JP3493543B2

JP3493543B2 - 抗体測定方法

Info

Publication number: JP3493543B2
Application number: JP11852498A
Authority: JP
Inventors: 粛典葛城; 温也野田; 哲也立川
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1998-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2004-02-03
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: JPH11311623A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体液中に存在する
抗体を検出乃至測定する方法、殊に、臨床検体としての
尿中に存在する、バクテリアやウイルス等の病原体に向
けられた抗体を精度よく、また簡便かつ特異的に検出乃
至測定する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】体液中に存在する、バクテリアやウイル
ス等の病原体に向けられた特異抗体の検出は、感染の有
無を間接的に診断するために有用であり、従来から広く
診断分野において、病原体またはその由来成分を測定系
の抗原として利用した免疫測定法が用いられている。

【０００３】しかしながら、測定系の抗原としてこのよ
うな病原体又はその由来成分を使用する場合、測定系の
構築が容易であるという利点はあるものの、感度や特異
性の面からは未だ改良の余地がある。特に被検体が尿等
の血液以外の体液である場合、その中に存在する抗体量
が低濃度であるがゆえに高感度な測定系が必要とされ、
そのため非特異反応が検出されやすく偽陽性を示しやす
いという問題がある。

【０００４】生体試料としての尿は、血液と比較して、
その調製が非侵襲的であり簡便かつ安全なことから、臨
床検査において殊に望ましい検体と考えられる。このた
め、尿を検体とする場合でも十分な精度を与える抗体測
定系、つまり偽陰性及び偽陽性検出が低減された、高感
度で且つ特異性の高い測定系が必要とされる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる事情
に鑑みて開発されたものであり、体液中に存在する抗体
を、高感度かつ高い特異性をもって検出する測定技術を
提供することを目的とするものである。しかして、本発
明は、尿を検体とする場合にも十分な精度を与える、従
来の課題を解決した優れた抗体測定技術を提供すること
を目的とするものである。

【０００６】

【課題を解決するための手段】既存の血清抗体の測定系
をそのまま尿中抗体の測定に準用した測定法では感度が
足りず、これを解決するため、例えば抗体検出試薬の量
を増すなどして感度を上昇させると、非特異反応を検出
しやすくなり偽陽性の結果を与え、検出特異性・検出精
度が劣るという問題点を有する。

【０００７】本発明者等は、かかる問題点を解決して、
特に尿を検体とする尿中抗体の高精度測定系を開発すべ
く、鋭意研究を進めていたところ、測定対象たる抗体と
それに対する抗原との抗原抗体反応を大腸菌に由来する
成分の存在下で行うことにより、特に検体に由来する非
特異反応を抑制することができ、その結果偽陽性検出が
低減して検出精度が有意に向上することを見出した。

【０００８】本発明は、かかる知見に基づき完成された
ものであり、体液中に存在する病原体に向けられた抗体
を抗原抗体反応を利用して検出測定する方法であって、
大腸菌由来成分の存在下で、当該抗体と抗原とを反応さ
せることを特徴とする抗体測定方法、特に尿中の抗体を
検出測定する抗体測定方法である。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の抗体測定方法は、体液中
の抗体の免疫測定法の改良方法であり、高感度な測定系
であって、かつ非特異反応の検出を減少させ、その結果
偽陽性検出を減少させたことに最大の特徴を有する。

【００１０】このような特徴を有する本発明の抗体測定
方法は、測定対象である抗体と該抗体の抗原との抗原抗
体反応工程を大腸菌由来成分の存在下で行うことにより
達成される。

【００１１】本発明において「体液」とは、測定対象と
なる抗体の存在が認められる生体（ヒト、その他の動物
を含む）の体液であれば特に限定されることなく、一般
の臨床検査において検体とされる体液を広く意味するも
のであるが、具体的には血清，血漿を含む血液、尿、脊
髄液、羊水、唾液等の体液を好ましく例示することがで
きる。特に、本発明は、従来から抗体検出への利用が望
まれていた尿検体における検出精度の問題を解決するも
のであり、本発明の効果を鑑みれば、体液として尿を特
に好ましく例示することができる。

【００１２】また、体液中に存在する測定対象の「抗
体」は、その測定乃至検出が望まれる抗体であれば特に
限定はなく、例えば生体にとって異物である各種の病原
体に向けられた抗体であることができる。

【００１３】かかる病原体としては、特に限定はなく、
ヒト、その他の動物へ感染しその結果としての抗体産生
が認められる各種の病原体を挙げることができる。具体
的には、例えば、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、Ａ
型，Ｂ型及びＣ型等の各種肝炎ウイルス、風疹ウイル
ス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、サイトメ
ガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘・帯状ヘル
ペスウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス等の
ウイルス類；ヘリコバクターピロリ菌（H. pylori：以
下、単にＨ．ピロリ菌ともいう）、クラミジア、結核
菌、スピロヘータ、淋菌、梅毒菌、マイコプラズマ等の
バクテリア類；及びトキソプラズマ、赤痢アメーバー、
ツツガムシ等の原虫類等を挙げることができる。好まし
くは、ＨＩＶ、各種肝炎ウイルス、風疹ウイルス、イン
フルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ヘルペスウイルス
等のウイルス類；ヘリコバクターピロリ菌等のバクテリ
ア類であり、特に好ましくはヘリコバクターピロリ菌等
のバクテリア類である。

【００１４】尚、上記病原体として、大腸菌は本発明の
測定方法に適するものでないことから、本発明における
病原体には、かかる大腸菌は含まれない。

【００１５】本発明における必須の構成としての大腸菌
由来成分は、大腸菌（Escherichiacoli）に由来する成
分であれば特に制限されず、例えば、その蛋白質成分、
糖質成分、脂質成分又はその混合成分であることができ
る。好ましくは、大腸菌の可溶性抽出物、またはリポ多
糖（ＬＰＳ）を例示することができる。

【００１６】上記大腸菌由来成分の調製方法は、特に制
限されず各種の方法によることができるる。通常、任意
の大腸菌を該大腸菌の生育に適した培地を用いて生育増
殖させ、得られた菌体を集菌して、超音波破砕機等を利
用した物理的手段により或いは界面活性剤等を用いて破
砕若しくは可溶化することにより可溶性成分（可溶性抽
出物）として調製することができる。また、ＬＰＳは、
有機溶媒（例えば、フェノール、クロロホルム及びエー
テル等の単溶媒又は２若しくは３種の混合溶媒使用）抽
出により調製することもでき、更に遺伝子工学的手法に
より人工的に調製することもできる。また、これらは簡
便には市販品を使用することもできる。

【００１７】本発明の測定方法において用いられる抗原
としては、検出すべき測定対象抗体と免疫反応（抗原抗
体反応）する抗原であれば特に制限はなく、例えば既存
の血清抗体測定系において採用されている抗原等をいず
れも良好に採用することができる。これらは、前述する
ようなウイルスやバクテリア等の病原体そのものであっ
てもよいが、少なくとも当該病原体に固有の抗原決定基
を有するものであればよい。例えば、病原体を加温処理
や放射線照射等により不活性化したもの、病原体を界面
活性剤等で抽出処理して得られる抗原、また、化学合成
や遺伝子工学的手法により人工的に調製した抗原等を例
示することができる。

【００１８】尚、採用しようとする抗原が本発明の測定
法において良好に使用し得るかは、例えば、測定対象抗
体との反応性を常法に従って試験することにより容易に
確認することができる。

【００１９】本発明において当該抗原等の測定系の試薬
は、所望により、常法に従って各種の任意の固相に固定
化して用いることができる。当該固相としては、この技
術分野において慣用の各種の固相が利用でき、例えばガ
ラス、セルロース粉末、セファデックス、セファロー
ス、ポリスチレン、濾紙、カルボキシメチルセルロー
ス、イオン交換樹脂、デキストラン、プラスチックフィ
ルム、プラスチックチューブ、ナイロン、ガラスビー
ズ、絹、ポリアミン−メチルビニルエーテル−マレイン
酸共重合体、アミノ酸共重合体、エチレン−マレイン酸
共重合体等の種々の素材からなるスティック、ビーズ、
プレート（マイクロプレートを含む）、試験管等を広く
例示できる。

【００２０】固定化方法についても特に制限はなく、物
理的結合及び化学的結合のいずれをも使用できる。例え
ば、共有結合法としてジアゾ法、ペプチド法（酸アミド
誘導体法、カルボキシルクロライド樹脂法、カルボジイ
ミド樹脂法、無水マレイン酸誘導体法、イソシアナート
誘導体法、臭化シアン活性化多糖体法、セルロースカル
ボナート誘導体法、縮合試薬を使用する方法等）、アル
キル化法、架橋試薬による担体結合法（例えば架橋試薬
としてグルタールアルデヒド、ヘキサメチレンイソシア
ナート等を用いるもの）、Ｕｇｉ反応による担体結合法
等の化学的反応：或いはイオン交換樹脂のような担体を
用いるイオン結合法：ガラスビーズ等の多孔性ガラスを
担体として用いる物理的吸着法等が例示できる。

【００２１】なお、測定系に使用される抗原の量は、特
に制限されず、採用する測定系において慣用の抗原量に
応じて任意に決定することができる。例えば、サンドイ
ッチ法を採用する場合には、通常、測定対象抗体に対し
て過剰の抗原が使用され、例えば１００μｌ容量で反応
させる場合を例に挙げると、通常０．１〜１００μｇ／
ｍｌ程度、好ましくは１〜１０μｇ／ｍｌ程度の使用を
例示することができる。

【００２２】上記抗原と測定対象抗体との免疫反応（抗
原抗体反応）は、大腸菌由来成分の存在下で行うことを
限度に、特に制限されず、通常の免疫反応における条件
が採用される。一般には４５℃以下、好ましくは約４〜
４０℃、より好ましくは２５〜４０℃程度の温度条件下
で、抗原と測定対象抗体とを共存させ、約０．５〜４０
時間、好ましくは１〜２０時間程度、放置もしくはイン
キュベーションする方法を挙げることができる。また、
反応に使用される溶媒及びそのｐＨも、当該反応に悪影
響を与えないものであれば特に制限されず、常法に従っ
て若しくはそれに準じて、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝
液、トリス塩緩衝液、酢酸緩衝液等のｐＨが約５〜９程
度の緩衝液を例示することができる。

【００２３】該反応系における大腸菌由来成分の配合割
合は、特に制限はないが、反応系の抗原１μｇあたり、
通常０．１〜１００μｇ程度、好ましくは０．５〜５０
μｇ程度を例示することができる。

【００２４】本発明の抗体測定方法は、基本的には、大
腸菌由来成分の存在下で行われる、体液中に存在する測
定対象の抗体と当該抗体に対する固定化されていてもよ
い抗原との免疫反応（抗原抗体反応）工程を有するもの
であれば、他の工程は特に制限されないが、更に当該抗
原に捕捉された測定対象抗体と抗体検出試薬との反応工
程を含んでいることが好ましい。

【００２５】かかる抗原抗体反応工程で得られる免疫複
合体（抗原抗体結合物）を検出・測定する方法並びにそ
れらの条件は、特に制限されることなく、通常の免疫測
定法で用いられるものと同じか若しくはそれに準じた方
法及び条件を採用することができる。

【００２６】本発明は、好適にはサンドイッチ法に従い
実施することができる。例えば、固相化サンドイッチ法
によれば、測定対象である体液中の抗体は例えば次のよ
うにして測定することができる。

【００２７】まず、測定対象である抗体と特異的に抗原
抗体反応する抗原を固相化してなる固相化抗原に、大腸
菌由来成分及び測定対象抗体を含み得る検体としての生
体試料（例えば、尿試料）を加えて、抗原抗体反応を行
わせる。次いで、未結合物質を例えば洗浄により除去し
て、抗体検出試薬を加えて、抗原抗体結合物における測
定対象抗体と反応させ、該試薬に応じた検出手段によっ
て抗原抗体結合物の存在を検出するか、又はその量を測
定する。また、上記において、より簡便には、金コロイ
ド着色ラテックス粒子等を標識してなる抗体検出試薬を
用いたイムノクロマト法の採用を例示することができ
る。

【００２８】これら測定手法における各種手段の選択や
それらの改変等はいずれも当業者のよく知るところであ
り、本発明においてはそれら各手法のいずれによること
もできる〔「臨床検査法提要」、金原出版、1995年等参
照〕。

【００２９】ここで抗体検出試薬としては、特に制限さ
れることなく、一般に当業界で用いられている各種の試
薬を広く用いることができる。例えば、測定対象である
抗体（イムノグロブリン）と結合し得る抗ヒトイムノグ
ロブリン抗体等を挙げることができる。なお、該抗ヒト
イムノグロブリン抗体には、測定対象である各クラスの
イムノグロブリンを免疫源として免疫された任意の被免
疫動物から得られる抗血清又はその精製物（ポリクロー
ナル抗体）或いはモノクローナル抗体が包含される。

【００３０】また、抗体検出試薬としては、イムノグロ
ブリン（ＩｇＧ）のＦｃ領域に結合特異性を有する抗Ｉ
ｇＧ抗体を挙げることができる。かかる抗ＩｇＧ抗体と
しては、ＩｇＧの軽鎖或いはＩｇＧのＦ（ａｂ）領域と
反応性を示さないＦｃ特異的抗ＩｇＧ抗体、又はＩｇＧ
のＦｃ領域に対して特異的に反応性を有するプロテイン
ＡやプロテインＧ等を使用することもでき、これらは測
定対象抗体がＩｇＧである尿中抗体の測定において、特
に好適に使用できる。

【００３１】これらの抗体検出試薬は、常法に従い調製
することができ、また市販品としても入手することがで
きる。

【００３２】当該抗体検出試薬は、その検出の為に、通
常の標識剤によって、直接的に修飾されていてもよい
し、また付加的な検出手段により間接的に修飾すること
もできる。

【００３３】この標識剤としては、特に制限はされず、
従来公知のもの又は将来使用され得るいずれのものをも
用いることができるが、具体的には¹²⁵Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃ等
の放射性同位元素類；アルカリホスファターゼ（ＡＬ
Ｐ）、ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）等の酵素類、フルオ
レセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチ
ルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣ）等の蛍光
物質類；及び１Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−
１−オキシル−４−ピペリジル）−５Ｎ−（アスパルテ
ート）−２，４−ジニトロベンゼン（ＴＯＰＡ）等が例
示され、これらを標識剤として使用する免疫測定法は、
それぞれラジオイムノアッセイ、エンザイムイムノアッ
セイ、フルオロイムノアッセイ及びスピンイムノアッセ
イと称されている。

【００３４】尚、これらの標識剤による標識方法や間接
的な標識化による修飾方法、並びにそれらの検出方法等
は、自体公知の方法に従って行うことができる（「単ク
ローン抗体」岩崎辰夫他著、講談社サイエンティフィ
ク、1984；「酵素免疫測定法」第２版、石川栄治他
著、医学書院、1982等）。

【００３５】本発明の測定方法は、前記測定対象たる抗
体とその抗原との反応において大腸菌由来成分を使用す
ることを必須とするものであって、その限りにおいて、
他の基本的操作等は特に制限されることなく、通常の免
疫測定法における方法及び慣用の方法等を広く採用する
ことができる。故に、上記の抗原抗体結合物と抗体検出
試薬との反応条件も特に制限されず、通常の免疫反応に
おける条件が採用される。通常、前述する抗原抗体反応
の条件と同様な条件、例えば通常４５℃以下、好ましく
は約４〜４０℃、より好ましくは２５〜４０℃程度の温
度条件下、ｐＨが約５〜９程度の下で、約０．５〜４０
時間、好ましくは１〜２０時間程度放置するかもしくは
インキュベーションする方法を挙げることができる。

【００３６】体液中における測定対象抗体の存在有無、
或いはその含有量は、常法に従って、抗体検出試薬の標
識に用いた標識剤（或はその間接的な標識）の種類に応
じた標識活性の測定により、或いはその測定値より換算
した抗体力価として評価される。

【００３７】上記本発明の測定方法を実施するに際して
は、この測定の為の試薬キットを利用することによっ
て、簡便に実施することができる。

【００３８】従って本発明は、前記する抗体測定方法を
実施する為の試薬キットを提供するものである。すなわ
ち、本発明は、体液中に存在する病原体に向けられた抗
体を抗原抗体反応を利用して検出測定するための試薬キ
ットであり、大腸菌由来成分を有効成分として含有する
ことを特徴とする抗体測定用キットである。

【００３９】当該キットは、更に測定対象である抗体と
抗原抗体反応する、固相化されていてもよい抗原又は抗
体検出試薬等を含有していてもよい。

【００４０】また、当該試薬キットには、測定の実施の
便益のために、更に適当な反応液、希釈液、洗浄液、反
応停止液、標識活性測定試薬等が含まれていてもよい。

【００４１】なお、本発明の実施態様には、下記のもの
が包含される：（１）体液中に存在する病原体に向けられた抗体を抗原
抗体反応を利用して検出測定する方法であって、当該抗
体と抗原との抗原抗体反応工程を大腸菌由来成分の存在
下で行うことを特徴とする抗体測定方法。

【００４２】（２）体液が尿である（１）記載の抗体測
定方法。

【００４３】（３）大腸菌由来成分が、大腸菌可溶性成
分又はリポ多糖のいずれか少なくとも１種であることを
特徴とする（１）又は（２）記載の抗体測定方法。

【００４４】（４）大腸菌由来成分を、測定系の抗原１
μｇあたり、０．１〜１００μｇ程度、好ましくは０．
５〜５０μｇ程度の割合で存在させることを特徴とする
（１）乃至（３）のいずれかに記載の抗体測定方法。

【００４５】（５）病原体が、大腸菌以外のバクテリア
類、ウイルス類又は原虫類のいずれかである（１）乃至
（４）のいずれかに記載の抗体測定方法。

【００４６】（６）病原体が、ＨＩＶ、各種肝炎ウイル
ス、風疹ウイルス、インフルエンザウイルス、麻疹ウイ
ルス、ヘルペスウイルス等のウイルス類：Ｈ．ピロリ菌
等のバクテリア類である（５）記載の抗体測定方法。

【００４７】（７）抗原が、バクテリア、ウイルス又は
少なくともそれらの抗原決定基を有するバクテリア由来
成分若しくはウイルス由来成分である（１）乃至（６）
のいずれかに記載の抗体測定方法。

【００４８】（８）抗原が、Ｈ．ピロリ菌又は少なくと
もその抗原決定基を有するＨ．ピロリ菌由来成分である
（７）記載の抗体測定方法。

【００４９】（９）体液中に存在する、病原体に向けら
れた抗体を抗原抗体反応を利用して検出測定するのに用
いられる試薬キットであって、大腸菌由来成分を含むこ
とを特徴とする試薬キット。

【００５０】（10）尿中の、病原体に向けられた抗体を
測定するための（９）記載の試薬キット。

【００５１】（11）更に固相化されていてもよい抗原又
は抗体検出試薬を含有する（９）又は(10）記載の試薬
キット。

【００５２】

【実施例】以下、本発明の内容を以下の実施例を用いて
具体的に説明する。ただし、本発明はこれらに何ら限定
されるものではない。

【００５３】実施例１Ｈ．ピロリ抗体の測定（１）Ｈ．ピロリ抽出抗原の調製Ｈ．ピロリ菌（臨床分離株）をブルセラアガー培地（ベ
クトン社）で４８時間培養（10% CO₂, 5% O₂, 37℃）
し、冷ＰＢＳで集菌した。冷ＰＢＳで５回遠心洗浄後、
菌体濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるように冷ＰＢＳを加
え、撹拌下、当量の冷０．２％トリトンＸ−１００のＰ
ＢＳ溶液を加えた。５分間撹拌後遠心して得た上清を
Ｈ．ピロリ抗原溶液とし、−８０℃で保存した。

【００５４】（２）Ｈ．ピロリ抗原プレートの調製上記のＨ．ピロリ抗原溶液（2.5μg蛋白量/ml）を１０
０μｌ／ウエルの割合で９６穴プレートに加え、４℃で
一夜インキュべートした。該ウエルをＰＢＳで１回洗浄
後、ブロッキング液（タ゛ルヘ゛ッコ-PBS（D-PBS），1% BSA,
5% ソルビトール, 0.05% NaN₃ (pH 7.4)）を３００μｌ
／ウエルで加え、４℃で一夜インキュベートした。ブロ
ッキング液を除去し、２５℃で一夜乾燥させ、これをア
ルミ袋に乾燥剤とともに入れ密封して、使用時まで４℃
で保存した。

【００５５】（３）大腸菌由来成分の調製大腸菌（pvc18/JM109株：宝酒造社製）をアンピシリン
含有液体ＬＢ培地（Luria-Bertani培地、日本製薬社）
で、３７℃、１８時間培養後、遠心により集菌しＰＢＳ
で２回洗浄した。菌体濃度が１００ｍｇ／ｍｌになるよ
うに冷ＰＢＳを加え、超音波破砕機により破砕抽出した
（10秒× 3回）。かくして得た遠心上清を大腸菌由来成
分とし、−８０℃にて保存した（以下、大腸菌抽出物と
いう。）。

【００５６】（４）Ｈ．ピロリ尿中抗体の測定尿検体中に含まれるＨ．ピロリ抗体を測定した。

【００５７】即ち、前記（２）で調製したＨ．ピロリ抗
原プレートの各ウエルに、２０μｇ蛋白量／ｍｌの大腸
菌抽出物を含む第１緩衝液（200mM Tris, 0.14M NaCl,
2%カゼイン, 0.5% BSA, 0.05% Tween 20, 0.1% NaN₃(p
H 7.3)）を２５μｌ及び尿サンプルを１００μｌ加え、
１０秒間撹拌後、３７℃で１時間放置した。該プレート
をＰＢＳＴ（0.05% Tween 20 及び 0.05% NaN₃ を含む
ＰＢＳ溶液）にて６回洗浄後、酵素（ＨＲＰ）標識抗ヒ
トｌｇＧ抗体（Peroxidase conjugated Affini Pure Go
at anti-Human lgG：ジャクソン・イムノ・リサーチ
社）を第２緩衝液（50mM Tris, 0.14M NaCl, 0.5% BSA,
5% ヤギ血清, 0.05% Tween 20, 0.1% XL-II、(pH 7.
3)）で１１,０００倍希釈したものを１００μ１加えて
３７℃で１時間放置し、その後ＰＢＳＴにて６回、プレ
ート洗浄を行った。

【００５８】発色液（50% TMB, 50mM シトレート-Na₂HP
O₄, 0.0075% H₂O₂）の１００μ１を加えて室温で２０分
間反応後、反応停止液（50% TMB停止溶液, 50% 1N-H₂SO
₄）を１００μｌ加えて吸光度を測定した。

【００５９】（５）測定結果 (i) 現在ある診断法のうち最も正確なＨ．ピロリ感染診
断法であるとされる¹³Ｃ−ＵＢＴテスト[J.Gastroenter
ol.,33:6-13(1998)]にて群分けしたＨ．ピロリ感染陽性
者及び同陰性者の各５例の尿を検体として、尿中のＨ．
ピロリ抗体を上記（４）に従って測定した。

【００６０】尚、対照実験として、大腸菌抽出物を添加
しない以外は同一方法にて同一尿検体を測定し、その結
果から大腸菌抽出物の添加による本発明方法の効果を検
討した。

【００６１】結果を図１に示す。

【００６２】図１において、縦軸は吸光度（OD450-650n
m）を、横軸は大腸菌抽出物の添加の有（＋）無（−）
を示し、また図中、○は¹³Ｃ−ＵＢＴテストにおける
Ｈ．ピロリ感染陽性者を、●は同テストにおけるＨ．ピ
ロリ感染陰性者をそれぞれ示す。

【００６３】図１から明らかなように、大腸菌抽出物を
添加した本発明方法による測定によれば、Ｈ．ピロリ感
染陽性者と陰性者をより明確に区別でき、精度に優れた
検出が可能である。

【００６４】(ii) 上記（４）に従い、Ｈ．ピロリの根
絶治療を受けたことのない健常者ボランティア９９名及
び胃疾患を有する患者２０名（胃潰瘍７例及び胃炎１３
例）の尿サンプルを用いて、尿中のＨ．ピロリ抗体を測
定した。

【００６５】結果を図２に示す。同図において、縦軸は
吸光度（O.D.450nm）を、横軸は¹³Ｃ−ＵＢＴテストに
よる群分けを示す。

【００６６】(iii) 上記(ii)における被検者の血清中に
含まれるＨ．ピロリ抗体の量を、市販のＥＬＩＳＡキッ
トを用いて測定し、その測定方法の感度、特異性及び精
度を本発明方法のそれらと比較した。尚、血清検体は、
尿検体と同時に採取し常法に従って調製した。

【００６７】使用した市販キットは、「ＨＭ−ＣＡＰ^TM
ｋｉｔ；Enteric Products社」（HM-CAP）、「Ｈｅｌ
ｉｃｏＧ^TM ｋｉｔ；Shield Diagnostic社」（Helic
o G）及び「ＨＥＬ−ｐＴＥＳＴ^TMｋｉｔ；AMRAD Bi
otech社」（HEL-p）であり、各測定は、各キットに添付
されている指示書に従って実施した。

【００６８】結果を表１に示す。

【００６９】

【表１】

【００７０】表１において、「感度」は、Ｈ．ピロリ陽
性者（¹³Ｃ−ＵＢＴテストにおける感染陽性者：ｎ＝７
０）における各キットでの陽性率を、「特異性」は、
Ｈ．ピロリ陰性者（¹³Ｃ−ＵＢＴテストにおける感染陰
性者：ｎ＝４９）における各キットでの陰性率をそれぞ
れ示すものであり、「精度」は、全被験者（７０＋４９
＝１１９例）における各キットで正確に測定できた割合
を示す。

【００７１】本発明方法によるＨ．ピロリ抗体の測定に
よれば、抗体が微量にしか存在しない尿を被検体として
用いているにも拘わらず、既存の血中抗体検出キットよ
りも感度及び特異性において優れており、顕著に優れた
精度を示すことが明らかである。

【００７２】（６）Ｈ．ピロリ尿中抗体の測定大腸菌抽出物の代わりに大腸菌ＬＰＳ（Gibco社製）を
含む第１緩衝液（ＬＰＳ濃度：５μｇ／ウエル）を用い
た以外は、前記（４）に従って、尿検体中に含まれる
Ｈ．ピロリ抗体を測定し、前記（５）(i)に従って、そ
の測定結果を評価した。

【００７３】結果を、図１に準じた体裁にて、図３に示
す。

【００７４】実施例２Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢｃ）抗
体の測定（１）Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢｃ）抗体の測定ＨＢｃ抗原（Chemicon International社製）を用いて前
記実施例１（２）に準じて抗原プレートを調製し、尿中
検体に含まれるＢ型肝炎ウイルス（コア）（ＨＢｃ）抗
体の測定を前記実施例１（４）に準じて行った。

【００７５】すなわち、ＨＢｃ抗原プレートの各ウエル
に、所定濃度の大腸菌抽出物を含む第１緩衝液２５μｌ
及び尿サンプル１００μｌを加え、１０秒間撹拌後、３
７℃で１時間放置した。該プレートをＰＢＳＴにて６回
洗浄後、酵素（ＨＲＰ）標識抗ヒトＩｇＧ抗体を第２緩
衝液で１１,０００倍希釈したものを１００μｌ加えて
３７℃で１時間放置し、その後、プレート洗浄（ＰＢＳ
Ｔにて６回）を行った。

【００７６】発色液１００μｌを加えて室温で２０分間
反応後、反応停止液１００μｌを加えて吸光度を測定し
た。

【００７７】（２）測定結果市販のＨＢｃ抗体リアキット（ダイナボット社製）を用
いた測定により血中ＨＢｃ抗体陽性者及び同陰性者に群
分けした各５例における尿中ＨＢｃ抗体を上記（１）に
従って測定した。

【００７８】なお、反応液中の大腸菌抽出物の濃度を、
０、０.７８、１.５６、３.１３、６.２５、１２.５μ
ｇ／ｍｌとなるように設定し、その添加による効果を検
討した。

【００７９】結果を図４に示す。

【００８０】図４において、縦軸は吸光度（ＯＤ450−6
50nm）を、横軸は大腸菌抽出物の添加濃度を、●は血中
ＨＢｃ抗体陽性者を、○は血中ＨＢｃ抗体陰性者をそれ
ぞれ示す。該図より、大腸菌抽出物の添加量に依存し
て、血中ＨＢｃ抗体陽性者及び同陰性者のそれぞれで検
出されたＨＢｃ抗体レベルの差が、尿を被検体とした場
合でも明確になることが明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明（実施例１（５）(i)）に従う尿中Ｈ．
ピロリ抗体の測定結果を示す図面である。

【図２】本発明（実施例１（５）(ii)）に従う尿中Ｈ．
ピロリ抗体の測定結果を示す図面である。

【図３】本発明（実施例１（６））に従う尿中Ｈ．ピロ
リ抗体の測定結果を示す図面である。

【図４】本発明（実施例２（２））に従う尿中ＨＢｃ抗
体の測定結果を示す図面である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/531

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】尿中に存在する病原体に向けられた抗体
を抗原抗体反応を利用して検出測定する方法であって、
抗原として、病原体、病原体を不活性化したもの、病原
体を抽出処理して得られるもの、又は化学合成により調
製したものを用いて、当該抗体と抗原との抗原抗体反応
工程を大腸菌由来成分の存在下で行うことにより、尿に
由来する非特異的反応を抑制させることを特徴とする抗
体測定方法。
【請求項２】大腸菌由来成分が、大腸菌可溶性成分又
はリポ多糖のいずれか少なくとも１種であることを特徴
とする請求項１に記載の抗体測定方法。
【請求項３】抗原が、Ｈ．ピロリ菌又は少なくともそ
の抗原決定基を有するＨ．ピロリ菌由来成分である請求
項１又は２に記載の抗体測定方法。
【請求項４】抗原として、病原体、病原体を不活性化
したもの、病原体を抽出処理して得られるもの、又は化
学合成により調製したものを用いて、尿に由来する非特
異的反応を抑制し、尿中に存在する病原体に向けられた
抗体を抗原抗体反応を利用して検出測定するのに用いら
れる試薬キットであって、大腸菌由来成分を含むことを
特徴とする試薬キット。
【請求項５】尿を検体とする尿中抗体の測定系におい
て、抗原として、病原体、病原体を不活性化したもの、
病原体を抽出処理して得られるもの、又は化学合成によ
り調製したものを用いて、測定対象たる抗体とそれに対
する抗原との抗原抗体反応を大腸菌に由来する成分の存
在下で行うことを特徴とする、検体に由来する非特異的
反応を抑制する方法。
【請求項６】大腸菌由来成分が、大腸菌可溶性成分又
はリポ多糖のいずれか少なくとも１種であることを特徴
とする請求項５に記載の非特異的反応を抑制する方法。
【請求項７】抗原が、Ｈ．ピロリ菌又は少なくともそ
の抗原決定基を有するＨ．ピロリ菌由来成分である請求
項５又は６に記載の非特異的反応を抑制する方法。