JP3602135B2 - 抗体クラス特異的干渉除去剤 - Google Patents
抗体クラス特異的干渉除去剤 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3602135B2 JP3602135B2 JP51504496A JP51504496A JP3602135B2 JP 3602135 B2 JP3602135 B2 JP 3602135B2 JP 51504496 A JP51504496 A JP 51504496A JP 51504496 A JP51504496 A JP 51504496A JP 3602135 B2 JP3602135 B2 JP 3602135B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- immunoglobulin
- class
- antigen
- composition
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
- C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/55—Fab or Fab'
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/965—Chemistry: molecular biology and microbiology involving idiotype or anti-idiotype antibody
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/825—Pretreatment for removal of interfering factors from sample
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/827—Proteins from mammals or birds
- Y10S530/829—Blood
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/861—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgG3, IgG4, IgA, or IgY
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/862—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgE or IgD
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
- Y10S530/864—Monoclonal
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/863—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving IgM
- Y10S530/864—Monoclonal
- Y10S530/865—Human
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
本発明は、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される組成物に関し、これは、免疫グロブリンクラスＧ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥの一つまたはいくつかから抗体をクラス特異的に検出するための免疫学的方法における干渉を減少させるための試薬として適する。
哺乳類生物は、抗原に対して防御するために免疫系のＢ細胞によって形成される種々のクラスの抗体を含む。抗体分子は、各々、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖から成り、互いにジスルフィド架橋によって連結している、４本のポリペプチド鎖の１組または数組で構成されている。
抗体は一般に、Ｇ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥのクラスに分類される。これら５つの免疫グロブリンクラスは、そのＨ鎖が異なり、それぞれγ、μ、α、δおよびε鎖とよぶ。さらに、IgG、IgAおよびIgMの場合は免疫グロブリンサブクラスもある。
IgGクラスの抗体は、正常なヒト血清の全免疫グロブリンの70〜75％（８〜16mg/mlに相当）を構成し、主に、感染に対する生物の二次免疫応答として形成される。
IgMクラスの抗体は、ヒト血清に存在する免疫グロブリンの約10％を構成し、五量体構造を有する。この抗体は、感染後、非常に早く出現するので、その測定は、病気の初期検出に重要である。
IgAの免疫グロブリンは、ヒト血清に存在する免疫グロブリンの約15〜20％を形成し、唾液、乳および尿生殖領域の分泌物における最も重要な分泌免疫グロブリンである。
IgDクラスの抗体は、循環しているＢ細胞の膜上に位置し、自己免疫疾患において役割を果たしていると考えられる。
IgEクラスの抗体は、血清中に極少量でのみ存在するが、喘息および枯草熱などの多くのアレルギー反応において重要な役割を有する。
免疫グロブリンのクラス特異的測定、すなわち、特定の抗原に結合する選択された一つまたはいくつかの免疫グロブリンクラスまたはサブクラスの抗体の、同じ抗原に結合する他の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス抗体の存在下での選択的測定は、急性感染と治癒した感染との区別をし、予後を明確にするための、特定の病気の検出、例えば感染の初期診断に対して特に重要である。
免疫グロブリンのクラス特異的測定法は、公知である。これに対しては、選択された抗体クラス、例えば、ヒトIgMのμ鎖に対する抗体に対して特異的な免疫成分を固体担体に結合し、抗原に特異的な免疫グロブリン成分を、直接または間接的に標識した抗原との反応によって検出することができる。この種の方法の欠点は、各々の選択された免疫グロブリンクラスの抗原に非特異的な免疫グロブリンが、固相抗体に対して、抗原に特異的な分子と競合するということである。この結果、この量の割合に応じて、結果の歪曲が生じ得る。
従来の方法のさらに別の欠点は、サンプルを免疫成分と固体担体上でインキュベートした後および抗原に特異的な免疫成分との反応の前に洗浄工程が必要であることである。これは、誤差の原因となり得るものであり、試験時間をかなり増加させる。
欧州特許出願公告公報第0292810号は、サンプル液体中の免疫グロブリンクラスＭ、Ａ、ＤおよびＥの一つに由来する、抗原に特異的な抗体の測定法を開示しており、該方法では、抗−ヒトIgG、集合性ヒトもしくは動物IgG、またはγ−Fcフラグメントから選択されるIgGクラスの抗体による干渉を避けるために、干渉除去剤が添加される。干渉除去剤は、サンプルに存在する特異的IgG抗体の抗原結合を除去し、リウマチ因子の活性を抑制するためのものである。
しかし、干渉を除去するための欧州特許出願公告公報第0292810号による試薬にはいくつかの欠点がある。すなわち、不溶性免疫複合体が生じてサンプルを混濁させ、測定を妨害する可能性がある。特に、開示された試薬は、IgGの抗原結合部位を遮蔽しないので、たとえ沈降が生じても、抗原結合はまだ存在し、従って試験はさらに歪曲され得る。さらに、抗−ヒトIgG抗体を使用する場合は、試薬の濃度を正確に調整しなければならない。なぜならば、過剰にあると、沈殿の溶解が生じ得るからである。
本発明の目的は、従来の欠点を少なくとも実質的に回避することである。
この目的は、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される組成物を提供することによって達成され、該組成物は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスの一つまたはいくつかの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分に対して特異的であり、これらの免疫グロブリンの抗原結合能を少なくとも実質的に遮蔽する。
抗−Fd試薬は、抗原結合部位とヒンジ部との間（VH領域およびCH 1ドメイン；図１参照）にある、免疫グロブリンのＨ鎖の遮蔽すべき領域に結合する。結合部位は、好ましくは、免疫グロブリンのCH 1ドメインの定常部、すなわちＣαＨ １、ＣδＨ １、ＣεＨ １、ＣγＨ １およびＣμＨ １領域にある（"Kurzes Lehrbuch der Immunologie",I.M.Roitt;Thieme Verlag,Stuttgart,New York（1987）,chapter 5:"Antikorper:Strukture und Funktion",p.49 ff参照）。これらのドメインのアミノ酸配列は、例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版（1992）,US Department of Health and Human Services,USAに記載されている。
本発明に係る組成物の作用は、特に、Ｈ鎖のFd部分の種々の領域に結合するいくつかの異なる抗体または抗体フラグメントの存在により、関与する抗体の抗原結合の可能性を強く遮蔽して、もはや特異的結合相手、すなわち抗原を認識することができないようにすることである。
組成物は、Ｈ鎖のFd部分に対して特異的である。すなわち、Ｌ鎖、すなわちκまたはλ鎖のFd部分と反応することができる成分を実質的に含まない。免疫グロブリンのＬ鎖と最大交差反応性は、Ｈ鎖との反応性に対して好ましくは10-1、特に好ましくは10-2である。
本発明に係る抗体および／または抗体フラグメント組成物は、抗原結合能が好ましくは少なくとも50％、特に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％阻害されるように遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰に添加することができる。
本発明に従って使用される組成物は、好ましくは、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスから選択される第一の免疫グロブリンクラスに対して特異的であり、別の免疫グロブリンクラスとの最大交差反応性が第一の免疫グロブリンクラスに対する反応性に対して10-2、特に好ましくは10-3である。
本発明の好ましい態様では、抗体および／または抗体フラグメント組成物は、特にヒト免疫グロブリンＧにおける免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd部分に対して特異的である。この組成物は、IgGクラスの抗体の存在下、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスの一つまたはいくつかに由来する抗体のクラス特異的測定に適する。そのような組成物は、好ましくは、IgMなどの他の免疫グロブリンクラスとの最大交差反応性が、IgGに対する反応性に対して10-2、特に好ましくは10-3である。
本発明の別の好ましい態様は、IgMクラスの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分に対して特異的である組成物であり、例えば、IgGクラスの抗体の選択的なクラス特異的測定に対して使用することができる。
いくつかの用途に対しては、組成物がヒト免疫グロブリンに対して種特異的であり、ヒト以外の免疫グロブリンとの最大交差反応性が、ヒト免疫グロブリンに対する反応性に対して10-2、特に好ましくは10-3であるのが好ましい。
本発明に従って使用する組成物は、抗体および／または抗体フラグメントで構成される。組成物は、好ましくは、一価の抗体フラグメント、例えば、抗体のパパインによる酵素分解および分解産物のその後の分別によって得られるFabフラグメントで構成される。一価の抗体フラグメントで構成される組成物を使用すると、遮蔽された抗体の沈降が回避される。
本発明に係る組成物は、各々、免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分の異なる領域に対して特異的であるいくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される。組成物は、好ましくは、ポリクローナル抗体および／または抗体フラグメントで構成されるが、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、特に好ましくは少なくとも４つの異なるモノクローナル抗体および／または抗体フラグメントの混合物で構成することもできる。
本発明に係るポリクローナル抗体および／または抗体フラグメント組成物は、
（ａ）実験動物を第一の免疫グロブリンクラスからの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分を含む免疫原で免疫感作し；
（ｂ）ポリクローナル抗血清を実験動物から得て；
（ｃ）ポリクローナル抗血清を必要により、分解によって一価の抗体フラグメントに変換し；
（ｄ）抗血清または一価の抗体フラグメントを、第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分に対して特異的である抗体および／または抗体フラグメントの選択を可能にする一工程または数工程の免疫収着（immunosorption）に供し；そして
（ｅ）第一の免疫グロブリンクラスのFd部分に対する特異性を有する抗体または抗体フラグメント組成物を単離する；
方法によって得ることができる。
適する免疫原の使用を適する免疫収着工程の実行と組み合わせると、一つまたはいくつかの選択された免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分に対して特異的であり、好ましくは、他の免疫グロブリンクラスまたは選択されたクラスと全く異なる種に由来する免疫グロブリンとの交差反応性を本質的に持たない、抗体または抗体フラグメント組成物を単離することができる。免疫原としては、例えば、全抗体、Fab、Fab'もしくはＦ（ab）'2のような酵素分解により生じる抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントなどの抗体フラグメント、ペプチドエピトープあるいはそれらの混合物を使用することができる。抗体Fc成分を含まない免疫原の使用が好ましい。こうして、実験動物、例えばヒツジ、ウサギまたはマウスにおける抗−Fc抗体の生成を実質的に回避することができる。
本発明に係る方法の免疫収着工程は、好ましくは、（ｉ）第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分を含む抗原に対する少なくとも一つの正の（positive）免疫収着、および第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分を特異的に認識する組成物の結合成分の単離を含む。免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd部分、例えばFabフラグメントを含む免疫原を使用する場合は、抗血清または抗体フラグメントを、免疫グロブリンＧまたはFd部分を含むそのフラグメントに対する正の免疫収着に供する。全免疫グロブリンを免疫原として使用した場合は、Fcを含まない抗原、例えばFabフラグメントを正の免疫収着に使用するのが好ましい。
免疫収着工程は、好ましくは、さらに、（ii）第一の免疫グロブリンクラスとは異なる免疫グロブリンクラスから選択される抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の（negative）免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含む。この負の免疫収着は、実質的に、組成物の、Ｌ鎖のFd部分との交差反応性および他の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分との交差反応性を減少させる。免疫グロブリンＧのFd部分に対して特異的な組成物を作製するために、IgM、IgD、IgEおよび／またはIgAあるいはそれらの成分に対して負の免疫収着を行うことができる。IgGの存在下でのIgMの選択的測定のための干渉除去剤を作製しようとする場合は、IgMまたはその成分に対して一工程またはいくつかの工程の免疫収着を行う。
必要により、免疫収着工程はさらに、（iii）正の免疫収着工程（ｉ）における免疫グロブリンの種とは異なる種の第一の免疫グロブリンクラスから選択される抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含むことができる。この工程は、免疫グロブリンクラスは同じであるが、別の種に由来する検出抗体を使用するイムノアッセイにおいて組成物を後で使用すべき場合に行うと好ましい。好ましくは、正の免疫収着（ｉ）をヒト免疫グロブリンに対して行い、負の免疫収着（iii）をヒト以外の種、例えばマウスの免疫グロブリンに対して行う。ヒト免疫グロブリンＧのFd部分に対して特異的である組成物を作製する場合、負の免疫収着工程（iii）は、ヒト以外の種の免疫グロブリンＧに対して行う。
免疫収着工程は、好ましくは、各ケースで使用する抗原を固定化したカラム上での吸着クロマトグラフィーにより行う。精製した抗原調製物を得る方法および抗体または抗体フラグメントを担体物質上に固定化する方法は、当業者には周知である（例えば、欧州特許出願公開公報第0394819号の特に実施例７参照）。
本発明に係る抗体および／または抗体フラグメント組成物は、好ましくは、他のクラスの抗体によって引き起こされる干渉を抑制するために、IgG、IgM、IgA、IgDおよび／またはIgEクラスの抗体の選択的クラス特異的測定のためのイムノアッセイで使用することができる。これに対しては、特定の抗原、例えばウイルスまたは細菌の抗原に対する特定の免疫グロブリンクラス（例えば、IgM）の抗体のクラス特異的定量を行うために測定すべきヒト血清または血漿サンプルを、例えば、本発明に係るIgG−特異的組成物と、好ましくは前希釈工程の後に混合すると、サンプルに存在する特異的および非特異的IgGが本質的に完全に遮蔽され、続く免疫学的検出において、サンプル中のIgGではなくIgMのみが検出される。こうすると、別の抗体クラスの特異的部分による干渉を受けることなく、特定の抗体クラスの特異的部分の示差的定量が可能になる。本発明に係る組成物の使用により、洗浄工程を含まない一工程試験法が可能となる。
すなわち、本発明の目的は、また、他の免疫グロブリンクラスも含むサンプル液の選択された一つまたはいくつかの免疫グロブリンクラスに由来する特異的抗体の免疫学的検出法であり、該方法は、他の免疫グロブリンクラスによって引き起こされる干渉を抑制するためにサンプル液を本発明組成物とインキュベートし、次いで、サンプル液中の検出すべき選択されたクラスの抗体の有無および／または量を測定することを特徴とする。組成物は、好ましくは、サンプル液中に存在する他の免疫グロブリンクラス、すなわち選択されていない免疫グロブリンクラスの抗体と比較して活性成分が少なくとも５倍モル過剰である量で添加する。組成物は、好ましくは、10〜1000倍モル過剰に添加する。前インキュベーションの時間は、好ましくは５〜60分、特に好ましくは10〜30分である。
特異的抗体の測定のための免疫学的試験法は、反応性固相ならびに検出すべき抗体に結合可能な二つのレセプターR1およびR2（R1は、固相に結合し、または固相に結合可能であり、R2は、間接的または直接的に標識されている。）の存在下、不均一イムノアッセイの原理に従って行うと特に好ましい。検出すべき抗体は、次いで、必要により固相およびインキュベーション液を分離した後、固相および／またはインキュベーション液中の標識を測定することにより測定することができる。
検出すべき抗体と特異的に反応する抗原と固相結合基とのコンジュゲートは、固相レセプターR1として使用することができる。この場合、レセプターR2は、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原または選択した抗体クラスを認識する抗体、例えば抗−IgM抗体もしくは適切な抗体フラグメントのどちらであってもよい。レセプターR2は、直接的または間接的に標識することができる。すなわち、標識基に結合させることもできるし、標識基を有するさらに別のレセプターに結合させることもできる。
また、選択した抗体クラスを認識する抗体または適切な抗体フラグメントと固相結合基とのコンジュゲートを固相レセプターR1として使用することもできる。この場合は、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原を、標識したレセプターR2として使用する。
好ましくは、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相およびこの固相に結合し得るビオチニル化レセプターR1を使用する。発色団物質、放射性同位体、酵素、NMR−標識またはその分野で現在知られている他のあらゆる標識を標識として使用することができる。好ましくは発光金属複合体が使用され、標識は、電気化学発光によって測定することができる。発光金属複合体ならびに電気化学発光測定の方法および装置は、欧州特許出願公開公報第0199804号、欧州特許出願公開公報第0580979号、国際公開公報第87/06706号、国際公開公報第90/05301号、国際公開公報第90/11511号および国際公開公報第92/14138号に記載されており、それらの開示は本明細書で引用する。酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）は別の好ましい標識であり、標識は、各々の酵素反応の検出によって測定することができる。
本発明のさらに別の目的は、本発明の組成物を含む一つまたはいくつかの選択した免疫グロブリンクラスに由来する特異的抗体の選択的免疫学的検出のための試薬である。
本発明は、下記実施例および図面によってさらに説明する。
図１は、Ｈ鎖のFd部分に対するFabフラグメント（＜ｈ−Fdγ＞Fab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への結合を示す。
図２は、実施例４で行った電気化学発光による抗−HBc IgMのクラス特異的検出の試験原理を示す。
図３は、抗−HBc IgMの電気化学発光によるクラス特異的検出の別の試験原理を示す。
実施例１
本発明に係る試薬の調製
1.1 免疫原の作製
免疫グロブリンＧ画分を標準的常法によってヒト血清から精製する。この精製は、例えば、アエロシル脱脂、硫酸アンモニウムによる沈殿、DEAE−セファロースFFによるクロマトグラフィーおよび必要により固定化IgG−特異的ポリクローナル抗体上での免疫収着によって行うことができる。
このようにして精製した免疫グロブリン画分は、パパインによってFabおよびFcフラグメントに分解する。分解は、好ましくは、pH7、37℃で、IgG濃度を10mg/mlとし、40mU/mlのパパイン、７および10ミリモル/lのシステインにより行う。Fab部分は、Fc部分をDEAE−セファロースFFクロマトグラフィーおよびゲルクロマトグラフィー（例えば、セファクリルTSK S200およびS300）により除去して精製する。Fabフラグメントは、好ましくは、免疫反応を高めるために、担体タンパク質、例えばマレイミド−活性化キーホールリンペットヘモシアニン（Boehringer Mannheim,Biochemicaカタログ、注文No.1376438）に結合させる。この場合、Fabフラグメントは、最初に、1:6のモル比でＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（SATP）により活性化する。担体タンパク質は、活性化Fabフラグメントと1:1のモル比で結合させる。
他の免疫グロブリンクラスのFabフラグメント（例えば、Fabμ）は、対応する方法で作製することができる。
1.2 ヒツジの免疫感作
ヒツジを、実施例１で作製した免疫原を使用して、標準的方法により免疫感作する。これらのヒツジは、免疫反応において、ヒトFabに対するポリクローナル抗体を形成し、これはヒトFabのＬ鎖部分およびＨ鎖部分に結合するものである。
免疫感作したヒツジから粗血清を取り出し、これからIgG画分をすでに記載されている方法により単離する。
1.3 Fd−特異的試薬の作製
ヒツジの免疫グロブリンＧ画分を、パパインによってタンパク質分解的に分解する。Fabフラグメントを他の分解産物から、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離する。
Ｈ鎖のFd部分に結合する成分を、いくつかの免疫収着工程によって、ヒツジの全Fab画分から精製する。
ヒトIgGのＬ鎖（κまたはλ）に対して特異的に結合する成分は、IgGおよびIgMのＬ鎖の定常部が相同であるので、その上にヒトIgMを固定化した免疫吸着剤に必要により数回通すことにより除去することができる。Ｌ鎖に結合する成分はカラムに吸着されるが、Ｈ鎖のFd部分に結合する成分はカラム溶離液中にある。ポリクローナルIgMを結合させたスフェロシルカラムをカラムとして使用する。使用する緩衝液は、例えば、PBS/アジド（50ミリモル/lのリン酸カリウム、pH7.5;150ミリモル/lのNaCl;0.1％のアジ化ナトリウム）である。
IgMカラムからの非結合画分をプールし、ヒトIgGを固定化した別の免疫吸着剤に、必要により数回繰り返して通した。抗−FdヒツジFabの特異的画分を、非特異的ヒツジFab画分からこのカラム上で分離することができる。Fd−特異的ヒツジFabはこのカラムに結合し、溶離緩衝液、例えば１モル/lのプロピオン酸によって溶離することができる。他の成分は結合しないで、適する緩衝液（例えば、PBS/アジド）によるカラムの洗浄により除去される。
さらに、免疫学的試験で結合相手として通常使用されるマウス抗体との干渉交差反応性は、固定化マウスIgGを含む免疫吸着剤にさらに通すことにより除くことができる。調製物の所望成分は、カラム溶離液中にある。
ヒトFdγに対して特異的なFabフラグメント（＜ｈ−Fdγ＞Fab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への結合を図１に図式的に示す。各ケースでのｈ−IgGの抗原結合部位は矢印で示す。
実施例２
試薬の純度の試験
Nunc Co.製のマイクロタイタープレート（MTP）を、固相または捕獲抗体としてのヒツジFab−特異的ウサギIgGで被覆した（10μg/mlのウサギIgG、炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6、PBS緩衝液に溶解した１％のウシ血清アルブミンで再被覆）。分析すべき試薬を、精製したヒトFabγフラグメントまたはヒトFabμフラグメントの調製物の各ケースで濃度を増加（例えば、０〜10μg/ml）させるサンプルとして前インキュベートし、次いで、被覆MTPに移した（サンプル体積200μｌ、室温で２時間インキュベート、緩衝液は１％のウシ血清アルブミンを含むPBS）。
ヒトFdγに対して特異的であるサンプルのヒツジFab成分は、存在する可能性のある不純物と同様に、固相に結合する。それらは、免疫グロブリンのＬ鎖に結合し、精製中に完全に分離されなかったと考えられる。非結合成分は、PBS緩衝液で３回洗浄することにより除去される。
ヒトFabγに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（200μｌ、50mU/ml）を検出試薬として使用する。PBS緩衝液で３回洗浄した後、結合したペルオキシダーゼコンジュゲートの酵素活性を、室温で１時間、基質ABTS（登録商標）とともにインキュベートすることにより引き出し、次いで、405nmで光度測定により測定した。予め固相に結合させたサンプルのヒツジFab成分のうち、ヒトFabに結合する成分のみが酵素マーカーコンジュゲートにより検出される。その結果、FabμおよびFabγを添加していない対照において、1000〜3000mAの正の信号が得られる。これは、試験すべき調製物中に存在する、ヒトFabに結合するヒツジFabの総量に相当する。ヒトFabγの添加量を多くしていったサンプルでは、Fdγ−特異的ヒツジFabの遮蔽により、コンジュゲートの排除が増加し、従って、測定される信号曲線は、０またはブランク値に向かう傾向を有する。これに対して、増加する量のヒトFabμを混合したサンプルでは、Ｌ鎖に結合するヒツジFab成分のみが遮蔽されるので、この場合、信号の減少は、所望でない成分がヒツジFab調製物になおも存在している場合にのみ起こる。後者の場合は、二つの排除曲線の相違が、調製物中のFdγ−特異的ヒツジFabの実際の量に相当する。
ヒトFabμまたはFabγを添加していないサンプルの測定により、1600mAの吸光度が得られる。サンプル＋Fabμでは、1500mAの吸光度が得られる。サンプル＋Fabγでは、150mAの吸光度が得られる。
実施例３
酵素イムノアッセイにおけるFd−特異的干渉除去剤の使用
実施例１で調製した抗−Fdγ抗体フラグメント調製物の機能性を調べるために、Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（HBc抗原）に結合する抗体（＜HBc＞）を含むヒト血清サンプルに抗−Fdγを添加した。次いで、HBc抗原を添加し、インキュベートした。抗−HBc−特異的IgGは、このとき、抗−Fdγによって遮蔽されていないならば、この抗原と反応し得る。次いで、過剰のIgG（HBc抗原に対して特異的および非特異的）を洗浄により分離した。HBc抗原に結合したIgGは、このとき、IgGのFcγ部分に結合する、ペルオキシダーゼ標識抗−IgGによって検出され得る。
試験手順は次の通りであった。
抗−HBc IgGを含むサンプルを種々の量の抗−Fdγと混合し、室温で30分間インキュベートした。次いで、サンプルを40ミリモル/lのリン酸塩緩衝液、pH7.4でさらに1:100に希釈した。
ストレプトアビジンで被覆した試験容器において、20μｌの希釈サンプルを500μｌのビオチニル化HBc抗原溶液（Enzymuntest（登録商標）抗−HBcの10μg/ml）に添加し、10分間インキュベートした。次いで、ペルオキシダーゼと抗−IgG抗体との500μｌのコンジュゲート（Enzymuntest（登録商標）抗−HCVの50mU/ml）を添加し、60分間インキュベートして、洗浄した。次いで、1000μｌの基質溶液（H2O2（過ホウ素酸ナトリウム）、Enzymuntest（登録商標）抗−HCVの3.2ミリモル/l）を添加し、60分間インキュベートした。最後に、ES600分析機（Boehringer Mannheim GmbH）で吸光度を測定した。
この実験の結果を表１に示す。明らかに、本発明の抗−Fdγ組成物は、IgGの抗原結合能を、もはや結合できない程度に変えることが分かる。
（本頁以下余白）
実施例４
電気化学発光による抗−HBc IgMのクラス特異的検出
装置は、国際公開公報第90/05302号に記載された測定に対するものを使用した。試験原理は、図２に示すが、ヒトIgGに特異的なビオチニル化抗体（＜Ｈ−IgM＞Bi）およびルテニウム複合体で直接標識したHBc抗原（HBc−Ru）の使用に基づく。あるいは、（ルテニル化抗−HBc抗体を結合させることにより）間接的に標識したHBc抗原の使用も可能である。HBc抗原または抗体に結合するために使用されるルテニウム複合体および技術は、欧州特許出願公開公報第0199804号に記載されている。
さらに別の試験原理を図３に示す。それは、ビオチニル化HBc抗原（HBc−Bi）およびルテニウム標識化HBc抗原（HBc−Ru）の使用に基づく。
手順は次の通りであった。
1000μg/mlの抗−Fdγを含む、または含まない非特異的ヒトIgM（11μg/ml）の溶液90μｌを10μｌの:100に前希釈したサンプルまたは標準物質と混合し、37℃で９分間インキュベートした。
次いで、ルテニウム標識化HBc抗原およびビオチニル化抗−ヒトIgM抗体（IgG）を含む100μｌの溶液、ならびに50μｌのストレプトアビジン−被覆磁気粒子（Dynal Co.）を添加した。次いで、その混合物を37℃でさらに９分間インキュベートした後、アッセイ緩衝液（200ミリモル/lのリン酸塩、pH6.8、0.1％のポリドカノール、0.1％のOxabon A、160ミリモル/lのトリプロピルアミン）とともに、28℃に温度調節した測定セルに移し、そこで測定した。
次いで，サンプル中のIgM濃度を検量線に基づいて求めた。濃度に関する結果を表２に示す。
表から分かるように、サンプルにおいて測定されたIgM濃度は、抗−Fdγの添加により増加し、その結果、enzymun系（洗浄工程により、IgG干渉が生じない場合）で測定されるIgM濃度範囲が影響を受ける。
注：サンプル１〜４は、各々、6000、12000、6900および4500U/mlのHBc−特異的IgGを含む。すなわち、かなり過剰である。IgGによって引き起こされる干渉は、Fdγの添加により除去される。
哺乳類生物は、抗原に対して防御するために免疫系のＢ細胞によって形成される種々のクラスの抗体を含む。抗体分子は、各々、２本のＨ鎖および２本のＬ鎖から成り、互いにジスルフィド架橋によって連結している、４本のポリペプチド鎖の１組または数組で構成されている。
抗体は一般に、Ｇ、Ｍ、Ａ、ＤおよびＥのクラスに分類される。これら５つの免疫グロブリンクラスは、そのＨ鎖が異なり、それぞれγ、μ、α、δおよびε鎖とよぶ。さらに、IgG、IgAおよびIgMの場合は免疫グロブリンサブクラスもある。
IgGクラスの抗体は、正常なヒト血清の全免疫グロブリンの70〜75％（８〜16mg/mlに相当）を構成し、主に、感染に対する生物の二次免疫応答として形成される。
IgMクラスの抗体は、ヒト血清に存在する免疫グロブリンの約10％を構成し、五量体構造を有する。この抗体は、感染後、非常に早く出現するので、その測定は、病気の初期検出に重要である。
IgAの免疫グロブリンは、ヒト血清に存在する免疫グロブリンの約15〜20％を形成し、唾液、乳および尿生殖領域の分泌物における最も重要な分泌免疫グロブリンである。
IgDクラスの抗体は、循環しているＢ細胞の膜上に位置し、自己免疫疾患において役割を果たしていると考えられる。
IgEクラスの抗体は、血清中に極少量でのみ存在するが、喘息および枯草熱などの多くのアレルギー反応において重要な役割を有する。
免疫グロブリンのクラス特異的測定、すなわち、特定の抗原に結合する選択された一つまたはいくつかの免疫グロブリンクラスまたはサブクラスの抗体の、同じ抗原に結合する他の免疫グロブリンクラスまたはサブクラス抗体の存在下での選択的測定は、急性感染と治癒した感染との区別をし、予後を明確にするための、特定の病気の検出、例えば感染の初期診断に対して特に重要である。
免疫グロブリンのクラス特異的測定法は、公知である。これに対しては、選択された抗体クラス、例えば、ヒトIgMのμ鎖に対する抗体に対して特異的な免疫成分を固体担体に結合し、抗原に特異的な免疫グロブリン成分を、直接または間接的に標識した抗原との反応によって検出することができる。この種の方法の欠点は、各々の選択された免疫グロブリンクラスの抗原に非特異的な免疫グロブリンが、固相抗体に対して、抗原に特異的な分子と競合するということである。この結果、この量の割合に応じて、結果の歪曲が生じ得る。
従来の方法のさらに別の欠点は、サンプルを免疫成分と固体担体上でインキュベートした後および抗原に特異的な免疫成分との反応の前に洗浄工程が必要であることである。これは、誤差の原因となり得るものであり、試験時間をかなり増加させる。
欧州特許出願公告公報第0292810号は、サンプル液体中の免疫グロブリンクラスＭ、Ａ、ＤおよびＥの一つに由来する、抗原に特異的な抗体の測定法を開示しており、該方法では、抗−ヒトIgG、集合性ヒトもしくは動物IgG、またはγ−Fcフラグメントから選択されるIgGクラスの抗体による干渉を避けるために、干渉除去剤が添加される。干渉除去剤は、サンプルに存在する特異的IgG抗体の抗原結合を除去し、リウマチ因子の活性を抑制するためのものである。
しかし、干渉を除去するための欧州特許出願公告公報第0292810号による試薬にはいくつかの欠点がある。すなわち、不溶性免疫複合体が生じてサンプルを混濁させ、測定を妨害する可能性がある。特に、開示された試薬は、IgGの抗原結合部位を遮蔽しないので、たとえ沈降が生じても、抗原結合はまだ存在し、従って試験はさらに歪曲され得る。さらに、抗−ヒトIgG抗体を使用する場合は、試薬の濃度を正確に調整しなければならない。なぜならば、過剰にあると、沈殿の溶解が生じ得るからである。
本発明の目的は、従来の欠点を少なくとも実質的に回避することである。
この目的は、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される組成物を提供することによって達成され、該組成物は、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスの一つまたはいくつかの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分に対して特異的であり、これらの免疫グロブリンの抗原結合能を少なくとも実質的に遮蔽する。
抗−Fd試薬は、抗原結合部位とヒンジ部との間（VH領域およびCH 1ドメイン；図１参照）にある、免疫グロブリンのＨ鎖の遮蔽すべき領域に結合する。結合部位は、好ましくは、免疫グロブリンのCH 1ドメインの定常部、すなわちＣαＨ １、ＣδＨ １、ＣεＨ １、ＣγＨ １およびＣμＨ １領域にある（"Kurzes Lehrbuch der Immunologie",I.M.Roitt;Thieme Verlag,Stuttgart,New York（1987）,chapter 5:"Antikorper:Strukture und Funktion",p.49 ff参照）。これらのドメインのアミノ酸配列は、例えば、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest,第５版（1992）,US Department of Health and Human Services,USAに記載されている。
本発明に係る組成物の作用は、特に、Ｈ鎖のFd部分の種々の領域に結合するいくつかの異なる抗体または抗体フラグメントの存在により、関与する抗体の抗原結合の可能性を強く遮蔽して、もはや特異的結合相手、すなわち抗原を認識することができないようにすることである。
組成物は、Ｈ鎖のFd部分に対して特異的である。すなわち、Ｌ鎖、すなわちκまたはλ鎖のFd部分と反応することができる成分を実質的に含まない。免疫グロブリンのＬ鎖と最大交差反応性は、Ｈ鎖との反応性に対して好ましくは10-1、特に好ましくは10-2である。
本発明に係る抗体および／または抗体フラグメント組成物は、抗原結合能が好ましくは少なくとも50％、特に好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％阻害されるように遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰に添加することができる。
本発明に従って使用される組成物は、好ましくは、IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスから選択される第一の免疫グロブリンクラスに対して特異的であり、別の免疫グロブリンクラスとの最大交差反応性が第一の免疫グロブリンクラスに対する反応性に対して10-2、特に好ましくは10-3である。
本発明の好ましい態様では、抗体および／または抗体フラグメント組成物は、特にヒト免疫グロブリンＧにおける免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd部分に対して特異的である。この組成物は、IgGクラスの抗体の存在下、IgM、IgA、IgDおよびIgEクラスの一つまたはいくつかに由来する抗体のクラス特異的測定に適する。そのような組成物は、好ましくは、IgMなどの他の免疫グロブリンクラスとの最大交差反応性が、IgGに対する反応性に対して10-2、特に好ましくは10-3である。
本発明の別の好ましい態様は、IgMクラスの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分に対して特異的である組成物であり、例えば、IgGクラスの抗体の選択的なクラス特異的測定に対して使用することができる。
いくつかの用途に対しては、組成物がヒト免疫グロブリンに対して種特異的であり、ヒト以外の免疫グロブリンとの最大交差反応性が、ヒト免疫グロブリンに対する反応性に対して10-2、特に好ましくは10-3であるのが好ましい。
本発明に従って使用する組成物は、抗体および／または抗体フラグメントで構成される。組成物は、好ましくは、一価の抗体フラグメント、例えば、抗体のパパインによる酵素分解および分解産物のその後の分別によって得られるFabフラグメントで構成される。一価の抗体フラグメントで構成される組成物を使用すると、遮蔽された抗体の沈降が回避される。
本発明に係る組成物は、各々、免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分の異なる領域に対して特異的であるいくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される。組成物は、好ましくは、ポリクローナル抗体および／または抗体フラグメントで構成されるが、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、特に好ましくは少なくとも４つの異なるモノクローナル抗体および／または抗体フラグメントの混合物で構成することもできる。
本発明に係るポリクローナル抗体および／または抗体フラグメント組成物は、
（ａ）実験動物を第一の免疫グロブリンクラスからの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分を含む免疫原で免疫感作し；
（ｂ）ポリクローナル抗血清を実験動物から得て；
（ｃ）ポリクローナル抗血清を必要により、分解によって一価の抗体フラグメントに変換し；
（ｄ）抗血清または一価の抗体フラグメントを、第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分に対して特異的である抗体および／または抗体フラグメントの選択を可能にする一工程または数工程の免疫収着（immunosorption）に供し；そして
（ｅ）第一の免疫グロブリンクラスのFd部分に対する特異性を有する抗体または抗体フラグメント組成物を単離する；
方法によって得ることができる。
適する免疫原の使用を適する免疫収着工程の実行と組み合わせると、一つまたはいくつかの選択された免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分に対して特異的であり、好ましくは、他の免疫グロブリンクラスまたは選択されたクラスと全く異なる種に由来する免疫グロブリンとの交差反応性を本質的に持たない、抗体または抗体フラグメント組成物を単離することができる。免疫原としては、例えば、全抗体、Fab、Fab'もしくはＦ（ab）'2のような酵素分解により生じる抗体フラグメントまたは組換え抗体フラグメントなどの抗体フラグメント、ペプチドエピトープあるいはそれらの混合物を使用することができる。抗体Fc成分を含まない免疫原の使用が好ましい。こうして、実験動物、例えばヒツジ、ウサギまたはマウスにおける抗−Fc抗体の生成を実質的に回避することができる。
本発明に係る方法の免疫収着工程は、好ましくは、（ｉ）第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分を含む抗原に対する少なくとも一つの正の（positive）免疫収着、および第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分を特異的に認識する組成物の結合成分の単離を含む。免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd部分、例えばFabフラグメントを含む免疫原を使用する場合は、抗血清または抗体フラグメントを、免疫グロブリンＧまたはFd部分を含むそのフラグメントに対する正の免疫収着に供する。全免疫グロブリンを免疫原として使用した場合は、Fcを含まない抗原、例えばFabフラグメントを正の免疫収着に使用するのが好ましい。
免疫収着工程は、好ましくは、さらに、（ii）第一の免疫グロブリンクラスとは異なる免疫グロブリンクラスから選択される抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の（negative）免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含む。この負の免疫収着は、実質的に、組成物の、Ｌ鎖のFd部分との交差反応性および他の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分との交差反応性を減少させる。免疫グロブリンＧのFd部分に対して特異的な組成物を作製するために、IgM、IgD、IgEおよび／またはIgAあるいはそれらの成分に対して負の免疫収着を行うことができる。IgGの存在下でのIgMの選択的測定のための干渉除去剤を作製しようとする場合は、IgMまたはその成分に対して一工程またはいくつかの工程の免疫収着を行う。
必要により、免疫収着工程はさらに、（iii）正の免疫収着工程（ｉ）における免疫グロブリンの種とは異なる種の第一の免疫グロブリンクラスから選択される抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含むことができる。この工程は、免疫グロブリンクラスは同じであるが、別の種に由来する検出抗体を使用するイムノアッセイにおいて組成物を後で使用すべき場合に行うと好ましい。好ましくは、正の免疫収着（ｉ）をヒト免疫グロブリンに対して行い、負の免疫収着（iii）をヒト以外の種、例えばマウスの免疫グロブリンに対して行う。ヒト免疫グロブリンＧのFd部分に対して特異的である組成物を作製する場合、負の免疫収着工程（iii）は、ヒト以外の種の免疫グロブリンＧに対して行う。
免疫収着工程は、好ましくは、各ケースで使用する抗原を固定化したカラム上での吸着クロマトグラフィーにより行う。精製した抗原調製物を得る方法および抗体または抗体フラグメントを担体物質上に固定化する方法は、当業者には周知である（例えば、欧州特許出願公開公報第0394819号の特に実施例７参照）。
本発明に係る抗体および／または抗体フラグメント組成物は、好ましくは、他のクラスの抗体によって引き起こされる干渉を抑制するために、IgG、IgM、IgA、IgDおよび／またはIgEクラスの抗体の選択的クラス特異的測定のためのイムノアッセイで使用することができる。これに対しては、特定の抗原、例えばウイルスまたは細菌の抗原に対する特定の免疫グロブリンクラス（例えば、IgM）の抗体のクラス特異的定量を行うために測定すべきヒト血清または血漿サンプルを、例えば、本発明に係るIgG−特異的組成物と、好ましくは前希釈工程の後に混合すると、サンプルに存在する特異的および非特異的IgGが本質的に完全に遮蔽され、続く免疫学的検出において、サンプル中のIgGではなくIgMのみが検出される。こうすると、別の抗体クラスの特異的部分による干渉を受けることなく、特定の抗体クラスの特異的部分の示差的定量が可能になる。本発明に係る組成物の使用により、洗浄工程を含まない一工程試験法が可能となる。
すなわち、本発明の目的は、また、他の免疫グロブリンクラスも含むサンプル液の選択された一つまたはいくつかの免疫グロブリンクラスに由来する特異的抗体の免疫学的検出法であり、該方法は、他の免疫グロブリンクラスによって引き起こされる干渉を抑制するためにサンプル液を本発明組成物とインキュベートし、次いで、サンプル液中の検出すべき選択されたクラスの抗体の有無および／または量を測定することを特徴とする。組成物は、好ましくは、サンプル液中に存在する他の免疫グロブリンクラス、すなわち選択されていない免疫グロブリンクラスの抗体と比較して活性成分が少なくとも５倍モル過剰である量で添加する。組成物は、好ましくは、10〜1000倍モル過剰に添加する。前インキュベーションの時間は、好ましくは５〜60分、特に好ましくは10〜30分である。
特異的抗体の測定のための免疫学的試験法は、反応性固相ならびに検出すべき抗体に結合可能な二つのレセプターR1およびR2（R1は、固相に結合し、または固相に結合可能であり、R2は、間接的または直接的に標識されている。）の存在下、不均一イムノアッセイの原理に従って行うと特に好ましい。検出すべき抗体は、次いで、必要により固相およびインキュベーション液を分離した後、固相および／またはインキュベーション液中の標識を測定することにより測定することができる。
検出すべき抗体と特異的に反応する抗原と固相結合基とのコンジュゲートは、固相レセプターR1として使用することができる。この場合、レセプターR2は、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原または選択した抗体クラスを認識する抗体、例えば抗−IgM抗体もしくは適切な抗体フラグメントのどちらであってもよい。レセプターR2は、直接的または間接的に標識することができる。すなわち、標識基に結合させることもできるし、標識基を有するさらに別のレセプターに結合させることもできる。
また、選択した抗体クラスを認識する抗体または適切な抗体フラグメントと固相結合基とのコンジュゲートを固相レセプターR1として使用することもできる。この場合は、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原を、標識したレセプターR2として使用する。
好ましくは、ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した固相およびこの固相に結合し得るビオチニル化レセプターR1を使用する。発色団物質、放射性同位体、酵素、NMR−標識またはその分野で現在知られている他のあらゆる標識を標識として使用することができる。好ましくは発光金属複合体が使用され、標識は、電気化学発光によって測定することができる。発光金属複合体ならびに電気化学発光測定の方法および装置は、欧州特許出願公開公報第0199804号、欧州特許出願公開公報第0580979号、国際公開公報第87/06706号、国際公開公報第90/05301号、国際公開公報第90/11511号および国際公開公報第92/14138号に記載されており、それらの開示は本明細書で引用する。酵素（例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはβ−ガラクトシダーゼ）は別の好ましい標識であり、標識は、各々の酵素反応の検出によって測定することができる。
本発明のさらに別の目的は、本発明の組成物を含む一つまたはいくつかの選択した免疫グロブリンクラスに由来する特異的抗体の選択的免疫学的検出のための試薬である。
本発明は、下記実施例および図面によってさらに説明する。
図１は、Ｈ鎖のFd部分に対するFabフラグメント（＜ｈ−Fdγ＞Fab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への結合を示す。
図２は、実施例４で行った電気化学発光による抗−HBc IgMのクラス特異的検出の試験原理を示す。
図３は、抗−HBc IgMの電気化学発光によるクラス特異的検出の別の試験原理を示す。
実施例１
本発明に係る試薬の調製
1.1 免疫原の作製
免疫グロブリンＧ画分を標準的常法によってヒト血清から精製する。この精製は、例えば、アエロシル脱脂、硫酸アンモニウムによる沈殿、DEAE−セファロースFFによるクロマトグラフィーおよび必要により固定化IgG−特異的ポリクローナル抗体上での免疫収着によって行うことができる。
このようにして精製した免疫グロブリン画分は、パパインによってFabおよびFcフラグメントに分解する。分解は、好ましくは、pH7、37℃で、IgG濃度を10mg/mlとし、40mU/mlのパパイン、７および10ミリモル/lのシステインにより行う。Fab部分は、Fc部分をDEAE−セファロースFFクロマトグラフィーおよびゲルクロマトグラフィー（例えば、セファクリルTSK S200およびS300）により除去して精製する。Fabフラグメントは、好ましくは、免疫反応を高めるために、担体タンパク質、例えばマレイミド−活性化キーホールリンペットヘモシアニン（Boehringer Mannheim,Biochemicaカタログ、注文No.1376438）に結合させる。この場合、Fabフラグメントは、最初に、1:6のモル比でＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネート（SATP）により活性化する。担体タンパク質は、活性化Fabフラグメントと1:1のモル比で結合させる。
他の免疫グロブリンクラスのFabフラグメント（例えば、Fabμ）は、対応する方法で作製することができる。
1.2 ヒツジの免疫感作
ヒツジを、実施例１で作製した免疫原を使用して、標準的方法により免疫感作する。これらのヒツジは、免疫反応において、ヒトFabに対するポリクローナル抗体を形成し、これはヒトFabのＬ鎖部分およびＨ鎖部分に結合するものである。
免疫感作したヒツジから粗血清を取り出し、これからIgG画分をすでに記載されている方法により単離する。
1.3 Fd−特異的試薬の作製
ヒツジの免疫グロブリンＧ画分を、パパインによってタンパク質分解的に分解する。Fabフラグメントを他の分解産物から、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーにより分離する。
Ｈ鎖のFd部分に結合する成分を、いくつかの免疫収着工程によって、ヒツジの全Fab画分から精製する。
ヒトIgGのＬ鎖（κまたはλ）に対して特異的に結合する成分は、IgGおよびIgMのＬ鎖の定常部が相同であるので、その上にヒトIgMを固定化した免疫吸着剤に必要により数回通すことにより除去することができる。Ｌ鎖に結合する成分はカラムに吸着されるが、Ｈ鎖のFd部分に結合する成分はカラム溶離液中にある。ポリクローナルIgMを結合させたスフェロシルカラムをカラムとして使用する。使用する緩衝液は、例えば、PBS/アジド（50ミリモル/lのリン酸カリウム、pH7.5;150ミリモル/lのNaCl;0.1％のアジ化ナトリウム）である。
IgMカラムからの非結合画分をプールし、ヒトIgGを固定化した別の免疫吸着剤に、必要により数回繰り返して通した。抗−FdヒツジFabの特異的画分を、非特異的ヒツジFab画分からこのカラム上で分離することができる。Fd−特異的ヒツジFabはこのカラムに結合し、溶離緩衝液、例えば１モル/lのプロピオン酸によって溶離することができる。他の成分は結合しないで、適する緩衝液（例えば、PBS/アジド）によるカラムの洗浄により除去される。
さらに、免疫学的試験で結合相手として通常使用されるマウス抗体との干渉交差反応性は、固定化マウスIgGを含む免疫吸着剤にさらに通すことにより除くことができる。調製物の所望成分は、カラム溶離液中にある。
ヒトFdγに対して特異的なFabフラグメント（＜ｈ−Fdγ＞Fab）のヒトIgG（ｈ−IgG）への結合を図１に図式的に示す。各ケースでのｈ−IgGの抗原結合部位は矢印で示す。
実施例２
試薬の純度の試験
Nunc Co.製のマイクロタイタープレート（MTP）を、固相または捕獲抗体としてのヒツジFab−特異的ウサギIgGで被覆した（10μg/mlのウサギIgG、炭酸ナトリウム緩衝液、pH9.6、PBS緩衝液に溶解した１％のウシ血清アルブミンで再被覆）。分析すべき試薬を、精製したヒトFabγフラグメントまたはヒトFabμフラグメントの調製物の各ケースで濃度を増加（例えば、０〜10μg/ml）させるサンプルとして前インキュベートし、次いで、被覆MTPに移した（サンプル体積200μｌ、室温で２時間インキュベート、緩衝液は１％のウシ血清アルブミンを含むPBS）。
ヒトFdγに対して特異的であるサンプルのヒツジFab成分は、存在する可能性のある不純物と同様に、固相に結合する。それらは、免疫グロブリンのＬ鎖に結合し、精製中に完全に分離されなかったと考えられる。非結合成分は、PBS緩衝液で３回洗浄することにより除去される。
ヒトFabγに結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（200μｌ、50mU/ml）を検出試薬として使用する。PBS緩衝液で３回洗浄した後、結合したペルオキシダーゼコンジュゲートの酵素活性を、室温で１時間、基質ABTS（登録商標）とともにインキュベートすることにより引き出し、次いで、405nmで光度測定により測定した。予め固相に結合させたサンプルのヒツジFab成分のうち、ヒトFabに結合する成分のみが酵素マーカーコンジュゲートにより検出される。その結果、FabμおよびFabγを添加していない対照において、1000〜3000mAの正の信号が得られる。これは、試験すべき調製物中に存在する、ヒトFabに結合するヒツジFabの総量に相当する。ヒトFabγの添加量を多くしていったサンプルでは、Fdγ−特異的ヒツジFabの遮蔽により、コンジュゲートの排除が増加し、従って、測定される信号曲線は、０またはブランク値に向かう傾向を有する。これに対して、増加する量のヒトFabμを混合したサンプルでは、Ｌ鎖に結合するヒツジFab成分のみが遮蔽されるので、この場合、信号の減少は、所望でない成分がヒツジFab調製物になおも存在している場合にのみ起こる。後者の場合は、二つの排除曲線の相違が、調製物中のFdγ−特異的ヒツジFabの実際の量に相当する。
ヒトFabμまたはFabγを添加していないサンプルの測定により、1600mAの吸光度が得られる。サンプル＋Fabμでは、1500mAの吸光度が得られる。サンプル＋Fabγでは、150mAの吸光度が得られる。
実施例３
酵素イムノアッセイにおけるFd−特異的干渉除去剤の使用
実施例１で調製した抗−Fdγ抗体フラグメント調製物の機能性を調べるために、Ｂ型肝炎ウイルスのコア抗原（HBc抗原）に結合する抗体（＜HBc＞）を含むヒト血清サンプルに抗−Fdγを添加した。次いで、HBc抗原を添加し、インキュベートした。抗−HBc−特異的IgGは、このとき、抗−Fdγによって遮蔽されていないならば、この抗原と反応し得る。次いで、過剰のIgG（HBc抗原に対して特異的および非特異的）を洗浄により分離した。HBc抗原に結合したIgGは、このとき、IgGのFcγ部分に結合する、ペルオキシダーゼ標識抗−IgGによって検出され得る。
試験手順は次の通りであった。
抗−HBc IgGを含むサンプルを種々の量の抗−Fdγと混合し、室温で30分間インキュベートした。次いで、サンプルを40ミリモル/lのリン酸塩緩衝液、pH7.4でさらに1:100に希釈した。
ストレプトアビジンで被覆した試験容器において、20μｌの希釈サンプルを500μｌのビオチニル化HBc抗原溶液（Enzymuntest（登録商標）抗−HBcの10μg/ml）に添加し、10分間インキュベートした。次いで、ペルオキシダーゼと抗−IgG抗体との500μｌのコンジュゲート（Enzymuntest（登録商標）抗−HCVの50mU/ml）を添加し、60分間インキュベートして、洗浄した。次いで、1000μｌの基質溶液（H2O2（過ホウ素酸ナトリウム）、Enzymuntest（登録商標）抗−HCVの3.2ミリモル/l）を添加し、60分間インキュベートした。最後に、ES600分析機（Boehringer Mannheim GmbH）で吸光度を測定した。
この実験の結果を表１に示す。明らかに、本発明の抗−Fdγ組成物は、IgGの抗原結合能を、もはや結合できない程度に変えることが分かる。
（本頁以下余白）
電気化学発光による抗−HBc IgMのクラス特異的検出
装置は、国際公開公報第90/05302号に記載された測定に対するものを使用した。試験原理は、図２に示すが、ヒトIgGに特異的なビオチニル化抗体（＜Ｈ−IgM＞Bi）およびルテニウム複合体で直接標識したHBc抗原（HBc−Ru）の使用に基づく。あるいは、（ルテニル化抗−HBc抗体を結合させることにより）間接的に標識したHBc抗原の使用も可能である。HBc抗原または抗体に結合するために使用されるルテニウム複合体および技術は、欧州特許出願公開公報第0199804号に記載されている。
さらに別の試験原理を図３に示す。それは、ビオチニル化HBc抗原（HBc−Bi）およびルテニウム標識化HBc抗原（HBc−Ru）の使用に基づく。
手順は次の通りであった。
1000μg/mlの抗−Fdγを含む、または含まない非特異的ヒトIgM（11μg/ml）の溶液90μｌを10μｌの:100に前希釈したサンプルまたは標準物質と混合し、37℃で９分間インキュベートした。
次いで、ルテニウム標識化HBc抗原およびビオチニル化抗−ヒトIgM抗体（IgG）を含む100μｌの溶液、ならびに50μｌのストレプトアビジン−被覆磁気粒子（Dynal Co.）を添加した。次いで、その混合物を37℃でさらに９分間インキュベートした後、アッセイ緩衝液（200ミリモル/lのリン酸塩、pH6.8、0.1％のポリドカノール、0.1％のOxabon A、160ミリモル/lのトリプロピルアミン）とともに、28℃に温度調節した測定セルに移し、そこで測定した。
次いで，サンプル中のIgM濃度を検量線に基づいて求めた。濃度に関する結果を表２に示す。
表から分かるように、サンプルにおいて測定されたIgM濃度は、抗−Fdγの添加により増加し、その結果、enzymun系（洗浄工程により、IgG干渉が生じない場合）で測定されるIgM濃度範囲が影響を受ける。
注：サンプル１〜４は、各々、6000、12000、6900および4500U/mlのHBc−特異的IgGを含む。すなわち、かなり過剰である。IgGによって引き起こされる干渉は、Fdγの添加により除去される。
Claims (35)
- IgG、IgM、IgA、IgDおよびIgEのクラスの一つまたはいくつかからの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分に対して特異的であり、少なくとも実質的に、これらの免疫グロブリンの抗原結合能を遮蔽する、いくつかの異なる抗体および／または抗体フラグメントで構成される組成物。
- 免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd部分に対して特異的である、請求項１に記載の組成物。
- 遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰で、抗体分子の抗原結合能を少なくとも50％阻害する、請求項１または２に記載の組成物。
- 遮蔽すべき抗体分子に対して５倍モル過剰で、抗体分子の抗原結合能を少なくとも90％阻害する、請求項３に記載の組成物。
- 第一の免疫グロブリンクラスに対して特異的であり、他の免疫グロブリンクラスとの最大交差反応性が、第一の免疫グロブリンクラスに対する反応性に対して10-2である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
- IgGに対して特異的であり、IgMとの最大交差反応性がIgGに対する反応性に対して10-2である、請求項５に記載の組成物。
- 最大交差反応性が10-3である、請求項６に記載の組成物。
- 一価の抗体フラグメントで構成される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
- Fabフラグメントで構成される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
- ヒト免疫グロブリンに対して特異的であり、ヒト以外の免疫グロブリンとの最大交差反応性がヒト免疫グロブリンに対する反応性に対して10-2である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
- ポリクローナル抗体および／または抗体フラグメントで構成される、請求項１〜10のいずれか一項に記載の組成物。
- （ａ）実験動物を第一の免疫グロブリンクラスからの免疫グロブリンのＨ鎖のFd部分を含む免疫原で免疫感作し；
（ｂ）ポリクローナル抗血清を実験動物から得て；
（ｃ）ポリクローナル抗血清を必要により、分解によって一価の抗体フラグメントに変換し；
（ｄ）抗血清または一価の抗体フラグメントを、第一の免疫グロブリンクラスのＨ鎖のFd部分に対して特異的である抗体および／または抗体フラグメントの選択を可能にする一工程または数工程の免疫収着に供し、ここで免 疫収着工程が、（ｉ）第一の免疫グロブリンクラスのＨ 鎖のFd部分を含む抗原に対する少なくとも一つの正の免 疫収着、および組成物の結合成分の単離；ならびに（i i）第一の免疫グロブリンクラスとは異なる免疫グロブ リンクラスから選択される抗原またはその成分に対する 少なくとも一つの負の免疫収着、および組成物の非結合 成分の単離；を含み、；そして（ｅ）第一の免疫グロブリンクラスのFd部分に対する特異性を有する抗体または抗体フラグメント組成物を単離する、請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物の作製方法。 - 免疫グロブリンのFc成分を含まない免疫原を使用する、請求項12に記載の方法。
- 免疫収着工程がさらに、（iii）正の免疫収着工程（ｉ）における免疫グロブリンの種とは異なる種の第一の免疫グロブリンクラスから選択される抗原またはその成分に対する少なくとも一つの負の免疫収着、および組成物の非結合成分の単離を含む、請求項12 または13に記載の方法。
- 正の免疫収着（ｉ）を第一の免疫グロブリンクラスのヒト免疫グロブリンに対して行い、負の免疫収着（iii）を第一の免疫グロブリンクラスのヒト以外の種の免疫グロブリンに対して行う、請求項14に記載の方法。
- 免疫収着工程を固定化抗原を使用して行う、請求項12〜15のいずれか一項に記載の方法。
- 免疫原は、免疫グロブリンＧのＨ鎖のFd部分を含むものを使用し、正の免疫収着（ｉ）は、免疫グロブリンＧまたはＨ鎖のFd部分を含むそのフラグメントに対して行い、結合成分を単離する、請求項12〜16のいずれか一項に記載の方法。
- IgM、IgD、IgEおよび／またはIgAあるいはそれらの成分に対する負の免疫収着（ii）を行い、非結合成分を単離する、請求項17に記載の方法。
- 負の免疫収着をIgMまたはその成分に対して行う、請求項18に記載の方法。
- ヒト以外の免疫グロブリンＧに対する負の免疫収着（iii）を行い、非結合成分を単離する、請求項17〜19のいずれか一項に記載の方法。
- ポリクローナル抗血清を、パパインによる分解によりFabフラグメントに変換する、請求項12〜2 0のいずれか一項に記載の方法。
- IgG、IgM、IgA、IgDおよび／またはIgEの抗体の選択的クラス特異的測定に対するイムノアッセイにおける、他のクラスの抗体によって引き起こされる干渉を抑制するための、請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物の使用。
- 一工程のイムノアッセイにおける請求項22に記載の使用。
- 他の免疫グロブリンクラスの抗体も含むサンプル液体における、一つまたはいくつかの選択した免疫グロブリンクラスからの特異的抗体の選択的免疫学的検出方法であって、サンプル液体を請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物と前インキュベートして、他の免疫グロブリンクラスによって引き起こされる干渉を抑制し、次いで、サンプル液体における選択した検出すべきクラスの抗体の有無および／または量を測定する方法。
- 組成物を、サンプル液体に存在する他の免疫グロブリンクラスの抗体に対して活性成分が少なくとも５倍モル過剰となる量で添加する、請求項24に記載の方法。
- 組成物を10倍〜1000倍モル過剰で添加する、請求項25に記載の方法。
- 前インキュベーションを、５〜60分間行う、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 測定を、反応性固相ならびに検出すべき抗体に結合可能な２つのレセプターR1およびR2（R1は、固相に結合しているか、固相に結合可能であり、R2は、直接または間接的に標識されている。）の存在下で、不均一イムノアッセイの原理に従って行い、検出すべき抗体を、固相および／またはインキュベーション液体中の標識を測定することにより測定する、請求項24〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 検出すべき抗体と特異的に反応する抗原および固相結合基のコンジュゲートをレセプターR1として使用し、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原を、直接または間接的に標識されているレセプターR2として使用する、請求項28に記載の方法。
- 検出すべき抗体と特異的に反応する抗原および固相結合基のコンジュゲートをレセプターR1として使用し、選択した抗体クラスを認識し、直接または間接的に標識されている抗体または対応する抗体フラグメントをレセプターR2として使用する、請求項28に記載の方法。
- 選択した抗体クラスを認識する抗体または対応する抗体フラグメントおよび固相結合基のコンジュゲートをレセプターR1として使用し、直接または間接的に標識され、検出すべき抗体と特異的に反応する抗原をレセプターR2として使用する、請求項28に記載の方法。
- ストレプトアビジンまたはアビジンで被覆した反応性固相およびビオチニル化レセプターR1を使用する、請求項28〜31のいずれか一項に記載の方法。
- 発光金属複合体を標識として使用し、標識を電気化学発光によって測定する、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 酵素を標識として使用し、標識を酵素反応の検出によって測定する、請求項28〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１〜11のいずれか一項に記載の組成物を含む、一つまたはいくつかの選択した免疫グロブリンクラスから特異的抗体を選択的免疫学的に検出するための試薬。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4439452A DE4439452A1 (de) | 1994-11-04 | 1994-11-04 | Antikörperklassenspezifisches Entstörungsreagenz |
| DE4439452.7 | 1994-11-04 | ||
| PCT/EP1995/004307 WO1996014337A1 (de) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | Antikörperklassenspezifisches entstörungsreagenz |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10508593A JPH10508593A (ja) | 1998-08-25 |
| JP3602135B2 true JP3602135B2 (ja) | 2004-12-15 |
Family
ID=6532500
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51504596A Expired - Lifetime JP3447010B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | 抗Ｆｄ抗体を用いたリウマチ因子干渉の排除 |
| JP51504496A Expired - Fee Related JP3602135B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | 抗体クラス特異的干渉除去剤 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51504596A Expired - Lifetime JP3447010B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-02 | 抗Ｆｄ抗体を用いたリウマチ因子干渉の排除 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5804391A (ja) |
| EP (2) | EP0782585B1 (ja) |
| JP (2) | JP3447010B2 (ja) |
| KR (1) | KR100249752B1 (ja) |
| AT (1) | ATE202116T1 (ja) |
| AU (1) | AU691995B2 (ja) |
| DE (3) | DE4439452A1 (ja) |
| ES (2) | ES2158134T3 (ja) |
| FI (1) | FI971883A (ja) |
| NO (1) | NO971873L (ja) |
| NZ (1) | NZ296087A (ja) |
| WO (2) | WO1996014337A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009025364A1 (ja) * | 2007-08-23 | 2009-02-26 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | 非特異反応抑制剤 |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19649390A1 (de) | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antigenspezifischer IgG-Nachweis |
| DE19649389A1 (de) * | 1996-11-29 | 1998-06-04 | Boehringer Mannheim Gmbh | Antigenspezifischer IgM-Nachweis |
| DE19731465A1 (de) * | 1997-07-22 | 1999-01-28 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verwendung von Kontrollflächen zur Detektion von Störproben in einem Nachweisverfahren |
| ATE221657T1 (de) | 1998-05-06 | 2002-08-15 | Roche Diagnostics Gmbh | Entstörung durch rheumafaktoren |
| US6228400B1 (en) * | 1999-09-28 | 2001-05-08 | Carlsbad Technology, Inc. | Orally administered pharmaceutical formulations of benzimidazole derivatives and the method of preparing the same |
| DE10006432A1 (de) * | 2000-02-14 | 2001-08-16 | Ganzimmun Inst Fuer Ganzheitli | Verfahren zum Nachweis von Helicobacter pylori in Stuhl- und Speichelproben |
| US20040018576A1 (en) * | 2002-07-24 | 2004-01-29 | Dematteo Todd M. | Bence Jones protein testing cassette |
| US20050112586A1 (en) * | 2003-11-24 | 2005-05-26 | Roland Janzen | Method and composition for stabilizing liquid reagents |
| FR2864624A1 (fr) * | 2003-12-24 | 2005-07-01 | Inodiag | Methode de diagnostic serologique des maladies infectieuses par immunodetection d'antigene microbien comprenant le controle de reaction faussement positive ou negative |
| US8445293B2 (en) | 2005-02-09 | 2013-05-21 | Rapid Pathogen Screening, Inc. | Method to increase specificity and/or accuracy of lateral flow immunoassays |
| CN105308437B (zh) | 2013-03-15 | 2018-01-19 | Hycor 生物医学有限责任公司 | 进行样本的冷光和荧光测量的装置和相关方法 |
| EP3578635B1 (en) * | 2014-04-02 | 2021-11-03 | Chembio Diagnostic Systems, Inc. | Immunoassay utilizing trapping conjugate |
| JP7051824B2 (ja) * | 2017-05-02 | 2022-04-11 | 田中貴金属工業株式会社 | 非特異反応抑制剤 |
| CN111077323A (zh) * | 2020-01-12 | 2020-04-28 | 天津市宝坻区人民医院 | 消除胰岛素自身抗体干扰的胰岛素测定试剂盒 |
| CN115586336A (zh) * | 2022-09-14 | 2023-01-10 | 杭州赛基生物科技有限公司 | 试剂盒及其制备方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS579723A (en) * | 1980-06-20 | 1982-01-19 | Mitsubishi Chem Ind Ltd | Stabilizing agent for immunological reaction and measuring method of antigen-antibody reaction |
| DE3717401A1 (de) * | 1987-05-23 | 1988-12-08 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aus einer der immunglobulin-klassen a, m, d oder e und dazu geeignetes mittel |
| US4914040A (en) * | 1988-03-03 | 1990-04-03 | Boehringer Mannheim Gmbh | Reagent and method for determination of a polyvalent substance using an immunoaggregate |
| DE4202923A1 (de) * | 1992-02-01 | 1993-08-05 | Behringwerke Ag | Verfahren zur bestimmung von antigenen oder antikoerpern in gegenwart eines immunkomplexes |
-
1994
- 1994-11-04 DE DE4439452A patent/DE4439452A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-11-02 US US08/817,089 patent/US5804391A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 EP EP95937047A patent/EP0782585B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 DE DE59509344T patent/DE59509344D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 WO PCT/EP1995/004307 patent/WO1996014337A1/de active IP Right Grant
- 1995-11-02 JP JP51504596A patent/JP3447010B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 JP JP51504496A patent/JP3602135B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-02 AU AU39801/95A patent/AU691995B2/en not_active Ceased
- 1995-11-02 ES ES95938392T patent/ES2158134T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 WO PCT/EP1995/004308 patent/WO1996014338A1/de active IP Right Grant
- 1995-11-02 NZ NZ296087A patent/NZ296087A/xx unknown
- 1995-11-02 US US08/809,412 patent/US5965378A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 KR KR1019970702920A patent/KR100249752B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-11-02 ES ES95937047T patent/ES2148577T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 EP EP95938392A patent/EP0789714B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 DE DE59508474T patent/DE59508474D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-11-02 AT AT95938392T patent/ATE202116T1/de not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-04-23 NO NO971873A patent/NO971873L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-05-02 FI FI971883A patent/FI971883A/fi unknown
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009025364A1 (ja) * | 2007-08-23 | 2009-02-26 | Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc. | 非特異反応抑制剤 |
| JPWO2009025364A1 (ja) * | 2007-08-23 | 2010-11-25 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 非特異反応抑制剤 |
| JP5189098B2 (ja) * | 2007-08-23 | 2013-04-24 | 三菱化学メディエンス株式会社 | 非特異反応抑制剤 |
| US10168325B2 (en) | 2007-08-23 | 2019-01-01 | Lsi Medience Corporation | Non-specific reaction inhibitor |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0782585B1 (de) | 2000-06-14 |
| AU691995B2 (en) | 1998-05-28 |
| NO971873D0 (no) | 1997-04-23 |
| DE4439452A1 (de) | 1996-05-09 |
| ES2148577T3 (es) | 2000-10-16 |
| FI971883A0 (fi) | 1997-05-02 |
| ES2158134T3 (es) | 2001-09-01 |
| EP0789714B1 (de) | 2001-06-13 |
| US5965378A (en) | 1999-10-12 |
| NO971873L (no) | 1997-04-23 |
| JPH10508593A (ja) | 1998-08-25 |
| US5804391A (en) | 1998-09-08 |
| DE59509344D1 (de) | 2001-07-19 |
| WO1996014338A1 (de) | 1996-05-17 |
| EP0789714A1 (de) | 1997-08-20 |
| NZ296087A (en) | 1999-01-28 |
| KR970707157A (ko) | 1997-12-01 |
| ATE202116T1 (de) | 2001-06-15 |
| DE59508474D1 (de) | 2000-07-20 |
| FI971883A (fi) | 1997-05-02 |
| EP0782585A1 (de) | 1997-07-09 |
| AU3980195A (en) | 1996-05-31 |
| JPH10508692A (ja) | 1998-08-25 |
| KR100249752B1 (ko) | 2000-03-15 |
| JP3447010B2 (ja) | 2003-09-16 |
| WO1996014337A1 (de) | 1996-05-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3602135B2 (ja) | 抗体クラス特異的干渉除去剤 | |
| US4828985A (en) | Antibodies against the complex of a small molecule and its binding protein, their preparation and their use in diagnostic methods | |
| US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| US20070166776A1 (en) | Immunoassay and kit for an early and simultaneous detection of biochemical markers in a patient's sample | |
| CA1256025A (en) | Immuno-chemical measurement process for haptens and proteins | |
| US8664007B2 (en) | Immune complex-specific antibodies for increased sensitivity in immunoassay array tests | |
| US6146836A (en) | Immunoassays using anti-allotypic monoclonal antibodies | |
| EP0088974A2 (en) | Homogeneous immunoassay with labelled monoclonal anti-analyte | |
| US5583003A (en) | Agglutination assay | |
| GB2171999A (en) | Antibodies | |
| AP156A (en) | Agglutination assay. | |
| JPH0727764A (ja) | Ｆｃ部位をブロックした免疫学的測定用抗体、該抗体を含む免疫学的測定用試薬、該免疫学的測定用試薬を使用する免疫学的測定法及びＦｃ部位をブロックするブロック試薬 | |
| JPH03503566A (ja) | 天然結合タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたイムノアツセイ | |
| JP3615006B2 (ja) | モノクローナル抗体、該抗体を用いた免疫測定方法及び測定試薬 | |
| CA2204397A1 (en) | Interference-suppressing reagent specific to certain classes of antibodies | |
| AU633633B2 (en) | Agglutination assay | |
| JPH0829420A (ja) | 免疫反応干渉作用の除去方法 | |
| AU2002346529B2 (en) | Immunoassay and kit for an early and simulataneous detection of biochemical markers in a patient's sample | |
| GB2177094A (en) | Polyclonal antibodies, preparation and use | |
| JP2002533677A (ja) | 自己免疫性関節炎の診断方法 | |
| JPH05211888A (ja) | マウスインターロイキン−６レセプターに対する抗体及びその使用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20040427 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20040831 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20040922 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081001 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081001 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091001 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101001 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111001 Year of fee payment: 7 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |