JP3492750B2 - 5-Aminolevulinic acid-producing microorganism and method for producing the same - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、農薬等として有用な５
−アミノレブリン酸を効率よく生産する微生物、当該微
生物の製造法、及び５−アミノレブリン酸の製造法に関
する。FIELD OF THE INVENTION The present invention is useful as a pesticide and the like.
-A microorganism that efficiently produces aminolevulinic acid, a method for producing the microorganism, and a method for producing 5-aminolevulinic acid.

【０００２】[0002]

【従来の技術】５−アミノレブリン酸は、テトラピロー
ル化合物の前駆物質として広く生物圏に存在し、生体中
で重要な役割を担っていると共に、除草剤、殺虫剤、植
物成長調節剤、植物の光合成増強剤として優れた効果を
示し、しかも人畜に対して毒性を示さず分解性が高いた
め、環境中への残留性もないなど優れた性質を示す天然
化合物である（特開昭６１−５０２８１４号公報、特開
平２−１３８２０１号公報など参照）。BACKGROUND OF THE INVENTION 5-Aminolevulinic acid exists widely in the biosphere as a precursor of tetrapyrrole compounds and plays an important role in the living body, as well as herbicides, insecticides, plant growth regulators and plant It is a natural compound that exhibits excellent effects as a photosynthesis enhancer, has no degradability to humans and animals, and has high degradability, and thus does not have residual properties in the environment (JP-A-61-502814). Japanese Patent Laid-Open No. 2-138201, etc.).

【０００３】この５−アミノレブリン酸の製造方法とし
ては、従来、種々の方法があり、微生物を用いた製造方
法（特開平５−１８４３７６号公報）も検討されている
が、従来の微生物を用いた製造方法では５−アミノレブ
リン酸の生産性が低く、満足できるものではない。ま
た、５−アミノレブリン酸がグリシンを前駆体として生
合成されるＣ４経路を有する光合成細菌や酵母などを用
いた５−アミノレブリン酸の製造方法として、５−アミ
ノレブリン酸の生合成の前駆体であるグリシンを培養液
中に添加する方法がある。There are various methods for producing 5-aminolevulinic acid, and a method using a microorganism (Japanese Patent Laid-Open No. 5-184376) has been investigated, but a conventional microorganism was used. In the production method, the productivity of 5-aminolevulinic acid is low, which is not satisfactory. Further, as a method for producing 5-aminolevulinic acid using a photosynthetic bacterium or yeast having a C4 pathway in which 5-aminolevulinic acid is biosynthesized using glycine as a precursor, glycine which is a precursor of 5-aminolevulinic acid biosynthesis is used. Is added to the culture solution.

【０００４】グリシンの添加は、５−アミノレブリン酸
の生産量を著しく増大させる効果をもたらすが、大量の
グリシンの添加は、微生物の生育や機能を著しく阻害す
る。従って、グリシンの５−アミノレブリン酸への転換
率を上昇させることが、５−アミノレブリン酸の生産性
を向上させるための重要な手段となる。The addition of glycine has the effect of significantly increasing the production of 5-aminolevulinic acid, but the addition of a large amount of glycine significantly inhibits the growth and function of microorganisms. Therefore, increasing the conversion rate of glycine to 5-aminolevulinic acid is an important means for improving the productivity of 5-aminolevulinic acid.

【０００５】一方、生体内でのグリシンの代謝には幾つ
もの経路が知られているが、中でもグリシンとアセチル
−ＣｏＡを基質としてアミノアセトン（アミノアセトン
シンターゼ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．２９）を生成する反
応は、グリシンだけでなく、この反応に必要な補酵素で
あるピリドキサールリン酸に関しても、５−アミノレブ
リン酸生産反応である５−アミノレブリン酸シンターゼ
反応と競合する。On the other hand, several pathways are known for the metabolism of glycine in the living body, and among them, aminoacetone (aminoacetone synthase, EC 2.3.1.1.) Using glycine and acetyl-CoA as substrates. The reaction producing 29) competes not only with glycine but also with the coenzyme pyridoxal phosphate required for this reaction, with the 5-aminolevulinic acid synthase reaction, which is the 5-aminolevulinic acid producing reaction.

【０００６】また、５−アミノレブリン酸の生産性を向
上させるためには、生体内でスクシニル−ＣｏＡが安定
に供給されなくてはならない。なおかつ、スクシニル−
ＣｏＡが安定に供給されていても、スクシニル−ＣｏＡ
が５−アミノレブリン酸シンターゼによって５−アミノ
レブリン酸に転換される際にアセチル−ＣｏＡが存在す
れば、アセチル−ＣｏＡが競合的に働く。さらに、５−
アミノレブリン酸シンターゼによってスクシニル−Ｃｏ
Ａの代わりにアセチル−ＣｏＡがグリシンとの縮合反応
を受ければ、アミノアセトンが生じる（Ｔｈｅ Ｅｎｚ
ｙｍｅ、Ｐ．Ｄ．ベイヤー編、１９７２年参照）。In order to improve the productivity of 5-aminolevulinic acid, succinyl-CoA must be stably supplied in vivo. Moreover, succinyl-
Even if CoA is stably supplied, succinyl-CoA
If acetyl-CoA is present when is converted to 5-aminolevulinic acid by 5-aminolevulinic acid synthase, acetyl-CoA acts competitively. Furthermore, 5-
Succinyl-Co by aminolevulinic acid synthase
If acetyl-CoA instead of A undergoes a condensation reaction with glycine, aminoacetone is produced (The Enz
ime, P.I. D. (See Bayer, 1972).

【０００７】以上のようにグリシンから５−アミノレブ
リン酸及びアミノアセトンへの代謝経路は酵素及び補酵
素が複雑に関与しており、これを制御することは困難で
あった。As described above, the metabolic pathway from glycine to 5-aminolevulinic acid and aminoacetone involves enzymes and coenzymes in a complicated manner, and it is difficult to control this.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はアミノアセトンの生産性を抑制し、選択的に５−アミ
ノレブリン酸を生産する微生物、当該微生物の創製法、
及び当該微生物を利用した５−アミノレブリン酸の製造
法を提供することにある。Therefore, an object of the present invention is to suppress the productivity of aminoacetone and selectively produce 5-aminolevulinic acid, a method for producing the microorganism,
And to provide a method for producing 5-aminolevulinic acid using the microorganism.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】このような実情におい
て、本発明者は、５−アミノレブリン酸生産菌の突然変
異処理について鋭意検索した結果、光合成細菌であるロ
ドバクター属に属する微生物を変異処理して得られる変
異株群のうち、比較的著量のアミノアセトンを蓄積する
ものが５−アミノレブリン酸の生産が著しく低下してい
ることを発見し、さらに上記変異株群の中からアミノア
セトンを蓄積しない菌株を選択することによって、５−
アミノレブリン酸を特異的に高蓄積する変異株を選択す
ることに成功し、本発明を完成するに至った。In such a situation, the present inventor has conducted a diligent search for mutation treatment of 5-aminolevulinic acid-producing bacteria, and as a result, mutated the microorganism belonging to the genus Rhodobacter, which is a photosynthetic bacterium. Among the obtained mutant strains, it was discovered that the one that accumulated a relatively large amount of aminoacetone had a significantly reduced production of 5-aminolevulinic acid, and further did not accumulate aminoacetone from the above mutant strain group. By selecting the strain,
We have succeeded in selecting a mutant strain that specifically accumulates aminolevulinic acid at a high level, and completed the present invention.

【００１０】[0010]

【産業上の利用分野】すなわち、本発明は５−アミノレ
ブリン酸を蓄積し、かつアミノアセトンを蓄積しないロ
ドバクター・セファロイデスに属する微生物を提供する
ものである。BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention provides a microorganism belonging to Rhodobacter cephaloides that accumulates 5-aminolevulinic acid and does not accumulate aminoacetone.

【００１１】 また、本発明はロドバクター・セファロ
イデスに属し、５−アミノレブリン酸及びアミノアセト
ンを蓄積する微生物を突然変異処理し、５−アミノレブ
リン酸を蓄積し、かつアミノアセトンを蓄積しない変異
株を選択することを特徴とする上記の微生物の製造法を
提供するものである。The present invention also mutates a microorganism belonging to Rhodobacter cephaloides that accumulates 5-aminolevulinic acid and aminoacetone, and selects a mutant strain that accumulates 5-aminolevulinic acid and does not accumulate aminoacetone. The present invention provides a method for producing the above-mentioned microorganism.

【００１２】さらにまた、本発明は上記の微生物を培養
し、得られた培養物から５−アミノレブリン酸を採取す
ることを特徴とする、５−アミノレブリン酸の製造法を
提供するものである。Furthermore, the present invention provides a method for producing 5-aminolevulinic acid, which comprises culturing the above-mentioned microorganism and collecting 5-aminolevulinic acid from the obtained culture.

【００１３】本発明の微生物はロドバクター・セファロ
イデスに属し、グリシン及びレブリン酸存在下で５−ア
ミノレブリン酸を高蓄積し、かつアミノアセトンを副生
しないものであれば特に制限されない。The microorganism of the present invention belongs to Rhodobacter cephaloides and is not particularly limited as long as it highly accumulates 5-aminolevulinic acid in the presence of glycine and levulinic acid and does not byproduce aminoacetone.

【００１４】 本発明の微生物は、例えば光合成細菌で
あるロドバクター・セファロイデスに属し、５−アミノ
レブリン酸及びアミノアセトンを蓄積する微生物を突然
変異処理し、当該変異株の中から５−アミノレブリン酸
の生産性を維持し、アミノアセトン生産性を失った株を
選択することにより得られる。The microorganism of the present invention belongs to, for example, a photosynthetic bacterium, Rhodobacter cephaloides, and mutates a microorganism that accumulates 5-aminolevulinic acid and aminoacetone to produce 5-aminolevulinic acid from the mutant strain. It is obtained by selecting a strain that retains sex and loses aminoacetone productivity.

【００１５】ここで用いられる親株としては、ロドバク
ター・セファロイデスに属する菌株、例えばＣＲ−３８
６株（微工研菌寄第１３１５９号）が挙げられる。この
ＣＲ−３８６株は、既知の菌株であるロドバクター・セ
ファロイデス（ＩＦＯ１２２０３）をＮＴＧで変異処理
し、得られた変異株より５−アミノレブリン酸デヒドラ
ターゼ変異酵素を有する株を選択することにより得られ
たものである。The parent strain used here is a strain belonging to Rhodobacter cephaloides, for example CR-38.
6 strains (Microtechnology Research Institute, No. 13159). This CR-386 strain was obtained by subjecting a known strain, Rhodobacter cephaloides (IFO12203), to mutation treatment with NTG, and selecting a strain having a 5-aminolevulinic acid dehydratase mutant enzyme from the obtained mutant strains. It is a thing.

【００１６】親株の突然変異処理は、例えばまず、親株
が増殖し得る液体培地を試験管中に調製し、滅菌した後
この培地中に滅菌した親株を接種し、振とう培養して、
菌体を増殖させ、得られた菌体を緩衝液で洗浄した後、
物理的変異原、化学的変異原などを用いた公知の変異手
法によって行われる。ここで物理的変異原としては紫外
線、電離放射線などが挙げられ、この場合、増殖した寒
天培地上の親株に上記線原から照射する方法を用いるこ
とができる。また、化学的変異原としては、エチルメタ
ンスルホネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、エチルニトロソ
尿素（ＥＮＵ）等のアルキル化剤やブロモデオキシウリ
ジン（ＢｒｄＵｒｄ）等の塩基アナログなどが挙げら
れ、この場合、これらの化合物を添加した緩衝液中で親
株を培養する方法を用いることができる。The mutation treatment of the parent strain is carried out, for example, by first preparing a liquid medium in which the parent strain can grow in a test tube, sterilizing it, inoculating the sterilized parent strain in this medium, and culturing with shaking.
After growing the cells and washing the obtained cells with a buffer,
It is carried out by a known mutagenesis method using a physical mutagen, a chemical mutagen and the like. Examples of the physical mutagen include ultraviolet rays and ionizing radiation. In this case, a method of irradiating the grown parent strain on the agar medium from the above-mentioned linear source can be used. In addition, as chemical mutagens, alkylating agents such as ethyl methane sulfonate (EMS), N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethyl nitrosourea (ENU) and bromodeoxyuridine (BrdUrd) are used. ) And the like, and in this case, a method of culturing a parent strain in a buffer containing these compounds can be used.

【００１７】本発明の微生物を得るための上記親株を増
殖・培養するために用いる培地としては、該微生物が十
分に増殖し得るものであればいずれをも用いることがで
きるが、該培地中には資化し得る炭素源及び窒素源を適
当量含有せしめておくことが好ましい。炭素源として
は、グルコース等の糖類、酢酸、リンゴ酸、コハク酸等
の酸類などを用いることができる。また、窒素源として
は、硫安、塩安等のアンモニア態窒素化合物、硝酸ナト
リウム等の硝酸態窒素化合物等の無機窒素源、尿素、ポ
リペプトン、酵母エキス等の有機窒素化合物などを用い
ることができる。さらに、無機塩類等の微量成分などを
適宜添加することができる。As a medium used for growing and culturing the above-mentioned parent strain for obtaining the microorganism of the present invention, any medium can be used as long as the microorganism can grow sufficiently. It is preferable that the carbon source and the nitrogen source that can be assimilated are contained in appropriate amounts. As the carbon source, sugars such as glucose, acids such as acetic acid, malic acid, succinic acid and the like can be used. As the nitrogen source, ammonium nitrogen compounds such as ammonium sulfate and ammonium chloride, inorganic nitrogen sources such as nitrate nitrogen compounds such as sodium nitrate, organic nitrogen compounds such as urea, polypeptone and yeast extract can be used. Furthermore, trace components such as inorganic salts can be added as appropriate.

【００１８】上記変異処理により得られた変異株から、
本発明微生物を選択するには、変異株をグリシン及びレ
ブリン酸含有培地中で培養し、５−アミノレブリン酸を
産生し、かつアミノアセトンを産生しない菌株を選択す
ればよい。From the mutant strain obtained by the above mutation treatment,
To select the microorganism of the present invention, the mutant strain may be cultured in a medium containing glycine and levulinic acid to select a strain that produces 5-aminolevulinic acid and does not produce aminoacetone.

【００１９】より具体的には、変異株をさらに緩衝液で
洗浄した後、寒天培地に撒いて培養し、この培養によっ
て生育した変異株の中から以下の工程によって目的とす
る菌株を選択する。More specifically, the mutant strain is further washed with a buffer solution, sown on an agar medium and cultured, and the target strain is selected from the mutant strains grown by this culture by the following steps.

【００２０】（１）得られた変異株を上記と同様の培地
に植菌し、２４時間程度振とう培養する。このとき使用
する培養器としては通常の試験管を利用する他に、効率
的に多くの変異株を評価するためにマイクロプレート等
を利用することもできる。(1) The obtained mutant strain is inoculated into the same medium as above and shake-cultured for about 24 hours. As the incubator used at this time, in addition to using a normal test tube, a microplate or the like can be used to efficiently evaluate many mutant strains.

【００２１】（２）グリシン及びレブリン酸を添加し、
２４時間程度振とう培養した後、それぞれの培養液の一
部を採取し、試薬１（酢酸ナトリウム６８ｇとアセチル
アセトン１０mlとを混合し、氷酢酸でpHを４．７に調整
し、蒸留水で１０００mlとしたもの）と混合する。沸騰
浴中で加熱したもの（反応液１）を用いて薄層クロマト
グラフィーを行う。このとき使用するゲル及び展開液
は、２，４−ジメチル−３−アセチルピロール（Ｉ）
（アミノアセトン発色体）と２−メチル−３−アセチル
−４−（３−プロピオン酸）ピロール（II）（５−アミ
ノレブリン酸発色体）を分離できるものであればいかな
る方法でもよい。(2) Add glycine and levulinic acid,
After shaking culture for about 24 hours, a part of each culture solution was collected, reagent 1 (68 g of sodium acetate and 10 ml of acetylacetone was mixed, the pH was adjusted to 4.7 with glacial acetic acid, and 1000 ml with distilled water). Mixed with). Thin layer chromatography is carried out using the one heated in a boiling bath (reaction solution 1). The gel and developing solution used at this time were 2,4-dimethyl-3-acetylpyrrole (I).
Any method may be used as long as it can separate (aminoacetone colorant) and 2-methyl-3-acetyl-4- (3-propionic acid) pyrrole (II) (5-aminolevulinic acid colorant).

【００２２】（３）上記条件で十分に展開した後、上記
化合物（Ｉ）のスポットの見られない株を選択する。こ
のとき、上記化合物（II）のスポットの発色の強いもの
が望ましい。なお、この確認のために反応液１の１部を
試薬２（ｐ−ジメチルアミノベンズアルデヒド１ｇと７
０％過塩素酸８mlを混合し、氷酢酸で５０mlとしたも
の）と混合したもの（反応液２）の５５３nmの吸光度を
測定する（エーリッヒ法）ことにより５−アミノレブリ
ン酸生産量を検討してもよい。(3) After sufficiently developing under the above conditions, a strain in which the spot of the compound (I) is not found is selected. At this time, it is desirable that the compound (II) has a strong spot color. For confirmation, 1 part of the reaction solution 1 was mixed with reagent 2 (1 g of p-dimethylaminobenzaldehyde and 7 g of p-dimethylaminobenzaldehyde).
The amount of 5-aminolevulinic acid produced was examined by measuring the absorbance at 553 nm of the mixture (reaction solution 2) mixed with 8 ml of 0% perchloric acid and adjusted to 50 ml with glacial acetic acid (Erich method). Good.

【００２３】このようにして得られる本発明微生物の例
としてはＣＲ−４５０株が挙げられる。このＣＲ−４５
０株の菌学的性質は、５−アミノレブリン酸を蓄積し、
アミノアセトンを蓄積しないという特性以外は前記ＣＲ
−３８６株と同様である。従って、このＣＲ−４５０株
をロドバクター・セファロイデス ＣＲ−４５０と命名
し、工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ
−１４０８５として寄託した。An example of the microorganism of the present invention thus obtained is the CR-450 strain. This CR-45
The mycological property of strain 0 is that 5-aminolevulinic acid accumulates,
CR except for the property that it does not accumulate aminoacetone
-386 strain. Therefore, this CR-450 strain was named Rhodobacter cephaloides CR-450, and was designated by the FERM P
Deposited as -14085.

【００２４】本発明微生物を用いて５−アミノレブリン
酸を生産するには、上記微生物を培養し、その培養物か
ら５−アミノレブリン酸を採取すればよい。In order to produce 5-aminolevulinic acid using the microorganism of the present invention, the above-mentioned microorganism is cultured and 5-aminolevulinic acid is collected from the culture.

【００２５】本発明微生物の培養条件は、通常のロドバ
クター属の微生物の培養と同様の条件を採用できる。５
−アミノレブリン酸の生産を主目的とする場合、培地
は、前記親株と同様の培地にグリシン及びレブリン酸を
添加したものが好ましい。グリシンの添加量は５〜１０
０mM、特に１０〜６０mMとすることが好ましく、レブリ
ン酸の添加量は１〜６０mM、特に５〜３０mMとすること
が好ましい。培養条件は、特に限定されるものではない
が、一般には１０〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃の
好気条件において培養すればよく、また、上記培地のpH
は５〜８、特に５．５〜７．５とすることが好ましい。
なお、５−アミノレブリン酸の生産時にpHが変化する場
合には、水酸化ナトリウム、アンモニア、水酸化カリウ
ム等のアルカリ溶液や塩酸、硫酸、燐酸等の酸を用いて
pHを調整することが好ましい。The conditions for culturing the microorganism of the present invention can be the same as those for culturing ordinary microorganisms of the genus Rhodobacter. 5
-When the main purpose is the production of aminolevulinic acid, the medium is preferably the same medium as the parent strain, to which glycine and levulinic acid are added. The amount of glycine added is 5-10
The amount of levulinic acid added is preferably 1 to 60 mM, and more preferably 5 to 30 mM. The culture conditions are not particularly limited, but generally, the culture may be performed under aerobic conditions of 10 to 40 ° C, preferably 20 to 35 ° C, and the pH of the medium is
Is preferably 5 to 8, and particularly preferably 5.5 to 7.5.
If the pH changes during the production of 5-aminolevulinic acid, use an alkaline solution such as sodium hydroxide, ammonia, or potassium hydroxide, or an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, or phosphoric acid.
It is preferable to adjust the pH.

【００２６】また、５−アミノレブリン酸の生産は本発
明微生物の増殖と同時に行うこともでき、菌体の増殖と
独立して行うこともできる。この場合、使用する微生物
は、増殖基菌体、休止菌体のいずれでもよく、そのまま
５−アミノレブリン酸の生産に使用することができる
が、遠心分離等の方法により集菌し、培地やリン酸緩衝
液等の適当な溶媒に再懸濁させるなどの方法を採用する
ことにより、菌濃度を高くして用いることもできる。The production of 5-aminolevulinic acid can be carried out at the same time as the growth of the microorganism of the present invention, or independently of the growth of bacterial cells. In this case, the microorganism to be used may be either a vegetative cell or a resting cell, and can be used as it is for the production of 5-aminolevulinic acid, but it is collected by a method such as centrifugation, and the medium or phosphoric acid is used. By using a method such as resuspending in an appropriate solvent such as a buffer solution, it is possible to increase the bacterial concentration for use.

【００２７】培養物から５−アミノレブリン酸を採取す
るには、培養により５−アミノレブリン酸は菌体外に分
泌されるので通常、培養液から、イオン交換樹脂を用い
る等の手段により分離すればよい。To collect 5-aminolevulinic acid from the culture, since 5-aminolevulinic acid is secreted outside the cells by the culture, it is usually separated from the culture medium by a means such as using an ion exchange resin. .

【００２８】[0028]

【発明の効果】本発明の微生物を５−アミノレブリン酸
の生産に用いた場合、副生するアミノアセトンの量が著
しく低減し、かつグリシンの５−アミノレブリン酸への
転換率の向上及び／又はスクシニル−ＣｏＡを５−アミ
ノレブリン酸に転換する際のアセチルＣｏＡによる競争
阻害の緩和の効果により、５−アミノレブリン酸の生産
性が著しく向上する。INDUSTRIAL APPLICABILITY When the microorganism of the present invention is used for the production of 5-aminolevulinic acid, the amount of by-produced aminoacetone is significantly reduced, and the conversion rate of glycine to 5-aminolevulinic acid is improved and / or succinyl is used. -The productivity of 5-aminolevulinic acid is significantly improved by the effect of mitigating the competition inhibition by acetyl CoA when converting CoA to 5-aminolevulinic acid.

【００２９】[0029]

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。The present invention will be described in more detail below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.

【００３０】実施例１ 表１に示すグルタメート・グルコース培地（培地１）１
０mlを直径２１mmの試験管に分注し、１２１℃で１５分
間滅菌し、冷却した。これにＣＲ−３８６株（微工研菌
寄第１３１５９号）の一白金耳を植菌した後、暗所にて
３０℃で２日間振とう培養した。別の直径２１mmの試験
管に培地１を１０ml分注して、上記と同様にして滅菌し
た。これに、上記の培養液０．５mlを植え継ぎ、暗所に
て３０℃で１８時間振とうすることにより培養した。次
に、この培養液を１００００rpm にて５分間遠心分離
し、その上清を捨て、遠心分離前と同量のトリス・マレ
イン酸緩衝液（pH６．０）に懸濁させた。この洗浄操作
をさらに２度繰り返した。この後、再び１００００rpm
にて５分間遠心分離し、その上清を捨て、１００μｇ／
mlのＮＴＧを含むトリス・マレイン酸（pH６．０）に懸
濁させ、室温にて８０分間静置培養した。このようにし
て変異処理した菌を、上記と同様の方法で３回洗浄した
後、滅菌した培地１の試験管に植え継ぎ、暗所にて３０
℃で２日間振とう培養し、培養液を得た。培地１に寒天
１５ｇ／ｌを添加し、１２１℃で１５分間滅菌して調製
した寒天プレートに、上記の培養液を生理食塩水で適宜
希釈して塗布し、暗所にて３０℃で４日間培養すること
により、約１００００株のコロニーを得た。上記の操作
で得られた変異株それぞれを培地１の試験管に植菌し、
暗所にて３０℃にて２日間振とう培養した。培養後それ
ぞれの試験管にグリシンを３０mM、レブリン酸を１mMと
なるように添加し、さらに２日間培養を続けた。培養上
清１mlと試薬１（酢酸ナトリウム６８ｇとアセチルアセ
トン１０mlとを混合し、氷酢酸でpHを４．７に調整し、
蒸留水で１０００mlとしたもの）を２mlとを混合し、沸
騰浴中で１５分間加熱し（反応液１）、これを冷却後、
反応液を一部取り、３．５mlの試薬２（ｐ−ジメチルア
ミノベンズアルデヒド１ｇと７０％過塩素酸８mlを混合
し、氷酢酸で５０mlとしたもの）を加えてよく混合し、
室温にて５分間静置した（反応液２）。上記反応液の５
５３nmの吸光度を測定し、吸光度の高いもの２７株（選
択菌）を得た。結果を表２に示す。Example 1 Glutamate-glucose medium (medium 1) 1 shown in Table 1
0 ml was dispensed into a test tube having a diameter of 21 mm, sterilized at 121 ° C. for 15 minutes, and cooled. After inoculating this with one platinum loop of the CR-386 strain (Microtechnology Research Institute No. 13159), it was cultured with shaking at 30 ° C. for 2 days in the dark. 10 ml of the medium 1 was dispensed into another test tube having a diameter of 21 mm and sterilized in the same manner as above. 0.5 ml of the above-mentioned culture solution was subcultured to this and cultured by shaking at 30 ° C. for 18 hours in the dark. Next, this culture solution was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was discarded, and the suspension was suspended in the same amount of Tris-maleic acid buffer solution (pH 6.0) as before centrifugation. This washing operation was repeated twice more. After this, 10,000 rpm again
Centrifuge for 5 minutes, discard the supernatant, and remove 100 μg /
The cells were suspended in tris-maleic acid (pH 6.0) containing ml of NTG, and statically cultured at room temperature for 80 minutes. The bacteria thus mutated were washed 3 times in the same manner as described above, and then transferred to a sterilized medium 1 test tube, and then transferred to a dark place for 30 days.
The culture was shaken at 2 ° C. for 2 days to obtain a culture solution. 15g / l of agar was added to the medium 1, and the above culture solution was appropriately diluted with physiological saline and applied to an agar plate prepared by sterilizing at 121 ° C for 15 minutes, and at 4 ° C for 4 days at 30 ° C in the dark. By culturing, colonies of about 10,000 strains were obtained. Each of the mutant strains obtained by the above operation was inoculated into a test tube of medium 1,
It was shake-cultured at 30 ° C. for 2 days in the dark. After the culture, glycine was added to each test tube at 30 mM and levulinic acid was added at 1 mM, and the culture was continued for another 2 days. 1 ml of the culture supernatant and reagent 1 (68 g of sodium acetate and 10 ml of acetylacetone were mixed and the pH was adjusted to 4.7 with glacial acetic acid,
2 ml of distilled water (made up to 1000 ml) was mixed and heated in a boiling bath for 15 minutes (reaction liquid 1), and after cooling,
A part of the reaction solution was taken, 3.5 ml of reagent 2 (1 g of p-dimethylaminobenzaldehyde and 8 ml of 70% perchloric acid were mixed and made to be 50 ml with glacial acetic acid) was added and mixed well,
The mixture was left standing at room temperature for 5 minutes (reaction solution 2). 5 of the above reaction solution
The absorbance at 53 nm was measured to obtain 27 strains (selective bacteria) with high absorbance. The results are shown in Table 2.

【００３１】上記選択菌２７株を含む反応液１を薄層ク
ロマトグラフィーに供し、十分に展開後、風乾した。こ
の場合、展開溶媒としては、酢酸エチル：イソプロピル
アルコール：２５％アンモニア＝９：７：４（容積比）
の混合液を用いた。次に、上記薄層板に試薬２を噴霧
し、５分間放置する方法を用いて、Ｒ．ｆ．＝０．８７
に検出される赤色のスポット（化合物Ｉに対応）の有無
を調べた。結果を表２に示す。The reaction solution 1 containing 27 strains of the selected bacteria was subjected to thin layer chromatography, sufficiently developed, and then air dried. In this case, the developing solvent is ethyl acetate: isopropyl alcohol: 25% ammonia = 9: 7: 4 (volume ratio).
Was used. Then, using the method of spraying the reagent 2 onto the thin layer plate and leaving it to stand for 5 minutes, R.I. f. = 0.87
The presence or absence of a red spot (corresponding to compound I) detected in 1. was examined. The results are shown in Table 2.

【００３２】[0032]

【表１】 [Table 1]

【００３３】[0033]

【表２】 [Table 2]

【００３４】＊： −；無し。 ±；Ｒ．ｆ．＝０．１及びＲ．ｆ．＝０．８７有り。 ＋；Ｒ．ｆ．＝０．８７のみ有り。*: -; None. ±; R. f. = 0.1 and R.I. f. = 0.87 is available. +; R. f. There is only 0.87.

【００３５】表２から、本発明に係る変異株Ｎｏ．４５
（ＣＲ４５０（ＦＥＲＭ Ｐ１４０８５））は、アミノ
アセトンを蓄積せず、なおかつピロール環に由来する５
５３nmの吸光度が高いことがわかる。From Table 2, the mutant strain No. 45
(CR450 (FERM P14085)) does not accumulate aminoacetone and is derived from the pyrrole ring.
It can be seen that the absorbance at 53 nm is high.

【００３６】実施例２ １０mlの培地１を直径２１mmの試験管に分注して、１２
１℃で１５分間滅菌し、冷却した。これにＣＲ−４５０
株の一白金耳を植菌後、暗所にて３０℃で２日間振とう
培養した。５００mlの振とうフラスコに培地１を２００
ml分注して、上記と同様にして滅菌した。これに、上記
の培養液１０mlを植え継ぎ、暗所にて３０℃で２日間振
とう培養した。これを１００００rpm で１０分間遠心分
離した後、菌体をグリシン３０mM、レブリン酸１５mMを
含む培地２に湿菌体０．３ｇ／１０mlとなるように懸濁
させ、暗所にて３０℃で振とう培養した。培養１５時間
及び４０時間後それぞれの培養液中の５−アミノレブリ
ン酸を岡山らの方法（ＣＬＩＮＩＣＡＬ ＣＨＥＭＩＳ
ＴＲＹ，Ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．８，ｐ１４９４，１９９
０）により定量した。結果を表３に示す。Example 2 10 ml of the medium 1 was dispensed into a test tube having a diameter of 21 mm, and 12
Sterilized at 1 ° C for 15 minutes and cooled. CR-450 to this
After inoculating one platinum loop of the strain, it was shake-cultured at 30 ° C. for 2 days in the dark. Add 200 ml of Medium 1 to a 500 ml shake flask.
It was dispensed in ml and sterilized in the same manner as above. To this, 10 ml of the above culture solution was subcultured and shake-cultured at 30 ° C. for 2 days in the dark. After centrifuging this at 10000 rpm for 10 minutes, the cells were suspended in medium 2 containing 30 mM glycine and 15 mM levulinic acid to give 0.3 g / 10 ml of wet cells, and shaken at 30 ° C. in the dark. Cultured. After 15 hours and 40 hours of culturing, 5-aminolevulinic acid in each culture solution was analyzed by the method of Okayama et al. (CLINICAL CHEMIS).
TRY, Vol. 36, No. 8, p1494, 199
0). The results are shown in Table 3.

【００３７】比較例１〜３ 実施例２において、植菌する菌株をＣＲ−３８６株（比
較例１）、表２に示すＮｏ．７８株（比較例２）、表２
に示すＮｏ．１０株（比較例３）とし、レブリン酸濃度
を３０mMとした以外は実施例３と同様に操作した。結果
を表３に示す。Comparative Examples 1 to 3 In Example 2, the strain to be inoculated was the CR-386 strain (Comparative Example 1), No. 1 shown in Table 2. 78 strains (Comparative Example 2), Table 2
No. shown in. The same procedure as in Example 3 was repeated except that 10 strains (Comparative Example 3) were used and the levulinic acid concentration was 30 mM. The results are shown in Table 3.

【００３８】[0038]

【表３】 [Table 3]

【００３９】表３から、アミノアセトン非蓄積菌株であ
る本発明に係るＣＲ−４５０株は、親株であるＣＲ−３
８６株や他のアミノアセトン蓄積株に比べて５−アミノ
レブリン酸の生産性が著しく上昇していることがわか
る。From Table 3, the CR-450 strain according to the present invention, which is a non-aminoacetone accumulating strain, is the parent strain CR-3.
It can be seen that the productivity of 5-aminolevulinic acid is remarkably increased as compared with the 86 strain and other aminoacetone accumulating strains.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 田中 徹 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 堀田 康司 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社 コスモ総合研究所研究開発センター内 (56)参考文献 特開 平５−95782（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12P 13/00 - 13/24 ＣＡ／ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＪＳＴＰｌｕｓ（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Inventor Toru Tanaka 1134-2, Gongendo, Satte City, Saitama Prefecture Cosmo Research Institute Co., Ltd. Research and Development Center (72) Inventor, Koji Horita, 1134-2, Gongendo, Satte City, Saitama Company Research & Development Center, Cosmo Research Institute (56) Reference JP-A-5-95782 (JP, A) (58) Fields investigated (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 1/00-1/38 C12P 13/00-13/24 CA / REGISTRY (STN) JSTPlus (JOIS) BIOSIS / WPI (DIALOG) PubMed

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】５−アミノレブリン酸を蓄積し、かつアミ
ノアセトンを蓄積しないロドバクター・セファロイデス
に属する微生物。1. A microorganism belonging to Rhodobacter cephaloides that accumulates 5-aminolevulinic acid and does not accumulate aminoacetone. 【請求項２】ロドバクター・セファロイデス ＣＲ−４
５０と命名され、ＦＥＲＭＰ−１４０８５として寄託さ
れたものである請求項１記載の微生物。2. Rhodobacter cephaloides CR-4
The microorganism according to claim 1, which is designated as 50 and is deposited as FERMP-14085. 【請求項３】ロドバクター・セファロイデスに属し、５
−アミノレブリン酸及びアミノアセトンを蓄積する微生
物を突然変異処理し、５−アミノレブリン酸を蓄積し、
かつアミノアセトンを蓄積しない変異株を選択すること
を特徴とする請求項１記載の微生物の製造法。3. A member of Rhodobacter cephaloides, 5
Mutating a microorganism accumulating aminolevulinic acid and aminoacetone, accumulating 5-aminolevulinic acid,
The method for producing a microorganism according to claim 1, wherein a mutant strain that does not accumulate aminoacetone is selected. 【請求項４】請求項１記載の微生物を培養し、得られた
培養物から５−アミノレブリン酸を採取することを特徴
とする５−アミノレブリン酸の製造法。4. A method for producing 5-aminolevulinic acid, which comprises culturing the microorganism according to claim 1 and collecting 5-aminolevulinic acid from the obtained culture.