JP3452936B2 - 高速液体クロマトグラフィー法および装置 - Google Patents
高速液体クロマトグラフィー法および装置Info
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- B01D—SEPARATION
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般的にはクロマトグラフィーに関し、よ
り詳しくは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を改良
するための方法および手順に関する。
り詳しくは高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を改良
するための方法および手順に関する。
発明の背景
高速液体クロマトグラフィーを通して行う分離方法で
は、通常、カラム中に充填した粒子床（固定相と呼ばれ
る）を通って流れる流体（移動相と呼ばれる）の試料流
中に含まれる多くの成分溶質分子を相互に効果的に分離
することができる。基本的に、個々の試料成分は固定相
に対する親和力が異なっているので、そのような成分の
それぞれの、カラムを通って移行する速度およびカラム
から流出する時間が異なり、各成分が分離される。分離
効率は、溶質の帯が床またはカラムを通過する際の帯の
拡散量により決定される。
は、通常、カラム中に充填した粒子床（固定相と呼ばれ
る）を通って流れる流体（移動相と呼ばれる）の試料流
中に含まれる多くの成分溶質分子を相互に効果的に分離
することができる。基本的に、個々の試料成分は固定相
に対する親和力が異なっているので、そのような成分の
それぞれの、カラムを通って移行する速度およびカラム
から流出する時間が異なり、各成分が分離される。分離
効率は、溶質の帯が床またはカラムを通過する際の帯の
拡散量により決定される。
そのような分離には、特に調製用処理において、その
処理のバッチ的性格により一般的に引き起こされる重大
な限界がある。一般的にクロマトグラフィーカラムは、
カラムを通して平衡化流体を流すことにより先ず平衡化
し、次いで分離すべき溶質を含む液体混合物をカラムに
投入または装填（ロード）し、１種類以上の溶離液を連
続的にカラムに流し、結合した溶質を選択的に放出させ
る。こうして溶離した溶質は流れの中で一時的に分離さ
れ、カラムの出口から放出され、この工程をサイクル状
に反復することができる。一般的な流量において、最初
の流体混合物中の所望の溶質の濃度が低い場合、比較的
長いサイクル時間を必要とする現在の装置および方法で
は、所望の溶質を必要な量で得るのがあまりにも遅くな
り、非常に経費のかかる工程になることがある。
処理のバッチ的性格により一般的に引き起こされる重大
な限界がある。一般的にクロマトグラフィーカラムは、
カラムを通して平衡化流体を流すことにより先ず平衡化
し、次いで分離すべき溶質を含む液体混合物をカラムに
投入または装填（ロード）し、１種類以上の溶離液を連
続的にカラムに流し、結合した溶質を選択的に放出させ
る。こうして溶離した溶質は流れの中で一時的に分離さ
れ、カラムの出口から放出され、この工程をサイクル状
に反復することができる。一般的な流量において、最初
の流体混合物中の所望の溶質の濃度が低い場合、比較的
長いサイクル時間を必要とする現在の装置および方法で
は、所望の溶質を必要な量で得るのがあまりにも遅くな
り、非常に経費のかかる工程になることがある。
図１に示す先行技術のクロマトグラフィー機構は、一
般的にクロマトグラフィーカラム20を含み、その入力
は、少なくとも対応する複数の異なった流体を貯蔵する
ための複数の貯蔵部から供給されるのが一般的である。
例えば、貯蔵部22は平衡化流体24の供給液を貯蔵し、貯
蔵部28および26は、溶離液32および分離すべき試料を含
む流体混合物の対応する供給液をそれぞれ貯蔵する。カ
ラム20の基底または入力末端と、貯蔵部22、26および28
の出力にそれぞれ接続された複数のバルブ手段36、37お
よび38との間には一般的にポンプ34が接続されており、
ポンプ34は各貯蔵部からカラム20の中に流体を強制的に
送り込む。カラム20の反対側または出力側の末端の近く
には、先行技術でよく知られているいずれかの型の通常
の検出器39が配置されている。
般的にクロマトグラフィーカラム20を含み、その入力
は、少なくとも対応する複数の異なった流体を貯蔵する
ための複数の貯蔵部から供給されるのが一般的である。
例えば、貯蔵部22は平衡化流体24の供給液を貯蔵し、貯
蔵部28および26は、溶離液32および分離すべき試料を含
む流体混合物の対応する供給液をそれぞれ貯蔵する。カ
ラム20の基底または入力末端と、貯蔵部22、26および28
の出力にそれぞれ接続された複数のバルブ手段36、37お
よび38との間には一般的にポンプ34が接続されており、
ポンプ34は各貯蔵部からカラム20の中に流体を強制的に
送り込む。カラム20の反対側または出力側の末端の近く
には、先行技術でよく知られているいずれかの型の通常
の検出器39が配置されている。
運転に際しては、通常、バルブ手段36を開き、ポンプ
34を作動させ、貯蔵部22から流体を予め決められた流量
でカラム20にポンプ輸送し、カラム20を先ず平衡化す
る。次いで、一般的にバルブ手段36を閉じ、バルブ手段
37を開き、ある量の流体混合物30をカラム20の中にポン
プ輸送してカラムに溶質分子をロードすることにより、
カラム20の中にあるクロマトグラフィー反応性表面に溶
質分子が結合する。最後に、バルブ手段36および37を閉
じ、バルブ手段38を開き、溶離液32を貯蔵部28からロー
ドされたカラムを通してポンプ輸送する。溶離液により
カラムから溶離した溶質分子は、検出器39により一般的
に光学的に検出され、公知の型のフラクションコレクタ
ー35の中に分離することができる。
34を作動させ、貯蔵部22から流体を予め決められた流量
でカラム20にポンプ輸送し、カラム20を先ず平衡化す
る。次いで、一般的にバルブ手段36を閉じ、バルブ手段
37を開き、ある量の流体混合物30をカラム20の中にポン
プ輸送してカラムに溶質分子をロードすることにより、
カラム20の中にあるクロマトグラフィー反応性表面に溶
質分子が結合する。最後に、バルブ手段36および37を閉
じ、バルブ手段38を開き、溶離液32を貯蔵部28からロー
ドされたカラムを通してポンプ輸送する。溶離液により
カラムから溶離した溶質分子は、検出器39により一般的
に光学的に検出され、公知の型のフラクションコレクタ
ー35の中に分離することができる。
平衡化流体および溶離液用の幾つかの貯蔵部を使用
し、すべての流体を長い導管およびバルブ機構を通して
交互にカラムの中にポンプ輸送する場合、各種の流体が
混合し、帯の拡散を引き起こし、バルブの切換えおよび
導管やバルブ中に一時的に滞留する一定量の未消費流体
移動の必要性のために、操作が不当に遅れることにな
る。そのような遅れはつい最近まで、カラム中の比較的
長いサイクル時間と比較して無視できると考えられてき
た。各種の流体を同じポンプの中に導入し、そこから排
出する場合、不可避な混合も起こり、遅れと混合の双方
が、帯の拡散を助長し、効率を下げる傾向がある。カラ
ムに試料を導入してから、カラムの出口で試料成分が最
終的に分離されるまでの間に通常必要とされる時間は、
数時間を優に超え、数日間を超えることも多い。
し、すべての流体を長い導管およびバルブ機構を通して
交互にカラムの中にポンプ輸送する場合、各種の流体が
混合し、帯の拡散を引き起こし、バルブの切換えおよび
導管やバルブ中に一時的に滞留する一定量の未消費流体
移動の必要性のために、操作が不当に遅れることにな
る。そのような遅れはつい最近まで、カラム中の比較的
長いサイクル時間と比較して無視できると考えられてき
た。各種の流体を同じポンプの中に導入し、そこから排
出する場合、不可避な混合も起こり、遅れと混合の双方
が、帯の拡散を助長し、効率を下げる傾向がある。カラ
ムに試料を導入してから、カラムの出口で試料成分が最
終的に分離されるまでの間に通常必要とされる時間は、
数時間を優に超え、数日間を超えることも多い。
先行技術のHPLC機構における分離の速度および処理量
の妨げになる主な問題点は、よく知られているVan Deem
ter式により課せられる制約およびその結果により配置
される機構の物理的構成要素の下でクロマトグラフィー
カラムを使用することにより生じる。
の妨げになる主な問題点は、よく知られているVan Deem
ter式により課せられる制約およびその結果により配置
される機構の物理的構成要素の下でクロマトグラフィー
カラムを使用することにより生じる。
Van Deemter式に従うクロマトグラフィー機構は、実
質的に薄層状の流体の流れで作動すると考えられ、カラ
ムの中に流れ込む様々な流体流の流体波面が放物面形状
を取る傾向があり、そのためにカラムを横切る様々な流
体の体積間の明確な分離を妨害し、混合の度合いを大き
くする。最近、Van Deemter曲線が最適であると指定し
ている移動相流量で操作することによりそのようなHPLC
分離に課せられる制限は、約5000を超える平均換算（re
duced）速度（以下に定義する）に対応する速度でクロ
マトグラフィーカラムを通る溶離液流量を使用して液体
クロマトグラフィーを行う方法により、克服できること
が発見された。そのような条件下では溶離液の乱流がカ
ラム中に誘発されると考えられ、そのような乱流が物質
移動速度を高め、分離を行うのに必要な時間を劇的に短
縮することにより、カラムの処理量／生産性を増加する
と推定される。液体クロマトグラフィーを実行するため
のこれらの新規な方法および装置は、全体をここに参考
として含める1995年11月２日提出の米国特許出願第08/5
52193号により詳細に記載されている。
質的に薄層状の流体の流れで作動すると考えられ、カラ
ムの中に流れ込む様々な流体流の流体波面が放物面形状
を取る傾向があり、そのためにカラムを横切る様々な流
体の体積間の明確な分離を妨害し、混合の度合いを大き
くする。最近、Van Deemter曲線が最適であると指定し
ている移動相流量で操作することによりそのようなHPLC
分離に課せられる制限は、約5000を超える平均換算（re
duced）速度（以下に定義する）に対応する速度でクロ
マトグラフィーカラムを通る溶離液流量を使用して液体
クロマトグラフィーを行う方法により、克服できること
が発見された。そのような条件下では溶離液の乱流がカ
ラム中に誘発されると考えられ、そのような乱流が物質
移動速度を高め、分離を行うのに必要な時間を劇的に短
縮することにより、カラムの処理量／生産性を増加する
と推定される。液体クロマトグラフィーを実行するため
のこれらの新規な方法および装置は、全体をここに参考
として含める1995年11月２日提出の米国特許出願第08/5
52193号により詳細に記載されている。
HPLCの関数をプロットで説明するのが一般的である
が、そこではカラムプレートの高さＨを移動相の線速度
ｕに対してプロットする。HPLC過程は拡散により推進さ
れる過程であり、異なった溶質分子は異なった拡散係数
を有するので、異なった分子量を有する広範囲な溶質に
この過程を適用する際に、この後者の変数を考慮するこ
とができる。さらに、カラム中の粒子の大きさは、カラ
ム毎に異なることがあり、もう一つの変数とも考えられ
る。同様に、溶質に対する溶剤の粘度も考えられよう。
プロットを標準化してこれらの変数を考慮するために、
換算座標を使用し、特にGiddingsにより開示され、Intr
oduction to Modern Liquid Chromatography,2nd Ed.,
上記、234−235頁に記載されているように、Ｈの代わり
にｈを、ｕの代わりにνを使用して下記のようなVan De
emter式の換算形態を得るのが有利である。
が、そこではカラムプレートの高さＨを移動相の線速度
ｕに対してプロットする。HPLC過程は拡散により推進さ
れる過程であり、異なった溶質分子は異なった拡散係数
を有するので、異なった分子量を有する広範囲な溶質に
この過程を適用する際に、この後者の変数を考慮するこ
とができる。さらに、カラム中の粒子の大きさは、カラ
ム毎に異なることがあり、もう一つの変数とも考えられ
る。同様に、溶質に対する溶剤の粘度も考えられよう。
プロットを標準化してこれらの変数を考慮するために、
換算座標を使用し、特にGiddingsにより開示され、Intr
oduction to Modern Liquid Chromatography,2nd Ed.,
上記、234−235頁に記載されているように、Ｈの代わり
にｈを、ｕの代わりにνを使用して下記のようなVan De
emter式の換算形態を得るのが有利である。
（式１） ｈ＝ａ＋b/ν＋ｃν、または
（式２） Ｈ＝adp＋bD/u＋cudp/D
ここでａ、ｂおよびｃは係数であり、座標ｈはH/dpと定
義され、ここでdpは粒子径であり、従ってｈは無次元座
標である。同様に、無次元座標、換算速度νはudp/Dと
定義され、ここでＤは移動相中の溶質の拡散係数であ
る。
義され、ここでdpは粒子径であり、従ってｈは無次元座
標である。同様に、無次元座標、換算速度νはudp/Dと
定義され、ここでＤは移動相中の溶質の拡散係数であ
る。
νはまたPeclet数としても知られている。しかし、換
算座標またはPeclet数νは、本発明の説明で使用するよ
うに、カラム全体を通る流体の流れを説明しているので
あって、カラム中の充填床を構成し得る多孔質粒子の細
孔内の流体の流れを説明していると考えるへきではない
ことを強調しておく必要がある。
算座標またはPeclet数νは、本発明の説明で使用するよ
うに、カラム全体を通る流体の流れを説明しているので
あって、カラム中の充填床を構成し得る多孔質粒子の細
孔内の流体の流れを説明していると考えるへきではない
ことを強調しておく必要がある。
発明の目的
本発明の主目的は、生物製剤等の溶質を高生産性、高
分解能で分離するための改良されたクロマトグラフィー
装置および方法を提供することである。本発明の他の目
的は、調製用クロマトグラフィーの処理量／生産性を劇
的に高めるものとしてそのような装置および方法を提供
すること、遊離液を節約するそのような装置および方法
を提供すること、および分離（separations）がクロマ
トグラフィーカラム中で比較的短い時間内で行なわれ、
カラム中に導入する前、およびカラムを通り抜ける間、
各流体本体間に最小の空間的分離（minimized spatial
separation）が維持されるような装置および方法を提供
することである。
分解能で分離するための改良されたクロマトグラフィー
装置および方法を提供することである。本発明の他の目
的は、調製用クロマトグラフィーの処理量／生産性を劇
的に高めるものとしてそのような装置および方法を提供
すること、遊離液を節約するそのような装置および方法
を提供すること、および分離（separations）がクロマ
トグラフィーカラム中で比較的短い時間内で行なわれ、
カラム中に導入する前、およびカラムを通り抜ける間、
各流体本体間に最小の空間的分離（minimized spatial
separation）が維持されるような装置および方法を提供
することである。
発明の概要
これらの目的のために本発明は、少なくとも一つの溶
質混合物試料をクロマトグラフィーカラム上にロード
し、続いて１種以上の溶離液によりカラムから溶離させ
る液体クロマトグラフィーを行うための新規な方法およ
び装置を提供する。少なくとも試料混合物および１種以
上の溶離流体をカラム中に、好ましくは迅速な注入によ
り、各流体注入物が密に一体となった、ただし相互に分
離した（separated）各流体プラグを形成するように、
カラムの基底または入力末端に隣接する１箇所以上で導
入する。各流体は妥当なあらゆる流量で注入することが
できるが、好ましくはカラム内に、高流量で、好ましく
は約5000を超える平均換算速度に相当する速度でカラム
を通過するように注入する。従って各流体は、各流体の
カラム内への導入前および導入後カラム中にある時に好
ましくない混合を助長する傾向がある介在共通ポンプや
他の装置を使用することなく、各プラグがカラムを通過
する際に、約5000を超える平均換算速度に相当する速度
であっても、各プラグ間に最小の空間的な段階分離（mi
nimized spatial step sparation）を維持するような様
式で、カラム内に直接供給する。
質混合物試料をクロマトグラフィーカラム上にロード
し、続いて１種以上の溶離液によりカラムから溶離させ
る液体クロマトグラフィーを行うための新規な方法およ
び装置を提供する。少なくとも試料混合物および１種以
上の溶離流体をカラム中に、好ましくは迅速な注入によ
り、各流体注入物が密に一体となった、ただし相互に分
離した（separated）各流体プラグを形成するように、
カラムの基底または入力末端に隣接する１箇所以上で導
入する。各流体は妥当なあらゆる流量で注入することが
できるが、好ましくはカラム内に、高流量で、好ましく
は約5000を超える平均換算速度に相当する速度でカラム
を通過するように注入する。従って各流体は、各流体の
カラム内への導入前および導入後カラム中にある時に好
ましくない混合を助長する傾向がある介在共通ポンプや
他の装置を使用することなく、各プラグがカラムを通過
する際に、約5000を超える平均換算速度に相当する速度
であっても、各プラグ間に最小の空間的な段階分離（mi
nimized spatial step sparation）を維持するような様
式で、カラム内に直接供給する。
本発明の一変形では、分離すべき（to be separate
d）流体混合物および１種以上の溶離流体の、以下に定
義するような望ましい相互に分離した各プラグ（discre
te plugs）を個別の注入器により連続的に注入し、注入
器の出力はすべて、カラムの入口に配置された共通の入
力口に接続されており、注入器のそれぞれを操作し、各
流体プラグの注入を、主ポンプから流れる流体の主要な
流れの内および外に切り換えることができる。
d）流体混合物および１種以上の溶離流体の、以下に定
義するような望ましい相互に分離した各プラグ（discre
te plugs）を個別の注入器により連続的に注入し、注入
器の出力はすべて、カラムの入口に配置された共通の入
力口に接続されており、注入器のそれぞれを操作し、各
流体プラグの注入を、主ポンプから流れる流体の主要な
流れの内および外に切り換えることができる。
本発明のさらに別の変形では、クロマトグラフィーカ
ラムの延長軸に沿って互いに空間的に分離した（spatia
lly separated）位置で互いに接続され、各種流体の相
互に分離した（discrete）各プラグを実質的に同時に、
空間的に分離した位置で注入するように操作できる複数
の注入器を使用する。
ラムの延長軸に沿って互いに空間的に分離した（spatia
lly separated）位置で互いに接続され、各種流体の相
互に分離した（discrete）各プラグを実質的に同時に、
空間的に分離した位置で注入するように操作できる複数
の注入器を使用する。
注入された各体積（volumes）に関連してここで使用
する用語「プラグ」は、クロマトグラフィーカラム中の
流れの中に注入され、カラムを実質的に完全に横切って
伸び、好ましくはカラムの延長軸に対して直角に伸び
る、ほぼ平坦な、または平面的な前方表面および後方表
面を有する、相互に分離した（discrete）実質的に同形
のかたまり（essentially isomorphic mass）を形成す
るような流体の一かたまりまたは一体積（a mass or vo
lume of fluid）を意味する。
する用語「プラグ」は、クロマトグラフィーカラム中の
流れの中に注入され、カラムを実質的に完全に横切って
伸び、好ましくはカラムの延長軸に対して直角に伸び
る、ほぼ平坦な、または平面的な前方表面および後方表
面を有する、相互に分離した（discrete）実質的に同形
のかたまり（essentially isomorphic mass）を形成す
るような流体の一かたまりまたは一体積（a mass or vo
lume of fluid）を意味する。
本発明の上記の、および他の目的は、下記の説明から
明らかである。したがって本発明は、下記の詳細な説明
で例示する部品の構造および配置を有する装置、および
幾つかの工程からなる方法およびそのような工程の幾つ
かの、他の工程に対する関係および順序を含み、本発明
の範囲は請求の範囲に規定する。
明らかである。したがって本発明は、下記の詳細な説明
で例示する部品の構造および配置を有する装置、および
幾つかの工程からなる方法およびそのような工程の幾つ
かの、他の工程に対する関係および順序を含み、本発明
の範囲は請求の範囲に規定する。
本発明の性格および目的をより深く理解するために、
同様の番号が同様の部品を示す図面を参照しながら、本
発明を以下に詳細に説明する。
同様の番号が同様の部品を示す図面を参照しながら、本
発明を以下に詳細に説明する。
図面の簡単な説明
図１は、代表的な先行技術の装置の簡素化した説明図
である。
である。
図２は、本発明の原理を具体化した装置の説明図であ
る。
る。
図３は、図２の装置で使用するクロマトグラフィーカ
ラムの断面の拡大図である。
ラムの断面の拡大図である。
図４は、本発明で効果的な代表的な二重コイル注入器
の、第一状態を示す図である。
の、第一状態を示す図である。
図５は、図４に示す二重コイル注入器の、第二状態を
示す図である。
示す図である。
図６は、本発明で効果的な単一コイル注入器の、第一
状態を示す図である。
状態を示す図である。
図７は、図６に示す注入器の、第二状態を示す図であ
る。
る。
図８は、図２の実施態様に類似しているが、すべての
注入器がクロマトグラフィーカラムに単一の入力を供給
する図である。
注入器がクロマトグラフィーカラムに単一の入力を供給
する図である。
図９は、本発明の原理を具体化する装置の一実施態様
の説明図である。
の説明図である。
図10は、本発明の原理を具体化する装置の一実施態様
の説明図である。
の説明図である。
図11は、本発明の原理を具体化する装置の一実施態様
の説明図である。
の説明図である。
図12は、本発明の原理を具体化する装置の一実施態様
の説明図である。
の説明図である。
図13は、本発明の装置を使用する調製用分離を例示す
るクロマトグラムである。
るクロマトグラムである。
好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の一態様は、図２および３に示すように、約30
μｍ以上の実質的に一様な平均直径を有する複数の固い
固体粒子42を充填して形成したクロマトグラフィーカラ
ム40を含む、クロマトグラフィー装置で具体化される。
ここで使用する用語「平均直径」は、粒子の形状に関係
なく、粒子の平均（中間）的な直径または断面寸法を意
味し、必然的に球形の粒子または規則的な固体に限定す
ると解釈するものではなく、そのような平均直径の値は
一般的に、約95％の信頼係数（confidence coefficien
t）で直径分布の中に存在する。本発明の好ましい態様
は、粒子形状の不規則性である。ここで使用する用語
「不規則な」は、粒子は混合した様々な多角形状で存在
し得るので、形状が一致していないとして定義するだけ
ではなく、粗い、不均質な、または凹凸のある表面を有
する、一般的に球形、円錐形、長円形、等の粒子のよう
な回転の固体を含むものとする。
μｍ以上の実質的に一様な平均直径を有する複数の固い
固体粒子42を充填して形成したクロマトグラフィーカラ
ム40を含む、クロマトグラフィー装置で具体化される。
ここで使用する用語「平均直径」は、粒子の形状に関係
なく、粒子の平均（中間）的な直径または断面寸法を意
味し、必然的に球形の粒子または規則的な固体に限定す
ると解釈するものではなく、そのような平均直径の値は
一般的に、約95％の信頼係数（confidence coefficien
t）で直径分布の中に存在する。本発明の好ましい態様
は、粒子形状の不規則性である。ここで使用する用語
「不規則な」は、粒子は混合した様々な多角形状で存在
し得るので、形状が一致していないとして定義するだけ
ではなく、粗い、不均質な、または凹凸のある表面を有
する、一般的に球形、円錐形、長円形、等の粒子のよう
な回転の固体を含むものとする。
本発明の上記の実施態様で使用する粒子は、圧縮でき
ない材料から形成されるが、この用語は、少なくとも約
５×103psi（出口カラムのフリット保持部を含む）の圧
力下にある粒子の密度および体積が変化する時間速度が
実質的にゼロであり、したがって粒子がそのような高圧
でも可塑性変形にかなり耐えられることを意味する。本
発明の粒子は、特に図３に示すように、粒子42間で形成
される隙間通路44を有することを特徴とするカラムを形
成するのに十分な圧力で充填できるような大きさおよび
形状の範囲内で、形成し、選択する。粒子が不規則であ
るために、そのような通路の内壁は必然的に形状が極め
て粗雑である。通路44の少なくとも大部分は平均断面直
径が実質的に約４μｍ以上であると考えられるが、隙間
容積画分（すなわち粒子間の隙間通路44の総容積）はカ
ラム40の総体積の約45％以上にすべきである。ここで先
行技術の代表的なカラム隙間容積画分は約45％未満、よ
り詳しくは約35％〜42％である。粒子42の表面は、この
分野で良く知られているようにそれ自体で、またはやは
りこの分野で良く知られているように、多くの公知のク
ロマトグラフィー的に活性な固定相の層で被覆するなど
の処理により、クロマトグラフィー的に活性である。粒
子42は、薄皮状であるか、または活性表面積を増加する
ために多孔質であり、粒子内細孔が一般的に約60Å〜5,
000Åの平均直径を有することができる。粒子が不規則
であると共に隙間容積画分が約45％以上である結果、本
発明のカラムの隙間通路を通る乱流は、驚くべきことに
10を優に下回るレイノルズ数で誘発されると考えられ
る。
ない材料から形成されるが、この用語は、少なくとも約
５×103psi（出口カラムのフリット保持部を含む）の圧
力下にある粒子の密度および体積が変化する時間速度が
実質的にゼロであり、したがって粒子がそのような高圧
でも可塑性変形にかなり耐えられることを意味する。本
発明の粒子は、特に図３に示すように、粒子42間で形成
される隙間通路44を有することを特徴とするカラムを形
成するのに十分な圧力で充填できるような大きさおよび
形状の範囲内で、形成し、選択する。粒子が不規則であ
るために、そのような通路の内壁は必然的に形状が極め
て粗雑である。通路44の少なくとも大部分は平均断面直
径が実質的に約４μｍ以上であると考えられるが、隙間
容積画分（すなわち粒子間の隙間通路44の総容積）はカ
ラム40の総体積の約45％以上にすべきである。ここで先
行技術の代表的なカラム隙間容積画分は約45％未満、よ
り詳しくは約35％〜42％である。粒子42の表面は、この
分野で良く知られているようにそれ自体で、またはやは
りこの分野で良く知られているように、多くの公知のク
ロマトグラフィー的に活性な固定相の層で被覆するなど
の処理により、クロマトグラフィー的に活性である。粒
子42は、薄皮状であるか、または活性表面積を増加する
ために多孔質であり、粒子内細孔が一般的に約60Å〜5,
000Åの平均直径を有することができる。粒子が不規則
であると共に隙間容積画分が約45％以上である結果、本
発明のカラムの隙間通路を通る乱流は、驚くべきことに
10を優に下回るレイノルズ数で誘発されると考えられ
る。
本発明では、第一の平衡化流体47のような流体を貯蔵
部48のような適当な供給源からポンプ輸送し、カラム40
中の隙間容積の少なくとも主要部分を通して、好ましく
は約5000をかなり上回る換算速度（すなわち上に定義す
るudp/D）で流すために、ポンプ46のような手段がカラ
ム40の基底末端に接続されている。5000は、h/ν曲線の
傾斜が換算座標ｈ（すなわちH/dp）軸に沿って減少し始
め、換算速度の増加と共に効率の向上を示す、大体の値
である。混合物の乱流は、本発明のカラム中に、約5000
の換算速度値に対応する流速で誘発されると考えられ
る。
部48のような適当な供給源からポンプ輸送し、カラム40
中の隙間容積の少なくとも主要部分を通して、好ましく
は約5000をかなり上回る換算速度（すなわち上に定義す
るudp/D）で流すために、ポンプ46のような手段がカラ
ム40の基底末端に接続されている。5000は、h/ν曲線の
傾斜が換算座標ｈ（すなわちH/dp）軸に沿って減少し始
め、換算速度の増加と共に効率の向上を示す、大体の値
である。混合物の乱流は、本発明のカラム中に、約5000
の換算速度値に対応する流速で誘発されると考えられ
る。
本発明は、カラム40内に流体試料混合物52の各プラグ
を注入するためのループ注入器50のような手段をさらに
含む。一般的に、本発明を調製目的に使用している場
合、溶質混合物52のプラグは、カラム40を十分にロード
するためにできるだけ大きくする。混合物52は問題とす
る溶質を含み、補助ポンプ54により注入器50の中にポン
プ輸送される。
を注入するためのループ注入器50のような手段をさらに
含む。一般的に、本発明を調製目的に使用している場
合、溶質混合物52のプラグは、カラム40を十分にロード
するためにできるだけ大きくする。混合物52は問題とす
る溶質を含み、補助ポンプ54により注入器50の中にポン
プ輸送される。
本発明は、カラム40内に溶離流体60を流すための少な
くとも１基のループ注入器58のような手段をも含む。流
体60は、別の補助ポンプ62により、別の適当な貯蔵部ま
たは貯蔵タンク64から注入器58の中にポンプ輸送され
る。図２に示す実施態様では、カラム40内に第二の溶離
流体68を注入するためのさらに別のループ注入器66も示
す。第二溶離流体は、第三の補助ポンプ70により、別の
適当な貯蔵部または貯蔵タンク72から注入器66の中に供
給される。無論、ポンプ46、54、62および70は、いずれ
かの所望の型の公知のポンプでよく、機械的ポンプに限
定せず、それぞれの流体に圧力をかけ、流体を所望の流
量で流すための公知の方式のいずれでもよい。無論、他
の溶離流体用の注入器を所望により追加することもでき
る。例えば、図10〜12は、本発明のクロマトグラフィー
機構の流路に特定の溶離流体を配送する上で最適の融通
性を得るための、追加の溶離流体120、124、および128
をそれぞれ貯蔵部122、126、および130の中に、様々な
配置で含む実施態様を示す。
くとも１基のループ注入器58のような手段をも含む。流
体60は、別の補助ポンプ62により、別の適当な貯蔵部ま
たは貯蔵タンク64から注入器58の中にポンプ輸送され
る。図２に示す実施態様では、カラム40内に第二の溶離
流体68を注入するためのさらに別のループ注入器66も示
す。第二溶離流体は、第三の補助ポンプ70により、別の
適当な貯蔵部または貯蔵タンク72から注入器66の中に供
給される。無論、ポンプ46、54、62および70は、いずれ
かの所望の型の公知のポンプでよく、機械的ポンプに限
定せず、それぞれの流体に圧力をかけ、流体を所望の流
量で流すための公知の方式のいずれでもよい。無論、他
の溶離流体用の注入器を所望により追加することもでき
る。例えば、図10〜12は、本発明のクロマトグラフィー
機構の流路に特定の溶離流体を配送する上で最適の融通
性を得るための、追加の溶離流体120、124、および128
をそれぞれ貯蔵部122、126、および130の中に、様々な
配置で含む実施態様を示す。
試料および溶離流体を本発明のカラム40に加えるの
に、流路中に測定量の流体を配送できるのであれば、ど
のような注入手段でも使用することができる。例えば、
注入手段は、ループ注入器または配管部分をポンプ手段
と組合せて含むことができる。あるいは、流路に作用す
る重力の作用により注入手段を駆動することができる。
に、流路中に測定量の流体を配送できるのであれば、ど
のような注入手段でも使用することができる。例えば、
注入手段は、ループ注入器または配管部分をポンプ手段
と組合せて含むことができる。あるいは、流路に作用す
る重力の作用により注入手段を駆動することができる。
図２に示す実施態様では、入力導管74がポンプ46の出
力からカラム40の入力末端75に接続され、注入器50、5
8、66はすべて、ポンプ46とカラム40の入力末端75の間
で互いに間隔を置いた異なった位置で、入力導管74に接
続されている。各注入器の運転を手動制御または自動制
御し、試料混合物52および溶離流体60および68のそれぞ
れのプラグをカラム40の基底末端中に、好ましくは約50
00を超える換算速度に相当する速度で注入することがで
きる。本発明による注入器の手動制御運転では、人間の
介在による操作で、注入器のロードを行うか、試料また
は溶離流体を機構の流れの中に、さらにカラムの中に注
入するか、または注入工程の両方を実行する。注入器の
自動制御運転とは、ここでは注入器のロードに、および
／または機構の流れの中に、さらにカラムの中に試料ま
たは溶離流体を注入するのに、人間の介在を必要としな
い運転として定義する。好ましい実施態様では、自動制
御される注入器が、コンピュータシステムの制御により
作動するモーターのようなアクチュエータにより操作さ
れる。本発明の自動制御注入器は、自動制御注入器に対
するバックアップとして手動注入器を含むこともでき
る。本発明の装置は、所望により手動制御および自動制
御注入器の両方を含むこともできる。
力からカラム40の入力末端75に接続され、注入器50、5
8、66はすべて、ポンプ46とカラム40の入力末端75の間
で互いに間隔を置いた異なった位置で、入力導管74に接
続されている。各注入器の運転を手動制御または自動制
御し、試料混合物52および溶離流体60および68のそれぞ
れのプラグをカラム40の基底末端中に、好ましくは約50
00を超える換算速度に相当する速度で注入することがで
きる。本発明による注入器の手動制御運転では、人間の
介在による操作で、注入器のロードを行うか、試料また
は溶離流体を機構の流れの中に、さらにカラムの中に注
入するか、または注入工程の両方を実行する。注入器の
自動制御運転とは、ここでは注入器のロードに、および
／または機構の流れの中に、さらにカラムの中に試料ま
たは溶離流体を注入するのに、人間の介在を必要としな
い運転として定義する。好ましい実施態様では、自動制
御される注入器が、コンピュータシステムの制御により
作動するモーターのようなアクチュエータにより操作さ
れる。本発明の自動制御注入器は、自動制御注入器に対
するバックアップとして手動注入器を含むこともでき
る。本発明の装置は、所望により手動制御および自動制
御注入器の両方を含むこともできる。
注入器は、それぞれの流体プラグを実質的に同時に、
またはタイミングを合わせた順序で注入するように操作
することができる。例えば、注入器50中の、以下に説明
する注入コイルが100mLプラグを配送するような大きさ
を有する場合、注入器58および66中の対応するコイル
は、例えばそれぞれ5mLの溶離流体のプラグを与える大
きさを有することができ、一般的に対応する小さな容量
の注入コイルを有する。そのような場合、注入器50中の
直径の大きなコイル導管を通して少量の溶離液がカラム
40の中に注入されるのを避け、その結果生じる傾向があ
る混合を避けるために、試料注入器50をカラム40の入力
末端から、他の注入器よりも遠い位置に配置するのが望
ましい。図10は、本発明のクロマトグラフィー装置の配
置を示すが、そこでは試料注入手段100および溶離液注
入手段102、104、106、108、および110が直列に接続さ
れ、各注入手段の操作順序が流れ切換バルブ手段82、8
4、86、88、90、および92により制御される。図11で
は、各種の流体が、流れ切換バルブ手段82、84、86、8
8、90、および92により制御されて流路に順次配送され
るように、試料注入手段100および溶離液注入手段102、
104、106、108、および110が接続されている。図12の実
施態様は、第二の平衡化流体47'を貯蔵部48'からポンプ
手段46'を経由して流路に送ることができる配置を示
す。バルブ手段80は、例えば流れ切換バルブ手段82、8
4、86、および88の上流で作動し、流路に溶離勾配を付
ける。無論、試料および溶離液注入器の、カラムおよび
カラムへのすべての入力導管に対する間隔および位置
は、図に示すものと異なっていてもよい。
またはタイミングを合わせた順序で注入するように操作
することができる。例えば、注入器50中の、以下に説明
する注入コイルが100mLプラグを配送するような大きさ
を有する場合、注入器58および66中の対応するコイル
は、例えばそれぞれ5mLの溶離流体のプラグを与える大
きさを有することができ、一般的に対応する小さな容量
の注入コイルを有する。そのような場合、注入器50中の
直径の大きなコイル導管を通して少量の溶離液がカラム
40の中に注入されるのを避け、その結果生じる傾向があ
る混合を避けるために、試料注入器50をカラム40の入力
末端から、他の注入器よりも遠い位置に配置するのが望
ましい。図10は、本発明のクロマトグラフィー装置の配
置を示すが、そこでは試料注入手段100および溶離液注
入手段102、104、106、108、および110が直列に接続さ
れ、各注入手段の操作順序が流れ切換バルブ手段82、8
4、86、88、90、および92により制御される。図11で
は、各種の流体が、流れ切換バルブ手段82、84、86、8
8、90、および92により制御されて流路に順次配送され
るように、試料注入手段100および溶離液注入手段102、
104、106、108、および110が接続されている。図12の実
施態様は、第二の平衡化流体47'を貯蔵部48'からポンプ
手段46'を経由して流路に送ることができる配置を示
す。バルブ手段80は、例えば流れ切換バルブ手段82、8
4、86、および88の上流で作動し、流路に溶離勾配を付
ける。無論、試料および溶離液注入器の、カラムおよび
カラムへのすべての入力導管に対する間隔および位置
は、図に示すものと異なっていてもよい。
調製用LCにおける注入は、カラム充填物全体をより効
率的に使用できるようにするために、カラムの断面全体
に試料をロードするのが一般的に好ましいので、特に重
要である。本発明では、カラム40の入力末端に試料入口
分配ヘッド76を配置しているが、これは、上記の理由の
みならず、隣接する各流体プラグ間の境界面を比較的鮮
明に維持するためにも、カラムの延長軸に対して直角で
実質的に平坦な、または平面的な表面を有するプラグと
して、注入された分量を分配するのに使用される。流体
は、カラム40中に注入されたプラグまたは分量が全体的
な流れと実質的に同じ速度で確実に移動する圧力で、ヘ
ッド76中に導入し、それによって隣接する各流体プラグ
の混合を最小に抑え、プラグが互いに隣接しているとこ
ろで各プラグの末端の大まかな平面性を維持する。
率的に使用できるようにするために、カラムの断面全体
に試料をロードするのが一般的に好ましいので、特に重
要である。本発明では、カラム40の入力末端に試料入口
分配ヘッド76を配置しているが、これは、上記の理由の
みならず、隣接する各流体プラグ間の境界面を比較的鮮
明に維持するためにも、カラムの延長軸に対して直角で
実質的に平坦な、または平面的な表面を有するプラグと
して、注入された分量を分配するのに使用される。流体
は、カラム40中に注入されたプラグまたは分量が全体的
な流れと実質的に同じ速度で確実に移動する圧力で、ヘ
ッド76中に導入し、それによって隣接する各流体プラグ
の混合を最小に抑え、プラグが互いに隣接しているとこ
ろで各プラグの末端の大まかな平面性を維持する。
カラム40を通って流れる混合物52のプラグにより、溶
質分子が、カラム中のクロマトグラフィー的に活性な表
面に結合し、カラムがロードされる。溶離流体によりカ
ラムから溶離する溶質分子は、カラム40の反対側の末端
に配置された、先行技術でよく知られている型の検出器
78により、よく知られている様式で、一般的には光学的
に、検出される。より優れた結果を得るには、溶離流体
により本発明のカラムから溶離する溶質の帯拡散が、溶
離流体に対するレイノルズ数の逆関数になり、溶離流体
中の溶質の拡散係数の大きさの正関数になるように、カ
ラム40を通る溶離液は、約5000を超える換算速度に対応
する速度で流れるのが好ましい。しかし、本発明はいず
れの場合でも使用する溶離液の量を最小に抑える傾向が
あるので、本発明は、無論、カラムを通る流れが薄層状
であるクロマトグラフィーにも適用できる。
質分子が、カラム中のクロマトグラフィー的に活性な表
面に結合し、カラムがロードされる。溶離流体によりカ
ラムから溶離する溶質分子は、カラム40の反対側の末端
に配置された、先行技術でよく知られている型の検出器
78により、よく知られている様式で、一般的には光学的
に、検出される。より優れた結果を得るには、溶離流体
により本発明のカラムから溶離する溶質の帯拡散が、溶
離流体に対するレイノルズ数の逆関数になり、溶離流体
中の溶質の拡散係数の大きさの正関数になるように、カ
ラム40を通る溶離液は、約5000を超える換算速度に対応
する速度で流れるのが好ましい。しかし、本発明はいず
れの場合でも使用する溶離液の量を最小に抑える傾向が
あるので、本発明は、無論、カラムを通る流れが薄層状
であるクロマトグラフィーにも適用できる。
本発明の一実施態様では、カラム40は、平均直径が約
30μｍ以上の粒子を、好ましくは少なくとも約５×103p
siの圧力下で充填し、形成されたカラムが、互いに接触
している粒子42間に形成される透き間通路44を除いて、
実質的に空隙を含まない、すなわちカラム40が実質的に
一様なかさ密度を有するように形成する。このようにし
て形成されたカラム40は、粒子が多孔質または非多孔質
であるかにかかわらず、約45％以上の透き間画分を有す
るべきである。より低い透き間画分（多孔質で非剛性の
ポリスチレン粒子では一般的に約35％）は、粒子をつぶ
す、または破壊する傾向がある過度に高い圧力は別とし
て、必要な換算流体速度を与えない。
30μｍ以上の粒子を、好ましくは少なくとも約５×103p
siの圧力下で充填し、形成されたカラムが、互いに接触
している粒子42間に形成される透き間通路44を除いて、
実質的に空隙を含まない、すなわちカラム40が実質的に
一様なかさ密度を有するように形成する。このようにし
て形成されたカラム40は、粒子が多孔質または非多孔質
であるかにかかわらず、約45％以上の透き間画分を有す
るべきである。より低い透き間画分（多孔質で非剛性の
ポリスチレン粒子では一般的に約35％）は、粒子をつぶ
す、または破壊する傾向がある過度に高い圧力は別とし
て、必要な換算流体速度を与えない。
好ましい透き間画分および望ましい一様な密度を有す
るカラムを確実に形成し、運転圧力下でのつぶれを防止
するには、本発明のカラムを充填するのに使用する粒子
は、少なくとも約５×103psi、好ましくは約１×104psi
までの高い充填圧でも圧縮されない、剛性のある固体で
ある。この目的に好ましい粒子は、アルミナ、チタニ
ア、シリカ、ジルコニア、バナジア、炭素およびそれら
の組合わせのような材料から形成する。
るカラムを確実に形成し、運転圧力下でのつぶれを防止
するには、本発明のカラムを充填するのに使用する粒子
は、少なくとも約５×103psi、好ましくは約１×104psi
までの高い充填圧でも圧縮されない、剛性のある固体で
ある。この目的に好ましい粒子は、アルミナ、チタニ
ア、シリカ、ジルコニア、バナジア、炭素およびそれら
の組合わせのような材料から形成する。
したがって本発明の方法には、クロマトグラフィーカ
ラム中の透き間通路の少なくとも大部分を通る流れが乱
流でなければならない。乱流プロフィールは、クロマト
グラフィーカラムを通る薄層状流れに典型的な放物面状
の流動プロフィールと異なり、ほとんど平らであると考
えられる。より重要なことに、乱流が誘発されると、正
常な拡散過程で速度の放射状成分が重なり合い、正常な
拡散過程および帯拡散速度をカラムの効率にとって好ま
しい様式で変化させる。さらに、カラムを通して乱流を
誘発し、持続させるには、流動通路の直径と直線的な流
動速度の間に重大な関係があると考えられる。したがっ
てそのような場合、剛性があり、上記のように、塑性変
形を起こさずに圧力変化に耐えられる粒子の必要性は非
常に重要である。
ラム中の透き間通路の少なくとも大部分を通る流れが乱
流でなければならない。乱流プロフィールは、クロマト
グラフィーカラムを通る薄層状流れに典型的な放物面状
の流動プロフィールと異なり、ほとんど平らであると考
えられる。より重要なことに、乱流が誘発されると、正
常な拡散過程で速度の放射状成分が重なり合い、正常な
拡散過程および帯拡散速度をカラムの効率にとって好ま
しい様式で変化させる。さらに、カラムを通して乱流を
誘発し、持続させるには、流動通路の直径と直線的な流
動速度の間に重大な関係があると考えられる。したがっ
てそのような場合、剛性があり、上記のように、塑性変
形を起こさずに圧力変化に耐えられる粒子の必要性は非
常に重要である。
本発明で効果的な注入器は市販されており、例えば、
Rheodyne Incorporated of Cotati,Californiaから市販
のModel 3725およびModel 3725−038手動注入器、Valco
Instrument Company,Inc.of Houston,Texasから市販の
Model E−45自動注入器、およびこれらの、および他の
メーカーから市販されている類似の注入器がある。図４
および５に、そのような型の代表的な二重ループ注入器
の図を、メーカーにより使用されている記号を使用して
２つの状態で示す。そのような図のそれぞれで、注入器
は、主ポンプ46の出力に接続された第一入力口80、第一
注入器ループコイル82、カラム40の入力末端75に接続さ
れた第一出力口84、補助ポンプ54の出力に接続された第
二入力口86、および廃棄部に放出する第二出力口90、お
よび各入力および出力を異なったループコイルを通して
切り換える、またはバルブ作用させるための手段を含
む。
Rheodyne Incorporated of Cotati,Californiaから市販
のModel 3725およびModel 3725−038手動注入器、Valco
Instrument Company,Inc.of Houston,Texasから市販の
Model E−45自動注入器、およびこれらの、および他の
メーカーから市販されている類似の注入器がある。図４
および５に、そのような型の代表的な二重ループ注入器
の図を、メーカーにより使用されている記号を使用して
２つの状態で示す。そのような図のそれぞれで、注入器
は、主ポンプ46の出力に接続された第一入力口80、第一
注入器ループコイル82、カラム40の入力末端75に接続さ
れた第一出力口84、補助ポンプ54の出力に接続された第
二入力口86、および廃棄部に放出する第二出力口90、お
よび各入力および出力を異なったループコイルを通して
切り換える、またはバルブ作用させるための手段を含
む。
図４および５の注入器の運転は、貯蔵部56から試料流
体を注入することに関して効果的に説明できるが、無
論、この説明は、溶離流体を対応する貯蔵部から注入す
ることにも同様に適用できる。運転に際して、図４示す
ように注入器の第一状態で、コイル82はすでに試料流体
52で満たされていると仮定することができる。図４に示
す注入器の内部バルブ機構では、入力口80がコイル82の
片側に接続され、コイル82の反対側は出力口84に接続さ
れている。したがって、ポンプ46により輸送される流体
が、注入器の切換またはバルブ作用により、口80の中に
急に導入されると、加えられる流体の圧力が水力学的に
試料流体をコイル82の外に押し出し、試料流体を貯蔵部
48から来る流体47で置き換え、試料流体をコイル82から
口84を通してカラム40の中にプラグとして注入する。注
入器のこの切換作用は、入力口86を第二ループコイル88
の片側に接続し、ループコイル82の試料流体が空になる
時にループコイル88を満たし、コイル82の反対側を口90
に接続する機能も果たすので、過剰の試料流体はすべて
口90を通して廃棄部へ放出される。
体を注入することに関して効果的に説明できるが、無
論、この説明は、溶離流体を対応する貯蔵部から注入す
ることにも同様に適用できる。運転に際して、図４示す
ように注入器の第一状態で、コイル82はすでに試料流体
52で満たされていると仮定することができる。図４に示
す注入器の内部バルブ機構では、入力口80がコイル82の
片側に接続され、コイル82の反対側は出力口84に接続さ
れている。したがって、ポンプ46により輸送される流体
が、注入器の切換またはバルブ作用により、口80の中に
急に導入されると、加えられる流体の圧力が水力学的に
試料流体をコイル82の外に押し出し、試料流体を貯蔵部
48から来る流体47で置き換え、試料流体をコイル82から
口84を通してカラム40の中にプラグとして注入する。注
入器のこの切換作用は、入力口86を第二ループコイル88
の片側に接続し、ループコイル82の試料流体が空になる
時にループコイル88を満たし、コイル82の反対側を口90
に接続する機能も果たすので、過剰の試料流体はすべて
口90を通して廃棄部へ放出される。
図５に示すように、注入器がその第二位置に切り換え
られた時、注入器の内部バルブ機構は、入力口80をコイ
ル88の片側に接続し、コイル88の反対側は出力口84に接
続される。したがって、ポンプ46により輸送される流体
が、注入器の切換またはバルブ作用により、口80を通し
て再び急速に導入されると、作用する流体の圧力がコイ
ル88の中に含まれる試料流体を、口84を通してカラム40
の中に別のプラグとして水力学的に押し出す。注入器の
この切換作用は、入力口86を第一ループコイル82の片側
に接続し、ループコイル82を試料流体で再び満たす機能
も果たす。コイル82の反対側は出力口90に接続されるの
で、過剰の流体はすべて廃棄部へ放出される。流体52の
プラグがカラム40の中に注入された後、一般的に溶離流
体60および68の１個以上のプラグが続いて注入される
か、または単に、幾つかの注入器の１個以上を通して流
体47の流れを順次進行させることにより、流体47の流れ
が起こる。
られた時、注入器の内部バルブ機構は、入力口80をコイ
ル88の片側に接続し、コイル88の反対側は出力口84に接
続される。したがって、ポンプ46により輸送される流体
が、注入器の切換またはバルブ作用により、口80を通し
て再び急速に導入されると、作用する流体の圧力がコイ
ル88の中に含まれる試料流体を、口84を通してカラム40
の中に別のプラグとして水力学的に押し出す。注入器の
この切換作用は、入力口86を第一ループコイル82の片側
に接続し、ループコイル82を試料流体で再び満たす機能
も果たす。コイル82の反対側は出力口90に接続されるの
で、過剰の流体はすべて廃棄部へ放出される。流体52の
プラグがカラム40の中に注入された後、一般的に溶離流
体60および68の１個以上のプラグが続いて注入される
か、または単に、幾つかの注入器の１個以上を通して流
体47の流れを順次進行させることにより、流体47の流れ
が起こる。
注入器の構造および運転を二重ループコイル注入器に
関連して説明したが、無論、これに限定するものではな
い。例えば、類似の番号が類似の部品を表す図６および
７に示すように、バイパス切換機構を備えた単ループ注
入器も使用できる。図６および７で、最小貯蔵容量のバ
イパス導管92を使用してループコイル82を置き換えた以
外は、この注入器の部品はすべて図４および５の部品と
等しい。無論、他の公知の型の注入器も本発明の装置に
効果的に使用することができる。
関連して説明したが、無論、これに限定するものではな
い。例えば、類似の番号が類似の部品を表す図６および
７に示すように、バイパス切換機構を備えた単ループ注
入器も使用できる。図６および７で、最小貯蔵容量のバ
イパス導管92を使用してループコイル82を置き換えた以
外は、この注入器の部品はすべて図４および５の部品と
等しい。無論、他の公知の型の注入器も本発明の装置に
効果的に使用することができる。
複数の注入器の切換運転は、切換時間を最適化し、カ
ラム40の中にプラグを注入する所望の順序を得るため
に、公知のコンピュータまたはコントローラーのような
手段の制御下におく。上記の型の注入器は、隣接する流
体プラグ間に所望の鮮明な移行境界を与える傾向がある
ので好ましい。
ラム40の中にプラグを注入する所望の順序を得るため
に、公知のコンピュータまたはコントローラーのような
手段の制御下におく。上記の型の注入器は、隣接する流
体プラグ間に所望の鮮明な移行境界を与える傾向がある
ので好ましい。
図２に示すように、注入器50、58および66を入力導管
74に間隔を置いた位置で接続するが、そのような場合、
これらの注入器のすべてを、適切にプログラム化したコ
ンピュータのような手段により同時に操作し、空間的に
間隔を置いたプラグの連続をヘッド76に与えるか、また
は連続的に操作し、プラグがカラム40を移行する時にプ
ラグの位置に間隔を持たせる上で、より高い融通性を与
えることができる。さらに、同様の番号が同様の部品を
表す図８に示すように、すべての注入器を口75または導
管74上の単一の位置に直接接続することができるが、そ
のような場合、これらの注入器のすべてを連続的に操作
し、空間的に間隔を置いたプラグの連続をヘッド76に与
えることができる。
74に間隔を置いた位置で接続するが、そのような場合、
これらの注入器のすべてを、適切にプログラム化したコ
ンピュータのような手段により同時に操作し、空間的に
間隔を置いたプラグの連続をヘッド76に与えるか、また
は連続的に操作し、プラグがカラム40を移行する時にプ
ラグの位置に間隔を持たせる上で、より高い融通性を与
えることができる。さらに、同様の番号が同様の部品を
表す図８に示すように、すべての注入器を口75または導
管74上の単一の位置に直接接続することができるが、そ
のような場合、これらの注入器のすべてを連続的に操作
し、空間的に間隔を置いたプラグの連続をヘッド76に与
えることができる。
図９に示す実施態様では、溶剤貯蔵部Ａが主ポンプＢ
と流体連絡し、そのポンプＢが平衡化流体を貯蔵部Ａか
ら引き出し、該流体を加圧下でカラムＨに送る。所望に
より、主ポンプＢの上流に迅速に外れる接合部を設け、
貯蔵部Ａと主ポンプＢを接続する配管の末端を密閉し、
漏れやこぼれが起こるのを阻止するか、または最小に抑
えることができる。主ポンプＢは、いずれかの適当なポ
ンプ手段でよいが、圧力計Ｃ、圧力センサーまたは変換
器Ｄ、およびパルス減衰器Ｅに接続した単ヘッドポンプ
が好ましい。主ポンプＢの出口における圧力は、圧力計
Ｃおよび圧力変換器Ｄを、圧力が予め決めた値を超えた
場合にシステムを停止する内部圧力スイッチと組合せて
使用することにより、監視する。主ポンプＢは、クロマ
トグラフィー機構の移動相を、リプルの無い、ユーザー
が選択する流量で配送できるべきである。単ヘッドポン
プを使用する場合、パルス減衰器Ｅを使用し、生じる可
能性がある流量のリプルまたは脈動を最小に抑える。パ
ルス減衰器Ｅは、好ましくは主ポンプＢの配送サイクル
の際は屈曲し、ポンプ運転の「リフレッシュ」サイクル
の際に回復する加圧テトラフルオロエチレン（TPE）メ
ンブレンを含む。メンブレンまたはパルス減衰器Ｅに作
用する圧力は、主ポンプＢが運転される圧力により異な
り、主ポンプＢの運転圧の約80％に等しい。
と流体連絡し、そのポンプＢが平衡化流体を貯蔵部Ａか
ら引き出し、該流体を加圧下でカラムＨに送る。所望に
より、主ポンプＢの上流に迅速に外れる接合部を設け、
貯蔵部Ａと主ポンプＢを接続する配管の末端を密閉し、
漏れやこぼれが起こるのを阻止するか、または最小に抑
えることができる。主ポンプＢは、いずれかの適当なポ
ンプ手段でよいが、圧力計Ｃ、圧力センサーまたは変換
器Ｄ、およびパルス減衰器Ｅに接続した単ヘッドポンプ
が好ましい。主ポンプＢの出口における圧力は、圧力計
Ｃおよび圧力変換器Ｄを、圧力が予め決めた値を超えた
場合にシステムを停止する内部圧力スイッチと組合せて
使用することにより、監視する。主ポンプＢは、クロマ
トグラフィー機構の移動相を、リプルの無い、ユーザー
が選択する流量で配送できるべきである。単ヘッドポン
プを使用する場合、パルス減衰器Ｅを使用し、生じる可
能性がある流量のリプルまたは脈動を最小に抑える。パ
ルス減衰器Ｅは、好ましくは主ポンプＢの配送サイクル
の際は屈曲し、ポンプ運転の「リフレッシュ」サイクル
の際に回復する加圧テトラフルオロエチレン（TPE）メ
ンブレンを含む。メンブレンまたはパルス減衰器Ｅに作
用する圧力は、主ポンプＢが運転される圧力により異な
り、主ポンプＢの運転圧の約80％に等しい。
インラインフィルターＦを圧力変換器Ｄの下流に配置
し、移動相から粒子状物質を除去する。好ましくは、直
径が約0.5μｍを超える粒子を除去できるフィルターを
使用するが、他のフィルターも本発明により使用でき
る。
し、移動相から粒子状物質を除去する。好ましくは、直
径が約0.5μｍを超える粒子を除去できるフィルターを
使用するが、他のフィルターも本発明により使用でき
る。
インラインフィルターＦの下流には、第一流路および
第二流路を選択的に確立する入口バルブＸおよび出口バ
ルブＹがあり、出口バルブＹはカラムＨと流体連絡して
いる。本発明により、第一流路は第二流路と平行であ
り、各流路は少なくとも１個の注入器バルブを含む。
第二流路を選択的に確立する入口バルブＸおよび出口バ
ルブＹがあり、出口バルブＹはカラムＨと流体連絡して
いる。本発明により、第一流路は第二流路と平行であ
り、各流路は少なくとも１個の注入器バルブを含む。
好ましくは、図９でバルブG1、G2、およびG3により例
示するように、第一流路に沿って複数の手動注入器バル
ブを備える。手動注入器バルブは、好ましくは互いに直
列に設置し、その際、各下流バルブの出口は隣接する上
流バルブの入口と流体連絡する（例えば、バルブG1の出
口はバルブG2の入口と流体連絡し、バルブG2の出口はバ
ルブG3の入口と流体連絡する）。試料または溶離液は、
この実施態様では手動注入器バルブG1、G2、およびG3の
いずれかを通してシステムに加えられる。第一流路の手
動注入器バルブは、自動注入バルブＫを使用して精製を
行う前に、特定のクロマトグラフィー精製の流動パラメ
ータを実験的に決定するために使用することができる。
手動注入器バルブG1、G2、およびG3により収容される体
積は、同じでも、この実施態様により異なっていてもよ
い。手動注入器バルブG1、G2、およびG3のそれぞれは、
個別のLOADおよびINJECT位置を示すバルブハンドル機構
中のニードルポートを介して充填する。流体は、バルブ
ハンドル機構がLOAD位置にある間に、正方形の末端を有
する注射器または他の適当なカニューレを使用して手動
注入器バルブの中に注入する。バルブハンドル機構をIN
JECT位置に回転させ、バルブからカラムＨへの流路の中
に流体を注入する。
示するように、第一流路に沿って複数の手動注入器バル
ブを備える。手動注入器バルブは、好ましくは互いに直
列に設置し、その際、各下流バルブの出口は隣接する上
流バルブの入口と流体連絡する（例えば、バルブG1の出
口はバルブG2の入口と流体連絡し、バルブG2の出口はバ
ルブG3の入口と流体連絡する）。試料または溶離液は、
この実施態様では手動注入器バルブG1、G2、およびG3の
いずれかを通してシステムに加えられる。第一流路の手
動注入器バルブは、自動注入バルブＫを使用して精製を
行う前に、特定のクロマトグラフィー精製の流動パラメ
ータを実験的に決定するために使用することができる。
手動注入器バルブG1、G2、およびG3により収容される体
積は、同じでも、この実施態様により異なっていてもよ
い。手動注入器バルブG1、G2、およびG3のそれぞれは、
個別のLOADおよびINJECT位置を示すバルブハンドル機構
中のニードルポートを介して充填する。流体は、バルブ
ハンドル機構がLOAD位置にある間に、正方形の末端を有
する注射器または他の適当なカニューレを使用して手動
注入器バルブの中に注入する。バルブハンドル機構をIN
JECT位置に回転させ、バルブからカラムＨへの流路の中
に流体を注入する。
好ましくは、図９に示すように、複数の自動化された
注入器バルブＫを、ＸおよびＹの間の第二流路に沿って
直列に設置する。図９に例示するように、各自動化され
た注入器バルブＫと流体連絡しているポンプＬを使用
し、試料または溶離流体を貯蔵部Ｍから第二流路の中に
注入する。各ポンプＬは、それぞれの注入時間およびポ
ンプ輸送される流体の流量を決定する、コンピュータプ
ログラムのような適当な手段で制御する。所望により、
各ポンプＬとそれぞれの注入器バルブＫの間に流量計を
配置し、それぞれの自動化された注入器バルブ中への流
体の流量を監視することができる。
注入器バルブＫを、ＸおよびＹの間の第二流路に沿って
直列に設置する。図９に例示するように、各自動化され
た注入器バルブＫと流体連絡しているポンプＬを使用
し、試料または溶離流体を貯蔵部Ｍから第二流路の中に
注入する。各ポンプＬは、それぞれの注入時間およびポ
ンプ輸送される流体の流量を決定する、コンピュータプ
ログラムのような適当な手段で制御する。所望により、
各ポンプＬとそれぞれの注入器バルブＫの間に流量計を
配置し、それぞれの自動化された注入器バルブ中への流
体の流量を監視することができる。
この実施態様で使用するカラムＨは、図３に示すカラ
ムに関して上に説明してある。カラムＨの下流に検出器
Ｉを含み、カラムＨから溶離する物質を検出する。所望
により検出器Ｉの下流に流量計Ｊを含み、システムを通
る移動相の流れを監視することができる。同様に、バル
ブＮ（好ましくはソレノイドバルブ）を検出器Ｉの下流
に配置し、溶離液の流れを回収容器中に分岐させる。検
出器Ｉの下流には、溶離液の流れを廃棄容器中に分岐さ
せるバルブＰも含む。
ムに関して上に説明してある。カラムＨの下流に検出器
Ｉを含み、カラムＨから溶離する物質を検出する。所望
により検出器Ｉの下流に流量計Ｊを含み、システムを通
る移動相の流れを監視することができる。同様に、バル
ブＮ（好ましくはソレノイドバルブ）を検出器Ｉの下流
に配置し、溶離液の流れを回収容器中に分岐させる。検
出器Ｉの下流には、溶離液の流れを廃棄容器中に分岐さ
せるバルブＰも含む。
本発明の装置を、上記の米国特許出願第08/552193号
に記載されているような充填粒子のクロマトグラフィー
カラムに関して説明したが、本発明で有用なカラムは、
実質的に一様な内径を有する中空の細長い通路を規定
し、その通路がクロマトグラフィー的に活性な内側表面
を備えている、毛細管の形態でもよい。この管は、内側
を通してポンプ輸送される流体内に、流体中に遠心力を
生じるのに十分な速度で乱流が誘発されるように形成す
る。
に記載されているような充填粒子のクロマトグラフィー
カラムに関して説明したが、本発明で有用なカラムは、
実質的に一様な内径を有する中空の細長い通路を規定
し、その通路がクロマトグラフィー的に活性な内側表面
を備えている、毛細管の形態でもよい。この管は、内側
を通してポンプ輸送される流体内に、流体中に遠心力を
生じるのに十分な速度で乱流が誘発されるように形成す
る。
本発明の装置で、２種類の異なった5mL溶離液を使用
し、100mLの試料プラグが関与する完全なサイクルを約1
5秒間で行い、極めて高い処理量を達成できることが分
かった。本発明の装置および方法で、特定体積の試料に
必要な溶離溶剤の量は一般的に著しく少ない。例えば、
公称容積8mLの１×10cmカラムに対して、先行技術で使
用する溶離液の量は一般的に約40mLである。同様のカラ
ムを使用する本発明では、溶離液の体積は約8mL以下に
減少し、高価であることが多い溶離液が約５のファクタ
ーで大幅に減少する。
し、100mLの試料プラグが関与する完全なサイクルを約1
5秒間で行い、極めて高い処理量を達成できることが分
かった。本発明の装置および方法で、特定体積の試料に
必要な溶離溶剤の量は一般的に著しく少ない。例えば、
公称容積8mLの１×10cmカラムに対して、先行技術で使
用する溶離液の量は一般的に約40mLである。同様のカラ
ムを使用する本発明では、溶離液の体積は約8mL以下に
減少し、高価であることが多い溶離液が約５のファクタ
ーで大幅に減少する。
図13は、本発明の装置を使用する、リゾチームからの
α−キモトリプシノーゲンＡの調製用分離を例示する。
この分離には、リン酸塩緩衝液（pH8）で平衡化した陽
イオン交換カラムを使用した。リン酸塩緩衝液（pH8）
に溶解させた様々な量のNaClを使用してタンパク質を連
続的に溶離させ、α−キモトリプシノーゲンは200mMのN
aClで溶離し、リゾチームは2MのNaClで溶離した。２種
類のタンパク質を分離した後、NaOHを使用して洗浄工程
を行い、本発明により分離をサイクル式に反復すること
ができた。
α−キモトリプシノーゲンＡの調製用分離を例示する。
この分離には、リン酸塩緩衝液（pH8）で平衡化した陽
イオン交換カラムを使用した。リン酸塩緩衝液（pH8）
に溶解させた様々な量のNaClを使用してタンパク質を連
続的に溶離させ、α−キモトリプシノーゲンは200mMのN
aClで溶離し、リゾチームは2MのNaClで溶離した。２種
類のタンパク質を分離した後、NaOHを使用して洗浄工程
を行い、本発明により分離をサイクル式に反復すること
ができた。
上記の装置および方法については本発明の範囲から逸
脱することなく種々の変形を行うことができ、上記説明
に含まれ、また添付の図面に示されるすべての事項は説
明のためであって、本発明を何ら制限するものではな
い。
脱することなく種々の変形を行うことができ、上記説明
に含まれ、また添付の図面に示されるすべての事項は説
明のためであって、本発明を何ら制限するものではな
い。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 メナペイス，レベッカ，エー.
アメリカ合衆国．01701 マサチューセ
ッツ，フラミンガム，セイレム エンド
ロード 185
(72)発明者 オバーハウザー，チャールズ，ジェー.
アメリカ合衆国．02178 マサチューセ
ッツ，ベルモント，サージェント ロー
ド ２
(56)参考文献 特開 昭56−61646（ＪＰ，Ａ)
特開 平４−301763（ＪＰ，Ａ)
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 30/16
B01D 15/08
G01N 30/26
G01N 30/38
G01N 30/88
Claims (16)
- 【請求項１】クロマトグラフィー的に反応性のある各表
面を有するクロマトグラフィーカラムで液体クロマトグ
ラフィーを行う方法であって、前記各表面と反応性があ
る少なくとも１種の溶質を含む液体混合物の分離したあ
る体積を前記カラムを通して流す工程、および前記カラ
ムを通して溶離流体を流すことにより、前記各表面に結
合した前記溶質を前記各表面から溶離させる工程を含む
方法において、少なくとも一種の溶離流体が、前記カラ
ムへの流入路内に、該流入路に沿って空間的に分離した
各位置で実質的に同時に注入されることで、該注入によ
り形成された該少なくとも一種の溶離流体の分離した各
体積が、密に集まってはいるが空間的に分離している流
体プラグとして前記カラムを通過するようにすることを
特徹とする方法。 - 【請求項２】クロマトグラフィー的に反応性のある各表
面を有するクロマトグラフィーカラムで液体クロマトグ
ラフィーを行う方法であって、前記各表面と反応性があ
る少なくとも１種の溶質を含む液体混合物の分離したあ
る体積を前記カラムを通して流す工程、および前記カラ
ムを通して溶離流体を流すことにより、前記各表面に結
合した前記溶質を前記各表面から溶離させる工程を含む
方法において、少なくとも一種の溶離流体が、前記カラ
ムへの流入路内に、該流入路上の少なくとも一つの位置
で逐次注入されることで、該注入により形成された該少
なくとも一種の溶離流体の分離した各体積が、密に集ま
ってはいるが空間的に分離している流体プラグとして前
記カラムを通過するようにすることを特徹とする方法。 - 【請求項３】前記溶離流体の各体積が、前記カラムを50
00を超える換算速度で通過する請求項１または２記載の
液体クロマトグラフィーを行う方法。 - 【請求項４】前記逐次注入が、該流入路に沿って空間的
に分離した各位置で行なわれる請求項２記載の液体クロ
マトグラフィーを行う方法。 - 【請求項５】前記分離した各体積の注入をサイクル的に
反復する工程、および前記注入のサイクル的反復の間に
前記カラムを通して平衡化流体の所定体積を流す工程を
含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマト
グラフィーを行う方法。 - 【請求項６】前記液体混合物の分離した体積の注入が、
前記溶離流体の分離した各体積の注入と同様に行われる
請求項１〜３のいずれか１項に記載の液体クロマトグラ
フィーを行う方法。 - 【請求項７】実質的に一様で長い、クロマトグラフィー
的に反応性の各表面を含むクロマトグラフィーカラム；
前記各表面と反応性がある少なくとも１種の溶質を含む
液体混合物の分離した体積を前記カラム中に注入して前
記カラムをロードする手段；およびロードしたカラムを
通して溶離流体を流すための手段を含むクロマトグラフ
ィー装置であって、前記溶離流体を流すための手段が、
前記溶離流体および前記液体混合物のそれぞれのプラグ
を前記カラムに注入するための複数の個別の注入器を含
む注入手段を含んでおり、前記各注入器が、前記プラグ
が前記カラムを密に集まった流体プラグとして通過する
ように、前記カラムへの流入路内に、該流入路に沿って
空間的に分離した各位置で複数の異なったプラグを注入
するように配置されており、かつ前記装置が前記それぞ
れのプラグを同時に注入するように前記注入を制御する
手段を含んでいることを特徴とするクロマトグラフィー
装置。 - 【請求項８】実質的に一様で長い、クロマトグラフィー
的に反応性の各表面を含むクロマトグラフィーカラム；
前記各表面と反応性がある少なくとも１種の溶質を含む
液体混合物の分離した体積を前記カラム中に注入して前
記カラムをロードする手段；およびロードしたカラムを
通して溶離流体を流すための手段を含むクロマトグラフ
ィー装置であって、前記溶離流体を流すための手段が、
前記溶離流体および前記液体混合物のそれぞれのプラグ
を前記カラムに注入するための複数の個別の注入器を含
む注入手段を含んでおり、前記各注入器が、前記プラグ
が前記カラムを密に集まった流体プラグとして通過する
ように、前記カラムへの流入路内に、該流入路上の少な
くとも一つの位置で行なわれる逐次注入として複数の異
なったプラグを注入するように配置されており、かつ前
記装置が前記それぞれのプラグを逐次注入するように前
記注入を制御する手段を含んでいることを特徴とするク
ロマトグラフィー装置。 - 【請求項９】前記カラムおよび前記流すための手段が、
前記溶離流体の体積の流れが前記カラムを5000を超える
換算速度で通過するように形成されている請求項７また
は８記載のクロマトグラフィー装置。 - 【請求項１０】前記注入手段が、前記カラムを通過する
前記プラグに、前記カラムの縦軸に対して実質的に直角
に延びる実質的に平らな前面を与えている請求項７〜９
のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。 - 【請求項１１】前記注入手段が、前記カラムを通過する
前記プラグに、前記カラムの縦軸に対して実質的に直角
に延びる実質的に平らな後面を与えている請求項７〜10
のいずれか１項に記載のクロマトグラフィー装置。 - 【請求項１２】前記注入器が、該流入路に沿って空間的
に分離した各位置で複数の異なったプラグを注入するよ
うに配置されている請求項８記載のクロマトグラフィー
装置。 - 【請求項１３】溶離流体および混合物の前記プラグの注
入をサイクル的に反復するための手段を含んでいる請求
項７または８記載のクロマトグラフィー装置。 - 【請求項１４】前記注入のサイクル的反復の間に前記カ
ラムを通して平衡化流体の所定体積を流すための手段を
含んでいる請求項13記載のクロマトグラフィー装置。 - 【請求項１５】前記注入手段が、少なくとも前記流入路
上の空間的に分離した第一位置および第二位置に前記プ
ラグをそれぞれ注入するように接続された第一注入器お
よび第二注入器、ならびに少なくとも第三および第四の
空間的に分離した位置に前記プラグをそれぞれ注入する
ように接続された第三注入器および第四注入器を含み、
前記装置が、前記第一位置および第二位置における前記
第一注入器および第二注入器による前記各プラグの注入
と、前記第三位置および第四位置における前記第三注入
器および第四注入器による前記各プラグの注入とをサイ
クル的に交互に行うように、前記注入器による注入を制
御するための手段を含んでいる請求項13記載のクロマト
グラフィー装置。 - 【請求項１６】前記第三位置および第四位置が、前記第
一位置および第二位置と同じである請求項15記載のクロ
マトグラフィー装置。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US58887496A | 1996-01-19 | 1996-01-19 | |
| US2721696P | 1996-09-30 | 1996-09-30 | |
| US60/027,216 | 1996-09-30 | ||
| US08/588,874 | 1996-09-30 | ||
| PCT/US1997/001096 WO1997026532A1 (en) | 1996-01-19 | 1997-01-21 | High performance liquid chromatography method and apparatus |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| JP3452936B2 true JP3452936B2 (ja) | 2003-10-06 |
Family
ID=26702215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52630597A Expired - Lifetime JP3452936B2 (ja) | 1996-01-19 | 1997-01-21 | 高速液体クロマトグラフィー法および装置 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5795469A (ja) |
| EP (1) | EP0840893B1 (ja) |
| JP (1) | JP3452936B2 (ja) |
| AT (1) | ATE184702T1 (ja) |
| AU (1) | AU712735B2 (ja) |
| CA (1) | CA2242885C (ja) |
| DE (1) | DE69700523T2 (ja) |
| DK (1) | DK0840893T3 (ja) |
| ES (1) | ES2140209T3 (ja) |
| NZ (1) | NZ330867A (ja) |
| PL (1) | PL327920A1 (ja) |
| WO (1) | WO1997026532A1 (ja) |
Families Citing this family (78)
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