JP3338060B2

JP3338060B2 - 濃縮抗体製剤

Info

Publication number: JP3338060B2
Application number: JP54155397A
Authority: JP
Inventors: ジュリアン、マーカス、レルトン
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1996-05-24
Filing date: 1997-05-22
Publication date: 2002-10-28
Anticipated expiration: 2017-05-22
Also published as: JPH11512753A; CO4850562A1; IL126940A0; TR199802423T2; CZ382498A3; US6252055B1; AU731950B2; CN1219882A; IS4892A; ID16966A; EA001860B1; NO985464L; NZ332625A; PE69098A1; AU2958997A; PL330111A1; ATE318146T1; DE69735295D1; KR20000015935A; EA199800946A1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、濃縮された抗体製剤、そのような製剤を含
有する医薬処方物、ヒトの治療におけるその使用、およ
びその製造法に関する。

高濃度で製造された市販の免疫グロブリンの多くは、
ヒト血清から得られ、血液製剤製造業によって製造され
ている。臨床的に使用された精製ヒト免疫グロブリンＧ
（IgG）の最初の製剤は、1940年代に調製された免疫血
清グロブリンであった（Cohn,E.J.et al“Preparation
and properties of serum and plasma proteins."J.Am.
Chem.Soc.68:459−475（1946）およびOncley,J.L.et al
“The separation of antibodies,isoagglutinins,prot
hrombin,plasminogen and β−lipoproteins into sub
−fractions of human plasma."J.Am.Chem.Soc.71:541
−550（1949））。

次世代の精製IgGが1960年代に開発されたが、それら
は静脈内投与に適する製剤が中心であった（Barandun,
S.et al“Intravenous administration of human γ−g
lobulin."Vox.Sang.7:157−174（1962））。これらの最
初のIgGの静脈内用製剤（Gamimune（商標名）、Cutter
Biological）は、0.2Mグリシン、10％マルトース、pH6.
8における５％（50mg/ml）IgG溶液として処方されてい
た。この溶液は、５℃で少なくとも２年半は安定であっ
た。静脈内用IgG（IVIG）製剤の承認に関する重要な基
準は、IgGの断片化がほとんど生じないこと、そして高
分子量の凝集物が存在しないことであった。

今日、ヒトの治療用免疫グロブリン製剤が、筋肉内
（IMIG）または静脈内（IVIM）のいずれかで投与するた
めに用いられている。IMIGは、Ａ型肝炎の予防のために
主に使用され、そして無ガンマグロブリン血症患者の処
置のために時々使用されている。IVIGは、続発性免疫不
全症、種々の感染、血液学的疾患および他の自己免疫疾
患のためだけでなく、原発性免疫不全症および突発性血
小板減少症の処置において使用されている。一般に、IM
IG製剤は16％（w/v）（160mg/ml）溶液として、IVIG製
剤は５％（w/v）（50mg/ml）溶液として市販されてい
る。

製造業者のIVIGに関する経験によって、これらの製剤
は、（10％（w/v）未満の）比較的薄い溶液では不安定
であることが示されている。この不安定性は、材料を室
温で貯蔵しているときの「シェディング（shedding）」
として知られている過程によって、不溶性粒子が形成さ
れるためであることが明らかにされている（Fernandes,
P.M.and Lundband,J.L.“Preparation of a stable int
ravenous gamma−globulin:process design and scale
up."Vox.Sang.39:101−112（1980））。市販の16.5％γ
−グロブリンは、通常、緩衝化されたグリシン−生理食
塩水溶液中で安定化されている。安定化剤としてのマル
トースを５〜10％で使用することによって、５％IVIGの
微粒子形成からの保護に有効であることが明らかにされ
ている（Fernandes et al前出）。

シェディングに加えて、濃縮された（16.5％）IVIG溶
液は、長期間の貯蔵の間に凝集しやすい。10〜30％（w/
w）もあるIVIG溶液は、凝集物から構成されることがあ
る（Gronski,P.et al“On the nature of IgG dimers.
I.Dimers in human polyclonal IgG preparations:kine
tics studies."Behring Inst.Mitt.82:127−143（198
8））。

これらの凝集物の大部分は、イディオタイプ抗体およ
び抗イディオタイプ抗体の複合体によって生成したダイ
マーである。組織培養上清から調製されるモノクローナ
ル抗体は抗イディオタイプ抗体を含有しないため、この
ようなダイマーは存在しない。しかし、これらの製剤で
は、部分的に変性したモノマー状の抗体分子間の複合体
形成によって、ダイマーが形成されることがある。抗体
製剤を濃縮するために使用されるタンジェント流限外ろ
過の間にかかるような物理的な力によっても、凝集物生
成を増大させることがある（Wang,Y.−C.J.and Hanson,
M.A.“Parenteral formulations of proteins and pept
ides:stability and stabilisers."J.Parenteral Sci.T
echnol.42（Suppl）:S3−S26（1988））。

従って、免疫グロブリンの（100mg/mlよりも高い）濃
縮製剤が用いられているが、現在までのところ、これら
は、血液処理業から得られるポリクローナル抗体製剤で
あり、グリシンおよびマルトースなどの種々の添加剤の
添加によって安定化されている。

従って、モノクローナル抗体製剤が、凝集物の増大を
伴うことなく、添加剤の非存在下で100mg/mlよりも高い
濃度で得られることは驚くべきことである。

日本国特許公報JP01268646A（AN89−359879）のDerwe
nt要約は、当該出願に、0.1μg/ml〜100mg/mlの濃度を
有するIgG₃モノクローナル抗体の注射用製剤が記載され
ていることを報告している。これらの刊行物において開
示されている事項は、本発明の範囲外である。

従って、本発明は、ヒトに投与されるモノクローナル
抗体製剤であって、該製剤中の抗体が、100mg/mlまたは
それよりも高い濃度、好ましくは100mg/mlよりも高い濃
度であることを特徴とするモノクローナル抗体製剤を提
供する。350mg/mlよりも高い濃度では、製剤は非常に粘
度が高くなることがあり、そして回収率は受容できない
ほど低くなる。理想的な濃度は、100mg/ml〜300mg/mlで
ある。

本発明による製剤は、実質的に凝集物を含まない。凝
集した不純物の許容レベルは、５％未満であり、理想的
には２％未満である。より日常的には約１％ではある
が、0.2％ほどの低いレベルが達成されることがある。
製剤はまた、好ましくは、ポリクローナル処方物の安定
化のために従来から使用されている添加剤（例えば、グ
リシンおよび／またはマルトース）を含まない。

従って、本発明は、ヒトに投与されるモノクローナル
抗体製剤であって、そのモノクローナル抗体製剤中の抗
体は、100mg/mlまたはそれよりも高い濃度、好ましくは
100mg/mlよりも高い濃度であり、製剤は、実質的に凝集
物を含まないことによって特徴づけられるモノクローナ
ル抗体製剤を提供する。

組換え抗体が、まさにそれらの性質によって、合成か
つ非天然の細胞培養環境で得られる。商業化のために十
分な量のタンパク質を生成させるために使用されている
発現システムは、日常的には、骨髄腫またはチャイニー
ズハムスターの卵巣（CHO）の宿主細胞に基づいてい
る。

そのような細胞を培養するために、動物性タンパク質
を全く含有しない複雑な合成培地が考案され、その結
果、自然界で生じているとは考えられないタンパク質の
グリコシル化パターンが得られている。従って、そのよ
うな合成条件下で生成される複雑な糖タンパク質が、そ
のすべての緩衝化能力とともに、正常なヒト血清中に存
在するよりも数倍高い濃度で調製され得ることは、実
に、さらに驚くべきことである。

従って、本発明は、ヒトに投与されるモノクローナル
抗体製剤であって、そのモノクローナル抗体製剤中の抗
体は、組換え抗体であり、100mg/mlまたはそれよりも高
い濃度、好ましくは100mg/mlよりも高い濃度であること
によって特徴づけられるモノクローナル抗体製剤を提供
する。製剤は、好ましくは、実質的に凝集物を含まな
い。

治療または診断のために使用されるとしても、精製抗
体を作製する間、抗体は貯蔵時に十分に安定であること
が重要である。種々の化学種は、抗体の安定性に悪作用
を有することがある。例えば、微量の銅（Cu⁺⁺）は、現
在、貯蔵時の免疫グロブリン分子に対して不安定化作用
を有すること（WO93/08837）、そしてこの作用は、銅イ
オンの適切なキレーター（例えば、EDTAまたはクエン酸
イオン）とともに免疫グロブリン分子を処方することに
よって排除され得ることが知られている。

本発明は、すべてのクラスの免疫グロブリン（すなわ
ち、IgM、IgG、IgA、IgEおよびIgD）の製剤に適用で
き、そしてFabフラグメントおよび二重特異性抗体の製
剤にも拡大される。本発明は、好ましくは、IgG₁、Ig
G₂、IgG₃およびIgG₄のサブクラスを含むIgGクラスの免
疫グロブリン製剤に適用される。本発明は、より好まし
くはIgG₄およびIgG₁のクラス、最も好ましくはIgG₁クラ
スの免疫グロブリン製剤に適用される。

本発明は、組換え抗体、最も詳しくはキメラ抗体また
はヒト化（CDR融合）抗体の調製において特に適用され
る。これらの具体的な例として、CD2、CD3、CD4、CD5、
CD7、CD8、CD11a、CD11b、CD18、CD19、CD23、CD25、CD
33、CD54およびCDw52の各抗原に対するキメラ抗体また
はヒト化抗体が挙げられる。さらなる例として、種々の
腫瘍細胞マーカー（例えば、40kd［J.Cell.Mol.125
（２）:437−446（1994）］）あるいはＢ型肝炎または
ヒトサイトメガロウイルスなどの感染因子の抗原に対す
るキメラ抗体またはヒト化抗体が挙げられる。特に好ま
しい例として、CDw52、CD4およびCD23の各抗原に対する
キメラ抗体またはヒト化抗体が挙げられる。

治療的使用を目的とする免疫グロブリンは、一般に、
医薬用処方物の形態で患者に投与される。そのような処
方物は、好ましくは、免疫グロブリンに加えて、他の免
疫グロブリンまたは薬物（例えば、抗生物質）などの他
の薬剤の１つ以上と混合されるかもしないが、生理学的
に受容可能なキャリアまたは希釈剤を含む。適切なキャ
リアとして、以下のものが挙げられるが、これらに限定
されない：生理食塩水、リン酸緩衝化生理食塩水、グル
コースおよび緩衝化生理食塩水、クエン酸緩衝化生理食
塩水、クエン酸／クエン酸ナトリウム緩衝液、マレイン
酸緩衝液（例えば、マレイン酸／水酸化ナトリウム緩衝
液）、コハク酸緩衝液（例えば、コハク液／水酸化ナト
リウム緩衝液）、酢酸緩衝液（例えば、酢酸ナトリウム
／酢酸緩衝液）、またはリン酸緩衝液（例えば、オルト
リン酸二水素カリウム／オルトリン酸水素二ナトリウム
緩衝液）。必要に応じて、処方物は、抗体安定化のため
にポリソルベートを含有する。あるいは、免疫グロブリ
ンは凍結乾燥（冷凍乾燥）され、水および／または上記
の水性緩衝化溶液を添加することによって必要時に使用
するために再構成され得る。

本発明のよる医薬用処方物の好ましいpHは、個々の投
与経路に依存する。しかし、濃縮溶液中での抗体の溶解
度を最大にするために、溶液のpHは、抗体の等電点のpH
と異なっていなければならない。

従って、本発明のさらなる面によれば、本発明は、ヒ
トに投与されるモノクローナル抗体製剤であって、その
モノクローナル抗体製剤中の抗体は、100mg/mlまたはそ
れよりも高い濃度であり、製剤のpHが抗体の等電点のpH
と異なっていることによって特徴づけられるモノクロー
ナル抗体製剤を提供する。

投与経路は、日常的には非経口的であり、静脈内、筋
肉内および腹腔内への注入または送達を含む。しかし、
製剤は、例えば、１用量あたりの容量が約1mlであるよ
うに、容量が少なくなければならない皮下用処方物を得
るために特に有用である。そのような処方物において治
療的な投薬を確実に達成し得るために、濃縮された製剤
が常に必要である。皮下用製剤に好ましい濃度は、例え
ば、100mg/ml〜200mg/ml（例えば、150mg/ml〜200mg/m
l）の範囲内である。皮下用製剤は自分で投与すること
ができ、従って静脈内投与のために病院に行かなければ
ならないことが避けられるという利点を有する。

好ましくは、本発明による皮下用処方物は等張であ
り、特定のpHに緩衝化されている。皮下用処方物に好ま
しいpH範囲は、一般に、pH4〜pH9の範囲である。好まし
いpH、従って緩衝液は、上記のように抗体の等電点に依
存する。従って、抗CD4抗体を含有する皮下用製剤の場
合、pHは、好ましくは、pH4〜pH5.5、例えばpH5.0〜pH
5.5の範囲、例えばpH5.5である。抗CD23抗体の場合は、
pH4〜pH6.5の範囲内である。従って、抗CD4抗体を含有
する皮下用製剤における使用に好ましい緩衝液は、マレ
イン酸、コハク酸、酢酸、あるいはより好ましくはリン
酸の緩衝液である。緩衝液は、好ましくは、50mM〜100m
Mの濃度で使用される。

本発明による皮下用製剤はまた、必要に応じて、溶液
の張度を調節するために塩化ナトリウムを含有させるこ
とができる。

従って、本発明のさらなる面によれば、本発明は、ヒ
トに皮下投与されるモノクローナル抗体製剤であって、
該製剤中の抗体が、100mg/mlまたはそれよりも高い濃度
であり、該製剤のpHが抗体の等電点のpHと異なっている
ことを特徴とするモノクローナル抗体製剤を提供する。

本発明のさらなる面において、モノクローナル製剤
は、ヒトの治療において使用することが考えられる。以
下のような種々のヒトの障害を処置することができる：
例えば、ガンまたは感染性疾患（例えば、上記の疾
患）、ならびにＴ細胞媒介性障害などの免疫不全症であ
って、重篤な血管炎、慢性関節リウマチ、全身性狼瘡、
さらに自己免疫障害（例えば、多発性硬化症、対宿主性
移植片病、乾癬、若年発症糖尿病、シェーグレン病、甲
状腺疾患、重症筋無力症、移植拒絶反応、炎症性腸疾患
および喘息）を含む免疫不全症。

従って、本発明は、上記障害のいずれかの処置に必要
な医薬品の製造において、本明細書に記載される濃縮モ
ノクローナル抗体製剤の使用を提供する。さらに、何ら
かのそのような障害を有するヒトの処置方法も提供され
る。この方法は、そのような個人に本発明による治療的
有効量の製剤を投与することを含む。

そのような抗体製剤の投薬量は、処置される状態およ
び処置の受け手により変化するが、成人患者について
は、50mg〜約2000mg、好ましくは100mg〜1000mgの範囲
で、１〜30日の期間にわたり毎日または毎週投与され、
必要に応じて繰り返される。投薬は、単回または複数回
の用量として行うことができる。

抗体製剤は、交叉流（タンジェンシャル）限外ろ過ま
たは攪拌限外ろ過などの種々の方法によって濃縮するこ
とができる。好ましい方法は、タンジェント流限外ろ過
による。低い回収率および沈澱物形成は、抗体濃縮時に
問題となることがある。本発明は、大きな循環速度（50
0ml/分）における交叉流限外ろ過の剪断力を低下させる
ことを伴う濃縮方法によって、特にこの問題を解決す
る。循環を、例えば、250ml/分に低下させると、問題な
く抗体濃度は150mg/mlよりも高くなり、そして材料の高
い回収率が得られる。

従って、本発明は、本明細書中に記載されるような、
濃縮抗体製剤の調製方法を提供する。濃縮製剤における
抗体の回収は、好ましくは70％よりも大きく、日常的に
は90％よりも大きい。

上記の方法に従って調製される濃縮抗体製剤は、緩衝
液、塩、ポリソルベートおよび／またはEDTAなどの添加
物をさらに含有させることができる。これらのさらなる
薬剤は、当該分野で公知で慣用的な方法による透析を用
いて、それらを除去または交換することができる場合、
最終的な医薬用処方物においては必要とされ得ない。例
えば、クエン酸緩衝液およびEDTAを含有する濃縮抗体製
剤は、この方法を使用してリン酸緩衝液またはマレイン
酸緩衝液を含有する濃縮抗体製剤に変えることができ
る。

本発明はまた、そのような方法によって得られる新規
な濃縮抗体製剤をも提供する。

以下の実施例は、本発明の非限定的な実施例である。

実施例１ Campath−1Hの濃縮 Minitan限外ろ過装置（Minitan XX42 ASY MT限外ろ過
システム、Millipore）を、２枚のポリスルホン製30K N
MWCOフィルタープレート（Minitan PTTK 30K NMWCO、Mi
llipore）を用いて組み立て、配管およびプレートを製
造者の指示に従って0.1M NaOHで30分間消毒した（Minit
an Ultrafiltration System:Assembly,Operation,Maint
enance Instructions、Millipore Corporation、P1507
6）。１〜２リットルのリン酸緩衝化生理食塩水（PBS:p
H7.2）で軽く洗浄してを消毒剤を除去した。

Campath−1H（CDw52抗原に対するヒト化抗体:Reichma
nn et al Nature 332:323−327（1988））（50mMクエン
酸ナトリウム（pH6.0）中に16.4mg/mlで2200ml）を、60
0ml/分の流速で、２〜2.5barの背圧でメンブランの保持
側を循環させた。実験中、背圧をこの値で維持し、透過
液の流速を種々の時間間隔で測定した。抗体試料を種々
の時点で保持容器から取り出し、抗体濃度、濁度、％凝
集物および粘度についてアッセイした。

この実験ではろ過速度が非常に低かったため、３日間
にわたってろ過を行うことが必要であった。システムを
PBSで洗い流し、濃縮物を４℃で一晩貯蔵した。第２日
目の後、微生物汚染を防止するために、0.01％（w/v）
のチオメルサールを濃縮物に添加し、その後一晩貯蔵し
た。濃縮終了後、システムを500mlのPBSで洗い流し、次
いでさらに500mlのPBS洗浄により、メンブランの保持側
を30分間再循環させた。これらの洗浄中の抗体濃度を、
280nmでの吸光度測定によって求めた。

Minitanシステムにおいてわずか２枚のプレートを使
用して、Campath−1Hを16.4mg/mlから257mg/mlに濃縮す
るのに要した全時間は、17.25時間であった。表１
（ａ）は、この間の時間におけるCampath−1Hの濃度変
化を示す。

濃度は、17時間後の300mg/mlの最大値まで指数関数的に
増加した。最終濃度は、この最大値よりもわずかに低か
った；この相違は、おそらくは、非常に粘度の高い液体
から代表し得る試料を得ることが困難であったためであ
る。表１（ｂ）は、Campath−1Hの濃度が、透過液の流
速の低下に反比例していることを示す。この表はまた、
残留している濃縮物の粘度が189mg/mlよりも高い濃度で
劇的に増大したことを示している。

表１（ｃ）は、190mg/mlまでの濃度では高い回収であ
ったが、この濃度よりも高くなると著しく低下し始めた
ことを示している。粘度の増大により、材料がガラス器
具および配管に付着し、一晩貯蔵する前の洗浄の間に失
われるためである。257mg/ml材料の最終的な回収（サン
プリング中に取り出された材料および洗浄中に失われた
材料を除く）は、63.4％であった。さらに、14.6％がシ
ステムの最初のPBS洗浄で回収され、そして0.5％が二番
目に再循環させたPBS洗浄で回収された。従って、合計
すれば、最初の材料の78.5％が実験終了時に回収された
（サンプリング中に取り出された材料および洗浄中に失
われた材料を除く）。21.5％の喪失は、主に、ガラス器
具および配管に付着している粘性の高い材料によるため
である。

濃縮中のCampath−1H溶液の濁度を計算によって求め
た。濁度の値として、適切に希釈した抗体試料の1.0ml
の650nmでの吸光度を使用した。表１（ｄ）は、増加し
なかったことを示している。

凝集物の測定に必要な試料は、PBSを使用してタンパ
ク質濃度を1mg/mlに希釈し、その50μｌまたは100μｌ
をTSK−GEL G3000SW_XLサイズ排除HPLCカラムに注入し
た。カラムを、0.05％ NaN₃および0.1M Na₂SO₄を含む0.
1Mリン酸緩衝液（pH6.7）を用いて1.0ml/分の流速で溶
出した。凝集物の量は、280nmでの吸光度のピークを積
分することによって求め、全期間を通して約１％で残留
していることを見出した。

実施例２抗CD4抗体の濃縮−方法Ａ Minitan限外ろ過装置を組立て、２の代わりに８ポリ
スルホン30K NMWCOフィルタープレートを用いることを
除いて、実施例１と同様に消毒した。全装置を無菌ドラ
フト内に設置した。抗CD4抗体（50mMクエン酸ナトリウ
ム、pH6.0中2142ml、13.9mg/ml）を流出速度190ml/mi
n、後方圧２〜2.5バールで膜の残留側にて循環させた。
以降の実験を通し後方圧をこの値で維持し、透過流出速
度を様々な時間間隔で測定した。様々な時点で抗体サン
プルを未透過液の容器から取り出し、抗体濃度、CD4結
合、濁度、凝集率および粘度を定量した。

実験の最後に未透過液をMinitan装置からポンプで吸
引し、膜の残留側を50mMクエン酸ナトリウム0.05mM EDT
A、pH6.0溶液500mlで洗浄した。そして洗浄液の50ml分
画を回収した。最後に、再循環している500mlの50mMク
エン酸ナトリウム0.05mM EDTA、pH6.0溶液で、残留側の
膜周辺を30分間洗浄した。洗浄分画の抗体濃度を吸光度
280nmで測定することで確定した。

結果を表２（ａ）〜（ｄ）に示した。濃縮に用いるプ
レートの枚数が増えると、250mg/mlの濃度へ達するため
に要する時間が減少した。250mg/mlまでにCampath−1H
での濃縮は17.25時間かかるのに対し、本実験は６時間
であった（表２（ａ）参照）。また表２（ａ）は、113m
g/mlの濃度に達するまで抗CD4抗体の粘度がはっきりと
上昇しないことを示している。この濃度を超えると粘度
は劇的に上昇した。

83mg/mlを超える濃度で、濃縮材料に顕著な蛋白石濁
が認められた。蛋白石濁は、濃度がこの値を超えて上昇
するにつれて沈殿を生ずる原因となった。このことは、
表２（ｂ）に示す透過流出速度の減少を、また表２
（ｃ）に示す濁度の上昇をもたらした。凝集率は全ての
濃度において非常に低いままで、全体を通して0.2％未
満であった（表２（ｃ）参照）。表２（ｂ）は粘度が上
昇し、沈殿が発生するまでは回収率が高い一方、装置か
らはずした後の未透過液の最終回収までに50％と劇的に
低下していることを示している。

この不十分な回収率は、濃縮抗CD4抗体の粘度が高い
ために、抗体が限外ろ過システムのチューブや膜に付着
することによるものである。本方法で失われた抗CD4抗
体はすべて、後に緩衝液でシステムを洗い流すことで回
収できた。表２（ｄ）は、実験の最後にMinitan装置を
洗い流している間の、連続した50mlの洗浄分画における
抗CD4抗体の回収を示している。最初の分画は235mg/ml
の濃度で11.7gの抗CD4抗体を含んでいたため、これを25
2mg/mlで装置から最初に回収した濃縮液12.6gと共に回
収した。この際、全体の濃度が著しく希釈されることは
なかった。残りの洗浄分画は全部で5.1gの抗CD4抗体を
含んでいたが、57mg/ml未満の濃度であったため、濃縮
材料と共に回収できなかった。濃縮液および最初の洗浄
分画における全回収率は90％であった。最終の濃縮抗CD
4抗体を４℃で一夜保存すると、一部の沈殿は再溶解す
ることが認められた。

従って、沈殿した抗CD4抗体が完全に可溶化する濃度
を測定するための実験を設定した。250mg/mlの抗CD4抗
体のアリコート10mlに、50mMクエン酸ナトリウム0.05mM
EDTA、pH6.0溶液を加えて徐々に希釈した。適度に希釈
した抗体サンプルのアリコートの1.0mlにおける650nmで
の吸光度を、濁度の測定に使用した。結果を表３に示し
た。

沈殿は再溶解したが、濁度および蛋白石濁は抗CD4抗
体が約80mg/mlの濃度に達するまで完全には消えなかっ
た。濃縮中に最初に蛋白石濁が認められた濃度はこの濃
度を上回っているため、沈殿は可逆性で濃度依存性であ
ると思われた。

実施例３抗CD4抗体の濃縮−方法Ｂ抗CD4抗体の緩衝液の調整抗CD4抗体（1460ml;24g）を50mMクエン酸ナトリウ
ム、0.05mM EDTA、pH6.0中で調製した。抗体製剤に固体
のクエン酸を添加し、次いでNaOHでpHを6.0に調整する
ことによって、この緩衝液を約100mMクエン酸ナトリウ
ム、0.05mM EDTA、pH6.0とした。得られた製剤を0.22μ
ｍフィルターを介して滅菌ろ過し、約12gの２アリコー
トとして保存した。

Filtron Ultrasetteにおける抗CD4抗体の濃縮 Filtron Mini−UltrasetteおよびWatson−Marlowポン
プを低温室に配置した。Mini−Ultrasette（カットオフ
値30Kの流限外ろ過フィルターFiltron）に水で軽く洗浄
し、次いで製造者の指示に従って0.1M NaOHで30分間消
毒した（Mini Ultrasette Tangenital Flow Device Ope
rating Instructions.＆ Mini Ultrasettte Care and U
se Manual.,Filtron Technology Corporation）。滅菌
水で軽く洗浄し、続いて滅菌PBS、pH7.2を溶出物のpHが
7.2になるまで１〜２リットルで洗浄して消毒剤を除去
した。抗CD4抗体を、全期間を通して250ml/分の流速で
膜の残留側に循環させた。

抗CD4抗体を約150mg/mlに濃縮した後、残留物をMini
−Ultrasetteからポンプで吸引し、膜の残留物側に20ml
の50mMクエン酸ナトリウム、0.05mM EDTA、pH6.0を３回
軽く洗浄し、20mlの洗浄画分のそれぞれを回収した。実
施例１に記載のように280nmでの吸光度を測定すること
によって、洗浄画分の抗体濃度を決定した。

結果は、残留流速を減少すると、交叉流限外ろ過によ
り抗CD4抗体を約150mg/mlにまで濃縮し、沈殿を回避す
る方法を提供し得ることを示唆した。これを、Filtron
Mini−Ultrasetteおよび250ml/分の残留物循環速度を用
いて試験した。

本操作のための適切な等張緩衝液は、100mMクエン酸
ナトリウム、0.05mM ED TA、pH6.0であった。従って、1
6.8gのクエン酸を添加することによって50mMクエン酸ナ
トリウム、0.05mM EDTA、pH6.0中抗CD4抗体の残りの146
0mlを再処方し、最終溶液のpHをNaOHで調整した。この
材料を滅菌ろ過し、２つの等量のアリコートに分割し、
次いで250ml/分の再循環流を用いてこのアリコートをFi
ltron限外ろ過装置において個別に濃縮した。結果を表
４に示す。

PBSを用いて凝集測定用サンプルを1mg/mlのタンパク
質濃度に希釈し、50μｌまたは100μｌのアリコートをT
SK−GEL G3000SW_XLサイズ排除HPLCカラムに注入した。
カラムを0.1Mリン酸緩衝液、pH6.7中の0.05％NaN₃およ
び0.1M Na₂SO₄で、1.0ml/分の流速で展開した。280nmで
の吸光度のピークを積分することによって凝集物の量を
決定した。

両方の濃縮とも、抗体の溶解度に悪影響を及ぼすこと
なく限外ろ過装置において150mg/mlを超える最大濃度を
達成した。濃縮には９〜11時間を要した。約100mg/mlの
最終濃度は、限外ろ過装置からの回収率を最大にするの
に必要な洗浄液で希釈した結果生じる。全体的な回収率
は90〜95％であり、肉眼では沈殿も凝集物のレベルの増
加も認められなかった。濃縮後650nmでの吸光度で測定
した濁度がわずかに増加して最終濃縮物がわずかに不透
明になったが、このことはPolysorbate 80による処方時
に除去され、滅菌ろ過は重要とは思われなかった。

濃縮１のCD4結合活性は、予想通りほぼ100mg/mlであ
ったが、濃縮２についてはかなり低い値しか得られなか
った。濃縮１および２から回収した材料の最終オスモル
濃度は約297mOs/kgであり、回収物は滅菌0.2μｍフィル
ターを容易に通過し得る透明かつ澄明かつ透明な溶液で
あった。

攪拌器付セルにおける抗CD4抗体の濃縮窒素ガスを用いて1.5バールの圧力を適用することに
より、Amicon攪拌器付限外ろ過セル（YM30膜Amiconを装
着した）中５℃で抗CD4抗体（上記）の330mlのアリコー
トを170mg/mlの最終濃度に濃縮した。限外ろ過セル内の
抗CD4抗体を所定の間隔でサンプリングし、280nmでの吸
光度を測定することによって濃度を、そして650nmでの
吸光度を測定することによって濁度を決定した。実験の
最後に、濃縮した材料を限外ろ過セルから取り出し、0.
22μｍフィルターを介して滅菌ろ過した。

Filtron交叉流限外ろ過装置上で発生する高い剪断力
を克服するために、緩衝液として50mMクエン酸ナトリウ
ム、0.05mM EDTA、pH6.0を用い、攪拌器付限外ろ過セル
内で濃縮を行った。表５は本実験の結果を示す。

全体で、濃縮には約2.5日を要し、濃縮された抗体の
粘度が上昇すると流速が急速に低下した。171mg/mlの最
終濃度が首尾よく達成され、沈殿は認められなかった。
この材料を限外ろ過セルから取り出し、膜を十分な50mM
クエン酸ナトリウム、0.05mM EDTA、pH6.0で洗浄し、濃
縮物回収時に100mg/mlの最終濃度を得た。

この材料は容易に0.2μｍの滅菌フィルターを通過す
る。この回収された材料の実際に測定された濃度は、9
4.3mg/mlで容積は46mlであった。このことは、限外ろ過
工程を介する回収率が79％であることに相当する。

従って、本実験は、50mMクエン酸ナトリウム、0.05mM
EDTA、pH6.0が抗CD4を少なくとも171mg/mgに濃縮する
のに適切な緩衝液であり、上記のMinitanおよびFiltron
Mini−Ultrasetteの両方における、本来の交叉流限外
ろ過実験で沈殿を生じるのはおそらく高い剪断力である
ことを証明した。

実施例４抗CD4および抗CD23抗体のための皮下用処方ａ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15g オルトリン酸二水素カリウム、KH₂PO₄（無水） 0.0656g オルトリン酸水素二ナトリウム、NaHPO₄・12H₂O 0.0673g NaCl 0.6263g Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100gまでｂ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15g 酢酸Na 3.674g 氷酢酸、10％溶液 0.315g NaCl 0.630g Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100gまでｃ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15g マレイン酸 0.227g 0.5M NaOH 0.09g NaCl 0.777g Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100gまでｄ）抗CD4または抗CD23抗体 0.15g コハク酸 0.203g 0.5M NaOH 6.54g NaCl 0.779g Polysorbate 80（総処方物重量中の％） 0.01 水 100gまで注意：処方ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）は任意に0.05mM
EDTAを含有してもよい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 16/00 Ｃ０７Ｋ 16/00 (56)参考文献特開平１−268646（ＪＰ，Ａ) 国際公開94／15640（ＷＯ，Ａ１) 欧州特許出願公開564061（ＥＰ，Ａ１) ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，33 （７），1989年，ｐ．938 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) テーマコード４Ｈ０４５

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記工程を含んでなる濃縮抗体製剤の製造
法：（ａ）抗体製剤を準備する、（ｂ）限外濾過を用いて濾過膜の保持側から抗体製剤を
濾過し、濾液を得る、（ｃ）500ml/分未満の循環速度で濾液を濾過膜の保持側
に戻して循環させ、それにより濾液の剪断力を低下させ
る。
【請求項２】循環速度が約250ml/分である、請求項１に
記載の製造法。
【請求項３】70％を超える抗体製剤が濃縮抗体製剤に回
収される、請求項１に記載の製造法。
【請求項４】90％を超える抗体製剤が濃縮抗体製剤に回
収される、請求項３に記載の製造法。
【請求項５】限外濾過がタンジェンシャル限外濾過また
は撹拌限外濾過である、請求項１に記載の製造法。