JP3594230B2

JP3594230B2 - Electrochemical detector and detection method

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Publication number: JP3594230B2
Application number: JP29196399A
Authority: JP
Inventors: 奈保子河西; 慶一鳥光; 泰彦神保; 克裕味戸
Original assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Current assignee: Nippon Telegraph and Telephone Corp
Priority date: 1999-10-14
Filing date: 1999-10-14
Publication date: 2004-11-24
Anticipated expiration: 2019-10-14
Also published as: JP2001108647A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、培養細胞や生体の微小組織について、それらの刺激に対する応答の測定を目的とした電気化学検出器及び検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
電極を手段とした検出器は、装置が簡便かつ安価であり、多くの分野で広く使用されている。
特にｐＨ電極やイオン電極のように汎用性の高い電極は、水質管理等の環境測定では不可欠である。
【０００３】
さらに、近年では電極の微小化に伴って（例えば、Ｍ．Ｍｏｒｉｔａ，Ｏ．Ｎｉｗａ，Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，ＥｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌＡｃｔａ，４２，３１７７−３１８３，１９９７）、極微小範囲における時間分解能の高い（「その場」）測定が行うことができるようになったため、電極は生体を対象にした測定にも用いられるようになった（例えば、Ｈ．Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｎ．Ｔｓｕｃｈｉｈａｓｈｉ，Ｎ．Ｋａｓａｉ，Ｔ．Ｍａｔｓｕｅ，Ｉ．Ｕｃｈｉｄａ，Ｎ．Ｍｏｒｉ，Ｈ．Ｏｈｙａ−ＮｉｓｈｉｇｕｃｈｉＨ．Ｋａｍａｄａ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ＆Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，１２，９−１０，１０３７−１０４１，１９９７）。
【０００４】
しかしながら多くの場合、使用に伴って電極の汚染、ひいては劣化が発生するため、電極感度の維持が困難となっている。
例えば、水質の分析や細胞を対象にした測定の際には、溶液中に含まれるタンパク質などの有機物質が電極上に付着し、電極の感度が低下してしまうため、測定値も不正確になり経時変化を追うような測定は不可能である。
さらに、頻繁に電極の研磨や交換が必要となる。
それゆえ、電極の感度を保持することが大きな課題となっている。
【０００５】
電極の汚染を除去するためには、例えば溶液を測定系に導入する前にその溶液に前処理を施し、問題となる可能性のある物質を除去するという方法があるが、その方法では溶液をサンプリングしてから測定するまでに時間差が生じ、「その場」測定ができない。
特に細胞を対象にした測定など、高時間分解能が必要な測定では使用が困難である。
そのため、短時間で簡便に効率よく電極汚染物質を除去できる方法が不可欠になっている。
【０００６】
また、電極電位を制御しながら電極に流れる電流を測定する場合、若しくは、電流を制御しながら電位を測定する場合、電極電位や電流値の変化が目的とする測定物質や、細胞などの測定対象物、目的物質を含有あるいは放出する物質、汚染物質など、電極や測定系に影響を与える場合もある。
例えば、細胞を測定対象にした場合では、細胞の活性が減少したり、ひどい場合になると細胞が死に至ることもあり、目的物質の正確な検出を妨害してしまう。
【０００７】
さらに、培養細胞を対象とした測定を行う場合、電極上で細胞を培養することが多く行われているが、その場合は同じ状態に保持した電極を再利用することが困難である。
以上の点から、簡便で広く利用されている電極を手段とした測定で、電極の汚染を防ぎ、かつ電極からの測定系への影響を軽減することは、必要不可欠の段階にきている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、上述した従来技術における問題点を解消するものであって、測定用の電極の汚染を低減し、電極の活性低下を防ぐことができ、測定対象物を「その場」測定できる、極めて簡便な方法であって、不要物を簡便にかつ短時間で除去する機能を有した電極測定装置の構築である。
【０００９】
またこの装置では、測定手段である電極と測定対象物とが極めて隣接しているものの、一定の距離だけ離れているため、電極を流れる電流や電位が測定系に影響を与えることもなく、正確な「その場」測定が可能である。
さらに、培養した細胞や生体組織を容易に移動することが可能となる。
このため、環境保全のニ一ズが高まる中、例えば、水質管理などの環境計測の分野や、近年注目されている細胞などを対象にした極微量測定の分野、物質移動を伴う反応過程の解析などの物理化学の分野などに貢献できるものと期待される。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
上記課題を解決する本発明の請求項１に係る検出方法は、作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された、 Laminine と poly-D-Lysin とによってコーティングされている多孔質膜とを有し、所定の物質を検出する電気化学検出器を使用する検出方法であって、前記作用極として複数のものを用いることにより、同時に多点における電流若しくは電位を計測する酵素反応を用いて所定の物質のみを検出することを特徴とする。
上記課題を解決する本発明の請求項２に係る電気化学検出器は、所定の物質を検出する電気化学検出器であって、作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された多孔質膜とを有し、前記多孔質膜が、Laminineとpoly-D-Lysinとによってコーティングされていることを特徴とする。
【００１１】
【発明の実施の形態】
本発明は、電極の汚染を防止する機能と、さらに電極と測定系と相互の影響をなくすよう一定の距離離れた機能を有するために、多孔質膜を電極上に設置することに重要なポイントがある。
この多孔質膜は、微細な多数の孔を有する有機・無機物質の絶縁性の膜であり、目的とする物質のみを透過し、電極上ではその物質のみを捕捉、検出することができるものである。
例えば、目的物質よりも大きく妨害物質より小さい孔を有する多孔質膜を使用するか、或いは、多孔質膜に特殊な機能を保たせることで、例えば、電荷を持った物質のみを透過させて電極で検出したり、特定の感応基を有する物質のみ、あるいは、特定の分子量を持つ分子のみを検出するなど、測定のために選択性を持たせることも可能である。
【００１２】
このような多孔質膜を電極上に設置することにより、電極は多孔質膜によって、汚染物質からは簡便に隔絶されることになる。
また、透明性の多孔質膜を使用すれば透過型顕微鏡を使用した観察も行うことができる。
測定対象物が溶液の場合は、容易に目的物質のみを抽出できるし、あるいは、測定対象物が細胞などのように付着性の物質の場合でも、測定対象物を多孔質膜上に付着させて測定すれば、電極活性を損なうことなく、さらに「その場」で測定を行うことが可能である。経時変化を追うような測定も可能である。
【００１３】
電極と測定系との間に絶縁性の膜が存在することから、電極を流れる電流や電位変化の影響を測定系に与えることがないため、目的物のみの正確な測定を行うことができる。
また、同様の測定を連続して行う際も、電極を交換したり電極表面を研磨する必要がなく、特に、付着性培養細胞のように測定対象物が多孔質膜に付着しているような場合では、多孔質膜を交換することによりきわめて簡単に測定対象物を交換することができる。
【００１４】
電極は、一般に使用されている平板状のものやシリンダ状のものなどが使用でき、それらを複数用いれば、容易に同時に複数の測定を行うことも可能である。また、電極と測定対象との距離を一定に保つことができるため、目的物質の移動速度などの物理化学の分野への応用へも有効である。
【００１５】
【実施例】
以下、実施例及び図面を参照して本発明をさらに具体的に説明する。
なお、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。
【００１６】
〔実施例１〕
本発明の第１の実施例に係る電気化学検出器を図１に示す。
図１（ａ）はその概観構成図、図１（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図１（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例では、図１（ａ）に示すように、ポテンシオスタット（ＬＣ４Ｃ，Bioanalytical Systems Corp.）１０を用いて、測定用セル２０内に設置した作用極（電極）Ａに流れる電流を測定した。
電極電位などの制御及びモニタリングは、コントローラ・レコーダ（パーソナルコンピュータ）３０によって行った。
【００１７】
測定用セル２０内には、作用極Ａと共に参照極４０及び対極５０が測定溶液６０中に浸漬されている。
本検出器は、作用極Ａ及び多孔質膜Ｂから構成される極めて簡易な電気化学検出器である。
この電気化学検出器では、ポテンシオスタット１０を用いることで、参照極４０に対する作用極Ａの電位を制御しながら、同時に作用極Ａと対極５０の間に流れる電流（還元電流）を計測する。
【００１８】
作用極Ａとしては絶縁基板Ｃ上の薄膜電極を用い、その上部に多孔質膜Ｂを設置した。
これにより、タンパク質などの電極を汚染する物質（妨害物質）Ｆを除去することができ、多孔質膜Ｂを通過することのできる目的物である分子（目的物質）Ｅのみを作用極Ａで捕捉することが可能である。
多孔質膜Ｂは、例えば、目的物質Ｅよりも大きく妨害物質Ｆよりも小さい孔を有する物質を使用し、ポリカーボネート製膜を用いる場合には、レーザーを使用して任意の大きさの孔を開けることができる。
また、多孔質膜Ｂが透明であるため、顕微鏡下で使用することもできる。
【００１９】
作用極Ａは、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）以外にも金属や炭素などの材料を用いる場合もある。
作用極Ａ以外の電極（参照極４０あるいは対極５０）はガラス基板上に作用極Ａと同様に作製される場合もある。
また、本実施例では３電極法（作用極Ａ、対極５０、参照極４０）で作用極Ａが１つの場合を用いているが、電流値が極微量の場合は、検出は２電極法（作用極Ａと参照極４０）でも行うことができる。
必要であれば電流増幅器７０を用いる場合もある。
【００２０】
本実施例では、作用極Ａとしては、ガラス基板上の酸化インジウムスズ薄膜を、リソグラフィにより一辺５０マイクロメートルの正方彩の微小平板電極にして用いた。
作用極Ａのリード部は絶縁膜で完全に覆い、溶液６０とは接触しないようにした。参照極４０には銀／塩化銀を、対極５０には白金線を用いた。
【００２１】
次に、図１で示した系による測定結果を図２に示す。
図２は異なる濃度のグルタミン酸に対して、電極で得られた応答電流（還元電流）である。
溶液６０にはグルタミン酸酸化酵素（２．７Ｕ）、西洋わさび由来ペルオキシデース（１３．５Ｕ）及び電極反応メディエータであるフェロセニルメタノール（０．３３ｍｍｏｌ／ｌ）を含んだ緩衝液７５μｌを用いた。
【００２２】
その溶液６０の上に多数の孔（孔径０．６μｍ）を有するポリカーボネート製膜（厚さ７μｍ）を設置し、そのうえからグルタミン酸を滴下して得られた還元電流の変化を求めた。
この溶液６０中では、１ｍｏｌのグルタミン酸がグルタミン酸酸化酵素により酸化され１ｍｏｌの過酸化水素を生成し、その過酸化水素が西洋わさび由来ペルオキシデースにより還元され、同時にフェロセニルメタノール１ｍｏｌが酸化される。
【００２３】
作用極Ａでは、その酸化型フェロセニルメタノールの還元電流の変化を測定することにより、グルタミン酸の濃度を算出するというのが測定原理である。
電極電位は酸化型フェロセニルメタノールが十分還元される電位（参照極に対して０ｍＶ）に固定した。
この結果から、グルタミン酸の濃度に比例した還元電流が観測されることが分かった。
また、異なる酵素を用いることでグルタミン酸以外の物質も測定できる可能性も示唆された。
【００２４】
〔実施例２〕
本発明の第２の実施例に係る電気化学検出器を図３に示す。
図３（ａ）はその概観構成図、図３（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図３（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例では、実施例１と同様の測定系を使用し、検出部の作用極Ａに複数の電極を使用したものである。
【００２５】
作用極Ａとしては、実施例１と同様に、一辺５０マイクロメートルの酸化インジウムスズアレイ電極を、フォトリソグラフィにより作製した。
電極間の相互作用が無視できるよう、電極間は１５０マイクロメートルと充分離した。
電流測定は、マルチポテンシオスタット８０を用いて測定した。
ただし、電流測定は、複数の作用極Ａを扱えるよう２台のポテンシオスタットを使用しても測定可能である。
【００２６】
多孔質膜Ｂは、同様にポリカーボネート製多孔質膜（厚さ７μｍ、孔径０．６μｍ）を使用し、細胞の付着性を向上するため、Ｌａｍｉｎｉｎｅとｐｏｌｙ−Ｄ−Ｌｙｓｉｎでコーティングした。
多孔質膜Ｂが透明であるため、倒立顕微鏡９０下で使用することもできる。
多孔質膜Ｂ上にウィスター系ラットの胎児（１８日）の神経細胞（大脳皮質）を、ＣＯ_２濃度１０％、３７℃下で２３日間培養した。
【００２７】
培養液にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍに非働化ウマ血清、非働化ウシ血清、インシュリン、ペニシリン・ストレプトマイシンを添加したものを使用した。
培養２日後に、細胞が付着し、成長していることを確認した。
培養２１日後に、多孔質膜上に培養した細胞をインキュベータから取り出し、細胞にダメージを与えないように測定溶液で２回洗浄し、電極上に設置した。
測定溶液には２ｍＭＣａ^２＋を含むｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液を、細胞の刺激には３７ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム（５μｌ）を用いた。
【００２８】
測定溶液には、グルタミン酸酸化酵素（２．７Ｕ）、西洋わさび由来ペルオキシデース（１３．５Ｕ）及び電極反応メディエータとしてフェロセニルメタノール（０．３３ｍｍｏｌ／ｌ）を含んだｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液７５μｌを用い、作用極Ａ上に滴下した上に、上述した培養細胞（測定対象物）Ｄの付着した多孔質膜Ｂを乗せた。
作用極Ａには、細胞が近傍にあるもの２つを選択し、電極電位を参照極に対して０ｍＶに固定した時に電極に流れる電流を測定した。
その結果を図４に示す。
【００２９】
図４に示すように、溶液に塩化カリウムを添加した際、電極１、２でそれぞれ１２ピコアンペア、４ピコアンペアの電流増加が確認された。
これは、細胞がない状態で塩化カリウムを添加した時とは明らかに異なる応答であり、この結果は、刺激に対して細胞がグルタミン酸を放出しているということを示している。
このように、本装置が細胞の応答を検出できることが確認された。
【００３０】
〔実施例３〕
本発明の第３の実施例に係る電気化学検出器を図５に示す。
図５（ａ）はその概観構成図、図５（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図５（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例は、実施例２と同様の測定系であるが、図５に示すように、グルタミン酸の測定に必要な酵素及びメディエータ（グルタミン酸酸化酵素，西洋わさび由来ペルオキシデース固定化オスミウムポリマ）Ｇを作用極Ａ上に固定して測定を行った。
【００３１】
刺激は、３７ｍｍｏｌ／ｌ塩化カリウム（５μｌ）を細胞近傍に添加して行った。
電極電位は酸化型オスミウムが十分還元される電位（参照極に対して−１００ｍＶ）に固定した。
その結果、同様に、２つの作用極Ａで測定された還元電流値の増加はそれぞれ２０ピコアンペアと１５ピコアンペアであった。
この結果は実施例２で得られた値よりも大きくなっていたが、これは、酵素やメディエータを電極を固定することにより、電極反応がより効率よく行われたためであると考えられる。
【００３２】
また、固定化することにより、測定溶液中に存在する酵素、メディエータが細胞に傷害を与えてしまい細胞の活性が低下する可能性が回避できるとも予想される。
このように、本手法により、極微量濃度のグルタミン酸が高精度、高感度に測定できることが分かった。
【００３３】
〔実施例４〕
本発明の第４の実施例に係る電気化学検出器を図６に示す。
図６（ａ）はその概観構成図、図６（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図６（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
本実施例は、実施例３と同様の検出系であるが、培養海馬スライス片を用いて測定を行った例である。
即ち、生後２日目のラットの海馬スライス（３００μｍ厚）を作成し、前記した多孔質ポリカーボネート膜上で、ＣＯ₂濃度１０％、３７℃下で培養した。
【００３４】
培養液にはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍに非働化ウマ血清、非働化ウシ血清、ペニシリン・ストレプトマイシン、グルコース及び神経成長因子を加えたものである。
電極電位は、参照極に対して−１００ｍＶに固定した。
培養開始２日後、スライス片が多孔質膜膜（ポリカーボネート製）Ｂ上に付着し、成長していることを確認した。
【００３５】
培養開始７日後に、スライス片（測定対象物、生体微小組織）Ｄ’が固定された多孔質膜Ｂを取り出し、測定溶液で２回洗浄した。
実施例３で記述したように酵素、メディエータを固定した作用極Ａ上に測定溶液を３０μｌを滴下し、膜を設置した。
刺激は、測定溶液に溶解した１０ｍＭミューシモルをスライス片近傍に投与して行った。
その結果、電極で電流値の変化が観察された。
【００３６】
また、スライス片Ｄ’のない系では電流変化が観察されなかったことから、電流変化は、スライス片Ｄ’からのグルタミン酸の放出の可能性を示唆していると言える。
ミューシモルはＧＡＢＡ_Ａリセプタのアゴニストであるが、ＧＡＢＡの投与による細胞からのグルタミン酸の放出は現在までに報告されている（例えば、Ｋ．Ｔｏｒｉｍｉｔｓｕ，Ｏ．Ｎｉｗａ，ＮｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙａｎｄＮｅｕｒｏｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ８，１３５３−１３５８，１９９７）。
本実験からもそれを指示するような結果が得られた。
【００３７】
【発明の効果】
以上、詳細に説明したように、本発明の電極測定装置は、水質の検査や細胞などを対象にした測定の際に極めて有効な方法で、電極上に多孔質膜を設置するという簡便な方法で構築することができる。
多孔質膜により測定対象物や妨害物質を電極から簡便に分離することができるため、測定対象物や妨害物質によって電極を汚染されることなく、電極自体の活性を高く保つことができ、目的物質を高感度に高精度な測定が可能である。
それゆえ、電極の交換や活性化の頻度が減少し、装置の高寿命化が実現できる。
【００３８】
さらに、多孔質膜が絶縁性であるため、電極を流れる電流や電極に印加される電位が測定系（目的物質や測定対象物を含む）へ影響を及ぼすことも避けられるため、経時変化を追うような測定も可能である。
また多孔質膜上に細胞など測定対象物を固定することもできるため、測定対象物を簡便に交換することもできる。
透明な多孔質膜であれば、顕微鏡下での使用も可能である。
【００３９】
このように、本発明により、既存の電極をそのまま使用し、簡便な方法で高性能な「その場」測定ができるということで、近年社会的に注目されている水質分析などの環境分野などでの各種センシングや、細胞を対象にした神経伝達物質の測定などの測定系に極めて有効であり、利用される可能性が大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の第１の実施例に係る電気化学検出器であって、図１（ａ）はその概観構成図、図１（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図１（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図２】実施例１で示される測定系による測定例に係るグルタミン酸に対する電極の電流応答を示すグラフである。
【図３】本発明の第２の実施例に係る電気化学検出器であって、図３（ａ）はその概観構成図、図３（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図３（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図４】実施例２で示される測定系による測定例に係る培養細胞に塩化カリウム刺激を与えたときの異なる２つの電極における電流応答（還元電流）、コントロールは細胞が存在しない系で同様の刺激を与えたときの電流変化を示すグラフである。
【図５】本発明の第３の実施例に係る電気化学検出器であって、図５（ａ）はその概観構成図、図５（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図５（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。
【図６】本発明の第４の実施例に係る電気化学検出器であって、図６（ａ）はその概観構成図、図６（ｂ）はその電気化学検出器の拡大斜視図、図６（ｃ）はその電気化学検出器の拡大断面図である。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to an electrochemical detector and a detection method for measuring a response to a stimulus of a cultured cell or a microtissue of a living body.
[0002]
[Prior art]
Detectors using electrodes are simple and inexpensive devices and are widely used in many fields.
Particularly, highly versatile electrodes such as pH electrodes and ion electrodes are indispensable for environmental measurements such as water quality control.
[0003]
Further, in recent years, with the miniaturization of electrodes (for example, M. Morita, O. Niwa, T. Horiuchi, Electrochemical Acta, 42, 3177-3183, 1997), the time resolution in a very small range is high (“in-situ”). )) Since the measurement can be performed, the electrode has also been used for the measurement of a living body (for example, H. Yokoyama, N. Tsuchihashi, N. Kasai, T. Matsue, I., et al.). Uchida, N. Mori, H. Ohya-Nishiguchi H. Kamada, Biosensors & Bioelectronics, 12, 9-10, 1037-1041, 1997).
[0004]
However, in many cases, the electrodes are contaminated and eventually deteriorated with use, so that it is difficult to maintain the electrode sensitivity.
For example, when analyzing water quality or measuring cells, the measured values may be inaccurate because the organic substances such as proteins contained in the solution adhere to the electrodes and reduce the sensitivity of the electrodes. It is impossible to make measurements that follow changes over time.
In addition, the electrodes need to be polished or replaced frequently.
Therefore, maintaining the sensitivity of the electrode is a major issue.
[0005]
In order to remove the contamination of the electrodes, for example, there is a method in which the solution is subjected to a pretreatment before introducing the solution into the measurement system to remove substances that may cause a problem. There is a time lag between sampling and measurement, making "in-situ" measurement impossible.
In particular, it is difficult to use in a measurement requiring a high time resolution, such as a measurement for a cell.
Therefore, a method that can easily and efficiently remove electrode contaminants in a short time is indispensable.
[0006]
In addition, when measuring the current flowing through the electrode while controlling the electrode potential, or when measuring the potential while controlling the current, a change in the electrode potential or the current value is a target substance or a measurement object such as a cell. In some cases, such as a substance, a substance containing or releasing a target substance, and a contaminant, the electrode or the measurement system may be affected.
For example, when a cell is used as an object to be measured, the activity of the cell may be reduced, or in severe cases, the cell may be killed, which hinders accurate detection of the target substance.
[0007]
Furthermore, when performing measurements on cultured cells, the cells are often cultured on electrodes, but in that case, it is difficult to reuse the electrodes held in the same state.
In view of the above, it has become an indispensable stage to prevent contamination of the electrode and reduce the influence of the electrode on the measurement system by simple and widely used measurement using the electrode.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems in the prior art, and to reduce contamination of an electrode for measurement, prevent a decrease in the activity of the electrode, and measure an object to be measured in-situ. It is an extremely simple method that can be performed, and is an electrode measuring device that has a function of removing unnecessary substances easily and in a short time.
[0009]
Also, in this device, although the electrode as the measuring means and the object to be measured are extremely adjacent to each other, they are separated by a certain distance, so that the current or potential flowing through the electrodes does not affect the measuring system, so that the measurement system can be accurately measured. It is possible to perform "in-situ" measurement.
Further, it becomes possible to easily move the cultured cells and biological tissues.
For this reason, as the need for environmental conservation increases, for example, the field of environmental measurement such as water quality management, the field of ultra-trace measurement of cells that have attracted attention recently, and the analysis of reaction processes involving mass transfer It is expected to contribute to the field of physical chemistry such as.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
Detection method according to claim 1 of the present invention for solving the above-mentioned problems, and at least two electrodes the working and reference electrodes, installed in the vicinity of the working electrode or the working electrode, Laminine and poly-D-Lysin And a porous film coated with a, and a detection method using an electrochemical detector for detecting a predetermined substance, by using a plurality of the working electrode, the current at multiple points at the same time Alternatively, only a predetermined substance is detected by using an enzyme reaction for measuring a potential.
The electrochemical detector according to claim 2 of the present invention that solves the above-mentioned problem is an electrochemical detector that detects a predetermined substance, and includes at least two electrodes, a working electrode and a reference electrode, on the working electrode or A porous film provided in the vicinity of the working electrode, wherein the porous film is coated with Laminine and poly-D-Lysin.
[0011]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
The present invention has an important point in installing a porous membrane on an electrode in order to have a function of preventing contamination of the electrode and a function of separating the electrode and the measurement system by a certain distance so as to eliminate mutual influence. There is.
This porous film is an organic / inorganic material insulating film having a large number of fine pores, it allows only the target material to pass through, and can capture and detect only that material on the electrode. is there.
For example, by using a porous membrane having pores larger than the target substance and smaller than the interfering substance, or by allowing the porous membrane to have a special function, for example, by allowing only charged substances to pass therethrough, It is also possible to impart selectivity for the measurement, for example, by detecting by a method described above, by detecting only a substance having a specific sensitive group, or only a molecule having a specific molecular weight.
[0012]
By placing such a porous membrane on the electrode, the electrode is easily isolated from contaminants by the porous membrane.
In addition, if a transparent porous film is used, observation using a transmission microscope can be performed.
When the measurement target is a solution, only the target substance can be easily extracted, or even when the measurement target is an adhesive substance such as a cell, the measurement target is attached to the porous membrane. By measuring, it is possible to perform the measurement “on the spot” without impairing the electrode activity. Measurements that follow changes over time are also possible.
[0013]
Since the insulating film exists between the electrode and the measurement system, the measurement system is not affected by the current flowing through the electrode or a change in potential, so that accurate measurement of only the target object can be performed.
In addition, when performing the same measurement continuously, there is no need to replace the electrode or polish the electrode surface, especially when the measurement target adheres to the porous membrane like adherent cultured cells. In such a case, the measurement object can be exchanged very easily by exchanging the porous membrane.
[0014]
As the electrode, a generally used plate-like or cylindrical electrode can be used. If a plurality of electrodes are used, a plurality of measurements can be easily performed at the same time. Further, since the distance between the electrode and the object to be measured can be kept constant, it is effective for application to the field of physical chemistry such as the moving speed of the target substance.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples and drawings.
In addition, this invention is not limited only to the following Examples.
[0016]
[Example 1]
FIG. 1 shows an electrochemical detector according to a first embodiment of the present invention.
FIG. 1A is a schematic configuration diagram, FIG. 1B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector, and FIG. 1C is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
In this embodiment, as shown in FIG. 1A, a potentiostat (LC4C, Bioanalytical Systems Corp.) 10 is used to measure a current flowing through a working electrode (electrode) A installed in a measuring cell 20. did.
Control and monitoring of the electrode potential and the like were performed by a controller / recorder (personal computer) 30.
[0017]
The reference electrode 40 and the counter electrode 50 are immersed in the measurement solution 60 together with the working electrode A in the measurement cell 20.
This detector is a very simple electrochemical detector composed of a working electrode A and a porous membrane B.
In this electrochemical detector, by using the potentiostat 10, the current (reduction current) flowing between the working electrode A and the counter electrode 50 is measured while controlling the potential of the working electrode A with respect to the reference electrode 40.
[0018]
As the working electrode A, a thin film electrode on an insulating substrate C was used, and a porous film B was provided thereon.
As a result, the substance (interfering substance) F contaminating the electrode such as a protein can be removed, and only the target molecule (target substance) E that can pass through the porous membrane B is captured by the working electrode A. It is possible to do.
As the porous membrane B, for example, a substance having pores larger than the target substance E and smaller than the interfering substance F is used. In the case of using a polycarbonate membrane, holes of an arbitrary size are formed by using a laser. be able to.
Further, since the porous film B is transparent, it can be used under a microscope.
[0019]
The working electrode A may use a material such as metal or carbon in addition to indium tin oxide (ITO).
Electrodes other than the working electrode A (the reference electrode 40 or the counter electrode 50) may be produced on the glass substrate in the same manner as the working electrode A.
Further, in the present embodiment, the case where one working electrode A is used in the three-electrode method (working electrode A, counter electrode 50, reference electrode 40) is used. However, when the current value is extremely small, detection is performed using the two-electrode method ( It can also be performed with the working electrode A and the reference electrode 40).
If necessary, a current amplifier 70 may be used.
[0020]
In this embodiment, as the working electrode A, an indium tin oxide thin film on a glass substrate was used as a small flat plate electrode having a side of 50 micrometers by lithography.
The lead portion of the working electrode A was completely covered with the insulating film so as not to come into contact with the solution 60. Silver / silver chloride was used for the reference electrode 40, and platinum wire was used for the counter electrode 50.
[0021]
Next, FIG. 2 shows the measurement results of the system shown in FIG.
FIG. 2 shows response currents (reduction currents) obtained at the electrodes for different concentrations of glutamic acid.
The solution 60 used was 75 μl of a buffer solution containing glutamate oxidase (2.7 U), horseradish-derived peroxidase (13.5 U), and ferrocenyl methanol (0.33 mmol / l) as an electrode reaction mediator.
[0022]
A polycarbonate film (thickness: 7 μm) having a large number of pores (pore diameter: 0.6 μm) was placed on the solution 60, and glutamic acid was dropped thereon to determine the change in reduction current.
In the solution 60, 1 mol of glutamic acid is oxidized by glutamic acid oxidase to generate 1 mol of hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide is reduced by horseradish-derived peroxidase, and at the same time, 1 mol of ferrocenyl methanol is oxidized.
[0023]
At the working electrode A, the measurement principle is to calculate the concentration of glutamic acid by measuring the change in the reduction current of the oxidized ferrocenyl methanol.
The electrode potential was fixed at a potential at which oxidized ferrocenylmethanol was sufficiently reduced (0 mV with respect to the reference electrode).
From this result, it was found that a reduction current proportional to the concentration of glutamic acid was observed.
In addition, it was suggested that substances other than glutamic acid could be measured by using different enzymes.
[0024]
[Example 2]
FIG. 3 shows an electrochemical detector according to a second embodiment of the present invention.
FIG. 3A is a schematic configuration diagram, FIG. 3B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector, and FIG. 3C is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
In the present embodiment, a measurement system similar to that of the first embodiment is used, and a plurality of electrodes are used for the working electrode A of the detection unit.
[0025]
As the working electrode A, as in Example 1, an indium tin oxide array electrode having a side length of 50 μm was produced by photolithography.
In order to neglect the interaction between the electrodes, the distance between the electrodes was 150 μm.
The current was measured using a multipotentiostat 80.
However, the current measurement can be performed by using two potentiostats so that a plurality of working electrodes A can be handled.
[0026]
As the porous membrane B, a polycarbonate porous membrane (thickness: 7 μm, pore diameter: 0.6 μm) was similarly coated with Laminine and poly-D-Lysin in order to improve cell adhesion.
Since the porous membrane B is transparent, it can be used under an inverted microscope 90.
Neuronal cells (cerebral cortex) of a Wistar rat fetus (day 18) were cultured on the porous membrane B for 23 days at 37 ° C. at a CO ₂ concentration of 10%.
[0027]
The culture solution used was Dulbecco's Modified Essential Medium supplemented with inactivated horse serum, inactivated bovine serum, insulin, and penicillin / streptomycin.
Two days after culturing, it was confirmed that the cells were attached and growing.
After 21 days of the culture, the cells cultured on the porous membrane were removed from the incubator, washed twice with a measurement solution so as not to damage the cells, and placed on the electrode.
A HEPES buffer at pH 7.2 containing 2 mM Ca ²⁺ was used as a measurement solution, and 37 mmol / l potassium chloride (5 μl) was used for stimulating cells.
[0028]
A HEPES buffer at pH 7.2 containing glutamate oxidase (2.7 U), horseradish-derived peroxidase (13.5 U), and ferrocenyl methanol (0.33 mmol / l) as an electrode reaction mediator was used as the measurement solution. Using 75 μl, the porous membrane B to which the above-mentioned cultured cell (measurement target) D was adhered was placed on the working electrode A and dropped on the working electrode A.
As the working electrode A, two cells in the vicinity of the cell were selected, and the current flowing through the electrode when the electrode potential was fixed at 0 mV with respect to the reference electrode was measured.
The result is shown in FIG.
[0029]
As shown in FIG. 4, when potassium chloride was added to the solution, an increase in current of 12 picoamps and 4 picoamps at electrodes 1 and 2 respectively was confirmed.
This is a distinctly different response than when potassium chloride was added in the absence of cells, indicating that the cells are releasing glutamate upon stimulation.
Thus, it was confirmed that the present device can detect the response of the cell.
[0030]
[Example 3]
FIG. 5 shows an electrochemical detector according to a third embodiment of the present invention.
FIG. 5A is a schematic configuration diagram, FIG. 5B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector, and FIG. 5C is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
This example is a measurement system similar to that of Example 2, but as shown in FIG. 5, an enzyme and a mediator (glutamic acid oxidase, horseradish-derived peroxidase-immobilized osmium polymer) G required for the measurement of glutamic acid are used. The measurement was carried out while being fixed on the working electrode A.
[0031]
Stimulation was performed by adding 37 mmol / l potassium chloride (5 μl) near the cells.
The electrode potential was fixed at a potential (-100 mV with respect to the reference electrode) at which oxidized osmium was sufficiently reduced.
As a result, similarly, the increase in the reduction current value measured at the two working electrodes A was 20 picoamps and 15 picoamps, respectively.
This result was larger than the value obtained in Example 2, which is considered to be because the electrode reaction was performed more efficiently by fixing the electrode with the enzyme or the mediator.
[0032]
It is also expected that the immobilization can avoid the possibility that enzymes and mediators present in the measurement solution may damage cells and reduce the activity of the cells.
As described above, it was found that the trace amount of glutamic acid can be measured with high accuracy and high sensitivity by this method.
[0033]
[Example 4]
FIG. 6 shows an electrochemical detector according to a fourth embodiment of the present invention.
FIG. 6A is a schematic configuration diagram, FIG. 6B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector, and FIG. 6C is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
The present example is a detection system similar to that of Example 3, but is an example in which measurement was performed using a cultured hippocampal slice.
That is, a hippocampal slice (thickness: 300 μm) of a rat on the second day after birth was prepared and cultured on the porous polycarbonate membrane at a CO ₂ concentration of 10% at 37 ° C.
[0034]
The culture solution was obtained by adding inactivated horse serum, inactivated bovine serum, penicillin-streptomycin, glucose, and nerve growth factor to Dulbecco's Modified Essential Medium.
The electrode potential was fixed at -100 mV with respect to the reference electrode.
Two days after the start of the culture, it was confirmed that the sliced pieces adhered to the porous membrane (made of polycarbonate) B and grew.
[0035]
Seven days after the start of the culture, the porous membrane B to which the slice pieces (measurement target, biological microtissue) D 'were fixed was taken out, and washed twice with the measurement solution.
As described in Example 3, 30 μl of the measurement solution was dropped on the working electrode A to which the enzyme and the mediator were fixed, and a membrane was set.
Stimulation was performed by administering 10 mM mucimol dissolved in the measurement solution to the vicinity of the slice.
As a result, a change in the current value was observed at the electrode.
[0036]
In addition, since no current change was observed in the system without the slice piece D ', it can be said that the current change indicates the possibility of release of glutamic acid from the slice piece D'.
Although mucimol is an agonist of the GABA _A receptor, the release of glutamate from cells upon administration of GABA has been reported to date (eg, K. Torimitsu, O. Niwa, Neuropharmacology and Neurotoxicology, Neurol813, Neuro13, 53-53). , 1997).
This experiment also gave results that indicated this.
[0037]
【The invention's effect】
As described above in detail, the electrode measuring apparatus of the present invention is a very effective method for water quality inspection and measurement of cells and the like, and a simple method of installing a porous membrane on an electrode. Can be built with
Since the measurement object and the interfering substance can be easily separated from the electrode by the porous membrane, the activity of the electrode itself can be kept high without the electrode being contaminated by the measurement object or the interfering substance, and the target substance can be maintained. Can be measured with high sensitivity and high accuracy.
Therefore, the frequency of electrode replacement and activation is reduced, and the life of the device can be prolonged.
[0038]
Furthermore, since the porous film is insulative, the current flowing through the electrode and the potential applied to the electrode can be prevented from affecting the measurement system (including the target substance and the object to be measured). Such a measurement is also possible.
In addition, since an object to be measured such as a cell can be fixed on the porous membrane, the object to be measured can be easily exchanged.
If it is a transparent porous membrane, it can be used under a microscope.
[0039]
As described above, according to the present invention, the existing electrodes can be used as they are, and high-performance “in-situ” measurement can be performed by a simple method. It is extremely effective for various types of sensing and measurement systems such as measurement of neurotransmitters for cells, and is likely to be used.
[Brief description of the drawings]
1A and 1B are electrochemical detectors according to a first embodiment of the present invention, wherein FIG. 1A is a schematic configuration diagram thereof, and FIG. 1B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector. FIG. 1 (c) is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
FIG. 2 is a graph showing a current response of an electrode to glutamic acid according to a measurement example by the measurement system shown in Example 1.
3A and 3B are electrochemical detectors according to a second embodiment of the present invention, wherein FIG. 3A is an outline configuration diagram, and FIG. 3B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector. 3 (c) is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
FIG. 4 shows the current response (reduction current) at two different electrodes when a cultured cell according to the measurement system shown in Example 2 was stimulated with potassium chloride, and the control was the same in a system without cells. It is a graph which shows the electric current change at the time of giving a stimulus.
5A and 5B are electrochemical detectors according to a third embodiment of the present invention, wherein FIG. 5A is a schematic configuration diagram thereof, and FIG. 5B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector. FIG. 5 (c) is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.
6A and 6B are electrochemical detectors according to a fourth embodiment of the present invention. FIG. 6A is a schematic configuration diagram of the electrochemical detector, and FIG. 6B is an enlarged perspective view of the electrochemical detector. FIG. 6C is an enlarged sectional view of the electrochemical detector.

Claims

作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された、 Laminine と poly-D-Lysin とによってコーティングされている多孔質膜とを有し、所定の物質を検出する電気化学検出器を使用する検出方法であって、前記作用極として複数のものを用いることにより、同時に多点における電流若しくは電位を計測する酵素反応を用いて所定の物質のみを検出することを特徴とする検出方法。Has at least two electrodes the working and reference electrodes, installed in the vicinity of the working electrode or the working electrode, a porous membrane is coated with a Laminine and poly-D-Lysin, given substance A detection method using an electrochemical detector for detecting a plurality of working electrodes, wherein only a predetermined substance is detected using an enzyme reaction for measuring current or potential at multiple points at the same time. A detection method characterized in that:

所定の物質を検出する電気化学検出器であって、作用極と参照極との少なくとも２つの電極と、当該作用極上若しくは当該作用極近傍に設置された多孔質膜とを有し、前記多孔質膜が、Laminineとpoly-D-Lysinとによってコーティングされていることを特徴とする電気化学検出器。An electrochemical detector for detecting a predetermined substance, comprising: at least two electrodes, a working electrode and a reference electrode; and a porous film provided on or near the working electrode, An electrochemical detector, wherein the membrane is coated with Laminine and poly-D-Lysin.