JP3644169B2 - Plasma or serum separation filter and plasma or serum separation method - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液中から血漿あるいは血清成分を分離回収するフィルター、および血漿あるいは血清を分離する方法に関する。さらに詳しくは、臨床検査等に用いられる際、少量の血液でも、迅速に純度の高い血漿あるいは血清を得ることが可能で、かつ操作性も簡便で、安全性が高く、さらに製造が容易な血漿あるいは血清分離フィルター、および血漿あるいは血清を分離する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
血液中の成分を測定するいわゆる生化学検査は、各種疾患の診断・経過観察に広く利用され、臨床検査として重要な地位を占めている。その分析技術は、近年著しく進歩し、各種自動分析機器の開発により、多数の検体が精度よく迅速に分析できるようになった。
【０００３】
しかし、生化学検査の多くの分野では赤血球等の血球の存在が検査を妨害するため、予め血液から血清または血漿を分離して使用されている。そのため、検査に先立ち、患者や被験者から採取した血液を一旦凝固させた後、遠心分離し、血清を得るという過程を経る必要がある。凝固、遠心分離の操作は時間がかかり、臨床検査の短時間化を妨げるネックとなっているばかりでなく、大型の遠心分離器が必要であるため、比較的大きな病院を除いては、臨床検査を外部の検査業者に依頼しているところが多く、検査結果を入手するまでに数日要している。また、血液から血清を分離する作業は未だほとんど人手に頼っているために、作業者は血液に触れ、感染等の恐れにもさらされている。
【０００４】
上記の問題点を解決する手段として、一般にドライケミストリーと呼ばれる技術が知られている。これは、ガラス繊維等の極細繊維フィルターからなる血清分離層とその下層に位置する反応層とから成り立つ小型プレートに、微量の血液を滴下すると、血清分離層にて血清が分離され、その下層の反応層にて反応、発色し、これを分光光度計にて測定する。
このドライケミストリーは、液状の発色試薬を使わず、遠心分離による面倒な血清採取も必要としない簡便な方法であるが、測定できる項目が、液状試薬を用いる一般の生化学分析や免疫分析に比べて数が限られていること、一つの検査項目に一つのプレートを用いるので、複数の項目を検査するために多数のプレートを用いなければならず、簡便である割に時間的メリットが少ないこと、高価であること等から、広く普及するには至っていない。
【０００５】
遠心分離を使わずに血漿あるいは血清を得る方法としては、特開昭５３−７２６９１号公報に一端が閉塞された細かいチューブ状フィルター素子を濾材として、血液から血漿を分離する方法が、特開昭６０−１１１６６号公報に中空繊維束を用いた濾過カートリッジを使用し、血液から血漿を分離する方法が提案されている。
しかしながら、前者の方法では、タンパク質の透過率が悪い上に、血球がフィルター表面に付着するため、血漿の濾過に極めて長時間を要し、逆に、濾過速度を速くするため濾過圧を高くすると赤血球の溶血を生じる等の問題がある。また、後者の中空繊維束を用いた濾過カートリッジを使用した方法では、血漿分離作業の準備としてプライミングによる前処理、つまり生理食塩水等で中空糸膜を濡らす等の作業を行うことが必要で、得られる血漿が希釈されてしまったり、血漿分離の作業そのものより準備の作業に手間がかかるという問題点を有する。
【０００６】
また、これらの膜分離による方法は、血球と血漿・血清の分子サイズの違いによる分離法であるために、血液中の蛋白質等、比較的分子量の大きい物質は、膜を十分に通過できず、得られた血漿中の各蛋白質の組成は、正確には元の血液中の蛋白質の組成を反映しない問題がある。さらに、膜の孔径を大きくしすぎると赤血球が目詰まりを起こし、溶血する問題があり、実用化には至っていない。
【０００７】
上記とは別に、繊維状フィルターを用いた臨床検査用血清あるいは血漿分離技術が種々提案されている。特開平４−２０８８５６号公報には、ポリアクリルエステル誘導体とポリエチレングリコールを含有するガラス繊維と、レクチン含浸層からなる血清または血漿成分の分離回収方法が開示されている。また、特開平５−１９６６２０号公報には、上記特開平４−２０８８５６号公報で示された分離フィルターを用いた血清・血漿分離器具が開示されている。
これらの方法および器具は、遠心分離を用いずに臨床検査用の血清あるいは血漿を採取できるものの、得られる血清・血漿の量が１００μｌ前後と少ない上、分離に必要な時間も２分前後で遠心分離に比べ短縮はされているが充分とはいえない。さらにこれらの技術は、分離材にガラス繊維を用いており、電解質等がガラス繊維から溶出したり、ガラス繊維に吸着するため、得られた血漿・血清中の電解質・リン・脂質の濃度が分離前の血液と大きく異なってしまうという欠点を有する。このため、これらの技術も広く普及するには至っていない。
【０００８】
血漿・血清分離用途とは異なるが、例えば特開昭６０−１９３４６８号公報には、白血球除去フィルターとして極細繊維不織布を複数枚重ねたものが開示されており、このような白血球除去フィルターが現在広く普及している。また、国際特許出願ＷＯ８９／２３０４号公報、ＷＯ８９／２３０５号公報あるいは特開平５−１６８７１１号公報には、連通した細孔を有する３次元網目構造の多孔質体を用いた白血球除去フィルターが開示されている。
しかしながら、これらの技術は全て、白血球除去フィルターに関するものであり、臨床検査用の血漿・血清分離に関しては何等情報を与えていない。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
以上説明した通り、臨床検査用途として、少量の血液から迅速、効率的、安全に、血漿・血清成分を分離するフィルターとして、組立性に優れ、充分な性能を有するものは存在しないのが現状である。
【００１０】
本発明の目的は、血液中におけるのと同一の成分組成を有する血漿・血清成分を、血液中の血球を損傷することなく、迅速・簡便・安全に血液から分離することが可能で、かつ組立性に優れた（製造の容易な）血漿・血清分離フィルター、および血漿・血清分離方法を提供することである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決すべく種々検討した結果、連通した細孔を有する３次元多孔質体を用い、細孔径をコントロールすることで、血液中の赤血球と血漿・血清の多孔質体中での移動速度に差を生じさせることができ、かつ、血液の流路長（Ｌ）と流路径（Ｄ）の比（Ｌ／Ｄ）を調整することによって、血液の移動速度の横方向のムラを少なくし、該移動速度の差により生じた赤血球と血漿・血清の移動距離の差を広げることにより、血液中の血漿・血清成分を血球と分離して回収することが可能となることを見出した。さらに３次元多孔質体を用いることで、シート状体を複数重ねたり、あるいは解す必要もなく、また、所望のフィルター形状への成形・加工が容易であり、さらに血液のチャンネリングや、目詰まりによる性能低下、溶血の発生を防ぐことができることを見出した。
【００１２】
上記において、血液中の白血球および血小板は、多孔質体に吸着する性質を有している（この性質は公知）ので、本発明のフィルターを通過する際に吸着除去される。次に、赤血球は多孔質体に吸着する性質を有していないが、多孔質体の細孔径、つまり流路の大きさを小さく設定することにより、いわゆる立体障害が起こり、細孔内を変形しながら移動する。これに対して血漿・血清成分は液体であり、立体障害がなく、赤血球より早く細孔内を移動する。このようにして、赤血球と血漿・血清の移動速度に差が生じる。さらに、Ｌ／Ｄを大きくすることで、血液の移動速度の横方向のムラを少なく、かつ赤血球と血漿・血清の移動距離差を大きくできるため、多孔質体入口に同時に進入した赤血球と血漿・血清は、多孔質体出口部では血漿・血清が先に到達し、血漿・血清のみが回収できる。
【００１３】
なお、本発明が臨床検査等における少量の血漿・血清を採取することを目的としているのに対し、白血球除去フィルターとして用いられる多孔質体は、多量の血液や赤血球濃厚液（通常１００〜５００ｍｌ程度）を処理することを目的としているので、目詰まりや通過抵抗を下げるためＬ／Ｄが小さく（即ち、厚みを薄く、径を大きく）設計されており、また吸着による白血球除去の原理を用いている点で、本発明のものとは基本的に大きく異なるものである。
【００１４】
即ち、本発明は、平均孔径が５〜５０μｍの３次元多孔質体が、血液の流路径（Ｄ）に対する血液の流路長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が０．１５〜６となるように、入口と出口を有する容器に装填されてなることを特徴とする血漿あるいは血清分離フィルターに関する。
【００１５】
また、本発明は、３次元多孔質体の空孔率が２０〜９５％であることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルター；
３次元多孔質体が円盤状であり、容器入口が３次元多孔質体の円周部全面にわたって血液を供給しうるように構成されており、且つ容器出口が円盤状の３次元多孔質体の中心部から血漿あるいは血清が流出するように構成されていることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルター；
３次元多孔質体に親水化剤が固定されていることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルター；
親水化剤が３次元多孔質体の表面に固定されていることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルター；
親水化剤がポリビニルピロリドンであることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルターに関する。
【００１６】
さらに、本発明は、ヘマトクリットが４０〜５０％の新鮮ウシ血液をフィルターの入口から流入させて０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 の圧力差をフィルター出入口間に与えて血漿あるいは血清を回収するとき、回収される血漿あるいは血清の液量が３次元多孔質体の空孔体積の１０〜５０％であることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルター；
ヘマトクリットが４０〜５０％の新鮮ウシ血液をフィルターの入口から流入させて０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 の圧力差をフィルター出入口間に与えて血漿あるいは血清を分離し、分離開始から３次元多孔質体の空孔体積の１０％に相当する量の血漿あるいは血清を回収するとき、該分離された血漿あるいは血清中の電解質濃度が、遠心分離で得られた血漿あるいは血清中の電解質濃度と比較して９０〜１１０％であることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルター；
ヘマトクリットが４０〜５０％の新鮮ウシ血液をフィルターの入口から流入させて０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 の圧力差をフィルター出入口間に与えて血漿あるいは血清を分離し、分離開始から３次元多孔質体の空孔体積の１０％に相当する量の血漿あるいは血清を回収するとき、該分離された血漿あるいは血清中の蛋白質濃度が、遠心分離で得られた血漿あるいは血清中の蛋白質濃度と比較して９０〜１１０％であることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離フィルターに関する。
【００１７】
また、本発明は、平均孔径が５〜５０μｍの３次元多孔質体が、血液の流路径（Ｄ）に対する血液の流路長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が０．１５〜６となるように、入口と出口を有する容器に装填されてなる血漿あるいは血清分離フィルターを用い、かつ血液の平均処理線速度が１〜３００ｃｍ／分であることを特徴とする血漿あるいは血清分離方法；
フィルター出入口間の圧力差が０．０１〜５ｋｇ／ｃｍ2 であることを特徴とする上記血漿あるいは血清分離方法に関する。
【００１８】
本発明における３次元多孔質体とは、１ｍｍ以上の厚みを有する多孔質体をいう。多孔質体とは、マトリックスおよび孔が共に連続したスポンジ状のものをいう。以下、３次元多孔質体を、単に多孔質体ともいう。
【００１９】
上記で「マトリックスが連続している」とは、多孔質体の全域にわたって、マトリックスが陸続きとなり一体化したものをいう。単にマトリックス同志が接触し絡み合ったものや、マトリックスを部分的に融着したり、接着剤等によりマトリックス同志を数カ所程度接着しているものは、本願発明には含まれない。
但し、マトリックス同志の点接着であっても、実質的にマトリックスが多孔質体全域にわたって一体化されたものや、マトリックス同志を線接着し一体化されたものは、本願発明に含まれる。
つまり、繊維を単に絡めた綿状のものや部分的に繊維素材の融着または接着剤等により点接着した不織布は本願発明に含まれないが、不織布等をさらに加工し、一体化させ、マトリックス同志が連続したものや多孔質体ビーズを互いに熱融着したものは本願発明に含まれる。
【００２０】
上記で「孔が連続している」とは、孔が多孔質体の全域にわたって、互いに連通していることをいう。
つまり、中空糸のようなストロー状のものを複数束ねたものや、束ねた後に接着剤や熱融着により一体化させたものは、それぞれの孔が連通しているのみで、互いに連通していないので、本願発明には含まれない。
【００２１】
このように、メルトブロー法等で得られる極細繊維不織布は、通常厚みが１ｍｍ未満のシート状であり、３次元とはいえない。また、繊維同士の絡み合いで形成された繊維塊（ウエッブ）も、マトリックスが連続していないので本発明の多孔質体とは異なる。また、細孔が連通していないと血液が流れることができず、本発明に適していないことは明らかである。
【００２２】
本発明における多孔質体は特に限定されるものではないが、その材料としては、例えばセルロース、セルロースアセテート、ポリウレタン、ポリアクリロニトリル、ポリビニルアセタール、ポリビニルホルマール、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリフッ化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、ポリトリフルオロクロロビニル、フッ化ビニリデン−テトラフルオロエチレン共重合体、フッ化ビニリデン−ヘキサフルオロプロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン−プロピレン共重合体、テトラフルオロエチレン−エチレン共重合体等が挙げられ、好ましくはセルロース、ポリビニルホルマールである。
これらは、１種でも２種以上を組み合わせても用いることができる。
【００２３】
当該多孔質体は、上記材料を用いて公知の方法（例えば、発泡、相分離等）によって成型、加工等を行うことにより得ることができる。例えば、水溶性のポリビニルアルコールに、酸を触媒として、ホルムアルデヒドを結合させるホルマール化反応において、予め気孔形成剤を加え、気孔形成を行い、不溶性の多孔質基質を形成した後に、気孔形成剤を抽出することにより、多孔質体を得ることができる。さらに、打ち抜き、削りだし等を行い、所望の形状のものを得ることができる。
【００２４】
また、当該多孔質体は、繊維素材と比較して、次のようなメリットがある。
1)所望の形状への成型加工性（フィルターの組立性）がよい。これは、多孔質体は、不織布の場合のように重ねたり解したりする必要がないためである。つまり、繊維の場合、綿状と不織布状があるが、綿状繊維は不定形であり、フィルター容器に綿を詰める作業が必要であり、不織布状繊維はシート形状であり、複数枚のシートを重ねる作業が必要となる。
2)孔径が均一で、連通した細孔を有することができ、目詰まりや溶血の発生を防止できる。これは、多孔質体の場合には、孔が化学反応により形成され、孔径が化学的な反応により決定されるためである。これに対し、繊維素材の場合は、フィルターの孔径は物理的な要因（圧縮）により決定され、圧縮時の力のかけ具合によっては疎密ができやすいため、疎の部分から血球が漏れたり、密の部分では通過抵抗により溶血が起きたりする。
【００２５】
また、当該多孔質体はそのまま用いることも可能だが、血液と多孔質体との親和性をより高めたり、蛋白質の吸着をより防いだり等するために、表面改質を行うこともできる。
当該表面改質は、例えば、上記多孔質体に親水化剤を固定する、特に上記多孔質体表面に親水化剤を固定することにより行うことができる。
【００２６】
親水化剤としては、例えばポリエチレングリコール、アクリル系ポリマー、ポリビニルアルコール、エチレン−ビニルアルコール共重合体、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。多孔質体素材との親和性が優れている点から、好ましくはポリビニルピロリドンである。
【００２７】
上記多孔質体に上記親水化剤を固定する方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いることができ、物理的あるいは化学的に親水化剤を固定することができる。親水化剤を多孔質体表面に固定することにより、多孔質体と血液との親和性が高まるため、血液を血球と血漿とに分離する際、通過抵抗が低下し、分離速度が速められうる。
【００２８】
ここでは、ポリビニルピロリドンを例に挙げて、より具体的に説明する。例えば、多孔質体を、親水化剤であるポリビニルピロリドンの水溶液に浸漬後、取り出して乾燥することにより、多孔質体表面に親水化剤を容易に物理的に固定化できる。
また、このようなポリビニルピロリドンを物理的に表面に固定化した多孔質体を、加熱処理、放射線処理すること等により、容易にポリビニルピロリドンどうしを架橋させることができる。架橋することにより、血液中へのポリビニルピロリドンの溶出をより低く抑えうる。
【００２９】
加熱処理する場合、その方法は特に限定されない。例えば、オートクレーブ処理のように加圧下において加熱する方法、あるいは恒温槽内に放置する方法等が挙げられる。
加熱処理の温度も特に限定されないが、７０℃以上が好ましく、１００℃以上がより好ましい。加熱温度が高いほど架橋の効率が向上する。上限温度は、用いる多孔質体の性質や、ポリビニルピロリドン自体の耐熱性等にもよるが、２００℃以下が好ましく、１５０℃以下がより好ましい。
加熱時間は、架橋を十分に行うためには長い方が好ましいが、用いる多孔質体の性質や、ポリビニルピロリドン自体の変性の点から、２０分間〜２時間が好ましい。
また、加熱による架橋は、多孔質体が親水化剤溶液に浸漬している状態（ＷＥＴ状態）、あるいは浸漬後乾燥した状態（ＤＲＹ状態）のいずれにおいても行うことができ、ポリビニルピロリドンが多孔質体に固定される。未反応のポリビニルピロリドンは、水で洗浄すること等により取り除くことができる。
【００３０】
放射線を用いて親水化剤を固定する方法も特に限定されない。例えば、γ線照射、電子線照射、コロナ放電等が挙げられる。処理できる厚みや、操作性の点から、γ線照射が好ましい。
照射量は、ポリビニルピロリドンが十分に架橋される照射量であれば特に限定されず、放射線照射による多孔質体やポリビニルピロリドン自体の変性を起こさない範囲として、１０〜５０ＫＧｙが好ましい。
また、放射線照射は、ＷＥＴ状態あるいはＤＲＹ状態で行うことができる。未反応のポリビニルピロリドンは、水洗浄等で取り除くことができる。
【００３１】
本発明のフィルターに用いられる多孔質体の平均孔径は、５〜５０μｍであることが必要であり、好ましくは８〜３０μｍ、より好ましくは１０〜２０μｍである。
平均孔径が５０μｍを超える場合には、赤血球の細孔内の通過抵抗（即ち、赤血球の変形および細孔壁との摩擦）が減少し、赤血球と血漿・血清成分との移動速度差が充分生じず、分離が不十分となるので好ましくない。
平均孔径が５μｍ未満の場合には、血液の流路が狭くなりすぎて、血球成分が目詰まりを生じ易く、またフィルターの通過抵抗が大きくなり、溶血が生じることがあるので好ましくない。
【００３２】
なお、本発明でいう平均孔径とは、多孔質体の表面あるいは任意の断面の細孔径の平均である。
平均孔径は、多孔質体を、血液の流れ方向に対して垂直方向に切断し、その断面の電子顕微鏡写真を撮影し、少なくとも１００個の細孔が存在する一定面積内の細孔の直径を測定して、相加平均により求める。
細孔断面の形が円形でない場合は、画像処理等により細孔断面積を求め、それに相当する円の相当径を細孔径とする。この場合、径とは全て直径を意味する。当該平均孔径は、多孔質体の製造条件を変えること等により、調節することができる。
【００３３】
さらに、本発明の多孔質体の細孔径は、血液入口から透過液出口に至る軸方向で一定としてもよいが、血液入口から透過液出口に向かって徐々に細孔径を小さくし、透過液出口付近で血球成分と血漿・血清成分との分離効率を上げるようにすることも可能である。ただし、その場合でも平均孔径は５〜５０μｍの範囲にあることが必要である。
【００３４】
また、本発明においては、血漿・血清分離用多孔質体と容器内壁との空間に、血液中の異物を取り除くプレフィルター（例えば、多孔質体、綿、不織布、メッシュ等）を設置することも可能である。
これらのプレフィルターの平均孔径は、当然、上記血漿・血清分離用多孔質体の平均孔径より大きくなるが、フィルター全体としての平均孔径には、プレフィルターにおける平均孔径は考慮せず、血漿・血清分離用多孔質体部分のみにおける平均孔径を用いることとする。
【００３５】
本発明のフィルターに用いられる多孔質体の空孔率は２０〜９５％であることが好ましく、より好ましくは３０〜９０％である。
空孔率が２０％未満であると、フィルター自体の嵩が大きくなり、また血液の通過抵抗が大きくなり易い傾向がある。空孔率が９５％より大きい場合は、フィルターの強度が低下して、組立性が低下し易い傾向がある。
【００３６】
空孔率とは、多孔質体体積全体に対する多孔質体内の空孔体積の比率（％）を意味する。
空孔率は、（１−ｒm ／ρ）×１００（％）として算出する。なお、ｒm は多孔質体の嵩密度、ρは多孔質体材料の密度である。
【００３７】
また、当該多孔質体の空孔体積は、（多孔質体体積×空孔率）×１／１００として算出することができる。
当該空孔率および空孔体積は、多孔質体の製造条件を変えること等により調節することができる。
【００３８】
本発明において、血漿・血清分離フィルターに装填される多孔質体の血液流路径（Ｄ）に対する血液流路長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）は、０．１５〜６であることが必要であり、好ましくは０．２５〜４、より好ましくは０．５〜２である。
Ｌ／Ｄが０．１５より小さい場合には、血液流路長が短すぎて血液中の各成分の移動距離が短く、血球と血漿・血清の移動距離に差があまり生じず、また流路径が大きいため血液中の各成分の移動速度の横方向にムラを生じるために、血球成分と血漿・血清成分の分離が不十分となる。
Ｌ／Ｄが６より大きい場合には、分離効率は高まるが、移動距離が長くなるために、血液が流れる際の通過抵抗が高まり、赤血球の溶血が生じ易くなる。
【００３９】
本発明において、流路長（Ｌ）とは、血液が多孔質体に供給される多孔質体表面から、容器出口に向かう透過液が多孔質体から流出する多孔質体表面までの最短距離を意味する。例えば、円錐状の多孔質体を用いる場合には、その円錐の高さを流路長（Ｌ）とする。
【００４０】
流路径（Ｄ）は、容器入口を経て血液が多孔質体に供給される多孔質体表面が円形である場合はその直径を用いるが、円以外の場合はその表面積の円相当直径を用いる。
なお、多孔質体の形状によっては、例えば円盤状の多孔質体の外周部から中心に向かって送液する場合や、円錐状の多孔質体の底面部から頂点部に向かって送液する場合等には、場所によって（血液の流路進行に従って）血液流路の断面積の円相当直径は変化するが、この場合にも、本発明における流路径（Ｄ）は、血液入口部の血液と接触する多孔質体表面の面積の円相当直径と定義する。
また、流入血液は、一度多孔質体と容器内壁との空間にたまり、その後加圧することにより、一瞬のうちに一様に多孔質体表面に供給されるものと考える。
【００４１】
流路長（Ｌ）は好ましくは５〜１００ｍｍ、より好ましくは１０〜１００ｍｍである。流路長が５ｍｍより短いと血球と血漿・血清の分離が不十分となり易い傾向がある。流路長が長くなると分離効率が高まり好ましいが、逆に通過抵抗が大きくなり溶血の恐れがある他、フィルターが大きくなるので必要な血液量も多くなる。よって１００ｍｍ以下が好ましい。
流路径（Ｄ）は、流路長の変化により最適値が変わるため一義的には決まらないが、好ましくは２〜１００ｍｍ、より好ましくは５〜１００ｍｍである。
【００４２】
また、本発明では前述のように、赤血球と血漿・血清の移動速度の差により生じる同時点での移動距離の差を利用して赤血球と血漿・血清を分離しているので、流路長が多孔質体の場所によって変わると、血漿・血清が出口に達する場所が多孔質体内で変わってしまい分離効率が低下し易くなる傾向がある。このため血液流路長は多孔質体の全ての部分で同一であることが望ましい。
【００４３】
本発明のフィルターに用いられる容器の材料としては、特に限定されない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ナイロン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエステル、ＡＢＳ（アクリロニトリル・ブタジエン・スチレン）樹脂、アクリル等のプラスチック類等が、加工性、割れにくさ、軽量の点から好ましく挙げられる。
内部の状態を観察する場合には、透明、半透明の材質を選択すればよい。
【００４４】
多孔質体の形状としては、例えば、▲１▼円柱や角柱型で一方の端面（底面）から反対の端面（底面）に血液を流す場合のように、血液の流路進行と血液流路面積が一定であるような形状、▲２▼円盤状の外周部から中心に向かって血液を流す場合、および円錐型で底面から頂点方向に向かって血液を流す場合のように、血液の流路進行に従って血液流路面積が減少するような形状等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４５】
本発明のフィルターを、例えば臨床検査用の血漿・血清分離等に用いる場合には、使用血液量を少なくすることが望ましいので、多孔質体の形状は後者（▲２▼）の方が好ましい。
【００４６】
また、３次元多孔質体が円盤状であり、容器入口が３次元多孔質体の円周部全面にわたって血液を供給しうるように構成されており、且つ容器出口が円盤状の３次元多孔質体の中心部から血漿あるいは血清が流出するように構成されているフィルターは、最も分離効率が高く、特に好ましい。
【００４７】
本発明の血漿あるいは血清分離フィルターにおいては、ヘマトクリットが４０〜５０％の新鮮ウシ血液をフィルターの入口から流入させて０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 の圧力差をフィルター出入口間に与えて血漿あるいは血清を回収するとき、得られる血漿あるいは血清量は、多孔質体の空孔体積の１０〜５０％であることが好ましい。
より好ましくは、得られる血漿あるいは血清量は、多孔質体の空孔体積の１５〜５０％である。
【００４８】
得られる血漿・血清量が多孔質体の空孔体積の１０％未満では、簡便で安全性が高く血漿・血清が得られても、臨床検査用として必要な血漿・血清量を得るためには多量の血液を要することとなる。
【００４９】
また、得られる血漿・血清が多ければ、それだけ処理血液量を少なくすることができて好ましいが、通常血液のヘマトクリットは４０〜５０％であるので、理論上、最大血漿・血清採取量は処理血液量の５０〜６０％である。もちろん、ヘマトクリットの低い血液を用いれば血漿・血清採取量は多く、ヘマトクリットの高い血液を用いれば血漿・血清採取量は少なくなるが、本発明では通常のヘマトクリット値の血液を想定している。
【００５０】
ヘマトクリットは、ヘマトクリット用毛細管を用いて遠心分離して測定する、通常のヘマトクリット測定法により測定する。
【００５１】
フィルターの出入口間の圧力差は、後述するように、好ましくは０．０１〜５ｋｇ／ｃｍ2 の範囲を取りうるが、上記では、条件としてフィルターの出入口間の圧力差を０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 とした場合のことを述べている。
なお、フィルターの出入口間に圧力差を付与する方法、当該圧力差の測定方法は後述する。
【００５２】
また、本発明の血漿あるいは血清分離フィルターにおいては、ヘマトクリットが４０〜５０％の新鮮ウシ血液をフィルターの入口から流入させて０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 の圧力差をフィルター出入口間に与えて血漿あるいは血清を分離し、分離開始から該多孔質体の空孔体積の１０％に相当する量の血漿あるいは血清を回収するとき、該分離された血漿あるいは血清中の電解質濃度が、遠心分離で得られた血漿あるいは血清中の電解質濃度と比較して９０〜１１０％であることが好ましい。
【００５３】
フィルター分離後の電解質濃度が、遠心分離した場合の電解質濃度の９０〜１１０％の範囲内であると、生化学検査の測定精度、生化学診断の信頼性等の点から好ましい。
なお、遠心分離する場合の条件は、１０００Ｇ、１０分間である。
【００５４】
電解質濃度は、各電解質（イオン）のイオン電極で測定する。
【００５５】
さらに、本発明の血漿あるいは血清分離フィルターにおいては、ヘマトクリットが４０〜５０％の新鮮ウシ血液をフィルターの入口から流入させて０．４〜０．６ｋｇ／ｃｍ2 の圧力差をフィルター出入口間に与えて血漿あるいは血清を分離し、分離開始から該多孔質体の空孔体積の１０％に相当する量の血漿あるいは血清を回収するとき、該分離された血漿あるいは血清中の蛋白質濃度が、遠心分離で得られた血漿あるいは血清中の蛋白質濃度と比較して９０〜１１０％であることが好ましい。
【００５６】
フィルター分離後の蛋白質濃度が、遠心分離した場合の蛋白質濃度の９０〜１１０％の範囲内であると、生化学検査の測定精度、生化学診断の信頼性等の点から好ましい。
なお、遠心分離する場合の条件は、１０００Ｇ、１０分間である。
【００５７】
蛋白質濃度において、総蛋白質濃度はビューレット法、アルブミン濃度はＢＣＧ（ブロムクレゾールグリーン）法によって測定する。
【００５８】
なお、本発明のフィルターは複数連結して用いてもよく、例えば、血漿成分と血球の分離性を向上させる場合には直列に連結し、処理液量を増加する場合には並列に連結すればよい。
さらに、本フィルターをサンプリング容器に結合して一体型として用いることもできる。この場合には、自動的に一定量の血液試料を本発明の血漿あるいは血清分離フィルターユニットに流入し、自動的にフィルターを交換する機構を有する自動分析装置等に容易に適用することが可能である。
【００５９】
本発明の血漿あるいは血清分離方法は、上記フィルター（平均孔径が５〜５０μｍの３次元多孔質体を、血液の流路径（Ｄ）に対する血液の流路長（Ｌ）の比（Ｌ／Ｄ）が０．１５〜６となるように、入口と出口を有する容器に装填してなるフィルター）を用い、かつ血液の平均処理線速度が１〜３００ｃｍ／分であることを特徴とする。
【００６０】
即ち、本発明のフィルターを用いた血漿・血清分離方法では、血液の平均処理線速度（線速度）が１〜３００ｃｍ／分であることが必要であり、好ましくは２〜１５０ｃｍ／分、より好ましくは３〜７５ｃｍ／分である。
血液の平均処理線速度が１ｃｍ／分より小さい場合には、多孔質体中を血液が移動する時間が長く、血漿・血清が得られるまでに時間がかかりすぎ、また各成分の移動中の拡散により血漿・血清成分と血球成分の分離が不十分となる。
血液の平均処理線速度が３００ｃｍ／分より大きい場合には、血漿・血清が得られる時間が短縮できるが、通過抵抗が大きくなり、溶血が発生することがある。
【００６１】
なお、血液の平均処理線速度とは、血液が多孔質体内を通過する平均速度をいう。
血液の平均処理線速度は、血液流路長（Ｌ）を、血液が多孔質体に侵入してから透過液が流出するまでの時間で割ることにより算出する。
例えば、円盤状の外周部から中心に向かって送液する場合（図１）には、場所によって線速度が異なるが、このような場合も上記のようにして平均処理線速度を求める。
当該血液の平均処理線速度は、多孔質体の空孔率、空孔体積を変えたり、加える圧力を変えること等により調節することができる。
【００６２】
本発明のフィルターを用いた血漿・血清分離方法は、圧力を負荷して、血液を多孔質体内を通過させ、血球と血漿・血清の移動速度の差を利用して、血漿・血清を分離する方法である。
【００６３】
フィルターの出入口間の圧力差は、フィルターの形状、多孔質体の空孔率、血液の平均処理線速度に依存するため一義的には決まらないが、０．０１〜５ｋｇ／ｃｍ2 が好ましく、０．０５〜３ｋｇ／ｃｍ2 がより好ましく、０．１〜１ｋｇ／ｃｍ2 が特に好ましい。
【００６４】
圧力差が０．０１ｋｇ／ｃｍ2 より小さい場合は、血液が多孔質体を通過するための負荷が小さいため、例えば多孔質体に疎水性が高い材料を使用したときには、血液を多孔質体内に送ることができなかったり、平均処理線速度が低下して血漿・血清が得られるまでに時間がかかりすぎる上、多孔質体内で血漿・血清と血球との移動速度差が生じず、血漿・血清の分離が不十分となり易い傾向がある。
圧力差が５ｋｇ／ｃｍ2 より大きい場合は、血漿・血清が得られる時間を短縮することができるが、血液の平均処理線速度が速すぎて、血漿・血清と血球との透過時間の差が短いため、血漿・血清の分離が不十分となったり、血球成分にダメージを与えて溶血して、血漿・血清が採取できなくなったり、装置やフィルターに損傷が生じ易くなる傾向がある。
【００６５】
なお、フィルターの出入口間に圧力差を付与する方法としては、例えば、フィルター入口側からポンプや加圧空気で血液を押し出す方法、フィルター出口側を減圧にして吸引する方法、あるいは入口加圧と出口減圧を組み合わせる方法等が挙げられるが、特に限定されるものではない。
フィルターの出入口間の圧力差は、ポンプまたは吸引装置のレベルゲージの指示値を用いる。
【００６６】
本発明に適用される血液は、特に限定されるものではなく、血液成分を含むものであれば全て用いることができる。
血液の由来は、ヒト、ウシ、ヤギ、イヌ、ウサギ等、何でもよい。また、血液をそのまま用いても、抗凝固剤〔例えばＡＣＤ液（血液保存溶液）、ヘパリン、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）等〕や赤血球凝集剤（例えばレクチン、抗体等）等の添加剤を加えて用いてもよい。
通常、血液に添加剤を加えずに放置したり、凝固剤を添加した場合には、血液中のフィブリノーゲンがフィブリンに変化して血液の凝固が進行するが、これらの凝固性血液をそのまま用いても、これに遠心分離等の処理を加えたものを用いても、化学的な処理を加えたものを用いてもよい。
【００６７】
血漿は、血液から血球成分のみを除いたものであるが、本発明においては、実質的に血球成分を含まないものとする。
これは、血液を遠心分離して得られた血漿でも、少量の赤血球、白血球、血小板や血球の破片の混入を完全に防ぐことはできないからである。
ここで、実質的に血球成分を含まないものとは、分離前の血液中の血球の９９．９％以上を除去したものを意味する。この程度の血球を除去すれば、得られた血漿の臨床検査データに血球の影響は現れない。
【００６８】
血清は、血漿からフィブリノーゲン等の血液凝固因子を除いたものに相当するが、本発明においては実質的にフィブリノーゲンを含まないものとする。
ここで、実質的にフィブリノーゲンを含まないものとは、セルロースアセテート電気泳動法により検出されないことを意味する。
【００６９】
【作用】
本発明における血球成分と血漿・血清成分の分離機構は、両成分の多孔質体細孔中の移動速度の差を利用している。多孔質体細孔内の移動速度は血漿・血清成分の方が血球成分より速いため、多孔質体に血液を供給し、圧力差を生じさせると、透過液出口側に初めに血漿・血清成分が到達し、その後血球成分が到達する。この時間差を利用することにより血液から血漿・血清を得ることができる。
【００７０】
つまり、本発明においては、多孔質体内の血漿・血清と血球との移動速度の差が大きければ大きいほど、得られる血漿・血清の量は多くなるが、透過液出口側には最終的には血球が透過してくるので、従来の比重差を利用した遠心分離、ふるい分けの原理を利用した膜分離、吸着の原理を利用した白血球分離等とは概念が根本的に異なる。
【００７１】
また、ゲルクロマトグラフィーや電気泳動等が原理的に比較的類似しているが、前者はゲル内の移動可能空間の差を利用しており、分子量の大きいものほど移動可能空間が少ないため早く流出する点で異なり、後者はゲル構造による立体障害の差を利用する点で一致するが、本発明が圧力により分離成分を移動させるのに対して、電気泳動ではクーロン力により分離成分を移動させる点で異なる。
【００７２】
このように、本発明は、遠心分離や膜分離と違って長時間処理や大量処理にはあまり向かないが、臨床検査等、少量の血液を短時間で血漿または血清に分離することが要求される分野においては、最適な血漿または血清の分離手段といえる。
さらに、極細繊維不織布を用いる場合と比較して、シートを重ねたり解したりする必要がないため組立性に優れ、所望の形状への成形・加工性に優れ、さらに均一な細孔を有するため血液のチャンネリングや目詰まりによる性能低下、溶血の発生を防ぐことができる。
【００７３】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに何等限定されるものではない。
【００７４】
実施例１
図１に示すような血漿・血清分離フィルターを作成した〔なお、図１（ｂ）は図１（ａ）のフィルターをＡの方向から見た時の図であり、この図１（ｂ）では部分的に破断して内部を見せており、多孔質体３にはハッチングを施している〕。つまり、入口１として容器の上面端部に直径１．０ｍｍの穴、出口２として底面中央部に直径１．０ｍｍの穴を有し、容器内部の直径５２．０ｍｍ、厚さ２．０ｍｍのアクリル製の円盤状容器４に、多孔質体３として平均孔径１２μｍ、空孔率８６％のポリビニルホルマールスポンジを直径５０．０ｍｍ、厚さ２．０ｍｍとなるように、容器の内周部表面との間に１．０ｍｍの隙間を設けて充填した。充填時の多孔質体の空孔体積は３．４ｍｌであった。容器の血液入口部断面積（円盤状多孔質体の側面積にあたるもの）は２ｍｍ×５０ｍｍ×π＝１００πｍｍ2 で、円相当直径は２０ｍｍとなり、血液流路長さは２５ｍｍ（多孔質体直径５０ｍｍの半分）であるので、Ｌ／Ｄは２５／２０（＝１．２５）である。
【００７５】
この血液に抗凝固剤としてＡＣＤ液を加え、ヘマトクリット４５％のウシ血液を容器の外周部から内側へ、０．５ｋｇ／ｃｍ2 の圧力で送液した。血液は、容器内で多孔質体の外周部から中心に向かって、多孔質体底面に対して水平方向（多孔質体側面に対して垂直方向）に多孔質体内を通過し、約５秒後に出口から透過液が得られた。透過液は約６秒後から血球が混入し始めた。血球の混入のない透過液は加圧後５秒から１秒間採取でき、その総量は０．７ｍｌであった。この時の採取透過液から求めた多孔質体中の平均処理線速度は３０ｃｍ／分であった。
【００７６】
得られた透過液のヘモグロビン濃度は３ｍｇ／ｄｌ以下で、溶血は認められなかった。また、血球分析器で測定した赤血球、白血球、血小板も全て検出限界以下であった。得られた透過液の生化学分析値〔生化学自動分析装置（日立製）により測定；当該装置内では、総蛋白質濃度はビューレット法、アルブミン濃度はＢＣＧ法、電解質濃度は各電解質（イオン）のイオン電極で測定〕を表２に示すが、同一の血液を遠心分離して得られた血漿の分析値と有意差を認めなかった。また、得られた透過液中のフィブリノーゲン濃度をセルロースアセテート電気泳動法により求めたところ、遠心分離で得られた血漿中の濃度の約５０％に減少していたが、完全に除かれてはいなかった。さらに一昼夜放置したところ、フィブリンの析出は認められなかった。
【００７７】
実施例２
実施例１で用いたものと同じフィルターを使用した。この血液に抗凝固剤を加えずに、採血直後のヘマトクリット４７％のヒト血液を、０．５ｋｇ／ｃｍ2 の圧力で送液した。血液は、容器内で外周部から中心に向かって、多孔質体底面に対して水平方向（多孔質体側面に対して垂直方向）に多孔質体内を通過し、約５秒後に出口から透過液が得られた。透過液は約７秒後から血球が混入し始めた。血球の混入のない透過液は加圧後５秒から２秒間採取でき、その総量は１．０ｍｌであった。この時の採取透過液から求めた多孔質体中の平均処理線速度は３０ｃｍ／分であった。
【００７８】
得られた透過液のヘモグロビン濃度は３ｍｇ／ｄｌ以下で、溶血は認められなかった。また、血球分析器で測定した赤血球、白血球、血小板も全て検出限界以下であった。得られた透過液の生化学分析値を表２に示すが、同一の血液を凝固後遠心分離して得られた血清の分析値と有意差を認めなかった。また、得られた透過液中にフィブリノーゲンは検出されず、得られた透過液は血漿ではなく血清であった。なお、同一人からヘパリンを抗凝固剤として加えた血液を遠心分離して得られた血漿中のフィブリノーゲン濃度は２２０ｍｇ／ｄｌであった。
【００７９】
用いた血液以外は実施例１と同様にして実験を行ったにも係わらず、採取できた透過液量に違いが認められたのは、赤血球の大きさがヒトとウシで違うためと考えられる。また、フィブリノーゲンが完全に除去されているのは、抗凝固剤を添加していないため、フィブリノーゲンがフィルターに吸着したためと考えられる。
【００８０】
実施例３
平均孔径１０μｍ、空孔率８３％のセルロースを多孔質体として用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。その結果、血球の混入のない透過液は約１５秒後から４秒間得られ、その量は０．８ｍｌであった。このときの血液の多孔質体中の平均処理線速度は１０ｃｍ／分であった。
得られた透過液のヘモグロビン濃度は３ｍｇ／ｄｌ以下で、溶血は認められなかった。また、血球分析器で測定した赤血球、白血球、血小板も全て検出限界以下であった。得られた透過液の生化学分析値を表２に示すが、同一の血液を遠心分離して得られた血漿の分析値と有意差を認めなかった。また、得られた透過液中のフィブリノーゲン濃度は、遠心分離により得られた血漿の１５％に減少していた。
【００８１】
比較例１
平均孔径２μｍ、空孔率８０％のセルロースを多孔質体として用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
その結果、フィルターは目詰まりを生じ、透過液を得ることができなかった。これは、平均孔径が２μｍであり、細孔径が小さすぎたため、血球成分が細孔に目詰まりを起こしたためと考えられる。
【００８２】
比較例２
平均孔径６０μｍ、空孔率９１％のポリビニルホルマールスポンジを多孔質体として用いた以外は、実施例１と同様にして実験を行った。
その結果、フィルターからの透過液には初期から赤血球が含まれ、血漿・血清の分離はできなかった。これは、平均孔径が６０μｍであり、赤血球と血漿・血清の移動速度に充分な差が生じず分離ができなかったためと考えられる。
【００８３】
比較例３
図２に示すような血漿・血清分離フィルターを作成した〔なお、図２（ｂ）は図２（ａ）のフィルターをＡの方向から見た時の図であり、この図２（ｂ）では部分的に破断して内部を見せており、多孔質体３にはハッチングを施している〕。つまり、容器４に、多孔質体３として有効断面形状φ５０．０ｍｍ、厚さ５ｍｍ、平均孔径１２μｍ、空孔率８６％のポリビニルホルマールスポンジを充填した。このときのＬ／Ｄは５／５０（＝０．１）である。このフィルターを用い、ＡＣＤ液を加えたヘマトクリット４５％のウシ血液を圧力０．５ｋｇ／ｃｍ2 でフィルターを通過させた。
その結果、１０秒後に透過液が得られたが、この透過液には初期から赤血球が含まれ、血漿・血清の分離はできなかった。この原因は、Ｌ／Ｄが０．１であり血液の移動距離が短く、赤血球と血漿・血清の分離が充分に行われなかったためと考えられる。
【００８４】
比較例４
図３に示すような血漿・血清分離フィルターを作成した〔なお、図３（ｂ）は図３（ａ）のフィルターをＡの方向から見た時の図であり、この図３（ｂ）では部分的に破断して内部を見せており、多孔質体３にはハッチングを施している〕。つまり、容器４に、多孔質体３として有効断面形状φ１０．０ｍｍ、厚さ１００．０ｍｍ、平均孔径１２μｍ、空孔率８６％のポリビニルホルマールスポンジを充填した。このときのＬ／Ｄは１００／１０（＝１０）である。このフィルターを用い、ＡＣＤ液を加えたヘマトクリット４５％のウシ血液を圧力０．５ｋｇ／ｃｍ2 でフィルターを通過させた。
その結果、５分後に透過液が得られたが、得られた透過液は溶血しており、ヘモグロビン濃度は５０ｍｇ／ｄｌであった。この原因は、Ｌ／Ｄが１０と大きく、血液の多孔質体内での通過抵抗が増大し、赤血球が破壊されたためと考えられる。
【００８５】
上記実施例、比較例における各物性値の測定方法を以下に示す。
▲１▼平均孔径
多孔質体を、血液の流れ方向に対して垂直方向に切断し、その断面の電子顕微鏡写真を撮影し、少なくとも１００個の細孔が存在する一定面積内の細孔の直径を測定して、相加平均により求めた。なお、細孔断面の形が円形でない場合は、画像処理等により細孔断面積を求め、それに相当する円の相当径を細孔径（直径）とした。
【００８６】
▲２▼空孔率
（１−ｒm ／ρ）×１００（％）として算出した。なお、ｒm は多孔質体の嵩密度、ρは多孔質体材料の密度である。
▲３▼空孔体積
（多孔質体体積×空孔率）×１／１００として算出した。
【００８７】
▲４▼平均処理線速度
血液流路長（Ｌ）を、血液が多孔質体に侵入してから透過液が流出するまでの時間で割って、算出した。
▲５▼圧力差
ポンプまたは吸引装置のレベルゲージの指示値を用いた。
【００８８】
上記実施例、比較例における条件等を表１に示す。また、上記実施例１〜３で得られた透過液の生化学分析値を表２に示す。
【００８９】
【表１】
【表２】
【発明の効果】
本発明の血漿・血清分離フィルターによれば、少量の血液でも、迅速に純度の高い血漿・血清を得ることが可能で、かつ組立性・操作性も簡便で、安全性の高い血漿・血清分離を行うことが可能となる。
即ち、本発明の血漿・血清分離フィルターを用いれば、臨床検査等をはじめとするその他の研究等において、血液成分を含む検液から、迅速、容易、安全に、血球成分を除くことが可能であり、さらに、細胞培養液中の細胞を分離除去することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の血漿・血清分離フィルターの１実施例を示す図である。
【図２】比較例３のフィルターの例を示す図である。
【図３】比較例４のフィルターの例を示す図である。
【符号の説明】
１ 入口
２ 出口
３ 多孔質体
４ 容器[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a filter for separating and recovering plasma or serum components from blood and a method for separating plasma or serum. More specifically, when used in clinical tests, plasma or serum with high purity can be obtained quickly even with a small amount of blood, and the operability is simple, the safety is high, and the plasma is easy to manufacture. Alternatively, the present invention relates to a serum separation filter and a method for separating plasma or serum.
[0002]
[Prior art]
So-called biochemical tests that measure blood components are widely used for diagnosis and follow-up of various diseases, and occupy an important position as clinical tests. The analysis technology has made significant progress in recent years, and the development of various automatic analyzers has made it possible to analyze a large number of specimens with high accuracy and speed.
[0003]
However, in many fields of biochemical tests, the presence of blood cells such as erythrocytes interferes with the test, so that serum or plasma is previously separated from blood and used. Therefore, it is necessary to go through a process of obtaining blood serum after coagulating blood collected from a patient or a subject before the examination. The operation of coagulation and centrifugation is time consuming and not only has become a bottleneck to shortening the time required for clinical examinations, but also requires a large centrifuge so that clinical examinations can be performed except in relatively large hospitals. In many cases, it is requested to an external inspection company, and it takes several days to obtain the inspection result. In addition, since the operation of separating serum from blood still relies on human hands, workers are exposed to blood and are in danger of infection.
[0004]
As a means for solving the above problems, a technique generally called dry chemistry is known. This is because when a small amount of blood is dropped on a small plate consisting of a serum separation layer consisting of an ultrafine fiber filter such as glass fiber and a reaction layer located therebelow, serum is separated in the serum separation layer. The reaction layer reacts and develops color, which is measured with a spectrophotometer.
This dry chemistry is a simple method that does not use a liquid coloring reagent and does not require cumbersome serum collection by centrifugation, but the items that can be measured are compared to general biochemical analysis and immunoassay using liquid reagents. The number of plates is limited, and one plate is used for one inspection item, so a large number of plates must be used to inspect multiple items, and there is little time merit for simplicity. However, due to its high cost, it has not been widely used.
[0005]
As a method for obtaining plasma or serum without using centrifugation, there is a method for separating plasma from blood using a fine tubular filter element with one end closed as disclosed in JP-A-53-72691. Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-11166 proposes a method of separating plasma from blood using a filtration cartridge using a hollow fiber bundle.
However, in the former method, since the protein permeability is poor and blood cells adhere to the filter surface, it takes a very long time to filter the plasma. Conversely, if the filtration pressure is increased to increase the filtration speed, There are problems such as causing red blood cell hemolysis. In addition, in the latter method using a filtration cartridge using a hollow fiber bundle, it is necessary to perform pretreatment by priming as preparation for plasma separation work, that is, work such as wetting the hollow fiber membrane with physiological saline, There is a problem that the obtained plasma is diluted or that the preparation work is more time-consuming than the plasma separation work itself.
[0006]
In addition, since these membrane separation methods are separation methods based on the difference in molecular size between blood cells and plasma / serum, substances with relatively large molecular weight such as proteins in blood cannot pass through the membrane sufficiently. There is a problem that the composition of each protein in the obtained plasma does not accurately reflect the composition of the protein in the original blood. Furthermore, if the pore size of the membrane is made too large, red blood cells are clogged and there is a problem of hemolysis, which has not been put into practical use.
[0007]
Apart from the above, various serum or plasma separation techniques for clinical tests using a fibrous filter have been proposed. Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-208856 discloses a method for separating and recovering serum or plasma components comprising a glass fiber containing a polyacrylic ester derivative and polyethylene glycol, and a lectin-impregnated layer. Japanese Patent Laid-Open No. 5-196620 discloses a serum / plasma separator using the separation filter disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 4-208856.
Although these methods and instruments can collect serum or plasma for clinical tests without using centrifugation, the amount of serum and plasma obtained is as small as about 100 μl, and the time required for separation is about 2 minutes. Although shortened compared to separation, it is not sufficient. In addition, these technologies use glass fiber as the separation material, and electrolytes are eluted from glass fiber or adsorbed on glass fiber, so the concentration of electrolyte, phosphorus, and lipid in the obtained plasma and serum is separated. It has the disadvantage that it is very different from the previous blood. For this reason, these techniques have not been widely spread.
[0008]
Although different from plasma / serum separation applications, for example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-193468 discloses a white blood cell removal filter in which a plurality of ultrafine fiber nonwoven fabrics are stacked, and such a white blood cell removal filter is currently widely used. It is popular. Further, International Patent Applications WO 89/2304, WO 89/2305, and Japanese Patent Laid-Open No. 5-168711 disclose a leukocyte removal filter using a porous body having a three-dimensional network structure having continuous pores. ing.
However, all of these techniques are related to leukocyte removal filters and do not provide any information regarding plasma / serum separation for clinical testing.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
As explained above, there are currently no filters that are excellent in assembly and have sufficient performance as filters for separating plasma and serum components quickly, efficiently, and safely from small amounts of blood for clinical laboratory use. is there.
[0010]
The object of the present invention is to assemble plasma / serum components having the same composition as in blood quickly and conveniently and safely without damaging blood cells in the blood and assembling. It is an object to provide a plasma / serum separation filter and a plasma / serum separation method that are excellent in performance (easily manufactured).
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies to solve the above-described problems, the present inventors have used a three-dimensional porous body having continuous pores and controlled the pore diameter, thereby making the red blood cells in blood and plasma / serum porous. It is possible to make a difference in the moving speed in the body and to adjust the ratio (L / D) of the flow path length (L) and the flow path diameter (D) of the blood, By reducing the unevenness of direction and widening the difference in moving distance between red blood cells and plasma / serum caused by the difference in moving speed, it becomes possible to separate plasma / serum components in blood from blood cells and collect them I found out. Furthermore, by using a three-dimensional porous material, there is no need to stack or unravel a plurality of sheet-like materials, and it is easy to form and process into a desired filter shape. Furthermore, blood channeling and clogging are possible. It has been found that the performance degradation due to and the occurrence of hemolysis can be prevented.
[0012]
In the above, the white blood cells and platelets in the blood have the property of adsorbing to the porous body (this property is known), so they are adsorbed and removed when passing through the filter of the present invention. Next, red blood cells do not have the property of adsorbing to the porous body, but by setting the pore diameter of the porous body, that is, the size of the flow path, a so-called steric hindrance occurs and the inside of the pore is deformed. Move while. On the other hand, plasma / serum components are liquid, have no steric hindrance, and move through pores faster than erythrocytes. In this way, a difference occurs in the moving speed of red blood cells and plasma / serum. Furthermore, by increasing the L / D, the lateral movement of the blood can be less uneven and the difference in the movement distance between the red blood cells and the plasma / serum can be increased. As for the serum, the plasma / serum reaches first at the outlet of the porous body, and only the plasma / serum can be collected.
[0013]
The porous body used as a leukocyte removal filter is a large amount of blood or erythrocyte concentrate (usually about 100 to 500 ml), whereas the present invention aims to collect a small amount of plasma / serum in clinical tests and the like. ) Is designed to reduce clogging and passage resistance, and the L / D is designed to be small (ie, the thickness is small and the diameter is large), and the principle of leukocyte removal by adsorption is used. In this respect, it is basically different from that of the present invention.
[0014]
That is, according to the present invention, the three-dimensional porous body having an average pore diameter of 5 to 50 μm has a ratio (L / D) of the blood flow path length (L) to the blood flow path diameter (D) of 0.15 to 6. Thus, the present invention relates to a plasma or serum separation filter which is loaded in a container having an inlet and an outlet.
[0015]
The present invention also provides the plasma or serum separation filter described above, wherein the three-dimensional porous body has a porosity of 20 to 95%;
The three-dimensional porous body is disk-shaped, the container inlet is configured to supply blood over the entire circumference of the three-dimensional porous body, and the container outlet is a disk-shaped three-dimensional porous body. The plasma or serum separation filter, wherein the plasma or serum is configured to flow out from the center;
The plasma or serum separation filter, wherein a hydrophilizing agent is fixed to the three-dimensional porous body;
The plasma or serum separation filter, wherein the hydrophilizing agent is fixed on the surface of the three-dimensional porous body;
The plasma or serum separation filter is characterized in that the hydrophilizing agent is polyvinylpyrrolidone.
[0016]
Furthermore, the present invention provides 0.4 to 0.6 kg / cm of fresh bovine blood having a hematocrit of 40 to 50% from the inlet of the filter. 2 When the plasma or serum is collected by applying a pressure difference between the filter inlet and outlet, the collected plasma or serum volume is 10 to 50% of the pore volume of the three-dimensional porous body. Plasma or serum separation filter;
0.4 to 0.6 kg / cm of fresh bovine blood with a hematocrit of 40 to 50% flowing from the inlet of the filter 2 When the plasma or serum is separated by applying a pressure difference between the inlet and outlet of the filter and the amount of plasma or serum corresponding to 10% of the pore volume of the three-dimensional porous body is recovered from the start of the separation, the separated plasma is collected. Alternatively, the plasma or serum separation filter described above, wherein the serum electrolyte concentration is 90 to 110% compared to the plasma or serum electrolyte concentration obtained by centrifugation;
0.4 to 0.6 kg / cm of fresh bovine blood with a hematocrit of 40 to 50% flowing from the inlet of the filter 2 When the plasma or serum is separated by applying a pressure difference between the inlet and outlet of the filter and the amount of plasma or serum corresponding to 10% of the pore volume of the three-dimensional porous body is recovered from the start of the separation, the separated plasma is collected. Alternatively, the present invention relates to the plasma or serum separation filter described above, wherein the protein concentration in serum is 90 to 110% compared to the protein concentration in plasma or serum obtained by centrifugation.
[0017]
In the present invention, the three-dimensional porous material having an average pore diameter of 5 to 50 μm has a ratio (L / D) of the blood flow path length (L) to the blood flow path diameter (D) of 0.15 to 6. A plasma or serum separation method using a plasma or serum separation filter loaded in a container having an inlet and an outlet, and having an average blood treatment linear velocity of 1 to 300 cm / min;
Pressure difference between filter inlet and outlet is 0.01-5kg / cm 2 The present invention relates to the plasma or serum separation method.
[0018]
The three-dimensional porous body in the present invention refers to a porous body having a thickness of 1 mm or more. The porous body refers to a sponge-like material in which a matrix and pores are both continuous. Hereinafter, the three-dimensional porous body is also simply referred to as a porous body.
[0019]
In the above, “the matrix is continuous” means that the matrix is continuous and integrated over the entire area of the porous body. The present invention does not include the case where the matrix members are simply in contact with each other and the matrix members are partially fused or the matrix members are bonded to each other at several places by an adhesive or the like.
However, even in the case of point bonding between the matrices, those in which the matrix is substantially integrated over the entire porous body, and those in which the matrices are integrated by line bonding are included in the present invention.
In other words, cotton that is simply entangled with fibers or non-woven fabric that is partially spot-bonded by fusing of fiber material or adhesive, etc. is not included in the present invention. Those in which comrades are continuous or those in which porous beads are heat-sealed to each other are included in the present invention.
[0020]
In the above, “the pores are continuous” means that the pores communicate with each other over the entire area of the porous body.
In other words, a bundle of a plurality of straw-shaped items such as hollow fibers, and a bundle of bundles that are integrated by adhesive or heat fusion after bundling are communicated with each other only by their respective holes. Therefore, it is not included in the present invention.
[0021]
Thus, the ultrafine fiber nonwoven fabric obtained by the melt-blowing method or the like is usually a sheet having a thickness of less than 1 mm and cannot be said to be three-dimensional. Also, a fiber lump (web) formed by entanglement of fibers is different from the porous body of the present invention because the matrix is not continuous. In addition, it is clear that blood cannot flow unless the pores are in communication, which is not suitable for the present invention.
[0022]
The porous body in the present invention is not particularly limited, and examples of the material thereof include cellulose, cellulose acetate, polyurethane, polyacrylonitrile, polyvinyl acetal, polyvinyl formal, polyester, polyamide, polystyrene, polysulfone, polyvinyl fluoride, Polyvinylidene fluoride, polytrifluorochlorovinyl, vinylidene fluoride-tetrafluoroethylene copolymer, vinylidene fluoride-hexafluoropropylene copolymer, tetrafluoroethylene-propylene copolymer, tetrafluoroethylene-ethylene copolymer, etc. Preferably, cellulose and polyvinyl formal are used.
These can be used singly or in combination of two or more.
[0023]
The porous body can be obtained by molding, processing, or the like using the above materials by a known method (for example, foaming, phase separation, etc.). For example, in a formalization reaction in which formaldehyde is bonded to water-soluble polyvinyl alcohol using acid as a catalyst, a pore-forming agent is added in advance to form pores, and after forming an insoluble porous substrate, the pore-forming agent is extracted. By doing so, a porous body can be obtained. Furthermore, a desired shape can be obtained by performing punching, shaving, and the like.
[0024]
Further, the porous body has the following merits as compared with the fiber material.
1) Good moldability (filter assembly) to a desired shape. This is because the porous body does not need to be stacked or unwound as in the case of a nonwoven fabric. In other words, in the case of fibers, there are cotton-like and non-woven fabrics, but the cotton-like fibers are indeterminate, and it is necessary to stuff the filter container with cotton, and the non-woven fabric is in the form of a sheet. Overlapping work is required.
2) The pore diameter is uniform and can have continuous pores, thereby preventing clogging and hemolysis. This is because in the case of a porous body, pores are formed by a chemical reaction, and the pore diameter is determined by a chemical reaction. On the other hand, in the case of fiber materials, the pore size of the filter is determined by physical factors (compression), and depending on the force applied at the time of compression, it is easy to be sparse / dense. In this part, hemolysis occurs due to passage resistance.
[0025]
In addition, the porous body can be used as it is, but surface modification can also be performed in order to further increase the affinity between blood and the porous body, or to prevent protein adsorption.
The surface modification can be performed, for example, by fixing a hydrophilizing agent to the porous body, and particularly fixing the hydrophilizing agent to the surface of the porous body.
[0026]
Examples of the hydrophilizing agent include polyethylene glycol, acrylic polymer, polyvinyl alcohol, ethylene-vinyl alcohol copolymer, polyvinyl pyrrolidone and the like. Polyvinyl pyrrolidone is preferable from the viewpoint of excellent affinity with the porous material.
[0027]
The method for fixing the hydrophilizing agent to the porous body is not particularly limited, and a known method can be used, and the hydrophilizing agent can be fixed physically or chemically. By immobilizing the hydrophilizing agent on the surface of the porous body, the affinity between the porous body and blood is increased. Therefore, when blood is separated into blood cells and plasma, the passage resistance is lowered and the separation speed can be increased. .
[0028]
Here, polyvinyl pyrrolidone will be described as an example in more detail. For example, by immersing the porous body in an aqueous solution of polyvinyl pyrrolidone that is a hydrophilizing agent, and then taking it out and drying it, the hydrophilizing agent can be easily physically immobilized on the surface of the porous body.
Moreover, the polyvinyl pyrrolidone can be easily cross-linked by subjecting the porous body in which such polyvinyl pyrrolidone is physically fixed to the surface to heat treatment or radiation treatment. By crosslinking, elution of polyvinylpyrrolidone into blood can be suppressed to a lower level.
[0029]
In the case of heat treatment, the method is not particularly limited. For example, the method of heating under pressure like an autoclave process, the method of leaving in a thermostat, etc. are mentioned.
The temperature of the heat treatment is not particularly limited, but is preferably 70 ° C. or higher, and more preferably 100 ° C. or higher. The higher the heating temperature, the more efficient the crosslinking. The upper limit temperature is preferably 200 ° C. or lower, more preferably 150 ° C. or lower, although it depends on the properties of the porous body used and the heat resistance of polyvinylpyrrolidone itself.
The heating time is preferably longer for sufficient crosslinking, but is preferably 20 minutes to 2 hours in view of the properties of the porous material used and the modification of polyvinylpyrrolidone itself.
Moreover, the crosslinking by heating can be carried out in either a state where the porous body is immersed in the hydrophilizing agent solution (WET state) or a state where the porous body is dried after being immersed (DRY state), and polyvinylpyrrolidone is porous. Fixed to the body. Unreacted polyvinyl pyrrolidone can be removed by washing with water or the like.
[0030]
A method for fixing the hydrophilizing agent using radiation is not particularly limited. Examples include γ-ray irradiation, electron beam irradiation, corona discharge, and the like. From the viewpoint of the thickness that can be treated and operability, γ-ray irradiation is preferable.
The irradiation amount is not particularly limited as long as the polyvinyl pyrrolidone is sufficiently crosslinked, and is preferably 10 to 50 KGy as a range in which the porous body and the polyvinyl pyrrolidone itself are not modified by irradiation.
Irradiation can be performed in a WET state or a DRY state. Unreacted polyvinyl pyrrolidone can be removed by washing with water or the like.
[0031]
The average pore size of the porous body used in the filter of the present invention needs to be 5 to 50 μm, preferably 8 to 30 μm, more preferably 10 to 20 μm.
When the average pore diameter exceeds 50 μm, the passage resistance in the erythrocyte pores (that is, deformation of the erythrocytes and friction with the pore walls) decreases, and a sufficient difference in moving speed between erythrocytes and plasma / serum components occurs. This is not preferable because separation is insufficient.
When the average pore diameter is less than 5 μm, the blood flow path becomes too narrow, blood cell components are likely to be clogged, the passage resistance of the filter increases, and hemolysis may occur, which is not preferable.
[0032]
In addition, the average pore diameter as used in the field of this invention is an average of the pore diameter of the surface of a porous body, or arbitrary cross sections.
The average pore diameter is obtained by cutting the porous body in a direction perpendicular to the blood flow direction, taking an electron micrograph of the cross section, and determining the diameter of the pores within a certain area where at least 100 pores exist. Measure and obtain by arithmetic mean.
If the shape of the pore cross section is not circular, the pore cross sectional area is obtained by image processing or the like, and the equivalent diameter of the corresponding circle is taken as the pore diameter. In this case, the diameter means all diameters. The average pore diameter can be adjusted by changing the production conditions of the porous body.
[0033]
Further, the pore diameter of the porous body of the present invention may be constant in the axial direction from the blood inlet to the permeate outlet, but the pore diameter is gradually reduced from the blood inlet toward the permeate outlet, and the permeate outlet It is also possible to increase the separation efficiency between blood cell components and plasma / serum components in the vicinity. However, even in that case, the average pore diameter needs to be in the range of 5 to 50 μm.
[0034]
In the present invention, a prefilter (for example, a porous body, cotton, nonwoven fabric, mesh, etc.) that removes foreign substances in blood may be installed in the space between the porous body for plasma / serum separation and the inner wall of the container. Is possible.
The average pore size of these prefilters is naturally larger than the average pore size of the porous body for plasma / serum separation, but the average pore size of the entire filter is not considered, and the average pore size in the prefilter is not considered. The average pore size only in the porous part for separation is used.
[0035]
The porosity of the porous body used in the filter of the present invention is preferably 20 to 95%, more preferably 30 to 90%.
If the porosity is less than 20%, the bulk of the filter itself tends to increase, and the blood passage resistance tends to increase. When the porosity is larger than 95%, the strength of the filter is lowered and the assemblability tends to be lowered.
[0036]
The porosity means the ratio (%) of the pore volume in the porous body to the entire porous body volume.
The porosity is (1-r m / Ρ) × 100 (%). R m Is the bulk density of the porous body, and ρ is the density of the porous body material.
[0037]
Further, the pore volume of the porous body can be calculated as (porous body volume × porosity) × 1/100.
The porosity and pore volume can be adjusted by changing the production conditions of the porous body.
[0038]
In the present invention, the ratio (L / D) of the blood flow path length (L) to the blood flow path diameter (D) of the porous body loaded in the plasma / serum separation filter needs to be 0.15-6. Preferably, it is 0.25-4, More preferably, it is 0.5-2.
When L / D is smaller than 0.15, the blood flow path length is too short, the movement distance of each component in the blood is short, and there is not much difference in the movement distance of blood cells and plasma / serum. Therefore, the blood cell component and the plasma / serum component are not sufficiently separated from each other because unevenness occurs in the lateral direction of the moving speed of each component in the blood.
When L / D is larger than 6, the separation efficiency is increased, but since the moving distance is increased, the passage resistance when blood flows is increased, and erythrocyte hemolysis is likely to occur.
[0039]
In the present invention, the flow path length (L) is the shortest distance from the surface of the porous body where blood is supplied to the porous body to the surface of the porous body where the permeate flowing toward the container outlet flows out of the porous body. means. For example, when a conical porous body is used, the height of the cone is defined as a flow path length (L).
[0040]
As the flow path diameter (D), the diameter is used when the surface of the porous body through which blood is supplied to the porous body through the container inlet is circular, but when the surface of the porous body is other than a circle, the equivalent diameter of the surface area is used.
Depending on the shape of the porous body, for example, when liquid is fed from the outer periphery of the disk-shaped porous body toward the center, or when liquid is fed from the bottom surface of the conical porous body toward the apex portion For example, the equivalent circle diameter of the cross-sectional area of the blood flow path varies depending on the location (according to the flow of the blood flow path). In this case as well, the flow path diameter (D) in the present invention It is defined as the equivalent circle diameter of the area of the surface of the porous body that comes into contact.
In addition, it is considered that the inflowing blood once accumulates in the space between the porous body and the inner wall of the container and is then uniformly supplied to the surface of the porous body in an instant by applying pressure.
[0041]
The flow path length (L) is preferably 5 to 100 mm, more preferably 10 to 100 mm. When the flow path length is shorter than 5 mm, separation of blood cells from plasma / serum tends to be insufficient. Longer flow path lengths are preferable because the separation efficiency is increased, but conversely, the passage resistance increases and there is a risk of hemolysis, and the required filter increases in volume because the filter becomes larger. Therefore, 100 mm or less is preferable.
The channel diameter (D) is not uniquely determined because the optimum value varies depending on the channel length, but is preferably 2 to 100 mm, more preferably 5 to 100 mm.
[0042]
In the present invention, as described above, since the red blood cells and plasma / serum are separated using the difference in moving distance at the same point caused by the difference in moving speed between red blood cells and plasma / serum, the flow path length is If the location of the porous body changes, the location where the plasma / serum reaches the outlet changes in the porous body, and the separation efficiency tends to decrease. For this reason, it is desirable that the blood flow path length is the same in all portions of the porous body.
[0043]
The material of the container used for the filter of the present invention is not particularly limited. For example, polyethylene, polypropylene, nylon, polycarbonate, polystyrene, polyester, ABS (acrylonitrile butadiene styrene) resin, plastics such as acrylic, and the like are preferable from the viewpoint of workability, resistance to cracking, and light weight.
When observing the internal state, a transparent or translucent material may be selected.
[0044]
As the shape of the porous body, for example, as in the case of (1) a cylinder or a prismatic type, when blood flows from one end face (bottom face) to the opposite end face (bottom face), the blood flow path progress and the blood flow passage area (2) Blood flow path progression, as in the case of flowing blood from the disc-shaped outer periphery to the center, and in the case of flowing blood from the bottom to the apex in a conical shape However, the shape of the blood flow passage area and the like are not limited thereto.
[0045]
When the filter of the present invention is used for, for example, plasma / serum separation for clinical tests, it is desirable to reduce the amount of blood used, and therefore the shape of the porous body is preferably the latter ((2)).
[0046]
Further, the three-dimensional porous body has a disk shape, the container inlet is configured to supply blood over the entire circumference of the three-dimensional porous body, and the container outlet has a disk shape. A filter configured to allow plasma or serum to flow out from the center of the body has the highest separation efficiency and is particularly preferable.
[0047]
In the plasma or serum separation filter of the present invention, fresh bovine blood having a hematocrit of 40 to 50% is introduced from the inlet of the filter to 0.4 to 0.6 kg / cm. 2 When the plasma or serum is recovered by applying the pressure difference between the inlet and outlet of the filter, the amount of plasma or serum obtained is preferably 10 to 50% of the pore volume of the porous body.
More preferably, the amount of plasma or serum obtained is 15 to 50% of the pore volume of the porous body.
[0048]
In order to obtain plasma / serum volume necessary for clinical testing, even if plasma / serum volume is less than 10% of the pore volume of the porous material, plasma / serum can be obtained easily and safely. A large amount of blood is required.
[0049]
Further, if the amount of plasma / serum obtained is large, it is preferable that the amount of blood to be processed can be reduced accordingly. However, since the hematocrit of blood is usually 40 to 50%, theoretically, the maximum amount of plasma / serum collected is the processed blood. 50-60% of the amount. Of course, if blood with a low hematocrit is used, the amount of plasma / serum collected is large, and if blood with a high hematocrit is used, the amount of plasma / serum collected is small.
[0050]
The hematocrit is measured by a normal hematocrit measurement method, which is measured by centrifugation using a hematocrit capillary tube.
[0051]
The pressure difference between the inlet and outlet of the filter is preferably 0.01 to 5 kg / cm as described later. 2 In the above, the pressure difference between the filter inlet and outlet is 0.4 to 0.6 kg / cm as a condition. 2 And if that is the case.
A method for applying a pressure difference between the filter inlet and outlet and a method for measuring the pressure difference will be described later.
[0052]
Further, in the plasma or serum separation filter of the present invention, fresh bovine blood having a hematocrit of 40 to 50% is introduced from the inlet of the filter to 0.4 to 0.6 kg / cm. 2 When the plasma or serum is separated by applying a pressure difference between the inlet and outlet of the filter and the amount of plasma or serum corresponding to 10% of the pore volume of the porous body is recovered from the start of the separation, The electrolyte concentration in serum is preferably 90 to 110% as compared to the electrolyte concentration in plasma or serum obtained by centrifugation.
[0053]
The electrolyte concentration after filter separation is preferably in the range of 90 to 110% of the electrolyte concentration when centrifuged, from the viewpoints of measurement accuracy of biochemical examination, reliability of biochemical diagnosis, and the like.
The conditions for centrifugation are 1000 G and 10 minutes.
[0054]
The electrolyte concentration is measured with an ion electrode of each electrolyte (ion).
[0055]
Furthermore, in the plasma or serum separation filter of the present invention, fresh bovine blood having a hematocrit of 40 to 50% is introduced from the inlet of the filter to 0.4 to 0.6 kg / cm. 2 When the plasma or serum is separated by applying a pressure difference between the inlet and outlet of the filter and the amount of plasma or serum corresponding to 10% of the pore volume of the porous body is recovered from the start of the separation, The protein concentration in serum is preferably 90 to 110% as compared to the protein concentration in plasma or serum obtained by centrifugation.
[0056]
The protein concentration after filter separation is preferably in the range of 90 to 110% of the protein concentration in the case of centrifugation, from the viewpoints of measurement accuracy of biochemical tests, reliability of biochemical diagnosis, and the like.
The conditions for centrifugation are 1000 G and 10 minutes.
[0057]
As for the protein concentration, the total protein concentration is measured by the Burette method, and the albumin concentration is measured by the BCG (Bromcresol Green) method.
[0058]
A plurality of the filters of the present invention may be used in combination. For example, in order to improve the separation of plasma components and blood cells, they may be connected in series, and in order to increase the amount of processing liquid, they may be connected in parallel. Good.
Furthermore, this filter can be combined with a sampling container and used as an integral type. In this case, it can be easily applied to an automatic analyzer having a mechanism for automatically flowing a certain amount of blood sample into the plasma or serum separation filter unit of the present invention and automatically replacing the filter. is there.
[0059]
The method for separating plasma or serum of the present invention comprises the above-described filter (the ratio (L / D) of the blood flow path length (L) to the blood flow path diameter (D) of the three-dimensional porous body having an average pore diameter of 5 to 50 μm). Is 0.15 to 6 so that the average treatment linear velocity of blood is 1 to 300 cm / min.
[0060]
That is, in the plasma / serum separation method using the filter of the present invention, the average blood treatment linear velocity (linear velocity) needs to be 1 to 300 cm / min, preferably 2 to 150 cm / min, more preferably Is 3 to 75 cm / min.
When the average treatment linear velocity of blood is less than 1 cm / min, it takes a long time for blood to move through the porous body, it takes too much time to obtain plasma and serum, and diffusion during the movement of each component As a result, the separation of plasma / serum components and blood cell components becomes insufficient.
When the average treatment linear velocity of blood is higher than 300 cm / min, the time for obtaining plasma / serum can be shortened, but passage resistance increases and hemolysis may occur.
[0061]
In addition, the average processing linear velocity of blood means the average velocity at which blood passes through the porous body.
The average blood treatment linear velocity is calculated by dividing the blood flow path length (L) by the time from when blood enters the porous body until the permeate flows out.
For example, when liquid is fed from the disk-shaped outer periphery toward the center (FIG. 1), the linear velocity varies depending on the location. In such a case as well, the average processing linear velocity is obtained as described above.
The average treatment linear velocity of the blood can be adjusted by changing the porosity and pore volume of the porous body, changing the applied pressure, or the like.
[0062]
The plasma / serum separation method using the filter of the present invention separates plasma / serum by applying pressure, allowing blood to pass through the porous body, and utilizing the difference in the moving speed between blood cells and plasma / serum. Is the method.
[0063]
The pressure difference between the inlet and outlet of the filter is not uniquely determined because it depends on the shape of the filter, the porosity of the porous body, and the average treatment linear velocity of blood, but is 0.01 to 5 kg / cm. 2 Is preferred, 0.05 to 3 kg / cm 2 Is more preferable, 0.1-1 kg / cm 2 Is particularly preferred.
[0064]
Pressure difference is 0.01kg / cm 2 If it is smaller, the load for blood to pass through the porous body is small. For example, when a highly hydrophobic material is used for the porous body, blood cannot be sent into the porous body, It takes too much time for the linear velocity to decrease to obtain plasma / serum, and there is no difference in the movement speed between plasma / serum and blood cells in the porous body, which tends to result in insufficient separation of plasma / serum. is there.
Pressure difference is 5kg / cm 2 If it is larger, the time to obtain plasma / serum can be shortened, but the average processing linear velocity of blood is too fast, and the difference in the permeation time between plasma / serum and blood cells is short. There is a tendency that separation is insufficient, blood cell components are damaged and hemolysis occurs, plasma / serum cannot be collected, or devices and filters are easily damaged.
[0065]
In addition, as a method of giving a pressure difference between the inlet and outlet of the filter, for example, a method of extruding blood with a pump or pressurized air from the filter inlet side, a method of suctioning with the filter outlet side being decompressed, or inlet pressure and outlet Although the method etc. which combine pressure reduction are mentioned, it is not specifically limited.
For the pressure difference between the inlet and outlet of the filter, the indicated value of the level gauge of the pump or suction device is used.
[0066]
The blood applied to the present invention is not particularly limited, and any blood containing a blood component can be used.
The origin of blood may be anything such as human, cow, goat, dog, rabbit and the like. In addition, even if blood is used as it is, an additive such as an anticoagulant [for example, ACD solution (blood preservation solution), heparin, EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid), etc.] or hemagglutinating agent (for example, lectin, antibody, etc.) It may be used.
Usually, when blood is left without adding an additive or a coagulant is added, fibrinogen in the blood changes to fibrin and blood coagulation proceeds, but these coagulable blood are used as they are. Alternatively, a material obtained by adding a treatment such as centrifugation may be used, or a material obtained by adding a chemical treatment may be used.
[0067]
Plasma is obtained by removing only blood cell components from blood, but in the present invention, it is substantially free of blood cell components.
This is because even plasma obtained by centrifuging blood cannot completely prevent a small amount of red blood cells, white blood cells, platelets and blood cell fragments from being mixed.
Here, what does not contain a blood cell component substantially means what removed 99.9% or more of the blood cell in the blood before isolation | separation. If this level of blood cells is removed, the effect of blood cells will not appear in the clinical laboratory data of the plasma obtained.
[0068]
The serum corresponds to a plasma obtained by removing blood coagulation factors such as fibrinogen, but in the present invention, it is substantially free of fibrinogen.
Here, what does not contain fibrinogen substantially means that it is not detected by cellulose acetate electrophoresis.
[0069]
[Action]
The separation mechanism of the blood cell component and the plasma / serum component in the present invention utilizes the difference in the moving speed of the two components in the porous body pores. Since the movement speed in the pores of the porous body is faster in the plasma / serum component than in the blood cell component, when blood is supplied to the porous body and a pressure difference is generated, the plasma / serum component is first introduced to the permeate outlet side. Arrives, and then the blood cell component arrives. By using this time difference, plasma and serum can be obtained from blood.
[0070]
In other words, in the present invention, the larger the difference in the moving speed between plasma / serum and blood cells in the porous body, the greater the amount of plasma / serum obtained, but finally the permeate outlet side is Since blood cells permeate, the concept is fundamentally different from conventional centrifugation using the specific gravity difference, membrane separation using the principle of sieving, leukocyte separation using the principle of adsorption, and the like.
[0071]
Gel chromatography, electrophoresis, etc. are relatively similar in principle, but the former uses the difference in the movable space in the gel, and the larger the molecular weight, the smaller the movable space, and the faster the outflow. The latter is the same in that it uses the difference in steric hindrance due to the gel structure, but in the present invention, the separation component is moved by pressure, whereas in the electrophoresis, the separation component is moved by Coulomb force. It is different.
[0072]
Thus, unlike the centrifugal separation and membrane separation, the present invention is not very suitable for long-time processing or large-scale processing, but it is required to separate a small amount of blood into plasma or serum in a short time, such as clinical examination. In other fields, it can be said to be an optimal means for separating plasma or serum.
Furthermore, compared to the case of using an ultra-fine fiber nonwoven fabric, it is not necessary to overlap or unravel the sheets, so it is excellent in assembling, excellent in formability / workability to a desired shape, and has uniform pores. Performance degradation and hemolysis can be prevented due to blood channeling and clogging.
[0073]
【Example】
EXAMPLES Hereinafter, although an Example is given and this invention is demonstrated concretely, this invention is not limited to these at all.
[0074]
Example 1
A plasma / serum separation filter as shown in FIG. 1 was prepared. [FIG. 1 (b) is a view of the filter of FIG. 1 (a) as viewed from the direction A. In FIG. 1 (b) It is partially broken to show the inside, and the
[0075]
An ACD solution is added to this blood as an anticoagulant, and hematocrit 45% bovine blood is introduced from the outer periphery of the container to the inside by 0.5 kg / cm. 2 The liquid was fed at a pressure of. In the container, blood passes through the porous body in the horizontal direction (perpendicular to the side surface of the porous body) from the outer periphery of the porous body toward the center, and after about 5 seconds. A permeate was obtained from the outlet. The permeate started to mix blood cells after about 6 seconds. The permeate without blood cell contamination could be collected for 5 to 1 second after pressurization, and the total amount was 0.7 ml. The average treatment linear velocity in the porous body determined from the collected permeate at this time was 30 cm / min.
[0076]
The resulting permeate had a hemoglobin concentration of 3 mg / dl or less, and no hemolysis was observed. In addition, red blood cells, white blood cells, and platelets measured with a hemocytometer were all below the detection limit. Biochemical analysis value of the obtained permeate [measured by an automatic biochemical analyzer (manufactured by Hitachi); in this apparatus, the total protein concentration is the Burette method, the albumin concentration is the BCG method, and the electrolyte concentration is each electrolyte (ion) Table 2 shows the results measured with an ion electrode of the same, but no significant difference was found from the analysis value of plasma obtained by centrifuging the same blood. In addition, when the fibrinogen concentration in the obtained permeate was determined by cellulose acetate electrophoresis, it was reduced to about 50% of the plasma concentration obtained by centrifugation, but it was not completely removed. It was. Furthermore, when it was left for a whole day and night, no fibrin deposition was observed.
[0077]
Example 2
The same filter as used in Example 1 was used. Without adding an anticoagulant to this blood, hematocrit 47% human blood immediately after blood collection was 0.5 kg / cm 2 The liquid was fed at a pressure of. In the container, blood passes through the porous body in the horizontal direction (perpendicular to the side surface of the porous body) from the outer peripheral portion toward the center, and after about 5 seconds, the permeate from the outlet. was gotten. The permeate started to mix blood cells after about 7 seconds. The permeate without blood cell contamination could be collected for 5 to 2 seconds after pressurization, and the total volume was 1.0 ml. The average treatment linear velocity in the porous body determined from the collected permeate at this time was 30 cm / min.
[0078]
The resulting permeate had a hemoglobin concentration of 3 mg / dl or less, and no hemolysis was observed. In addition, red blood cells, white blood cells, and platelets measured with a hemocytometer were all below the detection limit. The biochemical analysis values of the obtained permeate are shown in Table 2. No significant difference was found from the serum analysis values obtained by centrifuging the same blood after clotting. Moreover, fibrinogen was not detected in the obtained permeate, and the obtained permeate was not plasma but serum. In addition, the fibrinogen concentration in the plasma obtained by centrifuging blood added with heparin as an anticoagulant from the same person was 220 mg / dl.
[0079]
Although the experiment was performed in the same manner as in Example 1 except for the blood used, the difference in the amount of permeate collected was considered to be due to the difference in the size of red blood cells between humans and cattle. . Moreover, it is thought that fibrinogen was completely removed because no anticoagulant was added and fibrinogen was adsorbed on the filter.
[0080]
Example 3
The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that cellulose having an average pore diameter of 10 μm and a porosity of 83% was used as the porous body. As a result, a permeate without blood cell contamination was obtained for about 4 seconds after about 15 seconds, and the amount was 0.8 ml. The average treatment linear velocity in the porous body of blood at this time was 10 cm / min.
The resulting permeate had a hemoglobin concentration of 3 mg / dl or less, and no hemolysis was observed. In addition, red blood cells, white blood cells, and platelets measured with a hemocytometer were all below the detection limit. The biochemical analysis value of the obtained permeate is shown in Table 2, but no significant difference was found from the analysis value of plasma obtained by centrifuging the same blood. The fibrinogen concentration in the obtained permeate was reduced to 15% of the plasma obtained by centrifugation.
[0081]
Comparative Example 1
The experiment was performed in the same manner as in Example 1 except that cellulose having an average pore diameter of 2 μm and a porosity of 80% was used as the porous body.
As a result, the filter was clogged and a permeate could not be obtained. This is probably because the average pore diameter was 2 μm and the pore diameter was too small, so that the blood cell component clogged the pores.
[0082]
Comparative Example 2
An experiment was conducted in the same manner as in Example 1 except that polyvinyl formal sponge having an average pore diameter of 60 μm and a porosity of 91% was used as the porous body.
As a result, the permeate from the filter contained red blood cells from the beginning, and plasma / serum could not be separated. This is presumably because the average pore size was 60 μm, and there was no sufficient difference in the moving speed between red blood cells and plasma / serum, and separation was not possible.
[0083]
Comparative Example 3
A plasma / serum separation filter as shown in FIG. 2 was prepared. [FIG. 2 (b) is a view of the filter of FIG. 2 (a) as viewed from the direction A. In FIG. 2 (b) It is partially broken to show the inside, and the
As a result, a permeate was obtained after 10 seconds, but this permeate contained red blood cells from the beginning, and plasma / serum could not be separated. This is thought to be because L / D is 0.1, the blood travel distance is short, and red blood cells and plasma / serum are not sufficiently separated.
[0084]
Comparative Example 4
A plasma / serum separation filter as shown in FIG. 3 was prepared. [FIG. 3 (b) is a view of the filter of FIG. 3 (a) as viewed from the direction A. In FIG. 3 (b) It is partially broken to show the inside, and the
As a result, a permeate was obtained after 5 minutes, but the obtained permeate was hemolyzed and the hemoglobin concentration was 50 mg / dl. This is considered to be because L / D was as large as 10, the passage resistance of blood in the porous body increased, and the red blood cells were destroyed.
[0085]
The measuring method of each physical property value in the above Examples and Comparative Examples is shown below.
(1) Average pore diameter
The porous body is cut in a direction perpendicular to the direction of blood flow, an electron micrograph of the cross section is taken, and the diameter of the pores in a certain area where at least 100 pores are present is measured. Obtained by arithmetic mean. When the pore cross-sectional shape is not circular, the pore cross-sectional area was obtained by image processing or the like, and the equivalent diameter of the corresponding circle was taken as the pore diameter (diameter).
[0086]
(2) Porosity
(1-r m / Ρ) × 100 (%). R m Is the bulk density of the porous body, and ρ is the density of the porous body material.
(3) Hole volume
It was calculated as (porous body volume x porosity) x 1/100.
[0087]
(4) Average processing linear velocity
The blood flow path length (L) was calculated by dividing the time from when blood entered the porous body until the permeate flowed out.
(5) Pressure difference
The indicated value of the level gauge of the pump or suction device was used.
[0088]
Table 1 shows the conditions and the like in the examples and comparative examples. Moreover, Table 2 shows the biochemical analysis values of the permeates obtained in Examples 1 to 3 above.
[0089]
[Table 1]
[Table 2]
【The invention's effect】
According to the plasma / serum separation filter of the present invention, high-purity plasma / serum can be obtained quickly even with a small amount of blood, and the assembly / operability is simple and the plasma / serum is highly safe. Can be performed.
That is, by using the plasma / serum separation filter of the present invention, blood cell components can be quickly, easily and safely removed from a test solution containing blood components in other studies including clinical tests. Furthermore, it is possible to separate and remove cells in the cell culture medium.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing one embodiment of a plasma / serum separation filter of the present invention.
2 is a diagram illustrating an example of a filter of Comparative Example 3. FIG.
3 is a diagram illustrating an example of a filter of Comparative Example 4. FIG.
[Explanation of symbols]
1 entrance
2 Exit
3 Porous material
4 containers
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