JP3352429B2 - 組換えヒトエリトロポエチンを産生する発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法およびその利用法 - Google Patents
組換えヒトエリトロポエチンを産生する発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法およびその利用法Info
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- JP3352429B2 JP3352429B2 JP23900999A JP23900999A JP3352429B2 JP 3352429 B2 JP3352429 B2 JP 3352429B2 JP 23900999 A JP23900999 A JP 23900999A JP 23900999 A JP23900999 A JP 23900999A JP 3352429 B2 JP3352429 B2 JP 3352429B2
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、一般的には、ヒト
エリトロポエチン(erythropoietin)の
分子生物学の領域に関連するものである。さらに詳しく
は、本発明は、生物学的に活性な組換えヒトエリトロポ
エチン(rhEPO)を産生する発現系および分泌され
たrhEPOsを精製するための改良方法に関するもの
である。
エリトロポエチン(erythropoietin)の
分子生物学の領域に関連するものである。さらに詳しく
は、本発明は、生物学的に活性な組換えヒトエリトロポ
エチン(rhEPO)を産生する発現系および分泌され
たrhEPOsを精製するための改良方法に関するもの
である。
【0002】
【従来の技術】ヒトエリトロポエチン(hEPO)は、
30−40kDの分子量を有する糖蛋白質である。健康
な成人では、成熟hEPOは腎臓中で産生されそこから
分泌される。ヒトエリトロポエチンは、主に、脾臓、骨
髄および胎児肝細胞中のエリトロポエチン細胞の増殖を
促進し、赤血球の分化を促進する機能を有する。天然の
ヒトエリトロポエチンは、最初、再生不良性貧血の患者
の尿から調製された。患者の尿から得られるヒトエリト
ロポエチンの量は非常に僅少であり、ヒトエリトロポエ
チンを精製するための従来の方法は、多大の労力を必要
とし、時間を要するものである。それ故に、ヒトエリト
ロポエチンを簡便で経済的な方法で大量産生および大量
精製する方法を開発することが要請される。
30−40kDの分子量を有する糖蛋白質である。健康
な成人では、成熟hEPOは腎臓中で産生されそこから
分泌される。ヒトエリトロポエチンは、主に、脾臓、骨
髄および胎児肝細胞中のエリトロポエチン細胞の増殖を
促進し、赤血球の分化を促進する機能を有する。天然の
ヒトエリトロポエチンは、最初、再生不良性貧血の患者
の尿から調製された。患者の尿から得られるヒトエリト
ロポエチンの量は非常に僅少であり、ヒトエリトロポエ
チンを精製するための従来の方法は、多大の労力を必要
とし、時間を要するものである。それ故に、ヒトエリト
ロポエチンを簡便で経済的な方法で大量産生および大量
精製する方法を開発することが要請される。
【0003】哺乳動物のセルラインを宿主細胞として用
いた組換えヒトエリトロポエチン(rhEPO)を高レ
ベルで産生するための遺伝子工学技術が開発されてい
る。ヒトエリトロポエチン(hEPO)をコードするc
DNAフラグメントがJacobら(Jacob et
al.,Nature,313:806−809,1
985)によりクローニングされ塩基配列が決定され
た。さらに、Jacobと共同研究者らは、成熟ヒトエ
リトロポエチンをコードするcDNAフラグメントを導
入した発現ベクターを用いて、SV40プロモーターの
制御下で腎臓繊維芽細胞COS−1細胞を形質転換し、
当該形質転換された腎臓繊維芽細胞COS−1細胞から
その一時的な発現によりrhEPOを製造している。ま
た、Jacobらは製造したrhEPOの生物学的活性
を決定している。
いた組換えヒトエリトロポエチン(rhEPO)を高レ
ベルで産生するための遺伝子工学技術が開発されてい
る。ヒトエリトロポエチン(hEPO)をコードするc
DNAフラグメントがJacobら(Jacob et
al.,Nature,313:806−809,1
985)によりクローニングされ塩基配列が決定され
た。さらに、Jacobと共同研究者らは、成熟ヒトエ
リトロポエチンをコードするcDNAフラグメントを導
入した発現ベクターを用いて、SV40プロモーターの
制御下で腎臓繊維芽細胞COS−1細胞を形質転換し、
当該形質転換された腎臓繊維芽細胞COS−1細胞から
その一時的な発現によりrhEPOを製造している。ま
た、Jacobらは製造したrhEPOの生物学的活性
を決定している。
【0004】米国特許4,703,008,同5,44
1,868,同5,547,993,同5,621,0
80および同6,618,698は、ヒトエリトロポエ
チンの全長の遺伝子を有する5.6kbのゲノムDNA
のフラグメント、およびそのフラグメントを発現ベクタ
ー中に挿入してサルの繊維芽細胞COS−1細胞を形質
転換するために用いたことを開示している。当該形質転
換されたサルの繊維芽細胞COS−1細胞からrhEP
Oが一時的に分泌されていることが確認された。さら
に、rhEPOを産生できる安定な形質転換CHOセル
ラインがメトトレキサートの選択によって得られてい
る。また、大腸菌 E.coliおよびイースト中のr
hEPO発現系も開示されている。
1,868,同5,547,993,同5,621,0
80および同6,618,698は、ヒトエリトロポエ
チンの全長の遺伝子を有する5.6kbのゲノムDNA
のフラグメント、およびそのフラグメントを発現ベクタ
ー中に挿入してサルの繊維芽細胞COS−1細胞を形質
転換するために用いたことを開示している。当該形質転
換されたサルの繊維芽細胞COS−1細胞からrhEP
Oが一時的に分泌されていることが確認された。さら
に、rhEPOを産生できる安定な形質転換CHOセル
ラインがメトトレキサートの選択によって得られてい
る。また、大腸菌 E.coliおよびイースト中のr
hEPO発現系も開示されている。
【0005】昆虫細胞SF9中のバキュロウイルス系
が、rhEPOを製造するために使用された(Quel
le et al., Blood 74(2): 6
52−657,1989)。形質転換されたSF9細胞
からのrhEPOの収量は、著しく改良されているが
(500,000 U/培養液1リットル)、得られた
目的生成物の分子量は、グリコシル化が少ないために天
然のヒトエリトロポエチンの分子量よりも小さい。Mo
riと共同研究者ら(Gene 144(2):289
−293,1994)は、インターフェロン−α遺伝子
のプロモーターを有するrhEPO発現ベクターを構築
し、当該rhEPO発現ベクターをB細胞び白血病BA
LL−1細胞を形質転換するために用いた。センダイウ
イルスによりトランスフェクションすると、形質転換さ
れたB細胞の白血病BALL−1細胞は、それまでの研
究者が作製した形質転換体のいずれよりも高レベルでr
hEPOを産生した。
が、rhEPOを製造するために使用された(Quel
le et al., Blood 74(2): 6
52−657,1989)。形質転換されたSF9細胞
からのrhEPOの収量は、著しく改良されているが
(500,000 U/培養液1リットル)、得られた
目的生成物の分子量は、グリコシル化が少ないために天
然のヒトエリトロポエチンの分子量よりも小さい。Mo
riと共同研究者ら(Gene 144(2):289
−293,1994)は、インターフェロン−α遺伝子
のプロモーターを有するrhEPO発現ベクターを構築
し、当該rhEPO発現ベクターをB細胞び白血病BA
LL−1細胞を形質転換するために用いた。センダイウ
イルスによりトランスフェクションすると、形質転換さ
れたB細胞の白血病BALL−1細胞は、それまでの研
究者が作製した形質転換体のいずれよりも高レベルでr
hEPOを産生した。
【0006】コンディションド−メディウム(調整培養
液)からrhEPOを精製する方法は、通常、以下のよ
うなステップから成っている。第一に、rhEPOは、
DEAEセルロースカラム(Sherwood and
Goldwasser,Endocrinology
103(3): 866−870,1978)および
DEAE Sephacel カラム(Quelle
et al., Blood 74(2):652−6
57,1989; Inoue et al., Bi
ological and Pharmaceutic
al 17(2): 180−184,1994; B
en Ghanem et al.,Preparat
ive Biochemistry 24(2): 1
27−142,1994)のようなイオン交換クロマト
グラフィーカラムを通過させて選択的に吸着あるいは除
去した。
液)からrhEPOを精製する方法は、通常、以下のよ
うなステップから成っている。第一に、rhEPOは、
DEAEセルロースカラム(Sherwood and
Goldwasser,Endocrinology
103(3): 866−870,1978)および
DEAE Sephacel カラム(Quelle
et al., Blood 74(2):652−6
57,1989; Inoue et al., Bi
ological and Pharmaceutic
al 17(2): 180−184,1994; B
en Ghanem et al.,Preparat
ive Biochemistry 24(2): 1
27−142,1994)のようなイオン交換クロマト
グラフィーカラムを通過させて選択的に吸着あるいは除
去した。
【0007】第二に、rhEPOは、麦芽アグルチニン
−アガロース(Qian et al., Blood
68(1): 258−262,1986)およびコ
ンカナバリンA(ConA)−アガロース(Quell
e et al., Blood 74(2):652
−657,1989)のような固定化レクチン樹脂に特
異的に吸着させた。第三に、rhEPOを均一に精製す
るためにC4逆相HPLCが使用された(Lange
et al., Blood Cells 10(2−
3): 305−314,1984; Krystal
et al., Blood 67(1): 71−
79,1986; Quelle etal., Bl
ood 74(2):652−657,1989; I
noue et al., Biological a
nd Pharmaceutical 17(2):
180−184,1994)。米国特許5,322,8
37は、120,000−160,000U/mgの比
活性を示すrhEPOを均一に調製するためのC4逆相
HPLCを用いる方法を開示している。
−アガロース(Qian et al., Blood
68(1): 258−262,1986)およびコ
ンカナバリンA(ConA)−アガロース(Quell
e et al., Blood 74(2):652
−657,1989)のような固定化レクチン樹脂に特
異的に吸着させた。第三に、rhEPOを均一に精製す
るためにC4逆相HPLCが使用された(Lange
et al., Blood Cells 10(2−
3): 305−314,1984; Krystal
et al., Blood 67(1): 71−
79,1986; Quelle etal., Bl
ood 74(2):652−657,1989; I
noue et al., Biological a
nd Pharmaceutical 17(2):
180−184,1994)。米国特許5,322,8
37は、120,000−160,000U/mgの比
活性を示すrhEPOを均一に調製するためのC4逆相
HPLCを用いる方法を開示している。
【0008】固定化モノクローナル抗体のアフィニティ
ーカラムが、hEPO(またはrhEPO)を精製する
ために使用された。例えば、形質転換されたリンパ芽球
様細胞から分泌されたrhEPOは、抗hEPOモノク
ローナル抗体−Sepharose 4B アフィニテ
ィーカラムに特異的に吸着された(Ben Ghane
m et al., Preparative Bio
chemistry24(2): 127−142,1
994)。吸着されたrhEPOフラクションを溶出
し、次いで、DEAE Sephacel イオン交換
カラムを通過させた。均一な生成物のrhEPOが約5
0%の収率で得られた。
ーカラムが、hEPO(またはrhEPO)を精製する
ために使用された。例えば、形質転換されたリンパ芽球
様細胞から分泌されたrhEPOは、抗hEPOモノク
ローナル抗体−Sepharose 4B アフィニテ
ィーカラムに特異的に吸着された(Ben Ghane
m et al., Preparative Bio
chemistry24(2): 127−142,1
994)。吸着されたrhEPOフラクションを溶出
し、次いで、DEAE Sephacel イオン交換
カラムを通過させた。均一な生成物のrhEPOが約5
0%の収率で得られた。
【0009】
【発明が解決しようとする課題】組換えDNA技術を利
用することによって、rhEPOの収量は増加している
が、得られたrhEPOを均一に精製するには、特に、
大量のrhEPOを調製する必要がある場合には、いま
だ多大の労力と長時間が必要とされる。先行技術は、発
現系で大量のrhEPOを産生する効果的な手段に欠け
ていて、不十分である。さらに、先行技術は、大量のr
hEPOを精製する効果的な手段に欠けていて、不十分
である。本発明は、当該技術分野におけるこれらの長年
の要請と願望を実現化するものである。
用することによって、rhEPOの収量は増加している
が、得られたrhEPOを均一に精製するには、特に、
大量のrhEPOを調製する必要がある場合には、いま
だ多大の労力と長時間が必要とされる。先行技術は、発
現系で大量のrhEPOを産生する効果的な手段に欠け
ていて、不十分である。さらに、先行技術は、大量のr
hEPOを精製する効果的な手段に欠けていて、不十分
である。本発明は、当該技術分野におけるこれらの長年
の要請と願望を実現化するものである。
【0010】
【課題を解決するための手段】本発明は、rhEPOを
産生する新たに開発された発現系を提供するものであ
る。また、本発明は、分泌されたrhEPOを二段ステ
ップのカラムクロマトグラフィーの手法を用いて精製す
る新しい方法を提供するものである。目的の蛋白質rh
EPOを発現させるために、成熟rhEPOをコードす
るPCR−増幅cDNAフラグメントをサイトメガロウ
イルス(CMV)プロモーターの制御下に発現ベクター
中に挿入した。高収率でrhEPOを安定して産生し、
分泌する発現系を保有する形質転換体(BHK−21細
胞)は、抗生物質G418による選別によって得られ
た。産生されたrhEPO類を精製するために、まず、
目的蛋白質を塩析法を用いてコンディションド−メディ
ウムから沈殿させた。沈殿部分に含まれている糖蛋白質
を固定化レクチン樹脂に選択的に吸着させた。結合した
糖蛋白質を0.5Mのマンノースを含むバッファーで溶
出すると分子量約34kDの主成分と分子量35−45
kDの微量成分を含むrhEPO類が得られた。0.5
Mのマンノースを含むバッファーで溶出されないで強固
に結合しているrhEPO類の別のプールが酸性バッフ
ァー(pH4.0)で得られた。これらのrhEPOの
アイソフォーム(isoform)は、G−75クロマ
トグラフィーカラムを通過させることによりさらに精製
された。
産生する新たに開発された発現系を提供するものであ
る。また、本発明は、分泌されたrhEPOを二段ステ
ップのカラムクロマトグラフィーの手法を用いて精製す
る新しい方法を提供するものである。目的の蛋白質rh
EPOを発現させるために、成熟rhEPOをコードす
るPCR−増幅cDNAフラグメントをサイトメガロウ
イルス(CMV)プロモーターの制御下に発現ベクター
中に挿入した。高収率でrhEPOを安定して産生し、
分泌する発現系を保有する形質転換体(BHK−21細
胞)は、抗生物質G418による選別によって得られ
た。産生されたrhEPO類を精製するために、まず、
目的蛋白質を塩析法を用いてコンディションド−メディ
ウムから沈殿させた。沈殿部分に含まれている糖蛋白質
を固定化レクチン樹脂に選択的に吸着させた。結合した
糖蛋白質を0.5Mのマンノースを含むバッファーで溶
出すると分子量約34kDの主成分と分子量35−45
kDの微量成分を含むrhEPO類が得られた。0.5
Mのマンノースを含むバッファーで溶出されないで強固
に結合しているrhEPO類の別のプールが酸性バッフ
ァー(pH4.0)で得られた。これらのrhEPOの
アイソフォーム(isoform)は、G−75クロマ
トグラフィーカラムを通過させることによりさらに精製
された。
【0011】本発明で開示されている精製方法は、以下
の利点を有する: (1)最初のステップで目的の蛋白質rhEPO類は、
沈殿により濃縮され、それによって、rhEPO類の大
量調製が一層容易になる。 (2)従来の精製法では必要とされていた逆相HPLC
やイムノアフィニティーカラムクロマトグラフィーを使
用することなしに、より高い比活性を示す分子量35−
45kDのrhEPO類のプールとそれらのアイソフォ
ームである分子量25−34kDのもう一つのプールを
得ることが可能である。
の利点を有する: (1)最初のステップで目的の蛋白質rhEPO類は、
沈殿により濃縮され、それによって、rhEPO類の大
量調製が一層容易になる。 (2)従来の精製法では必要とされていた逆相HPLC
やイムノアフィニティーカラムクロマトグラフィーを使
用することなしに、より高い比活性を示す分子量35−
45kDのrhEPO類のプールとそれらのアイソフォ
ームである分子量25−34kDのもう一つのプールを
得ることが可能である。
【0012】本発明の一つの具体例では、ヒトエリトロ
ポエチンをコードするcDNAフラグメントとサイトメ
ガロウイルス(CMV)のプロモーター制御下のpcD
NA3.1ベクターを含有する発現ベクターが提供され
る。さらに、当該cDNAフラグメントは、好適には、
SEQ ID No:1(配列番号1)およびSEQI
D No:2(配列番号2)から成るグループから選択
されたプライマーを用いてPCR法によって製造され
る。
ポエチンをコードするcDNAフラグメントとサイトメ
ガロウイルス(CMV)のプロモーター制御下のpcD
NA3.1ベクターを含有する発現ベクターが提供され
る。さらに、当該cDNAフラグメントは、好適には、
SEQ ID No:1(配列番号1)およびSEQI
D No:2(配列番号2)から成るグループから選択
されたプライマーを用いてPCR法によって製造され
る。
【0013】本発明のもう一つの具体例では、上記発現
ベクターを保有したセルラインが提供される。当該セル
ラインは、好適には、抗生物質G418によってスクリ
ーニングされる。さらに、当該セルラインは、BHK−
21であることが好ましい。さらに、本発明のもう一つ
の具体例では、上記セルラインをコンディションド−メ
ディウム中で培養し、ヒトエリトロポエチンの産生を検
出することによってヒトエリトロポエチンを製造する方
法が提供される。好適には、当該方法によって、産生さ
れたヒトエリトロポエチンが提供される。
ベクターを保有したセルラインが提供される。当該セル
ラインは、好適には、抗生物質G418によってスクリ
ーニングされる。さらに、当該セルラインは、BHK−
21であることが好ましい。さらに、本発明のもう一つ
の具体例では、上記セルラインをコンディションド−メ
ディウム中で培養し、ヒトエリトロポエチンの産生を検
出することによってヒトエリトロポエチンを製造する方
法が提供される。好適には、当該方法によって、産生さ
れたヒトエリトロポエチンが提供される。
【0014】さらに、本発明のもう一つの具体例では、
サンプルからヒトエリトロポエチンを沈殿させるステッ
プと、沈殿したヒトエリトロポエチンを固定化レクチン
カラムに適用し、次いで、ゲルろ過カラムからヒトエリ
トロポエチンを溶出するステップを含むヒトエリトロポ
エチンの精製方法が提供される。好適には、得られた精
製ヒトエリトロポエチンは、分子量35−45kDのア
イソフォームを含有し、約90%の純度である。さら
に、本発明のもう一つの具体例では、上記方法によって
産生されたヒトエリトロポエチンを造血細胞に投与する
ことによって当該細胞の増殖を促進する方法が提供され
る。さらに、本発明のもう一つの具体例では、上記方法
によって産生されたヒトエリトロポエチンと薬学的に許
容され担体から成る医薬組成物が提供される。本発明の
その他のさらなる態様、特徴、および利点は、開示を目
的としてここに提示する本発明の好適な具体例に関する
以下の説明によって明らかである。
サンプルからヒトエリトロポエチンを沈殿させるステッ
プと、沈殿したヒトエリトロポエチンを固定化レクチン
カラムに適用し、次いで、ゲルろ過カラムからヒトエリ
トロポエチンを溶出するステップを含むヒトエリトロポ
エチンの精製方法が提供される。好適には、得られた精
製ヒトエリトロポエチンは、分子量35−45kDのア
イソフォームを含有し、約90%の純度である。さら
に、本発明のもう一つの具体例では、上記方法によって
産生されたヒトエリトロポエチンを造血細胞に投与する
ことによって当該細胞の増殖を促進する方法が提供され
る。さらに、本発明のもう一つの具体例では、上記方法
によって産生されたヒトエリトロポエチンと薬学的に許
容され担体から成る医薬組成物が提供される。本発明の
その他のさらなる態様、特徴、および利点は、開示を目
的としてここに提示する本発明の好適な具体例に関する
以下の説明によって明らかである。
【0015】
【発明の実施の形態】本発明は、哺乳動物の宿主細胞で
ヒトエリトロポエチンをコードするクローン化したcD
NAフラグメントを有する発現ベクターから成る発現系
に関するものである。当該cDNAフラグメントは、ポ
リメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって増幅された。
実際には、ヒトエリトロポエチンをコードする鋳型DN
Aフラグメントは、ファージのcDNAライブラリーか
ら抽出された。PCR反応法に用いられた二種のプライ
マー(SEQ ID Nos:1−2)は、Jacob
と共同研究者ら(Nature 313: 806−8
09,1985)によって報告されている配列にしたが
ってデザインされた。HindIII制限部位は、一つ
のプライマーの5′末端に導入され、XbaI制限部位
は、他のプライマーの3′末端に付加された。当該PC
Rの生成物は、シグナルペプチドのコード配列を含む5
96bpのフラグメントであると考えられる。当該PC
Rは、標準の方法で実施された。得られた反応混合物
は、フェノール/クロロホルムで抽出し、第二ランドの
PCRに鋳型として用いた。約600bpのフラグメン
トが得られ、DNA配列決定法によって同定された。
ヒトエリトロポエチンをコードするクローン化したcD
NAフラグメントを有する発現ベクターから成る発現系
に関するものである。当該cDNAフラグメントは、ポ
リメラーゼ連鎖反応法(PCR)によって増幅された。
実際には、ヒトエリトロポエチンをコードする鋳型DN
Aフラグメントは、ファージのcDNAライブラリーか
ら抽出された。PCR反応法に用いられた二種のプライ
マー(SEQ ID Nos:1−2)は、Jacob
と共同研究者ら(Nature 313: 806−8
09,1985)によって報告されている配列にしたが
ってデザインされた。HindIII制限部位は、一つ
のプライマーの5′末端に導入され、XbaI制限部位
は、他のプライマーの3′末端に付加された。当該PC
Rの生成物は、シグナルペプチドのコード配列を含む5
96bpのフラグメントであると考えられる。当該PC
Rは、標準の方法で実施された。得られた反応混合物
は、フェノール/クロロホルムで抽出し、第二ランドの
PCRに鋳型として用いた。約600bpのフラグメン
トが得られ、DNA配列決定法によって同定された。
【0016】確認されたヒトエリトロポエチンのcDN
Aフラグメントは、pcDNA3.1ベクター(Nov
agene社から購入)のHindIII制限部位とX
baI制限部位の間に連結した。こようにしてrhEP
Oを産生するpcDNA3.1発現ベクターを調製し
て、pcDNA3.1−HCと命名した。その制限地図
を、図1に示した。クローン化されたcDNAの発現
は、CMVプロモーターの制御下にあった。構築された
発現ベクターで宿主株 E.coli(NovaBlu
e)を形質転換して形質転換体を作製した。
Aフラグメントは、pcDNA3.1ベクター(Nov
agene社から購入)のHindIII制限部位とX
baI制限部位の間に連結した。こようにしてrhEP
Oを産生するpcDNA3.1発現ベクターを調製し
て、pcDNA3.1−HCと命名した。その制限地図
を、図1に示した。クローン化されたcDNAの発現
は、CMVプロモーターの制御下にあった。構築された
発現ベクターで宿主株 E.coli(NovaBlu
e)を形質転換して形質転換体を作製した。
【0017】また、本発明は、rhEPOを分泌する哺
乳動物セルラインを提供する。上記pcDNA3.1−
HCを用いて、電気穿孔法によってベビーハムスターの
腎臓繊維芽細胞BHK−21細胞(ATCC CCL−
10)を形質転換した。得られたBHK−21形質転換
体を100−400 mg/mlの各種濃度の抗生物質
G418によってスクリーニングした。抗生物質G41
8−耐性のものを採取し、増やした。最も高いレベルの
rhEPOを分泌するクローンをBHK21−pcDN
A3.1−HCと命名した。BHK21−pcDNA
3.1−HCから分泌されたrhEPOの生物学的活性
を、エリトロ白血病細胞TF−1の増殖を促進する能力
を評価することによって決定した。さらに、分泌された
rhEPOの免疫化学的特性を確認するために、ウエス
タンブロット法とELISA法を使用した。
乳動物セルラインを提供する。上記pcDNA3.1−
HCを用いて、電気穿孔法によってベビーハムスターの
腎臓繊維芽細胞BHK−21細胞(ATCC CCL−
10)を形質転換した。得られたBHK−21形質転換
体を100−400 mg/mlの各種濃度の抗生物質
G418によってスクリーニングした。抗生物質G41
8−耐性のものを採取し、増やした。最も高いレベルの
rhEPOを分泌するクローンをBHK21−pcDN
A3.1−HCと命名した。BHK21−pcDNA
3.1−HCから分泌されたrhEPOの生物学的活性
を、エリトロ白血病細胞TF−1の増殖を促進する能力
を評価することによって決定した。さらに、分泌された
rhEPOの免疫化学的特性を確認するために、ウエス
タンブロット法とELISA法を使用した。
【0018】本発明は、BHK21−pcDNA3.1
−HCのようなセルラインから分泌されたrhEPOの
アイソフォームを、逆相HPLCを使用することなく分
画する新しい方法を提供する。当該方法では、目的のr
hEPO類をまず最初に塩析法を用いて沈殿させる。種
々の量の硫酸アンモニウム(m/v)をコンディション
ド−メディウムに加え、分画されたプールを集めてドッ
トブロッティング法によって分析した結果、硫酸アンモ
ニウムの飽和度が50%から80%に達すると目的のr
hEPO類の全部を沈殿できることが判明した。第二
に、採取した分画を固定化レクチン樹脂とインキュベー
トして目的のrhEPO類を含有する糖蛋白質を吸着し
た。結合した蛋白質類を遊離させるために使用したバッ
ファーは、マンノースの0.5M濃度までの増加グラデ
ィエントから成っていた。強固に結合している分画は、
その後で酸性バッファー(pH 4.0)により溶出し
た。集められたプールの両者はともにrhEPOの生物
学的活性と免疫化学的特性を示した。第三に、集められ
たプールの各々を濃縮し、次いで、SephadexG
−75のカラムに通した。マンノース溶出分画は、分子
量約34kDの三種の主成分と分子量35−45kDの
微少成分から成るrhEPO類のプールを含んでいる。
当該rhEPO類のプールは、約90%の純度を示し、
240,000U/mgに達する比活性を示した。この
比活性は、CHO細胞から産生されたrhEPOの生物
学的活性によって算出されたTF−1細胞に対する比活
性と同等であった。酸−溶出部分は、分子量34kD、
28kDおよび25kDの三種の主rhEPOアイソフ
ォームを含有しており、Sephadex G−75の
カラムクロマトグラフィーで均一に精製することができ
る。これらのrhEPOアイソフォーム類は、マンノー
ス溶出プールから得られたrhEPO類よりも低い比活
性を示す(80,000−12,400U/mg)。
−HCのようなセルラインから分泌されたrhEPOの
アイソフォームを、逆相HPLCを使用することなく分
画する新しい方法を提供する。当該方法では、目的のr
hEPO類をまず最初に塩析法を用いて沈殿させる。種
々の量の硫酸アンモニウム(m/v)をコンディション
ド−メディウムに加え、分画されたプールを集めてドッ
トブロッティング法によって分析した結果、硫酸アンモ
ニウムの飽和度が50%から80%に達すると目的のr
hEPO類の全部を沈殿できることが判明した。第二
に、採取した分画を固定化レクチン樹脂とインキュベー
トして目的のrhEPO類を含有する糖蛋白質を吸着し
た。結合した蛋白質類を遊離させるために使用したバッ
ファーは、マンノースの0.5M濃度までの増加グラデ
ィエントから成っていた。強固に結合している分画は、
その後で酸性バッファー(pH 4.0)により溶出し
た。集められたプールの両者はともにrhEPOの生物
学的活性と免疫化学的特性を示した。第三に、集められ
たプールの各々を濃縮し、次いで、SephadexG
−75のカラムに通した。マンノース溶出分画は、分子
量約34kDの三種の主成分と分子量35−45kDの
微少成分から成るrhEPO類のプールを含んでいる。
当該rhEPO類のプールは、約90%の純度を示し、
240,000U/mgに達する比活性を示した。この
比活性は、CHO細胞から産生されたrhEPOの生物
学的活性によって算出されたTF−1細胞に対する比活
性と同等であった。酸−溶出部分は、分子量34kD、
28kDおよび25kDの三種の主rhEPOアイソフ
ォームを含有しており、Sephadex G−75の
カラムクロマトグラフィーで均一に精製することができ
る。これらのrhEPOアイソフォーム類は、マンノー
ス溶出プールから得られたrhEPO類よりも低い比活
性を示す(80,000−12,400U/mg)。
【0019】本発明の一つの具体例では、ヒトエリトロ
ポエチンをコードするcDNAフラグメントとサイトメ
ガロウイルスのプロモーター制御下のpcDNA3.1
ベクターを含有する発現ベクターが提供される。さら
に、当該cDNAフラグメントは、好適には、SEQ
ID No:1(配列番号1)とSEQ ID No:
2(配列番号2)から成るグループから選択されたプラ
イマーを用いてPCR法によって製造される。本発明の
もう一つの具体例では、上記発現ベクターを保有したセ
ルラインが提供される。当該セルラインは、好適には、
抗生物質G418によってスクリーニングされる。さら
に、好適には、当該セルラインは、BHK−21であ
る。さらに、本発明のもう一つの具体例では、上記セル
ラインをコンディションド−メディウム中で培養し、産
生物を検出することによって、ヒトエリトロポエチンを
製造する方法が提供される。好ましくは、この方法によ
って製造されたヒトエリトロポエチンが提供される。
ポエチンをコードするcDNAフラグメントとサイトメ
ガロウイルスのプロモーター制御下のpcDNA3.1
ベクターを含有する発現ベクターが提供される。さら
に、当該cDNAフラグメントは、好適には、SEQ
ID No:1(配列番号1)とSEQ ID No:
2(配列番号2)から成るグループから選択されたプラ
イマーを用いてPCR法によって製造される。本発明の
もう一つの具体例では、上記発現ベクターを保有したセ
ルラインが提供される。当該セルラインは、好適には、
抗生物質G418によってスクリーニングされる。さら
に、好適には、当該セルラインは、BHK−21であ
る。さらに、本発明のもう一つの具体例では、上記セル
ラインをコンディションド−メディウム中で培養し、産
生物を検出することによって、ヒトエリトロポエチンを
製造する方法が提供される。好ましくは、この方法によ
って製造されたヒトエリトロポエチンが提供される。
【0020】さらに、本発明のもう一つの具体例では、
サンプルからヒトエリトロポエチンを沈殿させるステッ
プと、沈殿したヒトエリトロポエチンを固定化レクチン
カラムに適用し、次いで、ゲルろ過カラムからヒトエリ
トロポエチンを溶出するステップを含むヒトエリトロポ
エチンの精製方法が提供される。得られた精製ヒトエリ
トロポエチンは、好ましくは、分子量35−45kDの
アイソフォームを含有し、約90%の純度である。さら
に、本発明のもう一つの具体例では、上記方法によって
産生されたヒトエリトロポエチンを造血細胞に投与する
ことによって当該細胞の増殖を促進する方法が提供され
る。さらに、本発明のもう一つの具体例では、上記方法
によって製造されたヒトエリトロポエチンと薬学的に許
容される担体から成る医薬組成物が提供される。
サンプルからヒトエリトロポエチンを沈殿させるステッ
プと、沈殿したヒトエリトロポエチンを固定化レクチン
カラムに適用し、次いで、ゲルろ過カラムからヒトエリ
トロポエチンを溶出するステップを含むヒトエリトロポ
エチンの精製方法が提供される。得られた精製ヒトエリ
トロポエチンは、好ましくは、分子量35−45kDの
アイソフォームを含有し、約90%の純度である。さら
に、本発明のもう一つの具体例では、上記方法によって
産生されたヒトエリトロポエチンを造血細胞に投与する
ことによって当該細胞の増殖を促進する方法が提供され
る。さらに、本発明のもう一つの具体例では、上記方法
によって製造されたヒトエリトロポエチンと薬学的に許
容される担体から成る医薬組成物が提供される。
【0021】
【実施例】以下の実施例は、本発明の種々の具体例を説
明するために記述されたものであり、本発明を何ら制限
することを意味しない。 実施例1 hEPOコードするcDNAフラグメントの増幅 PCRに使用された鋳型cDNAは、ヒト肝臓のcDN
Aライブラリー(ClonTech,カタログno.H
L3006a)からフェノール/クロロホルムで抽出さ
れた。PCRに使用されたプライマーは、報告されてい
る配列(Jacob et al.,Nature,3
13:806−809,1985)にしたがってデザイ
ンされたもので、以下に示される: EPOS:5′−GCAAGCTTATGGGGGTG
CACGAATG−3′(SEQ ID No:1) EPOX:5′−GCATCTAGATCATCTGT
CCCCTGTCCT−3′(SEQ ID No:
2)
明するために記述されたものであり、本発明を何ら制限
することを意味しない。 実施例1 hEPOコードするcDNAフラグメントの増幅 PCRに使用された鋳型cDNAは、ヒト肝臓のcDN
Aライブラリー(ClonTech,カタログno.H
L3006a)からフェノール/クロロホルムで抽出さ
れた。PCRに使用されたプライマーは、報告されてい
る配列(Jacob et al.,Nature,3
13:806−809,1985)にしたがってデザイ
ンされたもので、以下に示される: EPOS:5′−GCAAGCTTATGGGGGTG
CACGAATG−3′(SEQ ID No:1) EPOX:5′−GCATCTAGATCATCTGT
CCCCTGTCCT−3′(SEQ ID No:
2)
【0022】プライマーEPOSは、翻訳開始コドンと
それに続く導入されたHindIII制限部位を含有し
ている。プライマーEPOXは、翻訳停止コドンで終了
しているコード配列の末端にある配列で、そこにXba
I制限部位が付加されている。PCRの第一ラウンド用
の反応混合物は、1mlの事前に調製された鋳型cDN
A,1mlずつの二つのプライマー(0.5mM),1
0mlの反応バッファー,0.5ml(1.25単位)
の Ex Taq DNAポリメラーゼ(Takar
a,Japan)および100mlの最終体積に合致す
る十分な水を含んでいる。正規の加熱サイクルに先だっ
て反応混合物を5分間95℃に加熱した。続いて、反応
混合物を、1分間95℃、次いで、1分間50℃、最後
に3分間72℃で加熱変性した。この加熱サイクルを3
0回繰り返した後、最後のポリメリゼーションを完結す
るために生成物を7分間72℃でインキュベートした。
このPCRの操作は、‘Touch Down’加熱サ
イクラー装置(Hybaid)の制御下で実施された。
得られた生成物を抽出し、次のPCRサイクルの鋳型D
NAとして使用するために調製した。第二ラウンドのP
CR反応の加熱サイクルは、アニーリング温度を52℃
に変更した以外は第一のPCRの操作サイクルと同様に
した。得られた生成物を1.5%アガロースゲル電気泳
動法で解析した。約600bpの大きさを有する増幅D
NAフラグメントが得られ、DNA配列決定法により確
認された。
それに続く導入されたHindIII制限部位を含有し
ている。プライマーEPOXは、翻訳停止コドンで終了
しているコード配列の末端にある配列で、そこにXba
I制限部位が付加されている。PCRの第一ラウンド用
の反応混合物は、1mlの事前に調製された鋳型cDN
A,1mlずつの二つのプライマー(0.5mM),1
0mlの反応バッファー,0.5ml(1.25単位)
の Ex Taq DNAポリメラーゼ(Takar
a,Japan)および100mlの最終体積に合致す
る十分な水を含んでいる。正規の加熱サイクルに先だっ
て反応混合物を5分間95℃に加熱した。続いて、反応
混合物を、1分間95℃、次いで、1分間50℃、最後
に3分間72℃で加熱変性した。この加熱サイクルを3
0回繰り返した後、最後のポリメリゼーションを完結す
るために生成物を7分間72℃でインキュベートした。
このPCRの操作は、‘Touch Down’加熱サ
イクラー装置(Hybaid)の制御下で実施された。
得られた生成物を抽出し、次のPCRサイクルの鋳型D
NAとして使用するために調製した。第二ラウンドのP
CR反応の加熱サイクルは、アニーリング温度を52℃
に変更した以外は第一のPCRの操作サイクルと同様に
した。得られた生成物を1.5%アガロースゲル電気泳
動法で解析した。約600bpの大きさを有する増幅D
NAフラグメントが得られ、DNA配列決定法により確
認された。
【0023】実施例2 hEPO発現ベクター(pcDNA3.1−HC)の構
築 実施例1で得られたゲル精製DNAフラグメントとpc
DNA3.1(Invitrogen)の両者を制限酵
素HindIIIとXbaIで切断した。消化されたD
NAフラグメントはアガロースゲル上の電気泳動で分画
され、抽出された。連結混合物は50ngのPCR−増
幅DNAフラグメントと20ngのpcDNA3.1ベ
クターを含有していた。連結生成物はDNA配列決定法
により同定され、pcDNA3.1−HCと命名され
た。当該rhEPO発現ベクターpcDNA3.1−H
Cは1999年7月22日にpcDNA3.1−HC
(ATCC assigned number:PTA
−420)としてATCCに国際寄託された。その制限
地図を図1に示した。当該pcDNA3.1−HCをN
ovaBlue(Novagene)コンピテント細胞
に形質転換し、アンピシリン(100mg/ml)およ
びテトラサイクリン(25mg/ml)の両者に耐性の
あるクローンを選択した。尚、図1は、rhEPOを産
生するpcDNA3.1発現ベクター、すなわちpcD
NA3.1−HCの制限地図を示している。確認されて
いるヒトエリトロポエチンcDNAフラグメントをpc
DNA3.1(Novagene社から購入)の制限部
位HindIIIとXbaIの間に連結した。
築 実施例1で得られたゲル精製DNAフラグメントとpc
DNA3.1(Invitrogen)の両者を制限酵
素HindIIIとXbaIで切断した。消化されたD
NAフラグメントはアガロースゲル上の電気泳動で分画
され、抽出された。連結混合物は50ngのPCR−増
幅DNAフラグメントと20ngのpcDNA3.1ベ
クターを含有していた。連結生成物はDNA配列決定法
により同定され、pcDNA3.1−HCと命名され
た。当該rhEPO発現ベクターpcDNA3.1−H
Cは1999年7月22日にpcDNA3.1−HC
(ATCC assigned number:PTA
−420)としてATCCに国際寄託された。その制限
地図を図1に示した。当該pcDNA3.1−HCをN
ovaBlue(Novagene)コンピテント細胞
に形質転換し、アンピシリン(100mg/ml)およ
びテトラサイクリン(25mg/ml)の両者に耐性の
あるクローンを選択した。尚、図1は、rhEPOを産
生するpcDNA3.1発現ベクター、すなわちpcD
NA3.1−HCの制限地図を示している。確認されて
いるヒトエリトロポエチンcDNAフラグメントをpc
DNA3.1(Novagene社から購入)の制限部
位HindIIIとXbaIの間に連結した。
【0024】実施例3 rhEPO−発現哺乳動物宿主細胞BHK21−pcD
NA3.1−HCのクローニング セルラインBHK−21(ATCC CCL−10)を
10%の牛胎児血清を含む標準DMEM培地中で生育し
た。形質転換を行うために、107 個のBHK−21細
胞を0.8mlのPBSバッファー(10mMリン酸バ
ッファー、pH7.2)中に懸濁させ、10mgのcD
NA3.1−HC(Gene Pulser II s
ystem,BioRad)とともに電気穿孔した。得
られた細胞懸濁液を10mlの標準DMEM培地で希釈
した。形質転換されたBHK−21細胞を、まず、最初
の24時間普通に使用されたDMEM培地中で、続い
て、G418(400mg/ml)を含む新鮮なDME
M培地中で培養した。抗生物質G418に耐性のあるク
ローンをスクリーニングして、同じ培地中で増やした。
NA3.1−HCのクローニング セルラインBHK−21(ATCC CCL−10)を
10%の牛胎児血清を含む標準DMEM培地中で生育し
た。形質転換を行うために、107 個のBHK−21細
胞を0.8mlのPBSバッファー(10mMリン酸バ
ッファー、pH7.2)中に懸濁させ、10mgのcD
NA3.1−HC(Gene Pulser II s
ystem,BioRad)とともに電気穿孔した。得
られた細胞懸濁液を10mlの標準DMEM培地で希釈
した。形質転換されたBHK−21細胞を、まず、最初
の24時間普通に使用されたDMEM培地中で、続い
て、G418(400mg/ml)を含む新鮮なDME
M培地中で培養した。抗生物質G418に耐性のあるク
ローンをスクリーニングして、同じ培地中で増やした。
【0025】各クローンからコンディションド−メディ
ウムを集め、分泌されたrhEPOの生物学的活性を、
エリトロ白血病細胞TF−1(ATCC CRL−20
03; Kitamura et al.,J. Ce
ll Physiol. 140: 323−334,
1989)の増殖を促進する能力によって決定した。
通常、TF−1細胞は、組換えヒトGM−CSF(rh
GM−CSF, 2pg/ml, R&D Syste
m)の存在下RPMI1640培地中で生育した。96
−ウエルプレート上での増殖試験を行うために、103
個のTF−1細胞を、rhGM−CSFの不在下で50
mlのRPMI1640培地中に懸濁させ、その中に上
記クローン培養の各々から採集されたコンディションド
−メディウムを加えた。プレートは4日間通常の条件で
インキュベートされた。続いて、生存できるTF−1細
胞を標識するためにXTT増殖キット(Boehrin
ger Mannheim社から購入)加え、プレート
はさらに12−16時間インキュベートされた。自動E
LISAリーダー(ANthos 2001)を使い、
492nmの波長でインキュベートされたTF−1細胞
の光学密度(OD)を測定した。対照となるバックグラ
ンドは620nmの波長で読み取られた光学密度の値と
した。最も高い増殖強化能力を示すクローンがスクリー
ニングされBHK21−pcDNA3.1−HCと命名
された。当該BHK21−pcDNA3.1−HCは1
999年7月22日にBHK21−pcDNA3.1−
HC(ATCC assigned number:P
TA−419)としてATCCに国際寄託されている。
ウムを集め、分泌されたrhEPOの生物学的活性を、
エリトロ白血病細胞TF−1(ATCC CRL−20
03; Kitamura et al.,J. Ce
ll Physiol. 140: 323−334,
1989)の増殖を促進する能力によって決定した。
通常、TF−1細胞は、組換えヒトGM−CSF(rh
GM−CSF, 2pg/ml, R&D Syste
m)の存在下RPMI1640培地中で生育した。96
−ウエルプレート上での増殖試験を行うために、103
個のTF−1細胞を、rhGM−CSFの不在下で50
mlのRPMI1640培地中に懸濁させ、その中に上
記クローン培養の各々から採集されたコンディションド
−メディウムを加えた。プレートは4日間通常の条件で
インキュベートされた。続いて、生存できるTF−1細
胞を標識するためにXTT増殖キット(Boehrin
ger Mannheim社から購入)加え、プレート
はさらに12−16時間インキュベートされた。自動E
LISAリーダー(ANthos 2001)を使い、
492nmの波長でインキュベートされたTF−1細胞
の光学密度(OD)を測定した。対照となるバックグラ
ンドは620nmの波長で読み取られた光学密度の値と
した。最も高い増殖強化能力を示すクローンがスクリー
ニングされBHK21−pcDNA3.1−HCと命名
された。当該BHK21−pcDNA3.1−HCは1
999年7月22日にBHK21−pcDNA3.1−
HC(ATCC assigned number:P
TA−419)としてATCCに国際寄託されている。
【0026】実施例4 BHK21−pcDNA3.1−HCによって分泌され
たrhEPOの生物学的活性 抗生物質G418を含有するカルチャー培地に、上記実
施例3で得られたBHK21−pcDNA3.1−HC
を接種し(2x104 細胞/ml培地)7日間生育させ
た。コンディションド−メディウムを採取し、下記の試
験を順次行った。形質転換CHO細胞から産生されたr
hEPOは、0.1−0.5単位/mlのED50値( 3
H−チミジン インコーポレーション法により評価)の
TF−1細胞増殖強化の生物学的活性を持っている。T
F−1細胞に対する増殖試験に用いるために、上記標準
rhEPOを5.0,2.5,1.25,0.63,
0.32,0.16,0.08および0.04単位/m
lに希釈した。上述したXTT法を用いた。光学密度O
D492-620nm 値(黒丸)の標準曲線を図2に示した。E
D50値は0.5単位/mlに換算されている。コンディ
ションド−メディウムの二倍ずつの連続希釈法が上述の
条件下での増殖試験に用いられた。測定した光学密度O
D492-620nm 値(白丸)の曲線を図2に示した。BHK
21−pcDNA3.1−HCによって分泌されたrh
EPOの生物学的活性は、CHO細胞から分泌されたr
hEPOの生物学的活性と同等の19.2単位/mlと
算出された。尚、図2は、BHK21−pcDNA3.
1−HCによって分泌されたrhEPOの生物学的活性
を示している。黒丸は、培地を連続希釈した後の取得r
hEPOのOD値(スタンダード)を表している。白丸
は、BHK21−pcDNA3.1−HCによって分泌
されたrhEPOのOD値を表している。後者の生物学
的活性は、19.2単位/mlと算出され、この値は、
CHO細胞から分泌されたrhEPOの生物学的活性と
同等であった。
たrhEPOの生物学的活性 抗生物質G418を含有するカルチャー培地に、上記実
施例3で得られたBHK21−pcDNA3.1−HC
を接種し(2x104 細胞/ml培地)7日間生育させ
た。コンディションド−メディウムを採取し、下記の試
験を順次行った。形質転換CHO細胞から産生されたr
hEPOは、0.1−0.5単位/mlのED50値( 3
H−チミジン インコーポレーション法により評価)の
TF−1細胞増殖強化の生物学的活性を持っている。T
F−1細胞に対する増殖試験に用いるために、上記標準
rhEPOを5.0,2.5,1.25,0.63,
0.32,0.16,0.08および0.04単位/m
lに希釈した。上述したXTT法を用いた。光学密度O
D492-620nm 値(黒丸)の標準曲線を図2に示した。E
D50値は0.5単位/mlに換算されている。コンディ
ションド−メディウムの二倍ずつの連続希釈法が上述の
条件下での増殖試験に用いられた。測定した光学密度O
D492-620nm 値(白丸)の曲線を図2に示した。BHK
21−pcDNA3.1−HCによって分泌されたrh
EPOの生物学的活性は、CHO細胞から分泌されたr
hEPOの生物学的活性と同等の19.2単位/mlと
算出された。尚、図2は、BHK21−pcDNA3.
1−HCによって分泌されたrhEPOの生物学的活性
を示している。黒丸は、培地を連続希釈した後の取得r
hEPOのOD値(スタンダード)を表している。白丸
は、BHK21−pcDNA3.1−HCによって分泌
されたrhEPOのOD値を表している。後者の生物学
的活性は、19.2単位/mlと算出され、この値は、
CHO細胞から分泌されたrhEPOの生物学的活性と
同等であった。
【0027】実施例5 ELISA法を用いた、BHK21−pcDNA3.1
−HCから分泌されたrhEPOの免疫化学的特性 BHK21−pcDNA3.1−HCから分泌されたr
hEPOの免疫化学的特性を同定するのにELISAキ
ット(R&D System社から購入)を用いた。C
HO細胞から産生された標準rhEPOを200.0,
100.0,50.0,20.0,5.0,2.5およ
び0.0mIU/mlの各濃度に希釈した。使用説明に
したがってELISA法を行った。CHO細胞から産生
されたrhEPOの標準曲線を図3に示した。BHK2
1−pcDNA3.1−HCから分泌されたrhEPO
も上記と同様に連続希釈して、ELISA法を行った。
読み取ったOD450-620nm 値を基に標準曲線内で外挿し
て濃度データを補正し、BHK21−pcDNA3.1
−HCから分泌されたrhEPOの平均濃度を5,88
6mIU/mlと決定した。尚、図3はCHO細胞から
分泌されたrhEPOの免疫化学的な特性曲線を示して
いる。
−HCから分泌されたrhEPOの免疫化学的特性 BHK21−pcDNA3.1−HCから分泌されたr
hEPOの免疫化学的特性を同定するのにELISAキ
ット(R&D System社から購入)を用いた。C
HO細胞から産生された標準rhEPOを200.0,
100.0,50.0,20.0,5.0,2.5およ
び0.0mIU/mlの各濃度に希釈した。使用説明に
したがってELISA法を行った。CHO細胞から産生
されたrhEPOの標準曲線を図3に示した。BHK2
1−pcDNA3.1−HCから分泌されたrhEPO
も上記と同様に連続希釈して、ELISA法を行った。
読み取ったOD450-620nm 値を基に標準曲線内で外挿し
て濃度データを補正し、BHK21−pcDNA3.1
−HCから分泌されたrhEPOの平均濃度を5,88
6mIU/mlと決定した。尚、図3はCHO細胞から
分泌されたrhEPOの免疫化学的な特性曲線を示して
いる。
【0028】BHK21−pcDNA3.1−HCから
分泌されたrhEPOの生物学的活性が以上のように決
められたが、TF−1細胞増殖強化から得られた生物学
的活性はELISA法から得られた生物学的活性よりも
約三倍高い。このような差異は次のようなことによると
思われる。すなわち、(1)ELISA法で使用した、
CHO細胞から分泌された標準rhEPOに特異的なモ
ノクローナル抗体がBHK21−pcDNA3.1−H
Cのような異なった形質転換体から分泌されたrhEP
O類の存在を完全には検出できないこと、および(2)
TF−1細胞の増殖を促進するrhEPOと相助効果を
示す未知分子がコンディションド−メディウム中に存在
している可能性であること、である。
分泌されたrhEPOの生物学的活性が以上のように決
められたが、TF−1細胞増殖強化から得られた生物学
的活性はELISA法から得られた生物学的活性よりも
約三倍高い。このような差異は次のようなことによると
思われる。すなわち、(1)ELISA法で使用した、
CHO細胞から分泌された標準rhEPOに特異的なモ
ノクローナル抗体がBHK21−pcDNA3.1−H
Cのような異なった形質転換体から分泌されたrhEP
O類の存在を完全には検出できないこと、および(2)
TF−1細胞の増殖を促進するrhEPOと相助効果を
示す未知分子がコンディションド−メディウム中に存在
している可能性であること、である。
【0029】実施例6 BHK21−pcDNA3.1−HCから分泌されたr
hEPOの精製 実施例4で記述したようにして採取されたコンディショ
ンド−メディウム100ml中のrhEPO類全てを5
0−85%の飽和硫酸アンモニウムグラジエントで塩析
できる。沈殿部分を遠心分離(18,000xg)によ
り採取し、得られたペレットを5mlのConA結合用
バッファー(1mMずつののMnCl2 ,CaCl2 お
よびMgCl2 /10mM PIPES,pH6.4)
に溶解した。得られた溶液を5mlのConA−Sep
haroseで懸濁し、少なくとも二時間室温で穏やか
に振動させてインキュベートした。続いて、得られた混
合物を固定化レクチンカラムに適用し、ConA結合用
バッファー100mlで洗浄した。結合した分画を、
0.5Mに達するマンノースの直線グラディエントを有
する50mlのバッファーで溶出し、さらに、強固に結
合した分画を酸性バッファー(0.1M酢酸ナトリウム
および0.5M NaCl,pH4.0)で溶出した。
溶出された分画は12%SDS−PAGEゲル上で解析
され、rhEPOはドットブロット法によって確認され
た。
hEPOの精製 実施例4で記述したようにして採取されたコンディショ
ンド−メディウム100ml中のrhEPO類全てを5
0−85%の飽和硫酸アンモニウムグラジエントで塩析
できる。沈殿部分を遠心分離(18,000xg)によ
り採取し、得られたペレットを5mlのConA結合用
バッファー(1mMずつののMnCl2 ,CaCl2 お
よびMgCl2 /10mM PIPES,pH6.4)
に溶解した。得られた溶液を5mlのConA−Sep
haroseで懸濁し、少なくとも二時間室温で穏やか
に振動させてインキュベートした。続いて、得られた混
合物を固定化レクチンカラムに適用し、ConA結合用
バッファー100mlで洗浄した。結合した分画を、
0.5Mに達するマンノースの直線グラディエントを有
する50mlのバッファーで溶出し、さらに、強固に結
合した分画を酸性バッファー(0.1M酢酸ナトリウム
および0.5M NaCl,pH4.0)で溶出した。
溶出された分画は12%SDS−PAGEゲル上で解析
され、rhEPOはドットブロット法によって確認され
た。
【0030】マンノースグラディエントバッファーある
いは酸性バッファーによって溶出されたrhEPOを含
有する分画を、それぞれ、まとめて貯え、フィルターメ
ンブラン(PM10メンブラン,Amicon)を用い
て最終体積が約3mlに達するまで濃縮した。濃縮され
た溶液を、Sephadex−G75樹脂を詰めたカラ
ム(16mmx100mm)に適用し、溶出バッファー
としてPBSバッファーを添加した。マンノース溶出プ
ールからは、分子量約35kDを有する主成分のrhE
POと分子量36kD−45kDを有する微量成分のr
hEPOから成る混合物を得ることができた。このプー
ルのrhEPO類は180,000−240,000単
位/mgの連合比活性を示す。もう一つのプール(酸−
溶出)は、それぞれ、均一の分子量34kD(124,
000 units/mg)、および分子量25kDと
28kD(80,000 units/mg)を有する
rhEPOの三つの主要アイソフォーム成分を含有して
いる。銀染色およびウエスタンブロット法の結果を図4
−5に示した。尚、図4は、rhEPOの34kD同型
のSDS−PAGE−銀染色とウエスタンブロット法を
示している。その均一性は、酸−溶出プールをSeph
adex G−75カラムに通して達成された。尚、図
5は、CHO細胞(レーン1)およびBHK21−pc
DNA3.1−HC(レーン2−4)から分泌されたr
hEPOのウエスタンブロット法を示している。マンノ
ース溶出プールをSephadex G−75カラムに
通し、rhEPOのアイソフォームを含むフラクション
を順次収得した。その部分がレーン2−4に示されてい
る。
いは酸性バッファーによって溶出されたrhEPOを含
有する分画を、それぞれ、まとめて貯え、フィルターメ
ンブラン(PM10メンブラン,Amicon)を用い
て最終体積が約3mlに達するまで濃縮した。濃縮され
た溶液を、Sephadex−G75樹脂を詰めたカラ
ム(16mmx100mm)に適用し、溶出バッファー
としてPBSバッファーを添加した。マンノース溶出プ
ールからは、分子量約35kDを有する主成分のrhE
POと分子量36kD−45kDを有する微量成分のr
hEPOから成る混合物を得ることができた。このプー
ルのrhEPO類は180,000−240,000単
位/mgの連合比活性を示す。もう一つのプール(酸−
溶出)は、それぞれ、均一の分子量34kD(124,
000 units/mg)、および分子量25kDと
28kD(80,000 units/mg)を有する
rhEPOの三つの主要アイソフォーム成分を含有して
いる。銀染色およびウエスタンブロット法の結果を図4
−5に示した。尚、図4は、rhEPOの34kD同型
のSDS−PAGE−銀染色とウエスタンブロット法を
示している。その均一性は、酸−溶出プールをSeph
adex G−75カラムに通して達成された。尚、図
5は、CHO細胞(レーン1)およびBHK21−pc
DNA3.1−HC(レーン2−4)から分泌されたr
hEPOのウエスタンブロット法を示している。マンノ
ース溶出プールをSephadex G−75カラムに
通し、rhEPOのアイソフォームを含むフラクション
を順次収得した。その部分がレーン2−4に示されてい
る。
【0031】本明細書中で記述した特許および文献はい
ずれも本発明の属する分野の当業者のレベルを示してい
る。個々の文献は特定的かつ個別的に具体化して示され
ているように、これらの特許および文献は、本明細書で
それらと同程度に具体化して示されている。当業者は、
本発明の固有な事項はもとより、本発明は、その目的を
実施し、記述されている結果および利点を達成するのに
十分に適合していることを容易に理解できるであろう。
本発明で述べられている方法、手順、処理法、分子およ
び特定な化合物を含め、これら全ての実施例は好適な具
体例の代表であり、典型であって、本発明の範囲を限定
するものではない。当業者にとって部分的変更や他への
利用もなしうるであろうが、それらも、特許請求の範囲
に規定されるように本発明の範疇に包括される。
ずれも本発明の属する分野の当業者のレベルを示してい
る。個々の文献は特定的かつ個別的に具体化して示され
ているように、これらの特許および文献は、本明細書で
それらと同程度に具体化して示されている。当業者は、
本発明の固有な事項はもとより、本発明は、その目的を
実施し、記述されている結果および利点を達成するのに
十分に適合していることを容易に理解できるであろう。
本発明で述べられている方法、手順、処理法、分子およ
び特定な化合物を含め、これら全ての実施例は好適な具
体例の代表であり、典型であって、本発明の範囲を限定
するものではない。当業者にとって部分的変更や他への
利用もなしうるであろうが、それらも、特許請求の範囲
に規定されるように本発明の範疇に包括される。
【0032】
【発明の効果】以上詳述したように、本発明は、ヒトエ
リトロポエチンをコードするcDNAフラグメント、プ
ラスミドベクターおよびサイトメガロウイルスのプロモ
ーターを含有する発現ベクター、当該発現ベクターを保
有しているセルライン、セルラインを培養することによ
るヒトエリトロポエチンの製造方法、およびその改良精
製法に係るものであり、本発明により、1)新規な発現
ベクターによる組換えヒトエリトロポエチンを酸性する
発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法が
提供される、2)最初のステップで目的の蛋白質rhE
PO類は沈殿により濃縮され、それによって、rhEP
O類の大量調製が容易になる、3)従来の精製法では必
要とされていた逆相HPLCやイムノアフィニティーカ
ラムクロマトグラフィーを使用することなしに、より高
い比活性を示す分子量35−45kDのrhEPO類の
プールとそれらのアイソフォームである分子量25−3
4kDのもう一つのプールを得ることが可能である、等
の格別の効果が得られる。
リトロポエチンをコードするcDNAフラグメント、プ
ラスミドベクターおよびサイトメガロウイルスのプロモ
ーターを含有する発現ベクター、当該発現ベクターを保
有しているセルライン、セルラインを培養することによ
るヒトエリトロポエチンの製造方法、およびその改良精
製法に係るものであり、本発明により、1)新規な発現
ベクターによる組換えヒトエリトロポエチンを酸性する
発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法が
提供される、2)最初のステップで目的の蛋白質rhE
PO類は沈殿により濃縮され、それによって、rhEP
O類の大量調製が容易になる、3)従来の精製法では必
要とされていた逆相HPLCやイムノアフィニティーカ
ラムクロマトグラフィーを使用することなしに、より高
い比活性を示す分子量35−45kDのrhEPO類の
プールとそれらのアイソフォームである分子量25−3
4kDのもう一つのプールを得ることが可能である、等
の格別の効果が得られる。
【0033】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Li-Wei Hsu; Su-Chen Chaug <120> An expression system for producing recombinant human erythropoieti n, a method for purifying the secreted human erythropoietin and uses the reof <130> 10XP-ROC <160> 2 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 1 gcaagcttat gggggtgcac gaatg 25
【0034】 <210> 2 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 2 gcatctagat catctgtccc ctgtcct 27
【図1】図1は、pcDNA3.1発現ベクター、pc
DNA3.1−HCの制限地図を示す。
DNA3.1−HCの制限地図を示す。
【図2】図2は、BHK21−pcDNA3.1−HC
によって分泌されたrhEPOの生物学的活性を示す。
によって分泌されたrhEPOの生物学的活性を示す。
【図3】図3は、CHO細胞から分泌されたrhEPO
の免疫化学的な特性曲線を示す。
の免疫化学的な特性曲線を示す。
【図4】図4は、rhEPOの34kD同型のSDS−
PAGE−銀染色とウエスタンブロット法を示す。
PAGE−銀染色とウエスタンブロット法を示す。
【図5】図5は、CHO細胞(レーン1)およびBHK
21−pcDNA3.1−HC(レーン2−4)から分
泌されたrhEPOのウエスタンブロット法を示す。
21−pcDNA3.1−HC(レーン2−4)から分
泌されたrhEPOのウエスタンブロット法を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平2−115196(JP,A) 特開 昭62−149624(JP,A) 特開 平7−138292(JP,A) 特開 平2−475(JP,A) 特開 平3−95199(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/09 C07K 1/16 C07K 14/505 C12P 21/02 BIOSIS(DIALOG) WPI(DIALOG)
Claims (6)
- 【請求項1】 形質転換体から分泌された組換えヒトエ
リトロポエチン(rhEPO)を二段ステップのカラム
クロマトグラフィーに適用して、分子量35−45kD
のrhEPOを含むプールおよびそれらのアイソフォー
ムである分子量25−34kDのrhEPOを含むプー
ルを得て、当該rhEPOを精製する方法であって、次
に記載するステップ;(1) 形質転換細胞の培養液から得られたサンプルから
硫酸アンモニウムの飽和度50%から80%でrhEP
O類を沈殿させること、(2) 沈殿した当該rhEPO類を固定化レクチンのカ
ラムに適用すること、(3)マンノース グラディエントバッファーで分子量約
35kDを有する主成分のrhEPOと分子量36kD
−45kDを有する微量成分のrhEPOから成る混合
物を含むrhEPO含有プールを溶出すること、(4)上記マンノースで溶出した後、さらに、強固に結
合している画分を酸性バッファーで溶出して分子量34
kD、28kD及び25kDの三種の主rhEPOアイ
ソフォームを含むプールを溶出すること、 (5)上記(3)〜(4)のステップにより分子量35
−45kDのrhEPOを含むプールおよびそれらのア
イソフォームである分子量25−34kDのrhEPO
を含むプールを得ること、 (6)集められたプールの各々を濃縮し、次いで、 上記
rhEPO含有プールをゲルろ過カラムに適用するこ
と、および上記rhEPOを溶出すること、 から成ることを特徴とするrhEPOの精製方法。 - 【請求項2】 上記マンノース溶出プールからの精製r
hEPOが、35kDから45kDの分子量を有するア
イソフォームを含有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】 上記マンノース溶出プールからの精製r
hEPOが、約90%の純度を有する、請求項1記載の
方法。 - 【請求項4】 形質転換細胞が、BHK21−pcDN
A3.1−HC(ATCC;PTA−419)である、
請求項1記載の方法。 - 【請求項5】 0.5M濃度までの連続グラディエント
のマンノース溶液でrhEPOを含むプールを溶出す
る、請求項1記載の方法。 - 【請求項6】 酸性バッファー(略pH4.0)により
rhEPOのアイソフォームを含むプールを溶出する、
請求項1記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23900999A JP3352429B2 (ja) | 1999-08-25 | 1999-08-25 | 組換えヒトエリトロポエチンを産生する発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法およびその利用法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23900999A JP3352429B2 (ja) | 1999-08-25 | 1999-08-25 | 組換えヒトエリトロポエチンを産生する発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法およびその利用法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2001078770A JP2001078770A (ja) | 2001-03-27 |
JP3352429B2 true JP3352429B2 (ja) | 2002-12-03 |
Family
ID=17038548
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23900999A Expired - Fee Related JP3352429B2 (ja) | 1999-08-25 | 1999-08-25 | 組換えヒトエリトロポエチンを産生する発現系、分泌されたヒトエリトロポエチンの精製方法およびその利用法 |
Country Status (1)
Country | Link |
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JP (1) | JP3352429B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
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---|---|---|---|---|
JP4306229B2 (ja) | 2002-04-03 | 2009-07-29 | タカタ株式会社 | 衝突検出装置及び安全装置 |
-
1999
- 1999-08-25 JP JP23900999A patent/JP3352429B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Date | Code | Title | Description |
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
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