JP3490560B2 - 糞便中のヒトヘモグロビンの検出方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、糞便中のヒトヘモ
グロビンを検出する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】大腸癌などの下部消化器の疾患を検査す
る方法として、糞便中における、消化器官からの出血に
起因する潜血成分、特にヒトヘモグロビンの有無を調
べ、疾患を推定する方法が知られている。中でも、食品
摂取や薬剤投与の制限を必要としない抗ヒトヘモグロビ
ン抗体を用いた免疫学的検出方法が提案されている。こ
の様な糞便中のヒトヘモグロビンを検出する方法には、
例えば、動物血球に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作した
ものと、糞便溶解液とを混合して生じる沈降現象を利用
して検出する逆受身血球凝集法、高分子ラテックス粒子
に抗ヒトヘモグロビン抗体を感作したものと、糞便溶解
液を混合して生じる凝集像を利用して検出するラテック
ス凝集法、酵素で標識した抗ヒトヘモグロビン抗体を利
用する酵素免疫法がある。

【０００３】また、糞便中からヒトヘモグロビンをより
簡便に検出する方法として、免疫クロマト法が知られて
いる。免疫クロマト法は、吸水性基材上に、抗ヒトヘモ
グロビン抗体を固定化した固定相の領域を設け、該領域
においてヒトヘモグロビン及び着色粒子標識抗ヒトヘモ
グロビン抗体の複合体を結合させる事により、ヒトヘモ
グロビンを吸水性基材上にトラップし検出する方法であ
る。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従来の免疫クロマト法
では、採取した糞便をいったん緩衝液等に溶解し、この
糞便溶解液を吸水性基材上に展開して測定を行ってい
た。具体的な検出手順としては、例えば、採便スティッ
クで少量の糞便を採取し、これを緩衝液の入ったノズル
付の検査用容器に入れて糞便溶解液とし、次にノズル先
端部を開口し、吸水性基材上に糞便溶解液を滴下して展
開させ検査するという手順が挙げられる。

【０００５】従って、多数の試料を検査する場合には、
試料の数だけの検査用容器が必要であり、該容器に一つ
一つ糞便を溶解し、各々容器を開口して滴下する操作を
繰り返す必要があるため、検査作業者にとっては操作が
煩雑であり、また試料を取り違える恐れもあった。

【０００６】また、ヒトヘモグロビンの立体構造は、糞
便溶解液中で腸内細菌や消化酵素等により、徐々に変性
することが知られている。しかし、実際上の便潜血検査
では、被験者自身が自宅等で糞便を採取し、これを緩衝
液入りの容器に入れて糞便溶解液とした状態で数日間放
置されることが多い。この様な場合、前記理由でヒトヘ
モグロビンが変性し、抗ヒトヘモグロビン抗体と結合し
にくくなるため、偽陰性化するおそれがあった。

【０００７】本発明の目的は、糞便中のヒトヘモグロビ
ンを免疫クロマト法に従って検出するに際し、検体を取
り違えるような煩雑さを改善し、簡便な操作で、かつ、
ヒトヘモグロビンの変性を抑制し得る、糞便中のヒトヘ
モグロビンの検出方法を提供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、次の特徴を有
するものである。 （１）第一の抗ヒトヘモグロビン抗体（以下、「第一の
抗体」という）が固定化された領域を有するシート状の
吸水性基材を用意し、吸水性基材とは別に試料塗布部材
を用意し、試料の糞便を該試料塗布部材に塗布した後、
これを吸水性基材上の前記領域外に接触させ転写させる
ことによって、試料の糞便を厚さ３ｍｍ以下に配置した
後、免疫クロマト法に従い、試料中のヒトヘモグロビン
に、標識化された第二の抗ヒトヘモグロビン抗体（以
下、第二の抗ヒトヘモグロビン抗体を「第二の抗体」と
いう）を結合させ、これを展開液によって前記第一の抗
体が固定化された領域まで展開させて、試料中のヒトヘ
モグロビン（以下、ヒトヘモグロビンを「ヒトＨｂ」と
いう）と第一の抗体と標識化された第二の抗体との複合
体を形成させ第一の領域に捕捉することによって、試料
中のヒトＨｂを検出することを特徴とする糞便中のヒト
Ｈｂの検出方法。

【０００９】（２）上記シート状の吸水性基材上に、ポ
リマーフィルムによる非吸水性層を積層し、この非吸水
性層に部分的に貫通孔を設けて下層の吸水性基材の上記
領域外の表面を露出させ、該貫通孔内に露出した吸水性
基材に、試料の糞便が塗布された上記試料塗布部材を接
触させ転写させることによって、試料の糞便を上記領域
外に定量的に配置するものである、上記（１）記載の糞
便中のヒトＨｂの検出方法。

【００１０】

【００１１】（３）試料中のヒトＨｂと、標識化された
第二の抗体との結合が、展開液に標識化された第二の抗
体を含有させることによってなされるものである上記
（１）または（２）記載の糞便中のヒトＨｂの検出方
法。

【００１２】（４）試料中のヒトＨｂと、標識化された
第二の抗体との結合が、配置された試料の糞便と、第一
の抗体が固定化された領域との間に、標識化された第二
の抗体が固定化された領域を設けることによってなされ
るものである上記（１）または（２）記載の糞便中のヒ
トＨｂの検出方法。

【００１３】（５）試料中のヒトＨｂと、標識化された
第二の抗体との結合が、配置された試料の糞便を挟ん
で、第一の抗体が固定化された領域とは反対側の領域
に、標識化された第二の抗体を固定化し、該標識化され
た第二の抗体に展開液を先に加え、これを配置された試
料の糞便へ展開させることによってなされるものである
上記（１）または（２）記載の糞便中のヒトＨｂの検出
方法。

【００１４】

【作用】本発明の検出方法において、試料の糞便を配置
するとは、従来法のような試料の糞便を緩衝液に溶解す
ることを行わず、***された状態の組成で、または展開
させることを意図しない添加物が付与された組成で、試
料の糞便を配置することを意味する。ただし、乾燥など
による蒸発の有無は問わない。試料の糞便を配置するに
際しては、特に、後記説明の方法によって薄い厚みとな
るように塗布することが好ましい。このような試料の配
置によって、従来のように予め試料を緩衝液に溶解せず
とも、配置された試料に展開液を加えるだけで試料を吸
水性基材に展開させることができる。従って、試料を緩
衝液に溶解する作業工程が無くなり、検査作業が簡素化
される。また、これに伴い、その作業工程に固有の問題
点が解消される。特に、試料を緩衝液に溶解する従来の
方法では、腸内細菌や消化酵素等によるヒトＨｂの変性
が問題となっていたが、吸水性基材に試料を希釈しない
状態で配置することによって、糞便は徐々に乾燥し、腸
内細菌や消化酵素等によるヒトＨｂの変性は抑制され
る。従って、試料中のヒトＨｂについての保存性がより
改善される。

【００１５】

【発明の実施の形態】以下、本発明を図を用いて詳細に
説明する。図１は、本発明による検出方法に従って、糞
便中のヒトＨｂの検出を行なっている状態を模式的に示
す図である。同図に示すように、吸水性基材４上の領域
Ａ１には、第一の抗体１が固定化されている。この吸水
性基材４上に、領域Ａ１以外の領域Ａ３に試料３（糞
便）を配置する。試料中にはヒトＨｂがあるものとす
る。また、同図の例は、標識化された第二の抗体２を展
開液５に含有させた場合の例である。この状態におい
て、領域Ａ３に配置された試料３に対して免疫クロマト
法を適用する。即ち、試料に展開液を加え、該試料中の
ヒトＨｂに、標識化された第二の抗体を結合させ、これ
を同図中の矢印６の方向で示すように、展開液によって
領域Ａ１まで展開させる。これによって、領域Ａ１にお
いて、試料中のヒトＨｂと第一の抗体と標識化された第
二の抗体との複合体が形成され、試料中のヒトＨｂは第
一の抗体によって領域Ａ１に捕捉される。捕捉されたヒ
トＨｂは、第二の抗体の標識によって検出することがで
きる。

【００１６】吸水性基材は、当該試料に対して免疫クロ
マト法が適用可能な材料であればよい。即ち、展開液を
よく吸収し、試料内のヒトＨｂ、標識化された第二の抗
体を展開できるものであれば特に限定されない。また吸
水性基材は、糞便中のヒトＨｂが、標識化された第二の
抗体や、固定化された第一の抗体と十分な反応を行うた
めの時間を確保するために、適度な吸水性を有するもの
が好ましい。該吸水性が低い場合は、展開が遅く迅速な
測定を行うことができない。逆に吸水性が高すぎる場合
は、展開が早くヒトＨｂが第二および第一の抗体と十分
な反応を行うための時間が不足するので、十分な標識の
効果が得られず、判定が困難になる。

【００１７】吸水性基材の好ましい材料としては、例え
ばレーヨン、ポリエステル等の不織布、濾紙、ガラス繊
維布、ガラスフィルター、ニトロセルロースフィルタ
ー、多孔質材料等が挙げられる。また、吸水性基材の吸
水性を調整するために、当該吸水性基材に親水性重合
体、タンパク質、乳化剤を、被覆または含浸させてもよ
い。また、吸水性基材は、単一材料からなるものでも、
複数種の材料からなるものでもよい。吸水性基材が複数
の材料からなる場合は、異なる材料が面方向に接合され
た態様や、異なる材料が積層された態様が挙げられる。
吸水性基材の形状は、展開液によって試料を展開できる
形状であれば特に限定されるものではない。例えば、矩
形のシート状やロッド状などが好ましい。

【００１８】第一の抗体としては、ヒトＨｂと特異的に
結合し得る抗体であれば特に限定されない。例えば、抗
ヒトＨｂウサギポリクロナール抗体、抗ヒトＨｂヤギポ
リクロナール抗体、抗ヒトＨｂヒツジポリクロナール抗
体、抗ヒトＨｂモノクロナール抗体などが挙げられる。

【００１９】吸水性基材上に第一の抗体を固定化する方
法は、特に限定されるものではないが、公知の吸着法や
共有結合法が好ましい方法である。共有結合法による場
合、吸水性基材が共有結合法のための官能基を有しない
ときは、例えば、適宜の官能基を有する重合体を基材に
付着させればよい。また、第一の抗体と親水性重合体と
の混合液を吸水性基材に塗布した後、前記親水性重合体
を凝固させる凝固浴剤に浸漬することによって、第一の
抗体を固定化することができる。上記親水性重合体とし
ては、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニ
ルアルコール、ヒドロキシエチルセルロース等が、凝固
浴としてはアセトン、メタノール、エタノール等が用い
られる。

【００２０】試料を配置するに際しては、上記作用の説
明で述べたように、従来法のような試料を緩衝液に溶解
することは行わず、***された状態の組成で配置する。
***された状態の組成は、***から配置までの蒸発によ
る水分等の含有量の変化を問題としない。また、場合に
よっては、試料を軟化させてより容易に配置する目的や
保存の目的など試料を展開させる以外の目的で、また、
試料を展開させない範囲内で必要な添加物を必要量だけ
試料に付与してもよい。例えば、試料を軟化させ吸水性
基材への塗布を容易にするための添加物として水などの
希釈液が挙げられるが、従来行われていた免疫クロマト
法が成立するような展開が試料に起こり得ない量の添加
とする。

【００２１】配置される試料の量は、０．０５ｍｇ〜１
０ｍｇ程度が好ましい。また、配置される試料の厚さは
３ｍｍ以下が好ましい。厚すぎる場合、後述する糞便の
乾燥に時間がかかり、この間に糞便中のヒトＨｂが変性
する恐れがある。

【００２２】試料を吸水性基材上に配置する方法として
は、試料の厚みが薄い方が好ましいという点から、塗布
が好ましい方法である。塗布の方法としては、特に限定
されないが、吸水性基材とは別に試料塗布部材を用意
し、これに試料を配置し、これを吸水性基材上の試料配
置位置に接触させて転写する方法が好ましい方法として
挙げられる。試料塗布部材としては、濾紙、不織布、ガ
ラスフィルター等が挙げられる。

【００２３】また、先端付近に凹部や溝部等を有するス
ティックで試料を採取し、該スティックの凹部や溝部に
収容された試料を、吸水性基材の試料配置位置に接触さ
せて転写する方法が挙げられる。この様なスティックを
用いた場合、一定体積の凹部、溝部に定量的に試料をと
ることができるので測定の精度が向上する。

【００２４】試料の配置方法によらず、吸水性基材上
に、吸水性基材と同様の展開性を有する試料配置用部材
を設置し、これに試料を配置してもよい。試料配置用部
材としては、例えば、濾紙、不織布、ガラスフィルター
などが好ましいものとして挙げられる。また、吸水性基
材上に、ＰＥＴなどのポリマーフィルムによる非吸水性
層を積層し、この非吸水性層に部分的に貫通孔を設けて
下層の吸水性基材の表面を露出させることによって、そ
の貫通孔を試料の定量的な配置に利用してもよい。

【００２５】試料の糞便は、吸水性基材上に配置された
直後の未乾燥のものでも、保存等によって長時間が経過
した後の乾燥したものでも、免疫クロマト法の適用が可
能である。配置された直後の試料であれば、試料中のヒ
トＨｂは、ほとんど変性していないので、正確な検出が
行える。また、吸水性基材上に配置された後、一定時間
経過した試料は、従来のような緩衝液に溶解されたもの
とは異なり、糞便中での消化酵素や腸内細菌によるヒト
Ｈｂを変性する反応が乾燥によって抑制されるので、陽
性検体が偽陰性化することを防ぐことが出来る。配置し
た試料の乾燥は、通気性のよい状態で放置しておいても
よいが、乾燥剤を入れた密閉袋、容器に入れた方がより
速く乾燥し好ましい。

【００２６】以上の特徴を有する方法によって吸水性基
材上に試料を配置し、下記の特徴を有する方法によって
該試料に対して免疫クロマト法を適用する。即ち、吸水
性基材上に配置された試料に展開液を加え、該試料中の
ヒトＨｂに標識化された第二の抗体を結合させ、これを
第一の抗体が固定化された領域まで展開させ、その領域
にヒトＨｂをトラップして検出する。

【００２７】展開液は、従来より使用されている緩衝液
など、免疫クロマト法を行うことが出来るものであれば
特に制限されない。緩衝液としては、リン酸緩衝液、グ
リシン緩衝液、ほう酸緩衝液などが公知である。また、
ヒトＨｂと抗体との反応性をよくするために、塩化ナト
リウムを生理食塩水濃度で加えてもよい。緩衝液の成
分、ｐＨは、後述の標識化された第二の抗体が自然凝集
しないものが好ましい。標識化された第二の抗体が自然
凝集した場合、着色粒子などの標識化のための物質が吸
水性基材中で目詰まりを起こし、非特異的発色が生じる
からである。ｐＨは通常、中性付近の５〜９が用いられ
る。

【００２８】試料に対して展開液を加える方法は、試料
に対して展開液を直接的に滴下・添加する方法でも、吸
水性基材の他の領域（吸水部）に滴下・添加し、試料に
到達させて加える方法でもよい。また、展開液を一定量
が液滴となって取り出せるノズル付容器などに入れてお
き、所定滴数を吸水性基材・試料へ添加する方法、逆
に、吸水性基材の吸水部を、一検体分の展開液が入れら
れたウエルへ浸漬する方法などが、操作手順を簡便にす
る方法である。

【００２９】試料中のヒトＨｂと、標識化された第二の
抗体との結合は、試料中のヒトＨｂが第一の抗体の領域
に到達する前であれば、いつ行なってもよいが、大きく
は、次の方法による結合が挙げられる。 （ａ）図１に示すように、展開液に、標識化された第二
の抗体を含有させておく方法。この展開液を、試料、第
一の抗体の順番で通過するように吸水性基材に添加する
ことによって、試料中のヒトＨｂと、標識化された第二
の抗体との結合が先になされる。 （ｂ）吸水性基材上に、標識化された第二の抗体を固定
化しておく方法。その固定化の位置は、試料が配置され
る位置の前後いずれであってもよいが、各々の場合に、
展開液が次の順番で通過するように、該展開液を吸水性
基材に添加することが重要である。即ち、図２（ａ）に
示すように、標識化された第二の抗体２、試料３、第一
の抗体１の順番。または、図２（ｂ）に示すように、試
料３、標識化された第二の抗体２、第一の抗体１の順
番。

【００３０】第二の抗体としては、ヒトＨｂと特異的に
結合する抗体であれば特に限定されない。例えば抗ヒト
Ｈｂウサギポリクロナール抗体、抗ヒトＨｂヤギポリク
ロナール抗体、抗ヒトＨｂヒツジポリクロナール抗体、
抗ヒトＨｂモノクロナール抗体などが挙げられる。

【００３１】標識としては、第二の抗体に結合し得るも
のであればよいが着色粒子が特に好ましいものとして挙
げられる。着色粒子としては金、銀、銅等のコロイド状
金属粒子、着色化高分子ラテックス粒子、顔料粒子等が
用いられるが、特に金コロイド粒子、着色化高分子ラテ
ックス粒子が好ましい。着色粒子の粒子径は、用いられ
る吸水性基材に目詰まりしない範囲とすることが好まし
く、０．０１μｍ〜３μｍ程度がよい。

【００３２】第二の抗体に着色粒子を結合する方法は、
従来より知られている物理吸着法や化学結合法が用いら
れる。特に、官能基を粒子表面に有する着色粒子を用
い、これを共有結合法によって第二の抗体に結合する方
法が好ましい。例えば、アミノ基やカルボキシル基を有
する着色粒子に、結合試薬として水溶性カルボジイミド
を用いて抗体を共有結合する方法が例示される。

【００３３】上記（ｂ）のように、吸水性基材上に標識
化された第二の抗体を固定化しておく方法では、標識化
された第二の抗体が、展開液と接触して、吸水性基材か
ら脱離し得るように吸水性基材に固定化することが重要
である。例えば、標識化された第二の抗体を吸水性基材
に塗布した後、適当な条件にて乾燥させ固定化する方法
が挙げられる。具体的には、水溶性重合体あるいはサッ
カロースの溶液に、標識化された第二の抗体を分散さ
せ、この液を吸水性基材に塗布した後、乾燥させる方法
が挙げられる。この方法で第二の抗体を固定化すること
によって、固定化された部分に展開液が接触したとき
に、水溶性重合体またはサッカロースが容易に水溶性化
し、標識化された第二の抗体が速やかに基材から脱離す
る。また、この方法では、乾燥に際して第二の抗体の凝
集や変成が生じ難く、更に、乾燥後に第二の抗体が吸水
性基材から脱離し難い。また、標識化された第二の抗体
を吸水性基材の所定の領域に好適に含有させ得るよう、
水溶性重合体あるいはサッカロースの濃度を調整し、溶
液を適当な粘度とすることが好ましい。また、標識化さ
れた第二の抗体を他の吸水性基材上に固定化し、これを
適当な形状に加工して、メインの吸水性基材に貼付して
もよい。

【００３４】上記水溶性重合体としては、例えば、ポリ
ビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレ
ングリコール、セルロースエーテル（例えば、メチルセ
ルロース、エチルセルロース、ベンジルセルロース、ト
リチルセルロース、シアンエチルセルロース、カルボキ
シルメチルセルロース、カルボキシルエチルセルロー
ス、オキシエチルセルロース）、ゼラチン等が好ましく
用いられる。

【００３５】次に、本発明による検出方法の手順につい
て述べる。試料の糞便には、ヒトＨｂが含まれていたと
する。前述した方法によって、試料の糞便を、吸水性基
材上に直接または試料配置用部材を介して配置する。試
料の配置後、直ちに検出を行わない場合は、前述した乾
燥方法で試料を乾燥させ、試料中のヒトＨｂの変性を抑
制する。

【００３６】展開液を加えることにより、配置された試
料が溶解し試料中のヒトＨｂが抽出される。このヒトＨ
ｂと標識化された第二の抗体とが上記説明の方法によっ
て結合し、複合体を形成する。展開液が吸水性基材中を
流れることによって、前記複合体も移動し、第一の抗体
が固定化された領域に到達する。この領域において前記
複合体は、固定化された第一の抗体と結合することによ
って捕捉される。その結果、試料中にヒトＨｂが一定量
以上存在するとき、第一の抗体が固定化された領域に標
識が固定されることになり、この標識を肉眼観察又は光
学的に測定することでヒトＨｂの存在又は量を知ること
が出来る。上記において、試料中の全てのヒトＨｂを第
二の抗体と結合させて複合体を形成することは難しく、
また該複合体のすべてを第一の抗体と結合させることも
難しいことから、試料中のヒトＨｂの存在が一定量未満
の場合には、前記領域に固定される標識化された第二の
抗体の数はより少なくなり、肉眼観察又は光学的に測定
することが困難となる。

【００３７】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。 実施例１ 本実施例は、標識化のための物質として着色粒子を用
い、これによって標識化された第二の抗体を展開液に含
有させておき、この展開液を試料に加えた場合の例であ
る。

【００３８】（１）標識化された第二の抗体の作製 着色粒子として青色カルボキシル化ポリスチレンラテッ
クス（平均粒子径０．２２μｍ）を用い、これを０．０
１Ｍほう酸緩衝液（ｐＨ７．５）に固形分濃度１％とな
るように分散させた。この分散液１０ｍｌに１−エチル
−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
塩酸塩水溶液（５ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを加え、１０
℃にて１０分間攪拌した後、第二の抗体として抗ヒトＨ
ｂウサギポリクロナール抗体（１０ｍｇ／ｍｌ) ２ｍｌ
を加え、１０℃にて２４時間攪拌した。これを前記と同
じ緩衝液にて遠心洗浄し固形分濃度１％となるよう再分
散させ、青色ラテックス粒子によって標識化された第二
の抗体を得た。

【００３９】（２）吸水性基材に対する第一の抗体の固
定化 第一の抗体として抗ヒトＨｂウサギポリクロナール抗体
を用い、０．１Ｍリン酸緩衝液（ＮａＣｌ；０．９％含
有、ｐＨ７．４）にて希釈し、１ｍｇ／ｍｌの溶液に調
整した。吸水性基材として、ニトロセルロース膜（組織
の孔径１μｍ、外形５ｍｍ×１００ｍｍ、厚み０．１５
ｍｍ）を用い、その一端から２０ｍｍの部位に、第一の
抗体を含む上記溶液を１μｌ塗布し、室温で一夜乾燥し
た。次にこれを１％ウシ血清アルブミン水溶液に１時間
浸漬した後、室温で一夜乾燥し、第一の抗体が固定化さ
れた領域を有する吸水性基材を得た。

【００４０】（３）吸水性基材に対する付帯部品の付与 ＰＥＴフィルム（厚さ２５μｍ、５×１００ｍｍ）の一
端から１０ｍｍの部位にφ２ｍｍの貫通孔を開け、この
孔の部位と、上記吸水性基材上の第一の抗体の位置との
間隔が５０ｍｍになるようにＰＥＴフィルムと吸水性基
材とを貼合わせて、ニトロセルロース／ＰＥＴフィルム
を形成した。次に、吸水性基材上の、第一の抗体の位置
とは逆の一端に吸水部として、レーヨン不織布（厚さ
２．４ｍｍ、５×５ｍｍ）を貼付した。

【００４１】（４）試料の作製 試料は、糞便１ｇ中のヒトＨｂの含有量が、１μｇ、５
μｇ、１５μｇ、３０μｇ、６０μｇ、１２０μｇ、１
０００μｇの７種類とした。これら７種類の含有量の試
料は、健常者の糞便に対してヒトＨｂを新たに適当量だ
け添加し混合することによって作製した。またその作製
の際には、糞便１ｇ中のヒトＨｂの含有量を、ＥＩＡキ
ット（わかもと製薬、チェックメイトヘモ等）を用いて
定量し、確認して調製した。また、試料中のヒトＨｂが
失活しないように、下記ヒトＨｂの検出実験開始までの
間、試料を冷凍保存した。

【００４２】（５）試料の配置 上記（３）で作製したニトロセルロース／ＰＥＴフィル
ムの貫通孔内に、上記（４）で作製した試料であるヒト
Ｈｂを含有する糞便（７種類）を各々塗布し、穴からは
み出した過剰便はヘラ状の治具でぬぐいとった。（約
０．０８ｍｇの便が穴に入る）

【００４３】（６）試料中のヒトＨｂの検出 上記（１）で作製した標識化された第二の抗体を０．１
Ｍリン酸緩衝液（ＮａＣｌ；０．９％、アジ化ナトリウ
ム；０．１％含有、ｐＨ７．４）にて希釈し、０．０１
％の展開液（分散液）を調整した。この展開液１００μ
ｌを、試料を塗布した直後に吸水性基材に対して吸水部
から添加し、試料を第一の抗体の領域まで到達させて、
１０分後の固定部の発色を肉眼で観察し、ヒトＨｂの検
出を行った。また、同じ試料を同様の方法で配置した吸
水性基材を別途作製し、シリカゲル（タブレット状、１
ｇ）入りのチャック袋（６×１２ｃｍ）に入れて密封
し、３７℃で３日間、および６日間保存し水分を蒸発さ
せた後、前記と同様に各々に分散液を添加してヒトＨｂ
の検出を行った。

【００４４】下記表１は、上記７種類のヒトＨｂ含有量
の試料について、試料を塗布した直後の検出結果、３７
℃で３日間および６日間保存し水分を蒸発させた後の検
出結果を示すものである。下記表１から明らかなよう
に、検出結果に経時的な差異がなく、試料中のヒトＨｂ
の経時的な変性が抑制されていることがわかる。

【００４５】

【表１】

【００４６】実施例２ 本実施例は、標識化された第二の抗体を、予め吸水性基
材に固定化しておき、展開液だけを試料に加えた場合の
例である。試料の種類および作製方法は実施例１と同様
である。

【００４７】（１）吸水性基材に対する、標識化された
第二の抗体の固定化 吸水性基材、第一の抗体の固定は実施例１と同様とし、
さらにニトロセルロース／ＰＥＴフィルムを形成した。
標識化された第二の抗体は、上記実施例１と同様、青色
ラテックス粒子によって標識化された抗ヒトＨｂウサギ
ポリクロナール抗体を用いた。この標識化された第二の
抗体（固形分１％）１μｌと１０％サッカロース水溶液
４μｌの混合液を、レーヨン不織布（厚さ０．４ｍｍ、
５×３ｍｍ）に塗布し、室温でデシケーター内で一夜乾
燥した。この不織布を吸水性基材の吸水部端から２０ｍ
ｍの部位に貼布し、標識化された第二の抗体を吸水性基
材に固定した。

【００４８】（２）試料中のヒトＨｂの検出 このニトロセルロース／ＰＥＴフィルムのＰＥＴ貫通孔
内に、ヒトＨｂを含有する試料を実施例１と同様にして
塗布し充填した。展開液として０．１Ｍリン酸緩衝液
（ＮａＣｌ；０．９％、アジ化ナトリウム；０．１％含
有、ｐＨ７．４）１００μｌを、試料を塗布した直後に
吸水性基材に対して吸水部から添加し、試料を第一の抗
体の領域まで到達させて、１０分後の固定部の発色を肉
眼で観察した。また、同じ試料を同様の方法で配置した
吸水性基材を別途作製し、実施例１と同様の条件で、３
７℃で３日間、および６日間保存し水分を蒸発させた
後、前記と同様に分散液を添加して検出を行った。

【００４９】下記表２は、本実施例における検出結果を
示すものであり、上記表１と同様、検出結果に経時的な
差異がなく、試料中のヒトＨｂの経時的な変性が抑制さ
れていることがわかる。

【００５０】

【表２】

【００５１】実施例３ 本実施例は、試料の糞便を配置するに際し、別途用意し
た試料配置用部材に試料を塗布し、これを吸水性基材に
添付した場合の例である。試料の種類および作製方法は
実施例１と同様である。

【００５２】（１）試料の配置 試料配置用部材として外形φ２ｍｍの濾紙（Ｎｏ．１）
を用いた。 この試料配置用部材を、１％ウシ血清アル
ブミン水溶液に１時間浸漬した後、乾燥させ、試料を厚
さ約２５μｍで塗布した。

【００５３】（２）試料中のヒトＨｂの検出 上記試料配置用部材を、第二の抗体および第一の抗体が
実施例２と同様の態様にて固定化されたニトロセルロー
ス／ＰＥＴフィルム（ただしＰＥＴには貫通孔がないも
の）の吸水部端から１０ｍｍの部位に貼付し、実施例２
と同様にしてヒトＨｂの検出を行った。また、同じ試料
を塗布した同様の濾紙を同様の方法で添付した吸水性基
材を別途作製し、実施例１、２と同様の条件で、３７℃
で３日間、および６日間保存し水分を蒸発させた後、前
記と同様に分散液を添加して検出を行った。これら本実
施例の検出結果は、上記実施例１、２と全く同様であ
り、検出結果に経時的な差異がなく、試料中のヒトＨｂ
の経時的な変性が抑制されていることがわかった。

【００５４】比較例 本比較例は、試料の糞便を配置するに際し、従来の方法
に従い、試料を緩衝液に溶解して保存し、これを吸水性
基材に添付し展開させた場合の例である。試料の種類お
よび作製方法は実施例１と同様である。

【００５５】実施例３と比較例とで、検出１回当たりの
糞便の量を同じにするため、実施例３で作製した、試料
を塗布したφ２ｍｍの濾紙１０枚を０．１Ｍリン酸緩衝
液（ＮａＣｌ；０．９％、アジ化ナトリウム；０．１％
含有、ｐＨ７．４）１ｍｌに浸漬し、よく振とうして試
料を完全に溶解した。この溶解液１００μｌを実施例３
と同様のニトロセルロース／ＰＥＴフィルム（第二の抗
体、第一の抗体が固定されたもの）に添加し、ヒトＨｂ
の検出を行った。また、同じ溶解液を、３７℃で３日
間、および６日間保存した後、前記と同様の検出を行っ
た。

【００５６】下記表３は、本比較例における検出結果を
示すものである。同表から明らかなように、試料の保存
３日目以降で検出感度付近の検体が陰性化しており、糞
便溶解液を用いる従来の免疫クロマト法では、試料中の
ヒトＨｂが経時的に変性し易いことが確認できた。

【００５７】

【表３】

【００５８】

【発明の効果】本発明により、免疫クロマト法を適用し
て糞便中のヒトＨｂを検出する操作手順が簡便となる。
特に試料が多数の場合に、その操作手順の簡便化はより
顕著な検査時間の短縮効果として現れる。即ち、試料が
配置された吸水性基材が多数あっても、それらに対し
て、共通の展開液を付与するだけでよいからである。ま
た、検出機器へセットするまでの段取りが短縮されるこ
とによって、自動検出装置のラインに乗せるメリットが
出てくる。また、個々の試料が溶解された容器が多数集
合する状態が１段階無くなったことによって、検体を取
り違える事故の発生確率が格段に減少した。また、検体
が数日間放置された場合でも偽陰性化することが抑制さ
れ、信頼性のある、結果を得ることが出来るようになっ
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による検出方法に従って、糞便中のヒト
Ｈｂの検出を行なっている状態を模式的に示す図であ
る。

【図２】吸水性基材上に第二の抗体を固定する場合の態
様を模式的に示す図である。

【符号の説明】

１ 第一の抗体 ２ 第二の抗体 ３ 試料 ４ 吸水性基材 ５ 展開液

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 G01N 33/53 G01N 33/543 G01N 33/72

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 第一の抗ヒトヘモグロビン抗体が固定化
   された領域を有するシート状の吸水性基材を用意し、 吸水性基材とは別に試料塗布部材を用意し、試料の糞便
   を該試料塗布部材に塗布した後、これを吸水性基材上の
   前記領域外に接触させ転写させることによって、試料の
   糞便を厚さ３ｍｍ以下に配置した後、 免疫クロマト法に従い、試料中のヒトヘモグロビンに、
   標識化された第二の抗ヒトヘモグロビン抗体を結合さ
   せ、これを展開液によって前記第一の抗ヒトヘモグロビ
   ン抗体が固定化された領域まで展開させて、試料中のヒ
   トヘモグロビンと第一の抗ヒトヘモグロビン抗体と標識
   化された第二の抗ヒトヘモグロビン抗体との複合体を形
   成させ第一の領域に捕捉することによって、試料中のヒ
   トヘモグロビンを検出することを特徴とする糞便中のヒ
   トヘモグロビンの検出方法。
2. 【請求項２】 上記シート状の吸水性基材上に、ポリマ
   ーフィルムによる非吸水性層を積層し、この非吸水性層
   に部分的に貫通孔を設けて下層の吸水性基材の上記領域
   外の表面を露出させ、該貫通孔内に露出した吸水性基材
   に、試料の糞便が塗布された上記試料塗布部材を接触さ
   せ転写させることによって、試料の糞便を上記領域外に
   定量的に配置するものである、請求項１記載の糞便中の
   ヒトヘモグロビンの検出方法。
3. 【請求項３】 試料中のヒトヘモグロビンと、標識化さ
   れた第二の抗ヒトヘモグロビン抗体との結合が、展開液
   に標識化された第二の抗ヒトヘモグロビン抗体を含有さ
   せることによってなされるものである請求項１または２
   記載の糞便中のヒトヘモグロビンの検出方法。
4. 【請求項４】 試料中のヒトヘモグロビンと、標識化さ
   れた第二の抗ヒトヘモグロビン抗体との結合が、配置さ
   れた試料の糞便と、第一の抗ヒトヘモグロビン抗体が固
   定化された領域との間に、標識化された第二の抗ヒトヘ
   モグロビン抗体が固定化された領域を設けることによっ
   てなされるものである請求項１または２記載の糞便中の
   ヒトヘモグロビンの検出方法。
5. 【請求項５】 試料中のヒトヘモグロビンと、標識化さ
   れた第二の抗ヒトヘモグロビン抗体との結合が、配置さ
   れた試料の糞便を挟んで、第一の抗ヒトヘモグロビン抗
   体が固定化された領域とは反対側の領域に、標識化され
   た第二の抗ヒトヘモグロビン抗体を固定化し、該標識化
   された第二の抗ヒトヘモグロビン抗体に展開液を先に加
   え、これを配置された試料の糞便へ展開させることによ
   ってなされるものである請求項１または２記載の糞便中
   のヒトヘモグロビンの検出方法。