JP3355360B2 - 単離ペプチド - Google Patents
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Description
【０００１】 関連出願 本出願は、1994年６月３日出願の同時係属出願番号08
/253,503号の一部継続出願である、1995年１月17日出願
の出願番号08/373,636号の一部継続出願である。これら
の両出願は、参考文献として本出願にその内容が合体さ
れる。
/253,503号の一部継続出願である、1995年１月17日出願
の出願番号08/373,636号の一部継続出願である。これら
の両出願は、参考文献として本出願にその内容が合体さ
れる。
【０００２】 発明の分野 本発明は、腫瘍拒絶抗原前駆体由来で、HLA分子、特
にHLA−B44によって提示される単離ペプチドと、その利
用方法に関する。更に、本発明は、その異常細胞がこれ
らのペプチドとHLA分子との複合体を提示する、細胞異
常によって特徴付けられる病気であると診断される個体
を同定する能力と、前記提示されるペプチド、およびそ
の効果とに関する。
にHLA−B44によって提示される単離ペプチドと、その利
用方法に関する。更に、本発明は、その異常細胞がこれ
らのペプチドとHLA分子との複合体を提示する、細胞異
常によって特徴付けられる病気であると診断される個体
を同定する能力と、前記提示されるペプチド、およびそ
の効果とに関する。
【０００３】 背景および従来技術 哺乳類の免疫系が外来の又は異質の物質を認識して、
それらと反応するプロセスは複雑なものである。このシ
ステムの重要な局面は、Ｔ細胞応答である。この応答
は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（“HLA"）、又は、主要
組織適合遺伝子複合体（“MHC"）と称される細胞表面分
子と、ペプチドとからなる複合体を認識し、その複合体
と相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、HL
A/MHC分子も提示する細胞によってプロセシングされる
より大きな分子に由来する。この点に関しては、メール
（Male）他,Advanced Immunology（J.P.LipincottCompa
ny,1987），特にその６−10章を参照。Ｔ細胞とHLA/ペ
プチド複合体の相互作用は制限されたものである。即
ち、HLA分子とペプチドとの特定の組み合わせに対して
特異的なＴ細胞が必要とされる。もし特異的なＴ細胞が
存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が存在し
ていてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存
在していても、それに特異的な複合体が存在しなければ
応答は起こらない。このメカニズムは、異物に対する免
疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に対する応
答に関与している。最近、タンパク質がHLA結合ペプチ
ドへとプロセシングされるメカニズムに関して多くの研
究がなされてきている。この事については、バリナガ
（Barinaga）,Science 257:880（1992）；フリーモント
（Fremont）他,Science 257:919（1992）；マツムラ（M
atsumura）他,Science 257:927（1992）；ラトロン（La
tron）他,Science 257:964（1992）を参照。
それらと反応するプロセスは複雑なものである。このシ
ステムの重要な局面は、Ｔ細胞応答である。この応答
は、Ｔ細胞が、ヒト白血球抗原（“HLA"）、又は、主要
組織適合遺伝子複合体（“MHC"）と称される細胞表面分
子と、ペプチドとからなる複合体を認識し、その複合体
と相互作用することを必要とする。前記ペプチドは、HL
A/MHC分子も提示する細胞によってプロセシングされる
より大きな分子に由来する。この点に関しては、メール
（Male）他,Advanced Immunology（J.P.LipincottCompa
ny,1987），特にその６−10章を参照。Ｔ細胞とHLA/ペ
プチド複合体の相互作用は制限されたものである。即
ち、HLA分子とペプチドとの特定の組み合わせに対して
特異的なＴ細胞が必要とされる。もし特異的なＴ細胞が
存在しなければ、たとえそのパートナー複合体が存在し
ていてもＴ細胞応答は起こらない。同様に、Ｔ細胞が存
在していても、それに特異的な複合体が存在しなければ
応答は起こらない。このメカニズムは、異物に対する免
疫系の応答、自己免疫疾患、および細胞異常に対する応
答に関与している。最近、タンパク質がHLA結合ペプチ
ドへとプロセシングされるメカニズムに関して多くの研
究がなされてきている。この事については、バリナガ
（Barinaga）,Science 257:880（1992）；フリーモント
（Fremont）他,Science 257:919（1992）；マツムラ（M
atsumura）他,Science 257:927（1992）；ラトロン（La
tron）他,Science 257:964（1992）を参照。
【０００４】 Ｔ細胞が細胞異常を認識するメカニズムはガンにも関
係している。たとえば、1992年５月22日出願、1992年11
月26日公表で、参考文献として本出願にその内容を合体
させるPCT出願PCT/US92/04354には、一つの遺伝子ファ
ミリーが開示されておりそれらはプロセシングされてペ
プチドとなり、次に細胞表面に発現され、特異的なCTL
によって腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができる。こ
れら遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原前駆体」即ち“TRAP"分
子をコードするものであると言われ、これら分子に由来
するペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」即ち“TRA"と称され
る。このファミリーの遺伝子の詳細に関してはトラヴァ
ーサリ（Traversari）他、Immunogenetics35:145（199
2）；ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）
他,Science 254:1643（1991）を参照。又、参考文献と
して本出願にその内容を合体させる米国特許第5,342,77
4号も参照。
係している。たとえば、1992年５月22日出願、1992年11
月26日公表で、参考文献として本出願にその内容を合体
させるPCT出願PCT/US92/04354には、一つの遺伝子ファ
ミリーが開示されておりそれらはプロセシングされてペ
プチドとなり、次に細胞表面に発現され、特異的なCTL
によって腫瘍細胞の溶解を引き起こすことができる。こ
れら遺伝子は、「腫瘍拒絶抗原前駆体」即ち“TRAP"分
子をコードするものであると言われ、これら分子に由来
するペプチドは、「腫瘍拒絶抗原」即ち“TRA"と称され
る。このファミリーの遺伝子の詳細に関してはトラヴァ
ーサリ（Traversari）他、Immunogenetics35:145（199
2）；ファン・デア・ブルッゲン（van der Bruggen）
他,Science 254:1643（1991）を参照。又、参考文献と
して本出願にその内容を合体させる米国特許第5,342,77
4号も参照。
【０００５】 その開示内容を本出願に参考文献として合体させる米
国特許第5,405,940号に於いて、HLA−A1分子に結合する
ノナペプチドが教示されている。前記参考文献は、特定
のHLA分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれ
ば、ある特定のペプチドは一つのHLA分子に対して結合
するが、他のHLA分子に対しては結合しないであろうと
推測される、ということを教示している。これは重要な
ことである。なぜなら、異なる個体は異なるHLA表現型
を有するからである。そのため、ある特定のペプチド
が、ある特定のHLA分子に対するパートナーであると同
定されたことが、診断上および治療上の効果を有してい
るとしても、その効果はその特定のHLA表現型を有する
個体に対してしか適切ではないのである。細胞異常は一
つの特定のHLA表現型に限られるものではないため、ま
た、標的化療法（targeted therapy）には、問題の異常
細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、
この分野に於いて更なる研究を行う必要がある。
国特許第5,405,940号に於いて、HLA−A1分子に結合する
ノナペプチドが教示されている。前記参考文献は、特定
のHLA分子に対する特定のペプチドの特異性が判明すれ
ば、ある特定のペプチドは一つのHLA分子に対して結合
するが、他のHLA分子に対しては結合しないであろうと
推測される、ということを教示している。これは重要な
ことである。なぜなら、異なる個体は異なるHLA表現型
を有するからである。そのため、ある特定のペプチド
が、ある特定のHLA分子に対するパートナーであると同
定されたことが、診断上および治療上の効果を有してい
るとしても、その効果はその特定のHLA表現型を有する
個体に対してしか適切ではないのである。細胞異常は一
つの特定のHLA表現型に限られるものではないため、ま
た、標的化療法（targeted therapy）には、問題の異常
細胞の表現型に関する相当な知識が必要とされるため、
この分野に於いて更なる研究を行う必要がある。
【０００６】 酵素チロシナーゼは、チロシンをジヒドロキシフェニ
ルアラニン、即ち“DOPA"に変換する反応を触媒し、メ
ラノサイトに選択的に発現されるように思われる（ミュ
ラー（Muller）他,EMBO J 7:2751（1988））。前記ヒト
酵素に対するcDNAの初期の報告は、クウォン（Kwon）米
国特許第4,898,814号に見られる。ボウチャード（Bouch
ard）他,J.Exp.Med.169:2029（1989）によるそれより後
の報告では、わずかに異なる配列を示している。それが
色素異常症に関連付けられていることから、この酵素に
対する阻害剤を同定することに多大な労力が投じられて
きた。この文献のいくつかの具体例としてジンボウ（Ji
nbow）,WO9116302;ミシマ（Mishima）他，米国特許第5,
077,059号、およびナツァローパー（Nazzaropor）米国
特許第4,818,768号がある。当業者には、類似の物質を
教示するその他の参考文献も周知であろう。
ルアラニン、即ち“DOPA"に変換する反応を触媒し、メ
ラノサイトに選択的に発現されるように思われる（ミュ
ラー（Muller）他,EMBO J 7:2751（1988））。前記ヒト
酵素に対するcDNAの初期の報告は、クウォン（Kwon）米
国特許第4,898,814号に見られる。ボウチャード（Bouch
ard）他,J.Exp.Med.169:2029（1989）によるそれより後
の報告では、わずかに異なる配列を示している。それが
色素異常症に関連付けられていることから、この酵素に
対する阻害剤を同定することに多大な労力が投じられて
きた。この文献のいくつかの具体例としてジンボウ（Ji
nbow）,WO9116302;ミシマ（Mishima）他，米国特許第5,
077,059号、およびナツァローパー（Nazzaropor）米国
特許第4,818,768号がある。当業者には、類似の物質を
教示するその他の参考文献も周知であろう。
【０００７】 1993年６月23日出願で、参考文献として本出願にその
内容を合体させる米国特許出願第08/081,673号は、チロ
シナーゼが、外来性の抗原又はTRAP分子と同様に処理さ
れ得ることを教示している。即ち、メラノーマ等のある
種の細胞異常に於いて、チロシナーゼがプロセシングさ
れ、それに由来するペプチドがある種の異常細胞上に於
いてHLA分子と複合体を形成することが判明したのであ
る。これら複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞（“CTL"）によ
って認識され、その後、CTLが提示細胞を溶解すること
が判った。この驚くべき意外な現象の効果が記載され
た。現在、同様にHLA−A2分子によって提示される腫瘍
拒絶抗原として作用する別のペプチドが発見されてい
る。これらは、1994年２月28日出願で参考文献として本
出願にその内容を合体させる出願番号第08/203,054号に
記載されている。
内容を合体させる米国特許出願第08/081,673号は、チロ
シナーゼが、外来性の抗原又はTRAP分子と同様に処理さ
れ得ることを教示している。即ち、メラノーマ等のある
種の細胞異常に於いて、チロシナーゼがプロセシングさ
れ、それに由来するペプチドがある種の異常細胞上に於
いてHLA分子と複合体を形成することが判明したのであ
る。これら複合体は、細胞溶解性Ｔ細胞（“CTL"）によ
って認識され、その後、CTLが提示細胞を溶解すること
が判った。この驚くべき意外な現象の効果が記載され
た。現在、同様にHLA−A2分子によって提示される腫瘍
拒絶抗原として作用する別のペプチドが発見されてい
る。これらは、1994年２月28日出願で参考文献として本
出願にその内容を合体させる出願番号第08/203,054号に
記載されている。
【０００８】 1994年４月26日出願で参考文献として本出願にその内
容を合体させる米国特許出願第08/233,305号は、チロシ
ナーゼは、また、プロセシングされてHLA−B44分子によ
って提示される抗原にもなるということを開示した。こ
の知見は重要であった。というのは、すべての個体がHL
A−A2+というわけではないからである。しかしながら、
チロシナーゼがHLA−B44提示ペプチドへとプロセシング
されるという知見によって、すべてのHLA−B44+腫瘍の
診断および治療に対する普遍的なアプローチが提供され
るわけではない。なぜならば、チロシナーゼ発現は普遍
的ではないからである。更に、チロシナーゼが腫瘍細胞
のみならず正常細胞によっても発現されるという事実
は、同治療領域に於いてかなりの注意が必要であること
を示唆するものである。
容を合体させる米国特許出願第08/233,305号は、チロシ
ナーゼは、また、プロセシングされてHLA−B44分子によ
って提示される抗原にもなるということを開示した。こ
の知見は重要であった。というのは、すべての個体がHL
A−A2+というわけではないからである。しかしながら、
チロシナーゼがHLA−B44提示ペプチドへとプロセシング
されるという知見によって、すべてのHLA−B44+腫瘍の
診断および治療に対する普遍的なアプローチが提供され
るわけではない。なぜならば、チロシナーゼ発現は普遍
的ではないからである。更に、チロシナーゼが腫瘍細胞
のみならず正常細胞によっても発現されるという事実
は、同治療領域に於いてかなりの注意が必要であること
を示唆するものである。
【０００９】 カンナ（Khanna）他,J.Exp.Med.176:169−179（1992
年６月）は、HLA−B44結合ペプチドを開示し、これにつ
いては後に詳述される。このカンナ（Khanna）のペプチ
ドは、本出願で請求されているペプチドとは関係してい
ない。
年６月）は、HLA−B44結合ペプチドを開示し、これにつ
いては後に詳述される。このカンナ（Khanna）のペプチ
ドは、本出願で請求されているペプチドとは関係してい
ない。
【００１０】 カイタ（Kita）他,Hepatology 18（５）:1039−1044
（1993）は、HLA−B44に結合し、溶解を引き起こすとい
われる20アミノ酸ペプチドを教示している。
（1993）は、HLA−B44に結合し、溶解を引き起こすとい
われる20アミノ酸ペプチドを教示している。
【００１１】 ソルペ（Thorpe）他,Immunogenetics 40:303−305（1
994）は、HLA−B44に結合することが判った二つのペプ
チドのアラインメントについて議論し、普遍的な結合モ
チーフを示唆している。このソルペ（Thorpe）の開示
は、位置２に於ける負に荷電したアミノ酸と、位置９に
おける疎水性であるか、又は正に荷電したアミノ酸とに
ついて言及している。
994）は、HLA−B44に結合することが判った二つのペプ
チドのアラインメントについて議論し、普遍的な結合モ
チーフを示唆している。このソルペ（Thorpe）の開示
は、位置２に於ける負に荷電したアミノ酸と、位置９に
おける疎水性であるか、又は正に荷電したアミノ酸とに
ついて言及している。
【００１２】 フライシャウアー（Fleischauer）他,Tissue Antigen
s 44:311−317（1994）は、HLA−B44結合ペプチドの概
観を含んでいる。
s 44:311−317（1994）は、HLA−B44結合ペプチドの概
観を含んでいる。
【００１３】 今回、MAGE−３も又、HLA−B44分子によって提示され
る少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原へとプロセシングされ
る腫瘍拒絶抗原前駆体を発現することが判った。このペ
プチドは、同様にMAGE−３由来で、HLA−A1に結合する
ことが知られているペプチドとは、Ｎ末端の一つの追加
アミノ酸によって区別されることが注目される。これ
が、とりわけ、下記の本発明の開示の課題である。
る少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原へとプロセシングされ
る腫瘍拒絶抗原前駆体を発現することが判った。このペ
プチドは、同様にMAGE−３由来で、HLA−A1に結合する
ことが知られているペプチドとは、Ｎ末端の一つの追加
アミノ酸によって区別されることが注目される。これ
が、とりわけ、下記の本発明の開示の課題である。
【００１４】 好適実施例の詳細説明 例１ 下記の実験に於いて、既に長年に渡って研究者にとっ
て入手可能であるメラノーマ細胞ラインLB33−MELを使
用した。これに由来するクローンも使用した。このクロ
ーンを、以後、LB33−MELc1と称する。
て入手可能であるメラノーマ細胞ラインLB33−MELを使
用した。これに由来するクローンも使用した。このクロ
ーンを、以後、LB33−MELc1と称する。
【００１５】 単核血液細胞を含む複数のサンプルを、患者LB33から
採取した。前記メラノーマ細胞ラインを、これらの単核
血液細胞含有サンプルに接触させた。これらの混合物に
ついて前記メラノーマ細胞ラインの溶解を観察した。こ
の溶解は、ペプチドと前記メラノーマによって提示され
るHLA分子とからなる複合体に対して特異的な細胞溶解
性Ｔ細胞（“CTL"）がそのサンプル中に存在しているこ
とを示すものである。
採取した。前記メラノーマ細胞ラインを、これらの単核
血液細胞含有サンプルに接触させた。これらの混合物に
ついて前記メラノーマ細胞ラインの溶解を観察した。こ
の溶解は、ペプチドと前記メラノーマによって提示され
るHLA分子とからなる複合体に対して特異的な細胞溶解
性Ｔ細胞（“CTL"）がそのサンプル中に存在しているこ
とを示すものである。
【００１６】 使用した溶解アッセイは、参考文献として本出願にそ
の開示内容を合体させるヘリン（Herin）他,Int.J.Canc
er 39:390−396（1987）に依るクロム放出試験であっ
た。しかし、このアッセイについてここで説明してお
く。標的メラノーマ細胞を、イン・ヴィトロで成長さ
せ、次に、10mM HEPESと30％FCS（即ち、ウシ胎児血清
由来）とを追加したDMEM中に107細胞/mlで再懸濁し、20
0μCi/mlのNa（51Cr）O4とともに37℃で45分間インキュ
ベートした。標識化細胞を、10mM Hepesを追加したDME
Mで３回洗浄した。次に、これらを、10mM Hepesと10％
FCSとを追加したDMEM中に再懸濁し、その後、それぞれ1
03個の細胞を含む100μｌのアリコットを、96穴マイク
ロプレートに分配した。PBLのサンプルを、同じ培地100
μｌ中で添加し、アッセイを二連で行った。プレート
を、100gで４分間遠心分離し、5.5％CO2雰囲気中、37℃
で４時間インキュベートした。
の開示内容を合体させるヘリン（Herin）他,Int.J.Canc
er 39:390−396（1987）に依るクロム放出試験であっ
た。しかし、このアッセイについてここで説明してお
く。標的メラノーマ細胞を、イン・ヴィトロで成長さ
せ、次に、10mM HEPESと30％FCS（即ち、ウシ胎児血清
由来）とを追加したDMEM中に107細胞/mlで再懸濁し、20
0μCi/mlのNa（51Cr）O4とともに37℃で45分間インキュ
ベートした。標識化細胞を、10mM Hepesを追加したDME
Mで３回洗浄した。次に、これらを、10mM Hepesと10％
FCSとを追加したDMEM中に再懸濁し、その後、それぞれ1
03個の細胞を含む100μｌのアリコットを、96穴マイク
ロプレートに分配した。PBLのサンプルを、同じ培地100
μｌ中で添加し、アッセイを二連で行った。プレート
を、100gで４分間遠心分離し、5.5％CO2雰囲気中、37℃
で４時間インキュベートした。
【００１７】 プレートを再び遠心分離にかけ、上清の100μｌのア
リコットを、収集し、カウントした。51Cr放出の百分率
を以下のように計算した。
リコットを、収集し、カウントした。51Cr放出の百分率
を以下のように計算した。
【００１８】
【数１】
【００１９】 ここで、ERは観察された、実験による51Cr放出量、SR
は、200μｌの培地のみの中で103個の標識化細胞をイン
キュベートすることによって測定された自発的放出量、
そしてMRは、100μｌの0.3％Triton Ｘ−100を標的細
胞に添加することによって得られる最大放出量である。
は、200μｌの培地のみの中で103個の標識化細胞をイン
キュベートすることによって測定された自発的放出量、
そしてMRは、100μｌの0.3％Triton Ｘ−100を標的細
胞に添加することによって得られる最大放出量である。
【００２０】 高いCTL活性を示した単核血液サンプルを、拡張し、
限界希釈法によってクローン化し、同じ手法を使用して
再度スクリーニングした。
限界希釈法によってクローン化し、同じ手法を使用して
再度スクリーニングした。
【００２１】 標的K562細胞をテストするのにも同じ手法を使用し
た。EBV−Ｂ細胞を使用した時の唯一の相違点は、DMEM
培地を、５％FCSを追加したハンクス培地（Hank's medi
um）に置換したことであった。
た。EBV−Ｂ細胞を使用した時の唯一の相違点は、DMEM
培地を、５％FCSを追加したハンクス培地（Hank's medi
um）に置換したことであった。
【００２２】 これらの実験によって、CTLクローンLB33−CTL−159/
5が単離された。図１は、このクローンが腫瘍細胞を溶
解したが、EBV−Ｂ細胞やK562細胞は溶解しなかったこ
とを示している。
5が単離された。図１は、このクローンが腫瘍細胞を溶
解したが、EBV−Ｂ細胞やK562細胞は溶解しなかったこ
とを示している。
【００２３】 同じプロトコールに従い、第２のCTLクローン、即
ち、LB33−CTL−159/3を単離した。これらのラインを、
それぞれ、“159/5",“159/3"と称する。この第２のCTL
は159/5とは異なる特異性を有する。このことは、以下
の２つの抗原欠損変異体の単離によって確認された。即
ち（ｉ）159/5によって溶解され、159/3によっては溶解
されないものと、（ii）159/5によっては溶解されず、1
59/3によって溶解されるもの、である。これらの変異体
を、それぞれ、“A-"と“B-"と称する。
ち、LB33−CTL−159/3を単離した。これらのラインを、
それぞれ、“159/5",“159/3"と称する。この第２のCTL
は159/5とは異なる特異性を有する。このことは、以下
の２つの抗原欠損変異体の単離によって確認された。即
ち（ｉ）159/5によって溶解され、159/3によっては溶解
されないものと、（ii）159/5によっては溶解されず、1
59/3によって溶解されるもの、である。これらの変異体
を、それぞれ、“A-"と“B-"と称する。
【００２４】 前記A-変異体を、次に、195/5で免疫選抜（immunosel
ect）し、第３の変異体を得たが、これは、159/5と159/
3のいずれによっても溶解されなかった。この変異体をA
-B-と称する。図２は、これらの変異体の単離を導いた
溶解アッセイの結果を要約している。
ect）し、第３の変異体を得たが、これは、159/5と159/
3のいずれによっても溶解されなかった。この変異体をA
-B-と称する。図２は、これらの変異体の単離を導いた
溶解アッセイの結果を要約している。
【００２５】 例２ 変異体A-B-のHLA発現パターンを判定することが注目
された。親ラインLB33−MELの起源である患者を、HAL−
A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7であるとタイプした。PCR発現
分析を行った時、LB33−MELc1とB-変異体との両方が６
つ全部の対立遺伝子を発現するのに対して、A-B-変異体
は、HLA−A28,B44およびCw7を発現しないということが
判った。その結果、これらのHLA分子の一つが、CTLによ
る溶解をもたらす抗原を提示するものであると結論され
た。下記の例に於いてこれを更に探求する。
された。親ラインLB33−MELの起源である患者を、HAL−
A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7であるとタイプした。PCR発現
分析を行った時、LB33−MELc1とB-変異体との両方が６
つ全部の対立遺伝子を発現するのに対して、A-B-変異体
は、HLA−A28,B44およびCw7を発現しないということが
判った。その結果、これらのHLA分子の一つが、CTLによ
る溶解をもたらす抗原を提示するものであると結論され
た。下記の例に於いてこれを更に探求する。
【００２６】 例３ A-B-変異体のサンプルを、HLA−A28,HLA−B44又はHLA
−Cw7のいずれか一つをクローニングしたプラスミドpcD
NA−I/Amp Iでトランスフェクトした。選抜後、細胞
を、参考文献として本出願にその内容を合体させるトラ
ヴァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics35:145−1
52（1992）に従ってTNF放出試験でテストした。その結
果を図３に要約するが、これは、HLA−B44が明らかに抗
原の提示に関連していることを示している。
−Cw7のいずれか一つをクローニングしたプラスミドpcD
NA−I/Amp Iでトランスフェクトした。選抜後、細胞
を、参考文献として本出願にその内容を合体させるトラ
ヴァーサリ（Traversari）他,Immunogenetics35:145−1
52（1992）に従ってTNF放出試験でテストした。その結
果を図３に要約するが、これは、HLA−B44が明らかに抗
原の提示に関連していることを示している。
【００２７】 例４ 提示HLA分子が同定されたので、以後、提示ペプチド
源である「腫瘍拒絶抗原前駆体」即ち、“TRAP"分子と
称される分子を同定するための研究を行った。
源である「腫瘍拒絶抗原前駆体」即ち、“TRAP"分子と
称される分子を同定するための研究を行った。
【００２８】 これを行うために、トータルmRANを、細胞ラインLB33
−MELc1から単離した。前記メッセンジャーRANは、周知
の技術に従って、オリゴーdT結合キットを使用して単離
した。メッセンジャーRNAを確保した後、これを、再び
標準手法を使用してcDNAへと転写した。次に、製造業者
の指示に従って、前記cDNAを、EcoR Iアダプターに結合
させ、プラスミドpcDNA−I/AmpのEcoR I部位にクローニ
ングした。次に、これらの組換えプラスミドを、DH5α
大腸菌（E.coli）にエレクトロポーレーションした（エ
レクトロポーレーション条件:25μファラドで１パル
ス、2500V）。
−MELc1から単離した。前記メッセンジャーRANは、周知
の技術に従って、オリゴーdT結合キットを使用して単離
した。メッセンジャーRNAを確保した後、これを、再び
標準手法を使用してcDNAへと転写した。次に、製造業者
の指示に従って、前記cDNAを、EcoR Iアダプターに結合
させ、プラスミドpcDNA−I/AmpのEcoR I部位にクローニ
ングした。次に、これらの組換えプラスミドを、DH5α
大腸菌（E.coli）にエレクトロポーレーションした（エ
レクトロポーレーション条件:25μファラドで１パル
ス、2500V）。
【００２９】 前記トランスフェクトされた細菌を、アンピリシン
（50μg/ml）で選抜し、次に、それぞれが100の細菌か
らなる複数のプールに分けた。分析によると、約50％の
プラスミドがインサートを含んでいることが示されたの
で、各プールは約50種類のcDNAを代表するものであっ
た。各プールを、飽和するまで増幅し、プラスミドDNA
を、マニアティス（Maniatis）他,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual（Cold Spring Harbor,N.Y.,1982）
に従って、アルカリ法、酢酸カリウム沈殿およびフェノ
ール抽出によって単離した。セシウム勾配遠心法は使用
しなかった。
（50μg/ml）で選抜し、次に、それぞれが100の細菌か
らなる複数のプールに分けた。分析によると、約50％の
プラスミドがインサートを含んでいることが示されたの
で、各プールは約50種類のcDNAを代表するものであっ
た。各プールを、飽和するまで増幅し、プラスミドDNA
を、マニアティス（Maniatis）他,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual（Cold Spring Harbor,N.Y.,1982）
に従って、アルカリ法、酢酸カリウム沈殿およびフェノ
ール抽出によって単離した。セシウム勾配遠心法は使用
しなかった。
【００３０】 増幅したプラスミドを、次に、真核細胞にトランスフ
ェクトした。COS−７細胞のサンプルを、10％ウシ胎児
血清を追加したダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbeco'
s modified Eagles medium）（“DMEM"）中に、組織培
養平底マイクロウェルに、15,000細胞／ウェルの割合で
播種した。これらの細胞を、37℃で一晩インキュベート
し、培地を除去し、次にこれを、30μl/ウェルの、10％
Nu血清、400μg/ml DEAE−デキストラン、100μＭクロ
ロキン、およびLB33由来のHLA−B44に対するcDNAを有す
るプラスミド100ngを含むDMEM培地と交換した。37℃で
４時間のインキュベーション後、前記培地を除去し、こ
れを、10％DMSOを含有するPBS50μｌと交換した。この
培地を２分後に除去し、これを、10％のFCSを追加したD
MEM200μｌと交換した。
ェクトした。COS−７細胞のサンプルを、10％ウシ胎児
血清を追加したダルベッコ修飾イーグル培地（Dulbeco'
s modified Eagles medium）（“DMEM"）中に、組織培
養平底マイクロウェルに、15,000細胞／ウェルの割合で
播種した。これらの細胞を、37℃で一晩インキュベート
し、培地を除去し、次にこれを、30μl/ウェルの、10％
Nu血清、400μg/ml DEAE−デキストラン、100μＭクロ
ロキン、およびLB33由来のHLA−B44に対するcDNAを有す
るプラスミド100ngを含むDMEM培地と交換した。37℃で
４時間のインキュベーション後、前記培地を除去し、こ
れを、10％DMSOを含有するPBS50μｌと交換した。この
培地を２分後に除去し、これを、10％のFCSを追加したD
MEM200μｌと交換した。
【００３１】 この培地の交換後、COS細胞を、37℃で48時間インキ
ュベートした。次に、培地を捨て、10％のヒトプール血
清と25U/mlのIL−２とを含む100μｌのIscove培地中に
て、2000個の159/5細胞を添加した。上清を24時間後に
除去し、TNF含量を、その開示内容を本出願に参考文献
として合体させるトラヴァーサリ（Traversari）他,Imm
unogenetics35:145−152（1992）に記載されている要領
で、WEHI細胞に対するアッセイにおいて測定した。一つ
のプールがバックグラウンド以上のTNF放出を刺激し、
これらの細菌をクローン化し、次の実験に使用した。
ュベートした。次に、培地を捨て、10％のヒトプール血
清と25U/mlのIL−２とを含む100μｌのIscove培地中に
て、2000個の159/5細胞を添加した。上清を24時間後に
除去し、TNF含量を、その開示内容を本出願に参考文献
として合体させるトラヴァーサリ（Traversari）他,Imm
unogenetics35:145−152（1992）に記載されている要領
で、WEHI細胞に対するアッセイにおいて測定した。一つ
のプールがバックグラウンド以上のTNF放出を刺激し、
これらの細菌をクローン化し、次の実験に使用した。
【００３２】 例５ 例４でクローン化された細菌からプラスミドDNAを抽
出し、前述したものと同じ要領で、COS細胞の新しいサ
ンプルにトランスフェクトし、これらの細胞を、再び、
159/5の刺激に関してテストした。図4Aに要約されてい
るデータによって示されているように、クローン350/2
において一つの陽性クローンが見つかった。
出し、前述したものと同じ要領で、COS細胞の新しいサ
ンプルにトランスフェクトし、これらの細胞を、再び、
159/5の刺激に関してテストした。図4Aに要約されてい
るデータによって示されているように、クローン350/2
において一つの陽性クローンが見つかった。
【００３３】 この時点までに得られた結果を確認するために、ATCC
から容易に入手可能なヒト絨毛ガン細胞ラインJARを使
用した。この細胞ラインは、HLA分子を発現せず、ま
た、CTL159/5によって認識されない。JARをHLA−B44cDN
Aでトランスフェクトした時、それはCTL159/5によって
まだ認識されなかった。しかし、HLA−B44と350/2cDNA
とによる同時トランスフェクションによって、図4Bに示
されるように、溶解が起こった。
から容易に入手可能なヒト絨毛ガン細胞ラインJARを使
用した。この細胞ラインは、HLA分子を発現せず、ま
た、CTL159/5によって認識されない。JARをHLA−B44cDN
Aでトランスフェクトした時、それはCTL159/5によって
まだ認識されなかった。しかし、HLA−B44と350/2cDNA
とによる同時トランスフェクションによって、図4Bに示
されるように、溶解が起こった。
【００３４】 前記陽性クローンからのプラスミドを取り出し、これ
を、当該技術分野に於いて公知の技術に従って配列決定
した。その情報は、前記プラスミドインサートが1896塩
基対長であることを示しており、データバンクのいずれ
の配列ともホモロジーを示さなかった。このヌクレオチ
ド配列を、配列番号１として本出願に示す。
を、当該技術分野に於いて公知の技術に従って配列決定
した。その情報は、前記プラスミドインサートが1896塩
基対長であることを示しており、データバンクのいずれ
の配列ともホモロジーを示さなかった。このヌクレオチ
ド配列を、配列番号１として本出願に示す。
【００３５】 例６ 腫瘍拒絶抗原であるペプチドを確認するために、平均
で約300塩基対の、配列番号１の断片をPCRで増幅し、pc
DNA−1Ampにクローニングし、次に前記諸例のプロトコ
ールに従って、HLA−B44をコードするプラスミドととも
に、COS細胞に同時トランスフェクトした。これらの実
験によって、配列番号１の683−955のヌクレオチド残基
に対応する領域が、抗原ペプチドをコードするものであ
ることが同定された。この領域を、カンナ（Khanna）
他,J.Exp.Med.176:169−176（7/92）によって記載され
ているペプチド、及び、1994年４月26日出願の出願番号
第08/233,305号に記載されているペプチドと比較したと
ころ、配列番号１の核酸残基782−808にコードされる、 がこれらの残基に対応している。従って、この配列に対
応するペプチドを合成して、HLA−B44+細胞ラインを感
作するのに使用した。その結果を、図5A,5Bに示すが、
これらは、EBV形質転換Ｂ細胞を使用した場合（図5A）
と、前述したB-変異体を使用した場合（図5B）の51Cr放
出試験の結果を示している。これらの細胞を、CTL159/5
を添加する前に、様々な濃度の前記ペプチドとともに、
37℃で30分間インキュベートした（エフェクター／標的
比:10:1）。100−200ng/mlのペプチド最大半減の溶解が
得られた。
で約300塩基対の、配列番号１の断片をPCRで増幅し、pc
DNA−1Ampにクローニングし、次に前記諸例のプロトコ
ールに従って、HLA−B44をコードするプラスミドととも
に、COS細胞に同時トランスフェクトした。これらの実
験によって、配列番号１の683−955のヌクレオチド残基
に対応する領域が、抗原ペプチドをコードするものであ
ることが同定された。この領域を、カンナ（Khanna）
他,J.Exp.Med.176:169−176（7/92）によって記載され
ているペプチド、及び、1994年４月26日出願の出願番号
第08/233,305号に記載されているペプチドと比較したと
ころ、配列番号１の核酸残基782−808にコードされる、 がこれらの残基に対応している。従って、この配列に対
応するペプチドを合成して、HLA−B44+細胞ラインを感
作するのに使用した。その結果を、図5A,5Bに示すが、
これらは、EBV形質転換Ｂ細胞を使用した場合（図5A）
と、前述したB-変異体を使用した場合（図5B）の51Cr放
出試験の結果を示している。これらの細胞を、CTL159/5
を添加する前に、様々な濃度の前記ペプチドとともに、
37℃で30分間インキュベートした（エフェクター／標的
比:10:1）。100−200ng/mlのペプチド最大半減の溶解が
得られた。
【００３６】 例７ 前述した例１−６は、細胞ラインLB33−Melc1を使用
した研究を記載するものである。患者LB33からの皮膚転
移由来の別の細胞ラインも得た。その一つのラインはLB
33−MEL.A−１であり、これを下記の例に使用する。
した研究を記載するものである。患者LB33からの皮膚転
移由来の別の細胞ラインも得た。その一つのラインはLB
33−MEL.A−１であり、これを下記の例に使用する。
【００３７】 先ず、前記細胞ラインを、例１−６の細胞ラインと同
様にして使用した（ヘリン（Herin）他，前述）。血液
単核細胞（106/ウェル）を、10％のヒトプール血清、ア
スパラギン−グルタミン−アルギニン（それぞれ36mg/m
l,216mg/ml,116mg/ml）、２−メルカプトエタノール
（0.05mM）および5U/mlのヒトIL−４を追加した2mlのIs
cove培地中で、照射された腫瘍細胞（3/105細胞／ウェ
ル）によって刺激した。培養の三日目にIL−２（10U/m
l）を添加した。前記腫瘍細胞の自己CTLに対する感受性
を、前述の例１と同様にして測定した。この実験によっ
て、７つの独立した培養から82の安定した細胞溶解性Ｔ
リンパ球が得られた。これらCTLの全部がCD8+であっ
た。これらは、LB33−MEL.A−１細胞は溶解したが、K56
2又は自己の、EBV形質転換細胞は溶解しなかったという
意味に於いて、腫瘍細胞に対して特異的であった。
様にして使用した（ヘリン（Herin）他，前述）。血液
単核細胞（106/ウェル）を、10％のヒトプール血清、ア
スパラギン−グルタミン−アルギニン（それぞれ36mg/m
l,216mg/ml,116mg/ml）、２−メルカプトエタノール
（0.05mM）および5U/mlのヒトIL−４を追加した2mlのIs
cove培地中で、照射された腫瘍細胞（3/105細胞／ウェ
ル）によって刺激した。培養の三日目にIL−２（10U/m
l）を添加した。前記腫瘍細胞の自己CTLに対する感受性
を、前述の例１と同様にして測定した。この実験によっ
て、７つの独立した培養から82の安定した細胞溶解性Ｔ
リンパ球が得られた。これらCTLの全部がCD8+であっ
た。これらは、LB33−MEL.A−１細胞は溶解したが、K56
2又は自己の、EBV形質転換細胞は溶解しなかったという
意味に於いて、腫瘍細胞に対して特異的であった。
【００３８】 例８ LB33−MEL.A−１細胞が自己CTLによって溶解されたと
いう事実によって次の実験が示唆され、これは、抗原欠
損変異体を確立することによって認識される抗原を同定
するためのものであった。
いう事実によって次の実験が示唆され、これは、抗原欠
損変異体を確立することによって認識される抗原を同定
するためのものであった。
【００３９】 これを行うために、前述の要領で、自己CTLクローンL
B33−CTL159/3によって、前記細胞ラインのサンプル
を、４回選抜した。各ラウンドの選抜は、上述したのと
同様に、２−3x107個の粘着腫瘍細胞を類似数のCTLとと
もに２−６時間インキュベートするものであった。各ラ
ウンドに於いて、CTLを、インキュベーション後に洗い
流し、残存する粘着腫瘍細胞を、次のラウンドの選抜の
前に増幅した。
B33−CTL159/3によって、前記細胞ラインのサンプル
を、４回選抜した。各ラウンドの選抜は、上述したのと
同様に、２−3x107個の粘着腫瘍細胞を類似数のCTLとと
もに２−６時間インキュベートするものであった。各ラ
ウンドに於いて、CTLを、インキュベーション後に洗い
流し、残存する粘着腫瘍細胞を、次のラウンドの選抜の
前に増幅した。
【００４０】 この手順によって、CTL159/3に対する抵抗性を有する
クローンが得られたが、別の自己CTLでテストした場
合、前述したCTL159/5は、204/26と202/1とを含む他のC
TLクローンと同様に、この欠損変異体を溶解することが
判った。図６、“MEL.A−1.1"と表示されたコラムを参
照されたい。同様に、これら４つのCTLクローンのうち
の一つによっては溶解されないが、他のものによっては
溶解される更なる細胞ラインが確立された。図６を参
照。このように、４種類の異なる抗原欠損変異体が同定
されたので、少なくとも４つの異なる抗原が、LB33−ME
L.A−１の表面上に提示されることが判った。従って、
図６に示すように、LB33−MEL.A−１は、抗原発現に関
して“A+B+C+D+"（CTL159/3,159/5,204/26および202/1
の全部によって溶解される）であり、MEL.A−1.1はA-B+
C+D+（159/3によっては溶解されず、他によっては溶解
される）であり、MEL.A−1.2はA+B-C+D+（159/5によっ
ては溶解されず、他によっては溶解される）であり、ME
L.A−1.3はA+B+C-D+（204/26によっては溶解されず、他
によっては溶解される）であり、そしてMEL.A−1.4はA-
B+C+D-（202/1又は159/3によっては溶解されない）と考
えられる。更に、細胞ラインMEL.A−1.1.1が単離され、
これはA-B-C+D-（204/26のみによって溶解される）であ
った。
クローンが得られたが、別の自己CTLでテストした場
合、前述したCTL159/5は、204/26と202/1とを含む他のC
TLクローンと同様に、この欠損変異体を溶解することが
判った。図６、“MEL.A−1.1"と表示されたコラムを参
照されたい。同様に、これら４つのCTLクローンのうち
の一つによっては溶解されないが、他のものによっては
溶解される更なる細胞ラインが確立された。図６を参
照。このように、４種類の異なる抗原欠損変異体が同定
されたので、少なくとも４つの異なる抗原が、LB33−ME
L.A−１の表面上に提示されることが判った。従って、
図６に示すように、LB33−MEL.A−１は、抗原発現に関
して“A+B+C+D+"（CTL159/3,159/5,204/26および202/1
の全部によって溶解される）であり、MEL.A−1.1はA-B+
C+D+（159/3によっては溶解されず、他によっては溶解
される）であり、MEL.A−1.2はA+B-C+D+（159/5によっ
ては溶解されず、他によっては溶解される）であり、ME
L.A−1.3はA+B+C-D+（204/26によっては溶解されず、他
によっては溶解される）であり、そしてMEL.A−1.4はA-
B+C+D-（202/1又は159/3によっては溶解されない）と考
えられる。更に、細胞ラインMEL.A−1.1.1が単離され、
これはA-B-C+D-（204/26のみによって溶解される）であ
った。
【００４１】 例７で同定された82のCTLを、これらのラインに対し
てテストしたところ、29個の抗−A,29個の抗−B,10個の
抗−Ｃおよび14個の抗−Ｄクローンが同定され、このこ
とは提示される抗原は他にはないことを示唆している。
てテストしたところ、29個の抗−A,29個の抗−B,10個の
抗−Ｃおよび14個の抗−Ｄクローンが同定され、このこ
とは提示される抗原は他にはないことを示唆している。
【００４２】 抗Ｄ CTLクローン202/1での選抜によって、抗−Ｂ
CTLでの選抜と同様に（即ち、A-B-C+D-ラインが得られ
た）、抗−Ａ CTLクローン（159/3）に対しても抵抗性
を示すラインが同定された。この結果は、A-D-とA-B-C-
抗原欠損変異体が、実際に、抗原A,BおよびＤが同じHLA
提示分子を共有するHLA欠損変異体であるか、もしく
は、種々のクラスＩ分子が抗原欠損変異体と共に欠損し
ていた、ということを示唆している。次の諸実験によっ
てこの問題を更に追求した。
CTLでの選抜と同様に（即ち、A-B-C+D-ラインが得られ
た）、抗−Ａ CTLクローン（159/3）に対しても抵抗性
を示すラインが同定された。この結果は、A-D-とA-B-C-
抗原欠損変異体が、実際に、抗原A,BおよびＤが同じHLA
提示分子を共有するHLA欠損変異体であるか、もしく
は、種々のクラスＩ分子が抗原欠損変異体と共に欠損し
ていた、ということを示唆している。次の諸実験によっ
てこの問題を更に追求した。
【００４３】 例９ LB33細胞ラインの発生源である患者は、以前に、HLA
−A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7として血清学的にタイプさ
れている。次に、前記細胞ラインによるHLAクラスＩ遺
伝子の発現を測定するための研究を行った。
−A24,A28,B13,B44,Cw6,Cw7として血清学的にタイプさ
れている。次に、前記細胞ラインによるHLAクラスＩ遺
伝子の発現を測定するための研究を行った。
【００４４】 種々のLB33−MEL腫瘍細胞クローンによる前記６つの
クラスＩ対立遺伝子の各々の発現を評価するために、PC
RによるDNA増幅のための半定量的条件を確立した。DNA
増幅の特異性を保証するために、プライマー3'末端に於
いて必要とされる、完全なヌクレオチド一致に基づく、
ブラウニング（Browning）他，によって提案されたAmpl
ification Refractory Mutation System（ARMS）PCR法
を使用した。参考文献として本出願にその内容を合体さ
せるブラウニング（Browning）他,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 90:2842（1993）を参照。LB33をタイプする際に得
られた配列に基づいて、前記６つの対立遺伝子のそれぞ
れを他の５つから区別することを可能にする対立遺伝子
−特異的プライマー（5'プライマーの後に3'プライマー
を示す）を合成した。
クラスＩ対立遺伝子の各々の発現を評価するために、PC
RによるDNA増幅のための半定量的条件を確立した。DNA
増幅の特異性を保証するために、プライマー3'末端に於
いて必要とされる、完全なヌクレオチド一致に基づく、
ブラウニング（Browning）他，によって提案されたAmpl
ification Refractory Mutation System（ARMS）PCR法
を使用した。参考文献として本出願にその内容を合体さ
せるブラウニング（Browning）他,Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 90:2842（1993）を参照。LB33をタイプする際に得
られた配列に基づいて、前記６つの対立遺伝子のそれぞ
れを他の５つから区別することを可能にする対立遺伝子
−特異的プライマー（5'プライマーの後に3'プライマー
を示す）を合成した。
【００４５】 A24に対しては、5'−GCCGGAGTATTGGGACGA、および、
5'−GGCCGCCTCCCACTTGC（配列番号５および６）、 A28に対しては、5'−GGAGTATTGGGACCGGAAG、および、5'
−GGCCGCCTCCCACTTGT（配列番号７および８）、 B13に対しては、5'−CGCCACGAGTCCGAGGAT、および、5'
−CCTTGCCGTCGTAGGCTA（配列番号９および10）、 B44に対しては、5'−CGCCACGAGTCCGAGGAA、および、5'
−CCTTGCCGTCGTAGGCGT（配列番号11および12）、 Cw6に対しては、5'−CCGAGTGAACCTGCGGAAA、および、5'
−GGTCGCAGCCATACATCCA（配列番号13および14）、 Cw7に対しては、5'−TACAAGCGCCAGGCACAGG、および、5'
−CTCCAGGTAGGCTCTGTC（配列番号15および16）。
5'−GGCCGCCTCCCACTTGC（配列番号５および６）、 A28に対しては、5'−GGAGTATTGGGACCGGAAG、および、5'
−GGCCGCCTCCCACTTGT（配列番号７および８）、 B13に対しては、5'−CGCCACGAGTCCGAGGAT、および、5'
−CCTTGCCGTCGTAGGCTA（配列番号９および10）、 B44に対しては、5'−CGCCACGAGTCCGAGGAA、および、5'
−CCTTGCCGTCGTAGGCGT（配列番号11および12）、 Cw6に対しては、5'−CCGAGTGAACCTGCGGAAA、および、5'
−GGTCGCAGCCATACATCCA（配列番号13および14）、 Cw7に対しては、5'−TACAAGCGCCAGGCACAGG、および、5'
−CTCCAGGTAGGCTCTGTC（配列番号15および16）。
【００４６】 発現の半定量的測定を行うために、逆転写されたRNA
の27サイクルのPCR増幅を、それぞれのセットのプライ
マーを用いて行い、DNA増幅が、観察されたリニアな範
囲にあることが判った。増幅されたDNAの量を、臭化エ
チジウムで染色したアガロースゲルで視覚的に評価し
た。これらの量を、LB3−MEL.A−１細胞からのRNAの段
階希釈物のRT−PCR増幅産物を含む標準曲線で得られた
ものと比較した。サンプルの発現は、β−アクチン遺伝
子の発現レベルを考慮することによって、RNA整合性に
関して、標準化された。その結果を、LB33−MEL.A−１
細胞による発現のレベルと比較して表わした。この研究
の結果を、下記の表１に示す。“＋＋＋”は、LB33−ME
L.A−１細胞の発現の半分以上に対応する発現を示し、
“＋＋”は、発現がLB33−MEL.A−１の発現の1/8から1/
2であったことを示し、“＋”は発現がLB33−MEL.A−１
の発現の1/8以下であったことを示し、“−”は発現が
みられなかったことを示している。
の27サイクルのPCR増幅を、それぞれのセットのプライ
マーを用いて行い、DNA増幅が、観察されたリニアな範
囲にあることが判った。増幅されたDNAの量を、臭化エ
チジウムで染色したアガロースゲルで視覚的に評価し
た。これらの量を、LB3−MEL.A−１細胞からのRNAの段
階希釈物のRT−PCR増幅産物を含む標準曲線で得られた
ものと比較した。サンプルの発現は、β−アクチン遺伝
子の発現レベルを考慮することによって、RNA整合性に
関して、標準化された。その結果を、LB33−MEL.A−１
細胞による発現のレベルと比較して表わした。この研究
の結果を、下記の表１に示す。“＋＋＋”は、LB33−ME
L.A−１細胞の発現の半分以上に対応する発現を示し、
“＋＋”は、発現がLB33−MEL.A−１の発現の1/8から1/
2であったことを示し、“＋”は発現がLB33−MEL.A−１
の発現の1/8以下であったことを示し、“−”は発現が
みられなかったことを示している。
【００４７】
【表１】
【００４８】 表から理解されるように、MEL.A−１細胞とB-変異体
との両方が６つのHLA対立遺伝子すべてを類似のレベル
で発現した。A-変異体は、Cw7の発現に於いて約４分の
１の減少を示した。残りの抗原欠損変異体は、３つの対
立遺伝子の組の発現に於ける減少を示した。C-細胞につ
いては、HLA−A24,B13およびCw6の発現レベルの減少が
見られたのに対し、A-D-およびA-B-D-変異体は、A28,B4
4およびCw7発現の減少を示した。これは、A24−B13−Cw
6とA28−B44−Cw7が患者LB33の二つのHLAクラスＩハプ
ロタイプを構成するものであり、これらのハプロタイプ
の発現の減少が、恐らく、前記免疫選抜された腫瘍細胞
による抗原発現の欠損の原因であった、ということを示
唆している。
との両方が６つのHLA対立遺伝子すべてを類似のレベル
で発現した。A-変異体は、Cw7の発現に於いて約４分の
１の減少を示した。残りの抗原欠損変異体は、３つの対
立遺伝子の組の発現に於ける減少を示した。C-細胞につ
いては、HLA−A24,B13およびCw6の発現レベルの減少が
見られたのに対し、A-D-およびA-B-D-変異体は、A28,B4
4およびCw7発現の減少を示した。これは、A24−B13−Cw
6とA28−B44−Cw7が患者LB33の二つのHLAクラスＩハプ
ロタイプを構成するものであり、これらのハプロタイプ
の発現の減少が、恐らく、前記免疫選抜された腫瘍細胞
による抗原発現の欠損の原因であった、ということを示
唆している。
【００４９】 例10 HLA遺伝子発現とCTLによる溶解との間の相関関係を確
認するために次の実験を構成した。これを行うために、
前述の要領で測定した所与のHLA遺伝子の発現を、標準
式抗体アッセイを使用して得られた結果と比較した。A2
4,A28とB13についてのみ、それらに対して特異的なマウ
ス抗体（A24用にはC7709A1;A28用には2.28MIそしてB13
用にはTU48）を使用して、テストした。抗体の結合を、
抗体とインキュベーションし、洗浄し、その後、フルオ
レセインに結合させたヤギ抗−マウスIg抗体に接触させ
ることによって判定した。次に、これらの細胞を標準技
術であるフローサイトメトリーによって分析した。
認するために次の実験を構成した。これを行うために、
前述の要領で測定した所与のHLA遺伝子の発現を、標準
式抗体アッセイを使用して得られた結果と比較した。A2
4,A28とB13についてのみ、それらに対して特異的なマウ
ス抗体（A24用にはC7709A1;A28用には2.28MIそしてB13
用にはTU48）を使用して、テストした。抗体の結合を、
抗体とインキュベーションし、洗浄し、その後、フルオ
レセインに結合させたヤギ抗−マウスIg抗体に接触させ
ることによって判定した。次に、これらの細胞を標準技
術であるフローサイトメトリーによって分析した。
【００５０】 表２にその結果を要約するが、これらは、図７にも示
されている。下記の表２において示されたHLA発現レベ
ルは、図７に図示された平均蛍光強度に対応している。
値は、LB33−MEL.A−１細胞において見られるレベルと
比較して表わされている。
されている。下記の表２において示されたHLA発現レベ
ルは、図７に図示された平均蛍光強度に対応している。
値は、LB33−MEL.A−１細胞において見られるレベルと
比較して表わされている。
【００５１】 これらの結果から、HLA発現のレベルが、LB33−MEL.A
−１細胞のそれの1/8以下の範囲であると評価された場
合、つまり、HLA表面分子のレベルが検出不能である
か、かろうじて検出可能のいずれかであるという場合、
これは従って、CTLに対する抗原提示がその所与のHLA分
子によるものである可能性が低いことを示唆しているよ
うである。
−１細胞のそれの1/8以下の範囲であると評価された場
合、つまり、HLA表面分子のレベルが検出不能である
か、かろうじて検出可能のいずれかであるという場合、
これは従って、CTLに対する抗原提示がその所与のHLA分
子によるものである可能性が低いことを示唆しているよ
うである。
【００５２】 この点から、又、C-,A-D-およびA-B-D-選抜細胞が、H
LA分子を欠くという理由で抗原の発現を欠損したとする
と、抗原Ａに対するクラスＩ提示分子は、A28又はCw7で
あり、抗原Ｂに対するものはB44であり、抗原Ｃに対す
るものはA24又はB13又はCw6であり、抗原Ｄに対するも
のはA28又はCw7であるように思える。
LA分子を欠くという理由で抗原の発現を欠損したとする
と、抗原Ａに対するクラスＩ提示分子は、A28又はCw7で
あり、抗原Ｂに対するものはB44であり、抗原Ｃに対す
るものはA24又はB13又はCw6であり、抗原Ｄに対するも
のはA28又はCw7であるように思える。
【００５３】
【表２】
【００５４】 例11 上述した諸実験の後、LB33−MEL.A細胞によって発現
される抗原に対する提示分子を決定的に判定するために
更に研究を行った。これを行うために、特定のHLAクラ
スＩ分子の発現を欠損した腫瘍細胞を、古典的なリン酸
カルシウム沈殿法を使用して、前記特定クラスIcDNAを
クローニングした発現ベクターpcDNA3でトランスフェク
トした。このベクターは、neoRマーカーを含む。トラン
スフェクタントを、1.5mg/mlのG418で選抜し、これを、
前記諸例に記載したTNF試験を用いて、CTLクローンを刺
激するのに使用した。
される抗原に対する提示分子を決定的に判定するために
更に研究を行った。これを行うために、特定のHLAクラ
スＩ分子の発現を欠損した腫瘍細胞を、古典的なリン酸
カルシウム沈殿法を使用して、前記特定クラスIcDNAを
クローニングした発現ベクターpcDNA3でトランスフェク
トした。このベクターは、neoRマーカーを含む。トラン
スフェクタントを、1.5mg/mlのG418で選抜し、これを、
前記諸例に記載したTNF試験を用いて、CTLクローンを刺
激するのに使用した。
【００５５】 図８にこれらの結果を示す。抗原Ｂの発現は、HAL−B
44を有するプラスミドでのトランスフェクションによっ
てA-B-D-細胞において回復したが、HLA−A28又はHLA−C
w7を有するプラスミドでのトランスフェクションによっ
ては回復しなかった。抗原Ｃの発現は、HLA B13でのト
ランスフェクションによってC-細胞に於いて回復した。
４つの他の抗−Ｃ CTLクローンも、C-細胞を認識した
が、図示されたCTL179C/50を含む他の５つの抗−Ｃ CT
Lクローンは、それを認識せず、むしろ、これらのCTLは
HLA−Cw6でトランスフェクトされたC-細胞を認識した。
従って、２つのグループの抗−Ｃ CTLクローンが存在
すると結論することができる。一方は、HLA−B13によっ
て提示される抗原を認識し、他方は、HLA−Cw6によって
提示される抗原を認識する。抗原Ｄに関して、A-D-細胞
は、HLA−A28でのトランスフェクションによって、A-D+
に回復した。抗−Ａ CTLによる溶解は抗−クラスＩモ
ノクローナル抗体W6/32によって完全に阻害されるた
め、抗原ＡがHLA−クラスＩ分子によって提示されるも
のであることが明らかであるにも拘わらず、cDNAのいず
れ（即ち、テストされたHLA A28,B44,Cw7）も抗原Ａの
発現を回復しなかった。この抗原は、非−A,B,Cクラス
Ｉ分子によって提示されるものであり、それらの２つの
対立遺伝子が患者LB33に存在しており、それらの内の１
つが、A-D-,A-B-D-細胞において、A28−B44−Cw7ハプロ
タイプと共に欠損している可能性がある。
44を有するプラスミドでのトランスフェクションによっ
てA-B-D-細胞において回復したが、HLA−A28又はHLA−C
w7を有するプラスミドでのトランスフェクションによっ
ては回復しなかった。抗原Ｃの発現は、HLA B13でのト
ランスフェクションによってC-細胞に於いて回復した。
４つの他の抗−Ｃ CTLクローンも、C-細胞を認識した
が、図示されたCTL179C/50を含む他の５つの抗−Ｃ CT
Lクローンは、それを認識せず、むしろ、これらのCTLは
HLA−Cw6でトランスフェクトされたC-細胞を認識した。
従って、２つのグループの抗−Ｃ CTLクローンが存在
すると結論することができる。一方は、HLA−B13によっ
て提示される抗原を認識し、他方は、HLA−Cw6によって
提示される抗原を認識する。抗原Ｄに関して、A-D-細胞
は、HLA−A28でのトランスフェクションによって、A-D+
に回復した。抗−Ａ CTLによる溶解は抗−クラスＩモ
ノクローナル抗体W6/32によって完全に阻害されるた
め、抗原ＡがHLA−クラスＩ分子によって提示されるも
のであることが明らかであるにも拘わらず、cDNAのいず
れ（即ち、テストされたHLA A28,B44,Cw7）も抗原Ａの
発現を回復しなかった。この抗原は、非−A,B,Cクラス
Ｉ分子によって提示されるものであり、それらの２つの
対立遺伝子が患者LB33に存在しており、それらの内の１
つが、A-D-,A-B-D-細胞において、A28−B44−Cw7ハプロ
タイプと共に欠損している可能性がある。
【００５６】 抗原Ｃに対する結果から、命名法に変化が生じた。以
後、抗原Caと抗原Cbと称する二つの抗原が存在すること
とする。
後、抗原Caと抗原Cbと称する二つの抗原が存在すること
とする。
【００５７】 例12 更なる実験に於いて、ラインLB33−MEL.Bの細胞が、
自己細胞ラインによって認識されるか否かの問題が追求
された。
自己細胞ラインによって認識されるか否かの問題が追求
された。
【００５８】 照射されたLB33−MEL.B.1細胞を、自己リンパ球を刺
激するのに、前述したのと同様に（ヘリン（Herin）
他）使用した。これらのリンパ球は、1990年又は1994年
に患者LB33から採取されていたものである。
激するのに、前述したのと同様に（ヘリン（Herin）
他）使用した。これらのリンパ球は、1990年又は1994年
に患者LB33から採取されていたものである。
【００５９】 図10に示されるように、1994年採取のリンパ球のみが
LB33−MEL.B−１細胞を溶解したが、これらは、LB33−M
EL.A−１細胞は溶解しなかった。従って、LB33−MEL.B
−１ラインは、LB33−MEL.Aには見られない抗原を提示
するものである。
LB33−MEL.B−１細胞を溶解したが、これらは、LB33−M
EL.A−１細胞は溶解しなかった。従って、LB33−MEL.B
−１ラインは、LB33−MEL.Aには見られない抗原を提示
するものである。
【００６０】 ここに記載した実験と前述した実験とに於いても、過
去に於ける実験と同様に、さらなるCD8+CTLクローンの
パネルが確立された。CTL269/1の反応性のパネルを図10
Aおよび図10Bに示す。“MEL.B−1"とは反応するが、“M
EL.A−1"とは反応しないことに注目。これによって定義
されるこの新規な抗原をLB33−Ｅと称する。
去に於ける実験と同様に、さらなるCD8+CTLクローンの
パネルが確立された。CTL269/1の反応性のパネルを図10
Aおよび図10Bに示す。“MEL.B−1"とは反応するが、“M
EL.A−1"とは反応しないことに注目。これによって定義
されるこの新規な抗原をLB33−Ｅと称する。
【００６１】 抗体阻害実験に於いて、HLA−A24に対するmAbが溶解
を阻害した。これは、図10Cに示されている。従って、
前記“E"抗原は、HLA−A24によって提示される。
を阻害した。これは、図10Cに示されている。従って、
前記“E"抗原は、HLA−A24によって提示される。
【００６２】 例13 参考文献として本出願にその内容を合体させるフライ
シャウアー（Fleischhauer）他,Tissue Antigens 44:31
1−317（1994）は、HLA−B44結合に対するコンセンサス
モチーフを教示している。このモチーフは、９又は10の
アミノ酸のポリペプチドとして記載され、ここで、Glu
が第２位置に於いて優勢であり、Tyr又はPheが最後の位
置（位置９又は10）に存在し、Met等の疎水性残基が、
第３位置に存在している。
シャウアー（Fleischhauer）他,Tissue Antigens 44:31
1−317（1994）は、HLA−B44結合に対するコンセンサス
モチーフを教示している。このモチーフは、９又は10の
アミノ酸のポリペプチドとして記載され、ここで、Glu
が第２位置に於いて優勢であり、Tyr又はPheが最後の位
置（位置９又は10）に存在し、Met等の疎水性残基が、
第３位置に存在している。
【００６３】 MAGE−３ TRAPアミノ酸配列は、このモチーフに対応
する、位置167−176の一続きのアミノ酸を含んでいて
る。そのアミノ酸配列は、 である。
する、位置167−176の一続きのアミノ酸を含んでいて
る。そのアミノ酸配列は、 である。
【００６４】 HLA−B44モチーフは、HLA−Ｂ＊4402とHLA−Ｂ＊4403
と称される少なくとも二つの主要なサブタイプを含むこ
とが知られている。このMHC分子は、すべてのコーカソ
イドの23％に現れる。この数字をメラノーマの標準分析
と組み合わせると、コーカソイドのメラノーマ患者の15
％が、そのメラノーマ細胞の表面上にHLA−B44を提示す
るはずである、と結論される。従って、配列番号17のペ
プチド又はそれに関連する分子を、実際に、HLA−B44細
胞に同定して、MHC分子との結合後にその溶解を誘発さ
せるために利用可能であるか否かを判定することが非常
に注目される。前記諸例に於いて記載したように、配列
番号２のペプチドは、HLA−B44陽性細胞に結合すること
が示された。位置８に於いてLeuではなくAlaを有するこ
とを除いて配列番号２と類似するペプチドをデザインし
た。この新規なペプチド、即ち、 を、配列番号17とのコンペティションアッセイにおいて
テストした。このペプチドは、ここでは報告しない実験
に於いて得られた結果に鑑みて使用された。簡単に説明
すると、それぞれが配列番号２中に於いてAlaによって
占有されていない位置にAlaを有する、複数の配列番号
２の誘導体を作成した。CTLクローン159/5は、配列番号
よりも、配列番号18を含む複合体を認識するのにわずか
に良好であり、この理由から配列番号18はコンペティテ
ィブアッセイのための優れた試薬となる。コンペティシ
ョンを、ストークス（Storkus）他,J.Immunol138:1657
−1659（1987）に記載されているように、C1R細胞を使
用して行った。これらのC1R細胞は、MHCクラスＩ陰性
の、リンパ芽球腫細胞である。これらのC1R細胞を、上
述したのと同じ手法を使用して、HLA−Ｂ＊4402あるい
はHLA−Ｂ＊4403のいずれかに対するcDNAでトランスフ
ェクトした。HLA−Ｂ＊4402に対するcDNAは、フライシ
ャウアー（Fleischhauer）他,Tissue Antigens 44:311
−317（1994）によって示され、HLA−Ｂ＊4403に対する
cDNAは、フライシャウアー（Fleischhauer）他（1990）
New Eng.J.Med.323:1818−1822（1990）によって提供さ
れている。これら両方の文献を、参考文献として本出願
にその内容を合体させる。
と称される少なくとも二つの主要なサブタイプを含むこ
とが知られている。このMHC分子は、すべてのコーカソ
イドの23％に現れる。この数字をメラノーマの標準分析
と組み合わせると、コーカソイドのメラノーマ患者の15
％が、そのメラノーマ細胞の表面上にHLA−B44を提示す
るはずである、と結論される。従って、配列番号17のペ
プチド又はそれに関連する分子を、実際に、HLA−B44細
胞に同定して、MHC分子との結合後にその溶解を誘発さ
せるために利用可能であるか否かを判定することが非常
に注目される。前記諸例に於いて記載したように、配列
番号２のペプチドは、HLA−B44陽性細胞に結合すること
が示された。位置８に於いてLeuではなくAlaを有するこ
とを除いて配列番号２と類似するペプチドをデザインし
た。この新規なペプチド、即ち、 を、配列番号17とのコンペティションアッセイにおいて
テストした。このペプチドは、ここでは報告しない実験
に於いて得られた結果に鑑みて使用された。簡単に説明
すると、それぞれが配列番号２中に於いてAlaによって
占有されていない位置にAlaを有する、複数の配列番号
２の誘導体を作成した。CTLクローン159/5は、配列番号
よりも、配列番号18を含む複合体を認識するのにわずか
に良好であり、この理由から配列番号18はコンペティテ
ィブアッセイのための優れた試薬となる。コンペティシ
ョンを、ストークス（Storkus）他,J.Immunol138:1657
−1659（1987）に記載されているように、C1R細胞を使
用して行った。これらのC1R細胞は、MHCクラスＩ陰性
の、リンパ芽球腫細胞である。これらのC1R細胞を、上
述したのと同じ手法を使用して、HLA−Ｂ＊4402あるい
はHLA−Ｂ＊4403のいずれかに対するcDNAでトランスフ
ェクトした。HLA−Ｂ＊4402に対するcDNAは、フライシ
ャウアー（Fleischhauer）他,Tissue Antigens 44:311
−317（1994）によって示され、HLA−Ｂ＊4403に対する
cDNAは、フライシャウアー（Fleischhauer）他（1990）
New Eng.J.Med.323:1818−1822（1990）によって提供さ
れている。これら両方の文献を、参考文献として本出願
にその内容を合体させる。
【００６５】 これら細胞を、抗−HLAクラスＩモノクローナル抗体W
6/32（ハイブリドーマ細胞の培養液の30％（v/v））の
存在下に於いて、37℃で１時間、51Crによって標識し
た。これによって、前記細胞がＴ細胞に対して抗原ペプ
チドを提示する能力が増大する。
6/32（ハイブリドーマ細胞の培養液の30％（v/v））の
存在下に於いて、37℃で１時間、51Crによって標識し
た。これによって、前記細胞がＴ細胞に対して抗原ペプ
チドを提示する能力が増大する。
【００６６】 標識化細胞を洗浄し、種々の濃度のコンペティターペ
プチドと共に、無血清培地中にて、20℃で30分間インキ
ュベートした。これらのペプチドは、以下のもの、 これは、上述したように、HLA−B44分子に結合する、 これはEBV遺伝子EBNA−3Aによってコードされ、HLA−
B8に結合する（バロウズ（Burrows）,J.Exp Med 171:34
5−349（1990））。そして、配列番号17、とを含むもの
であった。
プチドと共に、無血清培地中にて、20℃で30分間インキ
ュベートした。これらのペプチドは、以下のもの、 これは、上述したように、HLA−B44分子に結合する、 これはEBV遺伝子EBNA−3Aによってコードされ、HLA−
B8に結合する（バロウズ（Burrows）,J.Exp Med 171:34
5−349（1990））。そして、配列番号17、とを含むもの
であった。
【００６７】 配列番号18のペプチドを次に、前記無血清培地に、終
濃度45ng/ml（C1R−B4402+細胞）又は、160ng/ml（C1R
−B4403+細胞）にて添加した。細胞を、20℃で30分間イ
ンキュベートし、２％ウシ胎児血清を追加したIscove培
地中で２回洗浄した。CTLクローンLB33−CTL159/5を、I
scove培地と10％ヒト血清中で、E:T比20で添加した。51
Crの放出を、３時間後に測定し、これを、C1R−Ｂ＊440
2細胞とC1R−Ｂ＊4403細胞とに関して、図11Aおよび11B
に示す。図11に示されたデータは、コンペティションの
明らかな証拠を示している。
濃度45ng/ml（C1R−B4402+細胞）又は、160ng/ml（C1R
−B4403+細胞）にて添加した。細胞を、20℃で30分間イ
ンキュベートし、２％ウシ胎児血清を追加したIscove培
地中で２回洗浄した。CTLクローンLB33−CTL159/5を、I
scove培地と10％ヒト血清中で、E:T比20で添加した。51
Crの放出を、３時間後に測定し、これを、C1R−Ｂ＊440
2細胞とC1R−Ｂ＊4403細胞とに関して、図11Aおよび11B
に示す。図11に示されたデータは、コンペティションの
明らかな証拠を示している。
【００６８】 例14 次に、例13の実験に続いて、追加の実験を行った。
【００６９】 細胞溶解性Ｔ細胞クローン（CTL）を、それぞれ、LB8
16およびLB822と称する２名の対象から得た。これらの
対象はガンの証拠を示さなかった。
16およびLB822と称する２名の対象から得た。これらの
対象はガンの証拠を示さなかった。
【００７０】 血液単核細胞（BMC）を、密度勾配遠心分離法を使用
して、前記対象から単離した。前記BMC中のＴリンパ球
を、予めアミノエチルイソチウロニウムブロミド（amin
oethylisothiouronium bromide）で処理しておいたヒツ
ジ赤血球を使用してロゼット形成反応（rosetting）に
よって精製し、次に、磁性マイクロビーズに結合させた
抗−CD8モノクローナル抗体で標識した。CD+8細胞を、
磁化領域を通過させることによって分類し、その後、10
％ヒト血清、116mg/ml Ｌ−アルギニン、36mg/ml Ｌ
−アスパラギン、そして216mg/mlのＬ−グルタミン、0.
05M ２−メルカプトエタノールおよび10％DMSOを追加
したIscove培地中で−80℃で保存した。
して、前記対象から単離した。前記BMC中のＴリンパ球
を、予めアミノエチルイソチウロニウムブロミド（amin
oethylisothiouronium bromide）で処理しておいたヒツ
ジ赤血球を使用してロゼット形成反応（rosetting）に
よって精製し、次に、磁性マイクロビーズに結合させた
抗−CD8モノクローナル抗体で標識した。CD+8細胞を、
磁化領域を通過させることによって分類し、その後、10
％ヒト血清、116mg/ml Ｌ−アルギニン、36mg/ml Ｌ
−アスパラギン、そして216mg/mlのＬ−グルタミン、0.
05M ２−メルカプトエタノールおよび10％DMSOを追加
したIscove培地中で−80℃で保存した。
【００７１】 すべての非ロゼット形成BMCは、組織培養プレート上
にて37℃で２時間付着するように放置された。非粘着細
胞を捨て、粘着細胞を、IL−４（50U/ml）とGM−CSF（1
00ng/ml）の存在下で７日間培養した。その結果得られ
た集団を抗原提示細胞（“APC";この場合、樹状細胞又
はマクロファージ）について強化（enrich）させた。次
に、これらの細胞の5x105ないし106個を、2.5ug/mlのヒ
トβ２ミクログロブリン、および50ug/mlの配列番号17
のペプチドとを追加した400μｌのIscove培地中で、37
℃で４時間、2mlのウェル内でインキュベートした。ペ
プチドをパルスした（peptide pulsed）粘着細胞を、次
に、5000ラドで照射し、洗浄した。次に、2x106個の自
己CD8+T細胞を、1000U/mlのIL−６と5ng/mlのIL−12と
を追加した培地中で添加した。
にて37℃で２時間付着するように放置された。非粘着細
胞を捨て、粘着細胞を、IL−４（50U/ml）とGM−CSF（1
00ng/ml）の存在下で７日間培養した。その結果得られ
た集団を抗原提示細胞（“APC";この場合、樹状細胞又
はマクロファージ）について強化（enrich）させた。次
に、これらの細胞の5x105ないし106個を、2.5ug/mlのヒ
トβ２ミクログロブリン、および50ug/mlの配列番号17
のペプチドとを追加した400μｌのIscove培地中で、37
℃で４時間、2mlのウェル内でインキュベートした。ペ
プチドをパルスした（peptide pulsed）粘着細胞を、次
に、5000ラドで照射し、洗浄した。次に、2x106個の自
己CD8+T細胞を、1000U/mlのIL−６と5ng/mlのIL−12と
を追加した培地中で添加した。
【００７２】 ７日後、リンパ球を、上述した要領でペプチドをパル
スした、粘着自己BMCで再刺激した。5x106個のBMCを、
上述したように、β２ミクログロブリンと配列番号17と
を含む400μｌのIscove培地中で37℃で２時間付着する
ように放置した。すべての、ペプチドをパルスした粘着
細胞を、照射し、洗浄した。次に、反応細胞を、10U/ml
のIL−２と、5ngmlのIL−７を追加した培地中にて添加
した。
スした、粘着自己BMCで再刺激した。5x106個のBMCを、
上述したように、β２ミクログロブリンと配列番号17と
を含む400μｌのIscove培地中で37℃で２時間付着する
ように放置した。すべての、ペプチドをパルスした粘着
細胞を、照射し、洗浄した。次に、反応細胞を、10U/ml
のIL−２と、5ngmlのIL−７を追加した培地中にて添加
した。
【００７３】 第14日目に、前記リンパ球を、配列番号17でパルスし
た自己BMCで再刺激した。BMCを、前述の、但し10％DMSO
を含まない追加Iscove培地中で2x107細胞/mlでインキュ
ベートした。２時間のインキュベーション（20℃）後、
ペプチドをパルスしたBMCを、照射し、洗浄し、上述し
たように、IL−２とIL−７とを加えた培地中で2x106細
胞/mlで再懸濁した。これらの刺激細胞（2x106）のサン
プルを、反応細胞を含む各ウェルに加えた。
た自己BMCで再刺激した。BMCを、前述の、但し10％DMSO
を含まない追加Iscove培地中で2x107細胞/mlでインキュ
ベートした。２時間のインキュベーション（20℃）後、
ペプチドをパルスしたBMCを、照射し、洗浄し、上述し
たように、IL−２とIL−７とを加えた培地中で2x106細
胞/mlで再懸濁した。これらの刺激細胞（2x106）のサン
プルを、反応細胞を含む各ウェルに加えた。
【００７４】 反応リンパ球を、第21日目にクローン化した。10ない
し0.3細胞／ウェルで、50U/mlのIL2と5U/mlのIL−４と
を追加しておいた培地中で、マイクロウェルに播種し
た。次に、これらを、同種EBV形質転換Ｂ細胞（LG2−EB
V）および、ウェル当たり20,000細胞の割合で、10,000
ラドで照射した、（ｉ）同種EBV−形質転換Ｂ細胞、（i
i）ペプチドをパルスしたHLA−B4402+細胞、又は（ii
i）ペプチドをパルスしたHLA−B4403+細胞、のいずれか
一つを添加することによって刺激した。
し0.3細胞／ウェルで、50U/mlのIL2と5U/mlのIL−４と
を追加しておいた培地中で、マイクロウェルに播種し
た。次に、これらを、同種EBV形質転換Ｂ細胞（LG2−EB
V）および、ウェル当たり20,000細胞の割合で、10,000
ラドで照射した、（ｉ）同種EBV−形質転換Ｂ細胞、（i
i）ペプチドをパルスしたHLA−B4402+細胞、又は（ii
i）ペプチドをパルスしたHLA−B4403+細胞、のいずれか
一つを添加することによって刺激した。
【００７５】 （ii）と（iii）の場合、照射は、ウェル当たり8000
個の細胞の割合で15,000ラドで行われた。
個の細胞の割合で15,000ラドで行われた。
【００７６】 ミクロ培養物を、第21日目と同様の要領で、毎週、再
刺激した。一つの相違点は、第21日目に於いては20,000
個であったのに対して、第28日目と35日目とに於いて
は、各ウェル当たりそれぞれ40,000と60,000個のEBV−
Ｂ細胞を添加したことであった。
刺激した。一つの相違点は、第21日目に於いては20,000
個であったのに対して、第28日目と35日目とに於いて
は、各ウェル当たりそれぞれ40,000と60,000個のEBV−
Ｂ細胞を添加したことであった。
【００７７】 第41日目と第52日目との間に、増殖しているミクロ培
養物のアリコットを、配列番号17によってパルスした、
および、パルスしなかったHLA−B4402+又はHLA−B4403+
標的細胞に対する溶解活性をテストするためにＶ字型マ
イクロウェルに移した。
養物のアリコットを、配列番号17によってパルスした、
および、パルスしなかったHLA−B4402+又はHLA−B4403+
標的細胞に対する溶解活性をテストするためにＶ字型マ
イクロウェルに移した。
【００７８】 抗−ペプチド溶解活性を示したすべてのミクロ培養物
を、5x104の照射された、ペプチドをパルスしたB4402+
又はB4403+細胞と、5x105の照射されたLG2−EBV−Ｂ細
胞とで、50U/mlのIL−２と5U/mlのIL−４とを加えた800
μｌの培地中にて、再刺激した。
を、5x104の照射された、ペプチドをパルスしたB4402+
又はB4403+細胞と、5x105の照射されたLG2−EBV−Ｂ細
胞とで、50U/mlのIL−２と5U/mlのIL−４とを加えた800
μｌの培地中にて、再刺激した。
【００７９】 ７日間後、CTLクローンを、毎週、前述したように、1
06の照射されたLG2−EBV−Ｂ細胞と共に、2x105の照射
された、ペプチドをパルスしたB4402+又はB4403+細胞に
よって再刺激した。このようにして、CTL LB 816−CT
L−340A/1とLB822−CTL−346A/1とが得られた。これら
のCTLは、それぞれ、配列番号17と、HLA−B4402+又はHL
A−B4403+のいずれかとの複合体に対して特異的であ
る。
06の照射されたLG2−EBV−Ｂ細胞と共に、2x105の照射
された、ペプチドをパルスしたB4402+又はB4403+細胞に
よって再刺激した。このようにして、CTL LB 816−CT
L−340A/1とLB822−CTL−346A/1とが得られた。これら
のCTLは、それぞれ、配列番号17と、HLA−B4402+又はHL
A−B4403+のいずれかとの複合体に対して特異的であ
る。
【００８０】 例15 更に別のセットの実験に於いて、MAGE−３を発現しな
いHLA−B4402+又はHLA−B4403+EBV形質転換Ｂ細胞を、3
7℃で１時間、モノクローナル抗体W6/32の存在下で、51
Crによって標識した。ブロドスキー（Brodsky）他,J.Im
munol 128:135（1982）。これらの細胞を洗浄し、種々
の濃度の配列番号17を使用して、無血清培地中にて、20
℃で30分間インキュベートした。例14に於いて記載した
各CTLを、同様に記載されたように、51Cr放出試験でテ
ストした。クロム放出は４時間後に測定した。
いHLA−B4402+又はHLA−B4403+EBV形質転換Ｂ細胞を、3
7℃で１時間、モノクローナル抗体W6/32の存在下で、51
Crによって標識した。ブロドスキー（Brodsky）他,J.Im
munol 128:135（1982）。これらの細胞を洗浄し、種々
の濃度の配列番号17を使用して、無血清培地中にて、20
℃で30分間インキュベートした。例14に於いて記載した
各CTLを、同様に記載されたように、51Cr放出試験でテ
ストした。クロム放出は４時間後に測定した。
【００８１】 図12に示すその結果は、前記ペプチドが、事実、溶解
を引き起こしたことを示している。
を引き起こしたことを示している。
【００８２】 例16 下記の諸実験に於いて、HLA−B44陽性である別の腫瘍
細胞ラインを調べた。
細胞ラインを調べた。
【００８３】 テストされるすべての細胞ラインを、51Crによって、
37℃で１時間、標識した。次に、これらを、２％ウシ胎
児血清を追加したIscove培地中にて、様々な数の例14に
記載した二つのCTLクローンに添加した。放出された51C
rの量を４時間後に測定した。コントロールも、図13に
示したように使用した。尚、細胞ラインLB33−MELは、
アッセイに先だって、48時間、IFN−γ（50U/ml）とイ
ンキュベートした。
37℃で１時間、標識した。次に、これらを、２％ウシ胎
児血清を追加したIscove培地中にて、様々な数の例14に
記載した二つのCTLクローンに添加した。放出された51C
rの量を４時間後に測定した。コントロールも、図13に
示したように使用した。尚、細胞ラインLB33−MELは、
アッセイに先だって、48時間、IFN−γ（50U/ml）とイ
ンキュベートした。
【００８４】 これらの実験の結果を図13に示す。CTLクローンLB816
−CTL−340A/1とLB822−CTL−346A/1とは、MAGE−３を
発現する腫瘍細胞を溶解したが、前記MAGE遺伝子を発現
しないLB33−EBV Ｂ細胞は溶解しなかった。CTLクロー
ンLB822−346A/1は、MAGE−３を発現するHLA−Ｂ＊4403
+腫瘍細胞ラインMZ2−MELを溶解したが、抗原欠損変異
体MZ2−MEL D-62.1は溶解しなかった。
−CTL−340A/1とLB822−CTL−346A/1とは、MAGE−３を
発現する腫瘍細胞を溶解したが、前記MAGE遺伝子を発現
しないLB33−EBV Ｂ細胞は溶解しなかった。CTLクロー
ンLB822−346A/1は、MAGE−３を発現するHLA−Ｂ＊4403
+腫瘍細胞ラインMZ2−MELを溶解したが、抗原欠損変異
体MZ2−MEL D-62.1は溶解しなかった。
【００８５】 例17 配列番号17のペプチドが、HLA−B44との複合体とし
て、CTLを刺激したか否かを判定する最後のテストとし
て、腫瘍壊死因子放出が刺激されたか否かを判定する実
験を行った。
て、CTLを刺激したか否かを判定する最後のテストとし
て、腫瘍壊死因子放出が刺激されたか否かを判定する実
験を行った。
【００８６】 先ず、COS−７細胞を、発現ベクターpcDNA−1/AMP中
の、ゴーグラー（Gaugler）他,J.Exp.Med 179:921/930
（1994）による、MAGE−３をコードするcDNAと、ベクタ
ーpcDNA3にクローニングされたHLA−Ｂ＊4402cDNA、又
は、pcDNA1/AMPにクローニングされたHLA−Ｂ 4403cDN
Aのいずれか一方とで、トランスフェフェクトした。ア
ルッフォ（Aruffo）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3365
−3369（1987）のDEAEデキストランクロロキン法を使用
した。
の、ゴーグラー（Gaugler）他,J.Exp.Med 179:921/930
（1994）による、MAGE−３をコードするcDNAと、ベクタ
ーpcDNA3にクローニングされたHLA−Ｂ＊4402cDNA、又
は、pcDNA1/AMPにクローニングされたHLA−Ｂ 4403cDN
Aのいずれか一方とで、トランスフェフェクトした。ア
ルッフォ（Aruffo）,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3365
−3369（1987）のDEAEデキストランクロロキン法を使用
した。
【００８７】 トランスフェクタントを、37℃で24時間インキュベー
トし、次に、3000CTL/ウェルを添加した。構成物を、37
℃で18時間インキュベートした。次に、上清を収集し、
TNF含量を、エスペヴィク（Espevik）他,J.Immunol.Met
h 95:99−105（1986）に従って、TNF感受性WEHI−16ク
ローン13細胞に対する細胞溶解効果をテストすることに
よって測定した。
トし、次に、3000CTL/ウェルを添加した。構成物を、37
℃で18時間インキュベートした。次に、上清を収集し、
TNF含量を、エスペヴィク（Espevik）他,J.Immunol.Met
h 95:99−105（1986）に従って、TNF感受性WEHI−16ク
ローン13細胞に対する細胞溶解効果をテストすることに
よって測定した。
【００８８】 次の表３にその結果を示し、ここで、TNF放出はpg/ml
単位で表わされている。LB33−MELとLB494 MELとを、
アッセイの前に、24時間、100U/mlのIFNγとインキュベ
ートした。腫瘍細胞ラインLB33−MEL,LB494−MEL,MZ2−
MELもテストした。これらの細胞ラインはすべて、MAGE
−3cDNAを発現し、HLA−Ｂ＊4402+（LB33−MEL,LB494−
MEL）か、HLA−Ｂ＊4403+（MZ2−MEL）のいずれかであ
る。従って、これらの細胞についてはトランスフェクシ
ョンは不要であった。結果はTNFが放出されたことを示
す。従って、配列番号17は、HLA−B44 MHC分子によっ
て提示されており、これらの複合体がCTL活性を引き起
こすものである、と結論される。
単位で表わされている。LB33−MELとLB494 MELとを、
アッセイの前に、24時間、100U/mlのIFNγとインキュベ
ートした。腫瘍細胞ラインLB33−MEL,LB494−MEL,MZ2−
MELもテストした。これらの細胞ラインはすべて、MAGE
−3cDNAを発現し、HLA−Ｂ＊4402+（LB33−MEL,LB494−
MEL）か、HLA−Ｂ＊4403+（MZ2−MEL）のいずれかであ
る。従って、これらの細胞についてはトランスフェクシ
ョンは不要であった。結果はTNFが放出されたことを示
す。従って、配列番号17は、HLA−B44 MHC分子によっ
て提示されており、これらの複合体がCTL活性を引き起
こすものである、と結論される。
【００８９】
【表３】
【００９０】 上記諸実験は、腫瘍拒絶抗原前駆体、“TRAP"分子、
をコードする単離核酸分子を記載するものである。これ
らがコードするタンパク質分子は、HLA−B44分子によっ
て提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原、即ち“TR
A"、産生が導かれるように、細胞内でプロセシングされ
る。HLA−B44分子はチロシナーゼ由来のペプチドを提示
することが以前に観察されていたが、本発明の核酸分子
は、チロシナーゼをコードせず、これらTRAはチロシナ
ーゼ由来ではない。
をコードする単離核酸分子を記載するものである。これ
らがコードするタンパク質分子は、HLA−B44分子によっ
て提示される少なくとも一つの腫瘍拒絶抗原、即ち“TR
A"、産生が導かれるように、細胞内でプロセシングされ
る。HLA−B44分子はチロシナーゼ由来のペプチドを提示
することが以前に観察されていたが、本発明の核酸分子
は、チロシナーゼをコードせず、これらTRAはチロシナ
ーゼ由来ではない。
【００９１】 本発明の腫瘍拒絶抗原は、デカマー、 である。
【００９２】 従って、本発明は、HLA−B44分子に結合し、次に、CT
Lによる溶解を引き起こす腫瘍拒絶抗原に関する。
Lによる溶解を引き起こす腫瘍拒絶抗原に関する。
【００９３】 前に示したように、TRAとHLA分子との複合体は、細胞
溶解性Ｔ細胞応答を引き起こす。従って、前記腫瘍拒絶
抗原とHLA−B44分子との単離複合体も本発明の範囲に含
まれ、又、前述の核酸分子によってコードされる単離腫
瘍拒絶抗原前駆体も含まれる。結合特異性が与えられれ
ば、前記ペプチドを、単にHLA−B44陽性細胞を同定する
ためのみに利用することも可能である。
溶解性Ｔ細胞応答を引き起こす。従って、前記腫瘍拒絶
抗原とHLA−B44分子との単離複合体も本発明の範囲に含
まれ、又、前述の核酸分子によってコードされる単離腫
瘍拒絶抗原前駆体も含まれる。結合特異性が与えられれ
ば、前記ペプチドを、単にHLA−B44陽性細胞を同定する
ためのみに利用することも可能である。
【００９４】 ここに記載した本発明は、多数の利用方法が有るが、
その内のいくつかをここに記載する。先ず、HLA−B44分
子によって特異的に提示される腫瘍拒絶抗原と、更に、
それに対応の腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子
との同定によって、当業者は、前記TRAPの発現によって
特徴付けられる疾患を診断することができる。これらの
方法には、TRAP遺伝子、および／又は、HLA分子によっ
て提示されるTRA等のこれらに由来するTRAの、発現の測
定が含まれる。他のTRAも、本発明のTRAPから由来させ
ることができ、種々のHLA分子によって提示させること
ができる。前者の場合、このような測定は、ポリメラー
ゼ連鎖反応を含むすべての標準的核酸測定アッセイ、或
いは、標識化ハイブリダイゼーションプローブによるア
ッセイ、によって行うことが可能である。後者の場合
は、抗体等の、TRAとHLAとの複合体に対する結合パート
ナーによるアッセイが特に好ましい。
その内のいくつかをここに記載する。先ず、HLA−B44分
子によって特異的に提示される腫瘍拒絶抗原と、更に、
それに対応の腫瘍拒絶抗原前駆体をコードする核酸分子
との同定によって、当業者は、前記TRAPの発現によって
特徴付けられる疾患を診断することができる。これらの
方法には、TRAP遺伝子、および／又は、HLA分子によっ
て提示されるTRA等のこれらに由来するTRAの、発現の測
定が含まれる。他のTRAも、本発明のTRAPから由来させ
ることができ、種々のHLA分子によって提示させること
ができる。前者の場合、このような測定は、ポリメラー
ゼ連鎖反応を含むすべての標準的核酸測定アッセイ、或
いは、標識化ハイブリダイゼーションプローブによるア
ッセイ、によって行うことが可能である。後者の場合
は、抗体等の、TRAとHLAとの複合体に対する結合パート
ナーによるアッセイが特に好ましい。
【００９５】 前記TRAP遺伝子の単離によって、そのTRAP分子自身、
特に、配列番号１のヌクレオチド配列を含むTRAP分子、
を単離することも可能となる。TRAとして、又はTRAとHL
A−B44との複合体として、提示される場合のこれらの単
離分子のペプチドのフラグメントを、アジュバント等の
物質と組み合わせて、前記TRAP分子の発現によって特徴
付けられる疾患の治療に有用なワクチンを作ることがで
きる。更に、たとえば、非増殖性のガン細胞、非増殖性
のトランスフェクタント等の、その表面上に前記TRA/HL
A複合体を提示する細胞からワクチンを作ることが可能
である。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合
に於いて、これらは、CTL応答を引き起こすのに必要な
前記構成成分の一つ又両方に対するコード配列をトラン
スフェクトされた細胞、あるいは、トランスフェクショ
ン無しで両方の分子を発現する細胞とすることができ
る。更に、前記TRAP分子、その関連TRA、更に、TRAとHL
Aとの複合体は、当該技術に於いて周知の標準的技法を
利用して、抗体を製造するのに使用することができる。
特に、配列番号１のヌクレオチド配列を含むTRAP分子、
を単離することも可能となる。TRAとして、又はTRAとHL
A−B44との複合体として、提示される場合のこれらの単
離分子のペプチドのフラグメントを、アジュバント等の
物質と組み合わせて、前記TRAP分子の発現によって特徴
付けられる疾患の治療に有用なワクチンを作ることがで
きる。更に、たとえば、非増殖性のガン細胞、非増殖性
のトランスフェクタント等の、その表面上に前記TRA/HL
A複合体を提示する細胞からワクチンを作ることが可能
である。細胞がワクチンとして使用されるすべての場合
に於いて、これらは、CTL応答を引き起こすのに必要な
前記構成成分の一つ又両方に対するコード配列をトラン
スフェクトされた細胞、あるいは、トランスフェクショ
ン無しで両方の分子を発現する細胞とすることができ
る。更に、前記TRAP分子、その関連TRA、更に、TRAとHL
Aとの複合体は、当該技術に於いて周知の標準的技法を
利用して、抗体を製造するのに使用することができる。
【００９６】 ここで「疾患」という用語が用いられた場合、それ
は、前記腫瘍拒絶抗原前駆体が発現するすべての病的
（異常）な状態を指す。このような疾患の一例は、ガ
ン、特にメラノーマ、である。
は、前記腫瘍拒絶抗原前駆体が発現するすべての病的
（異常）な状態を指す。このような疾患の一例は、ガ
ン、特にメラノーマ、である。
【００９７】 本開示に基づく治療上のアプローチは、関連HLA分子
を提示する細胞等の、TRA提示細胞の溶解を導く、患者
の免疫系による応答を前提としている。そのようなアプ
ローチの一つは、問題の表現型の異常細胞を有する患者
に、前記複合体に対して特異的なCTLを投与することで
ある。そのようなCTLをイン・ヴィトロで開発すること
は当業者の技術の範囲内に含まれる。即ち、血液細胞の
ような、細胞のサンプルを、前記複合体を提示する細胞
に接触させると、特異的なCTLの増殖を誘発することが
できる。標的細胞は、前述のタイプのCOS細胞のよう
な、トランスフェクタントとすることができる。その表
面に所望の複合体を提示するトランスフェクタントは、
問題のCTLと結合すると、その（CTLの）増殖を刺激す
る。ここで用いたようなCOS細胞は、、他の適当な宿主
細胞と同様に、広く入手可能である。
を提示する細胞等の、TRA提示細胞の溶解を導く、患者
の免疫系による応答を前提としている。そのようなアプ
ローチの一つは、問題の表現型の異常細胞を有する患者
に、前記複合体に対して特異的なCTLを投与することで
ある。そのようなCTLをイン・ヴィトロで開発すること
は当業者の技術の範囲内に含まれる。即ち、血液細胞の
ような、細胞のサンプルを、前記複合体を提示する細胞
に接触させると、特異的なCTLの増殖を誘発することが
できる。標的細胞は、前述のタイプのCOS細胞のよう
な、トランスフェクタントとすることができる。その表
面に所望の複合体を提示するトランスフェクタントは、
問題のCTLと結合すると、その（CTLの）増殖を刺激す
る。ここで用いたようなCOS細胞は、、他の適当な宿主
細胞と同様に、広く入手可能である。
【００９８】 養子移入（養子免疫細胞移入）と呼ばれる治療上の方
法を詳述すると、（グリーンバーグ（Greenberg）,J.Im
munol.136（５）:1917（1986）；レッデル（Reddel）
他,Science 257:238（７−10−92）；リンチ（Lynch）
他,Eur.J.Immunol.21:1403−1410（1991）；カスト（Ka
st）他,Cell 59:603−614（11−17−89））所望の複合
体を提示する細胞を、CTLと結合させると、その結果、
それに対して特異的なCTLが増殖する。増殖したCTLは、
次に、特定の複合体を提示するいくらかの異常細胞によ
って特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与され
る。すると、前記CTLが異常細胞を溶解し、それによっ
て所望の治療目的が達成される。
法を詳述すると、（グリーンバーグ（Greenberg）,J.Im
munol.136（５）:1917（1986）；レッデル（Reddel）
他,Science 257:238（７−10−92）；リンチ（Lynch）
他,Eur.J.Immunol.21:1403−1410（1991）；カスト（Ka
st）他,Cell 59:603−614（11−17−89））所望の複合
体を提示する細胞を、CTLと結合させると、その結果、
それに対して特異的なCTLが増殖する。増殖したCTLは、
次に、特定の複合体を提示するいくらかの異常細胞によ
って特徴づけられる細胞異常を有する患者に投与され
る。すると、前記CTLが異常細胞を溶解し、それによっ
て所望の治療目的が達成される。
【００９９】 前述の療法は、少なくともいくらかの患者の異常細胞
が、HLA/TRA複合体を提示することを仮定している。こ
のことは非常に簡単に判定できる。というのは、特定の
HLA分子を提示する細胞を同定する方法、及び、前述の
配列を含むDNAを発現する細胞をどのように同定するか
ということについて、当業者は非常によく精通している
からである。単離されると、そのような細胞を、患者の
異常細胞のサンプルとともに、イン・ヴィトロで溶解を
判定するのに使用することができる。もしも溶解が観察
されれば、そのような療法に於いて特異的CTLを使用す
ることによって、前記異常細胞に関連する病気を軽減す
ることができる。より簡単な方法は、標準的アッセイを
使用して、HLA表現型タイピングのために異常細胞を調
べ、たとえばPCRを使用して増幅によって発現を判定す
るものである。
が、HLA/TRA複合体を提示することを仮定している。こ
のことは非常に簡単に判定できる。というのは、特定の
HLA分子を提示する細胞を同定する方法、及び、前述の
配列を含むDNAを発現する細胞をどのように同定するか
ということについて、当業者は非常によく精通している
からである。単離されると、そのような細胞を、患者の
異常細胞のサンプルとともに、イン・ヴィトロで溶解を
判定するのに使用することができる。もしも溶解が観察
されれば、そのような療法に於いて特異的CTLを使用す
ることによって、前記異常細胞に関連する病気を軽減す
ることができる。より簡単な方法は、標準的アッセイを
使用して、HLA表現型タイピングのために異常細胞を調
べ、たとえばPCRを使用して増幅によって発現を判定す
るものである。
【０１００】 養子移入（養子免疫細胞移入）のみが本発明に従って
利用できる唯一の治療形態であるわけではない。CTL
を、数々のアプローチを利用して、イン・ヴィヴォで刺
激することも可能である。一つのアプローチ、即ち、前
記複合体を発現する非増殖性の細胞の利用方法について
は前に詳述した。このアプローチに於いて用いられる細
胞は、照射を受けたメラノーマ細胞、または、前記複合
体を提示するのに必要な一方又は両方の遺伝子をトラン
スフェクトされた細胞のような、通常前記複合体を発現
する細胞であってよい。チェン（Chen）他,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 88:110−114（1991年１月）は、治療法（t
herapeutic regime）における、HPVE7ペプチドを発現す
るトランスフェクション細胞の利用を示しており、この
アプローチを例証している。様々な細胞タイプが利用可
能である。同様に、問題の遺伝子の一方又は両方を担持
するベクターが利用可能である。ウィルス性の又は細菌
性のベクターが特に好ましい。これらのシステムに於い
て、問題の遺伝子は、たとえば、ワクシニアウィルス又
は細菌BCGによって伝えられ、この物質は、事実上、宿
主細胞に「感染」する。その結果得られた細胞は問題の
複合体を提示し、自己CTLによって認識され、そしてそ
のCTLは増殖する。問題のHLA分子を提示する細胞への取
り込みを容易にするために、前記腫瘍拒絶抗原又はその
前駆体自身を、アジュバントと組み合わせることによっ
て、同様の効果を達成することができる。TRAPはHLA分
子のペプチドパートナーを生じるためにプロセシングさ
れるが、一方、TRAは、更なるプロセシングをされる必
要無く提示される。
利用できる唯一の治療形態であるわけではない。CTL
を、数々のアプローチを利用して、イン・ヴィヴォで刺
激することも可能である。一つのアプローチ、即ち、前
記複合体を発現する非増殖性の細胞の利用方法について
は前に詳述した。このアプローチに於いて用いられる細
胞は、照射を受けたメラノーマ細胞、または、前記複合
体を提示するのに必要な一方又は両方の遺伝子をトラン
スフェクトされた細胞のような、通常前記複合体を発現
する細胞であってよい。チェン（Chen）他,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA 88:110−114（1991年１月）は、治療法（t
herapeutic regime）における、HPVE7ペプチドを発現す
るトランスフェクション細胞の利用を示しており、この
アプローチを例証している。様々な細胞タイプが利用可
能である。同様に、問題の遺伝子の一方又は両方を担持
するベクターが利用可能である。ウィルス性の又は細菌
性のベクターが特に好ましい。これらのシステムに於い
て、問題の遺伝子は、たとえば、ワクシニアウィルス又
は細菌BCGによって伝えられ、この物質は、事実上、宿
主細胞に「感染」する。その結果得られた細胞は問題の
複合体を提示し、自己CTLによって認識され、そしてそ
のCTLは増殖する。問題のHLA分子を提示する細胞への取
り込みを容易にするために、前記腫瘍拒絶抗原又はその
前駆体自身を、アジュバントと組み合わせることによっ
て、同様の効果を達成することができる。TRAPはHLA分
子のペプチドパートナーを生じるためにプロセシングさ
れるが、一方、TRAは、更なるプロセシングをされる必
要無く提示される。
【０１０１】 本発明の他の態様は、当業者にとって明らかであり、
ここで繰り返す必要はない。
ここで繰り返す必要はない。
【０１０２】 ここに使用した用語および表現は、限定ではなく記載
の用語として使用されたものであり、従って、これらの
用語および表現を使用するに当たって、図示および記載
された特徴構成又はその一部のいかなる均等物も除外す
る意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能である
と理解される。
の用語として使用されたものであり、従って、これらの
用語および表現を使用するに当たって、図示および記載
された特徴構成又はその一部のいかなる均等物も除外す
る意図は無く、本発明の枠内で様々な改変が可能である
と理解される。
［図面の簡単な説明］
【図１】 図１は、三種類の細胞ライン（LB33−MELc1,LB33EBV−
ＢおよびK562）のいずれかと細胞溶解性Ｔ細胞クローン
159/5とを使用したクロム放出試験の結果を示してい
る。データは、エフェクター／標的比に対する溶解の％
として示されている。
ＢおよびK562）のいずれかと細胞溶解性Ｔ細胞クローン
159/5とを使用したクロム放出試験の結果を示してい
る。データは、エフェクター／標的比に対する溶解の％
として示されている。
【図２】 図２は、細胞変異体、“A-",“B-",“A-,B-"を同定した
溶解研究の結果を示している。ここでも、クロム放出試
験が使用された。テストした両方のCTLラインによる陽
性の溶解によって示されているように、細胞ラインLB33
−MELc1はA+B+である。CTL159/3は抗−Ａであり、これ
に対して、CTL159/5は抗−Ｂである。
溶解研究の結果を示している。ここでも、クロム放出試
験が使用された。テストした両方のCTLラインによる陽
性の溶解によって示されているように、細胞ラインLB33
−MELc1はA+B+である。CTL159/3は抗−Ａであり、これ
に対して、CTL159/5は抗−Ｂである。
【図３】 図３は、前記変異体A-B-を、HLA−A28,HLA−B44,HLA−C
w7のいずれかに対するコード配列でトランスフェクトし
た場合に得られた結果を、コントロールラインとの比較
に於いて示している。これらの結果は、CTL159/5を使用
した敏感なTNF放出試験（pg/ml）について示されてい
る。
w7のいずれかに対するコード配列でトランスフェクトし
た場合に得られた結果を、コントロールラインとの比較
に於いて示している。これらの結果は、CTL159/5を使用
した敏感なTNF放出試験（pg/ml）について示されてい
る。
【図４】 図４は、CTL159/5によるTNF放出を示し、ここでは、COS
細胞を、HLA−B44で、または、HLA−B44と本発明に依る
核酸分子とでトランスフェクトした。
細胞を、HLA−B44で、または、HLA−B44と本発明に依る
核酸分子とでトランスフェクトした。
【図５Ａ】 図5Aは、CTL159/5と接触させた場合の、EBV−Ｂ細胞に
おける51Cr放出を示している。図5Aと図5Bとのそれぞれ
に於いて、本発明の抗原ペプチドは、CTLとの接触の前
に、前記細胞に接触させた。
おける51Cr放出を示している。図5Aと図5Bとのそれぞれ
に於いて、本発明の抗原ペプチドは、CTLとの接触の前
に、前記細胞に接触させた。
【図５Ｂ】 図5Bは、類似のものであるが、但し、LB33−MEL B-細
胞を使用した。図5Aと図5Bとのそれぞれに於いて、本発
明の抗原ペプチドは、CTLとの接触の前に、前記細胞に
接触させた。
胞を使用した。図5Aと図5Bとのそれぞれに於いて、本発
明の抗原ペプチドは、CTLとの接触の前に、前記細胞に
接触させた。
【図６】 図６は、メラノーマクローンラインLB33.MEL.A−１由来
の抗原欠損（antigen loss）変異体に対する、種々の自
己CTLクローンの溶解活性を示している。
の抗原欠損（antigen loss）変異体に対する、種々の自
己CTLクローンの溶解活性を示している。
【図７】 図７は、LB33−MEL.A−１の抗原欠損変異体による、HLA
−A24,A28,B13分子の発現を示す結果を表している。腫
瘍細胞は、予め、特定のHLA分子に対するマウス抗体と
インキュベートされ、その後、フルオレセイン標識化ヤ
ギ抗−マウス抗体で標識された。
−A24,A28,B13分子の発現を示す結果を表している。腫
瘍細胞は、予め、特定のHLA分子に対するマウス抗体と
インキュベートされ、その後、フルオレセイン標識化ヤ
ギ抗−マウス抗体で標識された。
【図８】 図８は、種々のHLA対立遺伝子でトランスフェクトされ
た、抗原欠損変異体によって刺激されたCTLクローンに
よる腫瘍壊死因子（TNF）の産生を示す。トランスフェ
クトされていないLB33−MEL.A−１細胞を、抗原欠損変
異体とともに、コントロールとして使用した。使用され
たCTLクローンは、それぞれ抗−A,抗−B,および抗−Ｃ
CTLに対応する159/3,159/5および204/26であった。
た、抗原欠損変異体によって刺激されたCTLクローンに
よる腫瘍壊死因子（TNF）の産生を示す。トランスフェ
クトされていないLB33−MEL.A−１細胞を、抗原欠損変
異体とともに、コントロールとして使用した。使用され
たCTLクローンは、それぞれ抗−A,抗−B,および抗−Ｃ
CTLに対応する159/3,159/5および204/26であった。
【図９】 図９は、自己混合リンパ球−腫瘍細胞培養中に得られた
リンパ球の細胞溶解活性に関するデータを示す。血液単
核細胞は、1990年３月又は1994年１月に、患者LB33から
予め単離されたものであった。細胞ラインLB33−MEL.A
は、1988年の手術後に得られた。細胞ラインLB33−MEL.
Bは、前記患者に於いて1993年に発生した転移から得
た。
リンパ球の細胞溶解活性に関するデータを示す。血液単
核細胞は、1990年３月又は1994年１月に、患者LB33から
予め単離されたものであった。細胞ラインLB33−MEL.A
は、1988年の手術後に得られた。細胞ラインLB33−MEL.
Bは、前記患者に於いて1993年に発生した転移から得
た。
【図１０Ａ】 図10Aは、自己メラノーマ細胞に対する抗−Ｅ CTLクロ
ーンLB33−CTL−269/1の溶解活性を示す。
ーンLB33−CTL−269/1の溶解活性を示す。
【図１０Ｂ】 図10Bは、自己メラノーマ細胞に対する抗−Ｅ CTLクロ
ーンLB33−CTL−269/1の溶解活性を示す。
ーンLB33−CTL−269/1の溶解活性を示す。
【図１０Ｃ】 図10Cは、LB33−MEL.B−１細胞による刺激後の、同じCT
LクローンによるTNFの産生を示している。刺激細胞（1
0,000/マイクロウェル）を、3000のCTLとともに16時間
インキュベートした。前記CTLによって放出されたTNFの
濃度は、TNF感受性WEHI−164c13細胞を使用して測定し
た。ハイブリドーマ細胞を接種されたマウスから得られ
た腹水液の1/100希釈液を添加することによって、抗HLA
−A24モノクローナル抗体C7709A2を使用して、CTL刺激
を阻害した。
LクローンによるTNFの産生を示している。刺激細胞（1
0,000/マイクロウェル）を、3000のCTLとともに16時間
インキュベートした。前記CTLによって放出されたTNFの
濃度は、TNF感受性WEHI−164c13細胞を使用して測定し
た。ハイブリドーマ細胞を接種されたマウスから得られ
た腹水液の1/100希釈液を添加することによって、抗HLA
−A24モノクローナル抗体C7709A2を使用して、CTL刺激
を阻害した。
【図１１Ａ】 図11Aは、配列番号17,18,19,3をコンペティティブ結合
アッセイに於いてテストした、アッセイの結果を示して
いる。
アッセイに於いてテストした、アッセイの結果を示して
いる。
【図１１Ｂ】 図11Bは、配列番号17,18,19,3をコンペティティブ結合
アッセイに於いてテストした、アッセイの結果を示して
いる。
アッセイに於いてテストした、アッセイの結果を示して
いる。
【図１２】 図12は、配列番号17を、HLA−B44を自然に提示する細胞
に関して、51Cr放出試験に於いて使用した時に得られた
結果を示している。
に関して、51Cr放出試験に於いて使用した時に得られた
結果を示している。
【図１３】 図13は、標的細胞が、ガン細胞ライン等のように天然で
HLA−B44陽性であった時の51Cr溶解試験の結果を要約し
ている。
HLA−B44陽性であった時の51Cr溶解試験の結果を要約し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ヘルマン，ジャン ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 クーリ，ピエール ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ファン・デア・ブルッゲン，ピエール ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (72)発明者 ブーン−ファラー，ティエリー ベルギー国 ビー−1200 ブリュッセル アベニュー・ヒポクラート 74 ユー シーエル 7459 (56)参考文献 特表 平10−501409（ＪＰ，Ａ) 国際公開93／17699（ＷＯ，Ａ１) 国際公開94／5304（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．92，Ｎｏ．17 （1995．Ａｕｇ）ｐ．797 Ｔｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖ ｏｌ．44，Ｎｏ．５（1994）ｐ．311− 317 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ
Claims (1)
- 【請求項１】配列番号17からなる単離ペプチド。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/531,864 | 1995-09-21 | ||
| US08/531,864 US5977300A (en) | 1994-06-03 | 1995-09-21 | Isolated nonapeptide which bind to HLA-B44 molecules and the uses thereof |
| PCT/US1996/015078 WO1997010837A1 (en) | 1995-09-21 | 1996-09-19 | Tumor rejection antigens presented by hla-b44 molecules, and uses thereof |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11509860A JPH11509860A (ja) | 1999-08-31 |
| JP3355360B2 true JP3355360B2 (ja) | 2002-12-09 |
Family
ID=24119368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51290897A Expired - Lifetime JP3355360B2 (ja) | 1995-09-21 | 1996-09-19 | 単離ペプチド |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5977300A (ja) |
| EP (1) | EP0854727B1 (ja) |
| JP (1) | JP3355360B2 (ja) |
| CN (1) | CN1119169C (ja) |
| AT (1) | ATE209041T1 (ja) |
| AU (1) | AU714884B2 (ja) |
| CA (1) | CA2232325C (ja) |
| DE (1) | DE69617255T2 (ja) |
| DK (1) | DK0854727T3 (ja) |
| ES (1) | ES2168514T3 (ja) |
| HK (1) | HK1016482A1 (ja) |
| NZ (1) | NZ320837A (ja) |
| PT (1) | PT854727E (ja) |
| TW (1) | TW387899B (ja) |
| WO (1) | WO1997010837A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060257A (en) * | 1994-06-03 | 2000-05-09 | Ludwig Institute For Cancer Research | Tumor rejection antigens presented by HLA-B44 molecules, and uses thereof |
| AU2001229681A1 (en) * | 2000-01-20 | 2001-07-31 | Ludwig Institute For Cancer Research | Mage antigenic peptides which bind hla-b35 and hla-b44 |
| US11945850B2 (en) * | 2018-09-17 | 2024-04-02 | Immatics Biotechnologies Gmbh | B*44 restricted peptides for use in immunotherapy against cancers and related methods |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5888512A (en) * | 1987-01-30 | 1999-03-30 | Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Lymphocyte activity regulation by HLA peptides |
| US5342774A (en) * | 1991-05-23 | 1994-08-30 | Ludwig Institute For Cancer Research | Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1 |
| US5405940A (en) * | 1992-08-31 | 1995-04-11 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated nonapeptides derived from MAGE genes and uses thereof |
| JP3608788B2 (ja) * | 1992-08-31 | 2005-01-12 | ルドヴィグ・インスティテュート・フォー・キャンサー・リサーチ | Ｍａｇｅ−３遺伝子から誘導されてｈｌａ−ａ１により提示される単離されたノナペプチドおよびそれらの用途 |
| US5997870A (en) * | 1994-06-03 | 1999-12-07 | Ludwig Institute For Cancer Research | Isolated peptides which bind to HLA-B44 Molecules |
| US6060257A (en) * | 1994-06-03 | 2000-05-09 | Ludwig Institute For Cancer Research | Tumor rejection antigens presented by HLA-B44 molecules, and uses thereof |
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1995
- 1995-09-21 US US08/531,864 patent/US5977300A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-09 TW TW084111881A patent/TW387899B/zh not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-09-19 EP EP96935876A patent/EP0854727B1/en not_active Expired - Lifetime
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- 1996-09-19 CA CA002232325A patent/CA2232325C/en not_active Expired - Lifetime
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