JP3337362B2 - Collagen gel, collagen sheet and method for producing the same - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、医療の分野におい
て、皮膚や骨などの生体組織への補填材、軟膏・湿布の
基材、創傷被覆材、粘着材、止血材、癒着防止材、ドッ
ラグデリバリーシステムのキャリアー等として利用する
ことが可能な細胞侵入性、生分解性、止血性、透明性、
薬剤の徐放性を有する水不溶性のコラーゲンゲル、コラ
ーゲンシートおよびその製造方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a medical material, a material for supplementing living tissues such as skin and bone, a base material for ointments and compresses, a wound covering material, an adhesive material, a hemostatic material, an adhesion preventing material, and a drag. Cell penetration, biodegradability, hemostasis, transparency, which can be used as a carrier for delivery systems, etc.
The present invention relates to a water-insoluble collagen gel having a sustained release of a drug, a collagen sheet, and a method for producing the same.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ゼラチンは動物の骨や皮などを構成する
主要蛋白質であるコラーゲンを加水分解して得られる水
溶性蛋白質で、ハイドロゲル及びハイドロコロイドの性
質を有する材料として医療の分野でも古くから利用され
てきた。ゼラチンにおいて特に注目すべき特性はそのゾ
ル-ゲル変換能であり、ゼラチン粉末を水中で膨潤させ
た後、３７℃以上に加温するとゼラチンは溶解し粘性の
あるゾルとなる。これを冷却すると弾性のあるゲルにな
り、３７℃以上に再加温すると再びゾルに戻る。このよ
うな性質を利用してゼラチンは胃で溶解されるようなカ
プセル剤として多用されており、多量に生産され安価に
入手することが可能な非常に有用な材料である。一方、
ゼラチンはそのゾル-ゲル変換能故に生体に適用したと
き容易に溶融、分解し、比較的長期の形態保持性を要求
される補填材や創傷被覆材の材料にはそのままの形態で
は不適当であるために、アルデヒド類を用いて架橋形成
させて用いることもあるが、このような処理により得ら
れた材料はゼラチンとしての本来の特性を失うだけでな
く、生体親和性も損なわれていることが多い。2. Description of the Related Art Gelatin is a water-soluble protein obtained by hydrolyzing collagen, which is a main protein constituting animal bones and skins, and has been used for a long time in the medical field as a material having hydrogel and hydrocolloid properties. It has been. A particularly noteworthy property of gelatin is its sol-gel conversion ability. When gelatin powder is swollen in water and heated to 37 ° C. or higher, gelatin dissolves into a viscous sol. When this is cooled, it becomes an elastic gel, and when it is reheated to 37 ° C. or higher, it returns to a sol again. Utilizing such properties, gelatin is widely used as a capsule that can be dissolved in the stomach, and is a very useful material that can be produced in large quantities and obtained at low cost. on the other hand,
Gelatin easily melts and decomposes when applied to living organisms due to its sol-gel conversion ability, and is unsuitable in its original form as a filler or wound dressing material requiring relatively long-term shape retention For this reason, aldehydes may be used to form cross-links, but the material obtained by such treatment not only loses the original properties of gelatin but also has a loss of biocompatibility. Many.

【０００３】近年、アルギン酸ナトリウムやカルボキシ
メチルセルロースナトリウム等の高分子が、その高吸水
性や水溶液に粘稠性を付与する性質のために創傷被覆
材、粘着材等として主に体表面で利用されるようになっ
てきた。これらの特性は生分解しないことであり、した
がって生体内に長期間の留まることとなり組織治癒の妨
げとなる可能性が懸念される。In recent years, polymers such as sodium alginate and sodium carboxymethylcellulose have been mainly used on the body surface as wound dressings, adhesives, etc. due to their high water absorption and the property of imparting viscosity to aqueous solutions. It has become. These properties are that they do not biodegrade, so they remain in the body for a long period of time, and there is a concern that they may hinder tissue healing.

【０００４】一方、キチン・キトサンが生分解性材料と
して注目されている。キチン質はカニ、エビ等の甲殻類
の殻、蚕等の昆虫の甲皮、イカ等の軟体動物の殻など自
然界に広く分布する豊富な天然資源であり、キチン・キ
トサンは主にカニ、エビ食品加工場で廃棄される殻から
精製され市販されている。キチン・キトサンは動物体内
でリゾチーム酵素で加水分解されるという特徴を持つだ
けでなく、血液と接すると凝血を促進し、皮膚欠損創に
適用すると結合組織再生を促進すると言われている。ま
た、キチンは水に不溶であるがメタスルホン酸や蟻酸を
含むヘキサフルオロアセトン等に可溶であり、キトサン
は水に不溶であるが希有機酸に可溶であるため、適当な
溶媒に溶かし、単独で膜・繊維材料として形成され、生
分解性外科用縫合糸、生分解性カプセル、創傷被覆材な
どとして広く利用されている有用な材料である。しか
し、キチン・キトサンはその物理化学的性状から、その
ままではハイドロゲルやハイドロコロイドを形成させる
ことが困難なため、種々の親水化処理や架橋処理等の二
次加工を受けて初めて軟膏・湿布基材や粘着剤として利
用することができるようになる。[0004] On the other hand, chitin / chitosan has been receiving attention as a biodegradable material. Chitin is an abundant natural resource that is widely distributed in nature, such as shells of crustaceans such as crabs and shrimp, shells of insects such as silkworms, and shells of mollusks such as squid. Chitin and chitosan are mainly crabs and shrimp. It is purified from husks discarded at food processing plants and is commercially available. It is said that chitin and chitosan not only have the characteristics of being hydrolyzed by lysozyme enzymes in animals, but also promote blood coagulation when in contact with blood, and promote connective tissue regeneration when applied to skin defect wounds. In addition, chitin is insoluble in water but soluble in hexafluoroacetone containing metasulfonic acid and formic acid, and chitosan is insoluble in water but soluble in dilute organic acids. It is formed as a membrane / fiber material by itself and is a useful material widely used as a biodegradable surgical suture, a biodegradable capsule, a wound dressing, and the like. However, chitin and chitosan are difficult to form hydrogels and hydrocolloids as they are because of their physicochemical properties. Therefore, ointment and poultice base materials have not been subjected to secondary processing such as various hydrophilic treatments and cross-linking treatments. And can be used as an adhesive.

【０００５】以上のような問題を解決する手段としてヒ
アルロン酸等のグリコサミノグリカン、フィブリン、コ
ラーゲン等の蛋白質などの生分解性の生体由来材料がハ
イドロゲルやハイドロコロイドとして医療の分野で取り
上げられるようになってきた。しかし、ヒアルロン酸や
フィブリンは高価であるため大量生産に不向きであると
いう問題があるだけでなく、ヒアルロン酸は生体に適用
したとき容易に溶融、分解し、比較的長期の形態保持性
を要求される補填材や創傷被覆材の材料にはそのままの
形態では不適当であり、フィブリンは原料が主に人血で
あるためウィルス感染性が危険があるいった問題があ
る。As means for solving the above problems, biodegradable biological materials such as glycosaminoglycans such as hyaluronic acid, and proteins such as fibrin and collagen may be taken up in the medical field as hydrogels and hydrocolloids. It has become However, hyaluronic acid and fibrin are expensive and are not suitable for mass production.In addition, hyaluronic acid easily melts and decomposes when applied to living organisms, and requires relatively long-term shape retention. However, it is not suitable as it is in the form of a prosthetic material or a wound dressing material, and there is a problem that fibrin has a risk of viral infectivity since the raw material is mainly human blood.

【０００６】コラーゲンは動物の真皮、腱、骨、筋膜等
に豊富に含まれ、また、異種動物由来のものでも酵素処
理によりアテロコラーゲンとすると免疫原性を低下させ
ることが可能であるために多量に生産されて比較的安価
に入手することが可能な有用な材料であるが、生理的条
件下で再線維を形成して水に不溶性になるという特性が
あり、そのままではハイドロゲルやハイドロコロイドと
して用いることができず、キチン・キトサンと同様に種
々の親水化処理や架橋処理を必要とする。メチル化やサ
クシニル化により生理的条件下でも可溶性のコラーゲン
はそのままでは形態保持性が悪いために、グルタールア
ルデヒド等の架橋剤により化学架橋を導入することによ
り形態保持性は向上するが、コラーゲンの特性であると
もいえる生体親和性が著しく損なわれる。[0006] Collagen is abundantly contained in the dermis, tendons, bones, fascia and the like of animals, and even if it is derived from a heterologous animal, it can be reduced in immunogenicity by converting it into atelocollagen by enzymatic treatment. Although it is a useful material that can be produced at a relatively low cost, it has the property of forming refibrils under physiological conditions and becoming insoluble in water, and is used as it is as a hydrogel or hydrocolloid It requires various hydrophilic treatments and cross-linking treatments like chitin and chitosan. Collagen that is soluble even under physiological conditions due to methylation and succinylation has poor shape retention as it is.By introducing chemical cross-linking with a cross-linking agent such as glutaraldehyde, shape retention is improved. Biocompatibility, which can be said to be a characteristic, is significantly impaired.

【０００７】[0007]

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述した公
知技術の問題点を鑑みて、生体親和性、細胞侵入性、生
分解性、止血性、透明性、薬剤の徐放性を有する水不溶
性のコラーゲンゲル得ることを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the above-mentioned problems of the known art, the present invention provides water having biocompatibility, cell invasiveness, biodegradability, hemostasis, transparency, and sustained drug release. The purpose is to obtain an insoluble collagen gel.

【０００８】[0008]

【課題を解決するための手段】上記課題は以下の本発明
により達成される。 （１）乾燥重量の２０から２００倍の水分を吸収するこ
とができる水不溶性のコラーゲンゲルである。 （２）アテロコラーゲン溶液を金属イオンを０.１ｍＭ
以上と架橋促進剤によって処理することにより得られる
上記（１）に記載のコラーゲンゲルである。 （３）前記金属イオンが、銅イオンまたは鉄イオンであ
る上記（１）乃至（２）に記載のコラーゲンゲルであ
る。 （４）前記架橋促進剤がアスコルビン酸、トコフェロー
ル類、または過酸化水素である上記（１）乃至（３）に
記載のコラーゲンゲルである。The above object is achieved by the present invention described below. (1) It is a water-insoluble collagen gel that can absorb 20 to 200 times the moisture of the dry weight. (2) The atelocollagen solution was added with 0.1 mM of metal ions.
The collagen gel according to the above (1), which is obtained by treating the above with the crosslinking accelerator. (3) The collagen gel according to (1) or (2), wherein the metal ion is a copper ion or an iron ion. (4) The collagen gel according to any one of (1) to (3), wherein the crosslinking accelerator is ascorbic acid, tocopherols, or hydrogen peroxide.

【０００９】（５）上記（１）乃至（４）に記載のコラ
ーゲンゲルを乾燥することにより得られる得られるコラ
ーゲンシートである。 （６）アテロコラーゲン溶液に金属イオンを０.１ｍＭ
以上と架橋促進剤を添加し作用させた後、キレート剤を
添加することによって得られるコラーゲンゲルの製造方
法である。 （７）前記金属イオンが、銅イオンまたは鉄イオンであ
る上記（６）に記載のコラーゲンゲルの製造方法であ
る。 （８）前記架橋促進剤がアスコルビン酸、トコフェロー
ル類、または過酸化水素である上記（６）乃至（７）に
記載のコラーゲンゲルの製造方法である。(5) A collagen sheet obtained by drying the collagen gel according to (1) to (4). (6) 0.1 mM of metal ions in the atelocollagen solution
This is a method for producing a collagen gel obtained by adding a chelating agent after adding and acting a crosslinking accelerator. (7) The method for producing a collagen gel according to (6), wherein the metal ion is a copper ion or an iron ion. (8) The method for producing a collagen gel according to (6) or (7) above, wherein the crosslinking accelerator is ascorbic acid, tocopherols, or hydrogen peroxide.

【００１０】本発明のコラーゲンゲルは、アテロコラー
ゲン本来の特性を生かしながら乾燥重量の２０から２０
０倍の水分を吸収するので創傷表面の浸出液や血液を吸
収するため、優れた細胞侵入性、生分解性、止血性を有
し、また薬剤を混入した際には優れた薬剤の徐放性を有
する。また、透明性にも優れているため医療用途に用い
る際に患部の状態が確認できる。The collagen gel of the present invention has a dry weight of 20 to 20 while utilizing the inherent properties of atelocollagen.
Because it absorbs water 0 times, it absorbs exudate and blood on the wound surface, so it has excellent cell penetration, biodegradability and hemostasis, and excellent drug sustained release when mixed with drugs. Having. In addition, since it is excellent in transparency, the state of the affected part can be confirmed when used for medical applications.

【００１１】[0011]

【発明の実施の形態】本発明のコラーゲンゲルを得るた
めの製造方法は、（１）アテロコラーゲン溶液への金属
イオンの添加、（２）アテロコラーゲン溶液への架橋促
進剤の添加、（３）アテロコラーゲン酸性溶液の中和の
３つの操作により構成されているが、３つの操作の順序
は問わない。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The method for producing a collagen gel according to the present invention comprises the following steps: (1) adding a metal ion to an atelocollagen solution; (2) adding a crosslinking accelerator to an atelocollagen solution; It is composed of three operations of neutralizing the solution, but the order of the three operations does not matter.

【００１２】上記の製造方法においてアテロコラーゲン
酸性溶液のｐＨは２〜５が好ましく、特にｐＨ２.５〜
３.５が好ましい。また、アテロコラーゲン酸性溶液の
中和は水酸化ナトリウム等のアルカリやリン酸ナトリウ
ム、トリス塩酸、ヘペス等の緩衝剤を加えることにより
行い、溶液を中和した後のｐＨは５〜９が好ましく、特
にｐＨ６〜８が好ましい。In the above production method, the pH of the atelocollagen acidic solution is preferably from 2 to 5, particularly preferably from 2.5 to 2.5.
3.5 is preferred. In addition, neutralization of the atelocollagen acidic solution is performed by adding an alkali such as sodium hydroxide or a buffer such as sodium phosphate, Tris-HCl, and Hepes, and the pH after neutralizing the solution is preferably 5 to 9, particularly preferably pH 6-8 is preferred.

【００１３】上記の製造方法においてアテロコラーゲン
の溶液に金属イオンと架橋促進剤を作用させるときのア
テロコラーゲンの含有率は０.１〜１０％、特に０.２〜
０.５％が好適である。また、金属イオンの濃度は０.１
ｍＭ以上、特に０.１〜１ｍＭが好適である。さらに、
架橋促進剤の濃度は０.０１〜１００ｍＭ、特に０.１〜
１０ｍＭが好適である。When the metal ion and the crosslinking accelerator are allowed to act on the atelocollagen solution in the above production method, the content of atelocollagen is 0.1 to 10%, particularly 0.2 to 10%.
0.5% is preferred. The concentration of metal ions is 0.1.
mM or more, especially 0.1 to 1 mM is preferred. further,
The concentration of the crosslinking accelerator is from 0.01 to 100 mM, especially from 0.1 to 100 mM.
10 mM is preferred.

【００１４】上記の製造方法においてアテロコラーゲン
の溶液に金属イオンと架橋促進剤を作用させるときの温
度範囲は０〜４５℃が好ましく、特に２０〜４０℃が好
ましい。In the above-mentioned production method, the temperature range for allowing the metal ion and the crosslinking accelerator to act on the atelocollagen solution is preferably 0 to 45 ° C., particularly preferably 20 to 40 ° C.

【００１５】本発明に使用するアテロコラーゲンは、特
に限定されず、ウシ、ブタ、ニワトリ等動物の真皮、
腱、骨、筋膜等コラーゲンが豊富に含まれる組織を原料
とし、プロクターゼ又はペプシンにより分子末端の抗原
性の高いテロペプチド領域を除去したアテロコラーゲン
タイプI、III及びVが好適である。[0015] The atelocollagen used in the present invention is not particularly limited, and the dermis of animals such as cows, pigs and chickens,
Atelocollagen types I, III and V obtained by using a tissue rich in collagen, such as tendon, bone and fascia, as a raw material and removing the highly antigenic telopeptide region at the molecular terminal with proctase or pepsin are preferred.

【００１６】本発明に使用する金属イオンは特に限定し
ないが、銅イオンと鉄イオンが好ましい。また、本発明
に使用する架橋促進剤は特に限定しないが、アスコルビ
ン酸、トコフェロール類、または過酸化水素が好まし
い。The metal ions used in the present invention are not particularly limited, but copper ions and iron ions are preferred. The crosslinking accelerator used in the present invention is not particularly limited, but is preferably ascorbic acid, tocopherols, or hydrogen peroxide.

【００１７】また、上記の製造方法においてアテロコラ
ーゲンの酸性溶液に金属イオンと架橋促進剤を１分〜２
４時間作用させた後、ＥＤＴＡ、ジメチルカプロール、
ペニシラミン等のキレート剤を添加しても、本発明のコ
ラーゲンゲルは得られる。Further, in the above-mentioned production method, the acidic solution of atelocollagen is mixed with a metal ion and a crosslinking accelerator for 1 minute to 2 minutes.
After acting for 4 hours, EDTA, dimethylcaprol,
Even if a chelating agent such as penicillamine is added, the collagen gel of the present invention can be obtained.

【００１８】上記の製造方法により得られたコラーゲン
ゲルは、４５〜１００℃で熱変性させても良く、また濃
縮して用いても良い。The collagen gel obtained by the above production method may be heat-denatured at 45 to 100 ° C., or may be used after being concentrated.

【００１９】また、本発明のコラーゲンゲルは、風乾ま
たは凍結乾燥することにより粉末状、スポンジ状及びフ
ィルムシート状として用いても良い。The collagen gel of the present invention may be used as a powder, sponge or film sheet by air drying or freeze drying.

【００２０】ここで本発明に用いるアテロコラーゲン、
本発明のコラーゲンゲル、およびその製造方法について
さらに詳細に説明する。アテロコラーゲンは、ウシ、ブ
タ、ニワトリ等動物の真皮、腱、骨、筋膜等コラーゲン
が豊富に含まれる組織を原料とし、プロクターゼ又はペ
プシンにより分子末端の抗原性の高いテロペプチド領域
を除去して得られ、ｐＨ２〜４の酸性溶液に溶解して粘
稠な溶液となる。Here, atelocollagen used in the present invention,
The collagen gel of the present invention and the method for producing the same will be described in more detail. Atelocollagen is obtained by using collagen-rich tissue such as dermis, tendon, bone, and fascia of animals such as bovine, porcine and chicken as raw materials, and removing telopeptide regions with high antigenicity at the molecular terminals using proctase or pepsin. And dissolved in an acidic solution having a pH of 2 to 4 to form a viscous solution.

【００２１】このアテロコラーゲンの酸性溶液を生理的
ｐＨ、イオン強度、温度にすると、アテロコラーゲンは
再構成され、生体内での状態と類似した線維を形成し、
溶液は白濁した懸濁液となる。再構成されたアテロコラ
ーゲンは再線維化アテロコラーゲンと呼ばれ、そのとき
の過程は溶液の濁度を経時的に測定することにより知る
ことができる。When the acidic solution of atelocollagen is brought to physiological pH, ionic strength and temperature, atelocollagen is reconstituted and forms fibers similar to those in vivo,
The solution becomes a cloudy suspension. The reconstituted atelocollagen is called refibrillated atelocollagen, and the process at that time can be known by measuring the turbidity of the solution over time.

【００２２】例えば、アテロコラーゲンを０.３（ｗ／
ｖ）％の含有率で含むｐＨ２〜３の塩酸溶液に氷浴中で
食塩とリン酸ナトリウムを含む緩衝液を加え、終濃度が
０.２７％アテロコラーゲン、３０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、
１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８の溶液に調製した。
これを３７℃の恒温槽に浸漬する前に、終濃度が０.１
ｍＭになるように塩化第二銅溶液を加え、さらに、終濃
度が１ｍＭになるようにアスコルビン酸溶液を加えた
後、３７℃の恒温槽に浸漬した。すると、１時間以上加
温しても溶液は白濁した懸濁液とはならなず、半透明な
粘弾性のある材料を含む懸濁液となった。図１の▲はそ
のときの溶液の濁度を示したものである。したがって、
金属イオンとアスコルビン酸などの架橋促進剤を用いる
ことにより透明性に優れたコラーゲンゲルが得られるこ
とがわかる。For example, atelocollagen is 0.3 (w /
v) A buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate was added to a hydrochloric acid solution of pH 2-3 containing a content of% in an ice bath to give a final concentration of 0.27% atelocollagen, 30 mM Na ₂ HPO ₄ ,
A solution of 100 mM NaCl, pH 7 to 8 was prepared.
Before immersing this in a thermostat at 37 ° C., the final concentration is 0.1.
A cupric chloride solution was added to a concentration of 1 mM, and an ascorbic acid solution was further added to a final concentration of 1 mM, followed by immersion in a thermostat at 37 ° C. Then, the solution did not become a cloudy suspension even if heated for 1 hour or more, but became a suspension containing a translucent viscoelastic material. The triangle in FIG. 1 shows the turbidity of the solution at that time. Therefore,
It is understood that a collagen gel having excellent transparency can be obtained by using a metal ion and a crosslinking accelerator such as ascorbic acid.

【００２３】一方比較例として、アテロコラーゲンを
０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２〜３の塩酸溶
液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含む緩衝液を加
え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲン、３０ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８の溶
液に調製した。調製直後のこの溶液の濁度は０である
が、この溶液を３７℃の恒温槽に浸漬して加温し始める
と、アテロコラーゲンが再線維化アテロコラーゲンを構
成するにつれ、溶液の濁度は徐々に上昇し、約１時間で
平衡に達した。図１の●はそのときの溶液の濁度を示し
たものである。On the other hand, as a comparative example, a buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate was added to a hydrochloric acid solution of pH 2 to 3 containing atelocollagen at a content of 0.3 (w / v)% in an ice bath, and the final concentration was adjusted. 0.27% atelocollagen, 30 mM
Na ₂ HPO _4, 100mM NaCl, were prepared in a solution of pH 7-8. The turbidity of this solution immediately after preparation is 0, but when this solution is immersed in a thermostat at 37 ° C. and heating is started, the turbidity of the solution gradually increases as atelocollagen constitutes refibrotic atelocollagen. Rose and reached equilibrium in about 1 hour. 1 in FIG. 1 indicates the turbidity of the solution at that time.

【００２４】次に、金属イオンの濃度について検討し
た。図２は塩化第二銅溶液の添加量を変化させたときの
濁度変化を示したものであり、塩化第二銅溶液の添加に
より懸濁液の濁度が急激に低下する様子が観察される。
すなわち、金属イオンを０.１ｍＭ以上にすることによ
り透明性に優れたコラーゲンゲルが得られることがわか
る。Next, the concentration of metal ions was examined. FIG. 2 shows the change in turbidity when the addition amount of the cupric chloride solution was changed. It was observed that the turbidity of the suspension rapidly decreased by the addition of the cupric chloride solution. You.
That is, it can be understood that a collagen gel having excellent transparency can be obtained by adjusting the metal ion to 0.1 mM or more.

【００２５】次に、上記図１の本発明のコラーゲンゲル
（▲）と比較例（●）の懸濁液を３０００ｒｐｍ、１０
分間の遠心分離により水層を完全に分離した後、それぞ
れの保水性を調べるために乾燥し、含水率（％）（式、
含水率＝（乾燥前重量／乾燥後重量）×１００により）
を求めた。すると、比較例の含水率が２２％であるのに
対し、本発明のコラーゲンゲルの含水率は１８５％であ
り、高吸水性を有することが明らかになった。また、図
３は塩化第二銅溶液の添加量を変化させたときの含水率
の変化を示したものであり、塩化第二銅溶液の添加によ
り材料の含水性が急激に上昇することがわかる。Next, the suspension of the collagen gel (▲) of the present invention and the comparative example (●) shown in FIG.
After completely separating the aqueous layer by centrifugation for minutes, each was dried to check the water retention, and the water content (%) (formula,
Water content = (weight before drying / weight after drying) × 100)
I asked. Then, while the water content of the comparative example was 22%, the water content of the collagen gel of the present invention was 185%, which revealed that the collagen gel had high water absorption. FIG. 3 shows the change in the water content when the amount of the cupric chloride solution was changed, and it can be seen that the water content of the material rapidly increased by the addition of the cupric chloride solution. .

【００２６】さらに、上記の本発明のコラーゲンゲルと
比較例を遠心分離や凍結乾燥により濃縮した後、大過剰
量の冷ｐＨ２.５塩酸溶液中に浸漬し、４℃冷蔵庫中で
１晩攪拌した。これらの浸漬溶液を３０００ｒｐｍ、１
０分間遠心分離することにより、酸可溶性コラーゲンを
上清として分離し、上清溶液中のコラーゲン含有量
（Ｓ）を測定した。また、残査中の酸不溶性コラーゲン
含有量（Ｐ）を測定した。上清溶液中の酸可溶性コラー
ゲン含有量（Ｓ）と残査中の酸不溶性コラーゲン含有量
（Ｐ）の和が全コラーゲン量（Ａ＝Ｓ＋Ｐ）であり、全
コラーゲン量に占める酸不溶性コラーゲン含有率（％）
（式、含有率＝（酸不可溶性コラーゲン量／全コラーゲ
ン量）×１００により）を求め、これを架橋度とした。
その結果、比較例の架橋度が０であるのに対し、本発明
のコラーゲンゲルの架橋度は約８７％であり、高度に架
橋されていることがわかった。Further, the collagen gel of the present invention and the comparative example were concentrated by centrifugation or lyophilization, immersed in a large excess of a cold pH 2.5 hydrochloric acid solution, and stirred in a refrigerator at 4 ° C. overnight. . These immersion solutions were applied at 3000 rpm, 1
By centrifuging for 0 minutes, the acid-soluble collagen was separated as a supernatant, and the collagen content (S) in the supernatant solution was measured. Further, the content (P) of the acid-insoluble collagen in the residue was measured. The sum of the acid-soluble collagen content (S) in the supernatant solution and the acid-insoluble collagen content (P) in the residue is the total collagen amount (A = S + P), and the content of the acid-insoluble collagen in the total collagen amount (%)
(Expression, content = (acid-insoluble collagen content / total collagen content) × 100) was determined, and this was defined as the degree of crosslinking.
As a result, the degree of cross-linking of the comparative example was 0, whereas the degree of cross-linking of the collagen gel of the present invention was about 87%, which indicates that the collagen gel was highly cross-linked.

【００２７】また、塩化第二銅溶液の添加量を変化させ
たときの架橋度変化を求めた。その結果、図４に示す通
り、塩化第二銅溶液の添加により材料の架橋度が急激に
上昇することがわかった。Further, a change in the degree of crosslinking when the amount of the cupric chloride solution added was changed was determined. As a result, as shown in FIG. 4, it was found that the degree of crosslinking of the material was sharply increased by the addition of the cupric chloride solution.

【００２８】以上より、本発明のコラーゲンゲルは、再
線維化せずに分子間架橋したアテロコラーゲンであり、
アテロコラーゲン溶液に銅イオンなどの金属イオンとア
スコルビン酸などの架橋促進剤を作用させることにより
アテロコラーゲン分子間に架橋が導入され、高吸水性、
透明性に優れたハイドロゲルが得られる。As described above, the collagen gel of the present invention is atelocollagen which has been crosslinked intermolecularly without refibrosis,
Crosslinking is introduced between atelocollagen molecules by causing a metal ion such as copper ion and a crosslinking accelerator such as ascorbic acid to act on the atelocollagen solution, resulting in high water absorption,
A hydrogel with excellent transparency can be obtained.

【００２９】また、図５に示すように、金属イオンとし
て銅イオンの代わりに鉄イオンを添加してもアテロコラ
ーゲン分子間に架橋が導入され、高吸水性のハイドロゲ
ルが形成されることがわかった。As shown in FIG. 5, it was found that even if iron ions were added instead of copper ions as metal ions, crosslinks were introduced between atelocollagen molecules and a highly water-absorbing hydrogel was formed. .

【００３０】さらに、図６に示すように、架橋促進剤と
してアスコルビン酸の代わりに過酸化水素やα-トコフ
ェロール類を添加してもアテロコラーゲン分子間に架橋
が導入され、高吸水性のハイドロゲルが形成されること
がわかった。Further, as shown in FIG. 6, even if hydrogen peroxide or α-tocopherols is added instead of ascorbic acid as a crosslinking accelerator, crosslinking is introduced between atelocollagen molecules, and a highly water-absorbing hydrogel is formed. It was found to be formed.

【００３１】[0031]

【実施例】以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的
に説明する。 （実施例１）アテロコラーゲン粉末（高研（株）製）を
０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２〜３の塩酸溶
液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含む緩衝液を加
え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲン、３０ｍＭ
Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７〜８のコ
ラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン溶液に終濃度
がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第二銅溶液とア
スコルビン酸溶液を加えた。このコラーゲン溶液を３７
℃の恒温槽に４時間浸漬すると、コラーゲン溶液は半透
明なハイドロゲルを含む懸濁液となった。この懸濁液に
終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を添加した
後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数回行い、
沈査を回収することにより乾燥重量の約１００倍の水分
を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲル（１）を得た。The present invention will be described more specifically with reference to the following examples. (Example 1) A buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate in an ice bath containing a pH 2 to 3 hydrochloric acid solution containing atelocollagen powder (manufactured by Koken Co., Ltd.) at a content of 0.3 (w / v)%. To a final concentration of 0.27% atelocollagen, 30 mM
A collagen solution of Na ₂ HPO ₄ , 100 mM NaCl, pH 7 to 8 was prepared. To this collagen solution, a cupric chloride solution and an ascorbic acid solution were added so that the final concentrations were each 0.1 mM. Apply this collagen solution to 37
When the collagen solution was immersed in a thermostat at 4 ° C. for 4 hours, the collagen solution became a suspension containing a translucent hydrogel. After adding an EDTA solution to the suspension to a final concentration of 10 mM, the suspension was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes several times.
By collecting the sediment, a hydrogel-like collagen gel (1) containing about 100 times the water content of the dry weight was obtained.

【００３２】得られたコラーゲンゲルをシャーレに５ｍ
ｍ厚に流し込み、凍結乾燥することによりスポンジ状シ
ート（１）に加工した。得られたスポンジ状シート
（１）を３７℃に加温した生理的食塩水に浸漬すると、
スポンジ構造を保ちながら直ちに自重の約３０倍の食塩
水を含み、透明化した。また、スポンジ状シート（１）
の架橋度測定を行った結果、架橋度は約８０％であっ
た。The obtained collagen gel is placed in a petri dish for 5 m.
The mixture was poured into a m-thick sheet and freeze-dried to form a sponge-like sheet (1). When the obtained sponge-like sheet (1) is immersed in physiological saline heated to 37 ° C.,
While maintaining the sponge structure, it immediately contained a saline solution of about 30 times its own weight and became transparent. Also, a sponge-like sheet (1)
As a result of measuring the degree of crosslinking, the degree of crosslinking was found to be about 80%.

【００３３】（比較例１）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１００ｍＭ ＮａＣｌ、
ｐＨ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲ
ン溶液を３７℃の恒温槽に４時間浸漬し、線維化アテロ
コラーゲンの懸濁液を得た。この懸濁液に終濃度がそれ
ぞれ０.１ｍＭになるように塩化第二銅溶液とアスコル
ビン酸溶液を加え、３０分間静置した後、終濃度が１０
ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を添加した。その後この
懸濁液に、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数回
行い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１０倍の
水分を含むコラーゲンゲル（Ａ）を得た。Comparative Example 1 pH2 containing atelocollagen powder (manufactured by Koken Co., Ltd.) at a content of 0.3 (w / v)%
A buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate was added to an aqueous solution of hydrochloric acid to a final concentration of 0.27% atelocollagen, 30 mM Na ₂ HPO ₄ , 100 mM NaCl,
A collagen solution having a pH of 7 to 8 was prepared. This collagen solution was immersed in a thermostat at 37 ° C. for 4 hours to obtain a suspension of fibrillated atelocollagen. To this suspension, a cupric chloride solution and an ascorbic acid solution were added so that the final concentrations became 0.1 mM, and the suspension was allowed to stand for 30 minutes.
The EDTA solution was added to make mM. Thereafter, this suspension was centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes several times, and the precipitate was collected to obtain a collagen gel (A) containing about 10 times the moisture of the dry weight.

【００３４】得られたコラーゲンゲル（Ａ）を実施例１
のコラーゲンゲル（１）と同じコラーゲン濃度に希釈し
た後、シャーレに５ｍｍ厚に流し込み、凍結乾燥するこ
とによりスポンジ状シート（Ａ）に加工した。得られた
スポンジ状シート（Ａ）を３７℃に加温した生理的食塩
水に浸漬すると、スポンジ構造を保ちながら直ちに自重
の約７倍の食塩水を吸収した。また、このスポンジ状シ
ート（Ａ）の架橋度測定を行った結果、架橋度は約７０
％であった。The obtained collagen gel (A) was used in Example 1.
Was diluted to the same collagen concentration as that of the collagen gel (1), poured into a Petri dish to a thickness of 5 mm, and freeze-dried to process into a sponge-like sheet (A). When the obtained sponge-like sheet (A) was immersed in a physiological saline solution heated to 37 ° C., the sponge structure immediately absorbed about seven times its own weight of saline while maintaining the sponge structure. As a result of measuring the degree of crosslinking of this sponge-like sheet (A), the degree of crosslinking was about 70.
%Met.

【００３５】（試験例１）ラット皮下埋入試験 上記の実施例１で得られた本発明のコラーゲンゲル
（１）からなるスポンジ状シート（１）を補填材、癒着
防止剤、ドラッグデリバリーシステムのキャリアーに想
定したときの、細胞侵入性及び生体内に留置したときの
分解速度を明らかにするために、ラット背部に皮下埋入
し、埋入後経時的に埋入物とその周囲組織の組織標本を
作製して検索した。体重１８０〜２００ｇのＳｐｒａｇ
ｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの背部皮膚をネンブタール
麻酔下で除毛した後、背部皮膚中央部に骨格筋筋膜に達
する長さ１ｃｍの切り傷を作製し、その切り傷から皮膚
と骨格筋筋膜の間に切り込みを入れ、皮下ポケットを作
製した。(Test Example 1) Rat subcutaneous implantation test The sponge-like sheet (1) comprising the collagen gel (1) of the present invention obtained in the above-mentioned Example 1 was used as a filling material, an adhesion inhibitor, and a drug delivery system. In order to clarify the cell invasiveness and the degradation rate when placed in a living body assuming a carrier, the implant was subcutaneously implanted in the back of the rat, and after implantation, the implant and the surrounding tissue Specimens were prepared and searched. Sprag weighing 180-200g
After removing the hair of the back skin of the ue-Dawley rat under Nembutal anesthesia, a 1 cm long incision reaching the skeletal muscle fascia was made at the center of the back skin, and from the cut, between the skin and the skeletal muscle fascia. A cut was made to create a subcutaneous pocket.

【００３６】そのポケットに上記の実施例１で得られた
スポンジ状シート（１）を１ｃｍ角に切断して挿入した
後、背部中央部の切り傷を縫合閉鎖することによりスポ
ンジ状シート（１）を埋入した。経時的に摘出したスポ
ンジ状シートの組織標本を観察した結果、本発明のスポ
ンジ状シート（１）は、強い炎症反応や材料周囲への皮
包形成を認めずに線維芽細胞と毛細血管が侵入しており
生体親和性に優れていることが明らかになった。また、
本発明のスポンジ状シート（１）は埋入後徐々に減少し
て４週目にはほとんど消失し、生分解性を有することが
明らかになった。After the sponge-like sheet (1) obtained in the above-mentioned Example 1 is cut into 1 cm square and inserted into the pocket, the cut in the center of the back is closed by suture and the sponge-like sheet (1) is closed. Implanted. As a result of observing the sponge-like sheet tissue sample extracted over time, the sponge-like sheet (1) of the present invention showed invasion of fibroblasts and capillaries without showing a strong inflammatory reaction or formation of a follicle around the material. It is clear that the biocompatibility is excellent. Also,
The sponge-like sheet (1) of the present invention gradually decreased after embedding and almost disappeared at the 4th week, indicating that it had biodegradability.

【００３７】一方、比較例１のコラーゲンゲル（Ａ）か
らなるスポンジ状シート（Ａ）を同様に皮下埋入し経時
的に観察したところ、埋入後１〜２週間でスポンジ状シ
ート内に石灰沈着と炎症細胞の侵入が観察された。ま
た、スポンジ状シート（Ａ）は埋入後４週間でも大部分
が残存し、本発明のスポンジ状シート（１）と比較して
生体親和性に劣るだけではなく、生分解速度も遅いこと
が明らかになった。On the other hand, the sponge-like sheet (A) composed of the collagen gel (A) of Comparative Example 1 was similarly subcutaneously implanted and observed over time. Deposition and infiltration of inflammatory cells were observed. In addition, most of the sponge-like sheet (A) remains even four weeks after implantation, and not only has poor biocompatibility but also a slow biodegradation rate as compared with the sponge-like sheet (1) of the present invention. It was revealed.

【００３８】（試験例２）ラット全層皮膚欠損創への移
植試験 上記の実施例１で得られた本発明のコラーゲンゲル
（１）からなるスポンジ状シート（１）を創傷被覆材に
想定したときの操作性及び創傷治癒効果を調べるため
に、ラット背部の全層皮膚欠損創への移植を試みた。体
重１８０〜２００ｇのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系
ラットの背部皮膚をネンブタール麻酔下で除毛した後、
背部皮膚に２×２ｃｍの皮筋を温存した欠損創を作製
し、充分に止血した。その欠損創にスポンジ状シート
（１）を２ｃｍ角に切断して適用し、周囲を創縁に縫合
固定することにより移植した。その後、移植部をバイオ
クルーシブとエラスチコンテープ（ジョンソンアンドジ
ョンソン社製）で被覆保護した。(Test Example 2) Transplantation test into rat full-thickness skin defect wound The sponge-like sheet (1) comprising the collagen gel (1) of the present invention obtained in Example 1 above was assumed as a wound dressing. In order to examine the operability and the wound healing effect at the time, transplantation to a full-thickness skin defect wound on the back of the rat was attempted. After removing the back skin of Sprague-Dawley rats weighing 180-200 g under Nembutal anesthesia,
A 2 × 2 cm cutaneous muscle was preserved in the back skin to create a defective wound, and the blood was sufficiently stopped. A sponge-like sheet (1) was cut into a 2 cm square and applied to the defective wound, and transplanted by suturing the periphery to the wound margin. Thereafter, the implanted portion was covered and protected with Bioclusive and Elasticon tape (manufactured by Johnson & Johnson).

【００３９】欠損創適用時、スポンジ状シート（１）は
透明性に優れ、創面の観察が充分に行えるだけではな
く、形態保持性に優れ、創縁に容易に縫合することがで
きた。また、欠損創からの浸出液を充分に吸収するだけ
でなく、創面への密着性も良好であった。また、経時的
な組織治癒性を病理組織学的に観察した結果、スポンジ
状シート（１）は、強い炎症反応や過剰な肉芽組織の増
殖のない、良好な線維芽細胞と毛細血管の侵入が認めら
れ、移植後１週目には創周囲からの表皮伸展が開始し
た。At the time of application of the defect wound, the sponge-like sheet (1) was excellent not only in transparency and sufficient observation of the wound surface, but also in shape retention and was easily sutured to the wound edge. In addition, not only the exudate from the defective wound was sufficiently absorbed, but also the adhesion to the wound surface was good. In addition, as a result of histopathological observation of tissue healing properties over time, the sponge-like sheet (1) showed good infiltration of fibroblasts and capillaries without a strong inflammatory reaction or excessive proliferation of granulation tissue. One week after transplantation, epidermal extension from around the wound started.

【００４０】一方、比較例１のコラーゲンゲル（Ａ）か
らなるスポンジ状シート（Ａ）を同様に欠損部に移植し
た。欠損創適用時、スポンジ状シート（Ａ）は不透明な
ため、創面の観察ができず、さらに浸出液を吸収し難い
ため、適用後厚みが著しく低下した。また、経時的な組
織治癒性を病理組織学的に観察した結果、本発明のスポ
ンジ状シート（１）と比べ大きな差異は認められなかっ
たが、線維芽細胞と毛細血管の侵入および表皮伸展がわ
ずかに遅延していた。On the other hand, the sponge-like sheet (A) made of the collagen gel (A) of Comparative Example 1 was similarly transplanted to the defect. At the time of application of the defect wound, the sponge-like sheet (A) was opaque, so that the wound surface could not be observed, and it was difficult to absorb the exudate. Further, as a result of histopathological observation of the tissue healing property over time, no significant difference was observed as compared with the sponge-like sheet (1) of the present invention, but penetration of fibroblasts and capillaries and epidermal extension were observed. Had a slight delay.

【００４１】以上の試験例１及び２より、本発明のコラ
ーゲンゲル、およびそれからなるスポンジ状シートは含
水性が高いだけではなく、細胞侵入性にも優れた材料で
あることが明らかになった。また、コラーゲン自体が生
体内に自己組織と同様に取り込まれその後徐々に分解さ
れるため、１度生体に適用すれば他の高分子ハイドロゲ
ル材料のように交換の必要がないことが明らかになっ
た。From the above Test Examples 1 and 2, it was revealed that the collagen gel of the present invention and the sponge-like sheet comprising the same are not only high in water content but also excellent in cell penetration. In addition, since collagen itself is taken into the living body in the same manner as the self-tissue and is gradually degraded thereafter, it is clear that once applied to the living body, there is no need to replace it like other polymer hydrogel materials. Was.

【００４２】（試験例３）全血凝固時間に及ぼす影響 １０mg乾燥重量の上記のコラーゲンゲル（１）、コラー
ゲンゲル（Ａ）及びヘリスタット（マリオン）を添加し
た１２×７５ｍｍガラス試験管に採取直後のラット全血
液を管壁を伝わらせて静かに添加した後、室温で３０秒
ごとに試験管を傾け、血液が凝固するまでの時間を測定
した。なお、何も加えなかった血液を対照として用い
た。その結果を下記の表１に示す。Test Example 3 Influence on Whole Blood Clotting Time Immediately after collection in a 12 × 75 mm glass test tube to which 10 mg dry weight of the above collagen gel (1), collagen gel (A) and helistat (Marion) was added. After the whole blood of the rat was gently added through the tube wall, the test tube was tilted every 30 seconds at room temperature, and the time until the blood clotted was measured. The blood to which nothing was added was used as a control. The results are shown in Table 1 below.

【００４３】[0043]

【表１】 [Table 1]

【００４４】（試験例４）臓器欠損創における止血効果 体重４５０〜５００ｇのＨａｒｔｌｅｙ系モルモットの
背部皮膚をネンブタール麻酔下で除毛した後、背部より
尿管及び動静脈を付けたままで腎臓を摘出した。その腎
臓に皮質に達する欠損創を作製し、欠損部の血液をガー
ゼで拭い、スポンジ状シート（１）を１ｃｍ角に切断し
たものを欠損部に軽く押しつけて適用した。約３０秒間
軽く圧迫した後、５分間観察した。その結果、スポンジ
状シート（１）は血液を良く吸収し、適用後３分以内で
欠損創からの出血が止まった。Test Example 4 Hemostatic Effect on Organ-Deficient Wounds The back skin of a Hartley guinea pig weighing 450 to 500 g was shaved under Nembutal anesthesia, and then the kidney was removed from the back with the ureter and arteries and veins attached. . A defect wound reaching the cortex of the kidney was prepared, blood in the defect was wiped with gauze, and a sponge-like sheet (1) cut into 1 cm square was lightly pressed against the defect and applied. After lightly pressing for about 30 seconds, observation was performed for 5 minutes. As a result, the sponge-like sheet (1) absorbed blood well and stopped bleeding from the defective wound within 3 minutes after application.

【００４５】一方、スポンジ状シート（Ａ）及びヘリス
タットを欠損創に適用すると、欠損創からの出血が止ま
るのに適用後４分以上の時間を要した。On the other hand, when the sponge-like sheet (A) and the helistat were applied to the defect wound, it took 4 minutes or more after the application to stop the bleeding from the defect wound.

【００４６】（実施例２）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ２HＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン
溶液に終濃度がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第
二銅溶液とアスコルビン酸溶液を加えた。このコラーゲ
ン溶液を３７℃の恒温槽に４時間浸漬すると、コラーゲ
ン溶液は半透明なハイドロゲルを含む懸濁液となった。
この懸濁液に終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶
液を添加した後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離
を数回行い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１
００倍の水分を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲルを
得た。得られたコラーゲンゲルを凍結乾燥した後、適量
の蒸留水を加えて４％の濃度に調製し、６０℃の恒温槽
に３０分間浸漬してコラーゲンに熱変性を施しコラーゲ
ンゲル（２）を得た。このコラーゲンゲル（２）の架橋
度測定を行ったところ、架橋度は約９０％であった。Example 2 pH2 containing atelocollagen powder (manufactured by Koken Co., Ltd.) at a content of 0.3 (w / v)%
A buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate was added to the hydrochloric acid solution of (1) to (3) in an ice bath to give a final concentration of 0.27% atelocollagen, 30 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl, p
A collagen solution of H7-8 was prepared. To this collagen solution, a cupric chloride solution and an ascorbic acid solution were added so that the final concentrations were each 0.1 mM. When this collagen solution was immersed in a thermostat at 37 ° C. for 4 hours, the collagen solution became a suspension containing a translucent hydrogel.
After adding an EDTA solution to the suspension to a final concentration of 10 mM, the suspension was centrifuged several times at 3000 rpm for 10 minutes, and the sediment was collected to obtain about 1% of the dry weight.
A hydrogel-like collagen gel containing 00 times the water content was obtained. After freeze-drying the obtained collagen gel, an appropriate amount of distilled water is added to adjust to a concentration of 4%, and the collagen gel is immersed in a thermostat at 60 ° C. for 30 minutes to thermally denature the collagen to obtain a collagen gel (2). Was. When the degree of crosslinking of this collagen gel (2) was measured, the degree of crosslinking was about 90%.

【００４７】（比較例２）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）に適量の蒸留水を加えて４％の濃度に調製し
た。これを６０℃の恒温槽に３０分間浸漬し、コラーゲ
ンに熱変性を行いコラーゲンゲル（Ｂ）を得た。このコ
ラーゲンゲル（Ｂ）の架橋度測定を行ったところ、架橋
度は０％であった。(Comparative Example 2) A suitable amount of distilled water was added to atelocollagen powder (manufactured by Koken Co., Ltd.) to adjust the concentration to 4%. This was immersed in a thermostat at 60 ° C. for 30 minutes to thermally denature the collagen to obtain a collagen gel (B). When the degree of crosslinking of this collagen gel (B) was measured, the degree of crosslinking was 0%.

【００４８】（試験例４）粘度測定 上記のコラーゲンゲル（２）とコラーゲンゲル（Ｂ）の
粘度を回転粘度計を用いて測定した。下記の表２に示す
ように、２０℃で測定すると、どちらのコラーゲンゲル
も粘度が高すぎて測定を行えなかった。しかし、３７℃
で測定するとコラーゲンゲル（Ｂ）の粘度が１３１ｃＰ
であるのに対し、コラーゲンゲル（２）の粘度は４４８
ｃＰであり、優位に高い粘性を示した。Test Example 4 Viscosity Measurement The viscosities of the above collagen gel (2) and collagen gel (B) were measured using a rotational viscometer. As shown in Table 2 below, when measured at 20 ° C., both collagen gels were too viscous to measure. But 37 ° C
The viscosity of the collagen gel (B) is 131 cP
Whereas the viscosity of collagen gel (2) is 448
It was cP and showed significantly higher viscosity.

【００４９】[0049]

【表２】 [Table 2]

【００５０】（実施例３）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ２HＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン
溶液に終濃度がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第
二銅溶液とアスコルビン酸溶液を加えた。さらに、この
コラーゲン溶液に終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにブ
ドウ糖を添加した後、３７℃の恒温槽に４時間浸漬し、
半透明なハイドロゲルを含む懸濁液を得た。この懸濁液
に終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を添加し
た後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数回行
い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１００倍の
水分を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲル（３）を得
た。Example 3 pH2 containing atelocollagen powder (manufactured by Koken Co., Ltd.) at a content of 0.3 (w / v)%
A buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate was added to the hydrochloric acid solution of (1) to (3) in an ice bath to give a final concentration of 0.27% atelocollagen, 30 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl, p
A collagen solution of H7-8 was prepared. To this collagen solution, a cupric chloride solution and an ascorbic acid solution were added so that the final concentrations were each 0.1 mM. Further, glucose was added to this collagen solution so that the final concentration became 1 mg / ml, and the collagen solution was immersed in a thermostat at 37 ° C. for 4 hours.
A suspension containing a translucent hydrogel was obtained. After adding an EDTA solution to the suspension to a final concentration of 10 mM, the suspension was centrifuged several times at 3000 rpm for 10 minutes, and the sediment was collected to obtain a hydrogel containing about 100 times the dry weight of water. As a result, a collagen gel (3) was obtained.

【００５１】得られたコラーゲンゲル（３）を３７℃に
加温した大過剰量の生理的食塩水に浸漬し、経時的に生
理的食塩水中のブドウ糖濃度をグルコースＢ−テストワ
コー（和光純薬工業(株)）を用いて測定することにより
コラーゲンゲル（３）からのブドウ糖の放出速度を調べ
た。その結果を図７に示す。図７の曲線に示す通り、コ
ラーゲンゲル（３）中のブドウ糖は生理的食塩水に浸漬
後、徐々に放出し、２時間目までにほぼ全量が放出され
ることが明らかになった。The collagen gel (3) thus obtained was immersed in a large excess of physiological saline heated to 37 ° C., and the glucose concentration in the physiological saline was measured with time using glucose B-Test Wako (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). The rate of glucose release from the collagen gel (3) was determined by measurement using Kogyo Co., Ltd.). FIG. 7 shows the result. As shown in the curve of FIG. 7, it was revealed that glucose in collagen gel (3) was gradually released after immersion in physiological saline, and almost the entire amount was released by the second hour.

【００５２】（実施例４）アテロコラーゲン粉末（高研
（株）製）を０.３（ｗ／ｖ）％の含有率で含むｐＨ２
〜３の塩酸溶液に氷浴中で食塩とリン酸ナトリウムを含
む緩衝液を加え、最終濃度が０.２７％アテロコラーゲ
ン、３０ｍＭ Ｎａ２HＰＯ４、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７〜８のコラーゲン溶液を調製した。このコラーゲン
溶液に終濃度がそれぞれ０.１ｍＭになるように塩化第
二銅溶液とアスコルビン酸溶液を加えた。さらに、この
コラーゲン溶液に終濃度が１〜１０μｇ／ｍｌになるよ
うにヘパリンを添加した後、３７℃の恒温槽に４時間浸
漬し、半透明なハイドロゲルを含む懸濁液を得た。この
懸濁液に終濃度が１０ｍＭになるようにＥＤＴＡ溶液を
添加した後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を数
回行い、沈査を回収することにより乾燥重量の約１００
倍の水分を含むハイドロゲル状のコラーゲンゲル（４）
を得た。Example 4 pH2 containing atelocollagen powder (manufactured by Koken Co., Ltd.) at a content of 0.3 (w / v)%
A buffer solution containing sodium chloride and sodium phosphate was added to an aqueous solution of hydrochloric acid to a final concentration of 0.27% atelocollagen, 30 mM Na2HPO4, 100 mM NaCl, p.
A collagen solution of H7-8 was prepared. To this collagen solution, a cupric chloride solution and an ascorbic acid solution were added so that the final concentrations were each 0.1 mM. Further, heparin was added to the collagen solution so that the final concentration became 1 to 10 μg / ml, and the collagen solution was immersed in a thermostat at 37 ° C. for 4 hours to obtain a suspension containing a translucent hydrogel. After adding an EDTA solution to the suspension to a final concentration of 10 mM, the suspension was centrifuged several times at 3000 rpm for 10 minutes, and the sediment was collected to obtain a dry weight of about 100%.
Hydrogel collagen gel containing twice the amount of water (4)
I got

【００５３】アテロコラーゲンとヘパリンはイオン結合
することが知られており、コラーゲンゲル（４）に結合
しているヘパリン結合量を、遠心分離上清中のヘパリン
含有量をテストチームヘパリンＳ（第一化学薬品(株)）
を用いて測定し逆算して求めた。その結果を図８に示
す。図８に示すように、１〜１０μｇ／ｍｌの濃度範囲
でアテロコラーゲン溶液に添加したヘパリンのほぼ全量
がアテロコラーゲンに結合し、アテロコラーゲン溶液へ
の銅とアスコルビン酸の添加はアテロコラーゲンへのヘ
パリンの結合を妨げないことが分かった。It is known that atelocollagen and heparin form ionic bonds. The amount of heparin bound to collagen gel (4) is determined by the amount of heparin in the supernatant of centrifugation. Pharmaceutical Co., Ltd.)
And was calculated by back calculation. FIG. 8 shows the result. As shown in FIG. 8, almost all of the heparin added to the atelocollagen solution in the concentration range of 1 to 10 μg / ml binds to atelocollagen, and the addition of copper and ascorbic acid to the atelocollagen solution prevents the binding of heparin to atelocollagen. I knew it wasn't.

【００５４】また、コラーゲンゲル（４）の架橋度測定
を行うと、架橋度は約８０％であり、アテロコラーゲン
溶液へのヘパリンの添加はハイドロゲルの形成を妨げな
いことが分かった。When the degree of crosslinking of the collagen gel (4) was measured, it was found that the degree of crosslinking was about 80%, and that the addition of heparin to the atelocollagen solution did not prevent the formation of the hydrogel.

【００５５】また、コラーゲンゲル（４）を３７℃に加
温した生理的食塩水に浸漬し、経時的に生理的食塩水中
のヘパリン濃度を測定することにより、ヘパリンの放出
速度を調べた。結果を図９に示す。図９に示すように２
４時間浸漬してもヘパリンはほとんど放出されなかっ
た。Further, the collagen gel (4) was immersed in physiological saline heated to 37 ° C., and the heparin release rate was examined by measuring the heparin concentration in the physiological saline over time. FIG. 9 shows the results. As shown in FIG.
Heparin was hardly released after immersion for 4 hours.

【００５６】また、コラーゲンゲル（４）を３７℃に加
温したラットから得られた新鮮な血清中に浸漬し、経時
的に血清を採取して加熱及びプロナーゼ処理を施した後
の血清中のヘパリン濃度を測定することにより、ヘパリ
ンの放出速度を調べた。その結果を図１０に示す。図１
０の曲線に示されるように、コラーゲンゲル（４）中の
ヘパリンは徐放されることが明らかになった。Further, the collagen gel (4) was immersed in fresh serum obtained from a rat heated to 37 ° C., and the serum was collected over time and subjected to heating and pronase treatment. The heparin release rate was determined by measuring the heparin concentration. The result is shown in FIG. FIG.
As shown by the curve of 0, it was revealed that heparin in the collagen gel (4) was released slowly.

【００５７】さらに、コラーゲンゲル（４）を試験例１
で述べた方法でラットの皮下に埋入し、３日後に取り出
して材料中のヘパリン含有量を調べると、残存量は埋入
前の初めの約５６％であった。Further, collagen gel (4) was used in Test Example 1
Rats were implanted subcutaneously by the method described above, and taken out 3 days later to examine the heparin content in the material. The remaining amount was about 56% of that before implantation.

【００５８】[0058]

【発明の効果】本発明のコラーゲンゲルおよびコラーゲ
ンシートは、細胞侵入性と生分解性を有し、生体親和性
に優れるだけでなく、高い止血性、薬剤の徐放性、透明
性を有し、水不溶性で乾燥重量の２０〜２００倍の水分
を吸収することができ、補填材、軟膏・湿布の基材、創
傷被覆材、粘着材、止血材、癒着防止材、ドッラグデリ
バリーシステムのキャリアー等として利用することが可
能である。また、本発明の製造方法により上記のコラー
ゲンゲルおよびコラーゲンシートを得ることができる。Industrial Applicability The collagen gel and collagen sheet of the present invention have cell penetration and biodegradability, are excellent in biocompatibility, and have high hemostasis, sustained drug release and transparency. It is water-insoluble and can absorb 20-200 times its dry weight of water. It can be used as a filler, ointment or compress base material, wound dressing material, adhesive material, hemostatic material, anti-adhesion material, drag delivery system carrier, etc. It is possible to use as. Further, the above-mentioned collagen gel and collagen sheet can be obtained by the production method of the present invention.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】アテロコラーゲン溶液に銅イオンとアスコルビ
ン酸を添加して（▲）加熱した場合と、添加せず（●）
に加温した場合の濁度の経時的変化を示す。FIG. 1. Copper ion and ascorbic acid added to atelocollagen solution (（), heated and not added (●)
Shows the change over time in turbidity when heated.

【図２】アテロコラーゲン溶液に添加する銅イオンの濃
度の違いによる濁度の変化を示す。FIG. 2 shows changes in turbidity due to differences in the concentration of copper ions added to the atelocollagen solution.

【図３】アテロコラーゲン溶液に添加する銅イオンの濃
度を変化させて得られたコラーゲンゲルの含水率を示
す。FIG. 3 shows the water content of a collagen gel obtained by changing the concentration of copper ions added to the atelocollagen solution.

【図４】 アテロコラーゲン溶液に添加する銅イオンの
濃度を変化させて得られたコラーゲンゲルの架橋度を示
す。FIG. 4 shows the degree of crosslinking of a collagen gel obtained by changing the concentration of copper ions added to the atelocollagen solution.

【図５】アテロコラーゲン溶液に添加する鉄イオンの濃
度を変化させて得られたコラーゲンゲルの架橋度を示
す。FIG. 5 shows the degree of crosslinking of a collagen gel obtained by changing the concentration of iron ions added to the atelocollagen solution.

【図６】アテロコラーゲン溶液に添加する各種架橋促進
剤の濃度を変化させて得られたコラーゲンゲルの架橋度
を示す。FIG. 6 shows the degree of crosslinking of a collagen gel obtained by changing the concentration of various crosslinking accelerators added to the atelocollagen solution.

【図７】コラーゲンゲルからの薬物（ブドウ糖）の放出
量の経時的変化を示す。FIG. 7 shows a time-dependent change in the amount of drug (glucose) released from a collagen gel.

【図８】添加したヘパリンのコラーゲンゲルへの結合量
を示す。FIG. 8 shows the amount of heparin added to a collagen gel.

【図９】コラーゲンゲルからの薬物（ヘパリン）の放出
量の経時的変化を示す。FIG. 9 shows a time-dependent change in the release amount of a drug (heparin) from a collagen gel.

【図１０】コラーゲンゲルからの薬物（ヘパリン）の血
清中への放出量の経時的変化を示す。FIG. 10 shows a time-dependent change in the amount of drug (heparin) released from a collagen gel into serum.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61L 15/00 - 33/18 A61K 47/00 - 47/48 C08L 89/04 C08H 1/00 ＣＡ／ＢＩＯＳＩＳ／ＭＥＤＬＩＮＥ／Ｅ ＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) A61L 15/00-33/18 A61K 47/00-47/48 C08L 89/04 C08H 1/00 CA / BIOSIS / MEDLINE / E MBASE (STN)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】0.1〜１ｍＭの銅イオンまたは鉄イオンと
0.01〜100ｍＭのアスコルビン酸、トコフェロール類ま
たは過酸化水素から選ばれる架橋促進剤により処理され
たことを特徴とする乾燥重量の２０から200倍の水分を
吸収する水不溶性のコラーゲンゲル。(1) 0.1 to 1 mM copper ion or iron ion
A water-insoluble collagen gel that has been treated with a crosslinking accelerator selected from 0.01 to 100 mM of ascorbic acid, tocopherols or hydrogen peroxide, and absorbs 20 to 200 times its dry weight of water. 【請求項２】請求項１に記載のコラーゲンゲルを乾燥す
ることにより得られるコラーゲンシート。2. A collagen sheet obtained by drying the collagen gel according to claim 1. 【請求項３】コラーゲン溶液中の銅イオンまたは鉄イオ
ン濃度を0.1〜１ｍＭに調整し、アスコルビン酸、トコ
フェロール類または過酸化水素から選ばれる架橋促進剤
の濃度を0.01〜100ｍＭに調整した後、加温しキレート
剤を添加することを特徴とする乾燥重量の２０から200
倍の水分を吸収する水不溶性のコラーゲンゲルの製造方
法。3. The concentration of copper or iron ions in the collagen solution is adjusted to 0.1 to 1 mM, and the concentration of a cross-linking accelerator selected from ascorbic acid, tocopherols or hydrogen peroxide is adjusted to 0.01 to 100 mM. 20 to 200 dry weight, characterized by adding a warming chelating agent
A method for producing a water-insoluble collagen gel that absorbs twice as much water.