JP3551443B2 - ウド及び広葉樹のシンナミルアルコ−ルデヒド ロゲナ−ゼ遺伝子及び該遺伝子を導入した広葉樹 - Google Patents
ウド及び広葉樹のシンナミルアルコ−ルデヒド ロゲナ−ゼ遺伝子及び該遺伝子を導入した広葉樹 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ウド及び広葉樹のシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＡＤということもある）遺伝子及びそのプロモーター部位、並びにこれらの全部又は一部を用いて作成したアンチセンス遺伝子を導入してなるリグニン含量が調節された広葉樹に関するものである。
【０００２】
本発明のウド及びユーカリのＣＡＤのアミノ酸配列を規定する遺伝子は広葉樹で有効に発現し、広葉樹中のリグニン合成に関与するため、これらのアンセチンス遺伝子を広葉樹に導入することによって広葉樹に含まれるＣＡＤ活性を任意に変化させ、リグニン含量の制御を可能とするものである。紙パルプ生産において原料となる木材からのリグニン分解には多大のコストを要しているため、本発明によってリグニン含量を低下させた木材を紙パルプ生産に用いれば、リグニン除去に要するコストを大幅に低減させることができ、紙パルプ生産の分野において極めて有効である。
【０００３】
【従来の技術】
リグニンは高等植物が普遍的に有する高分子複合体であり、高等植物の細胞間に存在し、植物体の強度を保つ役割を担っている。リグニンの生合成は樋口ら（Ｗｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２４，２３，１９９０）により詳細に研究されてきた。特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼはその酵素学的性質がよく研究されている。１９８８年にＣ．Ｊ．ＬａｍｂらによりインゲンマメＣＡＤ遺伝子のｃＤＮＡの単離が報告された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，５５４６，１９８８）。しかし彼らは１９９０年に発表した論文（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，５２５，１９９０）において、このｃＤＮＡのコードするタンパク質がトウモロコシのマリックエンザイムと高い相同性を有することから、ＣＡＤをコードすることに対しての疑問を示唆した。それ以降にマリックエンザイムが各種の植物で単離され、インゲンマメから単離したｃＤＮＡはＣＡＤをコードしていないことが明らかとなっている。このようなクローニングの誤ちは、ＣＡＤの生化学的性質が不明であったことに起因する。
【０００４】
その後、複数の研究グループによりＣＡＤに関する報告がなされた。１９９１年１０月に、タバコのＣＡＤ遺伝子の単離に関する報告（掲示番号：１６５３）が第３回国際植物分子生物学会（米国、ツーソン）の掲示発表においてなされたが、塩基配列及びアミノ酸配列に関する報告は皆無であった。また、同学会においてテーダ松のＣＡＤに関する報告（掲示番号：１１１１）もなされたが、アミノ末端の一部アミノ酸配列が示されるに留まった。この一部アミノ酸配列については１９９２年４月号のＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ誌に掲載された（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９８，１３６４，１９９２）。ただし、テーダ松は裸子植物（針葉樹）であり、本発明の被子植物であるウド及びユーカリと比較した場合、ＣＡＤの酵素的な性質の相違が存在する。
【０００５】
植物中のリグニンを構成する単量体として２種のモノリグノール（コニフェリルアルコール（ＣＡ）及びシナピルアルコール（ＳＡ））が存在する。被子植物ではこの２種のモノリグノールが混合したリグニンを形成するが、裸子植物ではシナピルアルコールのみでリグニンが形成される。Ｋｕｔｓｕｋｉらの報告（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１，１９，１９８２）において、複数の被子植物及び裸子植物からＣＡＤを部分精製し、ＣＡ及びＳＡに対する酵素活性の測定がなされ、被子植物ＣＡＤはＣＡ及びＳＡの双方に対して同等に作用するが、裸子植物ＣＡＤはＳＡに対する活性が低いことが示された。特に、マツ類ＣＡＤのＳＡに対する酵素活性は、ＣＡのそれに対して約５分の１以下であった。他の針葉樹ＣＡＤの基質特異性についての詳細なデータが、スプルース（トウヒ）ＣＡＤの精製に関する論文（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９，１１５，１９８４）に示されている。これによれば、スプルースＣＡＤはＣＡ及びＳＡに対する基質特異性に１０倍以上の差があることが明らかである。以上の観点から、裸子植物（特に針葉樹）ＣＡＤ及び被子植物ＣＡＤは基質の認識に関与する立体構造に決定的な違いがある、互いに異なる酵素であると結論される。
【０００６】
リグニンは紙パルプ生産過程において不要な物質であり、その除去過程に多大なコストを費やしている。従って、林木のリグニン含量を低減することは重要な育種目標である。近年の遺伝子組換え技術の進歩により、林木における該技術を用いた育種が可能となりつつある。従って、リグニン生合成に関与する遺伝子の単離および同定、これを用いた遺伝子組換え技術による林木の品種改良が待たれていた。
【０００７】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は上記に示した現状に鑑み、リグニン含量の低い林木の作出、並びに林木中のリグニン含有量のコントロールを目的として、リグニン生合成に関与する酵素群の中からシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼに着目し、この遺伝子の単離及び構造の解明のためになされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、各方面から鋭意研究した結果、ウドの幼梢よりＣＡＤを精製し、部分的なアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列から推定されるオリゴヌクレオチドプローブを作成し、このフローブを用いてウド幼梢由来のｃＤＮＡライブラリーからＣＡＤのｃＤＮＡの釣り出しに成功した。さらにウドＣＡＤのｃＤＮＡをプローブとして用い、ユーカリ由来のゲノムライブラリーからＣＡＤ遺伝子の釣り出しに成功した。本発明は、以上の知見に基づいてさらに研究した結果、完成されたものである。即ち、本発明はウド並びにユーカリＣＡＤ遺伝子に関するものであって、それらの塩基配列は配列表の配列番号１並びに２に示した。
【０００９】
本発明によれば、ウドＣＡＤのｃＤＮＡをプローブとして用いることによりユーカリＣＡＤ遺伝子を釣り出すことができたが、このことはＣＡＤ塩基配列がウド及びユーカリといった被子植物間で高い相同性を有していることに他ならない。従って、ウド並びにユーカリのＣＡＤ遺伝子及びその断片をプローブに用いることにより、全ての被子植物からＣＡＤ遺伝子を釣り出すことが可能である。
【００１０】
ウドのＣＡＤ遺伝子、及び広葉樹のＣＡＤ遺伝子の全部または一部を用いて、アンチセンス遺伝子として人工的に構築し、この遺伝子をエレクトロポレーション法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９２，２２６，１９９０）及びアグロバクテリウムを用いる遺伝子導入法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，１１１０，１９９０）等の確立された方法に従いウド、ユーカリはもとより、クワ、ポプラ等の広範囲の広葉樹に導入、発現させることが可能である。
【００１１】
本発明によれば、植物体再生が確立されている広葉樹であれば、ＣＡＤアンチセンス遺伝子を導入することによりリグニン含量の低減が可能である。例えばパルプ材として利用される木材を対象とすれば、リグニン含量の低い良質のパルプ材として作出することが可能である。
【００１２】
以降では本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。操作の手順は特に記述しない限りにおいて、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．１９８７）に記載された方法に従った。
【００１３】
【実施例】
【００１４】
（１）材料
市販されている食用ウドを購入し、材料とした。ＣＡＤの活性測定用の基質であるコニフェリルアルデヒド、シナップアルデヒド（以下、両者を総称してアルデヒドと呼ぶ場合がある）については、Ｋｕｔｓｕｋｉらの方法（木材学会誌２７，５２０，１９８１）に従い合成した。コニフェリルアルコール、シナピルアルコール（以下、両者を総称してアルコールと呼ぶ場合がある）については、前者をアルドリッチ社から購入し、後者を岐阜大学、河合真吾博士より分譲して頂いた。
【００１５】
（２）ＣＡＤ活性の測定方法
アルコールからアルデヒドへの酸化反応は、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）中に０．１ｍＭ ＮＡＤＰ＋、０．０７ｍＭ コニフェリルアルコール又はシナピルアルコールを加え全量を１ｍＬとし、酵素液を加えて３０℃でおこなった。反応は分光光度計の測定用セル中でおこない、生成したアルデヒドによる４００ｎｍの光吸収を測定し、ＣＡＤのアルコール酸化反応活性を計算した。
【００１６】
アルデヒドからアルコールへの還元反応は、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中に０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．０５ｍＭ コニフェリルアルデヒド又はシナップアルデヒドを加え全量を１ｍＬとし、酵素液を加えて３０℃でおこなった。反応は上記と同様におこない、減少したＮＡＤＰＨを３４０ｎｍの光吸収により測定し、ＣＡＤのアルデヒド還元反応活性を計算した。
【００１７】
（３）ＣＡＤの精製
市販のウドを吸水させながら１日放置すると、ＣＡＤ活性が約２倍に上昇したので、この処理をおこなったウド４．５ｋｇを出発試料とした。約１ｃｍ角に切断し、ＣＡＤ抽出用緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ β−メルカプトエタノール）４Ｌと混合した後、ジューサーミキサーを用いて細かく破砕した。試料溶液をガーゼをもちいて濾し、直ちに硫酸アンモニウムを４０％飽和濃度となるように加え、遠心分離をおこない、上清を回収した。上清に７０％飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離をおこない、沈澱を回収した。沈澱をＣＡＤ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）に溶解させ酵素溶液とし、ゲルろ過をおこない脱塩した。酵素溶液に硫酸アンモニウムを加え、最終濃度を０．５Ｍとした後、０．５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した東ソー社製のブチルトヨパールによる疎水クロマトグラフィーをおこない酵素溶液を分画した。溶出は硫酸アンモニウムの０．５Ｍから０Ｍの直線濃度勾配によりおこなった。得られたＣＡＤ画分をゲルろ過により脱塩した後、ファルマシア社製のモノＱカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーをおこない、さらに細かく分画した。溶出は塩化ナトリウムの０Ｍから０．３Ｍの直線濃度勾配によりおこなった。得られたＣＡＤ画分をゲルろ過により脱塩した後、ファルマシア社製のＮＡＤＰ＋−アガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーをおこない、１ｍＭ ＮＡＤＰ＋でＣＡＤを溶出させた。これをウドＣＡＤ最終標本とした。
【００１８】
上記の方法により２４０μｇの精製ＣＡＤを得た。精製ＣＡＤをファルマシア社製のファストシステムを用いて８％から２５％の濃度勾配を持つポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこない、銀染色法によりタンパク質を検出したところ、単一のバンドが確認できた。精製ＣＡＤをファルマシア社製のスーパーロース１２カラム及び同社製の分子量測定用マーカーを用いてゲルろ過をおこなった結果、ウドＣＡＤの分子量は７２，０００であることが判明した。この値は、既報のＣＡＤの分子量と類似していた。さらに、ＳＤＳを含む同様の電気泳動をおこなったところ、分子サイズが３８ｋＤａ及び３９ｋＤａと推定される２つのバンドが確認された。このことから、ウドＣＡＤは類似した２種類のサブユニットからなる２量体であることが示唆された。一方、基質に対するＫｍ値を測定したところ、既報のＣＡＤのＫｍ値に類似の値が得られた。また、低級アルデヒド（アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド）、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋は、ＣＡＤの基質とはならないことも確認した。以上の結果から、精製した酵素標本がリグニン生合成系にのみ存在するアルデヒドおよびアルコールに対して高い基質特異性を有することが示され、本酵素標本はウドＣＡＤであることが明らかとなった。
【００１９】
（４）ウドＣＡＤのアミノ酸配列の決定
精製したＣＡＤを５０μｇ取り、モル比で１００倍のシアン化臭素を加え、４０℃で２０時間反応させたＣＡＤの部分分解をおこなった。反応終了後、試料溶液を凍結乾燥させ、得られたペプチドを０．１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと省略する）に溶解した。これを日本分光社製のＣ１８・ＯＤＳカラムを用いる逆相クロマトグラフィーにより分画した。液相として０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの０％から８０％の直線濃度勾配を用い、ペプチドの検出方法として２２０ｎｍの紫外線吸収を測定した。分画されたペプチドを各々凍結乾燥を経て回収した。アプライドバイオシステム社製の自動アミノ酸配列分析装置（モデルＮｏ．４７０Ａ）を用い、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、図１に示した４つのＣＡＤの部分アミノ酸配列が得られた。
【００２０】
（５）オリゴヌクレオチドの合成
図１に示したアミノ酸配列の中からペプチド＃１５のアミノ酸配列を選び、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡ合成装置（モデルＮｏ．３８１Ａ）を用いてこれに相当するオリゴヌクレオチドを化学合成した。図２に合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示した。
【００２１】
（６）ウドｃＤＮＡライブラリーの作成
ＣＡＤ精製に用いた際と同じウドを材料としてＲＮＡの抽出操作をおこない、２５０μｇの全ＲＮＡを得た。さらに、ファルマシア社製のオリゴｄＴカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、１３．５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡ、ファルマシア社製のｃＤＮＡ合成キット及びλｇｔ１１、ストラータジーン社製のファージ粒子パッケージングキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。作成したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｙ１０８８）に感染させファージの増殖をおこなった際、ＳＭ緩衝液に溶出させ保存した。ライブラリー中の組換え体総数は約１６０万であった。
【００２２】
（７）ウドＣＡＤのｃＤＮＡ単離
プラークハイブリダイゼーション法に従い、ウドｃＤＮＡライブラリー中の約３０万の組換え体から、ＣＡＤのｃＤＮＡ単離をおこなった。プローブは、【００２０】に表記の合成オリゴヌクレオチドを〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてリン酸付加反応により標識したものを使用した。ハイブリダイゼーション時の温度は４２℃という比較的穏やかな条件に設定した。その結果、プローブと高い相同性を有するｃＤＮＡクローンが２０個得られたが、全て同一のｃＤＮＡクローンであることが判明したので、約１．４ｋｂｐ（１ｂｐは１塩基対）を有する最長のｃＤＮＡ断片をストラータジーン社製のプラスミドベクター（ブルースクリプトＳＫ＋）に移し換え、ｐＵＣＡＤ１０と命名した。以降の解析にはこのｐＵＣＡＤ１０を用いた。
【００２３】
（８）ウドＣＡＤのｃＤＮＡ解析及び同定
ｐＵＣＡＤ１０のｃＤＮＡ断片の塩基配列解析は、宝酒造社製のＭ１３シークエンスキットを用いてダイデオキシ法に従っておこなった。この際、プロメガ社製のデレーションキットを用いることにより、ｐＵＣＡＤ１０のｃＤＮＡ断片を一方向から約２５０塩基対の間隔で短くした計５つのｐＵＣＡＤ１０由来プラスミドを両方向について作成した。各々の塩基配列を約３００塩基対程度まで解析し、重複する塩基配列部分でつなぎ合わせた。得られたｐＵＣＡＤ１０の塩基配列を表１から表４で示した配列表の配列番号１に示した。
【００２４】
【表１】
【００２５】
【表２】
【００２６】
【表３】
【００２７】
【表４】
【００２８】
即ち、上記に示した配列表の配列番号１の配列は
【００２３】に表記したｃＤＮＡ断片の塩基配列とこれによって規定されるアミノ酸配列を示すものである。
【００２９】
このｃＤＮＡによって規定されるアミノ酸配列をウドＣＡＤのアミノ酸配列解析から得られたアミノ酸配列と比較したところ、両者の配列がほぼ一致することが示された。一致した部分については配列表の配列番号１中の下線で示した。このことから本ｃＤＮＡはウドＣＡＤのｃＤＮＡであることが明らかとなった。また、アミノ末端の配列（図１のペプチドＮ）についても確認できたことから、本ｃＤＮＡはウドＣＡＤ全長を規定していることが示された。
【００３０】
これまでのＣＡＤについての報告と異なり、ウドＣＡＤは類似する２種のサブユニットからの構成されていることが明らかであり、得られたｃＤＮＡはどちらか一方のサブユニットのアミノ酸配列を規定する。本発明はＣＡＤ遺伝子を利用して、最終的に植物内のＣＡＤ活性を抑えるためのものである。即ち、サブユニットに対する発現抑制を行うことによって、本発明の目的は達成される。
【００３１】
（９）ユーカリゲノムライブラリーの作成
ユーカリ（ボトルオイデス種）苗状原基由来のカルスをＭＳ培地上で生育させた。日尾野らの方法（第３６回リグニン討論会要旨集、６１頁、１９９１）に従い、ユーカリカルスからゲノムＤＮＡを抽出後、制限酵素（Ｓａｕ３ＡＩ）により部分分解し、塩化ナトリウムの２％から２５％の直線密度勾配遠心法により約１６から２０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を回収した。このゲノムＤＮＡ断片とストラタジーン社製のＥＭＢＬ３及びファージ粒子パッケージングキットを用いて、ユーカリゲノムライブラリーを作成した。作成したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＳＲＢ）に感染させファージの増殖をおこなった後、ＳＭ緩衝液に溶出させ保存した。ライブラリー中の組換え体総数は約２５０万であった。
【００３２】
（１０）ユーカリＣＡＤ遺伝子の単離
プラークハイブリダイゼーション法に従い、ユーカリゲノムライブラリー中の約５０万の組換え体から、ＣＡＤ遺伝子の単離をおこなった。プローブは、ウドＣＡＤのｃＤＮＡ断片全長を〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ及びベーリンガー社製ランダムプライムドＤＮＡラベリングキットを用いて標識したものを使用した。その結果、プローブと高い相同性を有するＣＡＤ遺伝子クローンが３つ得られた。これらの制限酵素地図の作成を行った。図３に示すように、３つのクローンのうち２つは互いに重複するクローンであり、残りの１つはユーカリ遺伝子断片上のＣＡＤを含まない部分において１箇所のみ制限酵素部位の相違が見られた。これは、作物などのように人工的に純系とされたものと異なり、林木においては対になる相同染色体間で微細な相違があることに起因すると推定される。３つのクローンは、λＥＣＡＤ７４、λＥＣＡＤ７２、λＥＣＡＤ２１と命名した。これらのクローン中にＣＡＤ遺伝子全域が含まれていることを確認するために、ウドＣＡＤのｃＤＮＡのＮ末端側の断片及びＣ末端側の断片を各々プローブとして用い、サザン分析を行なった。プローブとした断片はｐＵＣＡＤ１０の塩基配列を解析する際に作成したデレーションクローンの中から、Ｎ末端側およびＣ末端側を有するものを選び、そのｃＤＮＡ断片を制限酵素で切断して用いた。即ち、Ｎ端側プローブは配列表の配列番号１に示した１番から２０３番で示した塩基配列を有するＤＮＡ断片であり、Ｃ末端側プローブは配列表の配列番号１に示した９５１番から１３３６番で示した塩基配列を有するＤＮＡ断片である。ユーカリＣＡＤクローンを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写した。このＤＮＡを転写したナイロン膜に対して、上記のＮ末端側及びＣ末端側のプローブ各々を用いてサザン分析を行なった結果、λＥＣＡＤ７４、λＥＣＡＤ２１については両プローブともにハイブリダイズした。従ってこの２つのクローンはユーカリＣＡＤ全長をコードしていると結論した。λＥＣＡＤ７２については、Ｃ末端側プローブのみハイブリダイズしなかったので、このクローンはＣ末端の一部を欠いていると考えられる。図３に斜線網掛けで示すプローブと相同性を有する断片（ＳａｌＩによって切断される断片）を宝酒造社製のプラスミドベクター（ｐＵＣ１９）に連結し、各々ｐＥＣＡＤＳ１、ｐＥＣＡＤＳ２、ｐＥＣＡＤＳ３と命名した。即ち、ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ２はユーカリＣＡＤ全長をコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドである。尚、ｐＥＣＡＤＳ１については、このプラスミドを有する大腸菌（識別のための表示：Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＣＡＤＳ１）を通産省工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託した（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６５３）。尚、ラムダファージクローンλＥＣＡＤ７４については上記機関がファージの寄託を受け付けていないために寄託はできないが、第３者からの申し出が生じた場合、ファージクローンの分譲は可能である。
【００３３】
（１２）ユーカリＣＡＤ遺伝子の解析
ｐＥＣＡＤＳ１については遺伝子断片が８ｋｂに及ぶのでゲノムＤＮＡ断片の塩基配列解析を行なうにあたって、さらに小断片化及びそのサザン分析を行なった。その結果、制限酵素（ＳａｌＩ及びＢｇｌＩ）を用いることによって得られる約３．３ｋｂｐの断片がＣＡＤ全長をコードしていることが判明したので、これについて塩基配列解析を行うことにした。この３．３ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を末端平滑化した後、制限酵素（ＳｍａＩ）で消化済みの宝酒造社製のプラスミドベクター（ｐＵＣ１１９）に連結し、ｐＥＣＡＤＳ１３３と命名した。塩基配列解析は、宝酒造社製のＭ１３シークエンスキットを用いてダイデオキシ法に従って行なった。この際、プロメガ社製のデレーションキットを用いることにより、ｐＥＣＡＤＳ１３３のゲノム断片を一方向から約２５０塩基対の間隔で短かくした計９つのｐＥＣＡＤＳ１３３由来プラスミドを両方向について作成した。各々の塩基配列を約３００塩基対程度まで解析し、重複する塩基配列部分でつなぎ合わせた。ｐＥＣＡＤＳ２及びｐＥＣＡＤＳ３についても同様の塩基配列解析を行なったがこれら３つのクローンの塩基配列は全て同一であった。従って、以下にｐＥＣＡＤＳ１３３のゲノムＤＮＡの塩基配列を表５から表１１で示した配列表の配列番号２に示した。
【００３４】
【表５】
【００３５】
【表６】
【００３６】
【表７】
【００３７】
【表８】
【００３８】
【表９】
【００３９】
【表１０】
【００４０】
【表１１】
【００４１】
即ち、上記に示した配列表の配列番号２の配列は
【００３３】に表記したユーカリゲノムＤＮＡ断片の塩基配列、これによって規定されるアミノ酸配列を示すものである。この塩基配列中には、プロモーター部位及び４つの介在配列が存在した。
【００４２】
両者のアミノ酸配列は８０．７％の相同性を有することから、本ゲノムＤＮＡはューカリＣＡＤ全長を規定しているユーカリＣＡＤ遺伝子であることが明らかとなった。また、ウド及びユーカリ間において、ＣＡＤ遺伝子の塩基配列の相同性が７６．６％と高いことから（コード領域のみ）。被子植物全般でＣＡＤ遺伝子の塩基配列が類似していることが推定された。
【００４３】
本ユーカリＣＡＤ遺伝子の５′上流側の塩基配列中には、転写開始シグナルであるＴＡＴＡボックス（配列表の配列番号２の４７４から４８１）、ＣＡＴボックス（配列表の配列番号２の４２から４５、３６４から３６７及び２３から４２７）及び２カ所の繰り返し配列（配列表の配列番号２の１２３から１４０までと１５９から１７６及び４４１から４５０までと４４８から４５７）といったプロモーターに特異的な配列が存在した。即ち、このプロモーター領域はＣＡＤ遺伝子の発現において、時期及び組織特異的な制御を担っていると考えられる。
【００４４】
（１２）ウドＣＡＤのｃＤＮＡを用いたアンチセンス遺伝子の作成
ウドＣＡＤのｃＤＮＡクローン（ｐＵＣＡＤ１０）の制限酵素（ＮｏｔＩ）消化してｃＤＮＡ断片全長を取り出し、宝酒造社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。また、２つの制限酵素（ＡｃｃＩ及びＫｐｎＩ）を用い消化により、約６５０ｂｐの部分断片を取り出し、同様に平滑末端処理した。一方、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを有するクローンテック社製のＴｉプラスミドベクター（ｐＢＩ１２１）からＧＵＳ遺伝子を除いて平滑末端処理した。上記の平滑末端化したＣＡＤのＤＮＡ断片とベクターを各々連結し、ｃＤＮＡ断片の連結方向が異なる２種のプラスミドＤＮＡを得た。これらの内、ｃＤＮＡの連結が３５Ｓプロモーターに対して逆方向、即ち本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対の向き、であるプラスミドＤＮＡについて、全長断片を含むものをｐＵＣＡＤ１２１Ａと命名し、部分断片を含むものをｐＵＣＡＤ１２１ａと命名した。即ち、ｐＵＣＡＤ１２１ＡはウドＣＡＤ遺伝子全長を含むアンチセンス遺伝子、ｐＵＣＡＤ１２１ａはウドＣＡＤ遺伝子部分断片を含むアンチセンス遺伝子である。
【００４５】
（１３）ユーカリＣＡＤ遺伝子を用いたアンチセンス遺伝子の作成
ユーカリＣＡＤ遺伝子クローン（ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ１３３）のインサートＤＮＡ全長を制限酵素消化してゲノムＤＮＡ断片を取り出し、宝酒造社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。一方、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを有するクローンテック社製のＴｉプラスミドベクター（ｐＢＩ１２１）からＧＵＳ遺伝子を除いて平滑末端処理した。上記の平滑末端化したＤＮＡを連結し、ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ１３３各々に由来するゲノムＤＮＡ断片について、連結の向きが異なる２種のプラスミドＤＮＡを得た。これらの内、ゲノムＤＮＡの連結が３５Ｓプロモーターに対して逆方向、即ち本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対の向き、であるプラスミドＤＮＡをｐＥＣＡＤ１２１Ａと命名した。即ち、ｐＥＣＡＤ１２１ＡはユーカリＣＡＤアンチセンス遺伝子である。同様にｐＥＣＡＤＳ１３３由来のアンチセンス遺伝子をｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３と命名した。
【００４６】
（１４）ウドＣＡＤのアンチセンス遺伝子の広葉樹への導入
ｐＵＣＡＤ１２１Ａ及びｐＵＣＡＤ１２１ａのプラスミドＤＮＡを太田らの方法（特許出願番号、平２−１６２６９５）に従って、各々ユーカリに導入し、植物体を再生させた。
【００４７】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＵＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを、別の３株からｐＵＣＡＤ１２１ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら７つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＵＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１４％から２７％であり、これらは平均で７８％の活性減少が示された。一方、ｐＵＣＡＤ１２１ａの導入された３株のＣＡＤ活性は対照とした植物体に比べ１６％から３５％であり、平均で７６％の活性減少が示された。
【００４８】
ｐＵＣＡＤ１２１ＡのプラスミドＤＮＡを町井らの方法（日本蚕系学会誌５９，１０５，１９９０）に従ってクワに導入し、植物体を再生させた。
【００４９】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、３株からｐＵＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら３つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＵＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１２％から２５％であり、これらは平均で８２％の活性減少が示された。
【００５０】
これらの結果から、本発明のウドＣＡＤの全部又は一部を用いて作成したアンチセンス遺伝子により、これらを用いて作出した形質転換植物中でのＣＡＤ活性を低減させることが可能であることが示された。これにより広葉樹におけるリグニン含量を低減させることが可能であることが示唆された。
【００５１】
（１５）ユーカリＣＡＤのアンチセンス遺伝子の広葉樹への導入
ｐＥＣＡＤ１２１Ａ及びｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３の各々のプラスミドＤＮＡを太田らの方法（特許出願番号、平２−１６２６９５）に従ってユーカリに導入し、植物体を再生させた。
【００５２】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを、３株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３由来のＤＮＡを確認できた。これら計７つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。ｐＥＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ６％から１５％であり、これらは平均で８９％の活性減少が示された。一方ｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３の導入された３株についても同様の結果が得られ、平均で９０％のＣＡＤの活性減少が示された。
【００５３】
ｐＥＣＡＤ１２１ＡのプラスミドＤＮＡを町井らの方法（日本蚕糸学会誌５９，１０５，１９９０）に従ってクワに導入し、植物体を再生させた。
【００５４】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら計４つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＥＣＡＤ１２１Ａに導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１２％から２４％であり、これらは平均で８２％の活性減少が示された。
【００５５】
これらの結果から、本発明のユーカリＣＡＤのアンチセンス遺伝子により、これらを用いて作出した形質転換植物中でのＣＡＤ活性を低減させることが可能であることが示された。これにより広葉樹におけるリグニン含量を低減させることが可能であることが示唆された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によって初めて、ウド及びユーカリからのＣＡＤ遺伝子の単離に成功した。このことにより本発明は、各種の著効を奏する事が可能であり、それらを以下に説明する。
【００５７】
ＣＡＤの植物のリグニン生合成反応に関与しており、本発明により得られたＣＡＤ遺伝子を用いることにより、広葉樹においてＣＡＤ活性を調節可能であることを示した。従って、林木に含まれるリグニン含量を低減させることが可能であり、これは紙パルプ産業におけるリグニン除去にかかるコストを大きく節約する事になる。
【００５８】
本発明者らは、ＣＡＤが木化（即ち、リグニン化）していく組織中に特異的に発現していることを確認している。即ち、ＣＡＤ遺伝子はリグニン化組織においてのみ特異的な発現がなされている。本発明で得られたユーカリＣＡＤ遺伝子のプロモーター部位はこの特異的発現を担うものであり、これを任意の遺伝子と結合させれば、リグニン化組織に特異的に働く人工遺伝子を作製することが可能である。即ち、図３に示したプロモーター部位のＤＮＡ断片を任意の構造遺伝子と連結することによって作製した人工遺伝子を植物中に導入することにより、その構造遺伝子の規定するタンパク質をリグニン化組織で特異的に発現させることができる。その結果、リグニンの構成成分の変換やリグニンと密接な関係にあるセルロースやヘミセルロースの含量にも影響を与えることが可能となり、これらの分子育種への道が開かれる。また、本発明で得られたユーカリプロモーター部位はユーカリのみならず他の植物においても機能すると考えられ、広く植物の分子育種に利用することが可能である。
【００５９】
本発明で得られたウドＣＡＤのｃＤＮＡは、ウドＣＡＤのサブユニット全長アミノ酸を規定している。従って、このｃＤＮＡを用いれば、人工的に作られた無細胞翻訳系及び大腸菌内によって、ＣＡＤを大量に発現させ、精製、単離することが可能である。このようにして大量にＣＡＤを得られれば、これに対する各種薬剤の効果をあらゆる方面から検討することによって、ＣＡＤに作用してその活性を抑制するような薬剤の開発が可能となる。即ち、ＣＡＤに特異的な抑制剤の投与により植物体中で約２５％を占めるリグニン生合成を止め、植物を枯死させることができれば、これを農薬として利用できる。ＣＡＤは植物に特異的であり、ＣＡＤを持たない動物への影響は極めて低いと考えられる。また、このようなＣＡＤ特異的薬剤の環境への悪影響は少なく有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製したウドＣＡＤのアミノ末端部分及びウドＣＡＤ由来の４つのペプチドのアミノ酸配列を示した。ペプチドＮはＣＡＤのアミノ末端からの配列である。
【図２】ウドＣＡＤ由来のペプチド＃１５のアミノ酸配列を参考にして作成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示した。
【図３】ユーカリＣＡＤ遺伝子クローンの制限酵素地図を示した。ＣＡＤをコードしている部位は斜線網掛けで示した。塩基配列を決定した領域を矢印で示した。プロモーター部位は別に指定した範囲である。
【産業上の利用分野】
本発明は、ウド及び広葉樹のシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（以下、ＣＡＤということもある）遺伝子及びそのプロモーター部位、並びにこれらの全部又は一部を用いて作成したアンチセンス遺伝子を導入してなるリグニン含量が調節された広葉樹に関するものである。
【０００２】
本発明のウド及びユーカリのＣＡＤのアミノ酸配列を規定する遺伝子は広葉樹で有効に発現し、広葉樹中のリグニン合成に関与するため、これらのアンセチンス遺伝子を広葉樹に導入することによって広葉樹に含まれるＣＡＤ活性を任意に変化させ、リグニン含量の制御を可能とするものである。紙パルプ生産において原料となる木材からのリグニン分解には多大のコストを要しているため、本発明によってリグニン含量を低下させた木材を紙パルプ生産に用いれば、リグニン除去に要するコストを大幅に低減させることができ、紙パルプ生産の分野において極めて有効である。
【０００３】
【従来の技術】
リグニンは高等植物が普遍的に有する高分子複合体であり、高等植物の細胞間に存在し、植物体の強度を保つ役割を担っている。リグニンの生合成は樋口ら（Ｗｏｏｄ Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，２４，２３，１９９０）により詳細に研究されてきた。特にシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼはその酵素学的性質がよく研究されている。１９８８年にＣ．Ｊ．ＬａｍｂらによりインゲンマメＣＡＤ遺伝子のｃＤＮＡの単離が報告された（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，５５４６，１９８８）。しかし彼らは１９９０年に発表した論文（Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５，５２５，１９９０）において、このｃＤＮＡのコードするタンパク質がトウモロコシのマリックエンザイムと高い相同性を有することから、ＣＡＤをコードすることに対しての疑問を示唆した。それ以降にマリックエンザイムが各種の植物で単離され、インゲンマメから単離したｃＤＮＡはＣＡＤをコードしていないことが明らかとなっている。このようなクローニングの誤ちは、ＣＡＤの生化学的性質が不明であったことに起因する。
【０００４】
その後、複数の研究グループによりＣＡＤに関する報告がなされた。１９９１年１０月に、タバコのＣＡＤ遺伝子の単離に関する報告（掲示番号：１６５３）が第３回国際植物分子生物学会（米国、ツーソン）の掲示発表においてなされたが、塩基配列及びアミノ酸配列に関する報告は皆無であった。また、同学会においてテーダ松のＣＡＤに関する報告（掲示番号：１１１１）もなされたが、アミノ末端の一部アミノ酸配列が示されるに留まった。この一部アミノ酸配列については１９９２年４月号のＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ誌に掲載された（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，９８，１３６４，１９９２）。ただし、テーダ松は裸子植物（針葉樹）であり、本発明の被子植物であるウド及びユーカリと比較した場合、ＣＡＤの酵素的な性質の相違が存在する。
【０００５】
植物中のリグニンを構成する単量体として２種のモノリグノール（コニフェリルアルコール（ＣＡ）及びシナピルアルコール（ＳＡ））が存在する。被子植物ではこの２種のモノリグノールが混合したリグニンを形成するが、裸子植物ではシナピルアルコールのみでリグニンが形成される。Ｋｕｔｓｕｋｉらの報告（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２１，１９，１９８２）において、複数の被子植物及び裸子植物からＣＡＤを部分精製し、ＣＡ及びＳＡに対する酵素活性の測定がなされ、被子植物ＣＡＤはＣＡ及びＳＡの双方に対して同等に作用するが、裸子植物ＣＡＤはＳＡに対する活性が低いことが示された。特に、マツ類ＣＡＤのＳＡに対する酵素活性は、ＣＡのそれに対して約５分の１以下であった。他の針葉樹ＣＡＤの基質特異性についての詳細なデータが、スプルース（トウヒ）ＣＡＤの精製に関する論文（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９，１１５，１９８４）に示されている。これによれば、スプルースＣＡＤはＣＡ及びＳＡに対する基質特異性に１０倍以上の差があることが明らかである。以上の観点から、裸子植物（特に針葉樹）ＣＡＤ及び被子植物ＣＡＤは基質の認識に関与する立体構造に決定的な違いがある、互いに異なる酵素であると結論される。
【０００６】
リグニンは紙パルプ生産過程において不要な物質であり、その除去過程に多大なコストを費やしている。従って、林木のリグニン含量を低減することは重要な育種目標である。近年の遺伝子組換え技術の進歩により、林木における該技術を用いた育種が可能となりつつある。従って、リグニン生合成に関与する遺伝子の単離および同定、これを用いた遺伝子組換え技術による林木の品種改良が待たれていた。
【０００７】
【本発明が解決しようとする課題】
本発明は上記に示した現状に鑑み、リグニン含量の低い林木の作出、並びに林木中のリグニン含有量のコントロールを目的として、リグニン生合成に関与する酵素群の中からシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼに着目し、この遺伝子の単離及び構造の解明のためになされたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、各方面から鋭意研究した結果、ウドの幼梢よりＣＡＤを精製し、部分的なアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列から推定されるオリゴヌクレオチドプローブを作成し、このフローブを用いてウド幼梢由来のｃＤＮＡライブラリーからＣＡＤのｃＤＮＡの釣り出しに成功した。さらにウドＣＡＤのｃＤＮＡをプローブとして用い、ユーカリ由来のゲノムライブラリーからＣＡＤ遺伝子の釣り出しに成功した。本発明は、以上の知見に基づいてさらに研究した結果、完成されたものである。即ち、本発明はウド並びにユーカリＣＡＤ遺伝子に関するものであって、それらの塩基配列は配列表の配列番号１並びに２に示した。
【０００９】
本発明によれば、ウドＣＡＤのｃＤＮＡをプローブとして用いることによりユーカリＣＡＤ遺伝子を釣り出すことができたが、このことはＣＡＤ塩基配列がウド及びユーカリといった被子植物間で高い相同性を有していることに他ならない。従って、ウド並びにユーカリのＣＡＤ遺伝子及びその断片をプローブに用いることにより、全ての被子植物からＣＡＤ遺伝子を釣り出すことが可能である。
【００１０】
ウドのＣＡＤ遺伝子、及び広葉樹のＣＡＤ遺伝子の全部または一部を用いて、アンチセンス遺伝子として人工的に構築し、この遺伝子をエレクトロポレーション法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９２，２２６，１９９０）及びアグロバクテリウムを用いる遺伝子導入法（Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，９３，１１１０，１９９０）等の確立された方法に従いウド、ユーカリはもとより、クワ、ポプラ等の広範囲の広葉樹に導入、発現させることが可能である。
【００１１】
本発明によれば、植物体再生が確立されている広葉樹であれば、ＣＡＤアンチセンス遺伝子を導入することによりリグニン含量の低減が可能である。例えばパルプ材として利用される木材を対象とすれば、リグニン含量の低い良質のパルプ材として作出することが可能である。
【００１２】
以降では本発明を実施例に基づいて詳細に説明する。操作の手順は特に記述しない限りにおいて、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．１９８７）に記載された方法に従った。
【００１３】
【実施例】
【００１４】
（１）材料
市販されている食用ウドを購入し、材料とした。ＣＡＤの活性測定用の基質であるコニフェリルアルデヒド、シナップアルデヒド（以下、両者を総称してアルデヒドと呼ぶ場合がある）については、Ｋｕｔｓｕｋｉらの方法（木材学会誌２７，５２０，１９８１）に従い合成した。コニフェリルアルコール、シナピルアルコール（以下、両者を総称してアルコールと呼ぶ場合がある）については、前者をアルドリッチ社から購入し、後者を岐阜大学、河合真吾博士より分譲して頂いた。
【００１５】
（２）ＣＡＤ活性の測定方法
アルコールからアルデヒドへの酸化反応は、２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２５）中に０．１ｍＭ ＮＡＤＰ＋、０．０７ｍＭ コニフェリルアルコール又はシナピルアルコールを加え全量を１ｍＬとし、酵素液を加えて３０℃でおこなった。反応は分光光度計の測定用セル中でおこない、生成したアルデヒドによる４００ｎｍの光吸収を測定し、ＣＡＤのアルコール酸化反応活性を計算した。
【００１６】
アルデヒドからアルコールへの還元反応は、１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．８）中に０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨ、０．０５ｍＭ コニフェリルアルデヒド又はシナップアルデヒドを加え全量を１ｍＬとし、酵素液を加えて３０℃でおこなった。反応は上記と同様におこない、減少したＮＡＤＰＨを３４０ｎｍの光吸収により測定し、ＣＡＤのアルデヒド還元反応活性を計算した。
【００１７】
（３）ＣＡＤの精製
市販のウドを吸水させながら１日放置すると、ＣＡＤ活性が約２倍に上昇したので、この処理をおこなったウド４．５ｋｇを出発試料とした。約１ｃｍ角に切断し、ＣＡＤ抽出用緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ β−メルカプトエタノール）４Ｌと混合した後、ジューサーミキサーを用いて細かく破砕した。試料溶液をガーゼをもちいて濾し、直ちに硫酸アンモニウムを４０％飽和濃度となるように加え、遠心分離をおこない、上清を回収した。上清に７０％飽和濃度となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離をおこない、沈澱を回収した。沈澱をＣＡＤ緩衝液（１０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール）に溶解させ酵素溶液とし、ゲルろ過をおこない脱塩した。酵素溶液に硫酸アンモニウムを加え、最終濃度を０．５Ｍとした後、０．５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した東ソー社製のブチルトヨパールによる疎水クロマトグラフィーをおこない酵素溶液を分画した。溶出は硫酸アンモニウムの０．５Ｍから０Ｍの直線濃度勾配によりおこなった。得られたＣＡＤ画分をゲルろ過により脱塩した後、ファルマシア社製のモノＱカラムを用いたイオン交換クロマトグラフィーをおこない、さらに細かく分画した。溶出は塩化ナトリウムの０Ｍから０．３Ｍの直線濃度勾配によりおこなった。得られたＣＡＤ画分をゲルろ過により脱塩した後、ファルマシア社製のＮＡＤＰ＋−アガロースを用いるアフィニティークロマトグラフィーをおこない、１ｍＭ ＮＡＤＰ＋でＣＡＤを溶出させた。これをウドＣＡＤ最終標本とした。
【００１８】
上記の方法により２４０μｇの精製ＣＡＤを得た。精製ＣＡＤをファルマシア社製のファストシステムを用いて８％から２５％の濃度勾配を持つポリアクリルアミドゲル電気泳動をおこない、銀染色法によりタンパク質を検出したところ、単一のバンドが確認できた。精製ＣＡＤをファルマシア社製のスーパーロース１２カラム及び同社製の分子量測定用マーカーを用いてゲルろ過をおこなった結果、ウドＣＡＤの分子量は７２，０００であることが判明した。この値は、既報のＣＡＤの分子量と類似していた。さらに、ＳＤＳを含む同様の電気泳動をおこなったところ、分子サイズが３８ｋＤａ及び３９ｋＤａと推定される２つのバンドが確認された。このことから、ウドＣＡＤは類似した２種類のサブユニットからなる２量体であることが示唆された。一方、基質に対するＫｍ値を測定したところ、既報のＣＡＤのＫｍ値に類似の値が得られた。また、低級アルデヒド（アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド）、ＮＡＤＨ及びＮＡＤ＋は、ＣＡＤの基質とはならないことも確認した。以上の結果から、精製した酵素標本がリグニン生合成系にのみ存在するアルデヒドおよびアルコールに対して高い基質特異性を有することが示され、本酵素標本はウドＣＡＤであることが明らかとなった。
【００１９】
（４）ウドＣＡＤのアミノ酸配列の決定
精製したＣＡＤを５０μｇ取り、モル比で１００倍のシアン化臭素を加え、４０℃で２０時間反応させたＣＡＤの部分分解をおこなった。反応終了後、試料溶液を凍結乾燥させ、得られたペプチドを０．１ｍＬの０．１％トリフルオロ酢酸（以下、ＴＦＡと省略する）に溶解した。これを日本分光社製のＣ１８・ＯＤＳカラムを用いる逆相クロマトグラフィーにより分画した。液相として０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルの０％から８０％の直線濃度勾配を用い、ペプチドの検出方法として２２０ｎｍの紫外線吸収を測定した。分画されたペプチドを各々凍結乾燥を経て回収した。アプライドバイオシステム社製の自動アミノ酸配列分析装置（モデルＮｏ．４７０Ａ）を用い、得られたペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、図１に示した４つのＣＡＤの部分アミノ酸配列が得られた。
【００２０】
（５）オリゴヌクレオチドの合成
図１に示したアミノ酸配列の中からペプチド＃１５のアミノ酸配列を選び、アプライドバイオシステム社製のＤＮＡ合成装置（モデルＮｏ．３８１Ａ）を用いてこれに相当するオリゴヌクレオチドを化学合成した。図２に合成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示した。
【００２１】
（６）ウドｃＤＮＡライブラリーの作成
ＣＡＤ精製に用いた際と同じウドを材料としてＲＮＡの抽出操作をおこない、２５０μｇの全ＲＮＡを得た。さらに、ファルマシア社製のオリゴｄＴカラムを用いてアフィニティークロマトグラフィーを行い、１３．５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡを得た。２μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡ、ファルマシア社製のｃＤＮＡ合成キット及びλｇｔ１１、ストラータジーン社製のファージ粒子パッケージングキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作成した。作成したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｙ１０８８）に感染させファージの増殖をおこなった際、ＳＭ緩衝液に溶出させ保存した。ライブラリー中の組換え体総数は約１６０万であった。
【００２２】
（７）ウドＣＡＤのｃＤＮＡ単離
プラークハイブリダイゼーション法に従い、ウドｃＤＮＡライブラリー中の約３０万の組換え体から、ＣＡＤのｃＤＮＡ単離をおこなった。プローブは、【００２０】に表記の合成オリゴヌクレオチドを〔γ−32Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドカイネースを用いてリン酸付加反応により標識したものを使用した。ハイブリダイゼーション時の温度は４２℃という比較的穏やかな条件に設定した。その結果、プローブと高い相同性を有するｃＤＮＡクローンが２０個得られたが、全て同一のｃＤＮＡクローンであることが判明したので、約１．４ｋｂｐ（１ｂｐは１塩基対）を有する最長のｃＤＮＡ断片をストラータジーン社製のプラスミドベクター（ブルースクリプトＳＫ＋）に移し換え、ｐＵＣＡＤ１０と命名した。以降の解析にはこのｐＵＣＡＤ１０を用いた。
【００２３】
（８）ウドＣＡＤのｃＤＮＡ解析及び同定
ｐＵＣＡＤ１０のｃＤＮＡ断片の塩基配列解析は、宝酒造社製のＭ１３シークエンスキットを用いてダイデオキシ法に従っておこなった。この際、プロメガ社製のデレーションキットを用いることにより、ｐＵＣＡＤ１０のｃＤＮＡ断片を一方向から約２５０塩基対の間隔で短くした計５つのｐＵＣＡＤ１０由来プラスミドを両方向について作成した。各々の塩基配列を約３００塩基対程度まで解析し、重複する塩基配列部分でつなぎ合わせた。得られたｐＵＣＡＤ１０の塩基配列を表１から表４で示した配列表の配列番号１に示した。
【００２４】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
即ち、上記に示した配列表の配列番号１の配列は
【００２３】に表記したｃＤＮＡ断片の塩基配列とこれによって規定されるアミノ酸配列を示すものである。
【００２９】
このｃＤＮＡによって規定されるアミノ酸配列をウドＣＡＤのアミノ酸配列解析から得られたアミノ酸配列と比較したところ、両者の配列がほぼ一致することが示された。一致した部分については配列表の配列番号１中の下線で示した。このことから本ｃＤＮＡはウドＣＡＤのｃＤＮＡであることが明らかとなった。また、アミノ末端の配列（図１のペプチドＮ）についても確認できたことから、本ｃＤＮＡはウドＣＡＤ全長を規定していることが示された。
【００３０】
これまでのＣＡＤについての報告と異なり、ウドＣＡＤは類似する２種のサブユニットからの構成されていることが明らかであり、得られたｃＤＮＡはどちらか一方のサブユニットのアミノ酸配列を規定する。本発明はＣＡＤ遺伝子を利用して、最終的に植物内のＣＡＤ活性を抑えるためのものである。即ち、サブユニットに対する発現抑制を行うことによって、本発明の目的は達成される。
【００３１】
（９）ユーカリゲノムライブラリーの作成
ユーカリ（ボトルオイデス種）苗状原基由来のカルスをＭＳ培地上で生育させた。日尾野らの方法（第３６回リグニン討論会要旨集、６１頁、１９９１）に従い、ユーカリカルスからゲノムＤＮＡを抽出後、制限酵素（Ｓａｕ３ＡＩ）により部分分解し、塩化ナトリウムの２％から２５％の直線密度勾配遠心法により約１６から２０ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を回収した。このゲノムＤＮＡ断片とストラタジーン社製のＥＭＢＬ３及びファージ粒子パッケージングキットを用いて、ユーカリゲノムライブラリーを作成した。作成したｃＤＮＡライブラリーを大腸菌（ＳＲＢ）に感染させファージの増殖をおこなった後、ＳＭ緩衝液に溶出させ保存した。ライブラリー中の組換え体総数は約２５０万であった。
【００３２】
（１０）ユーカリＣＡＤ遺伝子の単離
プラークハイブリダイゼーション法に従い、ユーカリゲノムライブラリー中の約５０万の組換え体から、ＣＡＤ遺伝子の単離をおこなった。プローブは、ウドＣＡＤのｃＤＮＡ断片全長を〔α−32Ｐ〕ｄＣＴＰ及びベーリンガー社製ランダムプライムドＤＮＡラベリングキットを用いて標識したものを使用した。その結果、プローブと高い相同性を有するＣＡＤ遺伝子クローンが３つ得られた。これらの制限酵素地図の作成を行った。図３に示すように、３つのクローンのうち２つは互いに重複するクローンであり、残りの１つはユーカリ遺伝子断片上のＣＡＤを含まない部分において１箇所のみ制限酵素部位の相違が見られた。これは、作物などのように人工的に純系とされたものと異なり、林木においては対になる相同染色体間で微細な相違があることに起因すると推定される。３つのクローンは、λＥＣＡＤ７４、λＥＣＡＤ７２、λＥＣＡＤ２１と命名した。これらのクローン中にＣＡＤ遺伝子全域が含まれていることを確認するために、ウドＣＡＤのｃＤＮＡのＮ末端側の断片及びＣ末端側の断片を各々プローブとして用い、サザン分析を行なった。プローブとした断片はｐＵＣＡＤ１０の塩基配列を解析する際に作成したデレーションクローンの中から、Ｎ末端側およびＣ末端側を有するものを選び、そのｃＤＮＡ断片を制限酵素で切断して用いた。即ち、Ｎ端側プローブは配列表の配列番号１に示した１番から２０３番で示した塩基配列を有するＤＮＡ断片であり、Ｃ末端側プローブは配列表の配列番号１に示した９５１番から１３３６番で示した塩基配列を有するＤＮＡ断片である。ユーカリＣＡＤクローンを制限酵素ＳａｌＩで消化した後、アガロース電気泳動により分離し、ナイロン膜に転写した。このＤＮＡを転写したナイロン膜に対して、上記のＮ末端側及びＣ末端側のプローブ各々を用いてサザン分析を行なった結果、λＥＣＡＤ７４、λＥＣＡＤ２１については両プローブともにハイブリダイズした。従ってこの２つのクローンはユーカリＣＡＤ全長をコードしていると結論した。λＥＣＡＤ７２については、Ｃ末端側プローブのみハイブリダイズしなかったので、このクローンはＣ末端の一部を欠いていると考えられる。図３に斜線網掛けで示すプローブと相同性を有する断片（ＳａｌＩによって切断される断片）を宝酒造社製のプラスミドベクター（ｐＵＣ１９）に連結し、各々ｐＥＣＡＤＳ１、ｐＥＣＡＤＳ２、ｐＥＣＡＤＳ３と命名した。即ち、ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ２はユーカリＣＡＤ全長をコードするＤＮＡ断片を有するプラスミドである。尚、ｐＥＣＡＤＳ１については、このプラスミドを有する大腸菌（識別のための表示：Ｅ．ｃｏｌｉ ｐＥＣＡＤＳ１）を通産省工業技術院、生命工学工業技術研究所、特許微生物寄託センターに寄託した（ＦＥＲＭ Ｐ−１３６５３）。尚、ラムダファージクローンλＥＣＡＤ７４については上記機関がファージの寄託を受け付けていないために寄託はできないが、第３者からの申し出が生じた場合、ファージクローンの分譲は可能である。
【００３３】
（１２）ユーカリＣＡＤ遺伝子の解析
ｐＥＣＡＤＳ１については遺伝子断片が８ｋｂに及ぶのでゲノムＤＮＡ断片の塩基配列解析を行なうにあたって、さらに小断片化及びそのサザン分析を行なった。その結果、制限酵素（ＳａｌＩ及びＢｇｌＩ）を用いることによって得られる約３．３ｋｂｐの断片がＣＡＤ全長をコードしていることが判明したので、これについて塩基配列解析を行うことにした。この３．３ｋｂｐのゲノムＤＮＡ断片を末端平滑化した後、制限酵素（ＳｍａＩ）で消化済みの宝酒造社製のプラスミドベクター（ｐＵＣ１１９）に連結し、ｐＥＣＡＤＳ１３３と命名した。塩基配列解析は、宝酒造社製のＭ１３シークエンスキットを用いてダイデオキシ法に従って行なった。この際、プロメガ社製のデレーションキットを用いることにより、ｐＥＣＡＤＳ１３３のゲノム断片を一方向から約２５０塩基対の間隔で短かくした計９つのｐＥＣＡＤＳ１３３由来プラスミドを両方向について作成した。各々の塩基配列を約３００塩基対程度まで解析し、重複する塩基配列部分でつなぎ合わせた。ｐＥＣＡＤＳ２及びｐＥＣＡＤＳ３についても同様の塩基配列解析を行なったがこれら３つのクローンの塩基配列は全て同一であった。従って、以下にｐＥＣＡＤＳ１３３のゲノムＤＮＡの塩基配列を表５から表１１で示した配列表の配列番号２に示した。
【００３４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
【表１１】
即ち、上記に示した配列表の配列番号２の配列は
【００３３】に表記したユーカリゲノムＤＮＡ断片の塩基配列、これによって規定されるアミノ酸配列を示すものである。この塩基配列中には、プロモーター部位及び４つの介在配列が存在した。
【００４２】
両者のアミノ酸配列は８０．７％の相同性を有することから、本ゲノムＤＮＡはューカリＣＡＤ全長を規定しているユーカリＣＡＤ遺伝子であることが明らかとなった。また、ウド及びユーカリ間において、ＣＡＤ遺伝子の塩基配列の相同性が７６．６％と高いことから（コード領域のみ）。被子植物全般でＣＡＤ遺伝子の塩基配列が類似していることが推定された。
【００４３】
本ユーカリＣＡＤ遺伝子の５′上流側の塩基配列中には、転写開始シグナルであるＴＡＴＡボックス（配列表の配列番号２の４７４から４８１）、ＣＡＴボックス（配列表の配列番号２の４２から４５、３６４から３６７及び２３から４２７）及び２カ所の繰り返し配列（配列表の配列番号２の１２３から１４０までと１５９から１７６及び４４１から４５０までと４４８から４５７）といったプロモーターに特異的な配列が存在した。即ち、このプロモーター領域はＣＡＤ遺伝子の発現において、時期及び組織特異的な制御を担っていると考えられる。
【００４４】
（１２）ウドＣＡＤのｃＤＮＡを用いたアンチセンス遺伝子の作成
ウドＣＡＤのｃＤＮＡクローン（ｐＵＣＡＤ１０）の制限酵素（ＮｏｔＩ）消化してｃＤＮＡ断片全長を取り出し、宝酒造社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。また、２つの制限酵素（ＡｃｃＩ及びＫｐｎＩ）を用い消化により、約６５０ｂｐの部分断片を取り出し、同様に平滑末端処理した。一方、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを有するクローンテック社製のＴｉプラスミドベクター（ｐＢＩ１２１）からＧＵＳ遺伝子を除いて平滑末端処理した。上記の平滑末端化したＣＡＤのＤＮＡ断片とベクターを各々連結し、ｃＤＮＡ断片の連結方向が異なる２種のプラスミドＤＮＡを得た。これらの内、ｃＤＮＡの連結が３５Ｓプロモーターに対して逆方向、即ち本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対の向き、であるプラスミドＤＮＡについて、全長断片を含むものをｐＵＣＡＤ１２１Ａと命名し、部分断片を含むものをｐＵＣＡＤ１２１ａと命名した。即ち、ｐＵＣＡＤ１２１ＡはウドＣＡＤ遺伝子全長を含むアンチセンス遺伝子、ｐＵＣＡＤ１２１ａはウドＣＡＤ遺伝子部分断片を含むアンチセンス遺伝子である。
【００４５】
（１３）ユーカリＣＡＤ遺伝子を用いたアンチセンス遺伝子の作成
ユーカリＣＡＤ遺伝子クローン（ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ１３３）のインサートＤＮＡ全長を制限酵素消化してゲノムＤＮＡ断片を取り出し、宝酒造社製のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端処理した。一方、カリフラワーモザイクウィルス由来の３５Ｓプロモーターを有するクローンテック社製のＴｉプラスミドベクター（ｐＢＩ１２１）からＧＵＳ遺伝子を除いて平滑末端処理した。上記の平滑末端化したＤＮＡを連結し、ｐＥＣＡＤＳ１及びｐＥＣＡＤＳ１３３各々に由来するゲノムＤＮＡ断片について、連結の向きが異なる２種のプラスミドＤＮＡを得た。これらの内、ゲノムＤＮＡの連結が３５Ｓプロモーターに対して逆方向、即ち本来のアミノ酸配列を規定する向きとは反対の向き、であるプラスミドＤＮＡをｐＥＣＡＤ１２１Ａと命名した。即ち、ｐＥＣＡＤ１２１ＡはユーカリＣＡＤアンチセンス遺伝子である。同様にｐＥＣＡＤＳ１３３由来のアンチセンス遺伝子をｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３と命名した。
【００４６】
（１４）ウドＣＡＤのアンチセンス遺伝子の広葉樹への導入
ｐＵＣＡＤ１２１Ａ及びｐＵＣＡＤ１２１ａのプラスミドＤＮＡを太田らの方法（特許出願番号、平２−１６２６９５）に従って、各々ユーカリに導入し、植物体を再生させた。
【００４７】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＵＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを、別の３株からｐＵＣＡＤ１２１ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら７つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＵＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１４％から２７％であり、これらは平均で７８％の活性減少が示された。一方、ｐＵＣＡＤ１２１ａの導入された３株のＣＡＤ活性は対照とした植物体に比べ１６％から３５％であり、平均で７６％の活性減少が示された。
【００４８】
ｐＵＣＡＤ１２１ＡのプラスミドＤＮＡを町井らの方法（日本蚕系学会誌５９，１０５，１９９０）に従ってクワに導入し、植物体を再生させた。
【００４９】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、３株からｐＵＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら３つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＵＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１２％から２５％であり、これらは平均で８２％の活性減少が示された。
【００５０】
これらの結果から、本発明のウドＣＡＤの全部又は一部を用いて作成したアンチセンス遺伝子により、これらを用いて作出した形質転換植物中でのＣＡＤ活性を低減させることが可能であることが示された。これにより広葉樹におけるリグニン含量を低減させることが可能であることが示唆された。
【００５１】
（１５）ユーカリＣＡＤのアンチセンス遺伝子の広葉樹への導入
ｐＥＣＡＤ１２１Ａ及びｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３の各々のプラスミドＤＮＡを太田らの方法（特許出願番号、平２−１６２６９５）に従ってユーカリに導入し、植物体を再生させた。
【００５２】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを、３株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３由来のＤＮＡを確認できた。これら計７つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。ｐＥＣＡＤ１２１Ａの導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ６％から１５％であり、これらは平均で８９％の活性減少が示された。一方ｐＥＣＡＤ１２１Ａ３３の導入された３株についても同様の結果が得られ、平均で９０％のＣＡＤの活性減少が示された。
【００５３】
ｐＥＣＡＤ１２１ＡのプラスミドＤＮＡを町井らの方法（日本蚕糸学会誌５９，１０５，１９９０）に従ってクワに導入し、植物体を再生させた。
【００５４】
全ての形質転換体よりゲノムＤＮＡを抽出し、各々について導入したプラスミドＤＮＡをプローブとしてサザン分析をおこなったところ、４株からｐＥＣＡＤ１２１Ａ由来のＤＮＡを確認できた。これら計４つの形質転換体からタンパク質を抽出して、ＣＡＤ活性を測定した。その結果、ｐＥＣＡＤ１２１Ａに導入された４株のＣＡＤ活性は対照植物体に比べ１２％から２４％であり、これらは平均で８２％の活性減少が示された。
【００５５】
これらの結果から、本発明のユーカリＣＡＤのアンチセンス遺伝子により、これらを用いて作出した形質転換植物中でのＣＡＤ活性を低減させることが可能であることが示された。これにより広葉樹におけるリグニン含量を低減させることが可能であることが示唆された。
【００５６】
【発明の効果】
本発明によって初めて、ウド及びユーカリからのＣＡＤ遺伝子の単離に成功した。このことにより本発明は、各種の著効を奏する事が可能であり、それらを以下に説明する。
【００５７】
ＣＡＤの植物のリグニン生合成反応に関与しており、本発明により得られたＣＡＤ遺伝子を用いることにより、広葉樹においてＣＡＤ活性を調節可能であることを示した。従って、林木に含まれるリグニン含量を低減させることが可能であり、これは紙パルプ産業におけるリグニン除去にかかるコストを大きく節約する事になる。
【００５８】
本発明者らは、ＣＡＤが木化（即ち、リグニン化）していく組織中に特異的に発現していることを確認している。即ち、ＣＡＤ遺伝子はリグニン化組織においてのみ特異的な発現がなされている。本発明で得られたユーカリＣＡＤ遺伝子のプロモーター部位はこの特異的発現を担うものであり、これを任意の遺伝子と結合させれば、リグニン化組織に特異的に働く人工遺伝子を作製することが可能である。即ち、図３に示したプロモーター部位のＤＮＡ断片を任意の構造遺伝子と連結することによって作製した人工遺伝子を植物中に導入することにより、その構造遺伝子の規定するタンパク質をリグニン化組織で特異的に発現させることができる。その結果、リグニンの構成成分の変換やリグニンと密接な関係にあるセルロースやヘミセルロースの含量にも影響を与えることが可能となり、これらの分子育種への道が開かれる。また、本発明で得られたユーカリプロモーター部位はユーカリのみならず他の植物においても機能すると考えられ、広く植物の分子育種に利用することが可能である。
【００５９】
本発明で得られたウドＣＡＤのｃＤＮＡは、ウドＣＡＤのサブユニット全長アミノ酸を規定している。従って、このｃＤＮＡを用いれば、人工的に作られた無細胞翻訳系及び大腸菌内によって、ＣＡＤを大量に発現させ、精製、単離することが可能である。このようにして大量にＣＡＤを得られれば、これに対する各種薬剤の効果をあらゆる方面から検討することによって、ＣＡＤに作用してその活性を抑制するような薬剤の開発が可能となる。即ち、ＣＡＤに特異的な抑制剤の投与により植物体中で約２５％を占めるリグニン生合成を止め、植物を枯死させることができれば、これを農薬として利用できる。ＣＡＤは植物に特異的であり、ＣＡＤを持たない動物への影響は極めて低いと考えられる。また、このようなＣＡＤ特異的薬剤の環境への悪影響は少なく有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】精製したウドＣＡＤのアミノ末端部分及びウドＣＡＤ由来の４つのペプチドのアミノ酸配列を示した。ペプチドＮはＣＡＤのアミノ末端からの配列である。
【図２】ウドＣＡＤ由来のペプチド＃１５のアミノ酸配列を参考にして作成したオリゴヌクレオチドの塩基配列を示した。
【図３】ユーカリＣＡＤ遺伝子クローンの制限酵素地図を示した。ＣＡＤをコードしている部位は斜線網掛けで示した。塩基配列を決定した領域を矢印で示した。プロモーター部位は別に指定した範囲である。
Claims (2)
- 配列表の配列番号１に示した１番から３５８番によって規定されるウドのシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子。
- 配列表の配列番号２に示した１番から３５５番によって規定されるユーカリのシンナミルアルコールデヒドロゲナーゼのアミノ酸配列をコードする遺伝子。
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