重合開始剤としては、特に制限されるものではなく、従来公知のラジカル重合開始剤、例えば有機過酸化物、アゾ系開始剤、過硫酸塩系開始剤などを使用することができる。これらのうち、油溶性重合開始剤を使用することが好ましい。特に、疎水性モノマー中に超常磁性体を分散してモノマー組成物を調製する際に、油溶性重合開始剤を添加することが好ましく、これにより、超常磁性体を含有しないポリマー粒子の生成を防止することができる。
【００３９】
モノマーの重合反応は無酸素雰囲気下において行うことが好ましい。反応温度は、使用する重合開始剤の分解温度によっても異なるが、例えばベンゾイルペルオキシドを用いる場合には７５〜８５℃で好適に重合反応を進行させることができる。
【００４０】
本発明の製造法では、磁性ポリマー粒子の調製の後、重合の際に使用した界面活性剤または懸濁保護剤を除くために粒子の洗浄を行ってもよい。この際、水あるいはアルコール、アセトン等の水溶性溶剤を使用することが好ましく、これに少量の界面活性剤を添加することも好ましい。
また、必要であれば、重合した磁性ポリマー粒子を沈降分離、凝集分離、遠心分離、磁気分離等の手段で分級して目的とする粒子径、粒子径分布に調整することもできる。
【００４１】
本発明の製造方法においては、得られる磁性ポリマー粒子からの超常磁性体の流出を確実に防止するために、下記の工程（ａ）〜（ｃ）の何れかの工程を実施することが好ましい。
なお、下記の工程（ａ）〜（ｃ）に供される本発明の磁性ポリマー粒子を以下において「改質前粒子」ともいう。
【００４２】
工程（ａ）：改質前粒子の存在下にビニル系のモノマーを重合させる工程。
工程（ｂ）：改質前粒子に鉄溶解剤を接触させ、当該粒子の表面近傍に存在している超常磁性体を溶出除去する工程。
工程（ｃ）：改質前粒子に、有機性塩基および／または水溶性溶剤を接触させる工程。
【００４３】
＜工程（ａ）＞
この工程（ａ）は、改質前粒子の存在下にビニル系のモノマーを重合させる工程である。この工程（ａ）により、磁性ポリマー粒子の表面において、超常磁性体を含まない表面被覆層が重合形成される。そして、この工程（ａ）を経て得られる磁性ポリマー粒子（以下「表面改質粒子（ａ）」ともいう。）によれば、鉄系の超常磁性体の溶出が確実に抑制され、この結果、磁性ポリマー粒子としての性能の向上（用途の拡大）、性能の経時的安定性の向上（信頼性の向上）を図ることができる。
【００４４】
工程（ａ）において使用されるビニル系のモノマーとしては、最終的に得られる磁性ポリマー粒子〔表面改質粒子（ａ）〕の用途などに応じて適宜選択することができ、芳香族ビニル化合物、（メタ）アクリレート化合物、不飽和カルボン酸などを好ましい化合物として挙げることができる。
また、表面改質粒子（ａ）の表面に存在する非磁性ポリマー成分（表面被覆層）を効率的に形成させる観点からは、前記ビニル系のモノマーとして、改質前粒子を構成するポリマー（特定共重合体）に吸収されにくいモノマー、例えば水溶性ビニルモノマーを使用することが好ましい。
【００４５】
工程（ａ）におけるモノマーの使用量は、改質前粒子１００重量部に対して、通常１０〜１０００重量部とされ、好ましくは２０〜５００重量部、更に好ましくは３０〜２００重量部とされる。モノマーの使用量が過少である場合には、超常磁性体の流出を抑制するために十分な表面被覆層を形成することが困難であり、一方、モノマーの使用量が過大である場合には、この工程終了後に、磁性を有しないポリマー粒子が生成されやすい。
【００４６】
磁性ポリマー粒子（改質前粒子）の存在下にビニル系のモノマーを重合させるための具体的方法としては、特に限定されるものでないが、例えば、
（イ）改質前粒子にビニル系のモノマーを吸収させた後、改質前粒子内におけるモノマーを重合させるモノマー吸収重合法、
（ロ）改質前粒子が水中に分散されている磁性ポリマーラテックス中にビニル系のモノマーを連続的または間欠的に供給し、改質前粒子をシード粒子として前記モノマーを重合させるシード重合法、
（ハ）改質前粒子の粒子表面に吸着相を形成し、当該吸着相内においてビニル系のモノマーを重合させるカプセル重合法などを挙げることができる。
【００４７】
これらの方法のうち、改質前粒子が小径の粒子であっても確実に表面被覆層を形成することができるという観点から、上記（イ）および上記（ロ）の方法が好ましい。
また、上記（ロ）の方法においては、改質前粒子を構成するポリマーを得るための重合反応が実質的に終了した後（具体的には、重合転化率が８５％以上になった時点）で、当該重合反応系にビニル系のモノマーを添加して、当該モノマーの重合反応を継続させることが好ましい。
【００４８】
＜工程（ｂ）＞
この工程（ｂ）は、改質前粒子に鉄溶解剤を接触させ、当該粒子の表面近傍に存在している超常磁性体を予め溶出除去する工程である。
ここに「鉄溶解剤」とは、改質前粒子を構成する鉄成分（超常磁性体）を溶解することができ、しかも、当該改質前粒子を構成するポリマーを実質的に溶解しない物質をいうものとする。
【００４９】
また、改質前粒子に鉄溶解剤を接触させる方法としては、▲１▼ 当該改質前粒子に鉄溶解剤を直接接触させる方法、▲２▼ 改質前粒子が水中に分散されてなる分散体中において両者を接触させる方法、具体的には、改質前粒子が分散含有されてなる磁性ポリマーラテックス中に鉄溶解剤の水溶液を添加する方法などを挙げることができ、上記▲２▼の方法が好ましい。
【００５０】
改質前粒子に鉄溶解剤を接触させることにより、改質前粒子の表面および表面近傍に存在する鉄成分が優先的に溶解除去される。そして、この工程（ｂ）を経て得られる磁性ポリマー粒子（以下「表面改質粒子（ｂ）」ともいう。）は、鉄系の超常磁性体の溶出量が実用上問題とならないレベルまで抑制され、この結果、磁性ポリマー粒子としての性能の向上（用途の拡大）、性能の経時的安定性の向上（信頼性の向上）を図ることができる。
【００５１】
工程（ｂ）に使用することのできる鉄溶解剤としては、無機酸、有機酸、鉄との錯形成剤を挙げることができる。
【００５２】
ここに、鉄溶解剤として使用可能な無機酸としては、硫酸、塩酸、硝酸などを例示することができる。
無機酸は、鉄成分の溶解速度が大きいため、鉄溶解剤として無機酸を使用する場合には、改質前粒子の表面および表面近傍だけでなく、粒子内部に含有されている超常磁性体まで溶解除去してしまうことがある。従って、鉄成分を必要以上に溶解除去させない（粒子内部の超常磁性体まで溶解させない）よう、当該無機酸の濃度、処理時間などを調整することにより、鉄成分の溶解量を制御することが好ましい。
【００５３】
ここに、無機酸を使用する場合における鉄成分の好適な溶解除去量としては、改質前粒子中に含有されていた鉄成分（超常磁性体）の重量を「ｘ」、表面改質粒子（ｂ）中に含有されている鉄成分（超常磁性体）の重量を「ｙ」とするとき、〔（ｘ−ｙ）／ｘ〕の値が０．０５〜０．６となる量であることが好ましい。この値が０．０５未満である場合（溶出除去量が過少である場合）には、磁性ポリマー粒子の表面およびその近傍に残存する鉄成分（超常磁性体）が使用時において溶出し、生化学的な用途など、適用分野によっては十分な実用性能を有するものとならないことがある。一方、〔（ｘ−ｙ）／ｘ〕の値が０．６を超える場合（溶出除去量が過大である場合）には、粒子内部の超常磁性体まで溶出され、磁気沈降速度が低下するなど、十分な磁気応答性を有するものとならないことがある。
【００５４】
鉄溶解剤として無機酸を使用する場合における処理条件は、鉄成分の溶解除去量（ｘ−ｙ）を目安として、これを確保できるように選定される。好ましい処理条件は、鉄系超常磁性体や無機酸の種類によって異なるが、溶解除去量の制御の観点から、処理温度が０〜１００℃、処理時間が０．５〜２０時間とされる。
改質前粒子が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）中で、改質前粒子に硫酸を接触させる態様において、処理条件の好適な一例を示すと、水性媒体中における改質前粒子の濃度が４ｇ／リットル、硫酸濃度が２規定、処理温度が２５℃、処理時間が２時間とされる。また、処理後における磁性ポリマー粒子〔表面改質粒子（ｂ）〕は、洗浄・再分散した後、当該表面改質粒子（ｂ）の分散体にアルカリ性の化合物を添加して中和処理することが好ましい。
【００５５】
鉄溶解剤として使用可能な有機酸としては、シュウ酸、クエン酸、クロロ酢酸、メルカプト酢酸、スルホサリチル酸などを例示することができ、これらのうち、メルカプト酢酸およびスルホサリチル酸が好ましい。
また、鉄溶解剤として使用可能な錯形成剤としては、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸グアニジンなどのチオシアン酸塩；２−メルカプトエタノール、ジチオグリセリン、ジチオトリメチロールプロパン、ジチオエリトリトールなどのメルカプト化合物；ｏ−フェナントロリン、２，２’−ビピリジル、８−キノリノール、エチレンジアミン４酢酸などの窒素系錯形成剤などを例示することができる。これらのうち、チオシアン酸カリウム、チオシアン酸グアニジン、２−メルカプトエタノール、ジチオエリトリトール、ｏ−フェナントロリン、２，２’−ビピリジルが好ましい。
これらの鉄溶解剤は、単独で使用してもよいが、２種以上を組み合わせて使用することが好ましい。この場合において、有機酸とチオシアン酸塩との組合せ、メルカプト化合物とチオシアン酸塩との組合せのように、タイプの異なる鉄溶解剤を併用することが好ましい。
【００５６】
鉄溶解剤として使用される有機酸および錯形成剤は、改質前粒子の表面および表面近傍に存在する鉄成分を選択的に溶解除去することができる。
鉄溶解剤として有機酸を使用する場合における鉄成分の好適な溶解除去量としては、改質前粒子の表面および表面近傍に存在する超常磁性体の量などによって異なるが、表面および表面近傍に存在する超常磁性体の量が少ない場合において、当該改質前粒子中に含有されていた鉄成分（超常磁性体）の重量を「ｘ」、表面改質粒子（ｂ）中に含有されている鉄成分（超常磁性体）の重量を「ｚ」とするとき、〔（ｘ−ｚ）／ｘ〕の値が０．０１〜０．４となる量であることが好ましい。
【００５７】
有機酸および／または錯形成剤を使用する場合における処理条件としては、無機酸を使用する場合ほど厳密に制御する必要はない。
改質前粒子が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）中で、この改質前粒子に、チオシアン酸グアニジン（錯形成剤）および２−メルカプトエタノール（錯形成剤）を接触させる態様において、処理条件の好適な一例を示すと、水性媒体中における改質前粒子の濃度が５０ｇ／リットル、チオシアン酸グアニジンの濃度が１モル／リットル、２−メルカプトエタールの濃度が１重量％、処理温度が２５℃、処理時間が１２時間とされる。
【００５８】
工程（ｂ）を経て得られる表面改質粒子（ｂ）において、粒子表面および表面近傍に残存する鉄系の超常磁性体の量は、可能な限り少ないことが好ましい。
具体的には、洗浄処理された表面改質粒子（ｂ）０．１ｇを、７０℃に加熱された純水１０ミリリットル中に２時間浸漬させた後、当該純水中に溶出した金属含有率が１０ｐｐｍ以下であることが好ましく、更に好ましくは１ｐｐｍ以下とされる。
【００５９】
＜工程（ｃ）＞
この工程（ｃ）は、改質前粒子に、有機性塩基および／または水溶性溶剤を接触させる工程である。
【００６０】
工程（ｃ）に使用することのできる有機性塩基の具体例としては、アンモニア、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、トリメチルアミンなどの有機アミン化合物を挙げることができる。
【００６１】
工程（ｃ）に使用することのできる水溶性溶剤は、２５℃における水への溶解度が１重量％以上であって、ポリマーに親和性を有する有機溶剤である。かかる水溶性溶剤の具体例としては、アセトン、メルカプトエタノール、エリトリトール、ジチオエリトリトール、酢酸エチル、ブチルカルビトールアセテート、フェニルセロソルブなどを挙げることができる。
【００６２】
この工程（ｃ）においては、磁性ポリマー粒子（改質前粒子）の水性分散液に有機性塩基および／または水溶性溶剤を添加することにより行われる。
ここに、有機性塩基の使用量は、通常、改質前粒子の水性分散液の０．１〜２０容量％とされる。また、水溶性溶剤の使用量は、通常、改質前粒子の水性分散液の１〜９５容量％とされる。
また、水性分散液における改質前粒子の濃度は特に制限されるものではないが、０．１〜２０重量％であることが好ましい。なお、改質前粒子が沈降する場合には、適度に攪拌しながら処理することが好ましい。
また、前記水性分散液のｐＨは、通常９以上とされ、好ましくは１１以上とされる。処理温度としては特に制限はないが、５０℃〜８０℃程度であることが好ましい。処理時間も特に制限はないが、１〜４０時間であることが好ましい。
【００６３】
この工程（ｃ）を経て得られる磁性ポリマー粒子（以下「表面改質粒子（ｃ）」ともいう。）は表面荷電量の大きな粒子、具体的には、表面荷電量が０．０５ミリ当量／ｇ以上の粒子となる。ここに、「表面荷電量」は、電導度滴定により、磁性ポリマー粒子の表面に存在する酸を測定して得られる値であり、ミリ当量／ｇ（磁性ポリマー粒子１ｇ当たりの粒子表面に存在するカルボキシル基のミリ当量数）で表される。この測定法が記載されている文献としては「Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３７Ｐ．１６１（１９７２）」を挙げることができる。
このように大きな表面荷電量を有する粒子は、カルボキシル基変性粒子として実用上問題なく使用することができる。
また、このような大きな表面荷電量を有する粒子は、粒子の使用において高い電解質濃度の分散媒でも分散安定性が良く、また粒子を沈降させた後の再分散性に優れるほか、粒子表面の官能基を利用して表面に核酸あるいは抗原・抗体、酵素等の生理活性物質等を化学結合させることができる。
所定の表面荷電量を得るための方法として、通常行われている方法をそのまま使用することができる。例えば、重含時に共重合できる酸モノマーを直接加える方法、共重合できるエステル系モノマーを加えて粒子形成した後に、加水分解して表面荷電を得る方法、又は、グルタルメタアクリレートのような反応性の高い官能基をもつ共重合可能なモノマーと共重合させても良い。
【００６４】
本発明に係る磁性ポリマー粒子（本発明の磁性ポリマー粒子および本発明の方法により得られる磁性ポリマー粒子）は、診断薬担体、細菌分離単体、細胞分離担体、核酸分離精製担体、蛋白分離精製担体、固定化酵素担体、ドラッグデリバリー担体、磁性トナー、磁性インク、磁性塗料などとして好適に使用することができる。また、本発明に係る磁性ポリマー粒子には、ＤＮＡやＲＮＡなどの核酸、抗原・抗体、酵素などの生理活性物質を容易に結合（化学的結合または物理的結合）させることができる。
【００６５】
本発明の磁性ポリマー粒子表面に、オリゴヌクレオチドを固定化させることにより、核酸固定磁性ポリマー粒子を得ることができる。オリゴヌクレオチドの長さは１０から１００塩基、好ましくは１５から７０塩基である。必要に応じて、該固定化されるオリゴヌクレオチドは１本鎖ＤＮＡであっても良く、２本鎖ＤＮＡであっても良く、又はＲＮＡであっても良い。このような核酸は、通常市販される核酸合成器を用いて調製することができる。
本発明において核酸を有する担体となる粒子へ固定する法は、例えば特開平７−７５５９９号公報および特開平６−３３５３８０号公報で記述されている方法を適用することができる。
すなわち、具体的には、核酸プローブ１当量分と核酸プローブのハイブリッド形成部位と相補するＤＮＡ１当量分とをアニーリング緩衝液中で混合し、８０℃で５分間加熱した後、徐々に室温に戻し、２本鎖を形成させる。この２本鎖のＤＮＡをヒドロキシアパタイトカラムで精製した後に、脱水縮合剤と共に粒子の分散液に添加し、加熱することによって核酸プローブの固定化部位の塩基配列中のアミノ基と粒子表面のカルボキシル酸基とをアミド結合により固定することができる。
ここで、脱水縮合剤としては、例えば１─エチル─３─（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド等のカルボジイミド類、Ｎ−エチル─５─フェニルイソキサゾリウム─３’─スルホネート、Ｎ−エトキシカルボニル─２─エトキシ─１，２─ジヒドロキノリン等の水溶性の脱水縮合剤が好ましいものとして挙げられるが、他に油溶性の脱水縮合剤も使用することができる。
粒子の使用量は、核酸プローブ１ミリモル当り、通常０．５〜５００ｇ、好ましくは５〜５０ｇが適当である。核酸プローブの粒子への固定化反応は、通常ｐＨ３〜１１程度の水性媒体中、４〜７０℃において、５分ないし一夜行えばよい。
【００６６】
次にこの粒子に固定化された核酸プローブ中のハイブリッド形成部位に結合した相補的な塩基配列を離脱させることによって、本発明の核酸プローブ粒子が得られる。この際、前記相補的な塩基配列の離脱は、熱またはアルカリ変性により行うことができ、さらに遠心分離、濾過等の手段によって相補的な塩基配列を除去することができる。
このように調製される核酸固定化磁性ポリマー粒子は、遺伝子診断をはじめ、遺伝子工学全般に使用することができる。具体的には、例えばオリゴｄＴを結合させた磁性ポリマー粒子を用いて、細胞溶解液から、直接メッセンジャＲＮＡを回収することができる。又は、エイズウィルス核酸に相補性のある核酸配列を用いれば、生物検体から、エイズウィルスを回収し、ＤＮＡプローブ法、又はポリメラーゼチェーンリアクション法を用いて検出することができる。本発明の磁性ポリマー粒子の組成から、蛋白質の非特異的吸着が従来のスチレン系粒子に比べて著しく低いので、上記診断、研究目的に使用されるとき、バッググラウンドを低く抑えることが容易に実現し、よって、高感度な検出ができるので好ましい。また、酵素反応に於いても、酵素蛋白質の吸着による活性低下が少なく、従来の担体に比べて、高い効率の酵素反応が実現できる。
本発明の磁性ポリマー粒子に生理活性蛋白質を固定化させ、生理活性蛋白質を担持する蛋白質固定化磁性ポリマー粒子を調製することができる。上記生理活性蛋白質は一般的な生理活性を有する蛋白質、又はその複合体を含む。具体的に、例えば免疫グロブリン、各種酵素、アビジン蛋白質等が挙げられる。このような蛋白質を上記核酸固定と同様な方法で、磁性ポリマー粒子の表面に結合することができる。具体的に、蛋白質のアミノ基を利用して、粒子表面のカルボキシル基と反応させることができる。反応効率を高めるために、様々な工夫がなされるが、例えば、脱水縮合剤を先に粒子のカルボキシル基と反応させてから、蛋白質を加えて反応させても良い。
このように調製される抗体結合粒子、アビジン結合粒子、酵素結合粒子を診断分野、研究分野に利用することができる。特に本発明の磁性ポリマー粒子による蛋白質の物理吸着量が少ないため、バックグラウンドが極めて低い。従って、極く微量の測定対象も感度良く検出することができる
【００６７】
【実施例】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。なお、以下において、「部」は「重量部」を意味するものとする。
【００６８】
＜参考例１＞
油性磁性流体「フェリコロイドＨＣ５０」〔タイホー工業（株）製〕にアセトンを加えて粒子を析出沈殿させた後、これを乾燥することにより、親油化処理された表面を有するフェライト系の超常磁性体（粒子径：０．０１μｍ）を得た。
表１に示す処方に従って、前記超常磁性体４０部に、シクロヘキシルメタクリレート７５部、メタクリル酸５部、メチルメタクリレート２０部およびベンゾイルペルオキシド（重合開始剤）３部を添加し、この系を混合攪拌することにより超常磁性体を均一に分散させてモノマー組成物を調製した。
一方、ポリビニルアルコール１０部、ラウリル酸ナトリウム０．０５部およびポリエチレンオキシドノニルフェニルエーテル０．１部を水１０００部に溶解して水性媒体を調製した。
得られた水性媒体（水相）中に上記のモノマー組成物を添加し、この系を、ホモミキサーで予備撹拌した後、超音波分散機で分散処理することにより、平均粒子径が２μｍの油滴（油相）が水性媒体に分散されてなる懸濁液（油滴分散体）を調製した。
次いで、得られた懸濁液を、容量２リットルの攪拌機付三つ口フラスコ内に仕込み、この系を７５℃に昇温し、窒素雰囲気下において攪拌しながら５時間にわたって、油滴中のモノマーを重合（懸濁重合）させることにより、磁性ポリマー粒子が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を調製した。
この磁性ポリマーラテックスに分散されている磁性ポリマー粒子〔以下、「磁性ポリマー粒子（１）」ともいう。〕は、磁石によって容易に吸引沈降させて回収することができ、また、回収された磁性ポリマー粒子（１）は、水中に容易に再分散できるものであった。そこで、蒸留水中で磁気沈降させることにより、磁性ポリマー粒子（１）を洗浄・精製する操作を３回にわたって行った。
【００６９】
＜実施例１＞
表１に示す処方に従って、モノマー組成物における単量体組成を、シクロヘキシルアクリレート７５部、メタクリル酸３部およびアクリル酸２部に変更したこと以外は参考例１と同様にして、モノマー組成物および懸濁液を調製し、懸濁重合を行うことにより、本発明の磁性ポリマー粒子〔以下、「磁性ポリマー粒子（２）」ともいう。〕が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を調製した。
【００７０】
＜実施例２＞
表１に示す処方に従って、モノマー組成物における単量体組成を、２−エチルヘキシルメタクリレート１０部、シクロヘキシルメタクリレート５０部、メタクリル酸５部およびスチレン３５部に変更したこと以外は参考例１と同様にして、モノマー組成物および懸濁液を調製し、懸濁重合を行うことにより、本発明の磁性ポリマー粒子〔以下、「磁性ポリマー粒子（３）」ともいう。〕が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を調製した。
【００７１】
＜比較例１＞
表１に示す処方に従って、モノマー組成物における単量体組成を、メタクリル酸５部およびスチレン９５部に変更したこと以外は参考例１と同様にして、モノマー組成物および懸濁液を調製し、懸濁重合を行うことにより、比較用の磁性ポリマー粒子〔以下、「磁性ポリマー粒子（Ｃ１）」ともいう。〕が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を調製した。
【００７２】
＜比較例２＞
表１に示す処方に従って、モノマー組成物における単量体組成を、２−エチルヘキシルメタクリレート１０部、メタクリル酸５部、メチルメタクリレート１０部およびスチレン７５部に変更したこと以外は参考例１と同様にして、モノマー組成物および懸濁液を調製し、懸濁重合を行うことにより、比較用の磁性ポリマー粒子〔以下、「磁性ポリマー粒子（Ｃ２）」ともいう。〕が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を調製した。
【００７３】
参考例１並びに実施例１〜２および比較例１〜２によって得られた磁性ポリマーラテックスの各々について、重合転化率、固形分濃度および磁性ポリマー粒子中における超常磁性体の含有割合を測定した。また、下記に示す評価方法に従って、重合安定性、磁性ポリマー粒子における超常磁性体の分散性、静置安定性について評価し、下記に示す測定方法に従って、磁性ポリマー粒子の形状、数平均粒子径および変動係数を測定した。これらの結果を表１に併せて示す。
【００７４】
（イ）重合安定性の評価：
重合反応終了後、反応生成物を２００メッシュのステンレス金網を通過させ、金網上に残った凝集物の量が全固形分の１０重量％未満である場合を「良好」、凝集物の量が全固形分の１０重量％以上である場合を「不良」と判定した。
【００７５】
（ロ）超常磁性体の分散性の評価：
酢酸ウラニルで染色した後、透過型電子顕微鏡により磁性ポリマー粒子における超常磁性体の分散状態を観察し、ポリマー粒子の内部全体に均一に分散し、またはポリマー粒子の中心部において均一に分散している場合を「良好」、ポリマー粒子の表面近傍の一部、または表面近傍の全部に局在化している場合を「不良」と判定した。
【００７６】
（ハ）静置安定性の評価：
磁性ポリマーラテックスを希釈して固形分濃度（ｃ₀）を１重量％に調整し、この希釈液を、液相の高さが２ｃｍとなるよう容量２０ミリリットルのサンプルビン内に収容し、磁性ポリマー粒子が均一に分散されるまで容器を振盪した後１０分間静置し、液面から液面下１ｃｍに至る上層部分のみを取り出して固形分濃度（ｃ）を測定し、（ｃ／ｃ₀）×１００で算出される値を静置安定指数（重量％）として求めた。
【００７７】
（ニ）磁性ポリマー粒子の数平均粒子径および変動係数の測定：
酢酸ウラニルで染色した後、透過型電子顕微鏡による磁性ポリマー粒子の電子顕微鏡写真を撮影し、無作為に選んだ５００個の磁性ポリマー粒子の粒子径を測定することにより、数平均粒子径およびその変動係数を求めた。
【００７８】
＜比較例３＞
粒子径３０００Åのマグネタイト微粒子「マグネタイトＥＰＴ５００」〔戸田工業（株）製〕をオレイン酸ナトリウムにより親油化処理することにより強磁性体を調製した。表１に示す処方に従って、超常磁性体に代えて前記強磁性体を使用したこと以外は参考例１と同様にしてモノマー組成物および懸濁液を調製し、懸濁重合を行うことにより、比較用の磁性ポリマー粒子〔以下、「磁性ポリマー粒子（Ｃ３）」ともいう。〕が水性媒体中に分散されてなる分散体（磁性ポリマーラテックス）を調製した。
得られた磁性ポリマーラテックスについて、重合転化率、固形分濃度、磁性ポリマー粒子中における強磁性体の含有割合、重合安定性、磁性ポリマー粒子における強磁性体の分散性、静置安定性、磁性ポリマー粒子の形状、数平均粒子径および変動係数の結果を表１に併せて示す。
なお、比較例３の磁性粒子には残留磁化があり、磁気吸引で集めたあとの粒子は互いに吸引しあい再分散性が悪いものであった。
【００７９】
【表１】

【００８０】
＜参考例２＞
懸濁重合を開始してから３時間経過した後、反応系に、メチルメタクリレート１９部と、メタクリル酸１部とを添加し、さらに５時間懸濁重合させたこと以外は参考例１と同様にして磁性ポリマー粒子の分散体（磁性ポリマーラテックス）を製造した。このようにして得られた磁性ポリマーラテックスの重合転化率は９８重量％であり、磁性ポリマーラテックスを構成するこの例の磁性ポリマー粒子には、超常磁性体を含まない表面被覆層が形成されていた。
【００８１】
＜参考例３＞
参考例１により得られた磁性ポリマーラテックス（１）１００部を０．１規定の塩酸１０００部に添加し、当該磁性ポリマー粒子（１）の表面近傍に存在する超常磁性体を溶出除去した。ここに処理時間は１時間とした。次いで、処理された磁性ポリマー粒子を磁気分離により洗浄して精製することにより、磁性ポリマー粒子の分散体（磁性ポリマーラテックス）を製造した。この磁性ポリマー粒子には、超常磁性体を含まない表面被覆層が形成されていた。
【００８２】
＜参考例４＞
参考例１により得られた磁性ポリマーラテックス８．０ｇ（固形分で１ｇ）に、２規定の硫酸（鉄溶解剤）２５０ミリリットルを添加し、この系を２５℃で３時間緩く攪拌することにより、改質前粒子〔磁性ポリマー粒子（１）〕の酸処理（表面近傍に存在する超常磁性体の溶出除去処理）を行った。
次いで、処理された磁性ポリマー粒子を磁気沈降させて分離回収し、回収された磁性ポリマー粒子を、ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル「エマルゲン９１０」〔花王（株）製〕の水溶液（０．０１重量％）２００ミリリットルで２回洗浄し、１０ミリリットルの蒸留水中に再分散させ、得られた分散体のｐＨを水酸化ナトリウム水溶液（０．５重量％）により７に調整した。このような操作により、表面近傍の超常磁性体が溶出除去された磁性ポリマー粒子〔表面改質粒子（ｂ）〕０．７５ｇの分散体（磁性ポリマーラテックス）を得た。
得られた表面改質粒子（ｂ）において、熱天秤測定によるフェライト含量は２２．５重量％であり、改質前粒子中に含有されていたフェライト（超常磁性体）の２０重量％が溶解除去されたことになる。また、表面改質粒子（ｂ）の平均粒子径は１．８μｍであり、改質前粒子の粒子径と大差なかった。
さらに、本例で得られた磁性ポリマー粒子〔表面改質粒子（ｂ）〕の分散体１ｇ（固形分で０．１ｇ）にイオン交換水を添加し、磁気沈降処理を２回行って表面改質粒子（ｂ）を回収し、当該表面改質粒子（ｂ）を十分水洗した。次いで、当該表面改質粒子（ｂ）をイオン交換水１０ミリリットル中に添加し、この系を７０℃で２４時間攪拌した。その後、この系の上澄み部分を採取して原子吸光分析により鉄濃度を測定したところ、鉄濃度は１ｐｐｍ以下であり、このことから、表面改質粒子（ｂ）の粒子表面および表面近傍に存在する超常磁性体の量は、きわめて少ないものであることが確認された。なお、比較のため、実施例１で得られた磁性ポリマー粒子（２）の分散体０．８ｇ（固形分で０．１ｇ）について同様の操作を行ったところ、上澄み部分における鉄濃度は７３ｐｐｍであった。
【００８３】
＜参考例５＞
参考例１により得られた磁性ポリマーラテックス０．８ｇ（固形分で０．１ｇ）に、１重量％のアンモニア水（有機性塩基）１ｇを添加した。なお、このときの系（磁性ポリマーラテックス）のｐＨは１２．５であった。次いで、この系を６０℃で１０時間緩く振盪することにより、改質前粒子〔磁性ポリマー粒子（１）〕のアルカリ処理を行った。その後、この系を冷却し、０．５規定の硫酸で中和することによりｐＨを７．５に調整した。次いで、上記アルカリ処理が施された磁性ポリマー粒子〔表面改質粒子（ｃ）〕に対して、純水による洗浄・再分散処理を４回行った。
このようにして得られた表面改質粒子（ｃ）における超常磁性体の含有割合は２８重量％、当該表面改質粒子（ｃ）の平均粒子径は１．８μｍであり、改質前粒子の含有割合および粒子径と大差なかった。また、当該表面改質粒子（ｃ）の表面荷電量を測定したところ、０．１２５ミリ当量／ｇであり、磁性ポリマー粒子（１）の表面荷電量（０．００２ミリ当量／ｇ）と比較して大きな値を示すことが確認された。
【００８４】
＜参考例６〜１４＞
１重量％のアンモニア水に代えて、下記表２に示す有機性塩基または水溶性溶剤を使用したこと以外は、参考例５と同様にして改質前粒子〔磁性ポリマー粒子（１）〕を処理して表面改質粒子（ｃ）を得た。なお、処理剤として水溶性溶剤のみを使用した例においては、０．５規定の水酸化ナトリウム水溶液によって系のｐＨを１２に調整してから処理を行った。得られた表面改質粒子（ｃ）の各々について、参考例５と同様にして測定した表面荷電量の値を表２に併せて示す。
【００８５】
＜実施例３＞
実施例１により得られた磁性ポリマーラテックス０．８ｇ（固形分で０．１ｇ）を用い、処理剤としてアセトン１ｇを併用したこと以外は、参考例５と同様にして改質前粒子〔磁性ポリマー粒子（２）：表面荷電量０．００５ミリ当量／ｇ〕を処理して表面改質粒子（ｃ）を得た。このようにして得られた表面改質粒子（ｃ）について、参考例５と同様にして測定した表面荷電量の値を表２に併せて示す。
【００８６】
＜実施例４＞
実施例２により得られた磁性ポリマーラテックス０．８ｇ（固形分で０．１ｇ）を用い、処理剤としてアセトン１ｇを併用したこと以外は、参考例５と同様にして改質前粒子〔磁性ポリマー粒子（３）：表面荷電量０．００３ミリ当量／ｇ〕を処理して表面改質粒子（ｃ）を得た。このようにして得られた表面改質粒子（ｃ）について、参考例５と同様にして測定した表面荷電量の値を表２に併せて示す。
【００８７】
【表２】

【００８８】
＜試験例１＞
下記のような試験を実施することにより、免疫診断薬担体粒子（酵素免疫法の担体）としての評価を行った。
参考例１、実施例１〜２、参考例２〜３、参考例５、参考例７、参考例１２および比較例１〜３により得られた磁性ポリマーラテックスの各々を固形分換算で１０ｍｇ採取し、採取した磁性ポリマーラテックスから磁性ポリマー粒子を磁気分離して、この磁性ポリマー粒子をリン酸生理食塩水緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍｌ中に分散させた。次いで、この分散液に抗ヒトＩｇＭ抗体を２００μｇ添加し、室温で１時間ゆるく振盪して粒子表面に前記抗体を吸着させることにより磁性ポリマー粒子を感作させた。なお、感作後の磁性ポリマー粒子を磁気分離し、分離後の上澄み液中に前記抗体が残存しているか否かについて、２８０ｎｍにおける吸光度を測定することにより確認したところ、何れの上澄み液においても前記抗体の存在は認められず、従って、添加した全ての抗体が磁性ポリマー粒子に吸着されていることが確認された。
磁気分離された磁性ポリマー粒子（抗ヒトＩｇＭ抗体感作粒子）の各々に、０．５％の牛血清アルブミンと、０．１％のポリエチレングリコールとを含むリン酸生理食塩水緩衝液の溶液（ｐＨ７．５）１ｍｌを添加し、バイブレータにより振動分散させた後、室温で３０分間ゆるく振盪して、前記抗体が吸着されていない粒子表面をアルブミンでブロッキング処理することにより、係る酵素免疫法（ＥＩＡ法）の診断薬粒子を調製した。
上記のようにして調製された診断薬粒子の各々を用いて下記の操作を行った。０ｎｇ／ｍｌ，５０ｎｇ／ｍｌ，１００ｎｇ／ｍｌ，５００ｎｇ／ｍｌの濃度でヒトＩｇＭ抗原を含むリン酸生理食塩水緩衝液１００μｌを調製し、それぞれについて、診断薬粒子を含む分散液２０μｌを添加して室温で３０分間静置した。続いて、磁気分離した磁性ポリマー粒子にアセチルコリンエステラーゼを結合させた抗ヒトＩｇＭ抗体１００μｇを含む溶液を２００μｌ添加し、バイブレータにより振動分散させた後２５℃で１時間静置した。
次いで、アセチルコリンエステラーゼの基質である「Ｅｌｌｍａｎ’ｓ試薬」（Ｃａｙｍａｎ社製）を１００μｌ添加し、室温で１０分間ゆるく振盪して酵素反応発色させ、反応停止液である２規定の硫酸を５０μｌ添加してから、４１２ｎｍにおける吸光度を測定した。また、対照試験として、ヒトＩｇＭ抗原を含まないリン酸生理食塩水緩衝液１００μｌに、感作していない粒子を含む分散液２０μｌを添加して同様の操作を行って吸光度を測定した。これら結果を表３に示す。
【００８９】
【表３】

【００９０】
＜試験例２＞
試験例１と同様な方法で、抗ヒトＩｇＭの代わりに、ストレプットアビジン（和光純薬社製）を結合させ、同様な方法で、反応後磁性ポリマー粒子を洗浄処理した。最終的に５重量％の分散液とした。ビオチン結合したアセチルコリンエステラーゼ溶液（１μｇ／ｍｌ）をストレプットアビジン結合磁性ポリマー粒子１０μｌ（０．５ｍｇ）に対して、０μｌ、２５μｌまたは１００μｌを加えて、最終塩濃度が１ＭのＮａＣｌ溶液となるように５ＭのＮａＣｌ溶液を添加し、蒸留水で反応容量を０．５ｍｌにした。１０分間静置反応させた。次いで、試験例１と同様な方法で基質を加え、同様の条件で反応し、吸光度を測定した。結果を表４に示す。
【００９１】
【表４】

【００９２】
＜試験例３＞
ヒト白血球の癌細胞であるＫ５６２細胞を１重量％牛胎児血清を含むＰＲＭ１−１６４０培地で培養した。培養懸濁液中における細胞の数が５０万個／ｍＬとなった時点で、この培養懸濁液１ｍＬをサンプリングチューブに取り、５００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。回収した細胞に対しリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．２）１ｍＬを添加した後、超音波処理により無細胞化した。
この無細胞化したＫ５６２細胞溶解液を、３本の遠心チューブ（容積２ｍＬ）に０．５ｍＬずつ取り、１０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ５）によって２ｍＬまで希釈した。次いで、遠心チューブの各々に、エイズウィルスＤＮＡを組み込んで培養したヒト白血球（ＮＹ１０株）から取ったＨＩＶ−１ＤＮＡを、それぞれ、０分子、１０分子、５０分子分添加した。ボルテックス後、遠心チューブの各々に、参考例１により得られたカチオン性の磁性ポリマー粒子が分散されてなる固形分濃度１０重量％の分散体２μＬを添加し、室温下、１０ｒｐｍで５分間回転攪拌した。次いで、磁性ポリマー粒子を磁気分離し、分離された磁性ポリマー粒子の各々に、下記表５に示すＰＣＲ反応液を２５μＬずつ添加して、ＰＣＲ反応を行った。
【００９３】
【表５】

【００９４】
上記表５中、「プライマーＳＫ１４５Ａ」の配列は、「５’ＣＣＣＡＣＡＡＧＡＴＴＴＡＡＡＣＡＣＣＡ３’」であり、「プライマーＳＫ４５１Ａ」の配列は、「５’ＴＧＡＡＧＧＧＴＡＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣ３’」であって、これらをＤＮＡ合成器「３８１Ａ型」（アプライドバイオシステム社製）を用いて、メーカーマニュアルに従って合成した後、ＨＰＬＣで精製品を得た。
なお、ＰＣＲ反応は、「サーマルサイクラーモデルＪＰ２０００」（ＰＥＲＫＩＮＥＬＭＥＲＣＥＴＵＳ社製）を用いて、（９４℃×０．５分間，５５℃×１．０分間，７２℃×１．５分間）を３０サイクルと、７２℃×７分間のプログラムで増幅反応を行った。
上記１回目のＰＣＲ法による増幅反応の生成物を５μＬ取り、「プライマー
ＳＫ１４５Ａ」に代えて「プライマーＳＫ１４５」〔タカラ製〕を使用し、
「プライマーＳＫ４５１Ａ」に代えて「プライマーＳＫ４５１」〔タカラ製〕を使用したこと以外は同様にしてＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法の反応を行った。
ＰＣＲ法およびＮｅｓｔｅｄＰＣＲ法の反応増幅産物を、２重量％のアガロースゲル「Ａｇａｒｏｓｅ１６００」〔和光純薬製〕を用いてＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭホウ酸からなる緩衝液，ｐＨ８．２）中でＭｕｐｉｄ型電気泳動装置で泳動させ、エチジウムブロマイド染色後に波長２５４ｎｍの紫外線照射下で検出した。これらの結果を表６に示す。
【００９５】
【表６】

【００９６】
表６に示す結果により、本発明の磁性ポリマー粒子を用いることにより、遠心分離の代わりに磁気分離を利用しＤＮＡを回収することができるため、ＰＣＲ法に利用できることがわかった。
【００９７】
【発明の効果】
本発明によれば、超常磁性体の分散性に優れた新規な磁性ポリマー粒子を提供することができる。
本発明の磁性ポリマー粒子は、磁気応答性に優れていると共に、当該磁性ポリマー粒子の分散体（磁性ポリマーラテックス）において、磁性ポリマー粒子から水性媒体中に鉄イオンが溶出する問題を生じないので、この問題のために磁性ポリマーラテックスの適用が制限されていた各種の用途・技術分野においても好適に用いることができる。また、本発明の磁性ポリマー粒子は、水性媒体中で沈降しにくく、当該水性媒体中において均質な分散状態で存在することができる。
本発明の製造方法によれば、上記のような優れた特性を有する磁性ポリマー粒子およびその分散体を確実に製造することができる。
【００９８】
本発明の磁性ポリマー粒子は、上記のような優れた特性により、磁気応答性の要求される種々の用途・分野に広く適用することができる。例えば、抗原、抗体、蛋白、核酸などを物理的乃至は化学的に吸着させることにより、診断薬として広い範囲に適用することができる。また、酵素免疫法の診断薬として用いる場合において、磁性ポリマー粒子からの鉄イオンの溶出に起因して生じる非特異発色が抑制されるので、診断薬としての実用性および信頼性がさらに高められている。また、磁性ポリマー粒子の粒子表面に超常磁性体が露出することがないので、静電特性、成膜性に優れ、磁性トナー、磁性インク、磁性塗料としても有用である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to magnetic polymer particles and a method for producing the same, and more specifically, a diagnostic agent carrier, a bacterial isolation simple substance, a cell separation carrier, a nucleic acid separation purification carrier, a protein separation purification carrier, an immobilized enzyme carrier, a drug delivery carrier, and a magnetic toner. The present invention relates to magnetic polymer particles useful as magnetic ink, magnetic paint, and the like, and a method for producing the same.
[0002]
[Prior art]
Magnetic polymer latex can be used as a diagnostic reagent carrier, cell, protein or nucleic acid separation / purification carrier, etc. because of the advantage that latex particles can be easily separated and recovered by using magnetic force. It is expected.
Further, the magnetic polymer latex formed by drying or heating is expected to be applied to uses such as magnetic toner, magnetic ink, and magnetic paint.
As a method for synthesizing magnetic polymer particles constituting such a magnetic polymer latex, the following methods (1) to (3) are known as methods for obtaining particles of a type in which a magnetic substance is present inside the particles.
[0003]
(1) A method in which a magnetic material that is not a superparamagnetic material subjected to magnetization treatment and oleophilic treatment is dispersed in a polymerizable monomer, and this polymerizable monomer is subjected to suspension polymerization to obtain magnetic polymer particles (Japanese Patent Laid-Open No. 59). -221302).
[0004]
(2) A magnetic material subjected to lipophilic treatment is dispersed in an organic phase containing a vinyl aromatic monomer, and this dispersion is homogeneously dispersed in an aqueous phase using a homogenizer, followed by polymerization. A method for obtaining magnetic polymer particles having a small particle size (see Japanese Patent Publication No. 4-3088).
[0005]
(3) Precipitating an iron compound in the presence of a porous polymer particle having a specific functional group, and oxidizing the iron compound to introduce a magnetic substance into the porous polymer particle, resulting in a large particle size of 2 μm or more And a method of obtaining magnetic polymer particles having a uniform diameter (Japanese Patent Publication No. 5-10808).
[0006]
However, in the above method (1), in order to magnetize a magnetic material having a coercive force that is not a superparamagnetic material, dispersed particles are agglomerated and fused at the time of polymerization. There is a problem that such magnetic polymer particles tend to settle in an aqueous medium. In addition, when used as an adsorbent for a specific substance, there is also a problem that a sufficient amount of the target substance cannot be adsorbed because the surface area of the particles is small.
In JP-A-59-221302 which discloses the method (1), a polymerizable monomer mainly composed of styrene is used. However, since the styrene polymer has a low affinity with the magnetic substance, the magnetic substance that is well dispersed in the polymerization reaction system (monomer) is separated and aggregated inside the polymer particles after polymerization, There is a problem of precipitation on the particle surface.
In addition, magnetic polymer particles synthesized using a polymerizable monomer mainly composed of styrene absorb ultraviolet rays and develop a fluorescent color because of the aromatic ring structure introduced in a large amount. As a result, when the magnetic polymer particle is used for identification and detection of a physiologically active substance, there is a problem that many restrictions arise.
In addition, magnetic polymer particles obtained using a polymerizable monomer mainly composed of styrene have a high protein adsorbing property and a large non-specific adsorbing property, so that the diagnostic system using the magnetic polymer particles has a large background. There is.
[0007]
The magnetic polymer particles obtained by the method (2) are inferior in the uniform dispersibility of the magnetic substance inside the particles, and the magnetic substance is localized in the vicinity of the particle surface. For this reason, there is a problem that iron ions are eluted from the magnetic polymer particles, or the magnetic substance is dissolved and flowed out under acidic conditions, and the characteristics as the magnetic polymer particles are impaired.
[0008]
The method (3) has a problem that the production process of the magnetic polymer particles is complicated and the magnetic substance is not encapsulated by the polymer, so that iron ions are eluted.
[0009]
On the other hand, a method of ferritizing the surface of the polymer particles by precipitating an iron compound in the polymer particle emulsion has been disclosed (see JP-A-3-115862 and JP-A-5-138809). However, the magnetic polymer particles obtained by this method have a problem that the elution of iron ions occurs remarkably due to the presence of a magnetic substance on the particle surface.
When the magnetic polymer particles obtained by the conventional synthesis method as described above are used as, for example, a diagnostic agent carrier, sufficient sensitivity cannot be obtained, or good practical performance cannot be obtained due to non-specific enzyme reaction. . This is because the magnetic material is partially exposed on the particle surface of the magnetic polymer particle, or a micropath is formed between the particle surface and the magnetic material existing inside the particle, so that iron ions are eluted to the outside. This is considered to be because it adversely affects practical performance.
[0010]
Disclosed is a technique for obtaining magnetic polymer particles containing magnetic particles by polymerizing a hydrophobic crosslinking monomer in an aqueous phase using magnetic particles as a core material to suppress the elution of iron ions to the outside to some extent. However, this technique cannot sufficiently suppress the elution of iron ions. Further, a technique for forming a coating layer made of a polymer not containing a magnetic substance on the surface of magnetic polymer particles has been disclosed (see Japanese Patent Publication No. 5-16164). Only legal and spray-drying methods are shown and the scope of application is limited.
[0011]
Further, although a technique for synthesizing magnetic polymer particles by an emulsion polymerization method has been disclosed (Japanese Patent Publication No. 3-57921), it is difficult to synthesize particles having a large particle diameter by the emulsion polymerization method. Magnetic polymer particles having good magnetic sedimentation properties have not been obtained with good reproducibility.
[0012]
As described above, since the magnetic polymer particles obtained by the conventional synthesis method have a problem of elution of iron ions to the outside, they can be applied only to applications and fields that are not affected by elution of iron ions. is the current situation. For this reason, it is desired to develop magnetic polymer particles that are excellent in dispersibility of magnetic materials and do not elute iron ions to the outside.
From a practical point of view, it is necessary that the magnetic polymer particles are difficult to settle in an aqueous medium and maintain a homogeneous dispersion state.
[0013]
[Problems to be solved by the invention]
A first object of the present invention is to provide novel magnetic polymer particles excellent in uniform dispersibility of superparamagnetic materials. A second object of the present invention is to provide magnetic polymer particles that are difficult to settle in an aqueous medium. The third object of the present invention is to provide magnetic polymer particles that are excellent in magnetic responsiveness and that are difficult to elute iron ions derived from a magnetic substance to the outside and can be widely applied to various applications and fields. There is. A fourth object of the present invention is to provide magnetic polymer particles having good binding properties to physiologically active substances. A fifth object of the present invention is to provide a method capable of reliably producing magnetic polymer particles having the above-described excellent characteristics.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
  The magnetic polymer particle of the present invention comprises (A)2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, pentyl acrylate, pentyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, Cyclohexyl ethylene glycol acrylate, cyclohexyl ethylene glycol methacrylate, cyclohexyl dipropylene glycol acrylate, cyclohexyl dipropylene glycol methacrylate, cyclohexene diacrylate, cyclohexene dimethacrylate, and some of the hydrogen atoms of the cyclohexyl group are Selected from substituted cycloalkyl acrylates and substituted cycloalkyl methacrylates substituted by alkyl groups of primes 1-5,30 to 99% by weight of a structural unit derived from an alkyl (meth) acrylate having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group (hereinafter referred to as “structural unit A”), (B) a structural unit derived from an unsaturated carboxylic acid (hereinafter referred to as “structural unit A”) 1-20 wt% (referred to as “structural unit B”), and (C) copolymerizable with the alkyl (meth) acrylate and the unsaturated carboxylic acidAromatic vinyl compounds1 to 100 parts by weight of a superparamagnetic substance per 100 parts by weight of a copolymer (hereinafter referred to as “specific polymer”) consisting of 0 to 69% by weight of a structural unit derived from (hereinafter referred to as “structural unit C”) The number average particle diameter is 0.02 to 30 μm. (A)30 to 99% by weight of structural units derived from alkyl (meth) acrylate having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group, (B) 1 to 20% by weight of structural units derived from unsaturated carboxylic acid, and (C) the above 1-100 parts by weight of superparamagnetic material is contained with respect to 100 parts by weight of a copolymer consisting of 0 to 69% by weight of a structural unit derived from an alkyl (meth) acrylate and a vinyl monomer copolymerizable with the unsaturated carboxylic acid. Particles having a number average particle diameter of 0.02 to 30 μmMagnetic polymer particles obtained by immobilizing oligonucleotides or physiologically active proteins are preferred.
[0015]
  The method for producing magnetic polymer particles of the present invention comprises (A)2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, pentyl acrylate, pentyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, Cyclohexyl ethylene glycol acrylate, cyclohexyl ethylene glycol methacrylate, cyclohexyl dipropylene glycol acrylate, cyclohexyl dipropylene glycol methacrylate, cyclohexene diacrylate, cyclohexene dimethacrylate, and some of the hydrogen atoms of the cyclohexyl group are Selected from substituted cycloalkyl acrylates and substituted cycloalkyl methacrylates substituted by alkyl groups of primes 1-5,30 alkyl (meth) acrylates having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group~ 99% by weight,
  (B) 1 to 20% by weight of unsaturated carboxylic acid, and
  (C) 0 to 69% by weight of an aromatic vinyl compound copolymerizable with the alkyl (meth) acrylate and the unsaturated carboxylic acidThe monomer composition is prepared by dispersing the superparamagnetic substance in the monomer contained at a ratio of
  This monomer composition is dispersed in an aqueous medium to obtain a suspension,
  The monomer is polymerized in the suspension.
[0016]
[Action]
(1) The superparamagnetic substance is uniformly dispersed in the polymer (specific polymer), and can constitute magnetic polymer particles having a suitable particle size.
(2) The magnetic polymer particles formed by dispersing the superparamagnetic material are less likely to cause aggregation and fusion of the dispersed particles during synthesis, and have a suitable particle size. Therefore, the magnetic polymer particles are difficult to settle in the aqueous medium and can exist in a homogeneous dispersion state in the aqueous medium.
(3) Since the magnetic polymer particles of the present invention contain a superparamagnetic substance at a specific ratio, excellent magnetic responsiveness is exhibited and metal ions derived from the superparamagnetic substance are eluted to the outside. Is prevented.
(4) A specific polymer comprising a specific structural unit can impart good binding properties to a physiologically active substance to the magnetic polymer particles of the present invention.
[0017]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
<Magnetic polymer particles of the present invention>
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The magnetic polymer particles of the present invention are constituted by dispersing (including) a superparamagnetic substance in particles made of a specific copolymer.
[0018]
<Specific polymer>
The specific polymer constituting the magnetic polymer particle of the present invention is a copolymer containing the structural unit A and the structural unit B as essential components and the structural unit C as an optional component.
[0019]
The carbon number of the alkyl group in the alkyl (meth) acrylate (hereinafter also referred to as “monomer (A)”) constituting the structural unit A is usually 4 to 20, and preferably 6 to 18. This alkyl group may be linear, branched or cyclic.
Specific examples of such monomer (A) include 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, pentyl acrylate, pentyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl. Methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate; cyclohexyl acrylate, cyclohexyl methacrylate, cyclohexyl ethylene glycol acrylate, cyclohexyl ethylene glycol methacrylate, cyclohexyl dipropylene glycol acrylate, cyclohexyl dipropylene glycol methacrylate, cyclohexene diacrylate, cyclohexene dimethacrylate; methyl Examples thereof include substituted cycloalkyl acrylates and substituted cycloalkyl methacrylates in which a part of the hydrogen atoms of the “cyclohexyl group” are substituted with alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms, such as substituted cyclohexyl acrylate and methyl-substituted cyclohexyl methacrylate. Or in combination of two or more. Of these, 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, cyclohexyl acrylate, and cyclohexyl methacrylate are preferable.
[0020]
The content ratio of the structural unit A in the specific polymer is usually 30 to 99% by weight, preferably 50 to 99% by weight. When the content ratio of the structural unit A is less than 30% by weight, the polymerization stability and the dispersibility of the magnetic substance become poor, and the adsorbability of the obtained magnetic polymer particles to physiologically active proteins such as antibodies becomes poor. The non-specific adsorption phenomenon becomes remarkable. On the other hand, when the content ratio of the structural unit A exceeds 99% by weight, the hydrophobicity of the obtained copolymer becomes excessive, and the surface of the polymer particles by the copolymer is less physically adsorbed to the protein. In addition, the chemical binding properties to physiologically active substances such as proteins, enzymes, and nucleic acids are also poor.
[0021]
The unsaturated carboxylic acid constituting the structural unit B [hereinafter also referred to as “monomer (B)”] is a polymerizable monomer having a radical polymerizable unsaturated bond and a carboxyl group in the molecule. Specific examples of such a monomer (B) include acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, itaconic acid, fumaric acid, maleic acid and the like.
The content ratio of the structural unit B in the specific polymer is usually 1 to 20% by weight, preferably 2 to 15% by weight. When the content ratio of the structural unit B is less than 1% by weight, the hydrophobicity of the obtained copolymer becomes excessive, and the surface of the polymer particles by the copolymer is less physically adsorbed to proteins. In addition, chemical binding properties to physiologically active substances such as proteins, enzymes, and nucleic acids are inferior. On the other hand, when the content ratio of the structural unit B exceeds 20% by weight, the hydrophilicity of the obtained copolymer becomes excessive, and the surface of the polymer particles by the copolymer obtains good binding property to protein. I can't.
[0022]
Specific examples of the vinyl monomer constituting the structural unit C (hereinafter also referred to as “monomer (C)”) include aromatic vinyl compounds such as styrene and α-methylstyrene; methyl acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, Alkyl (meth) acrylates having 1 to 3 carbon atoms in the alkyl group such as ethyl methacrylate; Vinyl cyanide compounds such as acrylonitrile; Ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, diethylene glycol diacrylate, diethylene glycol dimethacrylate, tetraethylene glycol Diacrylate, tetraethylene glycol dimethacrylate, polyethylene glycol diacrylate, polyethylene glycol dimethacrylate, diallyl phthalate, trimer Polyfunctional (meth) acrylate compounds such as roll propane triacrylate and trimethylol propane trimethacrylate; polyfunctional vinyl compounds such as polyfunctional aromatic vinyl compounds such as divinylbenzene can be mentioned. A combination of the above can be used. Of these, alkyl (meth) acrylates having 1 to 3 carbon atoms in the alkyl group are preferred. Moreover, when using only 2-ethylhexyl (meth) acrylate as said monomer (A), it is preferable to use a polyfunctional vinyl compound as monomer (C).
[0023]
The content ratio of the structural unit C in the specific polymer is usually 0 to 69% by weight. The content ratio of the structural unit C derived from the aromatic vinyl compound is preferably 0 to 49% by weight, and more preferably 0 to 20% by weight.
Moreover, when using only 2-ethylhexyl (meth) acrylate as said monomer (A), the content rate of the structural unit C derived from the polyfunctional vinyl compound used suitably is 0.5-30 weight%. It is preferable that it is 1 to 20% by weight. When the proportion of the structural unit derived from the polyfunctional vinyl compound is less than 0.5% by weight, the obtained magnetic polymer particles do not have sufficient hardness, resulting in deformation of the particles and fusion of the particles. Sometimes. On the other hand, when the proportion of the structural unit derived from the polyfunctional vinyl compound exceeds 30% by weight, the obtained magnetic polymer particles may become brittle and do not have practical strength.
[0024]
The molecular weight (weight average molecular weight in terms of polystyrene) of the specific polymer constituting the magnetic polymer particles of the present invention is usually 10,000 or more, preferably 20,000 to 1,000,000.
[0025]
<Superparamagnetic material>
The magnetic polymer particle of the present invention is characterized in that the magnetic substance dispersed and contained in the particle is a “superparamagnetic substance”. While having attraction, even if magnetic attraction is repeated, substantially no magnetic history remains in the particles, and good redispersibility can be maintained.
The superparamagnetic material in the present invention means a magnetization (saturation) when a magnetic field of 5000 aersted is applied to a magnetic particle after applying a strong magnetic field of 5000 aersted to a zero magnetic field (residual magnetization). It refers to a magnetic material that is 1/3 or less of the magnetization.
Examples of the superparamagnetic material constituting the magnetic polymer particles of the present invention include triiron tetroxide (Fe_ThreeO_Four), Γ-heavy iron oxide (γ-Fe₂O_Three), Various types of ferrite, metals such as iron, manganese, cobalt, and chromium, and alloys such as cobalt, nickel, and manganese. Among these, triiron tetroxide and ferrite are particularly preferable.
The particle diameter of the primary particles of the superparamagnetic material constituting the magnetic polymer particles of the present invention is preferably 40 to 300 mm, more preferably 50 to 200 mm, and particularly preferably 60 to 150 mm. When the primary paramagnetic particle size is less than 40 mm, a large amount of a treatment agent (fatty acid, silane coupling agent, titanium coupling agent) for lipophilic treatment of the superparamagnetic material is required. In some cases, an excessive amount of the treatment agent may impair good magnetic responsiveness due to the superparamagnetic material. On the other hand, when the primary paramagnetic particle diameter exceeds 300 mm, the obtained magnetic polymer particles are magnetized, and the magnetic polymer particles aggregate with each other and easily settle in an aqueous medium. In addition, as a particle diameter of the primary particle of the superparamagnetic substance which is not spherical, the average value of the longest diameter and the shortest diameter of each superparamagnetic substance shall be taken.
[0026]
The content of the superparamagnetic substance constituting the magnetic polymer particles of the present invention is usually 1 to 100 parts by weight, preferably 5 to 80 parts by weight, more preferably 10 to 100 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the specific polymer. 60 parts by weight. When the content of the superparamagnetic material is less than 1 part by weight, the resulting particles cannot exhibit a sufficient magnetic response, while when the content of the superparamagnetic material exceeds 100 parts by weight. This causes problems such as elution of metal ions due to exposure of the superparamagnetic substance on the surface of the magnetic polymer particles obtained, and the magnetic polymer particles become brittle and do not have practical strength.
[0027]
In the magnetic polymer particle of the present invention, (1) it is preferable that the superparamagnetic substance is uniformly dispersed in the specific polymer constituting the inside of the particle, and (2) the superparamagnetic substance is present on and near the particle surface. Is preferably absent.
Here, as a method for determining whether or not the superparamagnetic substance is almost present on the surface of the particle and in the vicinity of the surface, 0.1 g of the magnetic polymer particle is immersed in 10 ml of pure water heated to 70 ° C. for 2 hours. Then, the metal content eluted in the pure water is measured. When the metal content is 10 ppm or less, it can be determined that the magnetic polymer particle is “a state in which almost no superparamagnetic substance is present on the particle surface and in the vicinity of the surface”.
[0028]
<Number average particle diameter of magnetic polymer particles>
The number average particle diameter of the magnetic polymer particles of the present invention is usually 0.02 to 30 μm, preferably 0.1 to 20 μm, more preferably 0.2 to 15 μm, and particularly preferably 0.3 to 10 μm. . When the number average particle diameter is less than 0.02 μm, sufficient magnetic responsiveness cannot be expressed. On the other hand, when the number average particle diameter exceeds 30 μm, the magnetic polymer particles tend to settle in an aqueous medium, and the magnetic polymer particles have a small particle surface area, which is used as an adsorbent for a specific substance. When used, a sufficient amount of the target substance cannot be adsorbed.
[0029]
The magnetic polymer particles of the present invention are less likely to settle in an aqueous medium and can exist in a homogeneous dispersion state in the aqueous medium (hereinafter, this property is referred to as “stationary stability”). Therefore, the magnetic polymer particles of the present invention are excellent from the viewpoint of handleability.
Here, as a method for evaluating the stationary stability, a magnetic polymer latex having a solid content concentration of 1% by weight is prepared by dispersing magnetic polymer particles in an aqueous medium, and the liquid polymer has a liquid phase height of 2 cm. The solid content of the upper part of the liquid phase from the liquid level to 1 cm below the liquid level when the container is shaken until the magnetic polymer particles are uniformly dispersed and then left to stand for 10 minutes. Measure the concentration. And if this solid content concentration is 0.1 weight% or more, it is said that it is excellent in stationary stability.
In the magnetic polymer particles of the present invention, this solid content concentration is usually 0.1% by weight or more, preferably 0.3% by weight or more, and more preferably 0.6% by weight or more.
[0030]
The magnetic polymer particles of the present invention preferably have a layer (hereinafter also referred to as “surface coating layer”) made of a polymer not containing a superparamagnetic substance on the surface thereof. By adopting such a configuration, it is possible to reliably prevent elution of iron ions from the magnetic polymer particles without impairing the excellent handleability due to the superparamagnetic substance existing inside the particles. Here, the thickness of the surface coating layer is preferably larger than the longest diameter of the superparamagnetic material to be used, for example, 100 mm or more.
[0031]
<Method for Producing Magnetic Polymer Particles of the Present Invention>
In the production method of the present invention, a superparamagnetic substance is dispersed in a monomer containing an alkyl (meth) acrylate having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group [the monomer (A)] in a proportion of 30% by weight or more. To prepare a monomer composition, and the monomer composition is emulsified and dispersed (finely divided) in an aqueous medium to obtain a suspension which is an oil droplet dispersion. In this suspension, the monomer is polymerized. It is characterized by a point.
According to the method as described above, a dispersion (magnetic polymer latex) in which the magnetic polymer particles of the present invention are dispersed in an aqueous medium can be reliably produced.
[0032]
In the production method of the present invention, a superparamagnetic material subjected to lipophilic treatment can be preferably used. When magnetic polymer particles are produced using a superparamagnetic material that has not been subjected to lipophilic treatment, the superparamagnetic material is unevenly distributed in the vicinity of the particle surface of the magnetic polymer particle, and the superparamagnetic material is exposed on the particle surface. Thus, elution of iron ions into an aqueous medium may be caused.
The method for lipophilic treatment of superparamagnetic materials is not particularly limited, such as a method of treating with a surface treatment agent such as a silane coupling agent or a titanium coupling agent, or a method of adsorbing a fatty acid salt to the superparamagnetic material. Absent. In addition, a superparamagnetic material obtained by removing the dispersion medium from a commercially available magnetic fluid can also be used.
[0033]
In the production method of the present invention, the monomer used as a dispersion medium for the superparamagnetic material is a hydrophobic monomer.
By using a hydrophobic monomer, it is possible to uniformly disperse the superparamagnetic material subjected to the lipophilic treatment in the monomer. In the monomer composition thus obtained, coarse particles due to aggregation of superparamagnetic materials are not generated. Therefore, the monomer composition can be uniformly emulsified and dispersed in an aqueous medium. .
[0034]
Here, in this specification, the “hydrophobic monomer” means a monomer having a solubility in water at 20 ° C. of less than 0.1% by weight, and the monomer having a solubility of 0.1% by weight or more. Hereinafter referred to as “hydrophilic monomer”.
In addition, when the monomer used as the dispersion medium of the superparamagnetic material is a mixture of two or more types, if 60% by weight or more of the monomer is a hydrophobic monomer, a hydrophilic monomer is contained in the mixed monomer. Also good.
[0035]
Examples of the hydrophilic monomer constituting a part of the dispersion medium include unsaturated carboxylic acids such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, itaconic acid and fumaric acid [monomer (B)], methyl List acrylate, methyl methacrylate, ethyl acrylate, ethyl methacrylate, ethylene glycol diacrylate, ethylene glycol dimethacrylate, diethylene glycol diacrylate, diethylene glycol dimethacrylate, tetraethylene glycol diacrylate, tetraethylene glycol dimethacrylate, diallyl phthalate, vinyl acetate, etc. Can do.
[0036]
As a disperser used for emulsifying and dispersing the monomer composition in an aqueous medium, conventionally known ultrasonic dispersers, high-pressure homogenizers, high shear rate dispersers, and the like can be used.
The type of the ultrasonic disperser is not particularly limited. For example, a disperser including a horn-type oscillator, a disperser including a plate-type oscillator, and continuous dispersion in which a liquid is circulated through an oscillation unit. A machine etc. can be illustrated. Examples of the high shear rate disperser include a homomixer, a colloid mill, a jet homogenizer, and a high pressure homogenizer, and these dispersers may be appropriately selected according to the target dispersed particle size. Can do.
Furthermore, a film emulsification method in which the monomer composition is emulsified and dispersed in the aqueous medium by extruding the monomer composition into the aqueous medium through a porous film or a porous filter, or pressure, vibration or high voltage is applied from the nozzle. It is also possible to employ a nozzle method for discharging the monomer composition.
[0037]
In the production method of the present invention, it is preferable to use water as an aqueous medium which is a dispersion medium for the monomer composition.
In the aqueous medium, an anionic surfactant, a nonionic surfactant, a water-soluble polymer, a surfactant such as an inorganic suspension protective agent, an emulsifier or a suspension protective agent may be added. . Among these, partially saponified polyvinyl alcohol is preferable because it can be applied to obtain particles having a wide particle diameter and can synthesize positively or negatively charged particles.
[0038]
In the method for producing magnetic polymer particles of the present invention, the polymerization initiator for polymerizing the monomer is not particularly limited, and conventionally known radical polymerization initiators such as organic peroxides, azo initiators, A persulfate-based initiator or the like can be used. Of these, it is preferable to use an oil-soluble polymerization initiator. In particular, when preparing a monomer composition by dispersing a superparamagnetic substance in a hydrophobic monomer, it is preferable to add an oil-soluble polymerization initiator, thereby preventing the formation of polymer particles not containing the superparamagnetic substance. can do.
[0039]
The monomer polymerization reaction is preferably performed in an oxygen-free atmosphere. Although the reaction temperature varies depending on the decomposition temperature of the polymerization initiator used, for example, when benzoyl peroxide is used, the polymerization reaction can be suitably carried out at 75 to 85 ° C.
[0040]
In the production method of the present invention, after the preparation of the magnetic polymer particles, the particles may be washed to remove the surfactant or suspension protective agent used in the polymerization. At this time, it is preferable to use water or a water-soluble solvent such as alcohol or acetone, and it is also preferable to add a small amount of a surfactant to this.
If necessary, the polymerized magnetic polymer particles can be classified by means of sedimentation separation, agglomeration separation, centrifugation, magnetic separation, etc., and adjusted to the desired particle size and particle size distribution.
[0041]
In the production method of the present invention, it is preferable to carry out any of the following steps (a) to (c) in order to reliably prevent the superparamagnetic substance from flowing out of the obtained magnetic polymer particles.
In addition, the magnetic polymer particle | grains of this invention provided to the following process (a)-(c) are also called "the particle | grains before modification | reformation" below.
[0042]
Step (a): A step of polymerizing a vinyl monomer in the presence of the particles before modification.
Step (b): A step of bringing an iron solubilizer into contact with the particles before modification, and eluting and removing superparamagnetic substances existing in the vicinity of the surface of the particles.
Step (c): A step of bringing an organic base and / or a water-soluble solvent into contact with the particles before modification.
[0043]
<Process (a)>
This step (a) is a step of polymerizing a vinyl monomer in the presence of the pre-modified particles. By this step (a), a surface coating layer that does not contain a superparamagnetic substance is polymerized and formed on the surface of the magnetic polymer particles. And, according to the magnetic polymer particles obtained through this step (a) (hereinafter also referred to as “surface modified particles (a)”), elution of iron-based superparamagnetic material is reliably suppressed, and as a result, It is possible to improve the performance as magnetic polymer particles (expansion of applications) and improve the stability over time (improvement of reliability).
[0044]
The vinyl monomer used in the step (a) can be appropriately selected according to the use of the finally obtained magnetic polymer particles [surface modified particles (a)], an aromatic vinyl compound, A (meth) acrylate compound, an unsaturated carboxylic acid, etc. can be mentioned as a preferable compound.
In addition, from the viewpoint of efficiently forming the nonmagnetic polymer component (surface coating layer) present on the surface of the surface modified particles (a), the polymer constituting the pre-modified particles (specifically) is used as the vinyl monomer. It is preferable to use a monomer that is difficult to be absorbed by the copolymer), for example, a water-soluble vinyl monomer.
[0045]
The amount of the monomer used in the step (a) is usually 10 to 1000 parts by weight, preferably 20 to 500 parts by weight, more preferably 30 to 200 parts by weight with respect to 100 parts by weight of the particles before modification. . When the amount of monomer used is too small, it is difficult to form a surface coating layer sufficient to suppress the outflow of superparamagnetic material, while when the amount of monomer used is excessive, After the completion of this step, polymer particles having no magnetism are likely to be generated.
[0046]
A specific method for polymerizing a vinyl monomer in the presence of magnetic polymer particles (pre-modification particles) is not particularly limited.
(A) a monomer absorption polymerization method in which a pre-modified particle is made to absorb a vinyl-based monomer and then the monomer in the pre-modified particle is polymerized;
(B) a seed polymerization method in which a vinyl-based monomer is continuously or intermittently supplied into a magnetic polymer latex in which particles before modification are dispersed in water, and the monomer is polymerized using the particles before modification as seed particles;
(C) A capsule polymerization method in which an adsorption phase is formed on the particle surface of the pre-modification particle and a vinyl monomer is polymerized in the adsorption phase.
[0047]
Among these methods, the above methods (a) and (b) are preferred from the viewpoint that the surface coating layer can be reliably formed even if the pre-modified particles are small-sized particles.
In the method (b), after the polymerization reaction for obtaining the polymer constituting the pre-modification particles is substantially completed (specifically, when the polymerization conversion rate becomes 85% or more). Therefore, it is preferable to add a vinyl monomer to the polymerization reaction system and continue the polymerization reaction of the monomer.
[0048]
<Step (b)>
This step (b) is a step in which an iron solubilizer is brought into contact with the particles before modification, and the superparamagnetic substance existing in the vicinity of the surface of the particles is eluted and removed beforehand.
Here, the “iron solubilizer” is a substance that can dissolve the iron component (superparamagnetic substance) constituting the pre-modification particles and that does not substantially dissolve the polymer constituting the pre-modification particles. It shall be said.
[0049]
In addition, as a method of bringing the iron solubilizer into contact with the pre-modification particles, (1) a method in which the iron solubilizer is brought into direct contact with the pre-modification particles, and (2) dispersion in which the pre-modification particles are dispersed in water. Examples include a method of bringing the two into contact with each other in the body, specifically, a method of adding an aqueous solution of an iron dissolving agent to a magnetic polymer latex in which pre-modified particles are dispersed and contained. The method is preferred.
[0050]
By bringing the iron solubilizer into contact with the pre-modification particles, the iron components present on the surface of the pre-modification particles and in the vicinity of the surface are preferentially dissolved and removed. The magnetic polymer particles obtained through this step (b) (hereinafter also referred to as “surface modified particles (b)”) are suppressed to a level at which the elution amount of the iron-based superparamagnetic substance does not cause a problem in practice. As a result, it is possible to improve the performance as a magnetic polymer particle (expansion of use) and improve the stability over time of the performance (improvement of reliability).
[0051]
Examples of the iron solubilizer that can be used in the step (b) include inorganic acids, organic acids, and complexing agents with iron.
[0052]
Examples of the inorganic acid that can be used as the iron solubilizer include sulfuric acid, hydrochloric acid, and nitric acid.
Since inorganic acids have a high dissolution rate of iron components, when inorganic acids are used as iron solubilizers, not only the surface of the particle before modification and the vicinity of the surface, but also superparamagnetic substances contained inside the particles. It may be dissolved and removed. Therefore, it is preferable to control the dissolution amount of the iron component by adjusting the concentration of the inorganic acid, the treatment time, etc. so that the iron component is not dissolved and removed more than necessary (the superparamagnetic substance inside the particle is not dissolved). .
[0053]
Here, when the inorganic acid is used, the suitable amount of dissolution and removal of the iron component is “x” for the weight of the iron component (superparamagnetic substance) contained in the particle before modification, and the surface modified particle ( b) When the weight of the iron component (superparamagnetic substance) contained therein is “y”, the value of [(xy) / x] is 0.05 to 0.6. Is preferred. When this value is less than 0.05 (when the amount of elution removed is too small), the iron component (superparamagnetic substance) remaining on the surface of the magnetic polymer particles and in the vicinity thereof elutes during use, and biochemistry Depending on the field of application, such as typical uses, it may not have sufficient practical performance. On the other hand, when the value of [(xy) / x] exceeds 0.6 (when the elution removal amount is excessive), the superparamagnetic substance inside the particle is eluted, and the magnetic sedimentation rate is decreased. , It may not have sufficient magnetic response.
[0054]
The treatment conditions in the case of using an inorganic acid as the iron solubilizer are selected so as to ensure this by taking the dissolved removal amount (xy) of the iron component as a guide. Preferred treatment conditions vary depending on the type of iron-based superparamagnetic material and inorganic acid, but from the viewpoint of controlling the amount of dissolution and removal, the treatment temperature is 0 to 100 ° C. and the treatment time is 0.5 to 20 hours.
In a mode in which sulfuric acid is brought into contact with particles before modification in a dispersion (magnetic polymer latex) in which particles before modification are dispersed in an aqueous medium, a preferred example of treatment conditions is shown in FIG. The concentration of pre-particles is 4 g / liter, the sulfuric acid concentration is 2 N, the treatment temperature is 25 ° C., and the treatment time is 2 hours. Further, after the treatment, the magnetic polymer particles [surface modified particles (b)] are washed and redispersed, and then neutralized by adding an alkaline compound to the dispersion of the surface modified particles (b). Is preferred.
[0055]
Examples of the organic acid that can be used as the iron solubilizer include oxalic acid, citric acid, chloroacetic acid, mercaptoacetic acid, sulfosalicylic acid and the like. Among these, mercaptoacetic acid and sulfosalicylic acid are preferable.
Further, complexing agents that can be used as iron solubilizers include thiocyanates such as potassium thiocyanate, sodium thiocyanate, and guanidine thiocyanate; mercapto such as 2-mercaptoethanol, dithioglycerin, dithiotrimethylolpropane, and dithioerythritol. Compounds: nitrogen-based complexing agents such as o-phenanthroline, 2,2′-bipyridyl, 8-quinolinol, and ethylenediaminetetraacetic acid can be exemplified. Of these, potassium thiocyanate, guanidine thiocyanate, 2-mercaptoethanol, dithioerythritol, o-phenanthroline, and 2,2'-bipyridyl are preferred.
These iron solubilizers may be used alone, but are preferably used in combination of two or more. In this case, it is preferable to use different types of iron solubilizers in combination, such as a combination of an organic acid and a thiocyanate, or a combination of a mercapto compound and a thiocyanate.
[0056]
The organic acid and complexing agent used as the iron solubilizer can selectively dissolve and remove iron components present on the surface of the pre-modification particle and in the vicinity of the surface.
When using an organic acid as the iron solubilizer, the preferred amount of the iron component to be dissolved and removed varies depending on the amount of superparamagnetic material existing on the surface of the particle before modification and in the vicinity of the surface. When the amount of superparamagnetic material to be produced is small, the weight of the iron component (superparamagnetic material) contained in the pre-modification particles is “x”, and the iron contained in the surface-modified particles (b) When the weight of the component (superparamagnetic material) is “z”, it is preferable that the value of [(x−z) / x] is 0.01 to 0.4.
[0057]
The processing conditions in the case of using an organic acid and / or complexing agent do not need to be controlled as strictly as in the case of using an inorganic acid.
In a dispersion (magnetic polymer latex) in which particles before modification are dispersed in an aqueous medium, guanidine thiocyanate (complexing agent) and 2-mercaptoethanol (complexing agent) are contacted with the particles before modification. In the embodiment of the present invention, a preferred example of the processing conditions is as follows: the concentration of the pre-modification particles in the aqueous medium is 50 g / liter, the concentration of guanidine thiocyanate is 1 mol / liter, and the concentration of 2-mercaptoethal is 1% by weight. The processing temperature is 25 ° C. and the processing time is 12 hours.
[0058]
In the surface-modified particles (b) obtained through the step (b), the amount of iron-based superparamagnetic substance remaining on the particle surface and in the vicinity of the surface is preferably as small as possible.
Specifically, after 0.1 g of the surface-modified particles (b) subjected to the washing treatment were immersed in 10 ml of pure water heated to 70 ° C. for 2 hours, the metal content eluted in the pure water Is preferably 10 ppm or less, more preferably 1 ppm or less.
[0059]
<Step (c)>
This step (c) is a step of bringing the organic base and / or the water-soluble solvent into contact with the particles before modification.
[0060]
Specific examples of the organic base that can be used in the step (c) include organic amine compounds such as ammonia, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dimethylamine, diethylamine, and trimethylamine.
[0061]
The water-soluble solvent that can be used in the step (c) is an organic solvent having a solubility in water at 25 ° C. of 1% by weight or more and having an affinity for the polymer. Specific examples of such water-soluble solvents include acetone, mercaptoethanol, erythritol, dithioerythritol, ethyl acetate, butyl carbitol acetate, and phenyl cellosolve.
[0062]
This step (c) is performed by adding an organic base and / or a water-soluble solvent to an aqueous dispersion of magnetic polymer particles (pre-modification particles).
Here, the amount of the organic base used is usually 0.1 to 20% by volume of the aqueous dispersion of the particles before modification. Moreover, the usage-amount of a water-soluble solvent is normally 1-95 volume% of the aqueous dispersion of the particle | grains before a modification | reformation.
The concentration of the pre-modification particles in the aqueous dispersion is not particularly limited, but is preferably 0.1 to 20% by weight. In addition, when the particle | grains before modification | settling settle, it is preferable to process, stirring moderately.
The pH of the aqueous dispersion is usually 9 or more, preferably 11 or more. Although there is no restriction | limiting in particular as processing temperature, It is preferable that it is about 50 to 80 degreeC. The treatment time is not particularly limited, but is preferably 1 to 40 hours.
[0063]
The magnetic polymer particles obtained through this step (c) (hereinafter also referred to as “surface modified particles (c)”) are particles having a large surface charge, specifically, the surface charge is 0.05 milliequivalent / g or more particles. Here, the “surface charge” is a value obtained by measuring the acid present on the surface of the magnetic polymer particle by conductometric titration, and is equivalent to milliequivalent / g (present on the particle surface per 1 g of the magnetic polymer particle). The number of milliequivalents of carboxyl groups). References describing this measurement method include “J. Electroanal. Chem., Vol. 37 P. 161 (1972)”.
The particles having such a large surface charge amount can be used as a carboxyl group-modified particle without any practical problem.
In addition, particles having such a large surface charge amount are excellent in dispersion stability even in a dispersion medium having a high electrolyte concentration in the use of the particles, and are excellent in redispersibility after the particles are settled. A group can be used to chemically bond a nucleic acid or a physiologically active substance such as an antigen / antibody or enzyme to the surface.
As a method for obtaining a predetermined surface charge amount, a conventionally performed method can be used as it is. For example, a method of directly adding an acid monomer that can be copolymerized at the time of polymerization, a method of adding an ester-based monomer that can be copolymerized to form particles, and then hydrolyzing to obtain surface charge, or a reactive property such as glutarmethacrylate It may be copolymerized with a copolymerizable monomer having a high functional group.
[0064]
Magnetic polymer particles according to the present invention (magnetic polymer particles of the present invention and magnetic polymer particles obtained by the method of the present invention) are a diagnostic agent carrier, a bacterial separation simple substance, a cell separation carrier, a nucleic acid separation purification carrier, a protein separation purification carrier, It can be suitably used as an immobilized enzyme carrier, drug delivery carrier, magnetic toner, magnetic ink, magnetic paint and the like. The magnetic polymer particles according to the present invention can be easily bound (chemically or physically bound) with a nucleic acid such as DNA or RNA, or a physiologically active substance such as an antigen / antibody or an enzyme.
[0065]
Nucleic acid-immobilized magnetic polymer particles can be obtained by immobilizing oligonucleotides on the surface of the magnetic polymer particles of the present invention. The length of the oligonucleotide is 10 to 100 bases, preferably 15 to 70 bases. If necessary, the oligonucleotide to be immobilized may be single-stranded DNA, double-stranded DNA, or RNA. Such a nucleic acid can be prepared using a commercially available nucleic acid synthesizer.
In the present invention, for example, methods described in JP-A-7-75599 and JP-A-6-335380 can be applied to the method of immobilizing the particles as a carrier having a nucleic acid.
Specifically, specifically, 1 equivalent of nucleic acid probe and 1 equivalent of DNA complementary to the nucleic acid probe hybridization site are mixed in an annealing buffer, heated at 80 ° C. for 5 minutes, and then gradually returned to room temperature. A double strand is formed. After purifying this double-stranded DNA with a hydroxyapatite column, it is added to a particle dispersion together with a dehydrating condensing agent and heated to heat the amino group in the base sequence of the nucleic acid probe immobilization site and the carboxyl acid on the particle surface. The group can be fixed by an amide bond.
Examples of the dehydrating condensing agent include carbodiimides such as 1-ethyl-3- (N, N′-dimethylamino) propylcarbodiimide, N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3′-sulfonate, N Water-soluble dehydration condensing agents such as ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2-dihydroquinoline are preferred, but oil-soluble dehydrating condensing agents can also be used.
The amount of particles used is usually 0.5 to 500 g, preferably 5 to 50 g, per mmol of nucleic acid probe. The immobilization reaction of the nucleic acid probe to the particles may be usually performed in an aqueous medium having a pH of about 3 to 11 at 4 to 70 ° C. for 5 minutes to overnight.
[0066]
Next, the nucleic acid probe particle of the present invention is obtained by releasing the complementary base sequence bound to the hybridization site in the nucleic acid probe immobilized on the particle. At this time, the complementary base sequence can be removed by heat or alkali denaturation, and the complementary base sequence can be removed by means such as centrifugation or filtration.
The nucleic acid-immobilized magnetic polymer particles thus prepared can be used for gene diagnosis and general genetic engineering. Specifically, for example, messenger RNA can be directly recovered from a cell lysate using magnetic polymer particles to which oligo dT is bound. Alternatively, if a nucleic acid sequence complementary to the AIDS virus nucleic acid is used, the AIDS virus can be recovered from the biological sample and detected using the DNA probe method or the polymerase chain reaction method. Due to the composition of the magnetic polymer particles of the present invention, the non-specific adsorption of proteins is significantly lower than that of conventional styrenic particles, so it is easy to keep the background low when used for the above diagnostic and research purposes. Therefore, it is preferable because highly sensitive detection can be performed. In addition, even in the enzyme reaction, the activity decrease due to adsorption of the enzyme protein is small, and a highly efficient enzyme reaction can be realized as compared with the conventional carrier.
A protein-immobilized magnetic polymer particle carrying a physiologically active protein can be prepared by immobilizing the physiologically active protein on the magnetic polymer particle of the present invention. The physiologically active protein includes a protein having general physiological activity or a complex thereof. Specific examples include immunoglobulins, various enzymes, and avidin proteins. Such a protein can be bound to the surface of the magnetic polymer particle in the same manner as the nucleic acid immobilization. Specifically, the amino group of the protein can be used to react with the carboxyl group on the particle surface. Various measures are taken to increase the reaction efficiency. For example, the dehydrating condensing agent may be reacted with the carboxyl group of the particles first, and then the protein may be added to react.
The antibody-bound particles, avidin-bound particles, and enzyme-bound particles prepared as described above can be used in the diagnostic field and research field. In particular, since the amount of physical adsorption of protein by the magnetic polymer particles of the present invention is small, the background is extremely low. Therefore, even a very small amount of measurement object can be detected with high sensitivity.
[0067]
【Example】
Examples of the present invention will be described below, but the present invention is not limited to these examples. In the following, “part” means “part by weight”.
[0068]
<Reference Example 1>
  Ferrite colloid HC50 (manufactured by Taiho Kogyo Co., Ltd.) is added with acetone to precipitate and precipitate particles, and then dried to obtain a ferrite-based superparamagnet having a lipophilic surface. A body (particle size: 0.01 μm) was obtained.
  According to the formulation shown in Table 1, 75 parts of cyclohexyl methacrylate, 5 parts of methacrylic acid, 20 parts of methyl methacrylate and 3 parts of benzoyl peroxide (polymerization initiator) are added to 40 parts of the superparamagnetic substance, and this system is mixed and stirred. The monomer composition was prepared by uniformly dispersing the superparamagnetic material.
  Meanwhile, 10 parts of polyvinyl alcohol, 0.05 part of sodium laurate and polyethyleneNAn aqueous medium was prepared by dissolving 0.1 part of oxidonyl phenyl ether in 1000 parts of water.
  The above monomer composition is added to the obtained aqueous medium (aqueous phase), and this system is pre-stirred with a homomixer and then dispersed with an ultrasonic disperser to obtain an oil having an average particle diameter of 2 μm. A suspension (oil droplet dispersion) in which droplets (oil phase) were dispersed in an aqueous medium was prepared.
  Next, the obtained suspension was charged into a 2 liter three-neck flask with a stirrer, and the system was heated to 75 ° C. and stirred for 5 hours under a nitrogen atmosphere over 5 hours. By polymerizing (suspension polymerization),Magnetic polymer particlesWas dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex).
  Dispersed in this magnetic polymer latexMagnetic polymer particles[Hereinafter also referred to as “magnetic polymer particles (1)”. ] Can be easily attracted and settled by a magnet and recovered, and the recovered magnetic polymer particles (1) can be easily redispersed in water. Therefore, the operation of washing and purifying the magnetic polymer particles (1) was performed three times by magnetic precipitation in distilled water.
[0069]
<Example 1>
  According to the formulation shown in Table 1, except that the monomer composition in the monomer composition was changed to 75 parts of cyclohexyl acrylate, 3 parts of methacrylic acid and 2 parts of acrylic acid.Reference example 1In the same manner as described above, a monomer composition and a suspension are prepared and subjected to suspension polymerization, whereby the magnetic polymer particles of the present invention [hereinafter also referred to as “magnetic polymer particles (2)”. ] Was dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex).
[0070]
<Example 2>
  According to the formulation shown in Table 1, except that the monomer composition in the monomer composition was changed to 10 parts 2-ethylhexyl methacrylate, 50 parts cyclohexyl methacrylate, 5 parts methacrylic acid and 35 parts styrene.Reference example 1In the same manner as described above, a monomer composition and a suspension are prepared and subjected to suspension polymerization, whereby the magnetic polymer particles of the present invention [hereinafter also referred to as “magnetic polymer particles (3)”. ] Was dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex).
[0071]
<Comparative Example 1>
  According to the formulation shown in Table 1, except that the monomer composition in the monomer composition was changed to 5 parts methacrylic acid and 95 parts styrene.Reference example 1In the same manner as described above, a monomer composition and a suspension are prepared, and suspension polymerization is performed, whereby comparative magnetic polymer particles [hereinafter also referred to as “magnetic polymer particles (C1)”. ] Was dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex).
[0072]
<Comparative example 2>
  According to the formulation shown in Table 1, except that the monomer composition in the monomer composition was changed to 10 parts 2-ethylhexyl methacrylate, 5 parts methacrylic acid, 10 parts methyl methacrylate and 75 parts styrene.Reference example 1In the same manner as described above, a monomer composition and a suspension are prepared, and suspension polymerization is performed, whereby comparative magnetic polymer particles [hereinafter also referred to as “magnetic polymer particles (C2)”. ] Was dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex).
[0073]
  Reference Example 1 andAbout each of the magnetic polymer latex obtained by Examples 1-2 and Comparative Examples 1-2, the polymerization conversion rate, solid content concentration, and the content rate of the superparamagnetic substance in a magnetic polymer particle were measured. Further, according to the evaluation method shown below, the polymerization stability, the dispersibility of the superparamagnetic substance in the magnetic polymer particles, and the stationary stability were evaluated, and the shape, number average particle diameter and The coefficient of variation was measured. These results are also shown in Table 1.
[0074]
(A) Evaluation of polymerization stability:
After completion of the polymerization reaction, the reaction product is passed through a 200-mesh stainless steel wire mesh. When the amount of agglomerates remaining on the wire mesh is less than 10% by weight of the total solids, the result is “good”. A case where the solid content was 10% by weight or more was judged as “bad”.
[0075]
(B) Evaluation of dispersibility of superparamagnetic material:
After staining with uranyl acetate, observe the dispersion state of the superparamagnetic substance in the magnetic polymer particles with a transmission electron microscope, and disperse uniformly throughout the interior of the polymer particles or uniformly in the center of the polymer particles The case was judged as “good”, and the case where it was localized in a part of the vicinity of the surface of the polymer particle or all of the vicinity of the surface was judged as “bad”.
[0076]
(C) Evaluation of stationary stability:
The magnetic polymer latex is diluted to obtain a solid content concentration (c₀) Was adjusted to 1% by weight, and this diluted solution was placed in a 20 ml sample bottle so that the height of the liquid phase was 2 cm, and the container was shaken until the magnetic polymer particles were uniformly dispersed. Let stand for 10 minutes, take out only the upper layer part from the liquid level to 1 cm below the liquid level, measure the solid content concentration (c), (c / c₀) X 100 was calculated as the static stability index (% by weight).
[0077]
(D) Measurement of number average particle size and coefficient of variation of magnetic polymer particles:
After dyeing with uranyl acetate, take an electron micrograph of magnetic polymer particles with a transmission electron microscope and measure the particle size of 500 randomly selected magnetic polymer particles. The coefficient was obtained.
[0078]
<Comparative Example 3>
  A ferromagnetic material was prepared by oleophilic treatment of magnetite fine particles “magnetite EPT500” (manufactured by Toda Kogyo Co., Ltd.) having a particle diameter of 3000 mm with sodium oleate. According to the prescription shown in Table 1, except that the ferromagnetic material was used instead of the superparamagnetic material.Reference example 1In the same manner as described above, a monomer composition and a suspension are prepared, and suspension polymerization is performed, whereby a comparative magnetic polymer particle [hereinafter also referred to as “magnetic polymer particle (C3)”. ] Was dispersed in an aqueous medium (magnetic polymer latex).
  About the obtained magnetic polymer latex, polymerization conversion rate, solid content concentration, content of ferromagnetic substance in magnetic polymer particles, polymerization stability, dispersibility of ferromagnetic substance in magnetic polymer particles, static stability, magnetic polymer Particle shape, number average particle size andCoefficient of variationThe results are also shown in Table 1.
  The magnetic particles of Comparative Example 3 had residual magnetization, and the particles after being collected by magnetic attraction attracted each other and had poor redispersibility.
[0079]
[Table 1]

[0080]
<Reference Example 2>
  After 3 hours from the start of suspension polymerization, 19 parts of methyl methacrylate and 1 part of methacrylic acid were added to the reaction system, and the suspension was further polymerized for 5 hours.Reference example 1LikeMagnetic polymer particlesA dispersion (magnetic polymer latex) was prepared. The polymerization conversion rate of the magnetic polymer latex thus obtained is 98% by weight and constitutes the magnetic polymer latex.This exampleThe magnetic polymer particles had a surface coating layer that did not contain a superparamagnetic substance.
[0081]
<Reference Example 3>
  Reference example 1100 parts of the magnetic polymer latex (1) obtained by the above was added to 1000 parts of 0.1 N hydrochloric acid, and the superparamagnetic substance existing in the vicinity of the surface of the magnetic polymer particles (1) was eluted and removed. Here, the processing time was 1 hour. The treated magnetic polymer particles are then washed and purified by magnetic separation,Magnetic polymer particlesA dispersion (magnetic polymer latex) was prepared.thisA surface coating layer not containing a superparamagnetic substance was formed on the magnetic polymer particles.
[0082]
<Reference Example 4>
  Reference example 1By adding 250 ml of 2N sulfuric acid (iron solubilizer) to 8.0 g (1 g in solid content) of the magnetic polymer latex obtained by the above, the system is gently stirred at 25 ° C. for 3 hours, before modification. The particle [magnetic polymer particle (1)] was subjected to acid treatment (elution removal treatment of superparamagnetic substance existing in the vicinity of the surface).
  Next, the treated magnetic polymer particles are separated and recovered by magnetic precipitation, and the recovered magnetic polymer particles are collected from an aqueous solution (0.01 wt%) of polyoxyethylene nonylphenyl ether “Emulgen 910” (manufactured by Kao Corporation). ) Washed twice with 200 ml, redispersed in 10 ml of distilled water, and the pH of the resulting dispersion was adjusted to 7 with aqueous sodium hydroxide (0.5 wt%). By such an operation, a dispersion (magnetic polymer latex) of 0.75 g of magnetic polymer particles [surface modified particles (b)] from which the superparamagnetic material in the vicinity of the surface was eluted and removed was obtained.
  The obtained surface modified particles (b) had a ferrite content of 22.5% by weight as measured by thermobalance, and 20% by weight of the ferrite (superparamagnetic material) contained in the particles before modification was dissolved and removed. It will be done. The average particle size of the surface modified particles (b) was 1.8 μm, which was not significantly different from the particle size of the particles before modification.
  further,This exampleIon-exchanged water was added to 1 g (0.1 g in solid content) of the dispersion of magnetic polymer particles [surface modified particles (b)] obtained in step 1 above, and magnetic precipitation was performed twice to obtain surface modified particles (b And the surface-modified particles (b) were sufficiently washed with water. Subsequently, the surface modified particles (b) were added to 10 ml of ion exchange water, and the system was stirred at 70 ° C. for 24 hours. Thereafter, when the supernatant portion of this system was collected and the iron concentration was measured by atomic absorption spectrometry, the iron concentration was 1 ppm or less. From this, it was present on the surface of the surface modified particles (b) and in the vicinity of the surface. It was confirmed that the amount of superparamagnetic material was extremely small. For comparison,Example 1When the same operation was performed on 0.8 g (0.1 g in solid content) of the magnetic polymer particle (2) dispersion obtained in 1 above, the iron concentration in the supernatant was 73 ppm.
[0083]
<Reference Example 5>
  Reference example 11 g of 1 wt% aqueous ammonia (organic base) was added to 0.8 g of the magnetic polymer latex obtained by the above (0.1 g in solid content). The pH of the system (magnetic polymer latex) at this time was 12.5. Next, this system was gently shaken at 60 ° C. for 10 hours to perform alkali treatment on the pre-modified particles [magnetic polymer particles (1)]. The system was then cooled and the pH was adjusted to 7.5 by neutralizing with 0.5 N sulfuric acid. Next, washing / redispersion treatment with pure water was performed 4 times on the magnetic polymer particles [surface modified particles (c)] subjected to the alkali treatment.
  The content of the superparamagnetic substance in the surface modified particles (c) thus obtained is 28% by weight, the average particle size of the surface modified particles (c) is 1.8 μm, There was no great difference between the content ratio and the particle size. Further, when the surface charge amount of the surface modified particles (c) was measured, it was 0.125 meq / g, which was compared with the surface charge amount (0.002 meq / g) of the magnetic polymer particles (1). It was confirmed that it showed a large value.
[0084]
<Reference Examples 6-14>
  Except for using 1% by weight of ammonia water, the organic base or water-soluble solvent shown in Table 2 below was used.Reference Example 5In the same manner as above, the pre-modified particles [magnetic polymer particles (1)] were treated to obtain surface-modified particles (c). In addition, only water-soluble solvents were used as treatment agents.ExampleIn No. 1, the treatment was carried out after adjusting the pH of the system to 12 with a 0.5 N aqueous sodium hydroxide solution. For each of the resulting surface modified particles (c),Reference Example 5Table 2 also shows the value of the surface charge measured in the same manner as described above.
[0085]
<Example 3>
  Example 1Except that 0.8 g (0.1 g in solid content) of the magnetic polymer latex obtained by the above was used together with 1 g of acetone as a treating agent.Reference Example 5In the same manner as above, particles before modification [magnetic polymer particles (2): surface charge amount 0.005 meq / g] were processed to obtain surface-modified particles (c). About the surface modified particles (c) thus obtained,Reference Example 5Table 2 also shows the value of the surface charge measured in the same manner as described above.
[0086]
<Example 4>
  Example 2Except that 0.8 g (0.1 g in solid content) of the magnetic polymer latex obtained by the above was used together with 1 g of acetone as a treating agent.Reference Example 5In the same manner as above, particles before modification [magnetic polymer particles (3): surface charge amount 0.003 meq / g] were processed to obtain surface modified particles (c). About the surface modified particles (c) thus obtained,Reference Example 5Table 2 also shows the value of the surface charge measured in the same manner as described above.
[0087]
[Table 2]

[0088]
<Test Example 1>
  By conducting the following tests, evaluation as immunodiagnostic carrier particles (enzyme immunization carrier) was performed.
  Reference Example 1, Examples 1-2, Reference Examples 2-3, Reference Example 5, Reference Example 7, Reference Example 1210 mg of each of the magnetic polymer latexes obtained in accordance with Comparative Examples 1 to 3 was collected in terms of solid content, and the magnetic polymer particles were magnetically separated from the collected magnetic polymer latex, and the magnetic polymer particles were then buffered with phosphate physiological saline. Dispersed in 1 ml of liquid (pH 7.5). Next, 200 μg of anti-human IgM antibody was added to this dispersion, and the polymer was adsorbed on the particle surface by gently shaking at room temperature for 1 hour to sensitize the magnetic polymer particles. The magnetic polymer particles after sensitization were magnetically separated, and whether or not the antibody remained in the supernatant after separation was confirmed by measuring the absorbance at 280 nm. The presence of the antibody was not recognized, and therefore, it was confirmed that all the added antibodies were adsorbed on the magnetic polymer particles.
  Each of the magnetically separated magnetic polymer particles (anti-human IgM antibody-sensitized particles) is a phosphate saline buffer solution containing 0.5% bovine serum albumin and 0.1% polyethylene glycol ( 1 ml of pH 7.5) was added, and the mixture was vibrated and dispersed with a vibrator, and then gently shaken at room temperature for 30 minutes, and the particle surface on which the antibody was not adsorbed was blocked with albumin, whereby the enzyme immunoassay (EIA Method) was prepared.
  The following operation was performed using each of the diagnostic agent particles prepared as described above. Prepare 100 μl of phosphate saline buffer containing human IgM antigen at concentrations of 0 ng / ml, 50 ng / ml, 100 ng / ml, 500 ng / ml, and add 20 μl of a dispersion containing diagnostic agent particles to each. Allowed to stand at room temperature for 30 minutes. Subsequently, 200 μl of a solution containing 100 μg of anti-human IgM antibody conjugated with acetylcholinesterase was added to the magnetically separated magnetic polymer particles, dispersed by vibration with a vibrator, and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour.
  Next, 100 μl of “Ellman's reagent” (Cayman), which is a substrate for acetylcholinesterase, is added and gently shaken at room temperature for 10 minutes to cause enzymatic reaction color development, and 50 μl of 2N sulfuric acid as a reaction stop solution is added. Then, the absorbance at 412 nm was measured. Further, as a control test, the absorbance was measured by adding 20 μl of a dispersion containing unsensitized particles to 100 μl of a phosphate physiological saline buffer containing no human IgM antigen and performing the same operation. These results are shown in Table 3.
[0089]
[Table 3]

[0090]
<Test Example 2>
Streptavidin (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was bound instead of anti-human IgM in the same manner as in Test Example 1, and the magnetic polymer particles were washed after the reaction in the same manner. The final dispersion was 5% by weight. Add 0 μl, 25 μl or 100 μl of biotin-conjugated acetylcholinesterase solution (1 μg / ml) to 10 μl (0.5 mg) of streptavidin-conjugated magnetic polymer particles so that the final salt concentration becomes 1M NaCl solution. 5M NaCl solution was added and the reaction volume was brought to 0.5 ml with distilled water. The reaction was allowed to stand for 10 minutes. Next, the substrate was added in the same manner as in Test Example 1, reacted under the same conditions, and the absorbance was measured. The results are shown in Table 4.
[0091]
[Table 4]

[0092]
<Test Example 3>
K562 cells, which are human leukocyte cancer cells, were cultured in a PRM1-1640 medium containing 1 wt% fetal bovine serum. When the number of cells in the culture suspension reached 500,000 cells / mL, 1 mL of this culture suspension was placed in a sampling tube and centrifuged at 500 rpm for 5 minutes to recover the cells. After 1 mL of potassium phosphate buffer (pH 7.2) was added to the collected cells, the cells were decellularized by sonication.
This cell-free K562 cell lysate was taken in 0.5 mL portions in three centrifuge tubes (volume 2 mL) and diluted to 2 mL with 10 mM phosphate buffer (pH 5). Next, HIV-1, DNA taken from human leukocytes (NY10 strain) cultured by incorporating AIDS virus DNA was added to each of the centrifuge tubes for 0 molecule, 10 molecules, and 50 molecules, respectively. After vortexing, each of the centrifuge tubesReference example 12 μL of a dispersion having a solid content concentration of 10% by weight obtained by dispersing the cationic magnetic polymer particles obtained by the above was added, and the mixture was rotationally stirred at 10 rpm at room temperature for 5 minutes. Next, the magnetic polymer particles were magnetically separated, and 25 μL of the PCR reaction solution shown in Table 5 below was added to each of the separated magnetic polymer particles to perform a PCR reaction.
[0093]
[Table 5]

[0094]
In Table 5 above, the sequence of “Primer SK145A” is “5′CCCACAAGATTTAAACACCA 3 ′”, and the sequence of “Primer SK451A” is “5′TGAAGGGTACTAGTAGTTCC 3 ′”, which is a DNA synthesizer “381A type” (Applied Biosystems) was synthesized according to the manufacturer's manual, and then purified product was obtained by HPLC.
The PCR reaction was performed using “Thermal Cycler Model JP2000” (manufactured by PERKIN ELMER CETUS) (94 ° C. × 0.5 minutes, 55 ° C. × 1.0 minutes, 72 ° C. × 1.5 minutes). The amplification reaction was performed with a cycle and a program of 72 ° C. × 7 minutes.
Take 5 μL of the product of the first PCR amplification reaction,
Instead of “SK145A”, “Primer SK145” (manufactured by Takara) is used,
The Nested PCR reaction was performed in the same manner except that “Primer SK451” (manufactured by Takara) was used instead of “Primer SK451A”.
The reaction amplification products of the PCR method and the nested PCR method were mixed in TBE buffer (buffer solution consisting of 50 mM boric acid, pH 8.2) using a 2% by weight agarose gel “Agarose 1600” (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). Electrophoresis was performed using a type electrophoresis apparatus, and after ethidium bromide staining, detection was performed under ultraviolet irradiation at a wavelength of 254 nm. These results are shown in Table 6.
[0095]
[Table 6]

[0096]
From the results shown in Table 6, it was found that by using the magnetic polymer particles of the present invention, DNA can be recovered using magnetic separation instead of centrifugation, and thus can be used for PCR.
[0097]
【The invention's effect】
ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel magnetic polymer particle excellent in the dispersibility of a superparamagnetic substance can be provided.
The magnetic polymer particles of the present invention are excellent in magnetic responsiveness, and in the dispersion of magnetic polymer particles (magnetic polymer latex), there is no problem of iron ions eluting from the magnetic polymer particles into the aqueous medium. Because of this problem, it can be suitably used in various applications and technical fields in which the application of magnetic polymer latex has been restricted. Further, the magnetic polymer particles of the present invention hardly settle in an aqueous medium and can exist in a homogeneous dispersion state in the aqueous medium.
According to the production method of the present invention, magnetic polymer particles having excellent characteristics as described above and dispersions thereof can be reliably produced.
[0098]
The magnetic polymer particles of the present invention can be widely applied to various applications and fields that require magnetic responsiveness due to the excellent properties as described above. For example, antigens, antibodies, proteins, nucleic acids and the like can be applied to a wide range as diagnostic agents by physically or chemically adsorbing them. In addition, when used as a diagnostic agent for enzyme immunoassay, non-specific color development caused by the elution of iron ions from magnetic polymer particles is suppressed, further enhancing the practicality and reliability as a diagnostic agent. Yes. In addition, since the superparamagnetic substance is not exposed on the surface of the magnetic polymer particles, it is excellent in electrostatic characteristics and film formability, and is also useful as a magnetic toner, magnetic ink, and magnetic paint.

Claims

（Ａ）２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールアクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールメタクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールアクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールメタクリレート、シクロヘキセンジアクリレート、シクロヘキセンジメタクリレート、並びに、シクロヘキシル基の水素原子の一部が炭素数１〜５のアルキル基により置換された置換シクロアルキルアクリレートおよび置換シクロアルキルメタクリレートから選ばれた、アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレートに由来する構造単位３０〜９９重量％、
（Ｂ）不飽和カルボン酸に由来する構造単位１〜２０重量％、並びに
（Ｃ）前記アルキル（メタ）アクリレートおよび前記不飽和カルボン酸と共重合可能な芳香族ビニル化合物に由来する構造単位０〜６９重量％からなる共重合体１００重量部に対して、超常磁性体１〜１００重量部を含有してなり、
数平均粒子径が０．０２〜３０μｍであることを特徴とする磁性ポリマー粒子。(A) 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, pentyl acrylate, pentyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, cyclohexyl acrylate, Cyclohexyl methacrylate, cyclohexyl ethylene glycol acrylate, cyclohexyl ethylene glycol methacrylate, cyclohexyl dipropylene glycol acrylate, cyclohexyl dipropylene glycol methacrylate, cyclohexene diacrylate, cyclohexene dimethacrylate, and the hydrogen atom of the cyclohexyl group A structural unit derived from an alkyl (meth) acrylate having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group , selected from substituted cycloalkyl acrylates and substituted cycloalkyl methacrylates partially substituted with an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms 30-99% by weight,
(B) 1 to 20% by weight of a structural unit derived from an unsaturated carboxylic acid, and (C) a structural unit derived from an aromatic vinyl compound copolymerizable with the alkyl (meth) acrylate and the unsaturated carboxylic acid. It contains 1 to 100 parts by weight of superparamagnetic material with respect to 100 parts by weight of a copolymer consisting of 69% by weight,
A magnetic polymer particle having a number average particle diameter of 0.02 to 30 μm.

（Ａ）２−エチルヘキシルアクリレート、２−エチルヘキシルメタクリレート、ｎ−ブチルアクリレート、ｎ−ブチルメタクリレート、イソブチルアクリレート、イソブチルメタクリレート、ペンチルアクリレート、ペンチルメタクリレート、ステアリルアクリレート、ステアリルメタクリレート、ラウリルアクリレート、ラウリルメタクリレート、シクロヘキシルアクリレート、シクロヘキシルメタクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールアクリレート、シクロヘキシルエチレングリコールメタクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールアクリレート、シクロヘキシルジプロピレングリコールメタクリレート、シクロヘキセンジアクリレート、シクロヘキセンジメタクリレート、並びに、シクロヘキシル基の水素原子の一部が炭素数１〜５のアルキル基により置換された置換シクロアルキルアクリレートおよび置換シクロアルキルメタクリレートから選ばれた、アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレートを３０〜９９重量％、
（Ｂ）不飽和カルボン酸を１〜２０重量％、並びに
（Ｃ）前記アルキル（メタ）アクリレートおよび前記不飽和カルボン酸と共重合可能な芳香族ビニル化合物を０〜６９重量％の割合で含有するモノマー中に超常磁性体を分散させてモノマー組成物を調製し、
このモノマー組成物を水性媒体中に分散させて懸濁液を得、
この懸濁液中において、前記モノマーを重合させることを特徴とする磁性ポリマー粒子の製造方法。(A) 2-ethylhexyl acrylate, 2-ethylhexyl methacrylate, n-butyl acrylate, n-butyl methacrylate, isobutyl acrylate, isobutyl methacrylate, pentyl acrylate, pentyl methacrylate, stearyl acrylate, stearyl methacrylate, lauryl acrylate, lauryl methacrylate, cyclohexyl acrylate, Cyclohexyl methacrylate, cyclohexyl ethylene glycol acrylate, cyclohexyl ethylene glycol methacrylate, cyclohexyl dipropylene glycol acrylate, cyclohexyl dipropylene glycol methacrylate, cyclohexene diacrylate, cyclohexene dimethacrylate, and the hydrogen atom of the cyclohexyl group 30 to 99 weights of alkyl (meth) acrylate having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group , selected from substituted cycloalkyl acrylates and substituted cycloalkyl methacrylates partially substituted with alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms %,
(B) 1 to 20% by weight of unsaturated carboxylic acid, and
(C) A monomer composition is prepared by dispersing a superparamagnetic substance in a monomer containing 0 to 69% by weight of an aromatic vinyl compound copolymerizable with the alkyl (meth) acrylate and the unsaturated carboxylic acid. And
This monomer composition is dispersed in an aqueous medium to obtain a suspension,
A method for producing magnetic polymer particles, wherein the monomer is polymerized in the suspension.

（Ａ）アルキル基の炭素数が４〜２０であるアルキル（メタ）アクリレートに由来する構造単位３０〜９９重量％、
（Ｂ）不飽和カルボン酸に由来する構造単位１〜２０重量％、並びに
（Ｃ）前記アルキル（メタ）アクリレートおよび前記不飽和カルボン酸と共重合可能なビニルモノマーに由来する構造単位０〜６９重量％からなる共重合体１００重量部に対して、超常磁性体１〜１００重量部を含有してなり、数平均粒子径が０．０２〜３０μｍである粒子にオリゴヌクレオチドまたは生理活性蛋白質を固定してなる磁性ポリマー粒子。(A) 30 to 99% by weight of a structural unit derived from an alkyl (meth) acrylate having 4 to 20 carbon atoms in the alkyl group,
(B) 1-20% by weight of structural units derived from unsaturated carboxylic acid, and
(C) 1 to 100 superparamagnetic materials with respect to 100 parts by weight of a copolymer consisting of 0 to 69% by weight of structural units derived from vinyl monomers copolymerizable with the alkyl (meth) acrylate and the unsaturated carboxylic acid. Magnetic polymer particles obtained by immobilizing an oligonucleotide or a physiologically active protein on particles containing a weight part and having a number average particle diameter of 0.02 to 30 μm.