JP3612551B2 - Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 - Google Patents
Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3612551B2 JP3612551B2 JP30534497A JP30534497A JP3612551B2 JP 3612551 B2 JP3612551 B2 JP 3612551B2 JP 30534497 A JP30534497 A JP 30534497A JP 30534497 A JP30534497 A JP 30534497A JP 3612551 B2 JP3612551 B2 JP 3612551B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- protease
- hepatitis
- rna molecule
- base sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Images
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害するＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型肝炎のメジャーな病原体（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， １９９４）で、その構造は１本のおよそ９５００ヌクレオチドのＲＮＡゲノムを持ったウイルスである（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９ａ； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１ｂ）。約３０００アミノ酸のｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎが、このゲノムから（図２Ａ）ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨの順序で翻訳される（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ａ； Ｐｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９１ａ； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。コアタンパク質（Ｃ）、外被タンパク質（Ｅ１、Ｅ２）そしてそれ以外のＮＳタンパク質がある。このｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎは、宿主とウィルスのプロテアーゼの協同作業によって、少くとも１０個のウィルスタンパク質に分断される。
【０００３】
今までの研究から、小包体の中に局在する宿主のシグナルペプチダーゼが構造上の部位（Ｃ／Ｅ１、Ｅ１／Ｅ２、Ｅ２／ｐ７とｐ７／ＮＳ２）でｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎを切断することがわかっている（Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， １９９４； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ｂ）。一方、ＮＳ３タンパク質は、ＮＳ部分の４箇所（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａと５Ａ／５Ｂ）で切断を行う（Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ； Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ； Ｔｏｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。ＮＳ２／３ サイトでの切断は、ＮＳ２部位を取り囲むＨＣＶにコードされたもう一つのメタロプロテアーゼによって行われる（ Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ａ； Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ）。
【０００４】
実際には、ＮＳ３のＮターミナルの１８０アミノ酸残基が、プロテアーゼドメインで、トリプシン様セリンプロテアーゼファミリーに共通のシーケンスを含む。すなわち、ＮＳ３のヒスチジン１０８３、アスパラギン酸１１０７、セリン１１６５は、セリンプロテアーゼファミリーの中でキモトリプシン系に属しているようなＮＳ３プロテアーゼの触媒作用の ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄを構成する。ごく最近明らかにされたこのプロテアーゼドメインの立体構造からも（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ １９９７）、トリプシン様セリンプロテアーゼに共通の構造が確認された。
【０００５】
一方、ＮＳ３ のＣ末には全く別のヘリカーゼのドメインがある（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。このタンパク質の作用については全くわかっていない。またＮＳ４Ａペプチドは特にＮＳ４Ｂ／５Ａサイトでの切断効率を高めるＮＳ３プロテアーゼのｃｏｆａｃｔｏｒかｅｆｆｅｃｔｏｒであることが示されたが、どのようにして切断効率を上げるのかは、今のところ不明である。
このようにＮＳ３領域にコードされているセリンプロテアーゼ（以下、「ＮＳ３プロテアーゼ」と記す） はＨＣＶの増殖に必須の酵素でかつＨＣＶの亜種の中で非常に保存されており、ＮＳ３の抗体が、ＨＣＶ診断の中で使われている。これらの特性から、ＮＳ３プロテアーゼは、現在、治療薬や診断薬の開発の中で一番の標的とされているが、特にＮＳ３プロテアーゼの阻害剤として今までに効果の有る物は見つかっていない。
【０００６】
我々は大腸菌から高活性のＮＳ３プロテアーゼ領域（以下、「△ＮＳ３」または「△ＮＳ３タンパク質」と記す、図２Ｂ）の簡単で高収率な精製系をすでに報告している（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら。 １９９７）。発現プラスミドｐＨｉｓＢ△ＮＳ３は、Ｎ末に６ヶのＨｉｓ−ｔａｇを付加した、１９２アミノ酸（アミノ酸残基１０２７−１２１８）のＮＳ３タンパク質をコードし、６つのＨｉｓ−ｔａｇを利用することで、ワンステップのクロマトグラフィーで精製されるようになっている。精製した△ＮＳ３は、今までに大腸菌で発現した他のＮＳ３プロテアーゼと比較すると、最も高い活性を示した。このことは ＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎの１０２７−１２１８がプロテアーゼ領域であることを示している。更に我々は、生体内の状況を反映するＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸シーケンス２２０３−２５０６において、△ＮＳ３の能力をテストした結果、合成ペプチド基質５Ａ／Ｂを用いた時と同じく、△ＮＳ３はＮＳ５Ａ／Ｂ結合を切断することができた（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら。 １９９７）。このように精製した△ＮＳ３プロテアーゼは小さい分子サイズで、ＮＳ３プロテアーゼの完全な触媒作用の機能を表わし、精製の平易さと高い収量を考えると、プロテアーゼ阻害剤の開発ならびに構造機能相関を解明するのに理想的な標的タンパク質と考える。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＳ３プロテアーゼを阻害する活性の高い物質を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インビトロ選択法を用いて、△ＮＳ３タンパク質に特異的に結合する高い親和性を持つＲＮＡアプタマーを創製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、下記の塩基配列（Ｉ）を含むＲＮＡ分子を提供する。
（配列中、ＸはＡまたはＵである）
上記の塩基配列（Ｉ）はループ構造を形成するとよい。また、ループ構造を形成する塩基配列（Ｉ）に隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するとよい。
【０００９】
ここで、「ループ構造」とは、一本鎖の核酸によるループ状の構造をいい、「ステム構造」とは、塩基対により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。このようなループ構造を形成する塩基配列（Ｉ）に隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するＲＮＡ分子としては、下記の塩基配列（ＩＩ）、塩基配列（ＩＩＩ）または塩基配列（ＩＶ）を含むものを挙げることができる。
【００１０】
上記の塩基配列（ＩＩ）、塩基配列（ＩＩＩ）または塩基配列（ＩＶ）を含むＲＮＡ分子は、さらに、下記の塩基配列（Ｖ）を５’末端側に、下記の塩基配列（ＶＩ）の５’末端から少なくとも１３個の連続する塩基の配列を３’末端側に有しているとよい。
【００１１】
また、本発明は、上記のＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬として用いることができる。この医薬組成物を用いて、Ｃ型肝炎を診断したり、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができる。
さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子を用いてＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法を提供する。かかる方法においては、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞に上記のＲＮＡ分子を導入するとよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
我々は、△ＮＳ３タンパク質に特異的に結合する高い親和性を持つＲＮＡアプタマーを創製するためにインビトロ選択法（図１）を使った。図１に示すように、ランダムな配列を持つＲＮＡ分子のプールから特定のタンパク質に結合する分子（ＲＮＡアプタマー）を選択、増幅するサイクルを繰り返すことで、非常に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが得られた。最初はごく僅かしかないそのような分子もＰＣＲ法で増幅され（条件により変異導入も可能）、結合の弱い分子はサイクルを繰り返すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみが残るのである。
このようにして得られたＲＮＡアプタマーとΔＮＳ３ との結合活性および結合定数は、以下のようにして測定することができる。
【００１３】
各サイクルのＲＮＡならびにクローン化後のＲＮＡを３２Ｐ標識する。ＲＮＡ／ΔＮＳ３／ｔＲＮＡ＝１／１／１０（０．１ μＭ／０．１ μＭ／１ μＭ）の条件で混ぜた後、ニトロセルロース膜でろ過する。結合活性はΔＮＳ３と混ぜた ＲＮＡ量に対して、膜上に残った複合体を形成した ＲＮＡ量の割合で表わす。結合定数は３２Ｐ標識した適当な濃度の（例えば、０．３μＭ）ＲＮＡの存在下、ΔＮＳ３の濃度を適当な範囲で（例えば、０．１５μＭ−１．５μＭ）変化させて、結合活性を測定し、最大結合活性の１／２の活性を示すΔＮＳ３の濃度で表す。
【００１４】
また、ＲＮＡアプタマーのΔＮＳ３ プロテアーゼに対する阻害活性は、基本的に垣内らにより報告された方法に従って測定することができる。すなわち、ΔＮＳ３ プロテアーゼを、ＲＮＡアプタマー又はｔＲＮＡの存在下にプレインキュベートし、これを基質（例えば、化学合成したＮＳ５Ａ／５Ｂ ｊｕｎｃｔｉｏｎペプチド）に添加して反応を行い、反応混合液中の基質分解産物の生成量を測定する。
【００１５】
ＨＣＶを含む細胞に本発明のＲＮＡを導入することにより、該細胞中のＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。例えば、本発明のＲＮＡをリポソームに封入し、これを生体に投与して、ＨＣＶを含む細胞内に取り込ませることにより、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。このような方法については、”Ｌｉｐｉｄｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７） Ｒ． Ｊ． Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌ． Ｈｕａｎｇ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １４， １７３−２０６．に記載されている。また、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡをウイルスなどのベクターに組み込んで、ＨＣＶを含む細胞内に導入し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のＲＮＡを産生させることにより、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することもできる。このような方法については、”Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ”（１９９７） Ａ． Ｅ． Ｓｍｉｔｈ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９， ８０７−８３８． に記載されている。これらの方法の詳細およびこれらの方法に用いられる材料は、遺伝子治療の分野で知られており、それらを本発明においても用いることができる。
【００１６】
ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することにより、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
また、本発明のＲＮＡを用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のＲＮＡを抗体の代わりに利用することができる。本発明のＲＮＡを蛍光などで標識しておき、ＨＣＶに感染している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース膜で濾過する。ＨＣＶが細胞内に存在すれば、膜上にトラップされ、検出できる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。
〔実施例１〕
ＲＮＡ アプタマーの創製
１−１ タンパク質、核酸
ここで使用するΔＮＳ３タンパク質は、すでに我々が報告した方法により大腸菌ＨＢ１０１より精製した（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら、１９９７）。
インビトロ選択法に用いた Ｎ３０のＲＮＡプールは、５’−ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ−［Ｎ３０］−ＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ−３’（図３Ａの配列、配列番号７）を持つ。配列番号７に示したＲＮＡ配列に対応する鋳型ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成した後、当量のプライマー２
５’ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ３’（配列番号８）を加えＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡとした。
更にプライマー１
５’ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ３’（配列番号９）を加え、ＰＣＲにより２本鎖を増幅する。これを鋳型とし試験管内転写反応により、Ｎ３０ ＲＮＡプールを作った。
【００１８】
１−２ インビトロ選択法
約１０１５分子の配列を持つ Ｎ３０ ＲＮＡプール（１ ｎ ｍｏｌ）とΔＮＳ３タンパク質（０．２５ ｎ ｍｏｌ）を ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．７）， ３０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， １０ｍＭ ＤＴＴ（結合バッファー）中、室温で１時間保温した。この混液をポップトップホルダーに固定したニトロセルロース膜でろ過し、上記バッファーで洗浄した。フィルター上に残ったΔＮＳ３に結合したＲＮＡは ２００μｌの溶離液（０．４Ｍ酢酸ソーダ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７Ｍ尿素 （ＰＨ５．５））につけ９０℃、５分間加温し、膜及びΔＮＳ３から遊離させ、エタノール沈殿により回収した。回収したＲＮＡからＡＭＶ逆転写酵素により ｃＤＮＡを合成し、さらに ＰＣＲにより増幅した。これを鋳型に試験管内転写反応により再度 ＲＮＡプールとし、次のインビトロ選択のサイクルに用いた。
【００１９】
このサイクルを １１回繰り返した。各ＲＮＡプールの結合活性を測定した後、サイクル９後の ｃＤＮＡをＴＡクローニングベクターに挿入し、クローン化した。４５個のクローンを選び、各クローンからアルカリ法でプラスミドを回収し、ＤＮＡシーケンスを決めた。
各選択サイクルで使用したＲＮＡとタンパク質の量比ならびにプールの結合活性を表１に示す。
【００２０】
【表１】
４５個のクローンをシーケンスした結果、主に３つのシーケンスファミリー、Ｇ９−Ｉ（２１個）、Ｇ９−ＩＩ（５個）、Ｇ９−ＩＩＩ（４個）があった（図３Ｂ）。それらはいずれも、５’−ＧＡＸＵＧＧＧＡＣ−３’（Ｘ＝Ａ ｏｒ Ｕ）（配列番号１）のコンセンサス配列を持ち、しかも二次構造をみると、コンセンサス配列はループ構造を形成していることがわかった（図４に太字で示した配列）。また、残りのＮ３０由来の配列はそれ自身であるいはプライマー部分（図４にイタリック体で示した配列）とともにステム構造を形成し、全体にステムに富んだ二次構造をとることが推測された。図４の矢印は、ΔＮＳ３との結合活性を有するアプタマーの３’末端の境界を指している。また、図４の−は塩基対の形成を示し、●はワブル塩基対の形成を示す。このコンセンサス配列を持つアプタマーはシーケンスを調べた全クローンのうち、８０％を占めていた。
【００２１】
〔実施例２〕
ＮＳ３ プロテアーゼに対するアプタマーの性質
２−１ アプタマーの結合活性ならびに結合定数の測定
各サイクルのＲＮＡならびにクローン化後のＲＮＡを３２Ｐ標識した。ＲＮＡ／ΔＮＳ３／ｔＲＮＡ＝１／１／１０（０．１ μＭ／０．１ μＭ／１ μＭ）の条件で混ぜ、以下はインビトロ選択法での操作と同様に、ニトロセルロース膜でろ過した。結合活性はΔＮＳ３と混ぜた ＲＮＡ量に対して、膜上に残った複合体を形成した ＲＮＡ量の割合で表わす。
結合定数は３２Ｐ標識したＲＮＡ（０．３μＭ）の存在下、ΔＮＳ３を０．１５μＭ−１．５μＭまで変化させ、結合活性を測定した。
Ｇ９−Ｉ、Ｇ９−ＩＩ、Ｇ９−ＩＩＩの３種類のアプタマーの△ＮＳ３タンパク質に対する結合活性は２０％前後であった（表２）。
【００２２】
【表２】
表２中、ΔＮＳ３−Ｇ９＊とは、インビトロ選択におけるサイクル９後のＲＮＡプールある。
また結合定数はいずれも６００ ｎＭであった（図５）。これらの結果はコンセンサス配列が△ＮＳ３タンパク質との結合に強く関与していることを示している。
【００２３】
２−２ ＲＮＡ アプタマーの構造解析
ＲＮＡアプタマーの３’側の必要領域を明らかにするため、５’末端を標識したＲＮＡアプタマーを ５０ｍＭ 炭酸ナトリウム（ＰＨ ９．２）バッファー中、２．５μｇのキャリアー ｔＲＮＡ存在下、９２℃、４．５分加温し、アルカリによる部分分解反応を行った。この反応液をΔＮＳ３と混ぜ、ニトロセルロース膜でろ過し、膜上の複合体から結合したＲＮＡを回収し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。マーカーとして、ΔＮＳ３を加えないＲＮＡのアルカリ部分分解物ならびにＲＮａｓｅ Ｔ１、Ｕ２、Ａによる限定分解物を同時に泳動した。なお、ΔＮＳ３を添加しない場合は、上記の方法でアルカリ部分分解後、そのまま変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
３’必要領域の分析結果、いずれも３’末端から１１Ｎｔｓまで取り除いても△ＮＳ３タンパク質に対する結合活性は失われないことがわかった（図６）。図６において、−は△ＮＳ３タンパク質の不存在を、＋は△ＮＳ３タンパク質の存在を示し、Ａ、Ｔ１およびＵ２は、それぞれ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、Ｕ２、Ａを示す。
【００２４】
２−３ Δ ＮＳ３ プロテアーゼ阻害活性の測定
基本的に垣内らにより報告された方法に従った（Ｋａｋｉｕｃｈｉら、１９９５）。ダンシル標識した ＮＳ５Ａ／５Ｂ境界領域の ２０アミノ酸 Ｄｎｓ − ＧＥＡＧＤ ＤＩＶＰＣ／ＳＭＳＹＴ ＷＴＧＡＬ（／がΔＮＳ３による切断部位）（配列番号１０）（８６μＭ）にプレインキュベートしたΔＮＳ３（０．７５μＭ）とＲＮＡアプタマー（３．６μＭ）の混液を加え、２５℃、１時間反応させた。反応混液をＨＰＬＣで分離し、蛍光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ： ３１０ ｎｍ、５１０ ｎｍ： ｅｍｉｓｓｉｏｎ：）測定により、合成基質から産物の生成量を測定した。その結果いずれのアプタマーも９０％以上の阻害が観察された（図７）。
【００２５】
ＮＳ３タンパク質がＨＣＶの増殖に不可欠なことから、セリンプロテアーゼの一般的阻害剤がいくつか （例えば、トシルリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）など） 、プロテアーゼ活性の阻害剤としてテストされた （Ｌｉｎ ら、１９９２） 。その結果、これらの阻害剤は、ｍＭ濃度で必要であったが、我々のアプタマーは、μＭ以下の濃度で９０％以上の阻害が観察されることから、活性の高い阻害剤であることがわかった。
【００２６】
引用文献
Ｃｈｏｏ， Ｑ．−Ｌ．， Ｋｕｏ， Ｇ．， Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．Ｊ．， Ｏｖｅｒｂｙ， Ｌ．Ｒ．， Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ． （１９８９ａ） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， ３５９−３６２
Ｃｈｏｏ， Ｑ．−Ｌ．， Ｒｉｃｈｍａｎ， Ｋ．， Ｈａｎ， Ｊ．Ｈ．， ｂｅｒｇｅｒ， Ｋ．， Ｌｅｅ， Ｃ．， Ｄｏｎｇ， Ｃ．， Ｇａｌｌｅｇｏｓ， Ｃ．， Ｃｏｉｔ， Ｄ．， Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｅｌｂｙ， Ａ．， Ｂａｒｒ， Ｐ．， Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．Ｊ．， Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄ．Ｗ．， Ｋｕｏ， Ｇ． ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ． （１９９１ｂ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ２４５１−２４５５
Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， Ｊ．Ａ． （１９９４） Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７， ５０５−５３２
Ｇｒａｋｏｕｉ， Ａ．， Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ， Ｃ．， Ｌｉｎ， Ｃ．， Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３ａ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， １３８５−１３９５
Ｇｒａｋｏｕｉ， Ａ．， ＭｃＣｏｕｒｔ， Ｄ．Ｗ．， Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ， Ｃ．， Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ２８３２−２８４３
Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｋａｔｏ， Ｎ．， Ｏｏｔｓｕｙａｍａ， Ｙ．， Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９１ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ５５４７−５５５１
Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｔ．， Ａｋａｇｉ， Ｓ．， Ｍｏｒｉ， Ｓ．， Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｋｔｏ， Ｎ．， Ｔａｎａｋａ， Ｔ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９３ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ４６６５−４６７５
Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ．， Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．， Ｈａｎ， Ｊ．， Ｋｕｏ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈｏｏ， Ｑ．−Ｌ． （１９９１） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １４， ３８１−３８８
Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｈｉｇｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｄａ， Ｙ．， Ｔａｎｊｉ， Ｙ．， Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１０， １０５９−１０６５
Ｋｉｍ， Ｄ．Ｗ．， Ｇｗａｃｋ， Ｙ．， Ｈａｎ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｃｈｏｅ， Ｊ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１５， １６０−１６６
Ｋｉｍ， Ｊ．Ｌ．， Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ， Ｋ．Ａ．， Ｌｉｎ， Ｃ．， Ｆｏｘ， Ｔ．， Ｄｗｙｅｒ， Ｍ．Ｄ．， Ｌａｎｄｒｏ， Ｊ．Ａ．， Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｐ．， ｍａｒｋｌａｎｄ， Ｗ．， Ｌｅｐｒｅ， Ｃ．Ａ．， Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ， Ｅ．Ｔ．， Ｈａｒｂｅｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ．， Ｍｕｒｃｋｏ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｒｏｎ， Ｐ．Ｒ． ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８７， ３４３−３５５．
Ｌｉｎ， Ｃ．， Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ， Ｂ．Ｄ．， Ｐｒａｇａｉ， Ｂ．， ＭｃＣｏｕｒｔ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８， ５０６３−５０７３
Ｌｏｖｅ， Ｒ．Ａ．， Ｐａｒｇｅ， Ｈ．Ｅ．， Ｗｉｃｋｅｒｓｈａｍ， Ｊ．Ａ．， Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ， Ｚ．， Ｈａｂｕｋａ， Ｎ．， Ｍｏｏｍａｗ， Ｅ．Ｗ．， Ａｄａｃｈｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｈｏｓｔｏｍｓｋａ， Ｚ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８７， ３３１−３４．
Ｍａｎａｂｅ， Ｓ．， Ｆｕｋｅ， Ｉ．， Ｔａｎｉｓｈｉｔａ， Ｏ．， Ｋａｊｉ， Ｃ．， Ｇｏｍｉ， Ｙ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｍｏｒｉ， Ｃ．， Ｔａｋａｍｉｚａｗａ， Ａ．， Ｙａｓｈｉｄａ， Ｉ． ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９８， ６３６−６４４
Ｍａｔｓｕｕｒａ， Ｙ． ａｎｄ Ｍｉｙａｍｕａｒ， Ｔ． （１９９３） Ｓｅｍ． Ｖｉｒｏｌ． ４， ２９７−３０４
Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．Ｈ． ａｎｄ Ｐｕｒｃｅｌｌ， Ｒ．Ｈ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ２０５７−２０６１
Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｔａｎｊｉ， Ｙ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９４ａ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８， ２７３１−２７３４
Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ａｓａｂｅ， Ｓ．−Ｉ．， Ｈｉｒｏｔａ， Ｍ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８， ６２１５−６２２２
Ｐｉｚｚｉ， Ｅ．， Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ， Ａ．， Ｔｏｍｅｉ， Ｌ．， Ｌａｍｏｎｉｃａ， Ｎ．， Ｆａｉｌｌａ， Ｃ．， Ｓａｒｄａｎａ， Ｍ．， Ｗｏｏｄ， Ｔ． ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ８８８−８９２
Ｔｏｍｅｉ， Ｌ．， Ｆａｉｌｌａ， Ｃ．， Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ， Ｅ．， ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ． ａｎｄ ＬａＭｏｎｉｃａ， Ｎ． （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ４０１７−４０２６
Ｖｉｓｈｉｎｕｖａｒｄｈａｎ， Ｄ．， Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｕｒｖｉｌ， Ｐ． Ｔ．， Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ．， Ｋｕｍａｒ， Ｐ． Ｋ． Ｒ． ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ｓ． （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０２， ２０９−２１２．
Ｌｉｎ， Ｃ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ７６２２−７６２６
【００２７】
【発明の効果】
本発明のＲＮＡアプタマーにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。従って、本発明のＲＮＡアプタマーを医薬に利用することができる。
【００２８】
【配列表】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＮＡアプタマー創製の概念図が示されている。
【図２】ＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎの構造の概念図（Ａ）（矢印は ＮＳ３プロテアーゼによる切断箇所を示す。）およびＮＳ３ プロテアーゼドメイン（ΔＮＳ３）の模式図（Ｂ）が示されている。
【図３】Ｎ３０のＲＮＡプールのシーケンス（Ａ）および単離したアプタマーのシーケンス（Ｂ）が示されている。
【図４】アプタマーの二次構造が示されている。太字はコンセンサス配列、イタリックはプライマー結合配列、矢印はΔＮＳ３との結合活性を有するＲＮＡアプタマーの３’末端の境界を示す。
【図５】結合定数を求める図である。
【図６】アプタマーの３’境界領域の分析結果を示す。
【図７】アプタマーによるΔＮＳ３プロテアーゼの阻害活性を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害するＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型肝炎のメジャーな病原体（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， １９９４）で、その構造は１本のおよそ９５００ヌクレオチドのＲＮＡゲノムを持ったウイルスである（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９ａ； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１ｂ）。約３０００アミノ酸のｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎが、このゲノムから（図２Ａ）ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨの順序で翻訳される（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ａ； Ｐｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９１ａ； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。コアタンパク質（Ｃ）、外被タンパク質（Ｅ１、Ｅ２）そしてそれ以外のＮＳタンパク質がある。このｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎは、宿主とウィルスのプロテアーゼの協同作業によって、少くとも１０個のウィルスタンパク質に分断される。
【０００３】
今までの研究から、小包体の中に局在する宿主のシグナルペプチダーゼが構造上の部位（Ｃ／Ｅ１、Ｅ１／Ｅ２、Ｅ２／ｐ７とｐ７／ＮＳ２）でｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎを切断することがわかっている（Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， １９９４； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ｂ）。一方、ＮＳ３タンパク質は、ＮＳ部分の４箇所（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａと５Ａ／５Ｂ）で切断を行う（Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ； Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ； Ｔｏｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。ＮＳ２／３ サイトでの切断は、ＮＳ２部位を取り囲むＨＣＶにコードされたもう一つのメタロプロテアーゼによって行われる（ Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ａ； Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ）。
【０００４】
実際には、ＮＳ３のＮターミナルの１８０アミノ酸残基が、プロテアーゼドメインで、トリプシン様セリンプロテアーゼファミリーに共通のシーケンスを含む。すなわち、ＮＳ３のヒスチジン１０８３、アスパラギン酸１１０７、セリン１１６５は、セリンプロテアーゼファミリーの中でキモトリプシン系に属しているようなＮＳ３プロテアーゼの触媒作用の ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄを構成する。ごく最近明らかにされたこのプロテアーゼドメインの立体構造からも（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ １９９７）、トリプシン様セリンプロテアーゼに共通の構造が確認された。
【０００５】
一方、ＮＳ３ のＣ末には全く別のヘリカーゼのドメインがある（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。このタンパク質の作用については全くわかっていない。またＮＳ４Ａペプチドは特にＮＳ４Ｂ／５Ａサイトでの切断効率を高めるＮＳ３プロテアーゼのｃｏｆａｃｔｏｒかｅｆｆｅｃｔｏｒであることが示されたが、どのようにして切断効率を上げるのかは、今のところ不明である。
このようにＮＳ３領域にコードされているセリンプロテアーゼ（以下、「ＮＳ３プロテアーゼ」と記す） はＨＣＶの増殖に必須の酵素でかつＨＣＶの亜種の中で非常に保存されており、ＮＳ３の抗体が、ＨＣＶ診断の中で使われている。これらの特性から、ＮＳ３プロテアーゼは、現在、治療薬や診断薬の開発の中で一番の標的とされているが、特にＮＳ３プロテアーゼの阻害剤として今までに効果の有る物は見つかっていない。
【０００６】
我々は大腸菌から高活性のＮＳ３プロテアーゼ領域（以下、「△ＮＳ３」または「△ＮＳ３タンパク質」と記す、図２Ｂ）の簡単で高収率な精製系をすでに報告している（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら。 １９９７）。発現プラスミドｐＨｉｓＢ△ＮＳ３は、Ｎ末に６ヶのＨｉｓ−ｔａｇを付加した、１９２アミノ酸（アミノ酸残基１０２７−１２１８）のＮＳ３タンパク質をコードし、６つのＨｉｓ−ｔａｇを利用することで、ワンステップのクロマトグラフィーで精製されるようになっている。精製した△ＮＳ３は、今までに大腸菌で発現した他のＮＳ３プロテアーゼと比較すると、最も高い活性を示した。このことは ＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎの１０２７−１２１８がプロテアーゼ領域であることを示している。更に我々は、生体内の状況を反映するＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸シーケンス２２０３−２５０６において、△ＮＳ３の能力をテストした結果、合成ペプチド基質５Ａ／Ｂを用いた時と同じく、△ＮＳ３はＮＳ５Ａ／Ｂ結合を切断することができた（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら。 １９９７）。このように精製した△ＮＳ３プロテアーゼは小さい分子サイズで、ＮＳ３プロテアーゼの完全な触媒作用の機能を表わし、精製の平易さと高い収量を考えると、プロテアーゼ阻害剤の開発ならびに構造機能相関を解明するのに理想的な標的タンパク質と考える。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＳ３プロテアーゼを阻害する活性の高い物質を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インビトロ選択法を用いて、△ＮＳ３タンパク質に特異的に結合する高い親和性を持つＲＮＡアプタマーを創製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、下記の塩基配列（Ｉ）を含むＲＮＡ分子を提供する。
上記の塩基配列（Ｉ）はループ構造を形成するとよい。また、ループ構造を形成する塩基配列（Ｉ）に隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するとよい。
【０００９】
ここで、「ループ構造」とは、一本鎖の核酸によるループ状の構造をいい、「ステム構造」とは、塩基対により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。このようなループ構造を形成する塩基配列（Ｉ）に隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するＲＮＡ分子としては、下記の塩基配列（ＩＩ）、塩基配列（ＩＩＩ）または塩基配列（ＩＶ）を含むものを挙げることができる。
上記の塩基配列（ＩＩ）、塩基配列（ＩＩＩ）または塩基配列（ＩＶ）を含むＲＮＡ分子は、さらに、下記の塩基配列（Ｖ）を５’末端側に、下記の塩基配列（ＶＩ）の５’末端から少なくとも１３個の連続する塩基の配列を３’末端側に有しているとよい。
また、本発明は、上記のＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬として用いることができる。この医薬組成物を用いて、Ｃ型肝炎を診断したり、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができる。
さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子を用いてＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法を提供する。かかる方法においては、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞に上記のＲＮＡ分子を導入するとよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
我々は、△ＮＳ３タンパク質に特異的に結合する高い親和性を持つＲＮＡアプタマーを創製するためにインビトロ選択法（図１）を使った。図１に示すように、ランダムな配列を持つＲＮＡ分子のプールから特定のタンパク質に結合する分子（ＲＮＡアプタマー）を選択、増幅するサイクルを繰り返すことで、非常に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが得られた。最初はごく僅かしかないそのような分子もＰＣＲ法で増幅され（条件により変異導入も可能）、結合の弱い分子はサイクルを繰り返すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみが残るのである。
このようにして得られたＲＮＡアプタマーとΔＮＳ３ との結合活性および結合定数は、以下のようにして測定することができる。
【００１３】
各サイクルのＲＮＡならびにクローン化後のＲＮＡを３２Ｐ標識する。ＲＮＡ／ΔＮＳ３／ｔＲＮＡ＝１／１／１０（０．１ μＭ／０．１ μＭ／１ μＭ）の条件で混ぜた後、ニトロセルロース膜でろ過する。結合活性はΔＮＳ３と混ぜた ＲＮＡ量に対して、膜上に残った複合体を形成した ＲＮＡ量の割合で表わす。結合定数は３２Ｐ標識した適当な濃度の（例えば、０．３μＭ）ＲＮＡの存在下、ΔＮＳ３の濃度を適当な範囲で（例えば、０．１５μＭ−１．５μＭ）変化させて、結合活性を測定し、最大結合活性の１／２の活性を示すΔＮＳ３の濃度で表す。
【００１４】
また、ＲＮＡアプタマーのΔＮＳ３ プロテアーゼに対する阻害活性は、基本的に垣内らにより報告された方法に従って測定することができる。すなわち、ΔＮＳ３ プロテアーゼを、ＲＮＡアプタマー又はｔＲＮＡの存在下にプレインキュベートし、これを基質（例えば、化学合成したＮＳ５Ａ／５Ｂ ｊｕｎｃｔｉｏｎペプチド）に添加して反応を行い、反応混合液中の基質分解産物の生成量を測定する。
【００１５】
ＨＣＶを含む細胞に本発明のＲＮＡを導入することにより、該細胞中のＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。例えば、本発明のＲＮＡをリポソームに封入し、これを生体に投与して、ＨＣＶを含む細胞内に取り込ませることにより、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。このような方法については、”Ｌｉｐｉｄｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７） Ｒ． Ｊ． Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌ． Ｈｕａｎｇ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １４， １７３−２０６．に記載されている。また、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡをウイルスなどのベクターに組み込んで、ＨＣＶを含む細胞内に導入し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のＲＮＡを産生させることにより、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することもできる。このような方法については、”Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ”（１９９７） Ａ． Ｅ． Ｓｍｉｔｈ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９， ８０７−８３８． に記載されている。これらの方法の詳細およびこれらの方法に用いられる材料は、遺伝子治療の分野で知られており、それらを本発明においても用いることができる。
【００１６】
ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することにより、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
また、本発明のＲＮＡを用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のＲＮＡを抗体の代わりに利用することができる。本発明のＲＮＡを蛍光などで標識しておき、ＨＣＶに感染している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース膜で濾過する。ＨＣＶが細胞内に存在すれば、膜上にトラップされ、検出できる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。
〔実施例１〕
ＲＮＡ アプタマーの創製
１−１ タンパク質、核酸
ここで使用するΔＮＳ３タンパク質は、すでに我々が報告した方法により大腸菌ＨＢ１０１より精製した（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら、１９９７）。
インビトロ選択法に用いた Ｎ３０のＲＮＡプールは、５’−ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ−［Ｎ３０］−ＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ−３’（図３Ａの配列、配列番号７）を持つ。配列番号７に示したＲＮＡ配列に対応する鋳型ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成した後、当量のプライマー２
５’ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ３’（配列番号８）を加えＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡとした。
更にプライマー１
５’ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ３’（配列番号９）を加え、ＰＣＲにより２本鎖を増幅する。これを鋳型とし試験管内転写反応により、Ｎ３０ ＲＮＡプールを作った。
【００１８】
１−２ インビトロ選択法
約１０１５分子の配列を持つ Ｎ３０ ＲＮＡプール（１ ｎ ｍｏｌ）とΔＮＳ３タンパク質（０．２５ ｎ ｍｏｌ）を ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．７）， ３０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， １０ｍＭ ＤＴＴ（結合バッファー）中、室温で１時間保温した。この混液をポップトップホルダーに固定したニトロセルロース膜でろ過し、上記バッファーで洗浄した。フィルター上に残ったΔＮＳ３に結合したＲＮＡは ２００μｌの溶離液（０．４Ｍ酢酸ソーダ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７Ｍ尿素 （ＰＨ５．５））につけ９０℃、５分間加温し、膜及びΔＮＳ３から遊離させ、エタノール沈殿により回収した。回収したＲＮＡからＡＭＶ逆転写酵素により ｃＤＮＡを合成し、さらに ＰＣＲにより増幅した。これを鋳型に試験管内転写反応により再度 ＲＮＡプールとし、次のインビトロ選択のサイクルに用いた。
【００１９】
このサイクルを １１回繰り返した。各ＲＮＡプールの結合活性を測定した後、サイクル９後の ｃＤＮＡをＴＡクローニングベクターに挿入し、クローン化した。４５個のクローンを選び、各クローンからアルカリ法でプラスミドを回収し、ＤＮＡシーケンスを決めた。
各選択サイクルで使用したＲＮＡとタンパク質の量比ならびにプールの結合活性を表１に示す。
【００２０】
【表１】
【００２１】
〔実施例２〕
ＮＳ３ プロテアーゼに対するアプタマーの性質
２−１ アプタマーの結合活性ならびに結合定数の測定
各サイクルのＲＮＡならびにクローン化後のＲＮＡを３２Ｐ標識した。ＲＮＡ／ΔＮＳ３／ｔＲＮＡ＝１／１／１０（０．１ μＭ／０．１ μＭ／１ μＭ）の条件で混ぜ、以下はインビトロ選択法での操作と同様に、ニトロセルロース膜でろ過した。結合活性はΔＮＳ３と混ぜた ＲＮＡ量に対して、膜上に残った複合体を形成した ＲＮＡ量の割合で表わす。
結合定数は３２Ｐ標識したＲＮＡ（０．３μＭ）の存在下、ΔＮＳ３を０．１５μＭ−１．５μＭまで変化させ、結合活性を測定した。
Ｇ９−Ｉ、Ｇ９−ＩＩ、Ｇ９−ＩＩＩの３種類のアプタマーの△ＮＳ３タンパク質に対する結合活性は２０％前後であった（表２）。
【００２２】
【表２】
また結合定数はいずれも６００ ｎＭであった（図５）。これらの結果はコンセンサス配列が△ＮＳ３タンパク質との結合に強く関与していることを示している。
【００２３】
２−２ ＲＮＡ アプタマーの構造解析
ＲＮＡアプタマーの３’側の必要領域を明らかにするため、５’末端を標識したＲＮＡアプタマーを ５０ｍＭ 炭酸ナトリウム（ＰＨ ９．２）バッファー中、２．５μｇのキャリアー ｔＲＮＡ存在下、９２℃、４．５分加温し、アルカリによる部分分解反応を行った。この反応液をΔＮＳ３と混ぜ、ニトロセルロース膜でろ過し、膜上の複合体から結合したＲＮＡを回収し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。マーカーとして、ΔＮＳ３を加えないＲＮＡのアルカリ部分分解物ならびにＲＮａｓｅ Ｔ１、Ｕ２、Ａによる限定分解物を同時に泳動した。なお、ΔＮＳ３を添加しない場合は、上記の方法でアルカリ部分分解後、そのまま変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
３’必要領域の分析結果、いずれも３’末端から１１Ｎｔｓまで取り除いても△ＮＳ３タンパク質に対する結合活性は失われないことがわかった（図６）。図６において、−は△ＮＳ３タンパク質の不存在を、＋は△ＮＳ３タンパク質の存在を示し、Ａ、Ｔ１およびＵ２は、それぞれ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、Ｕ２、Ａを示す。
【００２４】
２−３ Δ ＮＳ３ プロテアーゼ阻害活性の測定
基本的に垣内らにより報告された方法に従った（Ｋａｋｉｕｃｈｉら、１９９５）。ダンシル標識した ＮＳ５Ａ／５Ｂ境界領域の ２０アミノ酸 Ｄｎｓ − ＧＥＡＧＤ ＤＩＶＰＣ／ＳＭＳＹＴ ＷＴＧＡＬ（／がΔＮＳ３による切断部位）（配列番号１０）（８６μＭ）にプレインキュベートしたΔＮＳ３（０．７５μＭ）とＲＮＡアプタマー（３．６μＭ）の混液を加え、２５℃、１時間反応させた。反応混液をＨＰＬＣで分離し、蛍光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ： ３１０ ｎｍ、５１０ ｎｍ： ｅｍｉｓｓｉｏｎ：）測定により、合成基質から産物の生成量を測定した。その結果いずれのアプタマーも９０％以上の阻害が観察された（図７）。
【００２５】
ＮＳ３タンパク質がＨＣＶの増殖に不可欠なことから、セリンプロテアーゼの一般的阻害剤がいくつか （例えば、トシルリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）など） 、プロテアーゼ活性の阻害剤としてテストされた （Ｌｉｎ ら、１９９２） 。その結果、これらの阻害剤は、ｍＭ濃度で必要であったが、我々のアプタマーは、μＭ以下の濃度で９０％以上の阻害が観察されることから、活性の高い阻害剤であることがわかった。
【００２６】
引用文献
Ｃｈｏｏ， Ｑ．−Ｌ．， Ｋｕｏ， Ｇ．， Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．Ｊ．， Ｏｖｅｒｂｙ， Ｌ．Ｒ．， Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ． （１９８９ａ） Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４， ３５９−３６２
Ｃｈｏｏ， Ｑ．−Ｌ．， Ｒｉｃｈｍａｎ， Ｋ．， Ｈａｎ， Ｊ．Ｈ．， ｂｅｒｇｅｒ， Ｋ．， Ｌｅｅ， Ｃ．， Ｄｏｎｇ， Ｃ．， Ｇａｌｌｅｇｏｓ， Ｃ．， Ｃｏｉｔ， Ｄ．， Ｍｅｄｉｎａ−Ｓｅｌｂｙ， Ａ．， Ｂａｒｒ， Ｐ．， Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．Ｊ．， Ｂｒａｄｌｅｙ， Ｄ．Ｗ．， Ｋｕｏ， Ｇ． ａｎｄ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ． （１９９１ｂ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ２４５１−２４５５
Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， Ｊ．Ａ． （１９９４） Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ． ７， ５０５−５３２
Ｇｒａｋｏｕｉ， Ａ．， Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ， Ｃ．， Ｌｉｎ， Ｃ．， Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３ａ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， １３８５−１３９５
Ｇｒａｋｏｕｉ， Ａ．， ＭｃＣｏｕｒｔ， Ｄ．Ｗ．， Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ， Ｃ．， Ｆｅｉｎｓｔｏｎｅ， Ｓ．Ｍ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９３ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ２８３２−２８４３
Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｋａｔｏ， Ｎ．， Ｏｏｔｓｕｙａｍａ， Ｙ．， Ｎａｋａｇａｗａ， Ｍ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９１ａ） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８， ５５４７−５５５１
Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｔ．， Ａｋａｇｉ， Ｓ．， Ｍｏｒｉ， Ｓ．， Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｋｔｏ， Ｎ．， Ｔａｎａｋａ， Ｔ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９３ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ４６６５−４６７５
Ｈｏｕｇｈｔｏｎ， Ｍ．， Ｗｅｉｎｅｒ， Ａ．， Ｈａｎ， Ｊ．， Ｋｕｏ， Ｇ． ａｎｄ Ｃｈｏｏ， Ｑ．−Ｌ． （１９９１） Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ， １４， ３８１−３８８
Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｈｉｇｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｋｏｍｏｄａ， Ｙ．， Ｔａｎｊｉ， Ｙ．， Ｈｉｒｏｗａｔａｒｉ， Ｙ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１０， １０５９−１０６５
Ｋｉｍ， Ｄ．Ｗ．， Ｇｗａｃｋ， Ｙ．， Ｈａｎ， Ｊ．Ｈ． ａｎｄ Ｃｈｏｅ， Ｊ． （１９９５） Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ． ２１５， １６０−１６６
Ｋｉｍ， Ｊ．Ｌ．， Ｍｏｒｇｅｎｓｔｅｒｎ， Ｋ．Ａ．， Ｌｉｎ， Ｃ．， Ｆｏｘ， Ｔ．， Ｄｗｙｅｒ， Ｍ．Ｄ．， Ｌａｎｄｒｏ， Ｊ．Ａ．， Ｃｈａｍｂｅｒｓ， Ｓ．Ｐ．， ｍａｒｋｌａｎｄ， Ｗ．， Ｌｅｐｒｅ， Ｃ．Ａ．， Ｏ’Ｍａｌｌｅｙ， Ｅ．Ｔ．， Ｈａｒｂｅｓｏｎ， Ｓ．Ｌ．， Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ．， Ｍｕｒｃｋｏ， Ｍ．Ａ．， Ｃａｒｏｎ， Ｐ．Ｒ． ａｎｄ Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｊ．Ａ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８７， ３４３−３５５．
Ｌｉｎ， Ｃ．， Ｌｉｎｄｅｎｂａｃｈ， Ｂ．Ｄ．， Ｐｒａｇａｉ， Ｂ．， ＭｃＣｏｕｒｔ， Ｄ．Ｗ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９４） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８， ５０６３−５０７３
Ｌｏｖｅ， Ｒ．Ａ．， Ｐａｒｇｅ， Ｈ．Ｅ．， Ｗｉｃｋｅｒｓｈａｍ， Ｊ．Ａ．， Ｈｏｓｔｏｍｓｋｙ， Ｚ．， Ｈａｂｕｋａ， Ｎ．， Ｍｏｏｍａｗ， Ｅ．Ｗ．， Ａｄａｃｈｉ， Ｔ． ａｎｄ Ｈｏｓｔｏｍｓｋａ， Ｚ． （１９９６） Ｃｅｌｌ ８７， ３３１−３４．
Ｍａｎａｂｅ， Ｓ．， Ｆｕｋｅ， Ｉ．， Ｔａｎｉｓｈｉｔａ， Ｏ．， Ｋａｊｉ， Ｃ．， Ｇｏｍｉ， Ｙ．， Ｙｏｓｈｉｄａ， Ｓ．， Ｍｏｒｉ， Ｃ．， Ｔａｋａｍｉｚａｗａ， Ａ．， Ｙａｓｈｉｄａ， Ｉ． ａｎｄ Ｏｋａｙａｍａ， Ｈ． （１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ． １９８， ６３６−６４４
Ｍａｔｓｕｕｒａ， Ｙ． ａｎｄ Ｍｉｙａｍｕａｒ， Ｔ． （１９９３） Ｓｅｍ． Ｖｉｒｏｌ． ４， ２９７−３０４
Ｍｉｌｌｅｒ， Ｒ．Ｈ． ａｎｄ Ｐｕｒｃｅｌｌ， Ｒ．Ｈ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７， ２０５７−２０６１
Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ｔａｎｊｉ， Ｙ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９４ａ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８， ２７３１−２７３４
Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ， Ｈ．， Ｈｉｊｉｋａｔａ， Ｍ．， Ａｓａｂｅ， Ｓ．−Ｉ．， Ｈｉｒｏｔａ， Ｍ．， Ｋｉｍｕｒａ， Ｋ． ａｎｄ Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ． （１９９４ｂ） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６８， ６２１５−６２２２
Ｐｉｚｚｉ， Ｅ．， Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ， Ａ．， Ｔｏｍｅｉ， Ｌ．， Ｌａｍｏｎｉｃａ， Ｎ．， Ｆａｉｌｌａ， Ｃ．， Ｓａｒｄａｎａ， Ｍ．， Ｗｏｏｄ， Ｔ． ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ８８８−８９２
Ｔｏｍｅｉ， Ｌ．， Ｆａｉｌｌａ， Ｃ．， Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ， Ｅ．， ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ． ａｎｄ ＬａＭｏｎｉｃａ， Ｎ． （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ４０１７−４０２６
Ｖｉｓｈｉｎｕｖａｒｄｈａｎ， Ｄ．， Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｕｒｖｉｌ， Ｐ． Ｔ．， Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ．， Ｋｕｍａｒ， Ｐ． Ｋ． Ｒ． ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ｓ． （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０２， ２０９−２１２．
Ｌｉｎ， Ｃ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ７６２２−７６２６
【００２７】
【発明の効果】
本発明のＲＮＡアプタマーにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。従って、本発明のＲＮＡアプタマーを医薬に利用することができる。
【００２８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＮＡアプタマー創製の概念図が示されている。
【図２】ＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎの構造の概念図（Ａ）（矢印は ＮＳ３プロテアーゼによる切断箇所を示す。）およびＮＳ３ プロテアーゼドメイン（ΔＮＳ３）の模式図（Ｂ）が示されている。
【図３】Ｎ３０のＲＮＡプールのシーケンス（Ａ）および単離したアプタマーのシーケンス（Ｂ）が示されている。
【図４】アプタマーの二次構造が示されている。太字はコンセンサス配列、イタリックはプライマー結合配列、矢印はΔＮＳ３との結合活性を有するＲＮＡアプタマーの３’末端の境界を示す。
【図５】結合定数を求める図である。
【図６】アプタマーの３’境界領域の分析結果を示す。
【図７】アプタマーによるΔＮＳ３プロテアーゼの阻害活性を示す。
Claims (8)
- Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができるＲＮＡ分子であって、ループ構造を形成する下記の塩基配列(I)及び当該塩基配列(I)に隣接してステム構造を形成する塩基配列を含むと共に、下記の塩基配列(V)を５’末端側に、下記の塩基配列(VI)の５’末端から少なくとも１３個の連続する塩基の配列を３’末端側に有することを特徴とするＲＮＡ分子。
（配列中、XはAまたはUである） - 下記の塩基配列(II)を含む請求項１記載のＲＮＡ分子。
- 下記の塩基配列(III)を含む請求項１記載のＲＮＡ分子。
- 下記の塩基配列(IV)を含む請求項１記載のＲＮＡ分子。
- Ｃ型肝炎をin vitroにおいて診断するための、請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を含む診断剤。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を含む、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼ阻害剤。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子を用いてin vitroにおいてＣ型肝炎ウイルスのＮＳプロテアーゼを阻害する方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載のＲＮＡ分子をＣ型肝炎に感染しているおそれのある細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と接触させることを含む、in vit
roにおいてＣ型肝炎を診断する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30534497A JP3612551B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30534497A JP3612551B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11137252A JPH11137252A (ja) | 1999-05-25 |
| JP3612551B2 true JP3612551B2 (ja) | 2005-01-19 |
Family
ID=17943992
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30534497A Expired - Lifetime JP3612551B2 (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3612551B2 (ja) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002165594A (ja) * | 2000-11-29 | 2002-06-11 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | Ｃ型肝炎ウイルスのｉｒｅｓ及びｎｓ３プロテアーゼを標的とするｒｎａ分子 |
| JP4779089B2 (ja) * | 2001-05-25 | 2011-09-21 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼおよびヘリカーゼを標的とする新規機能性核酸 |
| US7119072B2 (en) | 2002-01-30 | 2006-10-10 | Boehringer Ingelheim (Canada) Ltd. | Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus |
| US7091184B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-08-15 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Hepatitis C inhibitor tri-peptides |
| US6642204B2 (en) | 2002-02-01 | 2003-11-04 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Hepatitis C inhibitor tri-peptides |
| US20050075279A1 (en) | 2002-10-25 | 2005-04-07 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Macrocyclic peptides active against the hepatitis C virus |
| KR101115294B1 (ko) | 2003-05-21 | 2012-04-12 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | Ｃ형 간염 억제제 화합물 |
| EA200600498A1 (ru) | 2003-09-22 | 2006-10-27 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Макроциклические пептиды, проявляющие противовирусную активность в отношении вируса гепатита с |
| ES2358333T3 (es) | 2004-01-21 | 2011-05-09 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Péptidos macrocíclicos con acción contra el virus de la hepatitis c. |
| UY29016A1 (es) | 2004-07-20 | 2006-02-24 | Boehringer Ingelheim Int | Analogos de dipeptidos inhibidores de la hepatitis c |
| JP4914355B2 (ja) | 2004-07-20 | 2012-04-11 | ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング | Ｃ型肝炎インヒビターペプチド類似体 |
| JP5191028B2 (ja) * | 2005-05-20 | 2013-04-24 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | 異常型プリオン蛋白質由来の原繊維に結合するｒｎａアプタマー |
-
1997
- 1997-11-07 JP JP30534497A patent/JP3612551B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH11137252A (ja) | 1999-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumar et al. | Isolation of RNA aptamers specific to the NS3 protein of hepatitis C virus from a pool of completely random RNA | |
| Bartenschlager et al. | Substrate determinants for cleavage in cis and in trans by the hepatitis C virus NS3 proteinase | |
| Kwong et al. | Hepatitis C virus NS3/4A protease | |
| Dimitrova et al. | Protein-protein interactions between hepatitis C virus nonstructural proteins | |
| Bartenschlager | The NS3/4A proteinase of the hepatitis C virus: unravelling structure and function of an unusual enzyme and a prime target for antiviral therapy | |
| Ishii et al. | Expression of hepatitis C virus NS5B protein: characterization of its RNA polymerase activity and RNA binding | |
| Chamberlain et al. | The complete coding sequence of hepatitis C virus genotype 5a, the predominant genotype in South Africa | |
| JP3612551B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを阻害するｒｎａ分子 | |
| Reed et al. | Molecular characterization of hepatitis C virus | |
| JP4247385B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスのｎｓ３プロテアーゼを標的とする、ヘテロ二量体を形成するｒｎａ分子 | |
| Butkiewicz et al. | Enhancement of hepatitis C virus NS3 proteinase activity by association with NS4A-specific synthetic peptides: identification of sequence and critical residues of NS4A for the cofactor activity | |
| Aizaki et al. | Full‐length complementary DNA of hepatitis C virus genome from an infectious blood sample | |
| Howe et al. | A novel recombinant single‐chain hepatitis C virus ns3‐ns4a protein with improved helicase activity | |
| JP2004147661A (ja) | ヘリカーゼ活性および改善された溶解性を有するｈｃｖｎｓ３タンパク質フラグメント | |
| Love et al. | The conformation of hepatitis C virus NS3 proteinase with and without NS4A: a structural basis for the activation of the enzyme by its cofactor | |
| JP3310298B2 (ja) | Ｈｃｖ ｎｓ３プロテアーゼのタンパク質分解活性を有するポリぺプチドを製造し、精製し、分析する方法 | |
| Yu et al. | Defective RNA replication by poliovirus mutants deficient in 2A protease cleavage activity | |
| Sudo et al. | Establishment of an in vitro assay system for screening hepatitis C virus protease inhibitors using high performance liquid chromatography | |
| JP2003523717A (ja) | Ｃ型肝炎ウイルスプロテアーゼ阻害物質の細胞ベースの評価で使用するレポーター遺伝子系 | |
| Gouvea et al. | Substrate specificity of recombinant dengue 2 virus NS2B-NS3 protease: influence of natural and unnatural basic amino acids on hydrolysis of synthetic fluorescent substrates | |
| US20040076949A1 (en) | Methods for identifying inhibitors of helicase activity from hepatitis C virus | |
| Yasumasa et al. | Processing of hepatitis C viral polyprotein in Escherichia coli | |
| Filocamo et al. | Chimeric Sindbis viruses dependent on the NS3 protease of hepatitis C virus | |
| Koch et al. | Determinants of substrate specificity in the NS3 serine proteinase of the hepatitis C virus | |
| Sudo et al. | Novel hepatitis C virus protease inhibitors: 2, 4, 6-trihydroxy, 3-nitro-benzamide derivatives |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040830 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |