JP3421855B2 - 微生物，調製法，および，用途 - Google Patents
微生物，調製法，および，用途Info
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- streptomyces
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- streptogramin
- antibiotic
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K11/00—Depsipeptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
- C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新しい微生物、それらを調製するための方
法、および、それらの用途に関する。より特別には、本
発明は、抗生物質を産生する微生物に関する。
法、および、それらの用途に関する。より特別には、本
発明は、抗生物質を産生する微生物に関する。
従来の技術において記載されている多くの抗生物質の
内、幾つかのものは互いに相乗的に作用する数種の活性
成分からなるという特徴を保持している。特に、マクロ
ラクトン（macrolactone）（グループＡの成分）および
デプシペプチド（depsipeptide）（グループＢの成分）
から成るストレプトグラミン（streptogramin）一族の
抗生物質に関してはこのことが該当する。抗生物質の活
性、および、それらの抗生物質の作用形式は研究の主題
とされており、特に、Tanaka（Antibiotics,vol.III
p.487,Springer,Berlin（1975））、および、Vasquez
（Antibiotics,vol.III p.521,Springer,Berlin（197
5））によってこのような研究が行われている。グルー
プＡおよびＢの分子の一般的な構造を図１および２に示
す。
内、幾つかのものは互いに相乗的に作用する数種の活性
成分からなるという特徴を保持している。特に、マクロ
ラクトン（macrolactone）（グループＡの成分）および
デプシペプチド（depsipeptide）（グループＢの成分）
から成るストレプトグラミン（streptogramin）一族の
抗生物質に関してはこのことが該当する。抗生物質の活
性、および、それらの抗生物質の作用形式は研究の主題
とされており、特に、Tanaka（Antibiotics,vol.III
p.487,Springer,Berlin（1975））、および、Vasquez
（Antibiotics,vol.III p.521,Springer,Berlin（197
5））によってこのような研究が行われている。グルー
プＡおよびＢの分子の一般的な構造を図１および２に示
す。
ストレプトグラミン一族の既知の抗生物質の中でも、
より特別には、 −プリスティナマイシン（pristinamycin）、 −ミカマイシン（mikamycin）、 −バージニアマイシン（virginiamycin）、 −ベルナマイシン（vernamycin）、 −オステログリシン（ostreogrycin）、 −シネルギスチン（synergistin）、 −プローラシン（plauracin）、 −エタマイシン（etamycin）、 −ストレプトグラミン（streptogramin） −ビリドグリゼイン（viridogrisein）、 −グリセオビリジン（griseoviridin）、もしくは、 −ネオビリドグリゼイン（neoviridogrisein）、を挙げ
ることができる。
より特別には、 −プリスティナマイシン（pristinamycin）、 −ミカマイシン（mikamycin）、 −バージニアマイシン（virginiamycin）、 −ベルナマイシン（vernamycin）、 −オステログリシン（ostreogrycin）、 −シネルギスチン（synergistin）、 −プローラシン（plauracin）、 −エタマイシン（etamycin）、 −ストレプトグラミン（streptogramin） −ビリドグリゼイン（viridogrisein）、 −グリセオビリジン（griseoviridin）、もしくは、 −ネオビリドグリゼイン（neoviridogrisein）、を挙げ
ることができる。
これらの抗生物質の各々のものの活性形態は、図１に
おいて示されるグループＡに属する分子と、図２におい
て示されるグループＢに属する分子、もしくは、各々に
関連する分子の相乗的な組み合わせから成る。
おいて示されるグループＡに属する分子と、図２におい
て示されるグループＢに属する分子、もしくは、各々に
関連する分子の相乗的な組み合わせから成る。
関連する分子とは、本発明に用いられる意味において
は、図１および２において示される分子の一般的な骨格
であって、置換もしくは他の二次的な変化により後者の
分子とは異なる一般的な骨格を保持し、かつ、同じ性質
の活性を保持する分子を意味することを了解事項とす
る。
は、図１および２において示される分子の一般的な骨格
であって、置換もしくは他の二次的な変化により後者の
分子とは異なる一般的な骨格を保持し、かつ、同じ性質
の活性を保持する分子を意味することを了解事項とす
る。
ストレプトグラミン一族の抗生物質は、広範囲にわた
る多様な微生物により産生され、特に、アクチノミセス
（Actinomyces）属の細菌および特定の真菌類により産
生される。これらの微生物は、成分ＡおよびＢの両方を
同時に合成するという特徴を有する。
る多様な微生物により産生され、特に、アクチノミセス
（Actinomyces）属の細菌および特定の真菌類により産
生される。これらの微生物は、成分ＡおよびＢの両方を
同時に合成するという特徴を有する。
表１は、産生を行う主な微生物を、相関する抗生物質
と共に列挙してある。
と共に列挙してある。
これらの微生物の産生レベルを増加させるという目的
で幾つかの研究が行われている。特に、培養条件の改
善、および、S.バージニアエ（S.virginiae）によるバ
ージニアマイシンの産生レベルにおける突然変異原性作
用物質の効果に関する、Biot（Biotechnology of Ind
ustrial Antibiotics,vol.22（1984） p.695）、もし
くは、Prikrylova et al.（Biotyechnology and Bi
oindustry/２（1988） 20）による研究を挙げることが
できる。それらの著者たちが述べているように、取得さ
れる過剰産生性変異体は、常に成分ＡとＢとを同時に産
生する。
で幾つかの研究が行われている。特に、培養条件の改
善、および、S.バージニアエ（S.virginiae）によるバ
ージニアマイシンの産生レベルにおける突然変異原性作
用物質の効果に関する、Biot（Biotechnology of Ind
ustrial Antibiotics,vol.22（1984） p.695）、もし
くは、Prikrylova et al.（Biotyechnology and Bi
oindustry/２（1988） 20）による研究を挙げることが
できる。それらの著者たちが述べているように、取得さ
れる過剰産生性変異体は、常に成分ＡとＢとを同時に産
生する。
しかしながら、従来の技術において取得することが可
能である、ストレプトグラミンを産生する微生物が、抗
生物質の相乗的な成分ＡおよびＢの両方を同時に同じ発
酵培地内において合成するという事実は、幾つかの事例
においてはかなり大きな欠点となってしまう。
能である、ストレプトグラミンを産生する微生物が、抗
生物質の相乗的な成分ＡおよびＢの両方を同時に同じ発
酵培地内において合成するという事実は、幾つかの事例
においてはかなり大きな欠点となってしまう。
実際に、これらの抗生物質の用途を最良のものにさせ
るため、かつ、薬剤学的作用物質としてそれらを使用す
ることを可能にするためには、ストレプトグラミンのＡ
とＢの成分の分離および精製が可能であることが好まし
い。このことは、ストレプトグラミンについての化学的
研究、特に、例えば、フランス特許第2,549,063号、フ
ランス特許第2,549,065号、欧州特許第191,662号、もし
くは、欧州特許第248,703号において記載されているも
ののような特に、半合成誘導体を調製するという目的を
有する、ストレプトグラミンについての化学的研究を実
行可能にさせる目的においても必要不可欠である。
るため、かつ、薬剤学的作用物質としてそれらを使用す
ることを可能にするためには、ストレプトグラミンのＡ
とＢの成分の分離および精製が可能であることが好まし
い。このことは、ストレプトグラミンについての化学的
研究、特に、例えば、フランス特許第2,549,063号、フ
ランス特許第2,549,065号、欧州特許第191,662号、もし
くは、欧州特許第248,703号において記載されているも
ののような特に、半合成誘導体を調製するという目的を
有する、ストレプトグラミンについての化学的研究を実
行可能にさせる目的においても必要不可欠である。
しかしながら、特に、それらが同時に産生され、か
つ、それらの物理化学的性質が類似しているがために、
これらの異なる成分を獲得するという試みは困難なもの
になっている。その上、これらの微生物は一般的に、各
成文につき数種の異なる分子を合成する結果、発酵液中
に多くの成分の混合物を生じ、しかもその割合はかなり
変動することがある。実際に、ストレプトグラミンのグ
ループＡおよびＢに属し、非常に異なった生物学的活性
を有し、かつ、それらの微生物により同時に産生される
という多くの分子が、現在のところ知られている。従っ
て、グループＡに属する以下に示す分子が従来の技術に
おいて知られており、それらは、プリスティナマイシン
PIIAおよびPIIB、バージニアマイシン M1およびM2、
ミカマイシン Ａ、あるいは、オステログリシン Ａお
よびＧである。同様に、グループＢに属する以下に示す
分子が従来の技術において知られており、それらは、プ
リスティナマイシン PIA、PIB、および、PIC、バージ
ニアマイシン S1、S2、S3、S4、および、S5、ミカマイ
シン Ｂ、ベルナマイシンのＢα、Ｂβ、Ｂγ、およ
び、Ｂδ、オステログリシン Ｂ、B1、B2、および、B
3、あるいは、ネオビリドグリゼイン Ｉ、II、III、お
よび、IVである。
つ、それらの物理化学的性質が類似しているがために、
これらの異なる成分を獲得するという試みは困難なもの
になっている。その上、これらの微生物は一般的に、各
成文につき数種の異なる分子を合成する結果、発酵液中
に多くの成分の混合物を生じ、しかもその割合はかなり
変動することがある。実際に、ストレプトグラミンのグ
ループＡおよびＢに属し、非常に異なった生物学的活性
を有し、かつ、それらの微生物により同時に産生される
という多くの分子が、現在のところ知られている。従っ
て、グループＡに属する以下に示す分子が従来の技術に
おいて知られており、それらは、プリスティナマイシン
PIIAおよびPIIB、バージニアマイシン M1およびM2、
ミカマイシン Ａ、あるいは、オステログリシン Ａお
よびＧである。同様に、グループＢに属する以下に示す
分子が従来の技術において知られており、それらは、プ
リスティナマイシン PIA、PIB、および、PIC、バージ
ニアマイシン S1、S2、S3、S4、および、S5、ミカマイ
シン Ｂ、ベルナマイシンのＢα、Ｂβ、Ｂγ、およ
び、Ｂδ、オステログリシン Ｂ、B1、B2、および、B
3、あるいは、ネオビリドグリゼイン Ｉ、II、III、お
よび、IVである。
これらの理由のために、活性を有しかつ薬剤学的に容
認される相乗的なストレプトグラミンの混合物を、産業
的なレベルでにおいて満足できる状態で取得することは
困難である。ストレプトグラミンについての化学的研究
（構造−機能の関連性、水可溶形態の開発、等）を実行
するのもやはり困難である。本発明は、当該技術分野に
おける従来の技術の欠点を改善することを可能にする。
認される相乗的なストレプトグラミンの混合物を、産業
的なレベルでにおいて満足できる状態で取得することは
困難である。ストレプトグラミンについての化学的研究
（構造−機能の関連性、水可溶形態の開発、等）を実行
するのもやはり困難である。本発明は、当該技術分野に
おける従来の技術の欠点を改善することを可能にする。
そこで、本出願者は、安定な方法において成分Ａおよ
びＢを別々に産生する微生物を取得することができるこ
とを証明した。従って、本出願者は、ストレプトグラミ
ンの成分ＡおよびＢを選択的に産生することが可能な微
生物を開発し、そして、これは本発明の目的となってい
る。本発明は、ストレプトグラミンのグループＡの分
子、もしくは、ストレプトグラミンのグループＢの分子
を選択的に産生することができる微生物、およびに、こ
れらのグループの内の一つに対して特異的な分子を選択
的に産生することができる微生物の両方に関する。
びＢを別々に産生する微生物を取得することができるこ
とを証明した。従って、本出願者は、ストレプトグラミ
ンの成分ＡおよびＢを選択的に産生することが可能な微
生物を開発し、そして、これは本発明の目的となってい
る。本発明は、ストレプトグラミンのグループＡの分
子、もしくは、ストレプトグラミンのグループＢの分子
を選択的に産生することができる微生物、およびに、こ
れらのグループの内の一つに対して特異的な分子を選択
的に産生することができる微生物の両方に関する。
従って、本発明は、大容量でのストレプトグラミンの
ＡもしくはＢの別々の産生を可能にする。
ＡもしくはＢの別々の産生を可能にする。
本発明はまた、より単純であり、従って、より効果が
高く、かつ、より経済的であるストレプトグラミンの精
製のための方法を使用することを可能にもするが、それ
は、抽出を行う際に、異なる成分との間の相互作がもは
や存在しない、もしくは、そのような相互作用がより少
ないためである。
高く、かつ、より経済的であるストレプトグラミンの精
製のための方法を使用することを可能にもするが、それ
は、抽出を行う際に、異なる成分との間の相互作がもは
や存在しない、もしくは、そのような相互作用がより少
ないためである。
本発明はまた、混合物中における成分ＡおよびＢの各
々の量を変化させることを可能にし、従って、純度およ
び相乗的効果の両方の点において至適である抗生物質組
成物を産生することこを可能にもする。
々の量を変化させることを可能にし、従って、純度およ
び相乗的効果の両方の点において至適である抗生物質組
成物を産生することこを可能にもする。
本発明はまた、充分な量および純度の産物を取得し
て、ストレプトグラミンの特徴ををさらに改善する目的
における化学的研究を行うことを可能にもする。
て、ストレプトグラミンの特徴ををさらに改善する目的
における化学的研究を行うことを可能にもする。
従って、本発明は、ストレプトグラミンの産生のため
の系を提供し、この系により、これらの抗生物質のずっ
と有効な工業的開発が可能となる。
の系を提供し、この系により、これらの抗生物質のずっ
と有効な工業的開発が可能となる。
より特別には、本発明は、プリスティナマイシン、バ
ージニアマイシン、ミカマイシン、オステログリシン、
シネルギスチン、ビリドグリゼイン、ベルナマイシン、
プローレーシン、エタマイシン、グリゼオビリジン、ネ
オビリドグリゼイン、および、ストレプトグラミンをふ
くんでなるグループより選択されるストレプトグラミン
の成分ＡおよびＢを選択的に産生することができる微生
物に関する。
ージニアマイシン、ミカマイシン、オステログリシン、
シネルギスチン、ビリドグリゼイン、ベルナマイシン、
プローレーシン、エタマイシン、グリゼオビリジン、ネ
オビリドグリゼイン、および、ストレプトグラミンをふ
くんでなるグループより選択されるストレプトグラミン
の成分ＡおよびＢを選択的に産生することができる微生
物に関する。
ある好ましい態様においては、本発明は、図１におい
て示される一般式に相当する、ストレプトグラミンの成
分Ａを選択的に産生することができる微生物に関し、式
中、 −Ｙは、Ｄ−プロリン、4,5−ジヒドロプロリン、Ｄ−
アラニン、あるいは、Ｄ−システインを意味し、 −R0は、Ｃ＝ＯもしくはCHOH基を意味し、 −R1は、水素原子、あるいは、メチル基であり、 −R2は、水素原子、あるいは、メチル基であり、 かつ、 −R3は、メチルもしくはイソプロピル基である。
て示される一般式に相当する、ストレプトグラミンの成
分Ａを選択的に産生することができる微生物に関し、式
中、 −Ｙは、Ｄ−プロリン、4,5−ジヒドロプロリン、Ｄ−
アラニン、あるいは、Ｄ−システインを意味し、 −R0は、Ｃ＝ＯもしくはCHOH基を意味し、 −R1は、水素原子、あるいは、メチル基であり、 −R2は、水素原子、あるいは、メチル基であり、 かつ、 −R3は、メチルもしくはイソプロピル基である。
他の好ましい態様においては、本発明は、図２（ａ）
において示される一般式に相当する、ストレプグラミン
の成分Ｂを選択的に産生することができる微生物に関
し、式中、 −Ｚは、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸、ピペコリ
ン酸、４−オキソピペリコン酸、４−ヒドロキシ−Ｌ−
ピペリコン酸、あるいは、５−ヒドロキシ−４−オキソ
−Ｌ−ピペコリン酸を意味し、 −R4は、水素原子、あるいは、式NH（CH3）もしくはＮ
（CH3）２のアミンであり、 −R5は、水素原子、あるいは、メチル基であり、 かつ、 −R6は、メチルもしくはエチル基である。
において示される一般式に相当する、ストレプグラミン
の成分Ｂを選択的に産生することができる微生物に関
し、式中、 −Ｚは、Ｌ−プロリン、Ｌ−アスパラギン酸、ピペコリ
ン酸、４−オキソピペリコン酸、４−ヒドロキシ−Ｌ−
ピペリコン酸、あるいは、５−ヒドロキシ−４−オキソ
−Ｌ−ピペコリン酸を意味し、 −R4は、水素原子、あるいは、式NH（CH3）もしくはＮ
（CH3）２のアミンであり、 −R5は、水素原子、あるいは、メチル基であり、 かつ、 −R6は、メチルもしくはエチル基である。
さらに、ある好ましい態様においては、本発明は、図
２（ｂ）において示される一般式に相当する、ストレプ
グラミンの成分Ｂを選択的に産生することができる微生
物に関し、式中、 −R7は、水素原子、あるいは、ヒドロキシ基を意味し、 かつ、 −R8は、メチルもしくはエチル基を意味する。
２（ｂ）において示される一般式に相当する、ストレプ
グラミンの成分Ｂを選択的に産生することができる微生
物に関し、式中、 −R7は、水素原子、あるいは、ヒドロキシ基を意味し、 かつ、 −R8は、メチルもしくはエチル基を意味する。
本発明は、より好ましくは、プリスティナマイシン、
バージニアマイシン、オステログリシン、および、ミカ
マイシンを含んでなるグループから選択されるストレプ
トグラミンの成分ＡもしくはＢを単独もしくは混合させ
た状態で、選択的に産生することができる微生物に関す
る。
バージニアマイシン、オステログリシン、および、ミカ
マイシンを含んでなるグループから選択されるストレプ
トグラミンの成分ＡもしくはＢを単独もしくは混合させ
た状態で、選択的に産生することができる微生物に関す
る。
一例として、本発明は、式中、R0はＣ＝Ｏ基を意味
し、R1はメチル基を意味し、R2はメチル基を意味し、R3
はイソプロピル基を意味し、かつ、ＹはＤ−プロリンあ
るいは4,5−ジヒドロプロリンを意味する、図１におい
て示される一般式に相当するストレプトグラミンの成分
Ａを選択的に産生することができる微生物、およびに、
式中、 −R4は式Ｎ（CH3）２のアミンであり、R5はメチル基で
あり、R6はエチル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペ
コリン酸を意味し、あるいは、 −R4は式NHCH3のアミンであり、R5はメチル基であり、R
6はエチル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペコリン
酸を意味し、あるいは、 −R4は式Ｎ（CH3）２のアミンであり、R5はメチル基で
あり、R6はメチル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペ
コリン酸を意味し、あるいは、 −R4は式Ｎ（CH3）２のアミンであり、R5はメチル基で
あり、R6はエチル基であり、かつ、Ｚは５−ヒドロキシ
−４−オキソ−Ｌ−ピペコリン酸を意味し、あるいは、 −R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、R6はエチ
ル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペコリン酸を意味
し、あるいは、 −R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、R6はメチ
ル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペコリン酸を意味
し、あるいは、 −R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、R6はエチ
ル基であり、かつ、Ｚは５−ヒドロキシ−４−オキソ−
Ｌ−ピペコリン酸を意味し、あるいは、 −R4は、水素原子であり、R5は水素原子であり、R6はエ
チル基であり、かつ、Ｚは４−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコ
リン酸を意味する、図２（ａ）において示される一般式
に相当するストレプトグラミンの成分Ｂを選択的に産生
することができる微生物にも関する。
し、R1はメチル基を意味し、R2はメチル基を意味し、R3
はイソプロピル基を意味し、かつ、ＹはＤ−プロリンあ
るいは4,5−ジヒドロプロリンを意味する、図１におい
て示される一般式に相当するストレプトグラミンの成分
Ａを選択的に産生することができる微生物、およびに、
式中、 −R4は式Ｎ（CH3）２のアミンであり、R5はメチル基で
あり、R6はエチル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペ
コリン酸を意味し、あるいは、 −R4は式NHCH3のアミンであり、R5はメチル基であり、R
6はエチル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペコリン
酸を意味し、あるいは、 −R4は式Ｎ（CH3）２のアミンであり、R5はメチル基で
あり、R6はメチル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペ
コリン酸を意味し、あるいは、 −R4は式Ｎ（CH3）２のアミンであり、R5はメチル基で
あり、R6はエチル基であり、かつ、Ｚは５−ヒドロキシ
−４−オキソ−Ｌ−ピペコリン酸を意味し、あるいは、 −R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、R6はエチ
ル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペコリン酸を意味
し、あるいは、 −R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、R6はメチ
ル基であり、かつ、Ｚは４−オキソピペコリン酸を意味
し、あるいは、 −R4は水素原子であり、R5はメチル基であり、R6はエチ
ル基であり、かつ、Ｚは５−ヒドロキシ−４−オキソ−
Ｌ−ピペコリン酸を意味し、あるいは、 −R4は、水素原子であり、R5は水素原子であり、R6はエ
チル基であり、かつ、Ｚは４−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコ
リン酸を意味する、図２（ａ）において示される一般式
に相当するストレプトグラミンの成分Ｂを選択的に産生
することができる微生物にも関する。
本発明の微生物は、主に、アクチノミセス（Actinomy
ces）属もしくは真菌類の細菌であることが好ましい。
ces）属もしくは真菌類の細菌であることが好ましい。
本発明の微生物はストレプトミセス（Streptomyces）
属に属することがさらにより好ましい。
属に属することがさらにより好ましい。
本発明の微生物は、標準的な好気的発酵条件下におい
て培養することができる。特に、栄養培地は、一般的
に、炭素源、窒素源、および無機塩類からなる。炭素源
としては、糖類、油脂類、有機酸類、デキストリン、デ
ンプン類、グリセロール、および、その他のものを特に
使用することができる。窒素源としては、アミノ酸、抽
出物類（麦芽、大豆、綿実、トマト、トウモロコシ、お
よび、その他のもの）、およびに、植物のひき割り粉、
内蔵、雑多な加水分解物類（カゼイン、イースト、およ
び、その類いのもの）、およびに、「デステイラルソル
ブル」のような工業的副産物類を挙げることができる。
無機物源としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウ
ム、もしくは、カルシウムの塩化物塩、硝酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、および、リン酸塩、あるいは、マグネシウ
ム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、もしくは、コバルトのよ
うな微量元素を挙げることができる。
て培養することができる。特に、栄養培地は、一般的
に、炭素源、窒素源、および無機塩類からなる。炭素源
としては、糖類、油脂類、有機酸類、デキストリン、デ
ンプン類、グリセロール、および、その他のものを特に
使用することができる。窒素源としては、アミノ酸、抽
出物類（麦芽、大豆、綿実、トマト、トウモロコシ、お
よび、その他のもの）、およびに、植物のひき割り粉、
内蔵、雑多な加水分解物類（カゼイン、イースト、およ
び、その類いのもの）、およびに、「デステイラルソル
ブル」のような工業的副産物類を挙げることができる。
無機物源としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウ
ム、もしくは、カルシウムの塩化物塩、硝酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、および、リン酸塩、あるいは、マグネシウ
ム、鉄、銅、亜鉛、マンガン、もしくは、コバルトのよ
うな微量元素を挙げることができる。
本発明の微生物は、ストレプトグラミンの非選択的産
生体である微生物から取得されることが好ましい。
生体である微生物から取得されることが好ましい。
非選択的微生物とは、本発明において用いられる意味
においては、ストレプトグラミンの成分ＡおよびＢを同
時に合成する微生物を意味することを了解事項とする。
表１において列挙されている微生物すべては、本発明に
おいて用いられる意味においては非選択的微生物とな
る。そこで、本出願者は、ストレプトグラミンの選択的
産生体である微生物を、ストレプトグラミンを産生する
非選択的微生物から取得することができるということを
示した。この目標のために、最初の随意の突然変異誘発
の段階、およびそれに続く選択の段階を伴う新しい処理
法を開発した。
においては、ストレプトグラミンの成分ＡおよびＢを同
時に合成する微生物を意味することを了解事項とする。
表１において列挙されている微生物すべては、本発明に
おいて用いられる意味においては非選択的微生物とな
る。そこで、本出願者は、ストレプトグラミンの選択的
産生体である微生物を、ストレプトグラミンを産生する
非選択的微生物から取得することができるということを
示した。この目標のために、最初の随意の突然変異誘発
の段階、およびそれに続く選択の段階を伴う新しい処理
法を開発した。
従って、本発明の他の目的は、先に定義した微生物を
調製するための方法に関し、この方法に従って以下に示
す、 −突然変異誘発をストレプトグラミンの非選択的産生体
である微生物において行う最初の随意の段階、および
に、 −選択的な微生物を選択する第二の段階、 という段階を実行する。
調製するための方法に関し、この方法に従って以下に示
す、 −突然変異誘発をストレプトグラミンの非選択的産生体
である微生物において行う最初の随意の段階、および
に、 −選択的な微生物を選択する第二の段階、 という段階を実行する。
先に記載したように、非選択的微生物は一般的にアク
チノミセス属の菌種および真菌類を含んでなるグループ
に属する。本発明の方法において使用することができる
出発用微生物は、プリスティナマイシン、バージニアマ
イシン、ミカマイシン、オステログリシン、シネルギス
チン、ビリドグリゼイン、ベルナマイシン、プローレー
シン、エタマイシン、ネオビリドグリゼイン、グリゼオ
ビリジン、および、ストレプトグラミンを含んでなるグ
ループより選択されるストレプトグラミンの非選択的産
生体であることがより好ましい。一例として、表１にお
いて列挙されている微生物が、本発明の方法において使
用することができる非選択的微生物となる。本発明は、
ストレプトミセス アルボレクタス（Streptomyces al
borectus）、ストレプトミセス ジアスタティクス（St
reptomyces diastaticus）、ストレプトミセス グラ
ミノファシエンス（Streptomyces graminofaciens）、
ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseu
s）、ストレプトミセス ロイデンシス（Streptomyces
loidensis）、ストレプトミセス ミタカエンシス（S
treptomyces mitakaensis）、ストレプトミセス オリ
バセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトミ
セス オステログリゼウス（Streptomyces ostreogris
eus）、ストレプトミセス プリスティナエスピラリス
（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトミ
セス バージニアエ（Streptomyces virginiae）、ス
トレプトミセス ラベンデゥーラエ（Streptomyces la
vendulae）、ストレプトミセス グリセオビリドゥス
（Streptomyces giriseoviridus）、ミクロモノスポラ
エスピー（Micromonospora sp.）、アクチノミセス
アウランティコーラー（Actinomyces auranticolo
r）、アクチノミセス ダグヘスタニクス（Actinomyces
daghestanicus）、および、アクチノミセス アズレ
ウス（Actinomyces azureus）から選択される微生物を
使用して実行することがさらにより好ましい。
チノミセス属の菌種および真菌類を含んでなるグループ
に属する。本発明の方法において使用することができる
出発用微生物は、プリスティナマイシン、バージニアマ
イシン、ミカマイシン、オステログリシン、シネルギス
チン、ビリドグリゼイン、ベルナマイシン、プローレー
シン、エタマイシン、ネオビリドグリゼイン、グリゼオ
ビリジン、および、ストレプトグラミンを含んでなるグ
ループより選択されるストレプトグラミンの非選択的産
生体であることがより好ましい。一例として、表１にお
いて列挙されている微生物が、本発明の方法において使
用することができる非選択的微生物となる。本発明は、
ストレプトミセス アルボレクタス（Streptomyces al
borectus）、ストレプトミセス ジアスタティクス（St
reptomyces diastaticus）、ストレプトミセス グラ
ミノファシエンス（Streptomyces graminofaciens）、
ストレプトミセス グリセウス（Streptomyces griseu
s）、ストレプトミセス ロイデンシス（Streptomyces
loidensis）、ストレプトミセス ミタカエンシス（S
treptomyces mitakaensis）、ストレプトミセス オリ
バセウス（Streptomyces olivaceus）、ストレプトミ
セス オステログリゼウス（Streptomyces ostreogris
eus）、ストレプトミセス プリスティナエスピラリス
（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトミ
セス バージニアエ（Streptomyces virginiae）、ス
トレプトミセス ラベンデゥーラエ（Streptomyces la
vendulae）、ストレプトミセス グリセオビリドゥス
（Streptomyces giriseoviridus）、ミクロモノスポラ
エスピー（Micromonospora sp.）、アクチノミセス
アウランティコーラー（Actinomyces auranticolo
r）、アクチノミセス ダグヘスタニクス（Actinomyces
daghestanicus）、および、アクチノミセス アズレ
ウス（Actinomyces azureus）から選択される微生物を
使用して実行することがさらにより好ましい。
本発明の方法は、ストレプトミセス アルボレクタ
ス、ストレプトミセス ミタカエンシス、ストレプトミ
セス プリスティナエスピラリス、ストレプトミセス
オステログリセウス、および、ストレプトミセス バー
ジニアエから選択される微生物を使用して実行するのが
さらにより好ましい。
ス、ストレプトミセス ミタカエンシス、ストレプトミ
セス プリスティナエスピラリス、ストレプトミセス
オステログリセウス、および、ストレプトミセス バー
ジニアエから選択される微生物を使用して実行するのが
さらにより好ましい。
本方法の第一段階は、抗生物質の産生のための総体的
な能力を増加させるように、そして／または、ストレプ
トグラミンの２つの成分のうちの一つのみを合成するよ
うに、非選択的微生物を変性することにある。これは、
遺伝子的変性（例えば、生合成の回路に関連する酵素の
ための構造遺伝子、もしくは、そのような構造遺伝子の
発現を可能にさせる配列における突然変異）、あるい
は、生化学的変性（翻訳後のメカニズムの変性、フィー
ドバック阻害メカニズムの変更、および、その類いのも
の）により行うことができる。この目的のために、突然
変異誘発の様々な手段を使用することができ、特に、 −物理学的作用物質であるＸ−線、紫外線、 あるいは、 −次に示すもののような化学的作用物質、 ・メタンスルフォン酸エチル（EMS）、Ｎ−メチル−N'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Delic et al.
Mutation Res.9（1970）167−182）、もしくは、４−
ニトロキノリンの１−オキシド（NQO）のようなアルキ
ル化剤、 ・ビアルキル化剤、 ・インターカレーション剤、あるいは、 −DNA、および特に、トランスポゾン、組込み用プラス
ミド、ファージ、もしくは、プロファージ内への突然変
異を伴う挿入の任意の系、あるいは、別の方法として、 −プロトプラストの融合（Cohen,Nature 268（1977）1
71−174）、 を使用することができる。
な能力を増加させるように、そして／または、ストレプ
トグラミンの２つの成分のうちの一つのみを合成するよ
うに、非選択的微生物を変性することにある。これは、
遺伝子的変性（例えば、生合成の回路に関連する酵素の
ための構造遺伝子、もしくは、そのような構造遺伝子の
発現を可能にさせる配列における突然変異）、あるい
は、生化学的変性（翻訳後のメカニズムの変性、フィー
ドバック阻害メカニズムの変更、および、その類いのも
の）により行うことができる。この目的のために、突然
変異誘発の様々な手段を使用することができ、特に、 −物理学的作用物質であるＸ−線、紫外線、 あるいは、 −次に示すもののような化学的作用物質、 ・メタンスルフォン酸エチル（EMS）、Ｎ−メチル−N'
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Delic et al.
Mutation Res.9（1970）167−182）、もしくは、４−
ニトロキノリンの１−オキシド（NQO）のようなアルキ
ル化剤、 ・ビアルキル化剤、 ・インターカレーション剤、あるいは、 −DNA、および特に、トランスポゾン、組込み用プラス
ミド、ファージ、もしくは、プロファージ内への突然変
異を伴う挿入の任意の系、あるいは、別の方法として、 −プロトプラストの融合（Cohen,Nature 268（1977）1
71−174）、 を使用することができる。
これらの手段の各々を、胞子の状態、すなわち、既に
萌芽しているもしくは萌芽途中である胞子の状態にある
非選択的微生物、あるいは、菌糸体に対して応用するこ
とができる。その上、これらの様々な手段を組み合わせ
て使用することもできる。
萌芽しているもしくは萌芽途中である胞子の状態にある
非選択的微生物、あるいは、菌糸体に対して応用するこ
とができる。その上、これらの様々な手段を組み合わせ
て使用することもできる。
幾つかの好ましい突然変異計画に着手して所期の選択
的微生物の形成をもたらすことができるが、当業者は、
使用する出発微生物、所期のストレプトグラミン、およ
び、設定する目標（所期の成分の合成速度の増加、後者
の産生レベルの増加、微生物による出発物質の消費の減
少、および、その類いのもの）に従って、これらの突然
変異誘発段階を応用することができることを了解事項と
する。これらの条件下において、本発明は、厳密な突然
変異計画に限定されるのではなく、非選択的微生物から
ストレプトグラミンの一つの成分を選択的に産生するこ
とができる微生物を取得することを可能にするすべての
操作（ランダムなものもしくは特異的なもの）にまで及
ぶのである。
的微生物の形成をもたらすことができるが、当業者は、
使用する出発微生物、所期のストレプトグラミン、およ
び、設定する目標（所期の成分の合成速度の増加、後者
の産生レベルの増加、微生物による出発物質の消費の減
少、および、その類いのもの）に従って、これらの突然
変異誘発段階を応用することができることを了解事項と
する。これらの条件下において、本発明は、厳密な突然
変異計画に限定されるのではなく、非選択的微生物から
ストレプトグラミンの一つの成分を選択的に産生するこ
とができる微生物を取得することを可能にするすべての
操作（ランダムなものもしくは特異的なもの）にまで及
ぶのである。
具体的な実施例として、メタンスルフォン酸エチルの
存在下における、あるいは、UVでの処理による突然変異
誘発により良好な結果が得られる。
存在下における、あるいは、UVでの処理による突然変異
誘発により良好な結果が得られる。
本方法の第２段階に関しては、この段階は、選択的微
生物を同定および単離することを可能にする。この段階
は、いろいろな方法において行うことができ、特に、微
生物に関する感受性テストの方法により行うことができ
る。この目的のために、ストレプトグラミンのグループ
Ａの成分もしくはグループＢの成分に対して特異的に感
受性を示すいろいろな微生物が存在する。特に、グルー
プＢの成分に対して特異的に感受性を示す、バチルス
スブチリス（Bacillus subtilis）（ATCC6633）、バチ
ルス サーキュランス（Bacillus circulans）、バチ
ルス セレウス（Bacillus cereus）（Watanabe,J.Ant
ibio,Ser.A XIII（１）（1960）62）、もしくは、C.
キセロシス（C. xerosis）（Watanabe、既述）を挙げ
ることができる。また、グループＡの成分に対して特異
的に感受性を示す、ストレプトコックス アガラクティ
アエ B96（Streptococcus agalactiae B96）（Antim
icrob.Agents Chemother.10（５）（1976）795）、ミ
クロコックス ルテウス（Micrococcus luteus）（Pri
krylova、既述）、もしくは、サルキナ ルテア（Sarci
na lutea）（ATCC9341）を挙げることができる。その
上、ストレプトグラミンの両方の成分に対して感受性を
示す微生物内に、ストレプトグラミンの成分の内の一つ
に対する耐性のための遺伝子を挿入することにより、ス
トレプトグラミンの一つの成分に対して特異的に感受性
を示す、人工的な微生物を調製することも可能である。
実際に、これらの遺伝子の幾つかがクローン化されてお
り（Le Goffic et al.,J.Antibio.XXX（８）（197
7）665;Le Goffic et al., Ann.Microbiol.Inst.Pa
steur 128B（1977）471;Solhet al.,Path.Biol.32
（５）（1984）362）、そして、当業者は分子生物学の
標準的な技術を使用して、このような遺伝子をいろいろ
な微生物中に組み入れることができる。この選択段階
は、成分ＡもしくはＢについて特異的である抗体を使用
するELISAにより、あるいは別の方法として、クロマト
グラフィー（液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグ
ラフィー、および、その類いのもの）のような分析的技
術により実行することもできる。微生物に関する感受性
テストの場合においては、それに加え、クロマトグラフ
ィーのアッセイによりその選択が妥当であることを確認
することが好ましい。
生物を同定および単離することを可能にする。この段階
は、いろいろな方法において行うことができ、特に、微
生物に関する感受性テストの方法により行うことができ
る。この目的のために、ストレプトグラミンのグループ
Ａの成分もしくはグループＢの成分に対して特異的に感
受性を示すいろいろな微生物が存在する。特に、グルー
プＢの成分に対して特異的に感受性を示す、バチルス
スブチリス（Bacillus subtilis）（ATCC6633）、バチ
ルス サーキュランス（Bacillus circulans）、バチ
ルス セレウス（Bacillus cereus）（Watanabe,J.Ant
ibio,Ser.A XIII（１）（1960）62）、もしくは、C.
キセロシス（C. xerosis）（Watanabe、既述）を挙げ
ることができる。また、グループＡの成分に対して特異
的に感受性を示す、ストレプトコックス アガラクティ
アエ B96（Streptococcus agalactiae B96）（Antim
icrob.Agents Chemother.10（５）（1976）795）、ミ
クロコックス ルテウス（Micrococcus luteus）（Pri
krylova、既述）、もしくは、サルキナ ルテア（Sarci
na lutea）（ATCC9341）を挙げることができる。その
上、ストレプトグラミンの両方の成分に対して感受性を
示す微生物内に、ストレプトグラミンの成分の内の一つ
に対する耐性のための遺伝子を挿入することにより、ス
トレプトグラミンの一つの成分に対して特異的に感受性
を示す、人工的な微生物を調製することも可能である。
実際に、これらの遺伝子の幾つかがクローン化されてお
り（Le Goffic et al.,J.Antibio.XXX（８）（197
7）665;Le Goffic et al., Ann.Microbiol.Inst.Pa
steur 128B（1977）471;Solhet al.,Path.Biol.32
（５）（1984）362）、そして、当業者は分子生物学の
標準的な技術を使用して、このような遺伝子をいろいろ
な微生物中に組み入れることができる。この選択段階
は、成分ＡもしくはＢについて特異的である抗体を使用
するELISAにより、あるいは別の方法として、クロマト
グラフィー（液体クロマトグラフィー、薄層クロマトグ
ラフィー、および、その類いのもの）のような分析的技
術により実行することもできる。微生物に関する感受性
テストの場合においては、それに加え、クロマトグラフ
ィーのアッセイによりその選択が妥当であることを確認
することが好ましい。
本発明の他の目的は、先に定義した微生物を産生条件
下において培養し、かつ、産生される成分を培養培地か
ら分離するという特徴を有する、ストレプトグラミンの
成分ＡもしくはＢの内の一つを調製するための方法に関
する。ストレプトグラミンの成分ＡおよびＢを、溶媒抽
出の標準的な方法により、発酵液から分離することがで
きる。これは、特に、以下に示される計画に従って実行
することができ、それは、pH約３に酸性化させた後の発
酵液のろ過、ろ液のpH7への中性化、ジクロロエタンで
の抽出、石油エーテルのような貧溶媒による産生される
成分の濃縮および沈殿化、という計画である。それによ
り取得される成分を、その後、クロマトグラフィーのよ
うな既知の方法に従って精製することができる。非選択
的微生物の発酵液からのストレプトグラミンの精製の方
法は刊行物において記載されており、さらに、これらを
本発明に対して応用することができる（特に、Chapin
et al.,J.of Liquid Chromatography 11（11）（19
88）2367;Prinkrylova et al.,Biotechnology and
Bioindustry/２（1988）20;Biot A.Biotechnology of
Industrial Antibiotics,vol.22（1984）p.695、を
参照せよ）。
下において培養し、かつ、産生される成分を培養培地か
ら分離するという特徴を有する、ストレプトグラミンの
成分ＡもしくはＢの内の一つを調製するための方法に関
する。ストレプトグラミンの成分ＡおよびＢを、溶媒抽
出の標準的な方法により、発酵液から分離することがで
きる。これは、特に、以下に示される計画に従って実行
することができ、それは、pH約３に酸性化させた後の発
酵液のろ過、ろ液のpH7への中性化、ジクロロエタンで
の抽出、石油エーテルのような貧溶媒による産生される
成分の濃縮および沈殿化、という計画である。それによ
り取得される成分を、その後、クロマトグラフィーのよ
うな既知の方法に従って精製することができる。非選択
的微生物の発酵液からのストレプトグラミンの精製の方
法は刊行物において記載されており、さらに、これらを
本発明に対して応用することができる（特に、Chapin
et al.,J.of Liquid Chromatography 11（11）（19
88）2367;Prinkrylova et al.,Biotechnology and
Bioindustry/２（1988）20;Biot A.Biotechnology of
Industrial Antibiotics,vol.22（1984）p.695、を
参照せよ）。
特別な態様においては、本発明は、式中、いろいろな
置換基が先に定義されている、図１において示される一
般式のマクロラクトン、あるいは、そのようなマクロラ
クトンの混合物を調製するための方法であって、先に定
義された特異的な微生物を培養し、そして、産生される
産物を培養培地から分離するという特徴を有する方法に
関する。
置換基が先に定義されている、図１において示される一
般式のマクロラクトン、あるいは、そのようなマクロラ
クトンの混合物を調製するための方法であって、先に定
義された特異的な微生物を培養し、そして、産生される
産物を培養培地から分離するという特徴を有する方法に
関する。
他の態様においては、本発明は、式中、いろいろな置
換基が先に定義されている、図２（ａ）において示され
る一般式のデプシペプチド、あるいは、そのようなデプ
シペプチドの混合物を調製するための方法であって、先
に定義された特異的な微生物を培養し、そして、産生さ
れる産物を培養培地から分離するという特徴を有する方
法に関する。
換基が先に定義されている、図２（ａ）において示され
る一般式のデプシペプチド、あるいは、そのようなデプ
シペプチドの混合物を調製するための方法であって、先
に定義された特異的な微生物を培養し、そして、産生さ
れる産物を培養培地から分離するという特徴を有する方
法に関する。
本発明の目的はまた、本発明に従う、選択的に産生を
行う微生物の培養培地から取得する場合の、ストレプト
グラミンの任意の成分Ａにも関する。この成分が、式
中、いろいろな置換基が先に定義されている、図１にお
いて示される一般式のマクロラクトン、あるいは、その
ようなマクロラクトンの混合物であることが好ましい。
行う微生物の培養培地から取得する場合の、ストレプト
グラミンの任意の成分Ａにも関する。この成分が、式
中、いろいろな置換基が先に定義されている、図１にお
いて示される一般式のマクロラクトン、あるいは、その
ようなマクロラクトンの混合物であることが好ましい。
本発明の目的はまた、本発明に従う選択的に産生を行
う微生物の培養培地から取得する場合の、ストレプトグ
ラミンの任意の成分Ｂにも関する。この成分が、式中、
いろいろな置換基が先に定義されている、図２において
示される一般式のデプシペプチド、あるいは、そのよう
なデプシペプチドの混合物であることが好ましい。
う微生物の培養培地から取得する場合の、ストレプトグ
ラミンの任意の成分Ｂにも関する。この成分が、式中、
いろいろな置換基が先に定義されている、図２において
示される一般式のデプシペプチド、あるいは、そのよう
なデプシペプチドの混合物であることが好ましい。
こうして取得されるストレプトグラミンの成分Ａおよ
びＢ（本発明に従う選択的微生物の培養培地からのも
の）を、構造−機能の研究のため、半合成誘導体の産生
のため、あるいは、抗生物質組成物の調製のために使用
することができる。
びＢ（本発明に従う選択的微生物の培養培地からのも
の）を、構造−機能の研究のため、半合成誘導体の産生
のため、あるいは、抗生物質組成物の調製のために使用
することができる。
本発明は以下に示す実施例によってより完全に説明さ
れるものと思われるが、これらの実施例は、説明であっ
てかつ制限ではないものとして配慮すべきものである。
れるものと思われるが、これらの実施例は、説明であっ
てかつ制限ではないものとして配慮すべきものである。
実施例
実施例1:株DS5647からのプリスティナマイシン PIIの
特異的産生体である微生物の調製 本実施例は、突然変異誘発の従来の段階を使用しない
で実行した。
特異的産生体である微生物の調製 本実施例は、突然変異誘発の従来の段階を使用しない
で実行した。
1. 微生物に対する感受性による選択
S. プリスティナエスピラリス DS5647（ATCC25486）
の胞子の懸濁液を、完全アガロース培地（HT培地：ホワ
イトデキストリン 10g;N−Ｚ−アミン タイプＡ 2g;
イーストエキストラクト 1g;ミートエキストラクト 1
g;CoCl2・6H2O 0.02g;バクトアガー 20g;脱塩水、充
分量、１、Pridham,Antibiotic Annual（1956）95
7、を参照せよ）上において、単離された状態のコロニ
ーが得られるように希釈した後、プレート培養を行う。
成長の段階を経た後、これらの単離しているコロニー
を、産生培地（HT培地）で継代培養させる。特定の時期
において、産生されたプリスティナマイシンをアッセイ
する目的で、培地からプラークを回収する。
の胞子の懸濁液を、完全アガロース培地（HT培地：ホワ
イトデキストリン 10g;N−Ｚ−アミン タイプＡ 2g;
イーストエキストラクト 1g;ミートエキストラクト 1
g;CoCl2・6H2O 0.02g;バクトアガー 20g;脱塩水、充
分量、１、Pridham,Antibiotic Annual（1956）95
7、を参照せよ）上において、単離された状態のコロニ
ーが得られるように希釈した後、プレート培養を行う。
成長の段階を経た後、これらの単離しているコロニー
を、産生培地（HT培地）で継代培養させる。特定の時期
において、産生されたプリスティナマイシンをアッセイ
する目的で、培地からプラークを回収する。
1. 1. プリスティナマイシン PIのアッセイ
回収したプラークの一部分を、40mg/のプリスティ
ナマイシン PIIが添加してあるアガロース培地［25g/
のMerieux培地No.2（Merieux ５ 177 １）、20g/
のNaCl、5g/のTAPS緩衝液、pH8.5］上に播き、そし
て、これに、3.6×108個の胞子／のバチルス スブチ
リス ATCC6633を接種する。この培地は、プラークを回
収した当日に、以下に示す方法において調製する。200
−ｍのエーレンマイヤーフラスコ内に分配してあるア
ガロース培地をマイクロ波を使用して溶かし、フラスコ
の内容物の温度を水浴槽中で約50℃にまで引き下げ、そ
の後、緩和に攪拌しながら、温度計を培地に浸して、栄
養培地下で温度を記録する。温度が48℃に達した際、以
下に記載するものを各フラスコの内容物に添加する。
ナマイシン PIIが添加してあるアガロース培地［25g/
のMerieux培地No.2（Merieux ５ 177 １）、20g/
のNaCl、5g/のTAPS緩衝液、pH8.5］上に播き、そし
て、これに、3.6×108個の胞子／のバチルス スブチ
リス ATCC6633を接種する。この培地は、プラークを回
収した当日に、以下に示す方法において調製する。200
−ｍのエーレンマイヤーフラスコ内に分配してあるア
ガロース培地をマイクロ波を使用して溶かし、フラスコ
の内容物の温度を水浴槽中で約50℃にまで引き下げ、そ
の後、緩和に攪拌しながら、温度計を培地に浸して、栄
養培地下で温度を記録する。温度が48℃に達した際、以
下に記載するものを各フラスコの内容物に添加する。
−4mg/mの濃度のプリスティナマイシン PIIの溶液
2m（最終濃度40mg/m）、および、
−20倍に希釈してある、3.6×109個の胞子/mの濃度の
バチルス スブチリス ATCC6633の懸濁液 0.4m（最
終濃度3.6×108個の胞子／）。
バチルス スブチリス ATCC6633の懸濁液 0.4m（最
終濃度3.6×108個の胞子／）。
その培地を緩和に攪拌することにより均質化させ、そ
の後、それを、プレート（NUNC社の「スクリーニング用
プレート」）当たり一つのフラスコの内容物という比率
で、完全に水平となっている表面上に注ぎ入れる。
の後、それを、プレート（NUNC社の「スクリーニング用
プレート」）当たり一つのフラスコの内容物という比率
で、完全に水平となっている表面上に注ぎ入れる。
プレート上にプラーク（プラーク孔の直系:4mm）を堆
積た後、４℃における６時間の前拡散処理を行い、その
後、プレートを37℃において16時間インキュベートす
る。
積た後、４℃における６時間の前拡散処理を行い、その
後、プレートを37℃において16時間インキュベートす
る。
1. 2 プリスティナマイシン PIIのアッセイ
回収したプラークの一部分を10mg/のプリスティナ
マイシンPIが添加してあるアガロース培地［52g/のブ
レイン・ハート・インフュージョン アガロース］上に
播き、そしてこれに、５×108個の胞子／のストレプ
トコックス アガラクティアエ B96を接種する。この
培地は、プラークを回収した当日に、以下に示す方法に
おいて調製する。200−ｍのエーレンマイヤーフラス
コ内に分配してあるアガロース培地をマイクロ波を使用
して溶かし、フラスコの内容物の温度を水浴槽中で約50
℃にまで引き下げ、その後、緩和に攪拌しながら、温度
計を培地に浸して、栄養培地下で温度を記録する。温度
が48℃に達した際、以下に記載するものを各フラスコの
内容物に添加する。
マイシンPIが添加してあるアガロース培地［52g/のブ
レイン・ハート・インフュージョン アガロース］上に
播き、そしてこれに、５×108個の胞子／のストレプ
トコックス アガラクティアエ B96を接種する。この
培地は、プラークを回収した当日に、以下に示す方法に
おいて調製する。200−ｍのエーレンマイヤーフラス
コ内に分配してあるアガロース培地をマイクロ波を使用
して溶かし、フラスコの内容物の温度を水浴槽中で約50
℃にまで引き下げ、その後、緩和に攪拌しながら、温度
計を培地に浸して、栄養培地下で温度を記録する。温度
が48℃に達した際、以下に記載するものを各フラスコの
内容物に添加する。
−2mg/mの濃度のプリスティナマイシン PIの溶液 1
m（最終濃度10mg/m）、および、 −５×108個の胞子/mの濃度のストレプトコックス
アガラクティアエ B96の懸濁液 0.7m。
m（最終濃度10mg/m）、および、 −５×108個の胞子/mの濃度のストレプトコックス
アガラクティアエ B96の懸濁液 0.7m。
その培地を緩和に攪拌することにより均質化させ、そ
の後、それを、プレート（NUNC社の「スクリーニング用
プレート」）当たり一つのフラスコの内容物という比率
で、完全に水平となっている表面上に注ぎ入れる。
の後、それを、プレート（NUNC社の「スクリーニング用
プレート」）当たり一つのフラスコの内容物という比率
で、完全に水平となっている表面上に注ぎ入れる。
プレート上にプラーク（プラーク孔の直系:3.5mm）を
堆積した後、４℃における６時間の前拡散処理を行い、
その後、プレートを37℃において16時間インキュベート
する。
堆積した後、４℃における６時間の前拡散処理を行い、
その後、プレートを37℃において16時間インキュベート
する。
1. 3 結果
阻害円の直系は、テスト用微生物を含むプレートの各
々について測定する。この値は培地中に存在する抗生物
質（成分ＡもしくはＢ）の濃度に依存し、従って、その
二つの成分のうちの一方もしくは他方のものを産生しな
いクローンを同定することが可能になる。
々について測定する。この値は培地中に存在する抗生物
質（成分ＡもしくはＢ）の濃度に依存し、従って、その
二つの成分のうちの一方もしくは他方のものを産生しな
いクローンを同定することが可能になる。
テストを行った3600のクローンの内、プリスティナマ
イシン PIを産生しない36のものを、この方法において
同定した。
イシン PIを産生しない36のものを、この方法において
同定した。
2.クロマトグラフィーのアッセイによる選択。
従って、固体培地内においてプリスティナマイシン
PIを産正するがプリスティナマイシン PIIは産生しな
いということが同定されたクローンを、その後、液体培
地中においてテストした。この目的のために、項目1.に
おいて選択した株の胞子の0.5Mの懸濁液を、滅菌条件
下で、300−ｍのエーレンマイヤーフラスコ内に含ま
れる40mの接種用培地に添加する。この接種用培地
は、10g/のトウモロコシの浸潤液、15g/のショ糖、
10g/の（NH4）2SO4、1g/のK2HPO4、3g/のNaCl、
0.2g/のMgSO4・7H2O、および、1.25g/のCaCO3から
成る。炭酸カルシウムを加える前に、水酸化ナトリウム
でpHを6.9に調整する。エーレンマイヤーフラスコを、3
25rpmのスピードにしてあるロータリー攪拌機上で、27
℃において44時間攪拌する。44時間を経過した先の培養
物の内の2.5mを、滅菌条件下で、300−ｍのエーレ
ンマイヤーフラスコ内に含まれる30mの生産培地に添
加する。この生産培地は、25g/の大豆ミール、7.5g/
のデンプン、22.5g/のグルコース、3.5g/の接種
用イースト、0.5g/の硫酸亜鉛、および、6g/の炭酸
カルシウムからなる。炭酸カルシウムを加える前に、水
酸化ナトリウムでpHを６に調整する。このエーレンマイ
ヤーフラスコを、24時間、27時間、もしくは、30時間攪
拌する。その後、10gの発酵液を、内容物が滑らかにな
っているエーレンマイヤーフラスコ内に測り入れ、これ
に、62.5％のアセトニトリルおよび37.5％の濃厚なK2HP
O4の0.1M溶液から成る20mlの量の流動相を添加する。室
温において20分間攪拌機（325rpm）上で攪拌した後、こ
の混合物をろ紙を通してろ過し、そして、ろ液中に含ま
れるプリスティナマイシンをLCによりアッセイする。こ
の目的のために、2.4mのろ液を、30:70の比率のアセ
トニトリルおよび水から成る希釈液中に溶解させる。こ
の溶液を、SFCCカラム（長さ:25cm、直系:1/4インチ、
固定相:Nucleosil C8 ５ミクロン）に注入する。この
流動相は、630mの0.1M KH2PO4（H3PO4でpH3に調整し
てある）、および、370mのアセトニトリルからなり、
溶出は1m／分の流速で行う。ストレプトグラミンは、
LDC スペクトロモニター III検出機を用いて、206nm
における吸光度を測定することにより検出する。
PIを産正するがプリスティナマイシン PIIは産生しな
いということが同定されたクローンを、その後、液体培
地中においてテストした。この目的のために、項目1.に
おいて選択した株の胞子の0.5Mの懸濁液を、滅菌条件
下で、300−ｍのエーレンマイヤーフラスコ内に含ま
れる40mの接種用培地に添加する。この接種用培地
は、10g/のトウモロコシの浸潤液、15g/のショ糖、
10g/の（NH4）2SO4、1g/のK2HPO4、3g/のNaCl、
0.2g/のMgSO4・7H2O、および、1.25g/のCaCO3から
成る。炭酸カルシウムを加える前に、水酸化ナトリウム
でpHを6.9に調整する。エーレンマイヤーフラスコを、3
25rpmのスピードにしてあるロータリー攪拌機上で、27
℃において44時間攪拌する。44時間を経過した先の培養
物の内の2.5mを、滅菌条件下で、300−ｍのエーレ
ンマイヤーフラスコ内に含まれる30mの生産培地に添
加する。この生産培地は、25g/の大豆ミール、7.5g/
のデンプン、22.5g/のグルコース、3.5g/の接種
用イースト、0.5g/の硫酸亜鉛、および、6g/の炭酸
カルシウムからなる。炭酸カルシウムを加える前に、水
酸化ナトリウムでpHを６に調整する。このエーレンマイ
ヤーフラスコを、24時間、27時間、もしくは、30時間攪
拌する。その後、10gの発酵液を、内容物が滑らかにな
っているエーレンマイヤーフラスコ内に測り入れ、これ
に、62.5％のアセトニトリルおよび37.5％の濃厚なK2HP
O4の0.1M溶液から成る20mlの量の流動相を添加する。室
温において20分間攪拌機（325rpm）上で攪拌した後、こ
の混合物をろ紙を通してろ過し、そして、ろ液中に含ま
れるプリスティナマイシンをLCによりアッセイする。こ
の目的のために、2.4mのろ液を、30:70の比率のアセ
トニトリルおよび水から成る希釈液中に溶解させる。こ
の溶液を、SFCCカラム（長さ:25cm、直系:1/4インチ、
固定相:Nucleosil C8 ５ミクロン）に注入する。この
流動相は、630mの0.1M KH2PO4（H3PO4でpH3に調整し
てある）、および、370mのアセトニトリルからなり、
溶出は1m／分の流速で行う。ストレプトグラミンは、
LDC スペクトロモニター III検出機を用いて、206nm
における吸光度を測定することにより検出する。
この分析により、先に同定した36の内の３つのクロー
ンがプリスティナマイシン PIIの選択的産生体である
ことを証明することが可能となる。クローンPr4R12を、
ブダペスト条約の規定に従い、1992年３月11日に、Baar
n（オランダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelc
ulturesに寄託し、受託番号CBS 183.92を受けている。
ンがプリスティナマイシン PIIの選択的産生体である
ことを証明することが可能となる。クローンPr4R12を、
ブダペスト条約の規定に従い、1992年３月11日に、Baar
n（オランダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelc
ulturesに寄託し、受託番号CBS 183.92を受けている。
実施例2:株DS5647からのプリスティナマイシン PIの特
異的産生体である微生物の調製 本実施例は、非選択的微生物における突然変異誘発の
段階、およびその後に続く選択の段階を含んでなる。
異的産生体である微生物の調製 本実施例は、非選択的微生物における突然変異誘発の
段階、およびその後に続く選択の段階を含んでなる。
1.突然変異誘発
1. 1 メタンスルフォン酸エチル（EMS）での突然変異
誘発 最初の種類の突然変異誘発は、突然変異原性作用物質
として化学的作用物質すなわちメタンスルフォン酸エチ
ル（EMS）を使用して、非選択的株DS5647について行っ
た。
誘発 最初の種類の突然変異誘発は、突然変異原性作用物質
として化学的作用物質すなわちメタンスルフォン酸エチ
ル（EMS）を使用して、非選択的株DS5647について行っ
た。
株DS5647の胞子の懸濁液を、40mの0.2M リン酸緩
衝液、pH7（0.2M K2HPO4;0.2M KH2PO4溶液でpHを７に
調整してある）中に加える。この懸濁液をその後、エー
レンマイヤーフラスコ当たり10mという比率で、４本
の100−ｍ エーレンマイヤーフラスコ内に分配する
が、これは、約６×108個の胞子／エーレンマイヤーフ
ラスコに相当する。その後、0.4mのEMSを各エーレン
マイヤーフラスコ内に添加し（最終濃度４％）、そし
て、その懸濁液を、様々な時間をかけて（表を参照せ
よ）、30℃において、280rpmで攪拌する。その後、この
懸濁液を、大きな250−ｍのビーカーに移し、90mの
0.16M Na2S3O3・5H2O溶液を添加する。0.5mのサンプ
ルを各ビーカーから取り出し、HT培地を含むペトリ皿上
でプレート培養し、対照に対する割合を計測することに
より生存の度合いを決定する（表を参照せよ）。残りの
懸濁液を遠心処理にかけ、10mの0.16M Na2S3O3・5H2
Oで一度すすぎ、再び遠心処理にかけ、そして、10mの
Hirsch培地（J. Bacteriol. 126（1976）13）で溶か
す。攪拌しながら（280rpm）30℃において一晩表現型発
現を行わせた後、細胞を、HT培地を含むペトリ皿上でプ
レート培養し、コロニーの栄養要求性突然変異の度合い
および形態学的不均一性を決定する。栄養要求性突然変
異の度合いを測定するために、コロニーを最低限の培地
上で継代培養し、生育することができないコロニーの％
を決定する。この最小培地は、アガロース 10g、Ｌ−
アスパラギン 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.2
g、FeSO4・7H2O 0.01g、オートクレーブ処理をしてあ
るグルコース 10g、蒸留水 １、からなる（Hopwood
D.A.,Bact.Rev. 31（1967）373）。得られた結果は
以下の表に示されている。
衝液、pH7（0.2M K2HPO4;0.2M KH2PO4溶液でpHを７に
調整してある）中に加える。この懸濁液をその後、エー
レンマイヤーフラスコ当たり10mという比率で、４本
の100−ｍ エーレンマイヤーフラスコ内に分配する
が、これは、約６×108個の胞子／エーレンマイヤーフ
ラスコに相当する。その後、0.4mのEMSを各エーレン
マイヤーフラスコ内に添加し（最終濃度４％）、そし
て、その懸濁液を、様々な時間をかけて（表を参照せ
よ）、30℃において、280rpmで攪拌する。その後、この
懸濁液を、大きな250−ｍのビーカーに移し、90mの
0.16M Na2S3O3・5H2O溶液を添加する。0.5mのサンプ
ルを各ビーカーから取り出し、HT培地を含むペトリ皿上
でプレート培養し、対照に対する割合を計測することに
より生存の度合いを決定する（表を参照せよ）。残りの
懸濁液を遠心処理にかけ、10mの0.16M Na2S3O3・5H2
Oで一度すすぎ、再び遠心処理にかけ、そして、10mの
Hirsch培地（J. Bacteriol. 126（1976）13）で溶か
す。攪拌しながら（280rpm）30℃において一晩表現型発
現を行わせた後、細胞を、HT培地を含むペトリ皿上でプ
レート培養し、コロニーの栄養要求性突然変異の度合い
および形態学的不均一性を決定する。栄養要求性突然変
異の度合いを測定するために、コロニーを最低限の培地
上で継代培養し、生育することができないコロニーの％
を決定する。この最小培地は、アガロース 10g、Ｌ−
アスパラギン 0.5g、K2HPO4 0.5g、MgSO4・7H2O 0.2
g、FeSO4・7H2O 0.01g、オートクレーブ処理をしてあ
るグルコース 10g、蒸留水 １、からなる（Hopwood
D.A.,Bact.Rev. 31（1967）373）。得られた結果は
以下の表に示されている。
1. 2 UVでの突然変異誘発
第二の種類の突然変異誘発は、突然変異原性作用物質
として物理学的作用物質すなわち紫外線を使用して、非
選択的株DS5647について行った。
として物理学的作用物質すなわち紫外線を使用して、非
選択的株DS5647について行った。
株DS5647の胞子の懸濁液（７×108個の胞子/m）
を、0.01％のTweenを含む水で希釈する（最終濃度:5×1
07個の胞子/m）。この懸濁液を、一皿当たり10mと
いう比率でペトリ皿に分配するが、これは、約５×108
個の胞子／エーレンマイヤーフラスコに相当する。その
後、このペトリ皿をいろいろな照射出力のUVに露出させ
る（表を参照せよ）。その後、各ペトリ皿の内容物を30
00rpmにおける10分間の遠心処理にかけ、そして、ペレ
ットを、5mのHirsch培地に溶かす。細胞は、胞子形成
が始まっていることが観察されるまで、攪拌機上で30℃
において保持する。その後、細胞をプレート培養し、そ
して、以下に示すパラメーターを、突然変異誘発の効
率、生存の度合い、および、栄養要求性突然変異の度合
いの証拠として決定する。これらのパラメーターは、先
の実施例におけるものと同様に決定する。
を、0.01％のTweenを含む水で希釈する（最終濃度:5×1
07個の胞子/m）。この懸濁液を、一皿当たり10mと
いう比率でペトリ皿に分配するが、これは、約５×108
個の胞子／エーレンマイヤーフラスコに相当する。その
後、このペトリ皿をいろいろな照射出力のUVに露出させ
る（表を参照せよ）。その後、各ペトリ皿の内容物を30
00rpmにおける10分間の遠心処理にかけ、そして、ペレ
ットを、5mのHirsch培地に溶かす。細胞は、胞子形成
が始まっていることが観察されるまで、攪拌機上で30℃
において保持する。その後、細胞をプレート培養し、そ
して、以下に示すパラメーターを、突然変異誘発の効
率、生存の度合い、および、栄養要求性突然変異の度合
いの証拠として決定する。これらのパラメーターは、先
の実施例におけるものと同様に決定する。
2. プリスティナマイシン PIの特異的産生体の選択
EMS突然変異誘発（R2）により取得されたコロニーか
らの選択は、実施例１におけるものと同様に二つの段階
において行う（固体培地中における微生物に対する感受
性のテスト、および、クロマトグラフィーの分析による
液体培地中での検証）。当初の3600のクローンの内の６
つのものが固体培地中において同定され、この内の３つ
が液体培地中において、プリスティナマイシン PIの特
異的産生体として検証された。クローンPr4R31を、ブダ
ペスト条約の規定に従い、1992年３月11日に、Baarn
（オランダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelcu
lturesに寄託し、受託番号CBS 182.92を受けている。
らの選択は、実施例１におけるものと同様に二つの段階
において行う（固体培地中における微生物に対する感受
性のテスト、および、クロマトグラフィーの分析による
液体培地中での検証）。当初の3600のクローンの内の６
つのものが固体培地中において同定され、この内の３つ
が液体培地中において、プリスティナマイシン PIの特
異的産生体として検証された。クローンPr4R31を、ブダ
ペスト条約の規定に従い、1992年３月11日に、Baarn
（オランダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelcu
lturesに寄託し、受託番号CBS 182.92を受けている。
実施例3:S.オステログリゼウス株ATCC27455からの、オ
ステログリシンＡおよびＢの特異的産生体である微生物
の調製 本実施例は、非選択的微生物における突然変異誘発の
段階、およびその後に続く選択の段階を含んでなる。
ステログリシンＡおよびＢの特異的産生体である微生物
の調製 本実施例は、非選択的微生物における突然変異誘発の
段階、およびその後に続く選択の段階を含んでなる。
1. 突然変異誘発
突然変異誘発は、メタンスルフォン酸エチル（EMS）
を用いて行った。
を用いて行った。
株ATCC2745の胞子の懸濁液を、50mの0.2M リン酸
緩衝液、pH7（0.2M K2HPO4;0.2M KH2PO4溶液でpHを７
に調整してある）中に加える。この懸濁液をその後、エ
ーレンマイヤーフラスコ当たり10mという比率で、５
本の100−ｍ エーレンマイヤーフラスコ内に分配す
るが、これは、約9.3×108個の胞子／エーレンマイヤー
フラスコに相当する。その後、いろいろな濃度になるよ
うにEMSを各エーレンマイヤーフラスコ内に添加し（表
を参照せよ）、そして、その懸濁液を、150分間もしく
は180分間、30℃において、280rpmで攪拌する。その
後、懸濁液を、実施例２の要点1. 1におけるのと同様
に、適切な培地に移し、そして、適切な処理を行う。得
られた結果を以下の表において示す。
緩衝液、pH7（0.2M K2HPO4;0.2M KH2PO4溶液でpHを７
に調整してある）中に加える。この懸濁液をその後、エ
ーレンマイヤーフラスコ当たり10mという比率で、５
本の100−ｍ エーレンマイヤーフラスコ内に分配す
るが、これは、約9.3×108個の胞子／エーレンマイヤー
フラスコに相当する。その後、いろいろな濃度になるよ
うにEMSを各エーレンマイヤーフラスコ内に添加し（表
を参照せよ）、そして、その懸濁液を、150分間もしく
は180分間、30℃において、280rpmで攪拌する。その
後、懸濁液を、実施例２の要点1. 1におけるのと同様
に、適切な培地に移し、そして、適切な処理を行う。得
られた結果を以下の表において示す。
2. オステログリシン Ａに特異的な産生体の選択
EMS突然変異誘発（QO3およびQO6）により取得された
コロニーからの選択は、実施例１におけるものと同様に
二つの段階において行う（固体培地中における微生物に
対する感受性のテスト、および、クロマトグラフィーの
分析による液体培地中での検証）。各突然変異誘発処理
の1800クローンの内（総計で3600クローン）、４つが固
体培地において同定された（各処理につき２つづつ）。
２つの株が、実施例１におけるのと同様の条件下におい
て、オステログリシンのタイプＡの特異的産生体として
検証された。クローンPr4QO62を、ブダペスト条約の規
定に従い、1993年１月27日に、Baarn（オランダ）にあ
るCentraalbureau voor Schimmelculturesに寄託し、
受託番号CBS 143.93を受けている。
コロニーからの選択は、実施例１におけるものと同様に
二つの段階において行う（固体培地中における微生物に
対する感受性のテスト、および、クロマトグラフィーの
分析による液体培地中での検証）。各突然変異誘発処理
の1800クローンの内（総計で3600クローン）、４つが固
体培地において同定された（各処理につき２つづつ）。
２つの株が、実施例１におけるのと同様の条件下におい
て、オステログリシンのタイプＡの特異的産生体として
検証された。クローンPr4QO62を、ブダペスト条約の規
定に従い、1993年１月27日に、Baarn（オランダ）にあ
るCentraalbureau voor Schimmelculturesに寄託し、
受託番号CBS 143.93を受けている。
3. オステログリシン Ｂの特異的産生体の選択
EMS突然変異誘発（QO3）により取得されたコロニーか
らの選択は、実施例１におけるものと同様に二つの段階
において行う（固体培地中における微生物に対する感受
性のテスト、および、クロマトグラフィーの分析による
液体培地中での検証）。当初の1800のクローンの内、た
だ１つのクローンのみが固体培地中で同定され、これ
は、液体培地中において検証された。このクローンはオ
ステログリシンのタイプＢの特異的産生体であり、Pr4Q
O31と表示されるが、これを、ブダペスト条約の規定に
従い、1993年１月27日に、Baarn（オランダ）にあるCen
traalbureau voor Schimmelculturesに寄託し、受託
番号CBS 142.93を受けている。
らの選択は、実施例１におけるものと同様に二つの段階
において行う（固体培地中における微生物に対する感受
性のテスト、および、クロマトグラフィーの分析による
液体培地中での検証）。当初の1800のクローンの内、た
だ１つのクローンのみが固体培地中で同定され、これ
は、液体培地中において検証された。このクローンはオ
ステログリシンのタイプＢの特異的産生体であり、Pr4Q
O31と表示されるが、これを、ブダペスト条約の規定に
従い、1993年１月27日に、Baarn（オランダ）にあるCen
traalbureau voor Schimmelculturesに寄託し、受託
番号CBS 142.93を受けている。
実施例4:S.バージニアエ株ATCC13161からのバージニア
マイシン ＡおよびＢの特異的産生体である微生物の調
製 本実施例は、非選択的微生物における突然変異誘発の
段階、およびその後に続く選択の段階を含んでなる。
マイシン ＡおよびＢの特異的産生体である微生物の調
製 本実施例は、非選択的微生物における突然変異誘発の
段階、およびその後に続く選択の段階を含んでなる。
1. 突然変異誘発
突然変異誘発は、実施例３と同様に、メタンスルフォ
ン酸（EMS）エチルを使用し、約3.2×109個の芽胞／エ
ーレンマイヤーフラスコに相当する、エーレンマイヤー
フラスコ当たり10mという比率で５本のエーレンマイ
ヤーフラスコ内に分配されている芽胞の懸濁液について
実行した。突然変異誘発の条件、および、得られた結果
を、以下の表においてそれぞれを相関させて示してい
る。実施例３において記載されている計画を用いた。
ン酸（EMS）エチルを使用し、約3.2×109個の芽胞／エ
ーレンマイヤーフラスコに相当する、エーレンマイヤー
フラスコ当たり10mという比率で５本のエーレンマイ
ヤーフラスコ内に分配されている芽胞の懸濁液について
実行した。突然変異誘発の条件、および、得られた結果
を、以下の表においてそれぞれを相関させて示してい
る。実施例３において記載されている計画を用いた。
2. バージニアマイシン VMの特異的産生体の選択
EMS突然変異誘発（QV9およびQV7）により取得された
コロニーからの選択は、実施例１におけるものと同様に
二つの段階において行う（固体培地中における微生物に
対する感受性のテスト、および、クロマトグラフィーの
分析による液体培地中での検証）。各突然変異誘発処理
の1800クローンの内（総計で3600クローン）、２つが、
実施例１の要点1. 2において記載した計画（107個の芽
胞／のッストレプトコックス B96を使用する）に従
う固体培地において同定された。これらの２つの株は、
実施例１におけるのと同様の条件下における液体培地中
において、バージニアマイシンのタイプVMの特異的産生
体として検証された。このクローンPr4QV71を、ブダペ
スト条約の規定に従い、1993年１月27日に、Baarn（オ
ランダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelcultur
esに寄託し、受託番号CBS 140.93を受けている。
コロニーからの選択は、実施例１におけるものと同様に
二つの段階において行う（固体培地中における微生物に
対する感受性のテスト、および、クロマトグラフィーの
分析による液体培地中での検証）。各突然変異誘発処理
の1800クローンの内（総計で3600クローン）、２つが、
実施例１の要点1. 2において記載した計画（107個の芽
胞／のッストレプトコックス B96を使用する）に従
う固体培地において同定された。これらの２つの株は、
実施例１におけるのと同様の条件下における液体培地中
において、バージニアマイシンのタイプVMの特異的産生
体として検証された。このクローンPr4QV71を、ブダペ
スト条約の規定に従い、1993年１月27日に、Baarn（オ
ランダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelcultur
esに寄託し、受託番号CBS 140.93を受けている。
しかしながら、液体培地中における選択については、
以下に示す培地を接種培地および生産培地として使用し
て、実施例１の要点２の計画に従った。
以下に示す培地を接種培地および生産培地として使用し
て、実施例１の要点２の計画に従った。
接種培地：破砕コーンステープリカー 20g、大豆ミ
ール 10g、イーストの自己消化物 5g、引きわりナッ
ツ油 15g、無水グルコース 40g、MnSO4 0.01g、CaCO
3 5g、水、充分量、１。pHは、炭酸カルシウムを加
える前に、水酸化ナトリウムで6.80に調整する。
ール 10g、イーストの自己消化物 5g、引きわりナッ
ツ油 15g、無水グルコース 40g、MnSO4 0.01g、CaCO
3 5g、水、充分量、１。pHは、炭酸カルシウムを加
える前に、水酸化ナトリウムで6.80に調整する。
産物用培地：破砕コーンステープリカー 20g、イー
ストの自己消化物 5g、引きわりナッツ油 10g、無水
グルコース 5g、グリセロール 25g、亜麻仁油 10g、
CaCO3、水、充分量、１。pHは、炭酸カルシウムを加
える前に、水酸化ナトリウムで6.8に調整する。
ストの自己消化物 5g、引きわりナッツ油 10g、無水
グルコース 5g、グリセロール 25g、亜麻仁油 10g、
CaCO3、水、充分量、１。pHは、炭酸カルシウムを加
える前に、水酸化ナトリウムで6.8に調整する。
3. バージニアマイシンのタイプVSの特異的産生体の選
択 EMS突然変異誘発（QV9）により取得されたコロニーか
らの選択は、実施例１におけるものと同様に二つの段階
において行う（固体培地中における微生物に対する感受
性のテスト、および、クロマトグラフィーの分析による
液体培地中での検証）。当初の3700のクローンの内、た
だ１つのクローンのみが固体培地中で同定され（実施例
１の要点1. 1を参照せよ）、これは、液体培地中におい
て検証された（培地については先を参照せよ）。このク
ローンはバージニアマイシンのタイプVSの特異的産生体
であり、Pr4QV91と表示されるが、これを、ブダペスト
条約の規定に従い、1993年１月27日に、Baarn（オラン
ダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelculturesに
寄託し、受託番号CBS 141.93を受けている。
択 EMS突然変異誘発（QV9）により取得されたコロニーか
らの選択は、実施例１におけるものと同様に二つの段階
において行う（固体培地中における微生物に対する感受
性のテスト、および、クロマトグラフィーの分析による
液体培地中での検証）。当初の3700のクローンの内、た
だ１つのクローンのみが固体培地中で同定され（実施例
１の要点1. 1を参照せよ）、これは、液体培地中におい
て検証された（培地については先を参照せよ）。このク
ローンはバージニアマイシンのタイプVSの特異的産生体
であり、Pr4QV91と表示されるが、これを、ブダペスト
条約の規定に従い、1993年１月27日に、Baarn（オラン
ダ）にあるCentraalbureau voor Schimmelculturesに
寄託し、受託番号CBS 141.93を受けている。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:29） Ｃ１２Ｒ 1:01
(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:04
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:465）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:29）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:04）
微生物の受託番号 ＣＢＳ １４０．９３
微生物の受託番号 ＣＢＳ １４１．９３
(72)発明者 ラクロワ，パトリシア
フランス国エフ―94360ブリ―シユール
―マルヌ・アベニユードリグニー54
(72)発明者 レマン，コリーヌ
フランス国エフ―91700サント―ジユヌ
ビエブ―デ―ボワ・リユモーツアルト２
(72)発明者 サバテイエ，アラン
フランス国エフ―75013パリ・リユドラ
コロニー74
(56)参考文献 特開 昭59−59198（ＪＰ，Ａ)
特表 平６−506350（ＪＰ，Ａ)
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ
Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏ
ｔｉｃｓ（1984），Ｖｏｌ．22，ｐ.
695−720
Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎ
ｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（1960），Ｖｏｌ.
８，Ｎｏ．１，ｐ．62−69
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 1/00
C12P 21/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／ＷＰＩＤ
Ｓ（ＳＴＮ)
Claims (5)
- 【請求項１】ストレプトミセス属の微生物の生物学的に
純粋な培養物であって、該微生物が抗生物質ストレプト
グラミン族のマクロラクトン成分を産生するが抗生物質
ストレプトグラミン族の対応するデプシペプチド成分を
検出できる量では産生せず、かつ該抗生物質ストレプト
グラミン族が、ミカマイシン、プリスティナマイシン、
オステログリシンまたはバージニアマイシンである、そ
れぞれ、ストレプトミセス・ミタカエンシス、ストレプ
トミセス・プリスティナエスピラリス、ストレプトミセ
ス・オステログリゼウスまたはストレプトミセス・パー
ジニアエの一菌株である培養物。 - 【請求項２】ストレプトミセス属の微生物の生物学的に
純粋な培養物であって、該微生物が抗生物質ストレプト
グラミン族のデプシペプチド成分を産生するが抗生物質
ストレプトグラミン族の対応するマクロラクトン成分を
検出できる量では産生せず、かつ該抗生物質ストレプト
グラミン族が、ミカマイシン、プリスティナマイシン、
オステログリシンまたはバージニアマイシンである、そ
れぞれ、ストレプトミセス・ミタカエンシス、ストレプ
トミセス・プリスティナエスピラリス、ストレプトミセ
ス・オステログリゼウスまたはストレプトミセス・パー
ジニアエの一菌株である培養物。 - 【請求項３】ストレプトミセス・プリスティナエスピラ
リスCBS182.92、ストレプトミセス・プリスティナエス
ピラリスCBS183.92、ストレプトミセス・オステログリ
ゼウスCBS142.93、ストレプトミセス・オステログリゼ
ウスCBS143.93、ストレプトミセス・パージニアエCBS14
0.93およびストレプトミセス・パージニアエCBS141.93
からなる群より選ばれる一菌株。 - 【請求項４】ストレプトミセス・ミタカエンシス、スト
レプトミセス・プリスティナエスピラリス、ストレプト
ミセス・オステログリゼウスまたはストレプトミセス・
パージニアエの一菌株であって、抗生物質ストレプトグ
ラミン族のマクロラクトン成分を産生するが抗生物質ス
トレプトグラミン族の対応するデプシペプチド成分を検
出できる量では産生せず、かつ該抗生物質ストレプトグ
ラミン族が、それぞれ、ミカマイシン、プリスティナマ
イシン、オステログリシンまたはバージニアマイシンで
ある、いずれかの一菌株を該マクロラクトン成分を生産
するのに有効な条件下で培養し、そして生産された該マ
クロラクトン成分を回収することを特徴とする抗生物質
ストレプトグラミン族のマクロラクトン成分の製造方
法。 - 【請求項５】ストレプトミセス・ミタカエンシス、スト
レプトミセス・プリスティナエスピラリス、ストレプト
ミセス・オステログリゼウスまたはストレプトミセス・
パージニアエの一菌株であって、抗生物質ストレプトグ
ラミン族のデプシペプチド成分を産生するが抗生物質ス
トレプトグラミン族の対応するマクロラクトン成分を検
出できる量では産生せず、かつ該抗生物質ストレプトグ
ラミン族が、それぞれ、ミカマイシン、プリスティナマ
イシン、オステログリシンまたはバージニアマイシンで
ある、いずれかの一菌株を該デプシペプチド成分を生産
するのに有効な条件下で培養し、そして生産された該デ
プシペプチド成分を回収することを特徴とする抗生物質
ストレプトグラミン族のデプシペプチド成分の製造方
法。
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|---|---|---|---|
| FR92/03939 | 1992-04-01 | ||
| FR9203939A FR2689518B1 (fr) | 1992-04-01 | 1992-04-01 | Microorganismes, procédé de préparation et utilisation. |
| PCT/FR1993/000324 WO1993020182A1 (fr) | 1992-04-01 | 1993-03-31 | Microorganismes, procede de preparation et utilisation |
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|---|---|
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ID=9428335
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51716593A Expired - Lifetime JP3421855B2 (ja) | 1992-04-01 | 1993-03-31 | 微生物，調製法，および，用途 |
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| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0633928B1 (ja) |
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| AU (1) | AU684042B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69333302T2 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6670157B1 (en) | 1999-01-15 | 2003-12-30 | Aventis Pharma S.A. | Polypeptides involved in the biosynthesis of streptogramins, nucleotide sequences coding for these polypeptides and their use |
| IL121821A (en) * | 1993-02-17 | 2000-02-17 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Process for purifying a group A minority component of streptogramin some such purified components and their uses |
| FR2701709B1 (fr) * | 1993-02-17 | 1995-04-07 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Forme purifiée de streptograminés, sa préparation et les compositions pharmaceutiques qui la contiennent. |
| GB2301821B (en) * | 1993-02-17 | 1997-07-09 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Group A component of streptogramins |
| FR2722210B1 (fr) * | 1994-07-08 | 1996-08-14 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouvelles streptogramines et procede de preparation de streptogramines par mutasynthese |
| FR2733236B1 (fr) * | 1995-04-18 | 1997-05-23 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Procede de preparation de streptogramines |
| FR2818644B1 (fr) * | 2000-12-21 | 2004-10-22 | Aventis Pharma Sa | Derives de streptogramines, leur preparation et les compositions qui les contiennent |
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|---|---|---|---|---|
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| FR1349946A (fr) * | 1962-10-13 | 1964-01-24 | Kanegafuchi Chemical Ind | Procédé de culture des organismes produisant des antibiotiques mikamycines alpha et beta |
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| US4536397A (en) * | 1977-06-06 | 1985-08-20 | Sanraku-Ocean Co., Ltd. | Antibiotics, neoviridogriseins, and their method of production |
| JPS5959198A (ja) * | 1982-09-29 | 1984-04-04 | Sanraku Inc | 抗生物質ネオビリドグリゼイン２の新規な製造方法 |
| FR2599036B1 (fr) * | 1986-05-22 | 1988-09-09 | Rhone Poulenc Sante | Nouveaux derives de synergistines, leur preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent |
-
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- 1992-04-01 FR FR9203939A patent/FR2689518B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1993
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- 1993-03-29 MX MX9301747A patent/MX9301747A/es unknown
- 1993-03-31 DK DK93907916T patent/DK0633928T3/da active
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- 1993-03-31 JP JP51716593A patent/JP3421855B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-31 AU AU38934/93A patent/AU684042B2/en not_active Expired
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- 1993-03-31 PT PT93907916T patent/PT633928E/pt unknown
- 1993-03-31 CA CA002131087A patent/CA2131087C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1993-03-31 DE DE69333302T patent/DE69333302T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-09-30 FI FI944563A patent/FI121338B/fi not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（１９８４），Ｖｏｌ．２２，ｐ．６９５−７２０ |
| Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ（１９６０），Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１，ｐ．６２−６９ |
Also Published As
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