JP3475183B2 - C型肝炎ウイルスのns3領域からの組換え抗原 - Google Patents
C型肝炎ウイルスのns3領域からの組換え抗原Info
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Description
CV)の非構造タンパク質3(NS3)領域からのポリ
ペプチド、かかるペプチドをコードする核酸並びに免疫
学的試験方法における抗原として又はヘリカーゼタンパ
ク質としてのこのポリペプチドの使用に関する。
場合C型肝炎ウイルス(HCV)により引き起こされ
る。HCVはそのゲノムが約9から10,000個の塩基から
成る一本鎖被包性の(encapsulated)RNAウイルスであ
る。このゲノムは、構造タンパク質(コア及びエンベロ
ープタンパク質)並びに非構造タンパク質をコードす
る。HCVの非構造タンパク質3(NS3)領域は、プ
ロテアーゼ及びヘリカーゼを含む。プロテアーゼ活性
は、NS3領域の第三アミノ末端(amino terminal thir
d)に存在する。
パ特許出願第318 216号明細書に開示されている。この
出願はのためのHCVからの核酸フラグメント又はポリ
ペプチドフラグメントの診断試験及び治療処置への使用
を特許請求している。
は、HCVの完全なヌクレオチド及びアミノ酸配列を開
示している。さらに、Cドメインからの第1のHCV抗
原及び非構造ドメインNS3,NS4又はNS5及びエ
ンベロープドメインSの1つからの少なくとも1個の他
のHCV抗原を含む合成HCV抗原の組み合わせが記載
されている。ドメインNS3からの好適な抗原は、ヨー
ロッパ特許出願第450 931号明細書の第1図に示される
HCVゲノムのアミノ酸1192から1457を含むC33とい
われる抗原である。
ノムからの種々のポリペプチドのクローニング及び配列
決定並びに試験キットにおける外来タンパク質部分のな
いこれらのポリペプチドの使用及びワクチンとしてのこ
れらのポリペプチドの使用に関する。寄託番号6847で
“ドイッチェ ザムルング フューア ミクロオルガニ
ズメン ウント ツェルクルツーレン GmbH,マッ
シェルオーデル ベーク1b,38124 ブラウンシュバイ
ク,BRD(DSM) ”に、この出願に関連して寄託さ
れたクローンNS−3は、HCVのNS3領域からの 5
27個のアミノ酸のポリペプチドに関する遺伝子情報を含
んでいる。
2), 264-268)、抗原としてウイルスタンパク質を使用し
て血中におけるウイルス抗体を検出することによるHC
V感染の診断学的検出を記載している。これらのHCV
タンパク質は、β−ガラクトシダーゼとの融合タンパク
質として大腸菌内で発現される。HCVゲノムの第1295
番目から1541番目のアミノ酸を含むNS3領域からのタ
ンパク質は、高い感受性を示した。しかしながら、この
融合タンパク質の欠点は、融合タンパク質部分との交差
反応が生じ、これが試験反応の特異性を減少させること
である。
高度の特異性及び感受性を必要とする。さらに、試験で
使用される抗原は高収率で発現可能であり、かつ安定で
なければならない。HCVゲノムからの既知の抗原は、
上述の要件の1つ又は幾つかを満足しないという欠点を
有する。
的は、上記の公知技術の欠点が少なくとも部分的に除か
れ、特に既知の抗原に比較して、一層高い特異性及び感
受性を有し、高収率で発現可能でありかつ安定である、
HCVゲノムからのポリペプチドを提供することであ
る。
イルスのアミノ酸1207±10から1488±10から成り、20未
満の、好ましくは15未満の外来アミノ酸を有するポリペ
プチドにより達成される。本発明のポリペプチドは、ヨ
ーロッパ特許出願(EP-A)第450 931号明細書の第1図で
言及されている番号付与において、好適には1207±5か
ら1488±5、特に好適には1207±2から、1488±2、そ
して最も好適には1207から1488のC型肝炎ウイルスのア
ミノ酸を含有する。
離物、例えばヨーロッパ特許出願第450 931号明細書に
記載されているようなヌクレオチド配列を有するHCV
単離物に由来することができる。しかしながら、好適に
はポリペプチドは、寄託番号DSM 6847で“ドイッチェ
ザムルング フォン ミクロオルガニズメン ウントツ
ェルクルツーレン GmbH”(DSM), マッシェルオ
ーデル ベーク 1b, 38124ブラウンシュバイクに寄託
され国際出願WO92/11370にクローンNS3と記載されて
いるHCV単離物に由来する。本発明のポリペプチド
は、特に好ましくは、ベクターpUC−D26の組換え
発現により得ることができる。
ノ酸配列を示す。アミノ酸1〜13は外来アミノ酸であ
る。アミノ酸14〜295はHCV起源である。本発明のポ
リペプチドは、特に好ましくは配列番号1及び2に示さ
れているアミノ酸配列のアミノ酸14〜295又は少なくと
も90%がこれに相同であるアミノ酸配列を含む。
ー基を含む先に定義したポリペプチドに関する。試験シ
ステムで検出できるすべての既知のマーカー基、例えば
直接又は間接的に検出しうるマーカー基が、マーカー基
として考慮される。これに関連して、直接に検出しうる
マーカー基とは、直接に検出しうる信号、即ち放射性
基、酵素基、発光基、金属複合体等を生成する基として
理解される。一方、マーカー基は、順番に信号発生基を
有する適当な結合パートナー(ストレプトアビジン、ア
ビジン又は抗−ハプテン抗体)と反応して検出しうる、
間接的に検出できる基、例えばビオチン又はハプテン基
であってもよい。マーカー基は、既知の態様で例えば二
官能性スペーサーにより抗原に結合できる。マーカー基
をペプチド抗原に結合させるためのかかる方法は、免疫
学の領域における当業者に知られており、ここで詳細に
記載する必要はない。
12、特に好ましくは3から7個のマーカー基を有する。
する1又は数個のスルフヒドリル基が共有結合的に修飾
された形態で存在する上述のポリペプチドに関する。適
当な共有結合的に修飾する基の例は、マレイミドジオキ
サオクチルアミン(MADOO)、N−メチル−マレイ
ンイミド(NMM)、ヨード酢酸及びヨードアセトアミ
ドである。共有結合のシステイン修飾は、特に高度に特
異的な免疫反応性を生ずる。
基は、特に好適にはポリペプチドのスルフヒドリル基に
共有結合している。スルフヒドリル基にカップリングす
るためのSH−反応性二官能性リンカーの例は、マレイ
ミドプロピルアミン(MP)、マレイミドエチルアミン
(MEA)及びマレイミドジオキサオクチルアミン(M
ADOO)である。
の天然の又は人工のアミノ酸で置換された本発明のポリ
ペプチドを使用することが好ましいかもしれない。シス
テイン残基は好適には構造的に類縁のα−アミノ酸、例
えばセリン又はα−アミノ酪酸により置換される。シス
テイン置換は特に高い安定性をもたらす。
チドに対して驚くべき利点を有する。ヨーロッパ特許出
願第450 931号明細書に記載されているHCV配列のア
ミノ酸残基1192から1457を含む抗原C33に比較して、
本発明のポリペプチドは実質的に一層高い特異性を示
し、ネガティブ血清において誤ったポジティブは、統計
的に有意な一層低い値のを示す。国際出願第WO92/11370
号に記載されているHCV配列のアミノ酸第1007から15
34番の領域を含む抗原NS3に比べると、本発明のポリ
ペプチドは試験状態においてかなり高い安定性を有す
る。HCVのNS3領域からのアミノ酸1227から1528を
有するポリペプチドに比較して、本発明のポリペプチド
は改善された発現効率及び一層高い感受性という利点を
有している。これらの利点の故に、本発明のポリペプチ
ドはNS3領域からの全ての既知のHCV抗原よりも実
質的にすぐれている。
をコードする核酸に関する。かかる核酸の好適な例は、
ベクターpUC−D26に外来性DNAを挿入したもの
である。
ポリペプチドをコードする本発明の核酸のヌクレオチド
配列を示す。ヌクレオチド40〜885は、HCVに由来す
るポリペプチドの領域をコードする。本発明の核酸は好
適には(a)配列番号1で示されるヌクレオチド配列の
ヌクレオチド40−885又は(b)遺伝子コードの縮重の
範囲内の(a)の配列に相当するヌクレオチド配列を含
む。
も1個のコピーを含むベクターに関する。本発明のベク
ターは、好適には原核ベクター、即ち、原核宿主細胞内
での増殖に適当なベクターである。かかるベクターの例
は、サムブルックらの“モリキュラー クローニング.
ラボラトリー マニュアル,第2版., コールド スプ
リング ハーバー ラボラトリー プレス(1989) ”、
殊にその第1〜4章及び17章に示されている。本発明の
ベクターは特に好適には環状プラスミドである。本発明
の核酸は、好適には本発明のポリペプチドの発現を可能
とするプロモーター配列の制御下にあるベクター上に存
在する。本発明のベクターの好適な例は、pUC−D2
6である。
の核酸のコピー又は本発明のベクターで形質転換された
細胞に関する。この細胞は好適には原核細胞、特に好適
にはグラム−陰性の原核細胞、そして最も好適には大腸
菌細胞である。
学的試験方法における抗原として使用される。一方、ポ
リペプチドはまた、しかしながら、ヘリカーゼタンパク
質として、さらに、そのすぐれた抗原作用のゆえにHC
V感染に対するワクチン製造のために使用できる。
ルスに対する抗体を免疫学的に決定する方法に関し、こ
の方法は、試料液を少なくとも一種の本発明のポリペプ
チドとインキュベートし、上記抗体をポリペプチドへの
結合を介して検出することによって特徴づけられる。こ
の検出方法は、いずれかの既知の試験方式を使用して、
例えば単一の反応相を有する均一のイムノアッセイ又は
1以上の反応相を有する不均一イムノアッセイで実施さ
れ得る。不均一試験方式は、好適には抗体の存在が反応
性固相の存在時に検出される場合に使用される。
重抗原架橋試験概念である。この方法において、試料液
は本発明の少なくとも2個のポリペプチド P1 及び
P2とともにインキュベートされ、その際、ポリペプチ
ドP1 は(a)固相に結合するか又は(b)固相に結
合しうる形態で存在し、ポリペプチドP2 はマーカー
基を保持する。試料液中の抗体は、固定された複合体、
即ち、固相に結合している複合体により、固相又は/及
び液相において、好適には固相において標識を測定する
ことにより検出される。
製標識抗原P2 及び精製固相抗原P1 と混合して標識
抗原、抗体及び固相−結合抗原より成る標識された不動
化複合体を得る。抗体を検出するための他の試験方式に
比較して、架橋試験方式は、IgMのような付加的な免
疫グロブリンのクラスが検出されること、及び特異性の
改善、即ち、抗−IgG結合体との非特異的反応性が減
少して、その感受性が改善される。
又は間接的に検出可能なマーカー基を有する。固相抗原
P1 は、例えば二官能性のスペーサーを介して固体相
に直接結合しうる。しかしながら、P1 は好適には、
本発明のポリペプチドの及び特異的結合システムの反応
パートナーの固相中に存在する結合体である。特異的結
合システムの他の反応パートナーは、固相に結合して存
在する。かかる特異的結合システムの例は、ビオチン/
アビジン、ビオチン/ストレプトアビジン、ビオチン/
アンチビオチン、ハプテン/アンチハプテン、多糖体/
レクチン及び抗体又は抗体フラグメント及びこの抗体又
は抗体フラグメントに対する抗体である。抗体P1 は
好適にはビオチン結合体の形態にある。
のポリペプチド抗原は、ブランクにおける増大及び抗原
の集合による望ましくない信号/ノイズ比を回避するた
めに可溶形態で使用される。この目的のために、抗原は
適当な発現システム内で可溶な形態ですでに発現されて
いるか、又は可溶な形態での発現の後で、既知の方法で
インビトロにて再生される。さらに、共有結合で架橋結
合された分子の凝集物の形成を回避するために、免疫試
験は穏和な還元状態〔穏和な還元試薬、好適にはスルフ
ヒドリル試薬、好ましくはDTT(ジチオスレイトー
ル)又はDTE(ジチオ−エリスリトール)を1ミリモ
ル/lから25ミリモル/lの濃度範囲で添加する〕で実
施することができ又は/及び好適には共有結合で修飾さ
れたスルフヒドリル基を有する抗原又は/及び少なくと
も部分的に置換されたシステイン残基を有する抗原が使
用される。
おける増大及び抗原の凝集による好ましくない信号/ノ
イズ比を回避するために、二重抗原架橋試験のように可
溶な形態で使用される。架橋試験方式の詳細は、ヨーロ
ッパ特許出願第280 211号明細書に記載されている。本
明細書では、この開示を参考とする。 本発明のポリペ
プチドは、しかしながら、他の試験方式でも使用しう
る。この例は、固定された特異抗原に結合させて特異的
イノムグロブリンを認識すること及び第2の抗体との結
合体を介して間接的に検出することによる間接イムノア
ッセイである。本発明の方法のこの態様において、試料
液は(a)固体相に結合している又は(b)固相に結合
することのできる形態で存在しているポリペプチドP1
とともにマーカー基を有するP1 に対しての他の抗体
とともにインキュベートされる。測定される抗体は固相
中で又は/及び液相中で、好適には固相中で標識を測定
することにより、間接的に検出される。この方法におい
ては、標識された抗体と固相に結合された抗原の固定さ
れた複合体により固相上で生成される信号は、試料液中
で測定されるべき抗体の濃度に間接的に比例する。
明のポリペプチドを含むC型肝炎ウイルスに対して向け
られた抗体を免疫的に測定するための試薬に関する。試
薬が二重抗原架橋試験で使用される場合は、試薬は好適
には少なくとも2個のポリペプチドP1 及びP2 を含
んでおり、ここでポリペプチドP1 は(a)固体相に
結合しているか又は(b)固相に結合可能な形態で存在
するものであり、ポリペプチドP2 はマーカー基を有
する。ポリペプチドP1 の固相への結合は、直接結合
により又は特異的な結合対手段、好ましくはストレプト
アビジン/アビジン及びビオチンのいずれかにより達成
できる。ポリペプチドP1 は、特に好ましくはビオチ
ン結合形態で存在する。
合には、本発明の試薬は好ましくは(a)固相に結合し
た又は(b)固相に結合しうる形態で存在するポリペプ
チドP1 とマーカー基を有するP1 に対しての抗体を
含む。本発明のポリペプチドに対する抗体の製造は、既
知の方法、即ち、実験動物を相応の抗体で免疫させ、こ
の実験動物からポリクローナル抗血清を分離することに
より実施される。代わりに、抗原に対するモノクローナ
ル抗体は、ケラー及びミルスタインの方法又はこの方法
の改良法により製造することができる。抗体フラグメン
ト又は抗体誘導体は、また、完全抗体に代えて使用でき
る。
は、ワクチンの製造である。このために、本発明のポリ
ペプチドは好適には精製された形態で製造され、次いで
ポリペプチド溶液又は懸濁液のいずれかであってもよい
注射可能な液体の形態とされる。ポリペプチドはまた、
リポゾーム内にとり込ませることもできる。これらのワ
クチンの他の構成成分は、例えば水、塩溶液、グルコー
ス又はグリセロールである。加えて、このワクチンは乳
化剤、緩衝物質のような少量の補助物質、及び所望によ
り免疫応答を増大するアジュバントを含む。ワクチンは
通常、注射、好ましくは皮下投与又は筋肉内投与によ
り、非経口的に投与される。
肝炎ウイルスに向けられた抗体の免疫学的測定のための
方法であり、ここで試料液はC型肝炎ウイルスからの配
列領域、特にC型肝炎ウイルスのNS3領域からの配列
領域を有する少なくとも1個のポリペプチドとともにイ
ンキュベートされ、そして抗体はポリペプチドへの結合
により検出される。その際に、少なくとも1個のシステ
イン残基を有する領域からのポリペプチドを使用し、
(a)抗体は還元状態下で測定され、(b) 1又は数個
のシステイン残基は共有結合的に修飾され又は/及び
(c)1又は数個のシステイン残基が他のアミノ酸で置
換されていることを特徴とするものである。
NS3領域は特別に多くのシステイン残基の蓄積を有す
る。ウイルス複製の過程の間に合成されたNS3タンパ
ク質は安定であるが、生理学的緩衝状態、例えば免疫学
的試験処理におけるNS3抗原の使用は極めて問題であ
ることが判明した、というのは、システイン残基の遊離
のスルフヒドリル基はこれらの条件下で容易に酸化する
からである。これは抗原の分子内並びに分子間の架橋を
もたらし、その免疫反応性を有意に減少させる。
基をもつ又は/及び置換したシステイン残基をもつ1又
は複数のNS3抗原が使用されるか、又は例えばスルフ
ヒドリル試薬を添加することにより緩和な還元状態が存
在する試験方式手段により、これらのNS3抗原の免疫
反応を有意に改善することが可能であった。こうして、
セロコンバージョンの早期認識が達成され、かつ、測定
シグナルの有意な増幅が達成される。
プロトコールにより記載される。
のヌクレオチド配列を示す。
酸配列を示す。
チド配列を示す。
チド配列を示す。
チド配列を示す。
チド配列を示す。
チド配列を示す。
チド配列を示す。
1488を有するポリペプチドのクローニング及び発現 配列番号3及び配列番号4で示されるヌクレオチド配列
をもつプライマー(1)及び(2)を使用し、クローン
NS3(DSM 6847) により開始するPCR手段により、
DNAフラグメントを増幅させた。クローニングのため
の配列(BamHI,BspHI, EcoRI制限開裂部位)並びに発現
増大のためのATGコドン及びAAA(Lys) コドン
は、このDNAフラグメントの5'末端に存在している。
HindIII及びEcoRI の制限部位並びに停止コドン(TT
A)は3'末端に存在している。プライマー(1)及び
(2)において、HCVに相同の領域は第19番目のヌク
レオチドで始まる。
BamHI 及びHindIII で切断されたpUC8ベクターにお
いて使用された。生成したプラスミドは、pUC−D2
6と命名された。
たE.Coli株JM109(ヤーニッシ−ペーロンら., Gen
e 33 (1985), 103) を 100mlの媒地(L培養液/アンピ
シリン)中で1晩インキュベートした。翌朝、この培養
物は3lのフラスコ内で900ml のL培養液(10g トリプ
トン、10g 酵母抽出物、5g NaCl/l)/アンピシリン
で2回希釈した。2mlのグリセロール及び1〜2滴のシ
リコンの消泡用エマルジョン(Serva 社)を添加した後
で、培養物を約185rpm及び37℃で2時間振盪させた。誘
導及び抗原製造は、2ミリモル/lの誘導物質であるイ
ソプロピルチオ−β−D−ガラクトシド(IPTG)を
添加し、3から4時間さらに振盪することにより達成さ
れる。次いで、バクテリアを遠心分離によりペレット状
にし、さらに処理する。
レットを 200mlの50ミリモル/lTris-HCl、pH 8.5、0.
2mg/mlリソチーム及び2ミリモル/lのジチオエリス
リトール(DTE)中に再懸濁させた。続いて、EDT
A(最終濃度:15ミリモル/l)、フェニルメチルスル
ホニル フルオリド(最終濃度:1ミリモル/L )と4
mgのDNアーゼを添加した。懸濁物は磁気攪拌器で数分
間混合し、水浴中37℃で45分間インキュベートした。
%)を添加し、磁気攪拌器で30分間攪拌した。−20℃に
おいて一晩凍結し、そして解凍した後で、37℃で細胞を
少なくとも1時間攪拌し、必要ならば音波処理した(so
nified) 。37℃でのインキュベーション及び/又は超音
波処理は、溶解した細胞の懸濁液の粘度が有意に減少す
る迄、続けられた。
離した。得られたペレットは30mlの50ミリモル/l Tris
-HCl、pH 8.5、2ミリモル/l DTE、150ミリモル/l
EDTA及び1.5% OGP(オクスチル−β−D−グ
ルコピラノシド、Biomol社)中で再懸濁した。この懸濁
物を室温で磁気攪拌器にて少なくとも3時間激しく攪拌
し、続いて35,000g及び4℃で20分間遠心した。
20ミリモル/l Tris-HCl、pH 8.5、2ミリモル/l DT
E中に溶解し、攪拌した。ここで溶解した抗原は、次に
処理する迄−20℃で凍結できる。
載するクロマトグラフィー工程で精製された。抗原は各
クロマトグラフィー工程の間は−20℃で保存された。
モル/l Tris-HCl pH 8.5、8モル/l 尿素、2ミリモ
ル/l DTE緩衝液を有するQ−セファロース ファー
ストフロー カラム(ファルマシア)で実施された。こ
れは、NaCl勾配(0から0.7モル/L )で溶出させた。
空(void)容積及び分画物は、SDS PAGE手段に
より試験した。本発明のポリペプチドは最初のメインピ
ークに存在する。ポジティブの分画物はプールされ、10
倍容量の4モル/l 尿素、2ミリモル/l DTE、20ミ
リモル/l Tris-HCl pH 7.3 に対して1晩透析した。
じカラムが使用された。カラム緩衝液は、最初のクロマ
トグラフ工程の後で使用された透析用緩衝液であった。
これをNaCl勾配(0から0.5モル/l )、次いで1モル
/l NaCl、NaOH pH 13、4モル/l 尿素を使用して溶出
した。
一の緩衝液に対して1晩透析した。
フロー カラム(ファルマシア)でクロマトグラフを行
った。緩衝液及び溶出条件は先のクロマトグラフ工程の
ものと同一であった。
おいて約41KDa の大きさを有している。収率は、培養媒
地リットル当たり約10mgの抗原であった。実施例2 HCV NS3領域からの他の抗原と比較した本発明の
抗原の発現以下の抗原を発現させた: a)本発明の抗原D26(アミノ酸1207から1488) b)抗原C33(ヨーロッパ特許出願第450 391号のア
ミノ酸1192から1457) c)抗原D27(アミノ酸1227から1528) d)抗原NS3(アミノ酸1007から1534) 寄託されたクローンNS−3(DSM 6847) を使用して、
抗原NS3を発現させた。抗原C33及びD27のクロ
ーニング及び発現は、実施例1に記載された方法に従っ
て実施された。C33に対するアミノ酸1192から1457及
びD27に対するアミノ酸1227から1528のコード領域
は、クローンNS−3からのプラスミドpUC−N3で
開始するPCRを使用する標準方法により増幅させた。
5及び配列番号6に示されているヌクレオチド配列を有
するC33のために使用された。配列番号7及び配列番
号8に示されているヌクレオチド配列を有するD27に
対してプライマー(5)及び(6)が使用された。HC
Vに相同の領域は、プライマー(3)及び(5)におい
てはヌクレオチド番号19で始まり、プライマー(4)及
び(6)においてはヌクレオチド番号13で始まる。
いでアガロースゲル電気泳動で精製した後で、増幅した
DNAフラグメントをBamHI 及びHindIII で開裂したベ
クターpUC8に挿入した。pUCベクターで発現され
た抗原は両方とも、N末端に13個の非HCV−コード化
外来アミノ酸の領域を有している(Met-Thr-Met-Ile-Th
r-Asn-Ser-Arg-Gly-Ser-Ile-Met-Lys)。
09を形質転換させた。C33抗原をコードするDNA
フラグメントを受け入れたクローンは、約34kDa (SDS-P
AGE)の分子量をもつ抗原を発現する。抗原D27をコー
ドするDNAフラグメントを有するクローンにおいて
は、48kDa の帯が見い出された。
パーセントは約10%であり、本発明のポリペプチドD2
6とほぼ同じ程度である。5%又はそれ以下の範囲のか
なり少量の発現がD27について見られる。
ーンの溶解物がSDSゲルにおいて同時に分離され、ニ
トロセルロース上に移された。種々のHCV−ポジティ
ブ血清と1:100 の希釈度で1晩インキュベートした
後、結合抗体は抗ヒトIgG抗体−パーオキシダーゼ接
合体及び3,3'−ジアミノベンジジンテトラクロリド
(DAB)/過酸化水素との呈色反応により検出され
た。
てのHCV抗原セグメントにおいて、良好な反応性が見
い出された。ポジティブ度が弱いNS3−HCV血清の
場合には、C33抗原は本発明の抗原に比較してある場
合には同程度であり、他の場合には僅かに弱い反応性を
示す。しかしながら、D27の場合には、弱いNS3−
ポジティブ血清とかなり弱まった呈色反応が見い出され
た。実施例3 HCVのNS3領域からの種々の抗原の特異性及び感受
性の検討NS−3領域から得られる種々の抗原の反応性
を、間接試験コンセプトを使用して、全部で 960個のネ
ガティブ血清において比較して評価した。この評価にお
いて、本発明の抗原D26は、それ自体有意に減少した
数の誤ったポジティブ結果を示す参照抗原C33に比較
して、有意にすぐれた特異性を有していることが見い出
された。
接試験コンセプトを使用して、種々のNS3構築物の反
応性が比較評価された。抗原D27の減少した感受性
は、構築物NS3(アミノ酸1007から1534)、C33、
D26及びD27に匹敵する感受性であることが見い出
された。
の安定性を比較評価した。抗原NS3は、本発明の抗原
D26に比較して有意に劣った安定性しか有しないこと
が見い出された。抗原の安定性は、37℃で72時間インキ
ュベートした後で調査した。
ーゼ抗原の反応性の検討 セロコンバーション時間は、20ミリモル/l のDTTの
存在時又は非存在時に生理的条件におかれたHCV−N
S3ヘリカーゼ抗原で異なる時間ごとに回収された血清
試料の反応性に基づいて試験した。
リンのクラス−非依存性認識のための二重抗原架橋試験
であり、この場合電気化学的マーカー基(ルテニウム金
属複合体)を有する抗原及び固体相に結合可能な抗原
(ビオチン化抗原)が使用された。
リモル/l のDTTの存在下では、38日以前にセロコン
バージョンを認識することが可能であったことが判明し
た。加えて、改善された信号強度がDTTの存在下で見
られた。
らの組換え抗原 (iii) 配列の数:8 (iv) コンピュータ リーダーブル フォーム (A)データキャリア:フロッピー(登録商標)ディス
ク (B)コンピュータ:IBM PC コンパチブル (C)操作 システム:PC−DOS/MS−DOS (D)ソフトウェア:パテントイン リリース #1.0、
バージョン #1.25(EPA) (2)配列番号1についての情報: (i) 配列の特徴: (A)長さ:885 塩基対 (B)型 :核酸 (C)鎖フォーム:両方 (D)トポロジー:線状 (ii) 分子の型:cDNA (vi) 最初の起源: (A)微生物:C型肝炎ウイルス (viii) ゲノム内の位置 (A)染色体/セグメント:NS3 (ix) 特徴: (A)名称/キー:CDS (B)ロケーション:1..885 (xi) 配列の記述:配列ID NO.1:
Claims (14)
- 【請求項1】(a)配列番号1のアミノ酸14−295
(C型肝炎ウイルスのNS3領域からのアミノ酸120
7から1488)からなるアミノ酸配列および (b)C型肝炎ウイルスに存在しない20未満のアミノ
酸のアミノ酸配列からなるポリぺプチド。 - 【請求項2】 C型肝炎ウイルスの少なくともアミノ酸
1217から1478から成り、C型肝炎ウイルスのア
ミノ酸1197から1498を越えるものを含まず、そ
して任意の20を越えない外来アミノ酸を含む請求項1
に記載のポリぺプチド。 - 【請求項3】 C型肝炎ウイルスのアミノ酸1207から148
8を含む請求項1に記載のポリペプチド。 - 【請求項4】 共有結合的に修飾された形態の1又は数
個のスルフヒドリル基を含む請求項1から3のいずれか
に記載のポリペプチド。 - 【請求項5】 1又は数個のシステイン残基が他のアミ
ノ酸により置換された請求項1から3のいずれかに記載
のポリペプチド。 - 【請求項6】 請求項1から5のいずれかに記載のポリ
ペプチドをコードする核酸。 - 【請求項7】(a)配列番号1に示される核酸配列ヌク
レオチド40−885または(b)配列番号1のアミノ
酸配列を有するポリぺプチドをコードする核酸配列から
なる、請求項6に記載の核酸。 - 【請求項8】 請求項6又は7に記載の核酸の少なくと
も1個のコピーを含むベクター。 - 【請求項9】 請求項6又は7に記載の核酸の少なくと
も1個のコピー又は請求項8に記載のベクターの少なく
とも1個のコピーで形質転換された細胞。 - 【請求項10】 試料液中のC型肝炎ウイルスに対する
抗体の免疫学的測定方法であって、試料液が請求項1か
ら5のいずれかに記載の少なくとも1つのポリペプチド
とともにインキュベートされ、該抗体が該ポリペプチド
への結合により検出される方法。 - 【請求項11】 試料液が2個のポリペプチドP1 及び
P2 とともにインキュベートされ、ここでポリペプチド
P1 は(a)固相に結合しているか又は(b) 固相に結
合可能な形態で存在しており、ポリペプチドP2 はマー
カー基を有しており、そして、抗体は固相中又は/及び
液相中の標識を測定することにより検出される請求項1
0に記載の方法。 - 【請求項12】 試料液を(a)固相に結合しているか
又は(b)固相に結合可能な形態で存在しているポリペ
プチドP1 とともに、そしてマーカー基を有するP1 に
対するさらなる抗体とともにインキュベートし、測定し
ようとする抗体は固相又は/及び液相中の標識を測定す
ることにより検出される請求項10に記載の方法。 - 【請求項13】 抗体の測定が還元状態で実施される請
求項10から12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】 請求項1から5のいずれかに記載され
た少なくとも1個のポリペプチドを含む、C型肝炎ウイ
ルスに対する抗体の免疫学的測定用試薬。
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