JP2873327B2 - Angiotensin converting enzyme inhibitor - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明はアンジオテンシン変
換酵素阻害剤に関し、特に近年増加の傾向にあり対策が
望まれている高血圧症の予防及び治療に有用な医薬品又
は食品に利用できることが期待されるアンジオテンシン
変換酵素阻害剤に関するものである。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an angiotensin converting enzyme inhibitor, and more particularly to angiotensin which is expected to be useful as a pharmaceutical or food useful for the prevention and treatment of hypertension, which has been increasing in recent years and for which measures are desired. The present invention relates to a converting enzyme inhibitor.

【０００２】[0002]

【従来の技術】高血圧症の発症にはレニン−アンジオテ
ンシン系が深いかかわりを有していることがよく知られ
ているが、このレニン−アンジオテンシン系にはアンジ
オテンシン変換酵素（ＥＣ３．４．１５．１、以下ＡＣ
Ｅとも言う）が重要な役割を果たしている。この場合Ａ
ＣＥは、肝で分泌されるアンジオテンシノーゲンが腎で
産生される酵素レニンにより分解されたアンジオテンシ
ンＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉ
ｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ）に対して作用
し、このものをアンジオテンシンＩＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ
−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）
に変換させる。そして、このアンジオテンシンＩＩは血
管壁平滑筋を収縮させて血圧を高め、さらに副腎皮質に
作用してアルドステロンの分泌を促進させるなどの作用
を有する。また、血漿に存在する酵素カリクレインはキ
ニノーゲンと呼ばれる蛋白質を分解し、血管を拡張させ
降圧させるブラジキニンを産生するが、このブラジキニ
ンはＡＣＥの作用により分解され、不活性化されてしま
う。このように、ＡＣＥは一方で昇圧性ペプチド（アン
ジオテンシンＩＩ）を生じさせるとともに、他方で降圧
性ペプチド（ブラジキニン）を分解し、結果として、血
圧を上昇の方向に進める。したがってこの酵素活性を抑
制することによって血圧上昇を防ぐこと（降圧）が可能
である。2. Description of the Related Art It is well known that the onset of hypertension is closely related to the renin-angiotensin system, and this renin-angiotensin system is related to angiotensin converting enzyme (EC 3.4.15.1). , Below AC
E also plays an important role. In this case A
CE is angiotensin I (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Hi) in which angiotensinogen secreted in the liver is degraded by the enzyme renin produced in the kidney.
s-Pro-Phe-His-Leu), which is converted to angiotensin II (Asp-Arg).
-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe)
Is converted to And this angiotensin II has a function of contracting vascular wall smooth muscle to increase blood pressure, and furthermore, acts on the adrenal cortex to promote secretion of aldosterone. In addition, the enzyme kallikrein present in plasma degrades a protein called kininogen to produce bradykinin, which dilates blood vessels and lowers blood pressure. This bradykinin is degraded and inactivated by the action of ACE. Thus, ACE produces, on the one hand, a pressor peptide (angiotensin II) and, on the other hand, breaks down the antihypertensive peptide (bradykinin), and consequently pushes blood pressure upward. Therefore, by suppressing this enzyme activity, it is possible to prevent an increase in blood pressure (lower blood pressure).

【０００３】ＡＣＥ阻害物質としては蛇毒より得られた
数種のペプチド性阻害剤を初めとして、カプトプリル
（Ｄ−２−メチル−３−メルカプトプロパノイル−Ｌ−
プロリン）などの合成物質が多数知られており、このう
ちカプトプリルは経口降圧剤として既に実用に供されて
いる。また、近年、微生物あるいは種々の食品中にもＡ
ＣＥ阻害物質が見出され、降圧剤としての実用化が検討
されている。As ACE inhibitors, there are several peptide inhibitors obtained from snake venom and captopril (D-2-methyl-3-mercaptopropanoyl-L-).
Many synthetic substances such as proline) are known, of which captopril has already been put to practical use as an oral antihypertensive agent. In recent years, microorganisms and various foods
A CE inhibitor has been found, and its practical use as a hypotensive agent is being studied.

【０００４】また、牛乳カゼインのトリプシン加水分解
物由来のＡＣＥ阻害物質を単離し、あるいはさらにペプ
チダーゼで処理し、これを血圧降下剤として用いること
が提案されている（特公昭６０−２３０８５号、同６０
−２３０８６号、同６０−２３０８７号、特開昭６１−
３６２２６号、同６１−３６２２７号）。また最近で
は、魚類タンパク質または大豆タンパク質のバチルス属
細菌由来のセリンプロテアーゼ、バチルス属細菌由来の
金属プロテアーゼまたは植物由来のチオールプロテアー
ゼによる加水分解物を血圧降下剤として用いることが提
案されている（特開昭６２−１６９７３２号）。[0004] It has also been proposed to isolate an ACE inhibitor derived from trypsin hydrolyzate of milk casein or to further treat it with peptidase and use it as a hypotensive agent (Japanese Patent Publication No. 60-23085; 60
No. 23086, No. 60-23087, JP-A-61-1986.
No. 36226, No. 61-36227). Recently, it has been proposed to use a hydrolyzate of a fish protein or a soybean protein with a serine protease derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus, a metal protease derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus, or a thiol protease derived from a plant as a blood pressure lowering agent (Japanese Patent Application Laid-Open (JP-A) no. No. 62-169732).

【０００５】一方、とうもろこしタンパク質はプロラミ
ンを５０〜６０％、グルテリンを３５〜４０％含み、主
成分であるプロラミンはゼイン（ｚｅｉｎ）と呼ばれ
る。ゼインはα、β、γの３種に分けられる（Ｊ．Ｃｅ
ｒｅａｌ Ｓｃｉ．５，１１７（１９８７））。γ−ゼ
イン中にはＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−
Ｐｒｏを基本単位とする繰り返し構造が含まれている
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３（５），
１４９３（１９８５））。On the other hand, corn protein contains 50 to 60% prolamin and 35 to 40% glutelin, and the main component prolamin is called zein. Zein is divided into three types, α, β, and γ (J. Ce).
real Sci. 5 , 117 (1987)). Val-His-Leu-Pro-Pro- in γ-zein
A repeating structure having Pro as a basic unit is included (Nucleic Acids Res. 13 (5),
1493 (1985)).

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】新規有用な血圧降下剤
ひいてはアンジオテンシン変換酵素阻害剤は常に求めら
れている。また医薬品としてのみならず、日常の摂取を
通して高血圧等の種々の症状の予防等を図る機能性食品
も求められる昨今である。従って本発明は優れたアンジ
オテンシン変換酵素阻害作用ならびに血圧降下作用を有
し、安全性が極めて高く、医薬品としてのみならず機能
性食品としても使用可能な特定のオリゴペプチド系アン
ジオテンシン変換酵素阻害剤を提供することを目的とす
る。There is a constant need for new and useful antihypertensive agents and thus angiotensin converting enzyme inhibitors. In addition, not only pharmaceutical products but also functional foods for preventing various symptoms such as hypertension through daily ingestion are required these days. Accordingly, the present invention provides a specific oligopeptide angiotensin converting enzyme inhibitor which has an excellent angiotensin converting enzyme inhibitory action and a blood pressure lowering action, is extremely high in safety, and can be used not only as a pharmaceutical product but also as a functional food. The purpose is to do.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らはＡＣＥ阻害
活性を有する物質を種々検索した結果、安価で最も一般
的な食品用タンパク質であるとうもろこしタンパク質中
のγ−ゼインを特定のプロテアーゼで加水分解して得ら
れる一定のペプチドがアンジオテンシン変換酵素阻害活
性を有すること、及び該ペプチドを用いることによって
上記課題を解決できることを見出した。すなわち本発明
はＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有効成分として含有するア
ンジオテンシン変換酵素阻害剤を提供する。Means for Solving the Problems The present inventors have searched various substances having ACE inhibitory activity and found that γ-zein in corn protein, which is an inexpensive and most common food protein, is hydrolyzed with a specific protease. It has been found that a certain peptide obtained by decomposition has angiotensin converting enzyme inhibitory activity, and that the above problem can be solved by using the peptide. That is, the present invention provides an angiotensin converting enzyme inhibitor containing Leu-Pro-Pro as an active ingredient.

【０００８】[0008]

【発明の実施の形態】本発明に使用するγ−ゼインとし
てはとうもろこし、またはコーンスターチの製造過程で
得られるとうもろこしタンパク質から分離したゼインタ
ンパク質から、常法に従って分離することができる（例
えばＰｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．，８０，６２３（１
９８６））。また参考例１にγ−ゼインの調製例を示
す。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The γ-zein used in the present invention can be separated from corn protein obtained from corn or corn protein obtained in the process of producing corn starch by a conventional method (for example, Plant Physiol., Ltd.). 80 , 623 (1
986)). Reference Example 1 shows a preparation example of γ-zein.

【０００９】本発明における加水分解は次の工程によっ
て行われる。 ａ） γ−ゼインはまずサーモライシン加水分解に付し
てＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを
生成させる。すなわちまずγ−ゼインを水酸化ナトリウ
ム水溶液等のアルカリ溶液に溶解し、限外濾過により可
溶化した低分子夾雑物を除去する。ついで必要に応じｐ
Ｈ１０〜１２、温度８０〜１００℃で５分〜１時間処理
する等してγ−ゼインを変性させ、サーモライシンを働
きやすくする。この際低分子化した画分は限外濾過によ
り除く。The hydrolysis in the present invention is performed by the following steps. a) γ-zein is first subjected to thermolysin hydrolysis to produce Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro. That is, first, γ-zein is dissolved in an alkaline solution such as an aqueous sodium hydroxide solution, and ultrafiltration removes solubilized low molecular impurities. Then p as needed
Γ-zein is denatured by, for example, treatment at H10 to 12 and a temperature of 80 to 100 ° C for 5 minutes to 1 hour to make thermolysin easier to work. At this time, the low molecular weight fraction is removed by ultrafiltration.

【００１０】ついでｐＨを塩酸等で中性付近に調整し、
Ｃａ含有緩衝液でｐＨを６〜９に調整し、温度を３０〜
８０℃に保ち、サーモライシンを加え１〜４０時間酵素
反応を行わせる。緩衝液としては０．００５〜０．０１
Ｍ ＣａＣｌ含有０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８
〜８．５）等が好適に用いられる。サーモライシンの使
用量は基質１００重量部に対し０．１〜１０重量部が適
当である。反応は例えば塩酸等の酸を添加してｐＨ３以
下として酵素を失活させることにより終了させる。Then, the pH is adjusted to around neutral with hydrochloric acid or the like,
The pH is adjusted to 6 to 9 with a Ca-containing buffer, and the temperature is adjusted to 30 to
While maintaining at 80 ° C., thermolysin is added and the enzyme reaction is performed for 1 to 40 hours. 0.005 to 0.01 as buffer
M CaCl-containing 0.05M Tris-HCl buffer (pH 8
To 8.5) and the like are preferably used. The appropriate amount of thermolysin used is 0.1 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the substrate. The reaction is terminated by, for example, adding an acid such as hydrochloric acid to inactivate the enzyme to a pH of 3 or less.

【００１１】反応後酵素液を限外濾過に付して通過する
低分子含有濾液を回収する。水酸化ナトリウム等のアル
カリ水溶液で濾液を中和後、濃縮し、カラムクロマトグ
ラフィー、例えばセファデックスＬＨ−２０カラムクロ
マトグラフィーに付し、各画分のＨＰＬＣによる溶出パ
ターンを合成Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏのそれと比較することにより、Ｖａｌ−Ｈｉｓ
−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ含有溶液を得る。こ
のものはカラムクロマトグラフィー、例えばＳＰ−トヨ
パール６５０Ｓ陽イオン交換クロマトグラフィー、逆相
系ＨＰＬＣなどによりさらに精製することができる。After the reaction, the enzyme solution is subjected to ultrafiltration to recover a filtrate containing low molecules passing therethrough. After neutralizing the filtrate with an aqueous alkali solution such as sodium hydroxide, the filtrate is concentrated and subjected to column chromatography, for example, Sephadex LH-20 column chromatography. The elution pattern of each fraction by HPLC is synthesized Val-His-Leu- Pro-Pro
Val-His by comparison with that of Pro
-A solution containing Leu-Pro-Pro-Pro is obtained. This product can be further purified by column chromatography, for example, SP-Toyopearl 650S cation exchange chromatography, reverse phase HPLC and the like.

【００１２】ｂ） 次にＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏをロイシンアミノペプチダーゼで加
水分解してＨｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏま
たはＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを生成させる。こ
の酵素反応は通常、ｐＨ６〜９の緩衝液中、３０〜６０
℃で１〜２４時間行う。緩衝液としては０．０５ＭＭｇ
Ｃｌ含有０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．６）等を使用す
る。ロイシンアミノペプチダーゼの使用量は基質１００
重量部に対し、０．１〜１０重量部が適当である。B) Next, Val-His-Leu-Pr
o-Pro-Pro is hydrolyzed with leucine aminopeptidase to produce His-Leu-Pro-Pro-Pro or Leu-Pro-Pro-Pro. This enzymatic reaction is usually carried out in a buffer having a pH of 6 to 9 for 30 to 60.
C. for 1 to 24 hours. 0.05M Mg as buffer
0.1M Tris-HCl (pH 8.6) containing Cl is used. The amount of leucine aminopeptidase used is 100 substrates.
The suitable amount is 0.1 to 10 parts by weight with respect to parts by weight.

【００１３】反応は例えば１００℃で５分間加熱するな
どして終了させる。反応終了液から目的物の単離精製は
カラムクロマトグラフィー、例えば逆相系ＨＰＬＣなど
によって行うことができる。目的物質の追跡はａ）の場
合と同様合成ペプチドのＨＰＬＣ溶出パターンの比較に
よって行うことができる。The reaction is terminated, for example, by heating at 100 ° C. for 5 minutes. The target compound can be isolated and purified from the reaction completed solution by column chromatography, for example, reverse phase HPLC. The target substance can be tracked by comparing the HPLC elution patterns of the synthetic peptides as in the case of a).

【００１４】ｃ） 次にＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ、Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−ＰｒｏまたはＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏをカル
ボキシペプチダーゼＣで加水分解するか、温和な酸加水
分解に付すことにより各Ｃ末端Ｐｒｏを１つ外す。この
酵素反応は通常ｐＨ４〜７の緩衝液中３０〜６０℃で１
〜２４時間行う。緩衝液としては０．１Ｍクエン酸緩衝
液等を使用する。カルボキシペプチダーゼＣの使用量は
基質１００重量部に対し０．１〜１０重量部が適当であ
る。反応は例えば１００℃で５分間加熱する等して終了
させる。C) Next, Val-His-Leu-Pr
o-Pro-Pro, His-Leu-Pro-Pro
-Remove one of each C-terminal Pro by hydrolyzing Pro or Leu-Pro-Pro-Pro with carboxypeptidase C or subject to mild acid hydrolysis. This enzymatic reaction is usually carried out in a buffer at pH 4-7 at 30-60 ° C.
Perform for ~ 24 hours. As the buffer, a 0.1 M citrate buffer or the like is used. The amount of carboxypeptidase C used is suitably 0.1 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the substrate. The reaction is terminated, for example, by heating at 100 ° C. for 5 minutes.

【００１５】酸加水分解は通常、濃度０．１〜６規定の
塩酸等の酸を用い、温度８０〜１２０℃で５〜１２０分
行う。反応は水酸化ナトリウム水溶液等で中和すること
により終了させる。いずれの場合も反応終了液から目的
物の単離精製はカラムクロマトグラフィー、例えば逆相
系ＨＰＬＣなどによって行うことができる。目的物質の
追跡はａ）の場合と同様合成ペプチドのＨＰＬＣ溶出パ
ターンの比較によって行うことができる。なお、上記
ｂ）の工程は必要に応じ行う。またｂ）とｃ）の工程を
共に行う場合いずれを先に行っても良い。The acid hydrolysis is usually carried out using an acid such as hydrochloric acid having a concentration of 0.1 to 6 N at a temperature of 80 to 120 ° C. for 5 to 120 minutes. The reaction is terminated by neutralization with an aqueous sodium hydroxide solution or the like. In any case, the target compound can be isolated and purified from the reaction-terminated liquid by column chromatography, for example, reverse phase HPLC. The target substance can be tracked by comparing the HPLC elution patterns of the synthetic peptides as in the case of a). Step b) is performed as necessary. In the case where the steps b) and c) are performed together, any one of the steps may be performed first.

【００１６】上記によって得られるアミノ酸重合度３〜
５のペプチドはＡＣＥ阻害活性を示す。これらのペプチ
ドをＡＣＥ阻害剤として使用する場合、これらのペプチ
ドは単独で含有されていても良く、また任意の割合の混
合物として含有されていても良く、さらに加水分解物由
来の他のペプチド、アミノ酸をマイナー成分として含有
していても良い。The degree of polymerization of the amino acid obtained as described above is 3 to
5 show ACE inhibitory activity. When these peptides are used as an ACE inhibitor, these peptides may be contained alone, or may be contained as a mixture in any ratio, and further, other peptides derived from the hydrolyzate, amino acids May be contained as a minor component.

【００１７】当該ペプチドはそのまま、または通常少な
くとも１つの製剤補助剤と製剤組成物にして使用する。
本発明のペプチドは非経口的（すなわち、静脈注射、直
腸投与等）または経口的にヒトをはじめとする哺乳類に
投与し、各投与方法に適した形態に製剤することができ
る。The peptide is used as it is or usually in the form of a pharmaceutical composition with at least one pharmaceutical auxiliary.
The peptide of the present invention can be administered parenterally (that is, intravenous injection, rectal administration, etc.) or orally to mammals including humans, and can be formulated into a form suitable for each administration method.

【００１８】注射剤としての製剤形態は、通常滅菌水水
溶液を包含する。上記形態の製剤はまた緩衝剤・ｐＨ調
節剤（リン酸水素ナトリウム、クエン酸等）、等張化剤
（塩化ナトリウム、グルコース等）、保存剤（パラオキ
シ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル
等）等の水以外の他の製薬補助剤を含有することができ
る。該製剤は細菌保持フィルターを通す濾過、組成物へ
の殺菌剤の混入、組成物の照射や加熱によって滅菌する
ことができる。該製薬はまた殺菌固体組成物として製造
し、用時滅菌水等に溶解して使用することもできる。The preparation form as an injection usually includes a sterile aqueous solution. Preparations in the above form also include buffering agents / pH regulators (sodium hydrogen phosphate, citric acid, etc.), tonicity agents (sodium chloride, glucose, etc.), preservatives (methyl parahydroxybenzoate, propyl p-hydroxybenzoate, etc. ) And other pharmaceutical auxiliaries other than water. The preparation can be sterilized by filtration through a bacteria-retaining filter, by mixing a bactericide into the composition, or by irradiating or heating the composition. The pharmaceutical can also be manufactured as a sterilized solid composition and used after dissolving in sterilized water or the like at the time of use.

【００１９】経口投与剤は胃腸器官による吸収に適した
形に製剤する。錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、粉
末剤は常用の製剤補助剤、例えば結合剤（シロップ、ア
ラビアゴム、ゼラチン、ソルビット、トラガカント、ポ
リビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース
等）、賦形剤（ラクトース、シュガー、コーンスター
チ、リン酸カルシウム、ソルビット、グリシン等）、滑
沢剤（ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレ
ングリコール、シリカ等）、崩壊剤（ポテトスターチ、
カルボキシメチルセルロース等）、湿潤剤（ラウリル硫
酸ナトリウム等）を包含することができる。錠剤は常法
によりコーティングすることができる。経口液剤は水溶
液等にしたり、ドライプロダクトにすることができる。
そのような経口液剤は常用の添加剤例えば保存剤（ｐ−
ヒドロキシ安息香酸メチルもしくはプロピル、ソルビン
酸等）を包含していても良い。[0019] Oral formulations are formulated in a form suitable for absorption by the gastrointestinal tract. Tablets, capsules, granules, fine granules and powders are commonly used as formulation aids such as binders (syrup, gum arabic, gelatin, sorbit, tragacanth, polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylcellulose, etc.), excipients (lactose) , Sugar, corn starch, calcium phosphate, sorbite, glycine, etc.), lubricants (magnesium stearate, talc, polyethylene glycol, silica, etc.), disintegrants (potato starch,
Carboxymethylcellulose) and wetting agents (such as sodium lauryl sulfate). Tablets can be coated by conventional methods. The oral solution can be made into an aqueous solution or the like or a dry product.
Such an oral solution is prepared by using a conventional additive such as a preservative (p-
Methyl or propyl hydroxybenzoate, sorbic acid, etc.).

【００２０】本発明のＡＣＥ阻害剤中の本ペプチドの量
は種々変えることができるが、通常１〜１００％（ｗ／
ｗ）が適当である。本ＡＣＥ阻害剤の投与量は有効成分
として０．５〜５００ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙが適当であ
る。なお、本発明のペプチドの急性毒性はいずれもＬＤ
（ラット、経口投与）＞５ｇ／ｋｇである。Although the amount of the present peptide in the ACE inhibitor of the present invention can be variously changed, it is usually 1 to 100% (w /
w) is appropriate. The dose of the present ACE inhibitor is suitably 0.5 to 500 mg / kg / day as an active ingredient. The acute toxicity of any of the peptides of the present invention was LD
(Rat, oral administration)> 5 g / kg.

【００２１】また、本発明のペプチドは多量に摂取して
も生体に悪影響を与えない利点を有することから、その
まま、または種々の栄養分等を加えて、もしくは飲食品
中に含有せしめて血圧降下作用、高血圧予防の機能を持
たせた機能性食品、健康食品として食しても良い。すな
わち、例えば各種ビタミン類、ミネラル類等の栄養分を
加えて、例えば栄養ドリンク、豆乳、スープ等の液状の
食品や各種形状の固形食品、さらには粉末状としてその
ままあるいは各種食品へ添加して用いることもできる。
かかる機能性食品、健康食品としての本発明のＡＣＥ阻
害剤中の本ペプチドの含有量、及び摂取量は上記製薬に
おけると同様で良い。The peptide of the present invention has an advantage that it does not adversely affect the living body even when ingested in a large amount. Therefore, the peptide has a blood pressure lowering effect as it is, or it is added to various nutrients or the like, or contained in food or drink. It may be eaten as a functional food or health food having a function of preventing hypertension. That is, for example, nutrients such as various vitamins and minerals are added and used, for example, liquid foods such as nutritional drinks, soy milk, soup and solid foods of various shapes, and further used as a powder or as it is or added to various foods. Can also.
The content and intake of the present peptide in the ACE inhibitor of the present invention as such functional foods and health foods may be the same as in the above-mentioned pharmaceuticals.

【００２２】[0022]

【実施例】次に本発明を実施例により説明する。実施例
中、％は重量％を示す。実施例１ 各オリゴペプチドの調製とＡＣＥ阻害活性 ａ） Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒ
ｏの調製 γ−ゼイン０．５ｇを蒸留水２５ｍｌに分散させ、１Ｎ
ＮａＯＨでｐＨ１２に調整しγ−ゼインを溶解させ
た。ついで限外濾過膜としてアミコン社ＰＭ−１０（分
画分子量１０，０００）を用いる限外濾過に付し、可溶
化した低分子夾雑物を除去した。内液にｐＨ１２のＮａ
ＯＨを加え全容２５ｍｌとし、１００℃で３０分加熱し
γ−ゼインを変性させた。この処理で低分子化した画分
を除去するため再度上記と同じ限外濾過に付し、内液に
蒸留水を加え全容２５ｍｌとし、さらに１Ｎ ＨＣｌで
中性にした。Next, the present invention will be described with reference to examples. In Examples,% indicates% by weight. Example 1 Preparation of each oligopeptide and ACE inhibitory activity a) Val-His-Leu-Pro-Pro-Pr
Preparation of o 0.5 g of γ-zein was dispersed in 25 ml of distilled water, and 1N
The pH was adjusted to 12 with NaOH to dissolve γ-zein. Then, ultrafiltration using Amicon PM-10 (fraction molecular weight: 10,000) as an ultrafiltration membrane was performed to remove solubilized low molecular impurities. PH 12 Na in the internal solution
OH was added to make the total volume 25 ml, and the mixture was heated at 100 ° C. for 30 minutes to denature γ-zein. In order to remove the fraction degraded by this treatment, the filtrate was again subjected to the same ultrafiltration as described above.

【００２３】全容に対し０．２５容の０．０５Ｍ Ｃａ
Ｃｌ含有０．２５ＭトリスＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）
を加え、３７℃に保った後、サーモライシン（シグマ
社）１８ｍｇを加えた。４０時間後、１Ｎ ＨＣｌでｐ
Ｈ１．７に調整して反応を停止させ、前記と同じ限外濾
過に付して通過する低分子を回収した。これを１Ｎ Ｎ
ａＯＨで中和後、濃縮した濃縮液をセファデックスＬＨ
−２０のカラムに添加し蒸留水で溶出させた（溶出条
件：カラム高さ７０ｃｍ、内径１．６ｃｍ、試料添加量
２ｍｌ、流速３３ｍｌ／ｈｒ）。0.25 volume of 0.05M Ca
0.25 M Tris HCl buffer containing Cl (pH 8.5)
And kept at 37 ° C., followed by addition of 18 mg of thermolysin (Sigma). 40 hours later, p with 1N HCl
The reaction was stopped by adjusting to H1.7 and subjected to the same ultrafiltration as described above to recover passing low molecules. This is 1NN
After neutralization with aOH, the concentrated solution was concentrated and applied to Sephadex LH.
The mixture was added to a -20 column and eluted with distilled water (elution conditions: column height 70 cm, inner diameter 1.6 cm, sample addition amount 2 ml, flow rate 33 ml / hr).

【００２４】各画分の少量を用いてＨＰＬＣによる溶出
パターンを調べ、合成Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが示す溶出位置と同位置のピークを持
つ画分を回収した（ＨＰＬＣの溶出条件：カラム ウォ
ーターズ社Ｒａｄｉａｌ ＰＡＫ Ｃ−８、１０μｍ、
試料添加量５μｌ、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出リン酸緩
衝液（１０ｍＭ ＫＨＰＯ，５０ｍＭ ＮａＳＯ，ｐＨ
３．０）：アセトニトリル＝２：３、検出ＵＶ２１０ｎ
ｍ）。The elution pattern by HPLC was examined using a small amount of each fraction, and the synthesized Val-His-Leu-Pro
-A fraction having a peak at the same position as the elution position shown by Pro-Pro was collected (HPLC elution conditions: Column Waters Radial PAK C-8, 10 µm,
Sample addition volume 5 μl, flow rate 1 ml / min, elution phosphate buffer (10 mM KHPO, 50 mM NaSO, pH
3.0): acetonitrile = 2: 3, detection UV210n
m).

【００２５】この画分を５ｍＭ緩衝液（ｐＨ４．０）で
平衡化したＳＰ−トヨパール６５０Ｓカラムに添加し、
０〜０．３Ｍ ＮａＣｌの直線濃度勾配で溶出し、ＨＰ
ＬＣにて合成Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏと同位置に溶出されるピークを持つ画分を回収
した（ＳＰ−トヨパール溶出条件：カラム高さ２０ｃ
ｍ、内径１．６ｃｍ、流速１００ｍｌ／ｈｒ、溶出５ｍ
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を含む０〜０．３Ｍ Ｎａ
Ｃｌ。ＨＰＬＣの溶出条件は前記と同じ）。This fraction was added to an SP-Toyopearl 650S column equilibrated with 5 mM buffer (pH 4.0),
Elution was performed with a linear gradient of 0 to 0.3 M NaCl.
Val-His-Leu-Pro-Pro synthesized by LC
-A fraction having a peak eluted at the same position as Pro was collected (SP-Toyopearl elution condition: column height 20c)
m, inner diameter 1.6cm, flow rate 100ml / hr, elution 5m
0-0.3 M Na containing M acetate buffer (pH 4.0)
Cl. HPLC elution conditions are the same as described above).

【００２６】回収した画分を濃縮後、ＨＰＬＣに付して
合成Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
と同位置のピークのみを分取し、ｐＨ２のＨＣｌで洗浄
した逆相シリカゲルカラムＳｅｐＰＡＫ Ｃ−１８（ウ
ォーターズ社）に吸着させ、ｐＨ２のＨＣｌで混在する
塩を除去した後、メタノールで溶出させ、アミノ酸分析
を行った（分取時のＨＰＬＣ溶出条件：試料添加量のみ
２５μｌで他は最初の場合の条件と同じ）。上記でアミ
ノ酸分析は試料を６Ｎ ＨＣｌに溶解し、真空下１１０
℃で２４時間加熱後アミノ酸分析計により行った。The collected fractions were concentrated and subjected to HPLC to synthesize Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro.
Only the peak at the same position as above was collected, adsorbed on a reverse-phase silica gel column SepPAK C-18 (Waters) washed with HCl at pH 2 and mixed salts were removed with HCl at pH 2, and then eluted with methanol. Amino acid analysis was performed (HPLC elution conditions at the time of fractionation: only 25 μl of sample was added, and the other conditions were the same as in the first case). For amino acid analysis above, the sample was dissolved in 6N HCl,
After heating at 24 ° C. for 24 hours, the measurement was performed with an amino acid analyzer.

【００２７】この結果Ｌｅｕを１としたモル比がＶａｌ
１．３、Ｈｉｓ １．２、Ｌｅｕ１、Ｐｒｏ ３．１
となり、Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏが回収できた。また、質量分析の結果は６５９（Ｍ
＋１）であり、上記ペプチドの予想分子量と一致した。As a result, the molar ratio, where Leu was 1, was Val
1.3, His 1.2, Leu1, Pro 3.1
And Val-His-Leu-Pro-Pro-P
ro could be collected. The result of mass spectrometry was 659 (M
+1), consistent with the expected molecular weight of the peptide.

【００２８】ｂ）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの調
製 ロイシンアミノペプチダーゼ（ベーリンガーマンハイム
山之内社）（５ｍｇ／ｍｌ液状）を０．０５Ｍ ＭｇＣ
ｌ含有０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．６）８００μｌに
溶解し酵素液とした。３００μＭ Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌ
ｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ ５０μｌと酵素液２０
０μｌを混合し、３７℃で２３時間反応させた。反応
後、反応液よりＨＰＬＣで合成Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｒｏと同位置に溶出されるピークを回収しアミノ酸
分析を行った（ＨＰＬＣ溶出条件：使用するリン酸緩衝
液のｐＨを２．５としたこと、及び試料添加量を１０μ
ｌとした以外は最初の場合の条件と同じ）。この結果Ｌ
ｅｕを１としたモル比がＶａｌ ０．１６、Ｌｅｕ
１、Ｈｉｓ０．１９、Ｐｒｏ ２．５１となり、Ｌｅｕ
−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏが回収できた。B) Preparation of Leu-Pro-Pro-Pro Leucine aminopeptidase (Boehringer Mannheim Yamanouchi) (5 mg / ml liquid) was added to 0.05M MgC
The resultant was dissolved in 800 μl of 0.1 M Tris-HCl (pH 8.6) containing 1 l to prepare an enzyme solution. 300 μM Val-His-L
eu-Pro-Pro-Pro 50 μl and enzyme solution 20
0 μl was mixed and reacted at 37 ° C. for 23 hours. After the reaction, the reaction solution was synthesized by HPLC from Leu-Pro-Pro.
A peak eluted at the same position as that of Pro was collected and subjected to amino acid analysis (HPLC elution conditions: pH of the phosphate buffer used was set to 2.5, and the amount of sample added was 10 μm).
The same as the condition in the first case except that it was 1.) As a result L
The molar ratio where eu is 1 is Val 0.16, Leu
1, His 0.19, Pro 2.51, Leu
-Pro-Pro-Pro could be recovered.

【００２９】ｃ）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの調製 ６．３ｍＭ Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ ２００
μｌと１２Ｎ ＨＣｌ２００μｌを混合し、１００℃で
１０分加水分解反応に服せしめた。ついでＨＰＬＣによ
る溶出で合成Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏと同位置のピーク
（３．１８ｍｍ）を持つ画分が回収できた。（溶出条
件：カラム メルク社 Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ ＲＰ−
ＳｅｌｅｃｔＢ ５μｍ、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、溶出
リン酸緩衝液（ｐＨ２．５）：アセトニトリル＝５：
１、検出ＵＶ２１０ｎｍ）。C) Preparation of Leu-Pro-Pro 6.3 mM Leu-Pro-Pro-Pro 200
μl and 200 μl of 12N HCl were mixed and subjected to a hydrolysis reaction at 100 ° C. for 10 minutes. Subsequently, a fraction having a peak (3.18 mm) at the same position as that of the synthetic Leu-Pro-Pro was recovered by elution by HPLC. (Elution conditions: Column Merck Lichrosorb RP-
Select B 5 μm, flow rate 1 ml / min, elution
Phosphate buffer (pH 2.5): acetonitrile = 5:
1, detection UV 210 nm).

【００３０】ｄ）Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐ
ｒｏの調製 Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏより
上記ｃ）と同様にして得た。D) Val-His-Leu-Pro-P
Preparation of ro Obtained from Val-His-Leu-Pro-Pro-Pro in the same manner as in c) above.

【００３１】ｅ）ＡＣＥ阻害活性の測定 以上のようにして得た各ペプチドのＡＣＥ阻害活性を以
下のごとく測定した。すなわちまず、５ｇのラビットラ
ングアセトンパウダーを５０ｍｌの０．１Ｍホウ酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ８．３）に溶かし、４０，０００
Ｇ、４０分の条件下で遠心処理し、その上澄液をさらに
上記緩衝液で５倍に希釈して、アンジオテンシン変換酵
素液を得た。E) Measurement of ACE inhibitory activity The ACE inhibitory activity of each peptide obtained as described above was measured as follows. That is, first, 5 g of rabbit lang acetone powder was dissolved in 50 ml of 0.1 M sodium borate buffer (pH 8.3), and 40,000 was dissolved.
G, centrifugation under the conditions of 40 minutes, and the supernatant was further diluted 5-fold with the above buffer to obtain an angiotensin converting enzyme solution.

【００３２】各ペプチド溶液を試験管に０．０３ｍｌ入
れ、これに基質として、０．２５ｍｌのヒプリルヒスチ
ジルロイシン（最終濃度５ｍＭ、ＮａＣｌ ３００ｍＭ
含む）を添加し、ついで上記アンジオテンシン変換酵素
液０．１ｍｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。そ
の後、１Ｎ塩酸０．２５ｍｌを添加して反応を停止させ
た後、１．５ｍｌの酢酸エチルを加え、酢酸エチル中に
抽出されたヒプリル酸の２２８ｎｍでの吸収値を測定
し、これを酵素活性とした。なお、この条件で本発明阻
害剤を含まない場合の２２８ｎｍの吸収値はほぼ０．３
５であった。このような実験を複数行い、阻害率を次の
式より算出した。0.03 ml of each peptide solution was placed in a test tube, and 0.25 ml of hypril histidylleucine (final concentration 5 mM, NaCl 300 mM) was used as a substrate.
Was added, and then 0.1 ml of the above-mentioned angiotensin converting enzyme solution was added, followed by reaction at 37 ° C. for 30 minutes. Thereafter, 0.25 ml of 1N hydrochloric acid was added to stop the reaction, and 1.5 ml of ethyl acetate was added. The absorption value of hyprilic acid extracted in ethyl acetate was measured at 228 nm, and the enzyme activity was measured. And Under the above conditions, the absorption value at 228 nm when the inhibitor of the present invention was not contained was approximately 0.3.
It was 5. A plurality of such experiments were performed, and the inhibition rate was calculated by the following equation.

【００３３】[0033]

【式１】 (Equation 1)

【００３４】Ａ：阻害剤を含まない場合の２２８ｎｍ吸
収値 Ｂ：阻害剤添加の場合の２２８ｎｍ吸収値 そして、阻害率５０％のときの阻害剤濃度Ｉを求めた。
結果を表１に示す。A: 228 nm absorption value without an inhibitor B: 228 nm absorption value with an inhibitor added The inhibitor concentration I at an inhibition rate of 50% was determined.
Table 1 shows the results.

【００３５】[0035]

【表１】 [Table 1]

【００３６】実施例２ Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏの血圧
降下作用 体重２００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄性ラット（日本ラット
（株）、１群５匹）をウレタン１．５ｇ／ｋｇ腹腔内投
与により麻酔し、常法に従って総頸動脈圧をトランスデ
ューサー（ＳＣＫ−５９０、日本光電（株））を介して
連続的に記録した。下腿静脈より、生理食塩水に溶解し
たＬｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを投与し、その５、１５、２
５および３５分後にアンジオテンシンＩ（ヒト配列、シ
グマ社）１００ｎｇ／ｋｇを繰り返し投与して、前後の
平均血圧の変化を測定した。対照としては、生理食塩水
を投与したものを用いた。結果を表２に示す。本ペプチ
ドは投与５分後のアンジオテンシンＩによる昇圧を効果
的に抑制し、その作用は３５分後にもなお持続してい
た。 Example 2 Blood pressure lowering effect of Leu-Pro-Pro Wistar male rats weighing 200 g (5 rats per group) were anesthetized by intraperitoneal administration of urethane 1.5 g / kg. , The common carotid artery pressure was continuously recorded via a transducer (SCK-590, Nihon Kohden). Leu-Pro-Pro dissolved in physiological saline was administered from the lower leg vein.
Five and 35 minutes later, 100 ng / kg of angiotensin I (human sequence, Sigma) was repeatedly administered, and the change in mean blood pressure before and after was measured. As a control, one to which physiological saline was administered was used. Table 2 shows the results. The peptide effectively suppressed the angiotensin I-induced hypertension 5 minutes after administration, and its action was continued even after 35 minutes.

【００３７】[0037]

【表２】 [Table 2]

【００３８】実施例３ 静脈注射剤 Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを２０〜１００倍（容積／重
量）の滅菌生理食塩水に溶解し、無菌的にフィルター
（孔径０．４５μｍ）で濾過した濾液を注射剤とする。 Example 3 Intravenous Injection Leu-Pro-Pro was dissolved in a 20 to 100-fold (volume / weight) sterile physiological saline solution, and aseptically filtered through a filter (pore size: 0.45 μm). And

【００３９】実施例４ 錠剤 Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ ７部 ヒドロキシプロピルセルロース １部 ラクトース １０．９部 ポテトスターチ １部 ステアリン酸マグネシウム ０．１部 ヒドロキシプロピルセルロース１部を含む６０％エタノ
ール水溶液２０部を調製し、本ペプチド７部およびラク
トース１０．９部を加えて充分に混練した後、減圧下で
乾燥し、得られた乾燥物にポテトスターチ１部およびス
テアリン酸マグネシウム０．１部を加えて混和し、打錠
機により製錠する。 Example 4 Tablets Leu-Pro-Pro 7 parts Hydroxypropyl cellulose 1 part Lactose 10.9 parts Potato starch 1 part Magnesium stearate 0.1 part Prepare 20 parts of a 60% ethanol aqueous solution containing 1 part of hydroxypropyl cellulose. Then, 7 parts of the present peptide and 10.9 parts of lactose were added, and the mixture was sufficiently kneaded. The mixture was dried under reduced pressure, and 1 part of potato starch and 0.1 part of magnesium stearate were added to the obtained dried product and mixed. And tablet making with a tableting machine.

【００４０】参考例１ γ−ゼインの調製 Ｅｓｅｎの方法（Ｊ．Ｃｅｒｅａｌ Ｓｃｉ．５，１１
７（１９８７））に準じて行った。粉砕とうもろこし
（普通種デントコーン）１００ｇに１％ ２−メルカプ
トエタノールを含む６０％イソプロピルアルコール水５
倍量を加え、６０℃で２時間攪拌することにより全ゼイ
ン画分を抽出した。混合物を３，０００Ｇで１０分遠心
分離し、上清に等容の蒸留水及び０．０２容の３Ｍ酢酸
ナトリウム水溶液を加え、少量の酢酸でｐＨ６に合わせ
４℃で一晩静置してαおよびβ−ゼインを沈殿させた。
ついで３，０００Ｇで１０分遠心分離し、上清を凍結乾
燥し、乾燥物を少量の蒸留水に分散させ、透析チューブ
を用いて蒸留水に対して透析し、ついで凍結乾燥して、
淡黄色粉末としてγ−ゼイン０．４ｇを得た。 Reference Example 1 Preparation of γ-zein The method of Esen (J. Cereal Sci. 5 , 11)
7 (1987)). 60% isopropyl alcohol water containing 1% 2-mercaptoethanol in 100 g of ground corn (normal dent corn)
A double volume was added, and the whole zein fraction was extracted by stirring at 60 ° C. for 2 hours. The mixture was centrifuged at 3,000 G for 10 minutes, an equal volume of distilled water and 0.02 volume of 3M aqueous sodium acetate solution were added to the supernatant, adjusted to pH 6 with a small amount of acetic acid, and allowed to stand at 4 ° C. overnight, and α And β-zein were precipitated.
Then, the mixture was centrifuged at 3,000 G for 10 minutes, the supernatant was freeze-dried, the dried substance was dispersed in a small amount of distilled water, dialyzed against distilled water using a dialysis tube, and then freeze-dried.
0.4 g of γ-zein was obtained as a pale yellow powder.

【００４１】[0041]

【発明の効果】本発明によれば優れたＡＣＥ阻害作用な
らびに血圧降下作用を有するＡＣＥ阻害剤が提供され
る。本発明のＡＣＥ阻害剤は食品タンパク質由来のため
大量に摂取しても極めて安全性が高く、従って副作用を
示すこともない。According to the present invention, there is provided an ACE inhibitor having an excellent ACE inhibitory action and an antihypertensive action. Since the ACE inhibitor of the present invention is derived from food proteins, it is extremely safe even when ingested in large amounts, and therefore does not show any side effects.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/06 Ａ６１Ｋ 37/18 (72)発明者 冨塚 登 茨城県つくば市東１丁目１番３号工業技 術院微生物工業技術研究所内 (72)発明者 三吉 新介 千葉県船橋市日の出２丁目20番２号昭産 日の出寮 (72)発明者 福井 史生 千葉県成田市中台１丁目２番117号 審査官 田村 聖子 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 38/55 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code FI C12P 21/06 A61K 37/18 (72) Inventor Noboru Tomizuka 1-3-1 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Pref. 72) Inventor Shinsuke Miyoshi 2-20-2, Hinode, Funabashi-shi, Chiba Pref.Shinsan Ryo (72) Inventor Fumio Fukui 1-2-117, Nakadai, Narita-shi, Chiba Examiner Seiko Tamura (58) Field (Int. Cl. ⁶ , DB name) A61K 38/55 CA (STN) REGISTRY (STN)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏを有効成分とし
て含有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。1. An angiotensin converting enzyme inhibitor comprising Leu-Pro-Pro as an active ingredient.