【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害するＲＮＡ分子に関する。
【０００２】
【従来の技術】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、非Ａ非Ｂ型肝炎のメジャーな病原体（Ｈｏｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９９１； Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， １９９４）で、その構造は１本のおよそ９５００ヌクレオチドのＲＮＡゲノムを持ったウイルスである（Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９８９ａ； Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．， １９９１ｂ）。約３０００アミノ酸のｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎが、このゲノムから（図２Ａ）ＮＨ２−Ｃ−Ｅ１−Ｅ２−ｐ７−ＮＳ２−ＮＳ３−ＮＳ４Ａ−ＮＳ４Ｂ−ＮＳ５Ａ−ＮＳ５Ｂ−ＣＯＯＨの順序で翻訳される（Ｍａｔｓｕｕｒａ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ａ； Ｐｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．， １９９４； Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９１ａ； Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。コアタンパク質（Ｃ）、外被タンパク質（Ｅ１、Ｅ２）そしてそれ以外のＮＳタンパク質がある。このｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎは、宿主とウィルスのプロテアーゼの協同作業によって、少くとも１０個のウィルスタンパク質に分断される。
【０００３】
今までの研究から、小包体の中に局在する宿主のシグナルペプチダーゼが構造上の部位（Ｃ／Ｅ１、Ｅ１／Ｅ２、Ｅ２／ｐ７とｐ７／ＮＳ２）でｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎを切断することがわかっている（Ｃｕｔｈｂｅｒｔ， １９９４； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ａ； Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ ｅｔ ａｌ．， １９９４ｂ）。一方、ＮＳ３タンパク質は、ＮＳ部分の４箇所（３／４Ａ、４Ａ／４Ｂ、４Ｂ／５Ａと５Ａ／５Ｂ）で切断を行う（Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ； Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ； Ｔｏｍｅｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３； Ｍａｎａｂｅ ｅｔ ａｌ．， １９９４）。ＮＳ２／３ サイトでの切断は、ＮＳ２部位を取り囲むＨＣＶにコードされたもう一つのメタロプロテアーゼによって行われる（ Ｇｒａｋｏｕｉ ｅｔ ａｌ．， １９９３ａ； Ｈｉｊｉｋａｔａ ｅｔ ａｌ．， １９９３ｂ）。
【０００４】
実際には、ＮＳ３のＮターミナルの１８０アミノ酸残基が、プロテアーゼドメインで、トリプシン様セリンプロテアーゼファミリーに共通のシーケンスを含む。すなわち、ＮＳ３のヒスチジン１０８３、アスパラギン酸１１０７、セリン１１６５は、セリンプロテアーゼファミリーの中でキモトリプシン系に属しているようなＮＳ３プロテアーゼの触媒作用の ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄを構成する。ごく最近明らかにされたこのプロテアーゼドメインの立体構造からも（Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ， １９９７， Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ １９９７）、トリプシン様セリンプロテアーゼに共通の構造が確認された。
【０００５】
一方、ＮＳ３ のＣ末には全く別のヘリカーゼのドメインがある（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， １９９５）。このタンパク質の作用については全くわかっていない。またＮＳ４Ａペプチドは特にＮＳ４Ｂ／５Ａサイトでの切断効率を高めるＮＳ３プロテアーゼのｃｏｆａｃｔｏｒかｅｆｆｅｃｔｏｒであることが示されたが、どのようにして切断効率を上げるのかは、今のところ不明である。
このようにＮＳ３領域にコードされているセリンプロテアーゼ（以下、「ＮＳ３プロテアーゼ」と記す） はＨＣＶの増殖に必須の酵素でかつＨＣＶの亜種の中で非常に保存されており、ＮＳ３の抗体が、ＨＣＶ診断の中で使われている。これらの特性から、ＮＳ３プロテアーゼは、現在、治療薬や診断薬の開発の中で一番の標的とされているが、特にＮＳ３プロテアーゼの阻害剤として今までに効果の有る物は見つかっていない。
【０００６】
我々は大腸菌から高活性のＮＳ３プロテアーゼ領域（以下、「△ＮＳ３」または「△ＮＳ３タンパク質」と記す、図２Ｂ）の簡単で高収率な精製系をすでに報告している（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら。 １９９７）。発現プラスミドｐＨｉｓＢ△ＮＳ３は、Ｎ末に６ヶのＨｉｓ−ｔａｇを付加した、１９２アミノ酸（アミノ酸残基１０２７−１２１８）のＮＳ３タンパク質をコードし、６つのＨｉｓ−ｔａｇを利用することで、ワンステップのクロマトグラフィーで精製されるようになっている。精製した△ＮＳ３は、今までに大腸菌で発現した他のＮＳ３プロテアーゼと比較すると、最も高い活性を示した。このことは ＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎの１０２７−１２１８がプロテアーゼ領域であることを示している。更に我々は、生体内の状況を反映するＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎのアミノ酸シーケンス２２０３−２５０６において、△ＮＳ３の能力をテストした結果、合成ペプチド基質５Ａ／Ｂを用いた時と同じく、△ＮＳ３はＮＳ５Ａ／Ｂ結合を切断することができた（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら。 １９９７）。このように精製した△ＮＳ３プロテアーゼは小さい分子サイズで、ＮＳ３プロテアーゼの完全な触媒作用の機能を表わし、精製の平易さと高い収量を考えると、プロテアーゼ阻害剤の開発ならびに構造機能相関を解明するのに理想的な標的タンパク質と考える。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＮＳ３プロテアーゼを阻害する活性の高い物質を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、インビトロ選択法を用いて、△ＮＳ３タンパク質に特異的に結合する高い親和性を持つＲＮＡアプタマーを創製することに成功し、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、下記の塩基配列（Ｉ）を含むＲＮＡ分子を提供する。
（配列中、ＸはＡまたはＵである）
上記の塩基配列（Ｉ）はループ構造を形成するとよい。また、ループ構造を形成する塩基配列（Ｉ）に隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するとよい。
【０００９】
ここで、「ループ構造」とは、一本鎖の核酸によるループ状の構造をいい、「ステム構造」とは、塩基対により二本鎖を形成した核酸のステム状の構造をいう。このようなループ構造を形成する塩基配列（Ｉ）に隣接してステム構造を形成する塩基配列が存在するＲＮＡ分子としては、下記の塩基配列（ＩＩ）、塩基配列（ＩＩＩ）または塩基配列（ＩＶ）を含むものを挙げることができる。
【００１０】
上記の塩基配列（ＩＩ）、塩基配列（ＩＩＩ）または塩基配列（ＩＶ）を含むＲＮＡ分子は、さらに、下記の塩基配列（Ｖ）を５’末端側に、下記の塩基配列（ＶＩ）の５’末端から少なくとも１３個の連続する塩基の配列を３’末端側に有しているとよい。
【００１１】
また、本発明は、上記のＲＮＡ分子を含む医薬組成物を提供する。かかる医薬組成物は、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができ、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス薬として用いることができる。この医薬組成物を用いて、Ｃ型肝炎を診断したり、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができる。
さらに、本発明は、上記のＲＮＡ分子を用いてＣ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害する方法を提供する。かかる方法においては、Ｃ型肝炎ウイルスに感染した細胞に上記のＲＮＡ分子を導入するとよい。
【００１２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を詳細に説明する。
我々は、△ＮＳ３タンパク質に特異的に結合する高い親和性を持つＲＮＡアプタマーを創製するためにインビトロ選択法（図１）を使った。図１に示すように、ランダムな配列を持つＲＮＡ分子のプールから特定のタンパク質に結合する分子（ＲＮＡアプタマー）を選択、増幅するサイクルを繰り返すことで、非常に特異的に結合するＲＮＡアプタマーが得られた。最初はごく僅かしかないそのような分子もＰＣＲ法で増幅され（条件により変異導入も可能）、結合の弱い分子はサイクルを繰り返すことで淘汰され、最終的に特異的に結合する分子のみが残るのである。
このようにして得られたＲＮＡアプタマーとΔＮＳ３ との結合活性および結合定数は、以下のようにして測定することができる。
【００１３】
各サイクルのＲＮＡならびにクローン化後のＲＮＡを３２Ｐ標識する。ＲＮＡ／ΔＮＳ３／ｔＲＮＡ＝１／１／１０（０．１ μＭ／０．１ μＭ／１ μＭ）の条件で混ぜた後、ニトロセルロース膜でろ過する。結合活性はΔＮＳ３と混ぜた ＲＮＡ量に対して、膜上に残った複合体を形成した ＲＮＡ量の割合で表わす。結合定数は３２Ｐ標識した適当な濃度の（例えば、０．３μＭ）ＲＮＡの存在下、ΔＮＳ３の濃度を適当な範囲で（例えば、０．１５μＭ−１．５μＭ）変化させて、結合活性を測定し、最大結合活性の１／２の活性を示すΔＮＳ３の濃度で表す。
【００１４】
また、ＲＮＡアプタマーのΔＮＳ３ プロテアーゼに対する阻害活性は、基本的に垣内らにより報告された方法に従って測定することができる。すなわち、ΔＮＳ３ プロテアーゼを、ＲＮＡアプタマー又はｔＲＮＡの存在下にプレインキュベートし、これを基質（例えば、化学合成したＮＳ５Ａ／５Ｂ ｊｕｎｃｔｉｏｎペプチド）に添加して反応を行い、反応混合液中の基質分解産物の生成量を測定する。
【００１５】
ＨＣＶを含む細胞に本発明のＲＮＡを導入することにより、該細胞中のＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。例えば、本発明のＲＮＡをリポソームに封入し、これを生体に投与して、ＨＣＶを含む細胞内に取り込ませることにより、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。このような方法については、”Ｌｉｐｉｄｉｃ ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ”（１９９７） Ｒ． Ｊ． Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌ． Ｈｕａｎｇ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒ． Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １４， １７３−２０６．に記載されている。また、本発明のＲＮＡをコードするＤＮＡをウイルスなどのベクターに組み込んで、ＨＣＶを含む細胞内に導入し、該細胞内でこのベクターを発現させ、本発明のＲＮＡを産生させることにより、ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することもできる。このような方法については、”Ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｉｎ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ”（１９９７） Ａ． Ｅ． Ｓｍｉｔｈ Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ４９， ８０７−８３８． に記載されている。これらの方法の詳細およびこれらの方法に用いられる材料は、遺伝子治療の分野で知られており、それらを本発明においても用いることができる。
【００１６】
ＨＣＶのＮＳ３プロテアーゼを阻害することにより、Ｃ型肝炎を予防および／または治療することができる。投与は、疾病の状態の重篤度や生体の応答性によるが、治療の有効性が認められるまで、あるいは疾病状態の軽減が達成されるまでの期間にわたり、適当な用量、投与方法、頻度で行えばよい。
また、本発明のＲＮＡを用いて、Ｃ型肝炎を診断することができる。本発明のＲＮＡを抗体の代わりに利用することができる。本発明のＲＮＡを蛍光などで標識しておき、ＨＣＶに感染している細胞の抽出液又は細胞をつぶした物と混ぜ、ニトロセルロース膜で濾過する。ＨＣＶが細胞内に存在すれば、膜上にトラップされ、検出できる。
【００１７】
【実施例】
以下、実施例によって本発明をより具体的に説明する。本発明の範囲はこれらの実施例により限定されることはない。
〔実施例１〕
ＲＮＡ アプタマーの創製
１−１ タンパク質、核酸
ここで使用するΔＮＳ３タンパク質は、すでに我々が報告した方法により大腸菌ＨＢ１０１より精製した（Ｖｉｓｈｕｎｕｖａｒｄｈａｎら、１９９７）。
インビトロ選択法に用いた Ｎ３０のＲＮＡプールは、５’−ＧＧＧＡＧＡＡＵＵＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ−［Ｎ３０］−ＣＣＵＵＵＣＣＵＣＵＣＵＣＣＵＵＣＣＵＣＵＵＣＵ−３’（図３Ａの配列、配列番号７）を持つ。配列番号７に示したＲＮＡ配列に対応する鋳型ＤＮＡをＤＮＡ自動合成機で合成した後、当量のプライマー２
５’ＡＧＡＡＧＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＡＡＡＧＧ３’（配列番号８）を加えＰＣＲにより２本鎖ＤＮＡとした。
更にプライマー１
５’ＡＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＡＴＴＣＣＧＡＣＣＡＧＡＡＧ３’（配列番号９）を加え、ＰＣＲにより２本鎖を増幅する。これを鋳型とし試験管内転写反応により、Ｎ３０ ＲＮＡプールを作った。
【００１８】
１−２ インビトロ選択法
約１０１５分子の配列を持つ Ｎ３０ ＲＮＡプール（１ ｎ ｍｏｌ）とΔＮＳ３タンパク質（０．２５ ｎ ｍｏｌ）を ５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐＨ７．７）， ３０ｍＭ ＮａＣｌ， ５ｍＭ ＣａＣｌ２， １０ｍＭ ＤＴＴ（結合バッファー）中、室温で１時間保温した。この混液をポップトップホルダーに固定したニトロセルロース膜でろ過し、上記バッファーで洗浄した。フィルター上に残ったΔＮＳ３に結合したＲＮＡは ２００μｌの溶離液（０．４Ｍ酢酸ソーダ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、 ７Ｍ尿素 （ＰＨ５．５））につけ９０℃、５分間加温し、膜及びΔＮＳ３から遊離させ、エタノール沈殿により回収した。回収したＲＮＡからＡＭＶ逆転写酵素により ｃＤＮＡを合成し、さらに ＰＣＲにより増幅した。これを鋳型に試験管内転写反応により再度 ＲＮＡプールとし、次のインビトロ選択のサイクルに用いた。
【００１９】
このサイクルを １１回繰り返した。各ＲＮＡプールの結合活性を測定した後、サイクル９後の ｃＤＮＡをＴＡクローニングベクターに挿入し、クローン化した。４５個のクローンを選び、各クローンからアルカリ法でプラスミドを回収し、ＤＮＡシーケンスを決めた。
各選択サイクルで使用したＲＮＡとタンパク質の量比ならびにプールの結合活性を表１に示す。
【００２０】
【表１】
４５個のクローンをシーケンスした結果、主に３つのシーケンスファミリー、Ｇ９−Ｉ（２１個）、Ｇ９−ＩＩ（５個）、Ｇ９−ＩＩＩ（４個）があった（図３Ｂ）。それらはいずれも、５’−ＧＡＸＵＧＧＧＡＣ−３’（Ｘ＝Ａ ｏｒ Ｕ）（配列番号１）のコンセンサス配列を持ち、しかも二次構造をみると、コンセンサス配列はループ構造を形成していることがわかった（図４に太字で示した配列）。また、残りのＮ３０由来の配列はそれ自身であるいはプライマー部分（図４にイタリック体で示した配列）とともにステム構造を形成し、全体にステムに富んだ二次構造をとることが推測された。図４の矢印は、ΔＮＳ３との結合活性を有するアプタマーの３’末端の境界を指している。また、図４の−は塩基対の形成を示し、●はワブル塩基対の形成を示す。このコンセンサス配列を持つアプタマーはシーケンスを調べた全クローンのうち、８０％を占めていた。
【００２１】
〔実施例２〕
ＮＳ３ プロテアーゼに対するアプタマーの性質
２−１ アプタマーの結合活性ならびに結合定数の測定
各サイクルのＲＮＡならびにクローン化後のＲＮＡを３２Ｐ標識した。ＲＮＡ／ΔＮＳ３／ｔＲＮＡ＝１／１／１０（０．１ μＭ／０．１ μＭ／１ μＭ）の条件で混ぜ、以下はインビトロ選択法での操作と同様に、ニトロセルロース膜でろ過した。結合活性はΔＮＳ３と混ぜた ＲＮＡ量に対して、膜上に残った複合体を形成した ＲＮＡ量の割合で表わす。
結合定数は３２Ｐ標識したＲＮＡ（０．３μＭ）の存在下、ΔＮＳ３を０．１５μＭ−１．５μＭまで変化させ、結合活性を測定した。
Ｇ９−Ｉ、Ｇ９−ＩＩ、Ｇ９−ＩＩＩの３種類のアプタマーの△ＮＳ３タンパク質に対する結合活性は２０％前後であった（表２）。
【００２２】
【表２】
表２中、ΔＮＳ３−Ｇ９＊とは、インビトロ選択におけるサイクル９後のＲＮＡプールある。
また結合定数はいずれも６００ ｎＭであった（図５）。これらの結果はコンセンサス配列が△ＮＳ３タンパク質との結合に強く関与していることを示している。
【００２３】
２−２ ＲＮＡ アプタマーの構造解析
ＲＮＡアプタマーの３’側の必要領域を明らかにするため、５’末端を標識したＲＮＡアプタマーを ５０ｍＭ 炭酸ナトリウム（ＰＨ ９．２）バッファー中、２．５μｇのキャリアー ｔＲＮＡ存在下、９２℃、４．５分加温し、アルカリによる部分分解反応を行った。この反応液をΔＮＳ３と混ぜ、ニトロセルロース膜でろ過し、膜上の複合体から結合したＲＮＡを回収し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。マーカーとして、ΔＮＳ３を加えないＲＮＡのアルカリ部分分解物ならびにＲＮａｓｅ Ｔ１、Ｕ２、Ａによる限定分解物を同時に泳動した。なお、ΔＮＳ３を添加しない場合は、上記の方法でアルカリ部分分解後、そのまま変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。
３’必要領域の分析結果、いずれも３’末端から１１Ｎｔｓまで取り除いても△ＮＳ３タンパク質に対する結合活性は失われないことがわかった（図６）。図６において、−は△ＮＳ３タンパク質の不存在を、＋は△ＮＳ３タンパク質の存在を示し、Ａ、Ｔ１およびＵ２は、それぞれ、ＲＮａｓｅ Ｔ１、Ｕ２、Ａを示す。
【００２４】
２−３ Δ ＮＳ３ プロテアーゼ阻害活性の測定
基本的に垣内らにより報告された方法に従った（Ｋａｋｉｕｃｈｉら、１９９５）。ダンシル標識した ＮＳ５Ａ／５Ｂ境界領域の ２０アミノ酸 Ｄｎｓ − ＧＥＡＧＤ ＤＩＶＰＣ／ＳＭＳＹＴ ＷＴＧＡＬ（／がΔＮＳ３による切断部位）（配列番号１０）（８６μＭ）にプレインキュベートしたΔＮＳ３（０．７５μＭ）とＲＮＡアプタマー（３．６μＭ）の混液を加え、２５℃、１時間反応させた。反応混液をＨＰＬＣで分離し、蛍光（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ： ３１０ ｎｍ、５１０ ｎｍ： ｅｍｉｓｓｉｏｎ：）測定により、合成基質から産物の生成量を測定した。その結果いずれのアプタマーも９０％以上の阻害が観察された（図７）。
【００２５】
ＮＳ３タンパク質がＨＣＶの増殖に不可欠なことから、セリンプロテアーゼの一般的阻害剤がいくつか （例えば、トシルリシルクロロメチルケトン（ＴＬＣＫ）など） 、プロテアーゼ活性の阻害剤としてテストされた （Ｌｉｎ ら、１９９２） 。その結果、これらの阻害剤は、ｍＭ濃度で必要であったが、我々のアプタマーは、μＭ以下の濃度で９０％以上の阻害が観察されることから、活性の高い阻害剤であることがわかった。
【００２６】
引用文献
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Ｐｉｚｚｉ， Ｅ．， Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ， Ａ．， Ｔｏｍｅｉ， Ｌ．， Ｌａｍｏｎｉｃａ， Ｎ．， Ｆａｉｌｌａ， Ｃ．， Ｓａｒｄａｎａ， Ｍ．， Ｗｏｏｄ， Ｔ． ａｎｄ ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１， ８８８−８９２
Ｔｏｍｅｉ， Ｌ．， Ｆａｉｌｌａ， Ｃ．， Ｓａｎｔｏｌｉｎｉ， Ｅ．， ＤｅＦｒａｎｃｅｓｃｏ， Ｒ． ａｎｄ ＬａＭｏｎｉｃａ， Ｎ． （１９９３） Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６７， ４０１７−４０２６
Ｖｉｓｈｉｎｕｖａｒｄｈａｎ， Ｄ．， Ｋａｋｉｕｃｈｉ， Ｎ．， Ｕｒｖｉｌ， Ｐ． Ｔ．， Ｓｈｉｍｏｔｏｈｎｏ， Ｋ．， Ｋｕｍａｒ， Ｐ． Ｋ． Ｒ． ａｎｄ Ｎｉｓｈｉｋａｗａ， Ｓ． （１９９７） ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． ４０２， ２０９−２１２．
Ｌｉｎ， Ｃ． ａｎｄ Ｒｉｃｅ， Ｃ．Ｍ． （１９９５） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２， ７６２２−７６２６
【００２７】
【発明の効果】
本発明のＲＮＡアプタマーにより、Ｃ型肝炎ウイルスのＮＳ３プロテアーゼを阻害することができる。従って、本発明のＲＮＡアプタマーを医薬に利用することができる。
【００２８】
【配列表】
【００３０】
【００３１】
【００３２】
【００３３】
【００３４】
【００３５】
【００３６】
【００３７】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＲＮＡアプタマー創製の概念図が示されている。
【図２】ＨＣＶ ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎの構造の概念図（Ａ）（矢印は ＮＳ３プロテアーゼによる切断箇所を示す。）およびＮＳ３ プロテアーゼドメイン（ΔＮＳ３）の模式図（Ｂ）が示されている。
【図３】Ｎ３０のＲＮＡプールのシーケンス（Ａ）および単離したアプタマーのシーケンス（Ｂ）が示されている。
【図４】アプタマーの二次構造が示されている。太字はコンセンサス配列、イタリックはプライマー結合配列、矢印はΔＮＳ３との結合活性を有するＲＮＡアプタマーの３’末端の境界を示す。
【図５】結合定数を求める図である。
【図６】アプタマーの３’境界領域の分析結果を示す。
【図７】アプタマーによるΔＮＳ３プロテアーゼの阻害活性を示す。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to RNA molecules that inhibit NS3 protease of hepatitis C virus.
[0002]
[Prior art]
Hepatitis C virus (HCV) is a major pathogen of non-A non-B hepatitis (Houghton et al., 1991; Matsuura et al., 1993; Cuthbert, 1994), which has a structure of approximately 9,500 nucleotides. It is a virus with an RNA genome (Choo et al., 1989a; Choo et al., 1991b). Polyprotein of about 3000 amino acids, from the genome is translated in the order (Fig. 2A) NH 2 -C-E1- E2-p7-NS2-NS3-NS4A-NS4B-NS5A-NS5B-COOH (Matsuura et al., 1993; Grakoui et al., 1993a; Pizzi et al., 1994; Hijikata et al., 1991a; Lin et al., 1994). There are core protein (C), coat protein (E1, E2) and other NS proteins. This polyprotein is fragmented into at least 10 viral proteins by the cooperation of host and viral proteases.
[0003]
Previous studies have shown that host signal peptidases localized in the parcel cleave polyprotein at structural sites (C / E1, E1 / E2, E2 / p7 and p7 / NS2). (Cuthbert, 1994; Mizushima et al., 1994a; Mizushima et al., 1994b). On the other hand, NS3 protein cleaves at four positions (3 / 4A, 4A / 4B, 4B / 5A and 5A / 5B) of the NS portion (Hijikata et al., 1993b; Grakoui et al., 1993b; Tomei et al. , 1993; Manabe et al., 1994). Cleavage at the NS2 / 3 site is performed by another metalloprotease encoded by HCV surrounding the NS2 site (Grakoui et al., 1993a; Hijikata et al., 1993b).
[0004]
In practice, the 180 amino acid residue of NS3 N terminal contains a sequence common to the trypsin-like serine protease family in the protease domain. That is, NS3 histidine 1083, aspartic acid 1107, and serine 1165 constitute the catalytic triad of the catalytic action of NS3 protease as belonging to the chymotrypsin system in the serine protease family. A structure common to trypsin-like serine proteases was also confirmed from the three-dimensional structure of this protease domain that was recently revealed (Love et al, 1997, Kim et al 1997).
[0005]
On the other hand, there is a completely different helicase domain at the C-terminus of NS3 (Kim et al., 1995). The effect of this protein is not known at all. The NS4A peptide has been shown to be a factor or effector of the NS3 protease that increases the cleavage efficiency particularly at the NS4B / 5A site, but it is unclear how to increase the cleavage efficiency.
The serine protease encoded in the NS3 region (hereinafter referred to as “NS3 protease”) is an enzyme essential for HCV growth and is highly conserved among HCV variants. , Used in HCV diagnosis. Because of these characteristics, NS3 protease is currently the primary target in the development of therapeutic agents and diagnostic agents, but nothing particularly effective as an inhibitor of NS3 protease has been found so far.
[0006]
We have already reported a simple, high-yield purification system of E. coli from the highly active NS3 protease region (hereinafter referred to as “ΔNS3” or “ΔNS3 protein”, FIG. 2B) (Vishunvardhan et al., 1997). . The expression plasmid pHisBΔNS3 encodes an NS3 protein of 192 amino acids (amino acid residues 1027-1218) with 6 His-tags added to the N-terminus, and uses 6 His-tags to make a one-step process. It is designed to be purified by chromatography. Purified ΔNS3 showed the highest activity when compared to other NS3 proteases expressed in E. coli to date. This indicates that 1027-1218 of HCV polyprotein is a protease region. Furthermore, we tested the ability of △ NS3 in the amino acid sequence 2203-2506 of HCV polyprotein that reflects the in vivo situation. As a result, △ NS3 binds to NS5A / B as well as when synthetic peptide substrate 5A / B is used. Could be cleaved (Vishunvardhan et al. 1997). The purified NS3 protease has a small molecular size and represents the complete catalytic function of NS3 protease. Given the ease of purification and high yield, the development of protease inhibitors and the elucidation of the structure-function relationship Think of it as an ideal target protein.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a highly active substance that inhibits NS3 protease.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have succeeded in creating an RNA aptamer with high affinity that specifically binds to the ΔNS3 protein using an in vitro selection method, and completed the present invention.
That is, the present invention provides an RNA molecule that can inhibit NS3 protease of hepatitis C virus and includes the following base sequence (I).
(In the sequence, X is A or U)
Said base sequence (I) is good to form a loop structure. In addition, a base sequence that forms a stem structure may be present adjacent to the base sequence (I) that forms the loop structure.
[0009]
Here, “loop structure” refers to a loop-like structure of a single-stranded nucleic acid, and “stem structure” refers to a stem-like structure of a nucleic acid in which a double strand is formed by base pairing. RNA molecules having a base sequence that forms a stem structure adjacent to the base sequence (I) that forms such a loop structure include the following base sequence (II), base sequence (III), or base sequence (IV): ).
[0010]
The RNA molecule comprising the above base sequence (II), base sequence (III) or base sequence (IV) further comprises the following base sequence (V) at the 5 ′ end side and 5 of the following base sequence (VI): It is good to have a sequence of at least 13 consecutive bases from the 'terminal side on the 3' terminal side.
[0011]
The present invention also provides a pharmaceutical composition comprising the above RNA molecule. Such a pharmaceutical composition can inhibit the NS3 protease of hepatitis C virus and can be used as an antiviral agent against hepatitis C virus. This pharmaceutical composition can be used to diagnose hepatitis C and to prevent and / or treat hepatitis C.
Furthermore, the present invention provides a method of inhibiting hepatitis C virus NS3 protease using the above RNA molecule. In such a method, the above RNA molecule may be introduced into a cell infected with hepatitis C virus.
[0012]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
We used an in vitro selection method (FIG. 1) to create a high affinity RNA aptamer that specifically binds to the ΔNS3 protein. As shown in Fig. 1, RNA aptamers that bind very specifically are obtained by repeating the cycle of selecting and amplifying molecules (RNA aptamers) that bind to specific proteins from a pool of RNA molecules with random sequences. It was. Initially very few such molecules are amplified by PCR (mutations can be introduced depending on conditions), and weakly bound molecules can be trapped by repeated cycles, leaving only molecules that bind specifically in the end. It is.
The binding activity and binding constant between the RNA aptamer thus obtained and ΔNS3 can be measured as follows.
[0013]
Each cycle of RNA as well as the cloned RNA is labeled with 32 P. After mixing under the conditions of RNA / ΔNS3 / tRNA = 1/1/10 (0.1 μM / 0.1 μM / 1 μM), the mixture is filtered through a nitrocellulose membrane. The binding activity is expressed as the ratio of the amount of RNA that formed a complex remaining on the membrane to the amount of RNA mixed with ΔNS3. The binding constant was determined by changing the concentration of ΔNS3 in an appropriate range (eg, 0.15 μM-1.5 μM) in the presence of 32 P-labeled appropriate concentration (eg, 0.3 μM) RNA. And expressed as a concentration of ΔNS3 that shows half of the maximum binding activity.
[0014]
In addition, the inhibitory activity of RNA aptamers on ΔNS3 protease can be measured basically according to the method reported by Kakiuchi et al. That is, ΔNS3 protease is preincubated in the presence of RNA aptamer or tRNA, and this is added to a substrate (for example, chemically synthesized NS5A / 5B junction peptide) to carry out the reaction, and the substrate degradation product in the reaction mixture is removed. Measure production.
[0015]
By introducing the RNA of the present invention into a cell containing HCV, NS3 protease of HCV in the cell can be inhibited. For example, the NS3 protease of HCV can be inhibited by encapsulating the RNA of the present invention in a liposome, administering it to a living body, and incorporating it into cells containing HCV. Such a method is described in “Lipidic vector systems for gene transfer” (1997) R.A. J. et al. Lee and L.L. Huang Crit. Rev. Ther. Drug Carrier System 14, 173-206. It is described in. In addition, the DNA encoding the RNA of the present invention is incorporated into a vector such as a virus, introduced into a cell containing HCV, and the vector is expressed in the cell to produce the RNA of the present invention. NS3 protease can also be inhibited. Such a method is described in “Virtual vectors in gene therapy” (1997) A.A. E. Smith Annu. Rev. Microbiol 49, 807-838. It is described in. Details of these methods and the materials used in these methods are known in the field of gene therapy and they can also be used in the present invention.
[0016]
By inhibiting the NS3 protease of HCV, hepatitis C can be prevented and / or treated. Administration depends on the severity of the disease state and the responsiveness of the organism, but at an appropriate dose, administration method, and frequency over the period until the effectiveness of treatment is observed or the reduction of the disease state is achieved. Just do it.
Moreover, hepatitis C can be diagnosed using the RNA of the present invention. The RNA of the present invention can be used in place of an antibody. The RNA of the present invention is labeled with fluorescence or the like, mixed with an extract of cells infected with HCV or a crushed product, and filtered through a nitrocellulose membrane. If HCV is present in the cell, it can be trapped on the membrane and detected.
[0017]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. The scope of the present invention is not limited by these examples.
[Example 1]
Creation of RNA aptamer 1-1 protein, nucleic acid ΔNS3 protein used here was purified from E. coli HB101 by the method already reported (Vishunvardhan et al., 1997).
The N30 RNA pool used in the in vitro selection method has 5′-GGGAGAAUUCCCGACCAGAG- [N30] -CCUUUCCUCUCUCCUCUCCUCUCU-3 ′ (sequence in FIG. 3A, SEQ ID NO: 7). After synthesizing a template DNA corresponding to the RNA sequence shown in SEQ ID NO: 7 with an automatic DNA synthesizer, an equivalent amount of primer 2
5 'AGAAGAGGAAGGAGAGGAGGAAAGG 3' (SEQ ID NO: 8) was added to obtain double-stranded DNA by PCR.
Primer 1
5 'AGTAATACGACTCACTATAGGGAGAATTCCGACCAGAA3' (SEQ ID NO: 9) is added, and the double strand is amplified by PCR. Using this as a template, an N30 RNA pool was prepared by in vitro transcription reaction.
[0018]
1-2 In vitro selection method An N30 RNA pool (1 nmol) having a sequence of about 10 15 molecules and ΔNS3 protein (0.25 nmol) were mixed with 50 mM Tris-HCl (pH 7.7), 30 mM NaCl, Incubated in 5 mM CaCl 2 , 10 mM DTT (binding buffer) at room temperature for 1 hour. The mixture was filtered through a nitrocellulose membrane fixed to a poptop holder and washed with the above buffer. The RNA bound to ΔNS3 remaining on the filter was immersed in 200 μl of eluent (0.4 M sodium acetate, 5 mM EDTA, 7 M urea (PH5.5)), heated at 90 ° C. for 5 minutes, and released from the membrane and ΔNS3. Recovered by ethanol precipitation. CDNA was synthesized from the recovered RNA by AMV reverse transcriptase and further amplified by PCR. This was again used as a template for the RNA pool by in vitro transcription reaction and used for the next cycle of in vitro selection.
[0019]
This cycle was repeated 11 times. After measuring the binding activity of each RNA pool, the cDNA after cycle 9 was inserted into a TA cloning vector and cloned. Forty-five clones were selected, the plasmid was recovered from each clone by the alkaline method, and the DNA sequence was determined.
Table 1 shows the amount ratio of RNA and protein used in each selection cycle and the binding activity of the pool.
[0020]
[Table 1]
As a result of sequencing 45 clones, there were mainly 3 sequence families, G9-I (21), G9-II (5), G9-III (4) (FIG. 3B). All of them have a consensus sequence of 5′-GAXUGGGAC-3 ′ (X = A or U) (SEQ ID NO: 1), and the secondary structure shows that the consensus sequence forms a loop structure. Yes (sequence shown in bold in FIG. 4). Further, it was speculated that the remaining N30-derived sequence forms a stem structure by itself or together with the primer portion (sequence shown in italics in FIG. 4), and has a stem-rich secondary structure as a whole. The arrow in FIG. 4 indicates the boundary of the 3 ′ end of the aptamer having the binding activity to ΔNS3. Further,-in FIG. 4 indicates the formation of a base pair, and ● indicates the formation of a wobble base pair. Aptamers with this consensus sequence accounted for 80% of all clones that were sequenced.
[0021]
[Example 2]
Properties of aptamer to NS3 protease 2-1 Determination of aptamer binding activity and binding constant RNA of each cycle and RNA after cloning were labeled with 32 P. The mixture was mixed under the conditions of RNA / ΔNS3 / tRNA = 1/1/10 (0.1 μM / 0.1 μM / 1 μM), and the following was filtered through a nitrocellulose membrane in the same manner as in the in vitro selection method. The binding activity is expressed as the ratio of the amount of RNA that formed a complex remaining on the membrane to the amount of RNA mixed with ΔNS3.
The binding constant was determined by changing ΔNS3 from 0.15 μM to 1.5 μM in the presence of 32 P-labeled RNA (0.3 μM).
The binding activity of the three types of aptamers G9-I, G9-II and G9-III to the ΔNS3 protein was around 20% (Table 2).
[0022]
[Table 2]
In Table 2, ΔNS3-G9 * is the RNA pool after cycle 9 in in vitro selection.
The coupling constants were all 600 nM (FIG. 5). These results indicate that the consensus sequence is strongly involved in binding to the ΔNS3 protein.
[0023]
2-2 'to clarify the necessary area of the side, 5' 3 structural analysis RNA aptamers RNA aptamer 50mM sodium carbonate labeled RNA aptamer terminal (PH 9.2) in a buffer, carrier tRNA of 2.5μg In the presence, it was heated at 92 ° C. for 4.5 minutes to carry out a partial decomposition reaction with alkali. This reaction solution was mixed with ΔNS3, filtered through a nitrocellulose membrane, and RNA bound from the complex on the membrane was recovered and separated by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis. As markers, alkaline partial degradation products of RNA to which ΔNS3 was not added and limited degradation products by RNase T1, U2, and A were simultaneously run. When ΔNS3 was not added, it was separated by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis as it was after alkali partial decomposition by the above method.
As a result of analysis of the 3 ′ necessary region, it was found that the binding activity to the ΔNS3 protein was not lost even when all of the 3 ′ end region was removed from the 3 ′ end to 11 Nts (FIG. 6). In FIG. 6, − indicates the absence of ΔNS3 protein, + indicates the presence of ΔNS3 protein, and A, T1, and U2 indicate RNase T1, U2, and A, respectively.
[0024]
According to the method reported by measuring <br/> essentially Kakiuchi et al 2-3 delta NS3 protease inhibitory activity (Kakiuchi et al., 1995). 20 NS of Dnsyl-labeled NS5A / 5B border region Dns-GEAGD DIVPC / SMSYT WTGAL (/ cleaved by ΔNS3) (SEQ ID NO: 10) (86 μM) and ΔNS3 (0.75 μM) and RNA aptamer (3. 6 μM) was added and reacted at 25 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was separated by HPLC, and the amount of product produced from the synthetic substrate was measured by fluorescence (excitation: 310 nm, 510 nm: emission :) measurement. As a result, 90% or more of inhibition was observed in any aptamer (FIG. 7).
[0025]
Since NS3 protein is essential for the growth of HCV, several common inhibitors of serine proteases (such as tosyl lysyl chloromethyl ketone (TLCK)) have been tested as inhibitors of protease activity (Lin et al., 1992). ) As a result, these inhibitors were required at mM concentrations, but our aptamers were observed to be 90% or higher at concentrations below μM, indicating that they are highly active inhibitors. It was.
[0026]
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[0027]
【The invention's effect】
The RNA aptamer of the present invention can inhibit NS3 protease of hepatitis C virus. Therefore, the RNA aptamer of the present invention can be used for medicine.
[0028]
[Sequence Listing]
[0030]
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035]
[0036]
[0037]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a conceptual diagram of RNA aptamer creation.
FIG. 2 shows a conceptual diagram (A) of the structure of HCV polyprotein (the arrow indicates the site of cleavage by NS3 protease) and a schematic diagram (B) of the NS3 protease domain (ΔNS3).
FIG. 3 shows the sequence of the N30 RNA pool (A) and the sequence of the isolated aptamer (B).
FIG. 4 shows the secondary structure of the aptamer. Bold letters indicate consensus sequences, italics indicate primer binding sequences, and arrows indicate the boundaries of the 3 ′ end of RNA aptamers having binding activity to ΔNS3.
FIG. 5 is a diagram for obtaining a coupling constant.
FIG. 6 shows the analysis results of the 3 ′ boundary region of aptamers.
FIG. 7 shows the inhibitory activity of ΔNS3 protease by aptamers.
