【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、ピレスロイド系化合物と結合する抗体、並びに抗体を製造する上で必要とするハプテン化合物、該ハプテン化合物の中間体、並びにこれらの製造方法、並びに抗体を用いて水、土壌などの自然環境試料、および、穀物などの食料試料からピレスロイド系化合物を検出する免疫学的検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ピレスロイド系化合物の免疫化学的分析方法としては、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｍｏｃｋらによるＳ−Ｂｉｏａｌｌｅｔｈｒｉｎに対する特異的抗体の研究（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２６：１３２８−１３３３，１９７８）およびラジオイムノアッセイ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ ３５：１６１９−１６２０，１９７９）がある。これらは免疫化学的分析方法を特定のピレスロイドに適用した基礎的な研究である。Ｌ．Ｈ．Ｓｔａｎｋｅｒらは食肉中のパーメスリンの免疫化学的分析方法について基礎的研究を報告している（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．３７：８３４−８３９，１９８９）。これはフェノスリンのジメチルビニル基をオゾン酸化してカルボン酸誘導体とし、これをタンパク質と結合させたハプテン−タンパク結合体を使用して動物に免疫することで３種類のモノクローナル抗体を単離した。しかしながら、この抗体はフェノスリン、パーメスリン、サイパーメスリン、デルタメスリンのみが検出可能であり、その他の合成ピレスロイドに対しては検出感度が非常に低い。また、抗体と検出対象化合物とを反応させる場合、試料中化合物の溶解性を高め反応し易くするために、水溶性有機溶媒（アセトニトリルなど）が添加される。しかし、抗体の有機溶媒に対する安定性から添加量は６％以下と低濃度でなければならず、水溶解度の極端に低い化合物の検出が難しいことや、微量分析に伴い溶媒の除去または濃縮操作が必要になるなどの課題が残されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
自然環境下での残留農薬、および、最近とくに増加してきた輸入食料のポストハーベスト農薬などの残留問題には大きな社会的関心がよせられている。これらの安全性確保のためには、自然環境および食料の多くの試料について含有される農薬残留量を、正確かつ迅速に測定する必要がある。従来、残留農薬は、主に、ガスクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィーを用いて測定しているが、これらの方法は、分析試料の調製に多大の手間と時間を必要とし、また、測定機器や試薬類が高価であるという欠点があるため、簡便、経済的かつ迅速に行うことのできる新しい測定方法が望まれている。
【０００４】
本発明の分析対象であるピレスロイド系化合物は穀物、果物、野菜、綿、コーヒー、および茶、動物、森林の樹木、家庭の衛生害虫駆除などに広く使用されている広範なスペクトルを有する汎用殺虫剤である。ピレスロイド系化合物は、他の多くの殺虫剤に比べて哺乳動物に対する毒性が低く、また、抵抗性害虫の防除に効果があるためその用途が拡大している。しかし、これら化合物にはそれぞれ、大部分の食品中における残留量の上限が法的に定められており、また、ピレスロイド系化合物の多くは水棲生物に対し強い毒性を有するため自然環境への影響が憂慮されている。従って、本発明の目的は、今後も増加が予想される自然環境および食料の残留分析が必要となる試料中のピレスロイド系化合物を、簡便、経済的かつ迅速に分析する方法を提供することである。特に輸入農産物の残留農薬を従来法で分析するには、今後、規制対象農薬の増加に伴い試料が膨大になるため経費、労力の点から対応しきれないのが現状である。本発明は、残留農薬の成分分析を実施する前に、あらかじめ分析対象試料がどのようなタイプの農薬がどの程度残留しているか検査することも可能である。さらに、今まで製造されている抗体の持つ弱点である有機溶媒に対する不安定性を克服できれば、ＥＬＩＳＡ法を応用できるピレスロイド系化合物の数が増える可能性も高くなり、輸入農産物分析に係わる諸問題を始め、前述した多くの課題が解決される。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
発明者らは前述の課題を解決するためにピレスロイド系化合物の免疫化学的分析法を検討し、自然環境および食料試料でのピレスロイド系化合物の簡便かつ迅速な検出方法として、間接競合ＥＬＩＳＡ法が有効であることを見いだし本発明を完成した。
【０００６】
すなわち、本発明は（ａ）下記一般式（１）（化５）または（２）（化６）の化合物（以下、ハプテン化合物という。）
【０００７】
【化５】
【０００８】
【化６】
【０００９】
（式中、Ｒ１ は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５ のハロアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルキルチオ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシカボニル基、Ｃ１〜Ｃ５ のハロアルコキシカルボニル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６ のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を表わし、Ｒ２ はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ３ は水素原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ２とＲ３はそれらが結合してＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ４、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表わし、Ｂは−ＣＨ２−、−ＮＲ６−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ６ は水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｚは−Ｙ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＨまたは −Ｙ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２を表わし、Ｙは−Ｈ２Ｃ−、−ＮＲ７−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ７ は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｍおよびｎは１〜５を表わす。）と高分子化合物の結合体を免疫原として動物に免疫することにより得られるピレスロイド系化合物に対する抗体を第一抗体とし、該第一抗体を試料溶液に混合した後、未反応の第一抗体を担体の表面にコートした高分子化合物とハプテンの結合体（以下、コーティング抗原と表す。）に結合させて抗原抗体結合体を得、該抗原抗体結合体に、標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体（以下、第二抗体と表す。）を反応させることからなるピレスロイド系化合物の検出方法、（ｂ）一般式（１）および（２）のハプテン化合物、（ｃ）一般式（１）および（２）を製造するための下記一般式（３）（化７）および（４）（化８）
【００１０】
【化７】
【００１１】
【化８】
【００１２】
（式中、Ｒ１ は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルコキシ基、Ｃ１〜 Ｃ５のアルキルチオ基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５ のアルケニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルチオ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニル基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のハロアルケニルオキシ基、Ｃ２〜Ｃ５のアルキニルオキシ基、Ｃ１〜Ｃ５のアルコキシカボニル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルコキシカルボニル基、Ｃ３ 〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６ のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を表わし、Ｒ２ はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ３ は水素原子、Ｃ１〜Ｃ５のアルキル基、Ｃ１〜Ｃ５のハロアルキル基を表わし、Ｒ２とＲ３はそれらが結合してＣ３〜Ｃ６のシクロアルキル基、Ｃ３〜Ｃ６のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ４、Ｒ５は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表し、Ｂは−ＣＨ２−、−ＮＲ６−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ６ は水素原子またたは低級アルキル基を表わし、Ｚ’は−Ｙ’−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯＯＲ７’ または−Ｙ’−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨＲ８を表わし、Ｙ’は−ＣＨ２Ｏ−、−ＮＲ９−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ７’はＣ１〜Ｃ５のアルキル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルキルチオ低級アルキル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロフラニル基、フェニル基、フェニルオキシ低級アルキル基、フェナシル基、ジアシルメチル基、Ｎ−フタルイミドメチル基、ベンジル基、シリル基を表わし、ｍは１〜５を表わし、Ｒ８ はホルミル基、アセチル基、ハロアセチル基、プロピオニル基、フェニルアセチル基、アルコキシカルボニル基、ハロアルコキシカルボニル基、フルオレンメチルカルボニル基、フェニルオキシカルボニル基、フェニルチオカルボニル基、ピペリジニルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基を表わす。Ｒ９ は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｎは１〜５を表わす。）で表わされるハプテン化合物中間体、（ｄ）一般式（１）または（２）のハプテン化合物と高分子化合物との結合体、（ｅ）アルコール類、ジメチルスルフォキシドまたはアセトニトリルの存在下に安定なピレスロイド系化合物を認識し得る抗体を提供するものである。
【００１３】
すなわち、ハプテン化合物と高分子化合物（例えばタンパク質）の結合体を免疫原として動物に免疫することによって得たピレスロイド系化合物に対する抗体を第一抗体とし、所定量の第一抗体とピレスロイド系化合物を含む試料溶液を混合し、反応液に含まれる未反応の第一抗体を、担体の表面にコートしたコーティング抗原に結合させ、標識酵素を結合した第二抗体を担体に結合した第一抗体に反応させた後、酵素の基質および酵素反応によって発色する発色試薬を含有する緩衝液を添加し、発色させた後に吸光度を測定し、その測定値から検量線をもとに試料中のピレスロイド系化合物の濃度を算出するものである。ここで使用する第一抗体は、免疫原として高分子化合物、例えばタンパク質と本発明のハプテン化合物との結合体を免疫原とし得たものである。一般式（１）において各種置換基の様々な組み合わせで多くの化合物を例示することができるが、好ましくはＡは炭素原子、Ｂは酸素原子である。さらに好ましくは、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ２およびＲ３はメチル基、ＺにおいてＹは酸素原子である。最も好ましくはＺはヒドロキシカルボニルメチルオキシ基であり、Ｒ２ およびＲ３ はメチル基、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ４およびＲ５は水素原子である。
【００１４】
また一般式（２）においても同様に多くの化合物を例示することができるが、好ましくはＡは炭素原子、Ｂは酸素原子、ＺにおいてＹは酸素原子である。最も好ましくはＲ１ はアルコキシ基またはハロアルコキシ基、Ｒ２およびＲ３はメチル基、Ｒ４およびＲ５は水素原子、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｚは４−ヒドロキシカルボニルメチルオキシ基である。
【００１５】
これらハプテン化合物は一般式（３）または（４）から製造することができる。一般式（３）または（４）の化合物を塩基または酸存在下で加水分解するか、あるいは還元することでそれぞれ相当する一般式（１）または（２）のハプテン化合物を得ることができる。ここで一般式（３）において各種置換基の組み合わせにより多くの化合物を例示することができるが、最も好ましくはＺ’ がメトキシカルボニルメチロキシ基であり、Ｒ２およびＲ３はメチル基、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ４よびＲ５は水素原子である。
【００１６】
これら中間体（３）および（４）は既知の化合物より製造することができる。すなわち、一般式（５）（化９）
【００１７】
【化９】
【００１８】
（式中、Ａ、Ｂ、Ｙ、Ｒ２〜Ｒ５は前記の意味を表わす。）の化合物と、一般式（６）（化１０）
【００１９】
【化１０】
【００２０】
（式中、Ｘはハロゲン原子、ｍおよびＲ７’は前記の意味を表わす。）の化合物とを塩基存在下縮合させることにより一般式（３）の化合物を製造することができる。
【００２１】
また一般式（５）の化合物と一般式（７）（化１１）
【００２２】
【化１１】
【００２３】
（式中、Ｘはハロゲン原子、ｎおよびＲ８ は前記の意味を表わす。）の化合物とを塩基存在下縮合させることで（ａ）と同様にして一般式（３）の化合物を製造することができる。
【００２４】
また一般式（８）（化１２）
【００２５】
【化１２】
【００２６】
（式中、Ｒ１〜Ｒ５、Ａ、ＢおよびＹ’ は前記の意味を表わす。）と一般式（６）または一般式（７）の化合物と塩基存在下縮合させることにより一般式（４）の化合物を製造することができる。
【００２７】
これらハプテン化合物中間体を製造する際の原料となる一般式（５）の化合物において、Ａが炭素原子でかつＢが酸素原子である化合物は、特開昭５８−３２８４０号公報、特開昭５８−７７８３６号公報に記載の公知化合物、またはそれら化合物の製造方法で容易に得ることができる。またＡおよびＢが共に炭素原子である化合物は特開昭６２−２０１８３５号公報に記載の公知化合物により公知の反応で製造することができる。例えば化合物（９）（化１３）
【００２８】
【化１３】
【００２９】
を極性有機溶媒中で塩基（例えばカリウムターシャリーブトキサイドのような強塩基）と反応させることで相当するフェノール誘導体を製造することができる。また一般式（５）の化合物においてＡがケイ素原子である場合、特開昭６１−２６３９８８号公報、特開昭６２−１０６０３２号公報に記載された公知の有機ケイ素化合物より公知の反応で製造することができる。例えば化合物（１０）（化１４）
【００３０】
【化１４】
【００３１】
を極性溶媒中で塩基（えばカリウムターシャリーブトキサイドのような強塩基）と反応させることで相当するフェノール誘導体を製造することができる。
【００３２】
もう一方のハプテン化合物中間体を製造する際の原料となる一般式（８）の化合物においてＡが炭素原子、Ｂが酸素原子である化合物は、特開昭５８−３２８４０号公報、特開昭５８−７７８３６号公報に記載の公知化合物またはそれら化合物の製造方法で容易に得ることができる。またＡおよびＢが炭素原子である化合物は特開昭６２−２０１８３５号公報に記載の公知化合物より公知の反応で製造できる。例えば化合物（１１）（化１５）
【００３３】
【化１５】
【００３４】
のメトキシメトキシ基を酸で処理して相当するフェノール誘導体を製造することができる。化合物（１１）は化合物（１２）（化１６）と化合物（１３）（化１７）を縮合し接触還元することで製造することができる。
【００３５】
【化１６】
【００３６】
【化１７】
【００３７】
またＡがケイ素原子である化合物は、特開昭６１−２６３９８８号公報、特開昭６２−１０６０３２号公報に記載された公知の有機ケイ素化合物より公知の反応で製造することができる。例えば化合物（１４）（化１８）
【００３８】
【化１８】
【００３９】
のメトキシメトキシ基を酸で処理して相当するフェノール誘導体を製造することができる。化合物（１４）は化合物（１５）（化１９）と化合物（１６）（化２０）とを塩基存在下縮合させることにより容易に製造することができる。
【００４０】
【化１９】
【００４１】
【化２０】
【００４２】
第一抗体を産生するための免疫原は、一般式（１）または（２）のハプテン化合物と高分子化合物（例えば血清タンパク質であるアルブミン、グロブリン、ヘモシアニンなどや、アゾフェニル酢酸、グルタミン−アデニン−チロシン共重合体など）とを結合試薬存在下で縮合させることにより製造できる。特にハプテン化合物がカルボン酸誘導体の場合、Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎｇｅｒらによる混合酸無水物法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２３４，１０９０−１０９４（１９５９））によってタンパク質と結合させることが一般的である。
【００４３】
本発明の検出法で使用する担体としては、ＥＬＩＳＡ法において通常用いられる担体を使用することができ、種々の形が可能である。例えば管、ウェルプレート、マイクロプレート、細長いスティック、薄いストリップまたはビーズなどがあげられる。このような固相の表面を形成する材料としてはポリスチレンもしくは他の適当なプラスチック、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラス、シリカなどがあげられる。特に限定されないが、ポリスチレンの９６穴マイクロプレートの使用が適している。
【００４４】
本発明の測定法において、コーティング抗原の担体表面へのコートは、ハプテン化合物と第一抗体を産生する動物種の血清アルブミンの結合体を、コーティング緩衝液で希釈し、担体に添加した後、インキュベーションすることによって行われる。ここで使用するコーティング緩衝液としては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ）の組成のものを使用するのが適してるが、コーティングを妨げる界面活性剤などを含まなければ、これのみに限定されるものではない。また、コーティング用結合体に用いるタンパク質は、免疫原に用いたもの以外のタンパク質を用いることが可能であり、免疫原の作製の場合と同様にして結合体を製造することができる。担体の抗原によるコーティングの条件について検討した結果、コーティング抗原の濃度は０．０１から０．１μｇ／ｍｌが適している。使用する量としては、９６穴マイクプレートを使用する場合には０．１ｍｇ／ｗｅｌｌ程度が望ましい。また、インキュベーションの条件としては、４℃で一晩のインキュベーションが適している。担体にコーティング抗原を吸着させた後、抗体の非特異的結合を防止するために抗原以外の蛋白質で抗原が吸着していない部分をブロックする必要がある。ブロッキングには３％のスキムミルク溶液と担体と２５℃で１時間インキュベーションする。担体はインキュベーション後、洗浄緩衝液（１０ｍＭン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適している。）で洗浄する。
【００４５】
本発明の方法は、ピレスロイド系化合物と第一抗体との反応溶液に高濃度の有機溶媒を加えることにより、ピレスロイド系化合物と第一抗体との反応をし易くくすることを特徴とする。一般にピレスロイド系化合物の水に対する溶解度は極めて低く、通常の条件下では第一抗体と十分に効率よく反応させることができない。そこで種々条件を検討した結果、反応系に有機溶媒を添加することで抗体とピレスロイド系化合物の反応を可能にすることができる。添加する有機溶媒としてはメタノール、エタノール等のアルコール類、ジメチルスルホキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド、ＨＭＰＡ、ＤＭＩ、アセトニトリル、アセトンなどの水溶性有機溶媒があげられる。第一抗体の有機溶媒に対する安定性からアルコール類、ジメチルスルフォキシド、アセトニトリルが適し、特にメタノールが適し、その溶媒濃度は２０％から５０％が適している。本発明の第一抗体が有機溶媒のこれらの濃度において安定であることは驚くべきことである。また第一抗体は希釈用緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ）で反応溶液中の抗体濃度が２０，０００から８０，０００倍希釈となるように調製する。水田水や水道水などの自然環境中の水類を試料とする場合には、試料に直接、第一抗体溶液や有機溶媒を所定の濃度になるように添加することにより、反応溶液を調製する。また、食料、植物および土壌などの試料では、有機溶媒で試料からピレスロイド系化合物を抽出した後、溶媒抽出溶液に抗体溶液を添加して反応溶液を調製することができる。この反応溶液を２５℃で１時間インキュベーションし反応させる。上記のように調製したピレスロイド系化合物と第一抗体の反応溶液中の未反応の第一抗体を、担体に結合したコーティング抗原と反応させる。反応溶液を担体に添加し２５℃で１時間インュベーションする。反応後、洗浄緩衝液で担体を洗浄して、第二抗体との反応に供する。
【００４６】
本発明の測定法において使用する第二抗体としては、酵素を結合した第一抗体に対する抗体を用いることができる。第一抗体としてウサギ抗血清を用いる場合、ペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ画分を用いるのが適当である。担体に結合した第一抗体に約５，０００から１０，０００倍、好ましくは最終吸光度が１．０から１．５となるよう希釈した第二抗体を反応させるのが望ましい。希釈には洗浄用緩衝液を用いる。反応は２５℃で１時間行い、反応後、洗浄緩衝液で洗浄する。また、アビジン−ビオチン反応を利用して、第二抗体としてビオチンを結合した第一抗体に対する抗体と酵素を結合したアビジンを組み合わせて用いることもできる。担体に結合した第一抗体に約２，０００倍に希釈したビオチンを結合した抗ウサギＩｇＧロバＩｇＧ画分を反応させた後、洗浄し、約１，０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼを結合したアビジンを加えるのが望ましいが、第二抗体を産生する動物、および、用いる酵素については他の動物および酵素であってもさしつかえない。希釈には洗浄用緩衝液を用い、反応はどちらも２５℃で１時間行い、反応後、洗浄緩衝液で洗浄して、酵素反応に供する。担体に結合した第二抗体の酵素と基質との反応によって発色する試薬を加え、吸光度を測定することによって検量線からピレスロイド系化合物の量を算出することができる。
【００４７】
第二抗体にペルオキシダーゼを使用する場合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてｏ‐フェニレンジアミンを使用することが望ましい。発色溶液を加え２５℃で１０分間反応させた後、直ちに４Ｎの硫酸を加えることにより、酵素反応を止める。ｏ−フェニレンジアミンを使用する場合、４９２および６３０ｎｍの吸光度を測定する。一方、アルカリフォスファターゼを使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止め、４１５および６３０ｎｍでの吸光度を測定する方法が適している。
【００４８】
ピレスロイド系化合物を添加していない反応溶液の吸光度に対する、一定量のピレスロイド系化合物を添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を阻害率として算出する。既知の濃度のピレスロイド系化合物を添加した反応液の阻害率により作成した検量線を用いて、試料中のピレスロイド系化合物濃度を算出することができる。
【００４９】
本願発明の第一抗体は、ハプテン化合物の構造にかかわらず、その反応性に差はあるが種々の他のピレスロイド系化合物と交叉反応性を示し、ピレスロイド系化合物を一般的に検出するのに有効に用いられる。
【００５０】
本発明で検出できるピレスロイド系化合物としてはレスメトリン、カデスリン、シハロトリン、ビフェントリン、フェンプロパトリン、アレスリン、トラロメスリンなどのシクロプロパンカルボン酸のエステル類、フェンバレレート、フルシトリネート、フルバリネート、シクロプロトリンなどの芳香族基置換アルカンカルボン酸のエステル類およびエトフェンプロックス、フブフェンプロックス（ＭＴＩ−７３２）、１−（３−フェノキシフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン（ＭＴＩ−７９０）、１−（３−フェノキシ−４−フルオロフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−４−メチルペンタン（ＭＴＩ−８００）、ジメチル−（４−エトキシフェニル）−（３−フェノキシベンジルオキシ）メチルシラン（ＳＳＩ−１１６）、シラフルオフェン、ＰＰ−６８２などの非エステル系化合物類などがあげらる。
【００５１】
両抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を実施することにより分析試料中の種々のピレスロイド系化合物の総残留量の検出が可能である。無論、これらの化合物の中で、その散布または使用が一つに限定されている分析試料であれば、その定量結果は該化合物の残留量となる。さらに、数種類のピレスロイド系化合物が混在する試料についても、個々の化合物の残留値を定量したい場合には、液体クロマトグラフィ−などの既存の技術を利用し各成分への分画操作を加えればよい。
【００５２】
【実施例】
以下にエトフェンプロックスに対する抗体の製造方法、本抗体を用いたピレスロイド系化合物の検出法を実施例によって詳細に説明するが、本発明は本化合物や実施例のみに限定されるものではない。
【００５３】
実施例１ ハプテン化合物（Ｉ）中間体の合成
３−フェノキシベンジル ２−４−ヒドロキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル３．０ｇ、水素化ナトリウム０．３６ｇ、アセトニトリル２０ｍｌを約２０分間加熱還流した後、室温でブロモ酢酸メチル ２ｍｌを滴下し、６０℃で２０分間攪拌した。反応液を濃縮し、酢酸エチル約５０ｍｌを加え、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−フェノキシベンジル ２−｛４−（メトキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル３．０ｇを得た。
ＮＭＲ ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），３．４０（２Ｈ，ｓ），３．７９（３Ｈ，ｓ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｓ），６．８１−７．３５（１３Ｈ，ｍ）
ＩＲ ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：１７６３，１５８５，１４８８，１２５２，１２１３，１０８０
屈折率 ：１．５６４１（２１．６℃）
【００５４】
実施例２ ハプテン化合物（Ｉ）の合成
３−フェキシベンジル ２−｛４−（メトキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル２．２ｇ、水酸化ナトリウム２．５ｇ、水７．５ｇ、エチレングリコール１０ｍｌを２．５時間加熱還流した。反応液に希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．９ｇの３−フェノキシベンジル２−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテルを得た。
ＮＭＲ ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），３．４１（２Ｈ，ｓ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６２（２Ｈ，ｓ），６．８１−７．３５（１３Ｈ，ｍ），９．１０−９．９０（１Ｈ，ｂｒ）
ＩＲ ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：３０４１，１７３３，１５８５，１４８８，１２５０，１１８８，１０７６
屈折率 ：１．５６８０（２１．６℃）
【００５５】
実施例３ ハプテン化合物（ＩＩ）中間体の合成
３−（４−ヒドロキシフェノキシ）ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル１．１ｇ、水素化ナトリウム０．１７ｇ、アセトニトリル１０ｍｌを約２０分間、６０℃で攪拌した後、室温でブロモ酢酸エチル１ｍｌを滴下して加え、５０℃で３０分間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇを得た。
ＮＭＲ ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），１．３９（３Ｈ，ｔ， Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｓ），４．２１−４．３１（４Ｈ，ｍ），４．４２（２Ｈ，ｓ），４．６０（２Ｈ，ｓ），６．８１−７．２７（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：１７５９，１５０５，１２４８，１１９２，１０８５
屈折率 ：１．５４６１（２０．４℃）
【００５６】
実施例４ ハプテン化合物（ＩＩ）の合成
３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、水酸化ナトリウム０．９ｇ、水３．０ｇ、エチルアルコール１２ｍｌを１．５時間加熱還流した。反応液に希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．７５ｇの３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテルを得た。
ＮＭＲ ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３０（６Ｈ，ｓ），１．３９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｓ）， ４．００（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６６（２Ｈ，ｓ），６．８０−７．２７（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：３０４４，１７３７，１５０５，１２４７，１２０５，１０８１
屈折率 ：１．５４４９（０．４℃）
【００５７】
実施例５ ハプテン化合物（ＩＩＩ）中間体の合成
３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニルオキシ｝ベンジルクロライド０．９ｇ、２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝ ２−メチルプロピルアルコール０．９ｇ、トリエチルベンジルアンモニウムクロライド０．１ｇ、水酸化ナトリウム３．５ｇ、水４．０ｇを４０〜５０℃で４時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して１．２ｇの３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニロキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇを得た。
【００５８】
３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニロキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸０．０５ｇ、アセトン３０ｍｌを２時間加熱還流した。反応液を濃縮し３−（４−ヒドロキシフェニルオキシ）ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇを油状物として得た。
【００５９】
３−（４−ヒドロキシフェニルオキシ）ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、水素化ナトリウム０．１３ｇ、アセトニトリル１０ｍｌを約２０分間、６０℃で攪拌した後、室温でブロモ酢酸エチル１ｍｌを滴下して加え、５０℃で３０分間攪拌した。反応液をろ過し、濾液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル １．０ｇを得た。
ＮＭＲ ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．３３（６Ｈ，ｓ），３．４３（２Ｈ，ｓ）， ４．２８（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６１（２Ｈ，ｓ），６．８３−７．３９（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：１７６０，１５０５，１１９８，１００８
屈折率 ：．４９８２（２３．８℃）
【００６０】
実施例６ ハプテン化合物（ＩＩＩ）の合成
３−｛４−（エトシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．０ｇ、水酸化ナトリウム０．９ｇ、水４．０ｇ、エチルアルコール２０ｍｌを６０℃で１．５時間攪拌した。反応液に水を加え、ヘキサンで洗浄後、希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．７２ｇの３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテルを得た。
ＮＭＲ ：δＴＭＳ（ＣＤＣｌ３）（ｐｐｍ）：１．３３（６Ｈ，ｓ），３．４４（２Ｈ，ｓ），４．４３（２Ｈ，ｓ），４．６６（２Ｈ，ｓ），６．８４−７．３９（１２Ｈ，ｍ）
ＩＲ ：νＭＡＸ（ｎｅａｔ）（ｃｍ−１）：３０４９，１７３３，１５０６，１２０２，１０８２，１００８
屈折率 ：１．５５０１（２３．５℃）
【００６１】
実施例７
免疫原として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と実施例２および４で得たカルボン酸誘導体の２種の結合体を混合酸無水法を用いて作製した。３−フェノキシベンジル ２−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチロキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル（ハプテン化合物（Ｉ））、もしくは、３−４−（ヒドロキシカルボニルメチロキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル（ハプテン化合物（ＩＩ））の２５ｍｇを２ｍｌの無水ジオキサンに溶解し、０．０５ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加えて１０℃で２０分間撹拌し、０．０２ｍｌのイソブチルクロロカーボネートを添加し１５分間撹拌して、ハプテンの酸無水物溶液を調製した。一方、８０ｍｇのＢＳＡを４．３ｍｌの蒸留水に溶解して、１Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９．０に調整した後、２．６ｍｌの無水ジオキサンを少しずつ添加した。このＢＳＡ溶液に１Ｎの水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９に保ちながら、先に調製したハプテンの酸無水物溶液を各々少しずつ加え、４℃で４時間撹拌して反応させた。得られた反応物を、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いたカラムで精製し、蒸留水で２４時間透析した後、凍結乾操して免疫原として使用した。また、抗原として用いるウサギ血清アルブミンとハプテン化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）との結合体も各々同様に調製した。
【００６２】
２種の各々の免疫原を２００μｇ／ｍｌになるように生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ；１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．９％ＮａＣｌ）に溶解し、フロイントの完全アジュバントと等量混合して油中水型エマルジョン状態にしたもの１ｍｌをウサギ（ＮＺＷ、雌、１３令）に皮下投与した。その後２週間毎に免疫原とフロイントの不完全アジュバントの混合エマルジョンを同様に追加免疫した。免疫後、採血して得られた血液を遠心分離して血清を取得し、更に血清を３３％の硫安で塩析したものを第一抗体として使用した。ハプテン化合物（Ｉ）とＢＳＡの結合体を免疫して得られた抗体を抗エトフェンプロックス抗体Ｉ（以下、Ｅ抗体Ｉと略す。）、ハプテン化合物（ＩＩ）とＢＳＡの結合体を免疫して得られた抗体を抗エトフェンプロックス抗体ＩＩ（以下、Ｅ抗体ＩＩと略す。）とする。
【００６３】
実施例８
Ｅ抗体Ｉを用いた以下のようなＥＬＩＳＡ法により、エトフェンプロックスを測定できた。
１．ポリスチレンの９６穴マイクロプレートに、コーティング抗原としてウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）とハプテン（Ｉ）の結合体を０．０３μｌ／ｗｅｌｌになるようにコーティング緩衝液（ｌ０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ）に溶解したものを０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で添加し、４℃で一晩インキュベーションしてプレートに吸着させた。残った溶液を除去し、３％のスキムミルク溶液を０．３ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で添加し、２５℃で１時間インキュベーション後、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣ１、０．０２％ＫＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄して抗原吸着プレートを得た。
【００６４】
２．Ｅ抗体Ｉを希釈緩衝液（ｌ０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ）で２０，０００倍に希釈し、メタノールに溶解したエトフェンプロックス溶液と１：１の割合で混合し、反応溶液中の抗体濃度が４０，０００倍希釈、メタノール濃度が５０％になるようにして、２５℃で１時間インキュベーションして反応させた。この反応液を０．１ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し、２５℃で１時間反応させた後、洗浄緩衝液でこのプレートを３回洗浄した。
【００６５】
３．西洋ワサビペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（第二抗体）を洗浄緩衝液で１０，０００倍に希釈し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し２５℃で１時間インキュベーションした後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
【００６６】
４．ｏ−フェニレンジアミン発色溶液（０．２％（ｖ／ｖ）ｏ−フェニレンジアミン、１００ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．００３％（ｖ／ｖ）過酸化水素）を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し、２５℃で１０分間インキュベーションしたのち、４Ｎ硫酸を０．０５ｍｌ／ｗｅｌｌづつプレートに添加して酵素反応を止め、その後、４９２および６３０ｎｍの吸光度を測定した。この方法により、１０ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスの測定が可能であった。
【００６７】
一方、Ｅ抗体ＩＩを用いたＥＬＩＳＡでは、コーティング抗原としてハプテン化合物（ＩＩ）とＲＳＡの結合体の０．０１μｇ／ｍｌ溶液を用い、Ｅ抗体ＩＩの６４，０００倍希釈溶液とエトフェンプロックスのメタノール溶液を４：１の割合で混合し、反応溶液中の抗体濃度が８０，０００倍希釈、メタノール濃度が２０％となるように混合して反応させた後、抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（第二抗体）を５，０００倍希釈したものを用いることにより、先のＥＬＩＳＡと同様の方法で３ｎｇ／ｍｌから１，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスの測定ができた。
【００６８】
実施例９
試験例１の方法を用いて、水田土壌、作物（穀物、野菜、果実など）および水道水に含まれるエトフェンプロックスの測定が可能であった。すなわち、４０から４，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む土壌５ｇに水５ｍｌとメタノール１５ｍｌを添加して３０分間振とう抽出した。抽出溶液と１０，０００倍に希釈したＥ抗体Ｉを３：１の割合で混合し、実施例８と同様にしてＥＬＩＳＡ法で測定できた。同様に、４０から４，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む作物１０ｇに水１０ｍｌとメタノール３０ｍｌを添加して３０分間振とう抽出した。抽出溶液と１０，０００倍に希釈した抗体を３：１の割合で混合し、実施例８と同様にしてＥＬＩＳＡ法で測定できた。一方、３０から３，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む水道水８０ｍｌ、４０，０００倍希釈のＥ抗体ＩＩ溶液２００ｍｌ、および、メタノール８０ｍｌを混合し、反応溶液中抗体濃度が８０，０００倍希釈、メタノール濃度が２０％となるようにして２５℃で１時間反応させてＥＬＩＳＡ法で測定した。この方法で土壌及び作物中のエトフェンプロックスは４０から４，０００ｎｇ／ｍｌを測定でき、また、水道中のエトフェンプロックスは３０から３，０００ｎｇ／ｍｌを測定できた。
【００６９】
実施例１０
実施例８の方法と同様にして、コーティング抗原としてハプテン化合物ＩまたはＩＩとＲＳＡの結合体を９６穴マイクロプレートにコーティングし、試料中のエトフェンロックスと反応させたＥ抗体ＩまたはＥ抗体ＩＩをコーティング抗原と反応させた後、下記の方法でもエトフェンプロックスを検出できた。すなわち、ビオチンを結合した抗ウサギＩｇＧロバＩｇＧを洗浄用緩衝液で２，０００倍に希釈し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し２５℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗浄用緩衝液で３回洗浄した。アルカリフォスファターゼを結合したアビジンを洗浄用緩衝液で１，０００倍に希釈して０．１ｍｌ／ｗｅｌｌず添加し、２５℃で１時間反応させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。アルカリフォスファターゼ発色溶液（０．１％ｐ−ニトロフェニルリン酸、９．７％ジエタノールアミン−塩酸緩衝液（ｐＨ９．８）、０．００５％塩化マグネシウム）を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で３０分間インキュベーションして発色させ、２Ｎの水酸化ナトリウムを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を止め、４１５および６３０ｎｍでの吸光度を測定した。このアビジン−ビオチン法を用いた方法では、約１０ｎｇ／ｍｌ以上のエトフェンプロックスの測定ができた。
【００７０】
実施例１１
Ｅ抗体ＩとＥ抗体ＩＩを用いて実施例８の方法により各種ピレスロイド系化合物に対する交又反応性を測定した。ピレスロイド系化合物の各々のメタノール溶液（濃度２〜２０，０００ｎｇ／ｍｌ）と、希釈用緩衝液で２０，０００倍に希釈したＥ抗体Ｉの溶液を１：１の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベーションして反応させた。この反応液を用いて、実施例８と同様にしてＥＬＩＳＡ法による測定を行った。そして、ピレスロイド系化合物を加えずに反応させた場合の吸光度を１００％としてその５０％を阻害するエトフェンプロックスの濃度をＩＣ５０濃度とし、さらにエトフェンプロックスのＩＣ５０濃度時の阻害率を１００％とした時の他のピレスロイド系化合物の阻害率の比を交叉反応性として第１表（表１）に示した。
【００７１】
また、ピレスロイド系化合物の各々のメタノール溶液（濃度５〜５０，０００ｎｇ／ｍｌ）とＥ抗体ＩＩの６４，０００倍希釈溶液を１：４の割合で混合し、２５℃で１時間インキュベーションした反応液を用いて実施例８と同様に行ない、交又反応性を求めた。結果を上記と同様にしてエトフェンプロックスのＩＣ５０濃度時の阻害率を１００％とした時の他のピレスロイド系化合物の阻害率の比を交叉反応性として第１表（表１）に示した。
【００７２】
【表１】
【００７３】
【発明の効果】
以上の各実施例から明らかなように、本発明によって、環境中の水、土壌、植物および食料に残留するピレスロイド系化合物の量を簡便かつ迅速に測定することが可能であった。[0001]
[Industrial applications]
The present invention provides an antibody that binds to a pyrethroid compound, a hapten compound required for producing the antibody, an intermediate of the hapten compound, a method for producing the hapten compound, and a natural environment such as water or soil using the antibody. The present invention relates to an immunological detection method for detecting a pyrethroid compound from a sample and a food sample such as a grain.
[0002]
[Prior art]
As an immunochemical analysis method for pyrethroid compounds, B.I. D. There is a study of specific antibodies to S-Bioalllethrin by Hammock et al. (J. Agric. Food Chem. 26: 1328-1333, 1978) and radioimmunoassay (Experimentia 35: 1619-1620, 1979). These are fundamental studies applying immunochemical analysis methods to specific pyrethroids. L. H. Have reported a basic study on a method for immunochemical analysis of permethrin in meat (J. Agric. Food Chem. 37: 834-839, 1989). The dimethylvinyl group of phenothrin was ozone-oxidized to form a carboxylic acid derivative, and three types of monoclonal antibodies were isolated by immunizing animals using a hapten-protein conjugate obtained by binding this to a protein. However, this antibody can detect only phenothrin, permethrin, cypermethrin, and deltamethrin, and has a very low detection sensitivity for other synthetic pyrethroids. When reacting the antibody with the compound to be detected, a water-soluble organic solvent (such as acetonitrile) is added to increase the solubility of the compound in the sample and facilitate the reaction. However, the amount of addition must be as low as 6% or less due to the stability of the antibody to organic solvents, making it difficult to detect compounds with extremely low water solubility, and removing or concentrating the solvent due to trace analysis. Issues such as necessity remain.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
There is great public interest in the problem of pesticide residues in the natural environment and in the post-harvest pesticides in imported foods, which have recently increased in particular. In order to ensure such safety, it is necessary to accurately and quickly measure the amount of pesticide residues contained in many samples of the natural environment and food. Conventionally, pesticide residues have been measured mainly using gas chromatography or high-performance liquid chromatography.However, these methods require a great deal of labor and time to prepare analytical samples, Due to the disadvantage that reagents are expensive, a new measurement method that can be performed simply, economically and quickly is desired.
[0004]
Pyrethroid compounds to be analyzed in the present invention are cereals, fruits, vegetables, cotton, coffee, and tea, animals, forest trees, general-purpose insecticides having a broad spectrum widely used in household sanitary pest control and the like. It is. Pyrethroid compounds are less toxic to mammals than many other insecticides, and are effective in controlling resistant pests. However, each of these compounds has a legal upper limit for the amount of residues in most foods, and many pyrethroids are highly toxic to aquatic organisms and may have a negative impact on the natural environment. I am concerned. Accordingly, an object of the present invention is to provide a simple, economical, and rapid method for analyzing pyrethroid compounds in a sample in which residual analysis of the natural environment and food, which is expected to increase in the future, is required. . In particular, in order to analyze pesticide residues in imported agricultural products by the conventional method, it is impossible to cope with costs and labor in the future because the number of samples becomes enormous as the number of regulated pesticides increases. According to the present invention, it is also possible to inspect in advance what kind of pesticide and how much pesticide remains in a sample to be analyzed before conducting component analysis of the pesticide residue. Furthermore, overcoming the instability of antibodies produced so far against organic solvents, which is a weakness of antibodies, increases the possibility of increasing the number of pyrethroid compounds to which the ELISA method can be applied, leading to problems related to the analysis of imported agricultural products. Thus, many problems described above are solved.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
The inventors studied immunochemical analysis of pyrethroid compounds in order to solve the above-mentioned problems, and indirect competitive ELISA was effective as a simple and rapid method for detecting pyrethroid compounds in natural environment and food samples. And completed the present invention.
[0006]
That is, the present invention provides (a) a compound represented by the following general formula (1) (formula 5) or (2) (formula 6) (hereinafter, referred to as a hapten compound).
[0007]
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(Where R 1 Is a hydrogen atom, a halogen atom, C 1 ~ C 5 An alkyl group of C 1 ~ C 5 Haloalkyl group of C 1 ~ C 5 An alkoxy group of C 1 ~ C 5 Haloalkoxy group, C 1 ~ C 5 An alkylthio group of C 1 ~ C 5 Haloalkylthio group of C 2 ~ C 5 An alkenyl group of C 2 ~ C 5 Haloalkenylthio group, C 2 ~ C 5 Alkynyl group, C 2 ~ C 5 Haloalkynyl group, lower alkoxy lower alkyl group, lower alkoxy lower alkoxy group, C 2 ~ C 5 Haloalkenyloxy group of C 2 ~ C 5 Alkynyloxy group of C 1 ~ C 5 An alkoxycarbonyl group, C 1 ~ C 5 Haloalkoxycarbonyl group of C 3 ~ C 6 A cycloalkyl group of C 3 ~ C 6 Represents a cycloalkoxy group, a phenyl group, a phenoxy group, or a cyano group of 2 Is C 1 ~ C 5 An alkyl group of C 1 ~ C 5 Represents a haloalkyl group of 3 Is a hydrogen atom, C 1 ~ C 5 An alkyl group of C 1 ~ C 5 Represents a haloalkyl group of 2 And R 3 Is that when they combine 3 ~ C 6 A cycloalkyl group of C 3 ~ C 6 May be formed. R 4 , R 5 Represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group or an alkoxy group, A represents a carbon atom or a silicon atom, and B represents -CH 2 -, -NR 6 -, -O-, -S-, and R 6 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and Z represents -Y- (CH 2 ) M-COOH or -Y- (CH 2 ) N-NH 2 And Y is -H 2 C-, -NR 7 -, -O-, -S-, and R 7 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and m and n represent 1 to 5. ) And an antibody against a pyrethroid compound obtained by immunizing an animal with the conjugate of the high molecular compound as an immunogen, as a first antibody, mixing the first antibody with a sample solution, and then unreacting the first antibody. An antigen-antibody conjugate is obtained by binding to a conjugate of a polymer compound and a hapten (hereinafter, referred to as a coating antigen) coated on the surface of the carrier, and the antigen-antibody conjugate is bound to a first antibody bound with a labeling enzyme. A method for detecting a pyrethroid compound, which comprises reacting an antibody (hereinafter referred to as a second antibody); (b) a hapten compound of the general formulas (1) and (2); (c) a general formula (1) and (c) The following general formulas (3) and (4) for producing 2)
[0010]
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[0011]
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[0012]
(Where R 1 Is a hydrogen atom, a halogen atom, C 1 ~ C 5 An alkyl group of C 1 ~ C 5 Haloalkyl group of C 1 ~ C 5 An alkoxy group of C 1 ~ C 5 Haloalkoxy group, C 1 ~ C 5 An alkylthio group of C 1 ~ C 5 Haloalkylthio group of C 2 ~ C 5 An alkenyl group of C 2 ~ C 5 Haloalkenylthio group, C 2 ~ C 5 Alkynyl group, C 2 ~ C 5 Haloalkynyl group, lower alkoxy lower alkyl group, lower alkoxy lower alkoxy group, C 2 ~ C 5 Haloalkenyloxy group of C 2 ~ C 5 Alkynyloxy group of C 1 ~ C 5 An alkoxycarbonyl group, C 1 ~ C 5 Haloalkoxycarbonyl group of C 3 ~ C 6 A cycloalkyl group of C 3 ~ C 6 Represents a cycloalkoxy group, a phenyl group, a phenoxy group, or a cyano group of 2 Is C 1 ~ C 5 An alkyl group of C 1 ~ C 5 Represents a haloalkyl group of 3 Is a hydrogen atom, C 1 ~ C 5 An alkyl group of C 1 ~ C 5 Represents a haloalkyl group of 2 And R 3 Is that when they combine 3 ~ C 6 A cycloalkyl group of C 3 ~ C 6 May be formed. R 4 , R 5 Represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group or an alkoxy group, A represents a carbon atom or a silicon atom, and B represents -CH 2 -, -NR 6 -, -O-, -S-, and R 6 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and Z ′ represents —Y ′ — (CH 2 ) M-COOR 7 'Or -Y'-(CH 2 ) N-NHR 8 Y ′ represents —CH 2 O-, -NR 9 -, -O-, -S-, and R 7 'Is C 1 ~ C 5 Alkyl group, lower alkoxy lower alkyl group, lower alkoxy lower alkoxy lower alkyl group, lower alkylthio lower alkyl group, tetrahydropyranyl group, tetrahydrofuranyl group, phenyl group, phenyloxy lower alkyl group, phenacyl group, diacylmethyl group, N -Represents a phthalimidomethyl group, a benzyl group or a silyl group, m represents 1 to 5, 8 Are formyl, acetyl, haloacetyl, propionyl, phenylacetyl, alkoxycarbonyl, haloalkoxycarbonyl, fluorenemethylcarbonyl, phenyloxycarbonyl, phenylthiocarbonyl, piperidinyloxycarbonyl, benzyloxy Represents a carbonyl group. R 9 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and n represents 1 to 5. ), A hapten compound intermediate represented by the general formula (1) or (2) and a polymer compound, (e) an alcohol, dimethyl sulfoxide or acetonitrile. It is intended to provide an antibody capable of recognizing a pyrethroid compound.
[0013]
That is, an antibody against a pyrethroid compound obtained by immunizing an animal with a conjugate of a hapten compound and a polymer compound (for example, a protein) as an immunogen is used as a first antibody, and a predetermined amount of the first antibody and a pyrethroid compound are contained. The sample solution is mixed, the unreacted first antibody contained in the reaction solution is bound to the coating antigen coated on the surface of the carrier, and the second antibody bound to the label enzyme is reacted with the first antibody bound to the carrier. After that, a buffer containing a substrate for the enzyme and a color-forming reagent that forms a color by the enzyme reaction is added, and after the color is developed, the absorbance is measured. Based on the measured value, the concentration of the pyrethroid compound in the sample is determined based on a calibration curve. Is calculated. The first antibody used herein is obtained by using, as an immunogen, a polymer compound such as a conjugate of a protein and the hapten compound of the present invention as an immunogen. In the general formula (1), many compounds can be exemplified by various combinations of various substituents. Preferably, A is a carbon atom and B is an oxygen atom. More preferably, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, R 2 And R 3 Is a methyl group, and in Z, Y is an oxygen atom. Most preferably, Z is a hydroxycarbonylmethyloxy group; 2 And R 3 Is a methyl group, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, R 4 And R 5 Is a hydrogen atom.
[0014]
Similarly, many compounds can be exemplified in the general formula (2). Preferably, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, and in Z, Y is an oxygen atom. Most preferably R 1 Is an alkoxy or haloalkoxy group, R 2 And R 3 Is a methyl group, R 4 And R 5 Is a hydrogen atom, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, and Z is a 4-hydroxycarbonylmethyloxy group.
[0015]
These hapten compounds can be produced from the general formula (3) or (4). By hydrolyzing or reducing the compound of the general formula (3) or (4) in the presence of a base or an acid, the corresponding hapten compound of the general formula (1) or (2) can be obtained. Here, many compounds can be exemplified by a combination of various substituents in the general formula (3). Most preferably, Z ′ is a methoxycarbonylmethyloxy group, 2 And R 3 Is a methyl group, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, R 4 And R 5 Is a hydrogen atom.
[0016]
These intermediates (3) and (4) can be produced from known compounds. That is, the general formula (5)
[0017]
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[0018]
(Where A, B, Y, R 2 ~ R 5 Represents the above-mentioned meaning. ) And a compound of the general formula (6)
[0019]
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[0020]
Wherein X is a halogen atom, m and R 7 'Represents the above-mentioned meaning. The compound of the general formula (3) can be produced by condensing the compound of the formula) with a base.
[0021]
Further, a compound of the general formula (5) and a compound of the general formula (7)
[0022]
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[0023]
Wherein X is a halogen atom, n and R 8 Represents the above-mentioned meaning. The compound of formula (3) can be produced in the same manner as in (a) by condensing the compound of formula (3) in the presence of a base.
[0024]
In addition, the general formula (8)
[0025]
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[0026]
(Where R 1 ~ R 5 , A, B and Y 'have the meanings given above. ) And a compound of the general formula (6) or (7) in the presence of a base to produce a compound of the general formula (4).
[0027]
Among the compounds of the general formula (5), which are the starting materials for producing these hapten compound intermediates, those wherein A is a carbon atom and B is an oxygen atom are disclosed in JP-A-58-32840 and JP-A-58-32840. The compound can be easily obtained by a known compound described in -77836 or a method for producing the compound. A compound in which A and B are both carbon atoms can be produced by a known reaction using a known compound described in JP-A-62-201835. For example, compound (9)
[0028]
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[0029]
Is reacted with a base (for example, a strong base such as potassium tert-butoxide) in a polar organic solvent to produce a corresponding phenol derivative. When A is a silicon atom in the compound of the general formula (5), the compound is produced by a known reaction from a known organosilicon compound described in JP-A-61-263988 and JP-A-62-106032. be able to. For example, compound (10)
[0030]
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[0031]
Is reacted with a base (for example, a strong base such as potassium tertiary butoxide) in a polar solvent to produce a corresponding phenol derivative.
[0032]
Compounds of the general formula (8), which are the starting materials for producing the other hapten compound intermediate, wherein A is a carbon atom and B is an oxygen atom are disclosed in JP-A-58-32840 and JP-A-58-32840. The compound can be easily obtained by a known compound described in -77836 or a method for producing the compound. Compounds in which A and B are carbon atoms can be produced by a known reaction from the known compounds described in JP-A-62-201835. For example, compound (11)
[0033]
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[0034]
Can be treated with an acid to produce the corresponding phenol derivative. Compound (11) can be produced by condensing compound (12) (formula 16) and compound (13) (formula 17) and subjecting them to catalytic reduction.
[0035]
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[0036]
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[0037]
The compound wherein A is a silicon atom can be produced by a known reaction from a known organic silicon compound described in JP-A-61-263988 and JP-A-62-106032. For example, compound (14)
[0038]
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[0039]
Can be treated with an acid to produce the corresponding phenol derivative. Compound (14) can be easily produced by condensing compound (15) (formula 19) and compound (16) (formula 20) in the presence of a base.
[0040]
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[0041]
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[0042]
The immunogen for producing the first antibody comprises a hapten compound represented by the general formula (1) or (2) and a high molecular compound (for example, serum proteins such as albumin, globulin, hemocyanin, azophenylacetic acid, glutamine-adenine-tyrosine). (E.g., a copolymer) in the presence of a binding reagent. In particular, when the hapten compound is a carboxylic acid derivative, B.I. F. It is common to couple proteins to proteins by the mixed acid anhydride method of Erlanger et al. (J. Biol. Chem. Vol. 234, 1090-1094 (1959)).
[0043]
As the carrier used in the detection method of the present invention, a carrier usually used in an ELISA method can be used, and various forms are possible. Examples include tubes, well plates, microplates, elongated sticks, thin strips or beads. Materials forming such a solid phase surface include polystyrene or other suitable plastics, nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, glass, silica, and the like. Although not particularly limited, the use of a polystyrene 96-well microplate is suitable.
[0044]
In the measurement method of the present invention, the coating of the carrier surface with the coating antigen is performed by diluting a conjugate of a hapten compound and serum albumin of an animal species producing the first antibody with a coating buffer, adding the mixture to the carrier, and then incubating. It is done by doing. As the coating buffer used here, it is suitable to use a buffer having a composition of 10 mM phosphate buffer (pH 7.5, 100 mM NaCl). However, if a surfactant that hinders coating is not contained, only this is used. It is not limited. Further, as the protein used for the conjugate for coating, a protein other than that used for the immunogen can be used, and the conjugate can be produced in the same manner as in the preparation of the immunogen. As a result of examining the conditions for coating the carrier with the antigen, the concentration of the coated antigen is suitably 0.01 to 0.1 μg / ml. When a 96-well microphone plate is used, the amount to be used is preferably about 0.1 mg / well. Incubation at 4 ° C. overnight is suitable as incubation conditions. After the coating antigen is adsorbed on the carrier, it is necessary to block the portion where the antigen is not adsorbed by a protein other than the antigen in order to prevent nonspecific binding of the antibody. For blocking, a 3% skim milk solution and a carrier are incubated for 1 hour at 25 ° C. After incubation, the carrier is washed with a washing buffer (10 mM acid buffer (pH 7.2), 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.02% Tween 20 is suitable). .
[0045]
The method of the present invention is characterized in that a high-concentration organic solvent is added to a reaction solution of a pyrethroid compound and the first antibody to facilitate the reaction between the pyrethroid compound and the first antibody. Generally, the solubility of a pyrethroid compound in water is extremely low, and it cannot react with the first antibody sufficiently efficiently under ordinary conditions. Therefore, as a result of examining various conditions, the reaction of the antibody with the pyrethroid compound can be made possible by adding an organic solvent to the reaction system. Examples of the organic solvent to be added include water-soluble organic solvents such as alcohols such as methanol and ethanol, dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, HMPA, DMI, acetonitrile, and acetone. Alcohols, dimethyl sulfoxide, and acetonitrile are suitable from the viewpoint of the stability of the first antibody in an organic solvent, and particularly, methanol is suitable, and the solvent concentration is preferably 20% to 50%. It is surprising that the primary antibodies of the present invention are stable at these concentrations of organic solvent. The first antibody is diluted with a buffer for dilution (10 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0.8% NaCl, 0.02% KCl) so that the antibody concentration in the reaction solution is 20,000 to 80,000-fold. It is prepared so that When water in the natural environment such as paddy water or tap water is used as a sample, a reaction solution is prepared by directly adding a first antibody solution or an organic solvent to the sample to a predetermined concentration. . For samples such as food, plants and soil, a pyrethroid compound is extracted from the sample with an organic solvent, and then an antibody solution is added to the solvent extraction solution to prepare a reaction solution. This reaction solution is incubated at 25 ° C. for 1 hour to react. The unreacted first antibody in the reaction solution of the pyrethroid compound and the first antibody prepared as described above is reacted with the coating antigen bound to the carrier. The reaction solution is added to the carrier and incubated at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction, the carrier is washed with a washing buffer and used for the reaction with the second antibody.
[0046]
As the second antibody used in the measurement method of the present invention, an antibody against the first antibody to which an enzyme is bound can be used. When a rabbit antiserum is used as the first antibody, it is appropriate to use a peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG goat IgG fraction. It is desirable to react the first antibody bound to the carrier with a second antibody diluted to about 5,000 to 10,000 times, preferably a final absorbance of 1.0 to 1.5. Wash buffer is used for dilution. The reaction is performed at 25 ° C. for 1 hour, and after the reaction, the plate is washed with a washing buffer. In addition, an avidin conjugated with an enzyme and an antibody conjugated with an enzyme can also be used as a second antibody by utilizing an avidin-biotin reaction. After reacting an anti-rabbit IgG donkey IgG fraction conjugated with biotin diluted about 2,000-fold to the first antibody bound to the carrier, washed, avidin conjugated with alkaline phosphatase diluted about 1,000-fold However, the animal producing the second antibody and the enzyme to be used may be other animals and enzymes. A washing buffer is used for dilution, and both reactions are carried out at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction, the reaction is washed with a washing buffer and then subjected to an enzyme reaction. The amount of the pyrethroid compound can be calculated from the calibration curve by adding a reagent that develops a color by the reaction of the enzyme of the second antibody bound to the carrier with the substrate and measuring the absorbance.
[0047]
When peroxidase is used for the second antibody, it is desirable to use hydrogen peroxide as a substrate and o-phenylenediamine as a coloring reagent. After adding the coloring solution and reacting at 25 ° C. for 10 minutes, the enzyme reaction is immediately stopped by adding 4N sulfuric acid. If o-phenylenediamine is used, measure the absorbance at 492 and 630 nm. On the other hand, when alkaline phosphatase is used, a method in which color is developed using p-nitrophenyl phosphate as a substrate, the enzyme reaction is stopped by adding 2N NaOH, and the absorbance at 415 and 630 nm is measured.
[0048]
The rate of decrease in the absorbance of a solution in which a fixed amount of a pyrethroid compound has been added and reacted with an antibody relative to the absorbance of a reaction solution to which a pyrethroid compound has not been added is calculated as an inhibition rate. The concentration of the pyrethroid compound in the sample can be calculated using a calibration curve created based on the inhibition rate of the reaction solution to which the known concentration of the pyrethroid compound has been added.
[0049]
Regardless of the structure of the hapten compound, the first antibody of the present invention exhibits cross-reactivity with various other pyrethroid compounds, although there is a difference in reactivity, and is effective for generally detecting pyrethroid compounds. Used for
[0050]
Pyrethroid compounds that can be detected in the present invention include resmethrin, cadhesrin, cyhalothrin, bifenthrin, fenpropatrin, allethrin, esters of cyclopropanecarboxylic acids such as tralomethrin, fenvalerate, flucitrinate, fulvalinate, cycloprothrin and the like. Esters of aromatic group-substituted alkanecarboxylic acids and etofenprox, fubufenprox (MTI-732), 1- (3-phenoxyphenyl) -4- (4-ethoxyphenyl) -4-methylpentane (MTI-790 ), 1- (3-phenoxy-4-fluorophenyl) -4- (4-ethoxyphenyl) -4-methylpentane (MTI-800), dimethyl- (4-ethoxyphenyl)-(3-phenoxybenzyloxy) Methylsi Down (SSI-116), silafluofen, non-ester-based compounds such as PP-682 and the like Ageraru.
[0051]
By carrying out the ELISA method using both antibodies, it is possible to detect the total residual amounts of various pyrethroid compounds in the analysis sample. Of course, among these compounds, in the case of an analytical sample whose application or use is limited to one, the quantitative result is the residual amount of the compound. Furthermore, when it is desired to quantify the residual value of each compound even in a sample in which several types of pyrethroid compounds are mixed, a fractionation operation for each component may be performed by using an existing technique such as liquid chromatography.
[0052]
【Example】
Hereinafter, a method for producing an antibody to etofenprox and a method for detecting a pyrethroid-based compound using the present antibody will be described in detail with reference to examples, but the present invention is not limited to the compounds and examples.
[0053]
Example 1 Synthesis of Hapten Compound (I) Intermediate
3.0 g of 3-phenoxybenzyl 2--4-hydroxyphenyl) -2-methylpropyl ether, 0.36 g of sodium hydride and 20 ml of acetonitrile were heated under reflux for about 20 minutes, and 2 ml of methyl bromoacetate was added dropwise at room temperature. Stirred at C for 20 minutes. The reaction solution is concentrated, about 50 ml of ethyl acetate is added, washed with water, dried and concentrated, and separated and purified by silica gel column chromatography to give 3-phenoxybenzyl 2- {4- (methoxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2-methyl. 3.0 g of propyl ether were obtained.
NMR: δTMS (CDCl 3 ) (Ppm): 1.30 (6H, s), 3.40 (2H, s), 3.79 (3H, s), 4.43 (2H, s), 4.59 (2H, s), 6.81-7.35 (13H, m)
IR: ν MAX (Neat) (cm -1 ): 1763, 1585, 1488, 1252, 1213, 1080
Refractive index: 1.5641 (21.6 ° C)
[0054]
Example 2 Synthesis of hapten compound (I)
3-Fexibenzyl 2- {4- (methoxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2-methylpropyl ether 2.2 g, sodium hydroxide 2.5 g, water 7.5 g, and ethylene glycol 10 ml are heated under reflux for 2.5 hours. did. Dilute hydrochloric acid was added to the reaction solution to make it acidic, extracted with ethyl acetate, washed with water, dried and concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to obtain 0.9 g of 3-phenoxybenzyl 2- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy). Phenyl｝ -2-methylpropyl ether was obtained.
NMR: δTMS (CDCl 3 ) (Ppm): 1.30 (6H, s), 3.41 (2H, s), 4.43 (2H, s), 4.62 (2H, s), 6.81-7.35 (13H) , M), 9.10-9.90 (1H, br)
IR: ν MAX (Neat) (cm -1 ): 3041, 1733, 1585, 1488, 1250, 1188, 1076
Refractive index: 1.5680 (21.6 ° C)
[0055]
Example 3 Synthesis of Hapten Compound (II) Intermediate
3- (4-Hydroxyphenoxy) benzyl 1.1 g of 2- (4-ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether, 0.17 g of sodium hydride and 10 ml of acetonitrile are stirred at 60 ° C. for about 20 minutes, and then at room temperature. 1 ml of ethyl bromoacetate was added dropwise, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was filtered, the filtrate was concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to give 3- {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- (4-ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether. 2 g were obtained.
NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (Ppm): 1.30 (6H, s), 1.30 (3H, t, J = 6.6 Hz), 1.39 (3H, t, J = 6.6 Hz), 3.40 (2H, s) s), 4.21-4.31 (4H, m), 4.42 (2H, s), 4.60 (2H, s), 6.81-7.27 (12H, m)
IR: ν MAX (Neat) (cm -1 ): 1759, 1505, 1248, 1192, 1085
Refractive index: 1.5461 (20.4 ° C)
[0056]
Example 4 Synthesis of Hapten Compound (II)
3- {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 1.2 g of 2- (4-ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether, 0.9 g of sodium hydroxide, 3.0 g of water and 12 ml of ethyl alcohol. The mixture was refluxed for 5 hours. Dilute hydrochloric acid was added to the reaction solution, and the mixture was acidified, extracted with ethyl acetate, washed with water, dried, concentrated, separated and purified by silica gel column chromatography, and 0.75 g of 3- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2 -(4-Ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether was obtained.
NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (Ppm): 1.30 (6H, s), 1.39 (3H, t, J = 6.6 Hz), 3.40 (2H, s), 4.00 (2H, q, J = 6. 6Hz), 4.43 (2H, s), 4.66 (2H, s), 6.80-7.27 (12H, m)
IR: ν MAX (Neat) (cm -1 ): 3044, 1737, 1505, 1247, 1205, 1081
Refractive index: 1.5449 (0.4 ° C)
[0057]
Example 5 Synthesis of Hapten Compound (III) Intermediate
3- {4- (methoxymethyloxy) phenyloxy} benzyl chloride 0.9 g, 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} 2-methylpropyl alcohol 0.9 g, triethylbenzylammonium chloride 0.1 g, hydroxylated 3.5 g of sodium and 4.0 g of water were stirred at 40 to 50 ° C for 4 hours. Water was added to the reaction solution, extracted with ethyl acetate, washed with water, dried and concentrated, then separated and purified by silica gel column chromatography to obtain 1.2 g of 3- {4- (methoxymethyloxy) phenyloxy} benzyl 2- {4-. 1.2 g of (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether were obtained.
[0058]
3- {4- (methoxymethyloxy) phenyloxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether 1.2 g, p-toluenesulfonic acid 0.05 g, and acetone 30 ml are heated for 2 hours. Refluxed. The reaction solution was concentrated to give 1.2 g of 3- (4-hydroxyphenyloxy) benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether as an oil.
[0059]
3- (4-Hydroxyphenyloxy) benzyl 1.2 g of 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether, 0.13 g of sodium hydride and 10 ml of acetonitrile are stirred at 60 ° C. for about 20 minutes. After that, 1 ml of ethyl bromoacetate was added dropwise at room temperature, and the mixture was stirred at 50 ° C for 30 minutes. The reaction solution is filtered, the filtrate is concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to give 3- {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methyl. 1.0 g of propyl ether was obtained.
NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (Ppm): 1.31 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.33 (6H, s), 3.43 (2H, s), 4.28 (2H, q, J = 7.3). 3Hz), 4.43 (2H, s), 4.61 (2H, s), 6.83-7.39 (12H, m)
IR: ν MAX (Neat) (cm -1 ): 1760, 1505, 1198, 1008
Refractive index:. 4982 (23.8 ° C)
[0060]
Example 6 Synthesis of hapten compound (III)
3- {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether 1.0 g, sodium hydroxide 0.9 g, water 4.0 g, ethyl alcohol 20 ml were stirred at 60 ° C. for 1.5 hours. The reaction solution was added with water, washed with hexane, diluted with hydrochloric acid, acidified, extracted with ethyl acetate, washed with water, dried, concentrated, and separated and purified by silica gel column chromatography to obtain 0.72 g of 3- {4- ( (Hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether was obtained.
NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (Ppm): 1.33 (6H, s), 3.44 (2H, s), 4.43 (2H, s), 4.66 (2H, s), 6.84-7.39 (12H) , M)
IR: ν MAX (Neat) (cm -1 ): 3049, 1733, 1506, 1202, 1082, 1008
Refractive index: 1.5501 (23.5 ° C)
[0061]
Example 7
Two conjugates of bovine serum albumin (BSA) as the immunogen and the carboxylic acid derivative obtained in Examples 2 and 4 were prepared using a mixed acid anhydride method. 3-phenoxybenzyl 2- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2-methylpropyl ether (hapten compound (I)) or 3-4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- (4 -Ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether (hapten compound (II)) (25 mg) was dissolved in 2 ml of anhydrous dioxane, 0.05 ml of N-methylmorpholine was added, the mixture was stirred at 10 ° C. for 20 minutes, and 0.02 ml Was added and stirred for 15 minutes to prepare a hapten anhydride solution. On the other hand, 80 mg of BSA was dissolved in 4.3 ml of distilled water, adjusted to pH 9.0 with a 1N sodium hydroxide solution, and then 2.6 ml of anhydrous dioxane was added little by little. While maintaining the pH at 9 with a 1N sodium hydroxide solution to this BSA solution, the hapten acid anhydride solution prepared above was added little by little, and the mixture was stirred at 4 ° C. for 4 hours to react. The obtained reaction product was purified by a column using Sephadex G-25, dialyzed against distilled water for 24 hours, and freeze-dried to use as an immunogen. Also, conjugates of rabbit serum albumin used as an antigen, hapten compounds (I) and (II) were prepared in the same manner.
[0062]
Each of the two immunogens was dissolved at 200 μg / ml in a physiological phosphate buffer (PBS; 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0.9% NaCl), and Freund's complete adjuvant. 1 ml of a water-in-oil emulsion prepared by mixing equal volumes was subcutaneously administered to a rabbit (NZW, female, 13 years old). Thereafter, every two weeks, a mixed emulsion of the immunogen and incomplete Freund's adjuvant was boosted in the same manner. After the immunization, blood was collected by centrifugation to obtain serum, and serum obtained by salting out with 33% ammonium sulfate was used as the primary antibody. An antibody obtained by immunizing a conjugate of the hapten compound (I) and BSA was immunized with an anti-ethofenprox antibody I (hereinafter abbreviated as E antibody I) and a conjugate of the hapten compound (II) and BSA. The obtained antibody is referred to as anti-ethofenprox antibody II (hereinafter abbreviated as E antibody II).
[0063]
Example 8
Etofenprox was measured by the following ELISA method using E antibody I.
1. A coating buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.5)) containing a conjugate of rabbit serum albumin (RSA) and hapten (I) as a coating antigen at a concentration of 0.03 μl / well was placed on a polystyrene 96-well microplate. A solution dissolved in 100 mM NaCl) was added at a rate of 0.1 ml / well, and the mixture was incubated at 4 ° C. overnight and adsorbed to the plate. The remaining solution was removed, a 3% skim milk solution was added at a rate of 0.3 ml / well, and after incubation at 25 ° C. for 1 hour, the plate was washed with a washing buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0 ml). The plate was washed three times with 0.8% NaCl, 0.02% KCl, and 0.02% Tween 20 to obtain an antigen-adsorbed plate.
[0064]
2. E antibody I was diluted 20,000-fold with a dilution buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.5), 0.8% NaCl, 0.02% KCl) and mixed with an etofenprox solution dissolved in methanol. , And the mixture was incubated at 25 ° C. for 1 hour so that the antibody concentration in the reaction solution was 40,000-fold diluted and the methanol concentration was 50%. The reaction solution was added to the antigen-adsorbing plate at a rate of 0.1 ml / well, and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Then, the plate was washed three times with a washing buffer.
[0065]
3. Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG goat IgG (second antibody) was diluted 10,000 times with a washing buffer, added to the antigen-adsorbing plate at 0.1 ml / well, and incubated at 25 ° C. for 1 hour. The plate was washed three times with wash buffer.
[0066]
4. 0.2 ml of o-phenylenediamine coloring solution (0.2% (v / v) o-phenylenediamine, 100 mM phosphate citrate buffer (pH 5.0, 0.003% (v / v) hydrogen peroxide)) / Well was added to the antigen-adsorbing plate, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 4N sulfuric acid was added to the plate at 0.05 ml / well to stop the enzymatic reaction, and then the absorbance at 492 and 630 nm was measured. According to the method, it was possible to measure Etofenprox from 10 ng / ml to 10,000 ng / ml.
[0067]
On the other hand, in ELISA using E antibody II, a 0.01 μg / ml solution of a conjugate of hapten compound (II) and RSA was used as a coating antigen, a 64,000-fold diluted solution of E antibody II and methanol of etofenprox were used. The solutions were mixed at a ratio of 4: 1 and mixed and reacted so that the antibody concentration in the reaction solution was 80,000-fold and the methanol concentration was 20%. After that, anti-rabbit IgG goat IgG (second antibody) ) Was diluted 5,000-fold, so that 3 to 1,000 ng / ml of etofenprox could be measured in the same manner as in the above ELISA.
[0068]
Example 9
Using the method of Test Example 1, it was possible to measure etofenprox contained in paddy soil, crops (cereals, vegetables, fruits, etc.) and tap water. That is, 5 ml of water and 15 ml of methanol were added to 5 g of soil containing 40 to 4,000 ng / ml of etofenprox and extracted by shaking for 30 minutes. The extraction solution and E antibody I diluted 10,000-fold were mixed at a ratio of 3: 1 and measured in the same manner as in Example 8 by ELISA. Similarly, 10 ml of water and 30 ml of methanol were added to 10 g of a crop containing 40 to 4,000 ng / ml of etofenprox, and the mixture was shaken and extracted for 30 minutes. The extraction solution and the antibody diluted 10,000-fold were mixed at a ratio of 3: 1 and measured in the same manner as in Example 8 by ELISA. On the other hand, 80 ml of tap water containing 30 to 3,000 ng / ml of etofenprox, 200 ml of a 40,000-fold diluted E antibody II solution, and 80 ml of methanol were mixed, and the antibody concentration in the reaction solution was diluted 80,000-fold. The reaction was carried out at 25 ° C. for 1 hour so that the methanol concentration became 20%, and the measurement was performed by the ELISA method. With this method, ethofenprox in soil and crops could be measured at 40 to 4,000 ng / ml, and in water, etofenprox could be measured at 30 to 3,000 ng / ml.
[0069]
Example 10
In the same manner as in Example 8, a conjugate of hapten compound I or II and RSA as a coating antigen was coated on a 96-well microplate, and E antibody I or E antibody II reacted with etofenlox in the sample was used. After reacting with the coating antigen, etofenprox was also detected by the following method. That is, biotin-conjugated anti-rabbit IgG donkey IgG was diluted 2,000-fold with a washing buffer, added at 0.1 ml / well, and incubated at 25 ° C. for 1 hour. Washed twice. Avidin to which alkaline phosphatase was bound was diluted 1,000-fold with a washing buffer, added without 0.1 ml / well, and reacted at 25 ° C. for 1 hour. Thereafter, the plate was washed three times with a washing buffer. An alkaline phosphatase color developing solution (0.1% p-nitrophenyl phosphate, 9.7% diethanolamine-hydrochloric acid buffer (pH 9.8), 0.005% magnesium chloride) was added in an amount of 0.2 ml / well, and 25 ° C. The reaction was stopped by adding 50 μl / well of 2N sodium hydroxide, and the absorbance at 415 and 630 nm was measured. In the method using the avidin-biotin method, it was possible to measure etofenprox of about 10 ng / ml or more.
[0070]
Example 11
Using E antibody I and E antibody II, the cross-reactivity to various pyrethroid compounds was measured by the method of Example 8. A methanol solution of each pyrethroid compound (concentration: 2 to 20,000 ng / ml) and a solution of E antibody I diluted 20,000-fold with a diluting buffer were mixed at a ratio of 1: 1. The reaction was performed by incubation for 1 hour. Using this reaction solution, measurement was performed in the same manner as in Example 8 by the ELISA method. Then, the concentration of etofenprox which inhibits 50% of the absorbance when the reaction was carried out without adding a pyrethroid compound as 100% was determined as IC. 50 Concentration and IC of etofenprox 50 Table 1 (Table 1) shows the ratio of the inhibition ratio of the other pyrethroid compounds when the inhibition ratio at the concentration was 100% as the cross-reactivity.
[0071]
A reaction solution obtained by mixing a methanol solution of each pyrethroid compound (concentration: 5 to 50,000 ng / ml) with a 64,000-fold diluted solution of E antibody II at a ratio of 1: 4 and incubating at 25 ° C. for 1 hour. And the reactivity was determined in the same manner as in Example 8. Etofenprox IC 50 Table 1 (Table 1) shows the ratio of the inhibition ratio of the other pyrethroid compounds when the inhibition ratio at the concentration was 100% as the cross-reactivity.
[0072]
[Table 1]
[0073]
【The invention's effect】
As is clear from the above Examples, the present invention made it possible to easily and quickly measure the amount of pyrethroid-based compounds remaining in environmental water, soil, plants and foods.