JP3313083B2 - DNA coding for novel fusion protein and method for producing useful polypeptide via its expression - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、新規な融合蛋白質
をコードするDNA、その発現を介する、医薬、研究分野
およびその他の産業で使用し得る生物学的活性を有する
有用ポリペプチドの製造への該DNAの使用に関する。The present invention relates to a DNA encoding a novel fusion protein and the production of a useful polypeptide having a biological activity which can be used in medicine, research fields and other industries through its expression. It relates to the use of the DNA.

【０００２】[0002]

【従来の技術】医薬品として用いられるホルモンや生理
活性物質、診断用酵素、産業用酵素、研究用酵素などポ
リペプチドと称される物質はかつては生物体から抽出す
るのが定法であったが、低価格で純粋な物質を大量に取
得するのが困難であった。近年、遺伝子組換え技術によ
り微生物、動物、植物などの各種の生物からの細胞を使
用して純度の高い遺伝子組換え蛋白質またはポリペプチ
ドが低価格で大量に生産できるようになった。しかしな
がら、低価格で大量生産という意味では必ずしも完成の
域に到達しているとは言えず、更なる技術開発が行われ
ている。また、開発された大量生産系が遺伝子組換え技
術による全ての蛋白質またはポリペプチドの生産を可能
にしているわけではなく、個々の蛋白質に応じた生産系
が開発されているのが現状である。2. Description of the Related Art Conventionally, substances called polypeptides such as hormones, physiologically active substances, diagnostic enzymes, industrial enzymes, and research enzymes used as pharmaceuticals have been conventionally extracted from living organisms. It was difficult to obtain large quantities of pure substances at low prices. In recent years, the use of cells from various organisms such as microorganisms, animals, plants, and the like has made it possible to produce high-purity recombinant proteins or polypeptides in large quantities at low prices using genetic recombination techniques. However, in terms of mass production at a low price, it cannot be said that it has reached the level of completion, and further technological development is being carried out. Also, the developed mass production system does not always enable production of all proteins or polypeptides by genetic recombination technology, and at present, production systems corresponding to individual proteins are being developed.

【０００３】バチルス・ブレビス（Bacillusbrevis）を
用いた遺伝子組換え蛋白質の発現系では、同微生物の細
胞壁蛋白質（CWP）のシグナルペプチドの直後に外来蛋
白質を融合させて発現させると、外来蛋白質はCWPシグ
ナルペプチドから切り離されて天然型と同一のものが培
地中に分泌生産される（特許第2082727号、特開昭62−2
01583号公報、Yamagata, H.ら, J. Bacteriol. 169, 12
39−1245 (1987)、鵜高重三、日本農芸化学会誌61, 669
-676 (1987)、Takao, M. ら, Appl. Microbiol. Biotec
hnol.30, 75-80 (1989)、Yamagata, H.ら , Proc. Nat
l. Acad. Sci.USA 86, 3589-3593 (1989)）。この発現
系を用いてヒト上皮細胞増殖因子を発現させると、その
発現量が他の発現系に比べて10〜100倍であること、発
現された蛋白質は培地中に元の活性を保持した状態で分
泌されるために分離精製が容易であること、しばしば大
腸菌の発現系でみられるように不活性な蛋白質から活性
を有する蛋白質への変換のための煩雑な操作を必要とし
ないことのために、遺伝子組換え蛋白質の大量生産系と
して注目された。In a recombinant protein expression system using Bacillus brevis, when a foreign protein is fused and expressed immediately after a signal peptide of a cell wall protein (CWP) of the same microorganism, the foreign protein becomes a CWP signal. The same peptide as the natural form is cleaved from the peptide and secreted and produced in the medium (Japanese Patent No. 2082727, Japanese Patent Application Laid-Open No. Sho 62-2).
No. 01583, Yamagata, H. et al., J. Bacteriol. 169 , 12
39-1245 (1987), Shigezo Udaka, Journal of the Japanese Society of Agricultural Chemistry 61 , 669
-676 (1987), Takao, M. et al., Appl. Microbiol. Biotec
hnol. 30 , 75-80 (1989); Yamagata, H. et al., Proc. Nat.
l. Acad. Sci. USA 86 , 3589-3593 (1989)). When human epidermal growth factor is expressed using this expression system, the expression level is 10 to 100 times that of other expression systems, and the expressed protein retains its original activity in the medium. To facilitate the separation and purification because of the secretion of E. coli, and to eliminate the need for complicated operations for converting an inactive protein into an active protein as often seen in an E. coli expression system. , As a mass production system for recombinant proteins.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、細胞壁
蛋白質CWPのシグナルペプチドに連結されたあらゆる蛋
白質がヒト上皮細胞増殖因子（EGF）と同様に大量に発
現されなかったし、またシグナルペプチドから切断され
て培地中に分泌されなかった。これを解決する1つの手
段として、宮内ら（日本農芸化学大会要旨集67, 372,19
93）は、CWPの1つであるMWPのシグナルペプチドとヒラ
メ成長ホルモン蛋白質の間にMWP蛋白質のN末端のアミノ
酸１７個（９および12個ではうまくいかない）を挿入し
た融合蛋白質をコードする遺伝子を作り、これをバチル
ス属細菌で発現することによって融合蛋白質を得たが、
しかし、このようにして得られた蛋白質はN末端にいく
つかのアミノ酸が付加された非天然型蛋白質として産生
された。しかも、宮内らの報告では、発現はMWPのN末端
のアミノ酸の数による影響を受けることが示唆される。However, all proteins linked to the signal peptide of the cell wall protein CWP were not expressed in large amounts like human epidermal growth factor (EGF), and were not cleaved from the signal peptide. It was not secreted into the medium. Miyauchi et al. (Abstracts of Japanese Society of Agricultural Chemistry 67 , 372, 19)
93) created a gene encoding a fusion protein in which 17 N-terminal amino acids of MWP protein (9 and 12 would not work) were inserted between the signal peptide of MWP, one of the CWPs, and flounder growth hormone protein. A fusion protein was obtained by expressing this in Bacillus bacteria,
However, the protein thus obtained was produced as a non-natural protein with some amino acids added to the N-terminus. Moreover, Miyauchi et al.'S report suggests that expression is affected by the number of N-terminal amino acids in MWP.

【０００５】宮内らの報告からは、配列中に予め化学的
または酵素的切断部位を挿入して天然型と同一のアミノ
酸組成のポリペプチドを取得しようとする記載および示
唆はなく、このような切断自体、宮内らが報告したヒラ
メ成長ホルモンでは化学的または酵素的切断を受け易い
配列を含むため実際困難である。このような背景の中、
遺伝子組み換え蛋白質の高発現系の一つであるバチルス
属細菌の発現系で外来ポリペプチドの発現分泌を可能に
し、かつ、天然型と同一のポリペプチドを生産させる技
術の開発は産業上極めて有益である。The report of Miyauchi et al. Does not disclose or suggest that a chemical or enzymatic cleavage site is previously inserted into the sequence to obtain a polypeptide having the same amino acid composition as the natural form. As such, flounder growth hormone reported by Miyauchi et al. Is actually difficult because it contains sequences that are susceptible to chemical or enzymatic cleavage. Against this background,
The development of technology that enables the expression and secretion of foreign polypeptides in a Bacillus bacterium expression system, which is one of the high expression systems for genetically modified proteins, and that produces the same polypeptide as the natural type is extremely useful in industry. is there.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明の目的は、有用ポ
リペプチド配列を含む融合蛋白質をコードするDNAを含
有するバチルス属発現系であって、融合蛋白質を高度に
発現・分泌し、該融合蛋白質を選択的に切断して天然型
構造をもつ該ポリペプチドを与える上記発現系を提供す
ることである。本発明を以下に要約する。An object of the present invention is to provide a Bacillus expression system containing a DNA encoding a fusion protein containing a useful polypeptide sequence, which highly expresses and secretes the fusion protein, and An object of the present invention is to provide the above expression system which selectively cleaves a protein to give the polypeptide having a native structure. The invention is summarized below.

【０００７】本発明の態様において、本発明は、バチル
ス属細菌の細胞壁蛋白質（CWP）のN末端の1個以上のア
ミノ酸残基からなる配列と、化学的または酵素的切断に
使用される単一もしくは複数のアミノ酸残基からなる配
列と、および外来ポリペプチド配列とをこの順序で互い
に直鎖状に連結して含む融合蛋白質をコードするDNA配
列を、バチルス属由来のプロモーター領域を含有するDN
A配列の３' 末端に結合させてなるDNAを提供する。[0007] In an embodiment of the present invention, the present invention provides a sequence comprising one or more N-terminal amino acid residues of the cell wall protein (CWP) of a bacterium belonging to the genus Bacillus and a single nucleotide used for chemical or enzymatic cleavage. Or a sequence comprising a plurality of amino acid residues, and a DNA sequence encoding a fusion protein comprising a foreign polypeptide sequence and linearly linked to each other in this order, a DN containing a Bacillus-derived promoter region
A DNA is provided which is linked to the 3 'end of the A sequence.

【０００８】本明細書中で使用する「（細胞壁蛋白質
の）N末端からの1個以上のアミノ酸残基」とは、1番目
として番号付けされる（細胞壁蛋白質の）N末端アミノ
酸からの1個以上のアミノ酸からなる配列を意味し、た
とえば３アミノ酸残基からなる配列は細胞壁蛋白質の1
番目から３番目までのアミノ酸配列を指す。融合蛋白質
は、そのN末端にバチルスCWPシグナルペプチド配列をさ
らに含むことができる。また、分離精製用のタグとして
使用される複数のアミノ酸残基からなる配列、および/
または、リンカーとして使用される複数のアミノ酸残基
からなる配列を含むこともできる。[0008] As used herein, "one or more amino acid residues from the N-terminus (of a cell wall protein)" is numbered as first and one of the amino acids from the N-terminal amino acid (of the cell wall protein). It means a sequence consisting of the above amino acids. For example, a sequence consisting of three amino acid residues is one of the cell wall proteins.
Refers to the third to third amino acid sequences. The fusion protein can further include a Bacillus CWP signal peptide sequence at its N-terminus. Further, a sequence consisting of a plurality of amino acid residues used as a tag for separation and purification, and /
Alternatively, it may include a sequence consisting of a plurality of amino acid residues used as a linker.

【０００９】本発明の一実施態様により、バチルス属細
菌はバチルス・ブレビスである。化学的切断に使用され
る単一のアミノ酸残基としてメチオニンを例示すること
ができるが、この場合、化学的切断反応においてたとえ
ば臭化シアンを用いて最も高い特異性が達成され得るよ
うに、融合蛋白質は追加のメチオニン残基を含んでいて
はいけない。一方、酵素的切断に使用されるアミノ酸残
基からなる配列は、TEVプロテアーゼ、V8プロテアーゼ
などのプロテアーゼで切断可能な配列を含むことができ
る。According to one embodiment of the present invention, the Bacillus bacterium is Bacillus brevis. Methionine can be exemplified as the single amino acid residue used for chemical cleavage, in which case the fusion is performed such that the highest specificity can be achieved with, for example, cyanogen bromide in the chemical cleavage reaction. The protein must not contain additional methionine residues. On the other hand, the sequence consisting of amino acid residues used for enzymatic cleavage can include a sequence cleavable by a protease such as TEV protease and V8 protease.

【００１０】本発明の第1の好適実施態様において、融
合蛋白質は、CWPの一つであるMWP蛋白質のN末端からの1
個以上のアミノ酸残基からなる配列と、分離精製用タグ
としての６個のヒスチジン残基からなる配列と、リンカ
ーとしてのアミノ酸配列GlySerProValProSerGly（配列
番号１）と、目的ポリペプチドを化学的に切り出すのに
必要とされるメチオニン残基と、およびアミノ酸配列中
にメチオニンを含まないポリペプチド配列とをこの順序
で互いに直鎖状に連結したものからなる。この例では、
融合蛋白質はそのN末端にMWPシグナルペプチド配列を含
んでもよい。また、ポリペプチドの具体例はヒトプロイ
ンスリンである。さらに、MWP蛋白質のN末端からの1個
以上のアミノ酸残基からなる配列は、好ましくは6，7，
8，10，11，12，13，14，15，17，20または50個のアミ
ノ酸を含むことができる。[0010] In a first preferred embodiment of the present invention, the fusion protein comprises one of the MWP proteins, one of the CWPs, from the N-terminus.
A sequence consisting of at least two amino acid residues, a sequence consisting of six histidine residues as a tag for separation and purification, an amino acid sequence GlySerProValProSerGly (SEQ ID NO: 1) as a linker, and a target polypeptide. And a polypeptide sequence not containing methionine in the amino acid sequence, which are linearly linked to each other in this order. In this example,
The fusion protein may include a MWP signal peptide sequence at its N-terminus. A specific example of the polypeptide is human proinsulin. Furthermore, the sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminus of the MWP protein is preferably 6,7,
It can comprise 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 20, or 50 amino acids.

【００１１】本発明の第２の好適実施態様において、融
合蛋白質は、CWP蛋白質の一つであるMWP蛋白質のN末端
からの10または20個のアミノ酸残基からなる配列と、分
離精製用タグとしての6個のヒスチジン残基からなる配
列と、リンカーとしてのヒト上皮細胞増殖因子配列と、
目的ポリペプチドをTEVプロテアーゼにより切り出すた
めに必要とされるアミノ酸配列AspTyrAspIleProThrThrG
luAsnLeuTyrPheGln（配列番号２）と、アミノ酸配列中
にTEVプロテアーゼ認識配列を含まずかつN末端がグリシ
ンかセリンであるポリペプチド配列とをこの順序で互い
に直鎖状に連結したものからなる。この例では、融合蛋
白質はさらに、そのN末端にMWPシグナルペプチド配列を
含んでもよい。ポリペプチドとしてヒトソマトスタチン
28が例示され得る。[0011] In a second preferred embodiment of the present invention, the fusion protein comprises a sequence consisting of 10 or 20 amino acid residues from the N-terminal of the MWP protein, which is one of the CWP proteins, and a tag for separation and purification. A sequence consisting of six histidine residues, and a human epidermal growth factor sequence as a linker,
Amino acid sequence AspTyrAspIleProThrThrG required for cleavage of target polypeptide by TEV protease
luAsnLeuTyrPheGln (SEQ ID NO: 2) and a polypeptide sequence which does not contain a TEV protease recognition sequence in its amino acid sequence and whose N-terminus is glycine or serine are linearly linked to each other in this order. In this example, the fusion protein may further include an MWP signal peptide sequence at its N-terminus. Human somatostatin as a polypeptide
28 may be exemplified.

【００１２】本発明の第3の好適実施態様において、融
合蛋白質は、CWP蛋白質の一つであるMWP蛋白質のN末端
からの20個のアミノ酸残基からなる配列と、分離精製用
タグとしての6個のヒスチジン残基からなる配列と、リ
ンカーとしてのアミノ酸配列ＧlyＳerＰroＶalＰroＳer
Ｇly（配列番号１）と、目的ポリペプチドをV8プロテア
ーゼにより切り出すために必要とされるアミノ酸配列Ph
eLeuGluと、およびアミノ酸配列中にグルタミン酸を含
まないポリペプチド配列とをこの順序で互いに直鎖状に
連結されたものからなる。この例でも同様に、融合蛋白
質はさらに、そのN末端にMWPシグナルペプチド配列を含
むことができる。また、ヒトグルカゴンがポリペプチド
として有用である。In a third preferred embodiment of the present invention, the fusion protein comprises a sequence consisting of 20 amino acid residues from the N-terminus of the MWP protein, which is one of the CWP proteins, and 6 Of histidine residues and an amino acid sequence GlySerProValProSer as a linker
Gly (SEQ ID NO: 1) and the amino acid sequence Ph required to excise the target polypeptide with V8 protease
eLeuGlu and a polypeptide sequence containing no glutamic acid in the amino acid sequence are linearly linked to each other in this order. Similarly, in this example, the fusion protein can further include an MWP signal peptide sequence at its N-terminus. Also, human glucagon is useful as a polypeptide.

【００１３】本発明はまた、別の態様において、バチル
ス属細菌のCWPシグナルペプチド配列と、酵素的切断に
使用される複数のアミノ酸残基からなる配列と、および
外来ポリペプチド配列とをこの順序で互いに直鎖状に連
結して含む融合蛋白質をコードするDNA配列を、バチル
ス属由来のプロモーター領域を含有するＤＮＡ配列の
３' 末端に結合させてなるDNAを提供する。この発明に
おいて、シグナルペプチド配列の直後に、CWP蛋白質の
Ｎ末端からの１個以上アミノ酸残基からなる配列を存在
させることも可能である。好適なバチルス属細菌とし
て、バチルス・ブレビスが例示できる。In another embodiment, the present invention provides, in this order, a CWP signal peptide sequence of a bacterium belonging to the genus Bacillus, a sequence consisting of a plurality of amino acid residues used for enzymatic cleavage, and a foreign polypeptide sequence in this order. Provided is a DNA obtained by binding a DNA sequence encoding a fusion protein containing a linearly linked fusion protein to the 3 ′ end of a DNA sequence containing a Bacillus-derived promoter region. In the present invention, a sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminal of the CWP protein can be present immediately after the signal peptide sequence. Bacillus brevis can be exemplified as a suitable Bacillus bacterium.

【００１４】本発明の実施態様において、酵素的切断に
使用される複数のアミノ酸残基からなる配列は、プロテ
アーゼにより切断可能である配列を含む。本発明の別の
実施態様において、融合蛋白質は、CWPの一つであるMWP
のシグナルペプチド配列と、目的ポリペプチドをTEVプ
ロテアーゼにより切り出すために必要とされるアミノ酸
配列AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln（配列
番号２）と、およびアミノ酸配列中にTEVプロテアーゼ
認識配列を含まないポリペプチド配列とをこの順序で互
いに直鎖状に連結したものからなる。この例では、シグ
ナルペプチド配列の直後に、MWP蛋白質のＮ末端からの
１個以上のアミノ酸残基からなる配列を存在させること
も可能である。ポリペプチドとして、Ｎ末端にGlyまた
はSerをもつ変異型ヒト成長ホルモンを例示できる。In an embodiment of the present invention, the sequence consisting of a plurality of amino acid residues used for enzymatic cleavage includes a sequence cleavable by a protease. In another embodiment of the invention, the fusion protein is one of the CWP MWP
And the amino acid sequence AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln (SEQ ID NO: 2) required for cleaving the target polypeptide with the TEV protease, and the polypeptide sequence not containing the TEV protease recognition sequence in the amino acid sequence in this order. It consists of linearly linked to each other. In this example, a sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminus of the MWP protein can be present immediately after the signal peptide sequence. Examples of the polypeptide include mutant human growth hormone having Gly or Ser at the N-terminus.

【００１５】本発明はさらに、上記に定義したDNA類の
各々を含むベクターを提供する。該ベクターにおいて
は、目的の融合蛋白質をコードするDNAの転写系を作動
可能とするように、該DNAは少なくともプロモーター配
列を含む調節配列の制御下に置かれる。本発明はさらに
また、上記ベクターで形質転換されたバチルス属に属す
る細菌を提供する。好適な細菌はバチルス・ブレビスで
ある。本発明は、他の態様において、上記定義の細菌を
培地に培養し、外来ポリペプチド配列を含む融合蛋白質
を菌体外に蓄積せしめ、該培地から該融合蛋白質を取り
出し、該取り出された融合蛋白質から該ポリペプチドを
切り出し、該ポリペプチドを回収することを含む、組換
えポリペプチドの製造方法を提供する。The present invention further provides a vector comprising each of the DNAs defined above. In the vector, the DNA is placed under the control of regulatory sequences including at least a promoter sequence so that the transcription system of the DNA encoding the fusion protein of interest can be activated. The present invention still further provides a bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with the above vector. A preferred bacterium is Bacillus brevis. In another aspect of the present invention, a bacterium as defined above is cultured in a medium, a fusion protein containing a foreign polypeptide sequence is accumulated outside the cells, the fusion protein is removed from the medium, and the removed fusion protein is removed. The present invention provides a method for producing a recombinant polypeptide, comprising cutting out the polypeptide from, and recovering the polypeptide.

【００１６】[0016]

【発明の実施の形態】本発明によって、上記定義のDNA
をバチルス属細菌で発現させて得られる融合蛋白質を化
学的または酵素的に処理することによって、所望の天然
型一次構造を有するポリペプチドを得ることができる。
バチルス属細菌のCWP蛋白質のN末端の1個以上のアミノ
酸残基としては、以下のものに限定されないが、たとえ
ばバチルス・ブレビス株、４７−５Q（FERM P-7224、FE
RM BP-1664:特開昭60−58074号公報、特開昭62−201589
号公報）、HPD31（FERM BP-1087:特開平4−278091号公
報）等に由来のものを用いることができる。たとえば、
以下に例示する配列を用いることができる（括弧内は引
用した文献である）：DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION According to the present invention, a DNA as defined above
Can be chemically or enzymatically treated to obtain a polypeptide having a desired natural primary structure.
The one or more amino acid residues at the N-terminus of the CWP protein of the Bacillus bacterium are not limited to the following ones.
RM BP-1664: JP-A-60-58074, JP-A-62-201589
And HPD31 (FERM BP-1087: JP-A-4-278091). For example,
The sequences exemplified below can be used (parentheses are cited references):

【００１７】MWPmp10: AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAlaPr
o（配列番号３；J.Bacteriol.,169:1239-1245,198７） OWPmp10: AlaProLysAspGlyIleTyrIleGlyGly (配列番号
４；J.Bacteriol.,170:176-186,1988) HWPmp10: AlaGluAspThrThrThrAlaProLysMet (配列番号
５；J.Bacteriol.,172:1312-1320,1990) N末端からのアミノ酸の残基数は、通常1個以上、好まし
くは 6個以上、より好ましくは６、７、８、１０、１
１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、50個であ
る。MWPmp10: AlaGluGluAlaAlaThrThrThrAlaPr
o (SEQ ID NO: 3; J. Bacteriol., 169 : 1239-1245, 1977) OWPmp10: AlaProLysAspGlyIleTyrIleGlyGly (SEQ ID NO: 4; J. Bacteriol., 170 : 176-186, 1988) HWPmp10: AlaGluAspThrThrThrAlaProLysMet (SEQ ID NO: 5; Bacteriol., 172 : 1312-1320, 1990) The number of amino acid residues from the N-terminus is usually 1 or more, preferably 6 or more, and more preferably 6, 7, 8, 10, 1 or more.
1, 12, 13, 14, 15, 17, 20, and 50.

【００１８】化学的または酵素的切断に使用されるアミ
ノ酸残基としては、化学的切断の例として、たとえば、
メチオニンのC末端側を選択的に切断する例（J.Biol.Ch
em.,237:1856-1860,1962）やトリプトファンのC末端側
で選択的に切断する例（Methods in Enzymol.,91:318-3
24,1983）を挙げることができる。また、酵素的切断の
ための酵素例として、たとえば、V8プロテアーゼ、TEV
プロテアーゼに加えてファクターXa、トロンビン、エン
テロキナーゼ等を挙げることができ、これらによって融
合部位を選択的に切断することができる。このような化
学的あるいは酵素的切断に使用されるアミノ酸配列を目
的のポリペプチドのN末端側に配置することによって、
その後の化学的または酵素的切断操作によって所望の一
次構造をもつ目的のポリペプチドに導くことができる。Examples of amino acid residues used for chemical or enzymatic cleavage include, for example, chemical cleavage, for example,
Example of selective cleavage at the C-terminal side of methionine (J. Biol. Ch.
em., 237 : 1856-1860, 1962) and examples of selective cleavage at the C-terminal side of tryptophan (Methods in Enzymol., 91 : 318-3).
24, 1983). Examples of enzymes for enzymatic cleavage include, for example, V8 protease, TEV
In addition to protease, factor Xa, thrombin, enterokinase and the like can be mentioned, and by these, the fusion site can be selectively cleaved. By placing the amino acid sequence used for such chemical or enzymatic cleavage on the N-terminal side of the target polypeptide,
Subsequent chemical or enzymatic cleavage can lead to the desired polypeptide having the desired primary structure.

【００１９】本発明において、外来ポリペプチドは、上
記の化学的または酵素的切断操作の影響をまったく受け
ないものであれば生物の起源を問わずいずれの蛋白質で
もよい。具体的には、化学的切断法特に臭化シアンによ
る化学的切断法が用いられる場合、目的の外来ポリペプ
チドの一次構造（またはアミノ酸組成）中にメチオニン
残基が含まれてはいけない。そのようなポリペプチドの
例として、ヒトプロインスリン、ヒト血小板由来成長因
子A鎖（PDGF-A）、ヒトセクレチン等を挙げることがで
きるが、これらに限定されない。また、酵素的切断法と
して特にTEVプロテアーゼが用いられる場合、天然型と
同一のポリペプチドを得るためには、外来ポリペプチド
のN末端側がGlyかSerである必要がある。そのような外
来ポリペプチドとして、ヒトソマトスタチン２８、ヒト
血小板由来成長因子A鎖（PDGF-A）、ヒト神経成長因子
（NGF）等を例示することができる。但し、N末端にGly
やSerが付加されても蛋白質の機能に影響を及ぼさない
場合は他の蛋白質も用いることができる。また、V8プロ
テアーゼが用いられる場合、外来ポリペプチドにGluを
含んではいけない。そのようなポリペプチドの例とし
て、ヒトグルカゴン、ヒト心房性ナトリウム利尿ペプチ
ド、ヒトカルシトニン等を挙げることができる。In the present invention, the foreign polypeptide may be any protein irrespective of the origin of the organism as long as it is not affected by the above-mentioned chemical or enzymatic cleavage operation. Specifically, when a chemical cleavage method, particularly a chemical cleavage method with cyanogen bromide, is used, the primary structure (or amino acid composition) of the foreign polypeptide of interest must not contain a methionine residue. Examples of such polypeptides include, but are not limited to, human proinsulin, human platelet-derived growth factor A chain (PDGF-A), human secretin, and the like. In addition, when TEV protease is used particularly as an enzymatic cleavage method, the N-terminal side of the foreign polypeptide must be Gly or Ser in order to obtain the same polypeptide as the native form. Examples of such a foreign polypeptide include human somatostatin 28, human platelet-derived growth factor A chain (PDGF-A), human nerve growth factor (NGF), and the like. However, Gly at the N-terminal
If addition of Ser or Ser does not affect the function of the protein, other proteins can be used. Also, when V8 protease is used, the foreign polypeptide must not contain Glu. Examples of such polypeptides include human glucagon, human atrial natriuretic peptide, human calcitonin, and the like.

【００２０】本発明によれば、DNAは好ましくは、融合
蛋白質のN末端にバチルス属CWPシグナルペプチド、特に
MWPシグナルペプチド、をコードするヌクレオチドを含
むことができる。本発明のDNAはさらに、分離精製用の
タグとして使用される複数のアミノ酸をコードするヌク
レオチド配列および／またはリンカーと呼ばれる複数の
アミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列をさらに含
むことができる。本明細書中、「分離精製用のタグ」と
は、組換え法による発現で得られる融合蛋白質の単離を
容易にするためのペプチドを意味する。タグとしては、
タグとタグに結合可能な物質との間の結合が可逆的であ
るものが好ましく使用できる。タグの例として、たとえ
ば、グルタチオンに親和性があるグルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼ、アミロースに親和性があるマルトース
結合プロテイン、メタルに親和性があるヒスチジンが複
数連結したもの、抗原または抗体を挙げることができ
る。本発明の好適実施態様によれば、そのようなタグは
HisHisHisHisHisHis（配列番号６１）［すなわち、（H
is）₆］である。According to the invention, the DNA is preferably at the N-terminus of the fusion protein, a Bacillus CWP signal peptide, in particular
MWP signal peptide. The DNA of the present invention can further include a nucleotide sequence encoding a plurality of amino acids used as a tag for separation and purification and / or a nucleotide sequence encoding a plurality of amino acid residues called a linker. As used herein, the term "tag for separation and purification" means a peptide for facilitating isolation of a fusion protein obtained by expression by a recombinant method. As tags,
Those in which the binding between the tag and the substance capable of binding to the tag is reversible can be preferably used. Examples of the tag include, for example, glutathione S-transferase having an affinity for glutathione, maltose-binding protein having an affinity for amylose, histidine having a plurality of metals having an affinity, an antigen or an antibody. According to a preferred embodiment of the present invention, such a tag is
HisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO: 61) [ie, (H
is) ₆ ].

【００２１】また、リンカーは一般には蛋白質のなかで
機能ドメインの間に存在しており、それぞれのドメイン
の機能に影響を及ぼすことなくドメインを連結する働き
がある。本発明では、分離・精製用のタグと外来ポリペ
プチドとの間に配置されているが、それらは分離・精製
用のタグが挿入された融合蛋白質の発現分泌を導くのに
役立っている。そのようなリンカーとしては、一般には
Ala,Gly,Pro,Ser,Valが適当数、適当な組み合わせで並
列されたものを用いることができる。好適実施態様によ
れば、そのようなリンカーはGlySerProValProSerGly
（配列番号１）である。したがって、分離・精製用のタ
グを挿入しない場合は、そのようなリンカーは必須では
ない。一方、外来ポリペプチドのソマトスタチン２８の
融合蛋白質の例のように、EGFのような特殊なリンカー
が外来ポリペプチドの発現分泌に必須になってくる場合
もある。A linker is generally present between functional domains in a protein, and functions to connect domains without affecting the function of each domain. In the present invention, the tag is arranged between the tag for separation / purification and the foreign polypeptide, and these are useful for guiding the expression and secretion of the fusion protein into which the tag for separation / purification has been inserted. Such linkers are generally
Ala, Gly, Pro, Ser, and Val can be used in parallel with an appropriate number and an appropriate combination. According to a preferred embodiment, such a linker is GlySerProValProSerGly
(SEQ ID NO: 1). Therefore, when a tag for separation / purification is not inserted, such a linker is not essential. On the other hand, as in the case of the fusion protein of the foreign polypeptide somatostatin 28, a special linker such as EGF may be essential for the expression and secretion of the foreign polypeptide.

【００２２】本発明は一実施態様において、CWPの一つ
である MWP蛋白質のN末端から1個以上、好ましくは６〜
50(但し、9は除く)個、特に6，7，8，10，11，12，13，
14，15，17，20または50個のアミノ酸残基からなる配列
（以下、MWPmp６、MWPmp7、MWPmp8、MWPmp10、などと称
する）と、分離精製用タグとしての６個のヒスチジン残
基からなる配列［本明細書中（His）₆と表示する］と、
リンカーとしての７個のアミノ酸残基からなる配列GlyS
erProValProSerGly（配列番号１）と、目的ポリペプチ
ドを化学的に切り出すのに必要とされるメチオニン残基
と、アミノ酸配列中にメチオニンを含まないポリペプチ
ド配列とがこの順序で互いに直鎖状に連結された融合蛋
白質をコードするDNA配列を、バチルス属由来のプロモ
ーター領域を含有するDNA配列の３' 末端に結合してな
るDNAを提供する。この場合のポリぺプチドの例はヒト
プロインスリンである。また、分離精製用タグおよびリ
ンカーは必ずしも必要でない。融合蛋白質はさらに、そ
のN末端にMWPシグナルペプチド配列を含むことができ
る。In one embodiment of the present invention, one or more, preferably 6 to
50 (except 9), especially 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13,
A sequence consisting of 14, 15, 17, 20 or 50 amino acid residues (hereinafter referred to as MWPmp6, MWPmp7, MWPmp8, MWPmp10, etc.) and a sequence consisting of 6 histidine residues as a tag for separation and purification [ In this specification, (His) ₆ is indicated.]
Sequence GlyS consisting of 7 amino acid residues as linker
erProValProSerGly (SEQ ID NO: 1), a methionine residue required to chemically cleave the target polypeptide, and a polypeptide sequence containing no methionine in the amino acid sequence are linearly linked to each other in this order. The present invention provides a DNA comprising a DNA sequence encoding the fusion protein and the 3 'end of a DNA sequence containing a Bacillus-derived promoter region. An example of a polypeptide in this case is human proinsulin. Separation / purification tags and linkers are not necessarily required. The fusion protein can further include an MWP signal peptide sequence at its N-terminus.

【００２３】本発明は、別の実施態様において、CWP蛋
白質の一つであるMWP蛋白質のN末端からの1個以上、好
ましくは６〜50(但し、9は除く)個、特に10または20個
のアミノ酸残基からなる配列と、分離精製用タグとして
6個のヒスチジン残基からなる配列と、リンカーとして
のヒト上皮細胞増殖因子配列と、目的ポリペプチドをTE
Vプロテアーゼにより切り出すために必要とされるアミ
ノ酸配列AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln
（配列番号２）と、およびアミノ酸配列中にTEVプロテ
アーゼ認識配列を含まずかつN末端がグリシンかセリン
であるポリペプチド配列とがこの順序で互いに直鎖状に
連結された融合蛋白質をコードするDNA配列を、バチル
ス属由来のプロモーター領域を含有するDNA配列の３'
末端に結合させてなるDNAを提供する。この場合のポリ
ぺプチドの例はヒトソマトスタチン28である。融合蛋白
質はさらに、そのN末端にMWPシグナルペプチド配列を含
むことができる。In another embodiment, the present invention provides, in another embodiment, one or more, preferably 6 to 50 (excluding 9), particularly 10 or 20 from the N-terminal of the MWP protein which is one of the CWP proteins. As a tag for separation and purification
A sequence consisting of six histidine residues, a human epidermal growth factor sequence as a linker, and a target polypeptide
Amino acid sequence required for cleavage by V protease AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln
DNA encoding a fusion protein in which (SEQ ID NO: 2) and a polypeptide sequence which does not contain a TEV protease recognition sequence in the amino acid sequence and whose N-terminus is glycine or serine are linearly linked to each other in this order. The sequence was added to the 3 ′ of the DNA sequence containing the promoter region derived from Bacillus.
Provide a DNA bound to the end. An example of a polypeptide in this case is human somatostatin 28. The fusion protein can further include an MWP signal peptide sequence at its N-terminus.

【００２４】本発明は、さらに別の実施態様において、
CWP蛋白質の一つであるMWP蛋白質のN末端からの1個以
上、好ましくは６〜50(但し、9は除く)個、特に20個の
アミノ酸残基からなる配列と、分離精製用タグとしての
6個のヒスチジン残基からなる配列と、リンカーとして
のアミノ酸配列ＧlyＳerＰroＶalＰroＳerＧlyと、目的
ポリペプチドをV8プロテアーゼにより切り出すために必
要とされるアミノ酸配列PheLeuGluと、アミノ酸配列中
にグルタミン酸を含まないポリペプチド配列とがこの順
序で互いに直鎖状に連結された融合蛋白質をコードする
DNA配列を、バチルス属由来のプロモーター領域を含有
するDNA配列の３' 末端に結合させてなるDNAを提供す
る。ポリぺプチドの例はヒトグルカゴンである。融合蛋
白質はさらに、そのN末端にMWPシグナルペプチドを含む
ことができる。The present invention, in yet another embodiment, comprises:
One or more, preferably 6 to 50 (however, excluding 9) from the N-terminal of the MWP protein, which is one of the CWP proteins, a sequence consisting of 20 amino acid residues, and a tag for separation and purification.
A sequence consisting of six histidine residues, an amino acid sequence GlySerProValProSerGly as a linker, an amino acid sequence PheLeuGlu required to excise the target polypeptide by V8 protease, and a polypeptide sequence containing no glutamic acid in the amino acid sequence. Encode fusion proteins linked linearly to each other in this order
Provided is a DNA obtained by binding a DNA sequence to the 3 ′ end of a DNA sequence containing a Bacillus-derived promoter region. An example of a polypeptide is human glucagon. The fusion protein can further include an MWP signal peptide at its N-terminus.

【００２５】本発明はまた、別の態様において、バチル
ス属細菌のCWPシグナルペプチド配列と、酵素的切断に
使用される複数のアミノ酸残基からなる配列と、および
外来ポリペプチド配列とをこの順序で互いに直鎖状に連
結して含む融合蛋白質をコードするDNAを、バチルス属
由来のプロモーター領域を含有するＤＮＡの３' 末端に
結合させてなるDNAを提供する。シグナルペプチド配列
の直後に、CWP蛋白質のＮ末端からの１個以上のアミノ
酸残基からなる配列が存在してもよい。また酵素的切断
のための配列は、ファクターXa、トロンビン、エンテロ
キナーゼ、V8プロテアーゼまたはTEVプロテアーゼなど
のプロテアーゼに感受性であり得る。The present invention also provides, in another embodiment, a CWP signal peptide sequence of a bacterium belonging to the genus Bacillus, a sequence consisting of a plurality of amino acid residues used for enzymatic cleavage, and a foreign polypeptide sequence in this order. Provided is a DNA obtained by binding DNAs encoding fusion proteins containing linearly linked to each other to the 3 ′ end of DNA containing a promoter region derived from Bacillus. Immediately after the signal peptide sequence, there may be a sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminus of the CWP protein. Also, sequences for enzymatic cleavage may be sensitive to proteases such as Factor Xa, thrombin, enterokinase, V8 protease or TEV protease.

【００２６】本発明の一実施態様により、融合蛋白質
は、CWPの一つであるMWPのシグナルペプチド配列と、目
的ポリペプチドをTEVプロテアーゼにより切り出すため
に必要とされるアミノ酸配列AspTyrAspIleProThrThrGlu
AsnLeuTyrPheGln（配列番号２）と、およびアミノ酸配
列中にTEVプロテアーゼ認識配列を含まないポリペプチ
ド配列とをこの順序で互いに直鎖状に連結したものから
なる。この例では、シグナルペプチド配列の直後に、MW
P蛋白質のＮ末端からの１個以上のアミノ酸残基からな
る配列が存在していてもよい。もしMWP蛋白質のN末端か
らの1個以上のアミノ酸残基からなる配列が融合蛋白質
の中に含まれる場合には、その配列は好ましくは、1，
2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，14，２０または
３０個のアミノ酸を含むことができる。ポリペプチドの
例は、Ｎ末端にGlyまたはSerをもつ変異型ヒト成長ホル
モンである。According to one embodiment of the present invention, the fusion protein comprises a signal peptide sequence of MWP which is one of CWP, and an amino acid sequence AspTyrAspIleProThrThrGlu required for excision of the target polypeptide by TEV protease.
AsnLeuTyrPheGln (SEQ ID NO: 2) and a polypeptide sequence having no TEV protease recognition sequence in the amino acid sequence are linearly linked to each other in this order. In this example, immediately after the signal peptide sequence, MW
A sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminus of the P protein may be present. If a sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminus of the MWP protein is included in the fusion protein, the sequence is preferably 1,
It can include 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 20, or 30 amino acids. An example of a polypeptide is a mutant human growth hormone with Gly or Ser at the N-terminus.

【００２７】本発明においては、上記の融合蛋白質をコ
ードするヌクレオチド配列はバチルス属由来のプロモー
ター領域を含有するヌクレオチド配列の３’末端に結合
される。使用し得るプロモーターとしては、バチルス・
ブレビス47−５Q株由来のMWPプロモーター(特公平1−58
950号公報、特公平7−108224号公報)、バチルス・ブレ
ビスHPD31株由来のHWPプロモーター(特開平4−278091号
公報、特開平6−133782号公報)等を挙げることができる
が、これらに限定されない。In the present invention, the nucleotide sequence encoding the above-mentioned fusion protein is ligated to the 3 'end of the nucleotide sequence containing a promoter region derived from Bacillus. Examples of promoters that can be used include Bacillus
MWP promoter derived from Brevis 47-5Q strain (Japanese Patent Publication No. 1-58)
No. 950, Japanese Patent Publication No. 7-108224), HWP promoter derived from Bacillus brevis HPD31 strain (Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-278091, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-133782), and the like. Not done.

【００２８】本発明のDNAは、当業界で公知の技術を組
み合わせて作製することができる。たとえば、構成要素
の各DNA配列を化学的合成法またはクローニング法によ
って個々に調製し、これら構成要素をリガーゼを用いて
順次連結し、PCR増幅法を組み合わせて目的のDNAを作製
することができる。具体的には実施例を参照することに
よってその詳細が理解されるが、個々の技術として、Ma
niatis、T.ら、Molecular Cloning ２nd ed., A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (198
9)、Innis, M.A.ら, PCR Protocols, A guide to metho
ds and applications, Academic Press (1990)、等に記
載の一般的技術が使用可能である。The DNA of the present invention can be prepared by combining techniques known in the art. For example, each DNA sequence of the constituent elements can be individually prepared by a chemical synthesis method or a cloning method, and these constituent elements can be sequentially ligated using a ligase, and the target DNA can be prepared by combining PCR amplification methods. Specifically, the details can be understood by referring to the examples.
niatis, T. et al., Molecular Cloning 2nd ed., A Labora
tory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (198
9), Innis, MA et al., PCR Protocols, A guide to metho
General techniques described in ds and applications, Academic Press (1990), and the like can be used.

【００２９】外来ポリペプチドをコードするDNAは、通
常のDNAクローニング法を使用して得ることができる。
たとえば、外来蛋白質を精製し、その蛋白質に特徴的な
アミノ酸配列を部分的に決定し、決定された配列に基づ
いてプローブを合成するか、または精製蛋白質に対する
抗体を調製して、これらプローブまたは抗体を用いて目
的のcDNAを含有するｃDNAライブラリーをスクリーニン
グして目的のポリペプチドをコードするDNAを得ること
ができる。短鎖DNAは、市販のDNAシンセサイザーを用い
てたとえばホスホアミダイト化学により合成することが
できる。DNAはさらに必要により一般的なポリメラーゼ
連鎖反応（PCR）によって増幅することができ、この場
合、DNAの変性、プライマーとのアニーリング、および
伸長反応を１サイクルとして２０サイクル以上繰り返
す。The DNA encoding the foreign polypeptide can be obtained using a conventional DNA cloning method.
For example, a foreign protein is purified, an amino acid sequence characteristic of the protein is partially determined, a probe is synthesized based on the determined sequence, or an antibody to the purified protein is prepared, and the probe or antibody is purified. The cDNA encoding the desired polypeptide can be obtained by screening a cDNA library containing the desired cDNA using the above method. Short-chain DNA can be synthesized using a commercially available DNA synthesizer, for example, by phosphoramidite chemistry. If necessary, the DNA can be amplified by a general polymerase chain reaction (PCR). In this case, denaturation of the DNA, annealing with the primer, and extension reaction are repeated for 20 cycles or more as one cycle.

【００３０】本発明はさらに、本発明の上記DNAを含む
ベクターを提供する。使用可能なベクターは、本発明の
DNAを組み込むことのできる適当な挿入部位すなわち制
限酵素部位を有していること、該DNAをバチルス属宿主
細胞内で発現可能であること、さらに該宿主細胞内で自
律的に複製可能であること、等の性質を少なくとも有し
ている必要がある。ベクターは複製開始点、ターミネー
ター配列、リボソーム結合部位等を適宜含むことがで
き、さらに薬剤耐性遺伝子、栄養要求性を相補する遺伝
子等の選択マーカーを含んでもよい。好ましくは、本発
明のベクターはプラスミドである。ベクターは、以下の
ものに限定されないが、たとえば、ｐNU200、 pHY500(P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3589−3593,1989)、pHY4831
(J.Bacteriol.,169:1239-1245,1987)、pNU100（Appl.Mi
crobiol.Biotechnol.,30:75-80,1989) 、ｐNU211(J.Bio
chem.,112:488-491,1992)、ｐNU211R2L5(特開平7−1709
84号公報)、pHY700（特開平4−278091号公報）、ｐHT21
0（特開平6−133782号公報）、pHT110R2L5(Appl.Microb
iol.Biotechnol.,42:358-363,1994)が使用可能である。
本発明の具体例では、図５、図１８に示すような構築法
で発現ベクター（ｐNU-PINS-1、ｐNU-PINS-2、ｐNU-ST
N、ｐNU-GCNおよびpNU-G〜GH）を作製することができ
る。The present invention further provides a vector containing the above DNA of the present invention. Vectors that can be used are those of the present invention.
It must have an appropriate insertion site, ie, a restriction enzyme site, into which the DNA can be incorporated, be capable of expressing the DNA in a Bacillus host cell, and be capable of autonomously replicating in the host cell. , Etc. must be at least possessed. The vector may appropriately contain a replication origin, a terminator sequence, a ribosome binding site and the like, and may further contain a selection marker such as a drug resistance gene and a gene that complements auxotrophy. Preferably, the vector of the present invention is a plasmid. Vectors are not limited to the following, for example, pNU200, pHY500 (P
roc.Natl.Acad.Sci.USA, 86 : 3589-3593,1989), pHY4831
(J. Bacteriol., 169 : 1239-1245, 1987), pNU100 (Appl.
crobiol.Biotechnol. , 30: 75-80, 1989), pNU211 (J. Bio
chem., 112 : 488-491, 1992), pNU211R2L5 (JP-A-7-1709).
No. 84), pHY700 (JP-A-4-278091), pHT21
0 (JP-A-6-133372), pHT110R2L5 (Appl.
iol. Biotechnol., 42 : 358-363, 1994) can be used.
In a specific embodiment of the present invention, the expression vectors (pNU-PINS-1, pNU-PINS-2, pNU-ST
N, pNU-GCN and pNU-G to GH).

【００３１】本発明はさらにまた、上記定義のベクター
で形質転換されたバチルス属細菌を提供する。宿主とし
てのバチルス属細菌としては、以下のものに限定されな
いが、たとえばバチルス・ブレビス株、４７−５Q（FER
M P-7224、FERM BP-1664：特開昭60−58074号公報、特
開昭62−201589号公報）、４７K（特開平2−257876号公
報）、31 OK（特開平6−296485号公報）およびHPD31（F
ERM BP-1087；特開平4−278091号公報）等を挙げること
ができる。発現ベクターｐNU-PINS-1、ｐNU-PINS-2、ｐ
NU-STNおよびｐNU-GCNをそれぞれバチルス・ブレビス４
７−５Q株に移入して得られた組換え細菌は、平成１０
年３月30日付で通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所（茨城県つくば市東一丁目１の３）に、ブダペスト条
約下にそれぞれ受託番号FERM BP−6311、FERM BP−631
2、FERM BP−6313、FERM BP−6314で国際寄託された。The present invention further provides a Bacillus bacterium transformed with a vector as defined above. The Bacillus bacterium as a host is not limited to the following, but for example, Bacillus brevis strain, 47-5Q (FER
MP-7224, FERM BP-1664: JP-A-60-58074, JP-A-62-201589), 47K (JP-A-2-257876), 31 OK (JP-A-6-296485) ) And HPD31 (F
ERM BP-1087; Japanese Patent Application Laid-Open No. 4-278091). Expression vectors pNU-PINS-1, pNU-PINS-2, p
NU-STN and pNU-GCN are each Bacillus brevis 4
The recombinant bacterium obtained by transferring to the 7-5Q strain was
On March 30, 2012, the Ministry of International Trade and Industry, Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology (1-3-3, Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture) received accession numbers FERM BP-6311, FERM BP-631 under the Budapest Treaty, respectively.
2. Deposited internationally under FERM BP-6313 and FERM BP-6314.

【００３２】上記のようにして得られた発現ベクターは
コンピテントなバチルス属細菌に移入し、発現可能な条
件下適切な培地にて該細菌を培養して目的の組換え融合
ポリペプチドを菌体外または菌体内、好ましくは菌体外
に産生し、常法によりポリペプチドを回収し精製する。
移入方法としては、エレクトロポレーション（Methods
in Enzymol.，217：23−33，1993）などを例示すること
ができる。また、融合ポリペプチドの精製は、たとえば
ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラ
フィー、アフィニティクロマトグラフィー、疎水性相互
作用クロマトグラフィー、電気泳動、等電点電気泳動、
等の方法を適切に組合わせて実施することができる。The expression vector obtained as described above is transferred to a competent Bacillus bacterium, and the bacterium is cultured in an appropriate medium under conditions capable of expression to transform the desired recombinant fusion polypeptide into cells. It is produced outside or inside the cells, preferably outside the cells, and the polypeptide is recovered and purified by a conventional method.
Electroporation (Methods
in Enzymol., 217: 23-33, 1993). Purification of the fusion polypeptide may be performed, for example, by gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydrophobic interaction chromatography, electrophoresis, isoelectric focusing,
Etc. can be implemented in appropriate combination.

【００３３】上記で得られた融合蛋白質は、次いで、化
学的または酵素的切断処理にかけて、天然型の一次構造
をもつ目的のポリペプチドを得ることができる。切断処
理については前述の方法、即ち、メチオニンやトリプト
ファンのC末端側を化学的に切断する方法、また、ファ
クターXa、トロンビン、エンテロキナーゼ、V8プロテア
ーゼ、TEVプロテアーゼ等による酵素的切断を用いるこ
とができる。したがって、本発明はさらに、上記のよう
に形質転換されたバチルス属細菌を培地に培養し、菌体
外に外来ポリペプチド配列を含む融合蛋白質を蓄積せし
め、採取された融合蛋白質を切断し、外来ポリペプチド
を得ることを含む、組換えポリペプチドの製造方法を提
供する。本発明の方法によって製造される組換えポリペ
プチドは、医薬用、診断用、研究用、等に有用である。The fusion protein obtained above is then subjected to a chemical or enzymatic cleavage treatment to obtain a target polypeptide having a natural primary structure. For the cleavage treatment, the above-mentioned method, that is, a method for chemically cleaving the C-terminal side of methionine or tryptophan, or an enzymatic cleavage using factor Xa, thrombin, enterokinase, V8 protease, TEV protease, or the like can be used. . Therefore, the present invention further comprises culturing the bacterium belonging to the genus Bacillus transformed as described above in a medium, accumulating a fusion protein containing a foreign polypeptide sequence outside the cells, cutting the collected fusion protein, and removing the foreign protein. Provided is a method for producing a recombinant polypeptide, comprising obtaining the polypeptide. The recombinant polypeptide produced by the method of the present invention is useful for medicine, diagnosis, research, and the like.

【００３４】[0034]

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
るが、これら実施例により本発明が限定されるものでは
ない。融合蛋白質をコードするDNAを作製するにあたっ
ては、化学合成した順方向および逆方向オリゴヌクレオ
チドのアニーリング、並びにPCR（polymerase chainrea
ction）で増幅したDNA断片をDNAリガーゼを用いたライ
ゲーション反応で連結する手法をとった。本文中、MWPs
pはMWP蛋白質のシグナルペプチドを意味し、MWPmp1, 2,
3, ・・・はMWP成熟蛋白質のＮ末端から順に数えたア
ミノ酸の数が１、２、３、・・・個であることを意味す
る。EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described specifically with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples. In preparing the DNA encoding the fusion protein, annealing of chemically synthesized forward and reverse oligonucleotides, and PCR (polymerase chainrea) were performed.
ction), the DNA fragments were amplified and ligated by a ligation reaction using DNA ligase. In the text, MWPs
p means the signal peptide of MWP protein, MWPmp1, 2,
... means that the number of amino acids counted in order from the N-terminal of the MWP mature protein is 1, 2, 3, ....

【００３５】実施例１ MWPsp-MWPmp10 -(His) ₆-Linker-Met-Proinsu lin融合DNA
を組み込んだベクター（pPINS-1）の構築 （１）DNA断片MWPsp-MWPmp10の取得 a.鋳型DNA バチルス・ブレビス（47-5Q株）より公知の方法（Molec
ular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratoryf(1989)）により抽出したゲ
ノムDNA 840 ng Example 1 MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsu lin fusion DNA
Vector incorporating (pPINS-1) Construction of (1) DNA fragment MWPsp-MWPmp10 acquisition a. Template DNA brevis (47-5Q strain) than known methods (Molec
ular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold
840 ng of genomic DNA extracted by Spring Harbor Laboratoryf (1989))

【００３６】b.プライマー 順方向プライマー: 5' - GTCGTTAACAGTGTATTGCT - 3'
（配列番号６） 逆方向プライマー: 5' - TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTC
TGC - 3'（配列番号７） Yamagata, H.ら（J. Bacteriol.,169, 1239-1245, 198
7）とTsuboi, A.ら（J.Bacteriol.,170, 935-945, 198
8）により決定されたMWP蛋白質の塩基配列をもとに有機
化学合成し、最終濃度0.1 μMとなるように加えた。 c. Taq DNA polymerase 市販の製品（GIBCO BRL社製）５U加えた。B. Primers Forward primer: 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3 '
(SEQ ID NO: 6) Reverse primer: 5'-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTC
TGC-3 '(SEQ ID NO: 7) Yamagata, H. et al. (J. Bacteriol., 169 , 1239-1245, 198)
7) and Tsuboi, A. et al. (J. Bacteriol., 170 , 935-945, 198)
Organic chemical synthesis was performed based on the nucleotide sequence of the MWP protein determined in 8), and added to a final concentration of 0.1 μM. c. Taq DNA polymerase 5 U of a commercially available product (GIBCO BRL) was added.

【００３７】d.その他 Tris-HCｌ（最終濃度20 mＭ、pH 8）、MgCl₂（最終濃度
2.5 mＭ）、dNTPs（dATP, dGTP, dCTP, dTTP がそれぞ
れ最終濃50μＭ）を加えた。A〜dを反応液量100μlとし
て0.5mlチューブに入れて公知の方法（Innis, M. A.
ら、PCR Protocols, A guide to methods and applicat
ions、Academic Press、(1990)）でPCR反応（変性温
度：94℃ - 1 min、アニール温度：55℃ - 1 min、DNA鎖
伸長温度：72℃ - 1 minを１サイクルとして30回繰り返
す）を行った。PCR反応終了後、反応液をフェノールで
濃縮してから0.8%のアガロースゲルにアプライして通常
条件下で電気泳動を行い、ミリポア社のウルトラフリー
C3HでアガロースゲルからPCR産物、即ち、DNA断片MWPsp
-MWPmp10を回収した。回収したPCR産物はフェノール処
理後、エタノール沈殿して真空乾燥し、適量の蒸留水に
溶かして、平滑末端反応を宝酒造社のDNA blunting kit
を使用し、方法は取り扱い説明書に準じて行った。D. Others Tris-HCl (final concentration 20 mM, pH 8), MgCl ₂ (final concentration
2.5 mM) and dNTPs (50 μM each of dATP, dGTP, dCTP, and dTTP at a final concentration of 50 μM). A to d were used in a known method (Innis, MA
PCR Protocols, A guide to methods and applicat
PCR reaction (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 55 ° C-1 min, DNA chain elongation temperature: 72 ° C-1 min, repeated 30 times) with ions, Academic Press, (1990) went. After the PCR reaction is completed, the reaction solution is concentrated with phenol, applied to a 0.8% agarose gel, and subjected to electrophoresis under normal conditions.
PCR product from agarose gel with C3H, ie DNA fragment MWPsp
-MWPmp10 was recovered. The recovered PCR product is treated with phenol, precipitated with ethanol, dried in vacuo, dissolved in an appropriate amount of distilled water, and the blunt-end reaction is performed using Takara Shuzo's DNA blunting kit.
And the method was performed according to the instruction manual.

【００３８】（２）DNA断片(His)₆の取得 遺伝暗号表（Molecular Cloning 2nd ed., A Laborator
y Manual, Cold Spring Harbor Laboratoryf(1989)）に
従って(His)₆をコードする順方向オリゴヌクレオチド5'
- CATCATCATCATCATCAC？ 3'（配列番号８）、逆方向オ
リゴヌクレオチド5'- GTGATGATGATGATGATG - 3'（配列
番号９）を化学合成し、リン酸化反応をニッポンジーン
社のT4 polynucleotide kinaseを使用し、方法は取り扱
い説明書に準じて行った後、10 mM Tris-HCl (pH 8), 5
mM MgCl₂溶液中で95℃５ min処理し、37℃15 minでア
ニールさせた。アニールした二重鎖DNA断片(His)6をフ
ェノール処理後、エタノール沈殿して真空乾燥して適量
の蒸留水に溶かした。(2) Obtaining DNA Fragment (His) ₆ Genetic Code Table (Molecular Cloning 2nd ed., A Laborator)
y, Forward oligonucleotide 5 ′ encoding (His) ₆ according to Cold Spring Harbor Laboratoryf (1989)).
-CATCATCATCATCATCAC? 3 ′ (SEQ ID NO: 8), reverse oligonucleotide 5′-GTGATGATGATGATGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 9) was chemically synthesized, and the phosphorylation was carried out using T4 polynucleotide kinase from Nippon Gene, according to the instruction manual. After that, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 5
The solution was treated at 95 ° C. for 5 minutes in a mM MgCl ₂ solution and annealed at 37 ° C. for 15 minutes. The annealed double-stranded DNA fragment (His) 6 was treated with phenol, precipitated with ethanol, dried in vacuo, and dissolved in an appropriate amount of distilled water.

【００３９】（３）DNA断片Linkerの取得 遺伝暗号表（前掲）に従ってLinker GlySerProValProSe
rGly（配列番号１）をコードする順方向オリゴヌクレオ
チド5'- GGTTCTCCAGTACCTTCTGGA - 3'（配列番号５
３）、逆方向オリゴヌクレオチド5'- TCCAGAAGGTACTGGA
GAACC - 3'（配列番号１０）を化学合成し、（２）の方
法に従ってアニーリングを行い二重鎖DNA断片Linkerを
得た。(3) Acquisition of DNA fragment Linker Linker GlySerProValProSe according to Genetic Code Table (supra)
Forward oligonucleotide 5'-GGTTCTCCAGTACCTTCTGGA-3 'encoding rGly (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 5
3), reverse oligonucleotide 5'-TCCAGAAGGTACTGGA
GAACC-3 '(SEQ ID NO: 10) was chemically synthesized and annealed according to the method of (2) to obtain a double-stranded DNA fragment Linker.

【００４０】（４） DNA断片Proinsulinの取得 以下の点以外は（１）と同様な手順に従って平滑末端化
した DNA断片Proinsulinを取得した。 ・鋳型DNAとして、ヒトプロインスリンDNAを組み込んだ
プラスミドベクター10ngを用いた。ヒトプロインスリン
DNAを組み込んだプラスミドベクターの取得は次のよう
にして行った。市販のヒト膵臓mRNA（CLONTECH社製）よ
りファルマシア社の1st strand cDNA synthesis kitを
用い、取り扱い説明書に従ってヒト膵臓cDNAを合成し
た。このcDNAを鋳型として、Bell, G. I.ら（Nature, 2
8 2, 525-527, (1979)）により決定されたヒトプロイン
スリン遺伝子の塩基配列をもとに合成された順方向プラ
イマー5'-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3'（配列番号１１）、
逆方向プライマー5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3'（配列番
号１２）を用いてPCR反応（条件：94℃ - 1 min, 60℃
- 1 min, 72℃ - 1minを１サイクルとして35サイクル繰
り返す）を行い、得られたPCR産物、即ち、ヒトプロイ
ンスリンDNAをpGEM-Tベクター（Promega社製）にクロー
ニングした。(4) Procurement of DNA fragment Proinsulin A blunt-ended DNA fragment Proinsulin was obtained according to the same procedure as (1) except for the following points. -As a template DNA, 10 ng of a plasmid vector incorporating human proinsulin DNA was used. Human proinsulin
The plasmid vector having the DNA incorporated therein was obtained as follows. Human pancreatic cDNA was synthesized from commercially available human pancreatic mRNA (manufactured by CLONTECH) using a 1st strand cDNA synthesis kit from Pharmacia according to the instruction manual. Using this cDNA as a template, Bell, GI et al. (Nature, 2
8 2, 525-527, (1979)) Forward primer 5'-ATGGCCCTGTGGATGCGCC-3 synthesized based on the nucleotide sequence of the human proinsulin gene determined by '(SEQ ID NO: 11),
PCR reaction using reverse primer 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 12) (conditions: 94 ° C-1 min, 60 ° C)
-1 min, 72 ° C.-1 min, one cycle was repeated 35 cycles), and the obtained PCR product, that is, human proinsulin DNA, was cloned into a pGEM-T vector (Promega).

【００４１】・プライマーとして、順方向プライマー5'
- TTTGTGAACCAACACCTG - 3'（配列番号１３）、逆方向
プライマー5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3'（配列番号１
２）を用いた。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：53℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。As a primer, a forward primer 5 '
-TTTGTGAACCAACACCTG-3 '(SEQ ID NO: 13), reverse primer 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 1)
2) was used.・ Set the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1 min, DNA strand extension temperature: 72 ° C-30 sec)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００４２】（５）DNA断片Met-Proinsulinの取得 以下の点以外は（４）と同様な手順に従って平滑末端化
したDNA断片Met-Proinsulinを取得し、さらにリン酸化
反応（ニッポンジーン社のT4 polynucleotide kinaseを
使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、リン
酸化したDNA断片Met-Proinsulinを得た。 ・鋳型DNAとして、（４）より得られたProinsulin PCR
産物10 nｇを用いた。 ・順方向プライマーとして、5' - ATGTTTGTGAACCAACACC
TG - 3'（配列番号５４）を用いた。(5) Acquisition of DNA fragment Met-Proinsulin A DNA fragment Met-Proinsulin blunt-ended was obtained according to the same procedure as (4) except for the following points, followed by a phosphorylation reaction (T4 polynucleotide kinase from Nippon Gene). And the method according to the instruction manual) to obtain a phosphorylated DNA fragment Met-Proinsulin.・ Proinsulin PCR obtained from (4) as template DNA
10 ng of the product was used.・ 5'-ATGTTTGTGAACCAACACC as forward primer
TG-3 '(SEQ ID NO: 54) was used.

【００４３】（６）MWPsp- MWPmp10-(His)₆融合DNAの取
得 以下の点以外は（１）と同様な手順に従って平滑末端化
した融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆を取得した。 ・鋳型DNAとして、（１）で得られたDNA断片MWPsp-MWPm
p10と（２）で得られたDNA断片(His)₆を適量ずつ混ぜて
宝酒造社のDNA ligation kitで16℃、30分反応させたも
のを用いた。 ・逆方向プライマーとして、5' - GTGATGATGATGATGATG
- 3'（配列番号９）を用いた。(6) Obtaining MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ Fusion DNA A blunt-ended fusion DNA, MWPsp-MWPmp10- (His) _6, was obtained according to the same procedure as (1) except for the following points. -As a template DNA, the DNA fragment MWPsp-MWPm obtained in (1)
An appropriate amount of p10 and the DNA fragment (His) ₆ obtained in (2) were mixed, and the mixture was reacted with Takara Shuzo's DNA ligation kit at 16 ° C for 30 minutes.・ 5'-GTGATGATGATGATGATG as reverse primer
-3 '(SEQ ID NO: 9) was used.

【００４４】・PCRの反応条件（変性温度：94℃ - 1 mi
n、アニール温度：45℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃
-30 secを１サイクルとして25回繰り返す）とした。そ
の後、ニッポンジーン社のT4 polynucleotide kinaseを
用いて取り扱い説明書に従ってPCR産物のリン酸化を行
った。リン酸化したPCR産物は、宝酒造社のDNA ligatio
n kitを用いて制限酵素Hinc IIでカットしたベクター
（STRATAGENE社製、Blue Script SKー）に組み込み、公
知の方法（Molecular Cloning 2nd ed.,A Laboratory M
anual, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)）に従っ
て大腸菌DH5αを形質転換させ、形質転換体からベクタ
ーであるプラスミドDNAを精製した。ベクターの塩基配
列決定用順方向プライマー（M13 forward primer）、あ
るいは逆方向プライマー（M13 reverse preimer）を用
いて塩基配列を決定してMWPsp-MWPmp10-(His)₆融合DNA
ができていることを確認した。次に、MWPsp-MWPmp10-(H
is)₆を組み込んだベクターを鋳型DNAとし、順方向プラ
イマー5' - GTCGTTAACAGTGTATTGCT - 3'（配列番号６）
と逆方向プライマー5'- GTGATGATGATGATGATG -3'（配列
番号９）を用いて上記と同様な方法で第２回目のPCR反
応を行い、平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(Hi
s)₆を取得した。PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 mi
n, annealing temperature: 45 ° C-1 min, DNA strand extension temperature: 72 ° C
-30 sec is defined as one cycle and repeated 25 times). Thereafter, the PCR product was phosphorylated using T4 polynucleotide kinase from Nippon Gene according to the instruction manual. Phosphorylated PCR product is DNA ligatio of Takara Shuzo
The kit was incorporated into a vector (Blue Script SK-, manufactured by STRATAGENE) cut with the restriction enzyme Hinc II using an n kit, and the fragment was inserted in a known manner (Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory M).
E. coli DH5α was transformed according to anual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989), and plasmid DNA as a vector was purified from the transformant. The nucleotide sequence is determined using a forward primer (M13 forward primer) or a reverse primer (M13 reverse preimer) for determining the nucleotide sequence of the vector, and the MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ fusion DNA is determined.
I confirmed that it was done. Next, MWPsp-MWPmp10- (H
is) Using the vector incorporating ₆ as a template DNA, forward primer 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3 '(SEQ ID NO: 6)
And a reverse primer 5′-GTGATGATGATGATGATG-3 ′ (SEQ ID NO: 9), a second PCR reaction was performed in the same manner as described above, and the blunt-ended fusion DNA, MWPsp-MWPmp10- (Hi
s) We got ₆ .

【００４５】（７）MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker融合D
NAの取得 以下の点以外は（６）と同様な手順に従って平滑末端化
した融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linkerを取得し
た。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、（６）で得られた
融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆と（３）で得られたDNA
断片Linkerを適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA ligation k
itで16℃、30分反応させたものを使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして5'- TCC
AGAAGGTACTGGAGAACC -3'（配列番号１０）を使用した。(7) MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker fusion D
Acquisition of NA A blunt-ended fusion DNA, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker, was obtained according to the same procedure as (6) except for the following points. • As the template DNA for the first PCR reaction, the fusion DNA obtained in (6), MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ and the DNA obtained in (3)
Mix the appropriate amount of Fragment Linker and add DNA ligation k of Takara Shuzo
It was used at 16 ° C. for 30 minutes. -5'-TCC as a reverse primer for the first PCR reaction
AGAAGGTACTGGAGAACC-3 '(SEQ ID NO: 10) was used.

【００４６】（８）MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-
Proinsulin融合DNAを組み込んだベクターの取得 以下の点以外は（６）と同様な手順に従って融合体MWPs
p-MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinが組み込まれ
たベクター（pPINS-1）を取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、（７）で得られた
融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker と（5）で得ら
れたDNA断片Met-Proisulinを適量ずつ混ぜて宝酒造社の
DNA ligation kitで16℃、30分反応させたものを使用し
た。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'-CT
AGTTGCAGTAGTTCTCC-3'（配列番号１２）を使用した。(8) MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-
Acquisition of vector containing Proinsulin fusion DNA Fusion MWPs
A vector (pPINS-1) incorporating p-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin was obtained. -As the template DNA for the first PCR reaction, mix the appropriate amount of the fusion DNA obtained in (7), MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker, and the DNA fragment Met-Proisulin obtained in (5), respectively. Company
A DNA ligation kit that had been reacted at 16 ° C. for 30 minutes was used. -5'-CT as a reverse primer for the first PCR reaction
AGTTGCAGTAGTTCTCC-3 '(SEQ ID NO: 12) was used.

【００４７】実施例２ MWPsp-MWPmp6- , 8-, 9-, 11-, 12-, 15-, 40-, 50-, 10
0-( His) ₆-Linker-Met-Pr oinsulin融合DNAを組み込んだ
ベクターの構築 （１）DNA断片MWPsp-MWPmp6, 8, 9, 11, 12, 15, 40, 5
0, 100の取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化した DNA断片MWPsp-MWPmp6, 8, 9, 11, 12,
15, 40, 50, 100を取得した。 Example 2 MWPsp-MWPmp6- , 8-, 9-, 11-, 12-, 15-, 40-, 50-, 10
Construction of vector incorporating 0- ( His) ₆ -Linker-Met- Proinsulin fusion DNA (1) DNA fragment MWPsp-MWPmp6, 8, 9, 11, 12, 15, 40, 5
Acquisition of 0, 100 DNA fragments MWPsp-MWPmp6, 8, 9, 11, 12, and blunt-ended according to the same procedure as in Example 1, (1) except for the following points
Acquired 15, 40, 50, 100.

【００４８】・逆方向プライマーとして、以下のものを
それぞれ用いた。 MWPmp6 : 5'-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3'（配列番号１４） MWPmp8 : 5'-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3'（配列番号１５） MWPmp9 : 5'-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3'（配列番号１６） MWPmp11 : 5'-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3'（配列番号１７） MWPmp12 : 5'-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3'（配列番号１８） MWPmp15 : 5'-ATCAGCGTCCATTTTTGG-3'（配列番号１９） MWPmp40 : 5'-GTCTACACCGTATTCGCCGT-3'（配列番号２
０） MWPmp50 : 5'-AGTAGCGAACTCTGCACGAG-3'（配列番号２
１） MWPmp100: 5'-AGATTTGTCCGGGAAACCTT-3'（配列番号２
２） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：45℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 1 min
を１サイクルとして30回繰り返す）とした。The following primers were used, respectively. MWPmp6: 5'-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 14) MWPmp8: 5'-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3' (SEQ ID NO: 15) MWPmp9: 5'-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3 '(SEQ ID NO: 16) MWPmp11: 5'-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3 '(SEQ ID NO: 17) MWPmp12: 5'-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3' (SEQ ID NO: 18) MWPmp15: 5'-ATCAGCGTCCATTTTTGG-3 '(SEQ ID NO: 19) MWPmp40: 5'-GTCTACACCGTATTCGCCGT-3' (SEQ ID NO: 2)
0) MWPmp50: 5'-AGTAGCGAACTCTGCACGAG-3 '(SEQ ID NO: 2)
1) MWPmp100: 5'-AGATTTGTCCGGGAAACCTT-3 '(SEQ ID NO: 2
2) ・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 45 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-1 min)
Is repeated as one cycle for 30 times).

【００４９】（２）DNA断片(His)₆-Linker-Met-Proinsu
linの取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化したDNA断片(His)₆-Linker-Met-Proinsulin
を取得し、さらにリン酸化反応（ニッポンジーン社のT4
polynucleotide kinaseを使用し、方法は取り扱い説明
書に準じた）を行い、リン酸化したDNA断片(His)₆-Link
er-Met-Proinsulinを得た。 ・鋳型DNAとして、実施例１の（８）で取得したMWPsp-M
WPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsulin融合DNAを組み込
んだベクター、pPINS-1 10ngを用いた。(2) DNA fragment (His) ₆ -Linker-Met-Proinsu
Acquisition of lin DNA fragment (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin blunt-ended according to the same procedure as (1) of Example 1 except for the following points
And then perform a phosphorylation reaction (Nippon Gene T4
Phosphorylated DNA fragment (His) using polynucleotide kinase and the method according to the instruction manual) ₆ -Link
er-Met-Proinsulin was obtained. -As a template DNA, MWPsp-M obtained in (8) of Example 1
A vector into which WPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin fusion DNA had been integrated, 10 ng of pPINS-1 was used.

【００５０】・プライマーとして、以下のものを用い
た。 順方向プライマー：5'-CATCATCATCATCATCAC-3'（配列番
号８） 逆方向プライマー：5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTC-3'（配列番
号２３） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：47℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。The following primers were used. Forward primer: 5'-CATCATCATCATCATCAC-3 '(SEQ ID NO: 8) Reverse primer: 5'-CTAGTTGCAGTAGTTCTC-3' (SEQ ID NO: 23) : 47 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-30 sec
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００５１】（３）MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 11-, 12-,
15-, 40-, 50-, 100-(His)₆-Linker-Met-Proinsulin融
合DNAを組み込んだベクターの取得 以下の点以外は実施例１の（８）と同様な手順に従って
MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 11-, 12-, 15-, 40-, 50-, 10
0-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinの融合DNAが組み込ま
れたベクターを取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、上記（１）で得ら
れたDNA断片MWPsp-MWPmp6〜 100と、上記（２）で得ら
れたDNA断片(His)₆-Linker-Met-Proinsulinを適量ずつ
混ぜて宝酒造社のDNA ligation kitで16℃30分反応させ
たものを使用した。(3) MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 11-, 12-,
Acquisition of vector incorporating 15-, 40-, 50-, 100- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin fusion DNA According to the same procedure as (8) of Example 1 except for the following points
MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 11-, 12-, 15-, 40-, 50-, 10
A vector into which the fusion DNA of 0- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin was integrated was obtained. -Appropriate amounts of the DNA fragment MWPsp-MWPmp6-100 obtained in the above (1) and the DNA fragment (His) _6- Linker-Met-Proinsulin obtained in the above (2) as template DNA for the first PCR reaction These were mixed and reacted at 16 ° C. for 30 minutes using a DNA ligation kit manufactured by Takara Shuzo.

【００５２】実施例３ MWPsp-MWPmp10 -Met-Proinsulin融合DNAを組み込んだベ
クター（pPINS-2）の構築 以下の点以外は実施例１の（８）と同様な手順に従って
MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulinの融合DNAが組み込まれ
たベクター（pPINS-2）を取得した。 ・第１回目のPCR反応の鋳型DNAとして、実施例１の
（１）で得られたDNA断片MWPsp-MWPmp10と実施例１の
（５）で得られたDNA断片Met-Proisulinを適量ずつ混ぜ
て宝酒造社のDNA ligation kitで16℃、30分反応させた
ものを使用した。 Example 3 A vector incorporating MWPsp-MWPmp10- Met-Proinsulin fusion DNA
Construction of the vector (pPINS-2) Following the same procedure as in (8) of Example 1 except for the following points
A vector (pPINS-2) into which the fusion DNA of MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulin was integrated was obtained. As the template DNA for the first PCR reaction, mix appropriate amounts of the DNA fragment MWPsp-MWPmp10 obtained in Example 1 (1) and the DNA fragment Met-Proisulin obtained in Example 1 (5). The reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes using a DNA ligation kit from Takara Shuzo Co., Ltd.

【００５３】実施例４ MWPsp-MWPmp1- , 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11
-, 1 2-, 13-, 14-, 15-,17-, 20- , 50 -Met-Proinsulin
融合DNAを組み込んだベクターの構築 （１）DNA断片MWPsp-MWPmp1, 2, 3, 4, 5, 7, 13, 14,
17, 20 の取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化した DNA断片MWPsp-MWPmp1, 2, 3, 4, 5, 7,
13, 14, 17, 20 を取得した。[0053]Example 4 MWPsp-MWPmp1- , 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11
-, 1 2-, 13-, 14-, 15-, 17-, 20- , 50 -Met-Proinsulin
Construction of vector incorporating fusion DNA (1) DNA fragment MWPsp-MWPmp1, 2, 3, 4, 5, 7, 13, 14,
Acquisition of 17, 20 According to the same procedure as (1) of Example 1 except for the following points
Blunt-ended DNA fragment MWPsp-MWPmp1, 2, 3, 4, 5, 7,
 13, 14, 17, and 20 were acquired.

【００５４】・逆方向プライマーとして、以下のものを
それぞれ用いた。 MWPmp1 : 5'-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3'（配列番号２４） MWPmp2 : 5'-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3'（配列番号２５） MWPmp3 : 5'-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3'（配列番号２６） MWPmp4 : 5'-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3'（配列番号２７） MWPmp5 : 5'-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3'（配列番号２８） MWPmp7 : 5'-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3'（配列番号２９） MWPmp13 : 5'-GTCCATTTTTGGAGCTGT-3'（配列番号３０） MWPmp14 : 5'-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3'（配列番号３１） MWPmp17 : 5'-TTCCATATCAGCGTCCAT-3'（配列番号３２） MWPmp20 : 5'-TACGGTTTTTTCCATATCAGC-3'（配列番号３
３） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：45℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 1 min
を１サイクルとして30回繰り返す）とした。The following primers were used respectively. MWPmp1: 5'-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3 '(SEQ ID NO: 24) MWPmp2: 5'-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3' (SEQ ID NO: 25) MWPmp3: 5'-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3 '(SEQ ID NO: 26) MWPmp4: 5'-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3 '(SEQ ID NO: 27) MWPmp5: 5'-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 28) MWPmp7: 5'-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3 '(SEQ ID NO: 29) MWPmp13: 5'-GTCCATTTTTGGAGCTGT-3' (SEQ ID NO: 30) MWPmp14: 5'-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 31) MWPmp17: 5'-TTCCATATCAGCGTCCAT-3' (SEQ ID NO: 32) MWPmp20: 5'-TACGGTTTTTTCCATATCAGC-3 '(SEQ ID NO: 3)
3) ・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 45 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-1 min)
Is repeated as one cycle for 30 times).

【００５５】（２）MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6
-, 7-, 8-, 9-, 11-, 12-, 13-, 14-,15-, 17-, 20-, 5
0-Met-Proinsulin融合DNAを組み込んだベクターの取得 以下の点以外は実施例１の（８）と同様な手順に従って
MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11
-, 12-, 13-, 14-, 15-, 17-, 20-, 50-Met-Proinsulin
の融合DNAが組み込まれたベクターを取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、実施例２の
（１）、および上記（１）で得られたDNA断片MWPsp-MWP
mp1〜−MWPmp50と、実施例１の（５）で得られたDNA断
片Met-Proinsulinを適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA liga
tion kitで16℃、30分反応させたものを使用した。(2) MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6
-, 7-, 8-, 9-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 17-, 20-, 5
Obtaining a Vector Incorporating 0-Met-Proinsulin Fusion DNA According to the same procedure as (8) of Example 1 except for the following points
MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 11
-, 12-, 13-, 14-, 15-, 17-, 20-, 50-Met-Proinsulin
To obtain a vector in which the fusion DNA was integrated. -The DNA fragment MWPsp-MWP obtained in (1) of Example 2 and (1) above as a template DNA for the first PCR reaction
mp1 to -MWPmp50 and the DNA fragment Met-Proinsulin obtained in (5) of Example 1 were mixed in appropriate amounts, and DNA liga of Takara Shuzo was mixed.
The reaction kit was reacted at 16 ° C for 30 minutes.

【００５６】実施例５ MWPsp-Proinsu lin融合DNAを組み込んだベクターの構築 （１）DNA断片MWPspの取得 以下の点以外は、実施例１の（１）と全く同様な手順に
従って平滑末端化したDNA断片MWPspを取得した。 ・PCR反応の逆方向プライマーとして、5' - TGCGAAAGCC
ATTGGAGCAAC - 3'（配列番号３４）を用いた。 Example 5 Construction of Vector Incorporating MWPsp-Proinsulin Fusion DNA (1) Obtaining DNA Fragment MWPsp DNA blunt-ended according to exactly the same procedure as (1) in Example 1 except for the following points Fragment MWPsp was obtained.・ 5'-TGCGAAAGCC as reverse primer for PCR reaction
ATTGGAGCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 34) was used.

【００５７】（２）MWPsp-Proinsulin融合DNAを組み込
んだベクターの取得 以下の点以外は実施例１の（８）と同様な手順に従って
MWPsp-Proinsulin融合DNAが組み込まれたベクターを取
得した。 ・第１回目のPCR反応の鋳型DNAとして、上記（１）で得
られたDNA断片MWPspと実施例１の（４）で得られた平滑
末端化DNA断片Proisulinをリン酸化したもの適量ずつ混
ぜて宝酒造社のDNA ligation kitで16℃、30分反応させ
たものを使用した。(2) Obtaining a Vector Incorporating the MWPsp-Proinsulin Fusion DNA According to the same procedure as in (8) of Example 1, except for the following points:
A vector into which the MWPsp-Proinsulin fusion DNA was integrated was obtained. -As a template DNA for the first PCR reaction, mix the DNA fragment MWPsp obtained in (1) above and the blunt-ended DNA fragment Proisulin obtained in (4) of Example 1 in appropriate amounts, and mix them. The reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes using a DNA ligation kit from Takara Shuzo Co., Ltd.

【００５８】実施例６ MWPsp-Somatos tatin 28, MWPsp-MWPmp10-(His) ₆-EGF-TE
V-Somatostatin 28, MWPsp-MWPm p10-(His) ₆-TEV-Somato
stati n 28, MWPsp-MWPmp20-(His) ₆-EGF-TEV-Somatostat
in 28（p STN）の各融合DNAを組み込んだベクタ- の構築 （１）DNA断片Somatostatin 28の取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化したDNA断片Somatostatin 28を取得し、さら
にリン酸化反応（ニッポンジーン社のT4 polynucleotid
e kinaseを使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を
行い、リン酸化したDNA断片Somatostatin 28を得た。 Example 6 MWPsp-Somatos tatin 28, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF -TE
V-Somatostatin 28, MWPsp-MWPm p10- (His) ₆ -TEV-Somato
stati n 28, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF -TEV-Somatostat
Construction of vector incorporating each fusion DNA of in 28 (p STN) (1) Acquisition of DNA fragment Somatostatin 28 DNA fragment Somatostatin blunt-ended according to the same procedure as (1) of Example 1 except for the following points 28, and a phosphorylation reaction (T4 polynucleotid
e kinase was used, and the method was followed according to the instruction manual) to obtain a phosphorylated DNA fragment Somatostatin 28.

【００５９】・鋳型DNAとして、Shen, L. -P.ら（Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.,79, 4575-4579, 1982）によ
り決定された塩基配列をもとに有機合成したヒトソマト
スタチン28一本鎖DNA： 5'−TCTGCTAACTCAAACCCGGCTATG
GCACCCCGAGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTT
CACATCCTGTTAG−3'（配列番号５５）を10 ng用いた。 ・プライマーとして、以下のものを用いた。 順方向プライマー：5'-TCTGCTAACTCAAACCCG-3'（配列番
号３５） 逆方向プライマー：5'-CTAACAGGATGTGAAAGTCTT-3'（配
列番号３６） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：50℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 10 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。As a template DNA, Shen, L.-P. et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 79 , 4575-4579, 1982). Human somatostatin 28 single-stranded DNA synthesized organically based on the nucleotide sequence determined by 5'-TCTGCTAACTCAAACCCGGCTATG.
GCACCCCGAGAACGCAAAGCTGGCTGCAAGAATTTCTTCTGGAAGACTTT
10 ng of CACATCCTGTTAG-3 ′ (SEQ ID NO: 55) was used. -The following primers were used. Forward primer: 5'-TCTGCTAACTCAAACCCG-3 '(SEQ ID NO: 35) Reverse primer: 5'-CTAACAGGATGTGAAAGTCTT-3' (SEQ ID NO: 36) PCR conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature) : 50 ℃-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ℃-10 sec
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００６０】（２）DNA断片EGFの取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化したDNA断片EGFを取得し、さらにリン酸化反
応（ニッポンジーン社のT4 polynucleotide kinaseを使
用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、リン酸
化したDNA断片EGFを得た。(2) Preparation of DNA fragment EGF A blunt-ended DNA fragment EGF was obtained according to the same procedure as in (1) of Example 1 except for the following points, and further subjected to a phosphorylation reaction (T4 polynucleotide kinase from Nippon Gene). Was used and the method was according to the instruction manual) to obtain a phosphorylated DNA fragment EGF.

【００６１】・鋳型DNAとして、Bell, G. I.ら（Nuclei
c Acids Res., 14, 8427-8446, 1986）により決定され
たヒト上皮細胞増殖因子の塩基配列をもとに有機合成し
たヒト上皮細胞増殖因子（EGF）一本鎖DNA：5'−AACTCT
GACTCCGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTATTGCCTGCATGATGGTGT
TTGTATGTATATCGAAGCTCTGGACAAATATGCTTGCAACTGTGTTGTTG
GTTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTATCGCGACCTGAAATGGTGGGAACTG
CGT−3'（配列番号５６）を10 ng用いた。 ・プライマーとして、以下のものを用いた。 順方向プライマー：5'-AACTCTGACTCCGAATGC-3'（配列番
号３７） 逆方向プライマー：5'-ACGCAGTTCCCACCATTT-3'（配列番
号３８） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：50℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 15 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。As a template DNA, Bell, GI et al. (Nuclei
c Acids Res., 14 , 8427-8446, 1986) Human epidermal growth factor (EGF) single-stranded DNA synthesized organically based on the base sequence of human epidermal growth factor: 5'-AACTCT
GACTCCGAATGCCCGCTGTCTCACGACGGTTATTGCCTGCATGATGGTGT
TTGTATGTATATCGAAGCTCTGGACAAATATGCTTGCAACTGTGTTGTTG
GTTACATCGGTGAGCGTTGCCAGTATCGCGACCTGAAATGGTGGGAACTG
10 ng of CGT-3 ′ (SEQ ID NO: 56) was used. -The following primers were used. Forward primer: 5'-AACTCTGACTCCGAATGC-3 '(SEQ ID NO: 37) Reverse primer: 5'-ACGCAGTTCCCACCATTT-3' (SEQ ID NO: 38) : 50 ℃-1 min, DNA strand extension temperature: 72 ℃-15 sec
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００６２】（３）DNA断片TEVの取得 遺伝暗号表（前述）に従ってTEVプロテアーゼにより認
識されるアミノ酸配列をコードする順方向オリゴヌクレ
オチド5'-GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA -
3'（配列番号５７）、逆方向オリゴヌクレオチド、5'-
TTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC - 3'（配
列番号５８）を化学合成し、実施例１の（２）の方法に
従ってアニーリングを行い二重鎖DNA断片TEVを得た。(3) Obtaining a DNA fragment TEV A forward oligonucleotide 5′-GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA encoding an amino acid sequence recognized by a TEV protease according to the Genetic Code Table (described above)
3 '(SEQ ID NO: 57), reverse oligonucleotide, 5'-
TTGGAAGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC-3 ′ (SEQ ID NO: 58) was chemically synthesized and annealed according to the method of Example 1, (2) to obtain a double-stranded DNA fragment TEV.

【００６３】（４）MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGF融合DNA
の取得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGFを
取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、実施例１の（６）
で得られた融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆と上記
（２）で得られたDNA断片EGFを適量ずつ混ぜて宝酒造社
のDNA ligation kitで16℃、30分反応させたものを使用
した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'- A
CGCAGTTCCCACCATTT- 3'（配列番号３８）を使用した。(4) MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF fusion DNA
Obtainment The blunt-ended fusion DNA, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF, was obtained according to the same procedure as in (1) of Example 1 except for the following points. -As a template DNA for the first PCR reaction, (6) of Example 1
The fusion DNA obtained in the above, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ and the DNA fragment EGF obtained in the above (2) were mixed in appropriate amounts and reacted with a DNA ligation kit from Takara Shuzo at 16 ° C. for 30 minutes. did. • 5'-A as a reverse primer for the first PCR reaction
CGCAGTTCCCACCATTT-3 '(SEQ ID NO: 38) was used.

【００６４】（５）MWPsp-MWPmp10-(His)₆-TEV融合DNA
の取得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-TEVを
取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、実施例１の（６）
で得られた融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆と上記
（３）で得られたDNA断片TEVを適量ずつ混ぜて宝酒造社
のDNA ligation kitで16℃、30分反応させたものを使用
した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'- T
TGGAAGTACAGGTTTTC- 3'（配列番号３９）を使用した。(5) MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -TEV fusion DNA
Obtainment A blunt-ended fusion DNA, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -TEV, was obtained according to the same procedure as (6) in Example 1 except for the following points. -As a template DNA for the first PCR reaction, (6) of Example 1
Using the fusion DNA obtained in the above, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ and the DNA fragment TEV obtained in the above (3) in appropriate amounts and reacting at 16 ° C. for 30 minutes with a DNA ligation kit from Takara Shuzo Co., Ltd. did. • 5'-T as a reverse primer for the first PCR reaction
TGGAAGTACAGGTTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 39) was used.

【００６５】（６）MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGF-TEV融合
DNAの取得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGF-TE
Vを取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、上記（４）で得ら
れた融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGFと上記（３）
で得られたDNA断片TEVを適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA
ligation kitで16℃、30分反応さたものを使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'-TT
GGAAGTACAGGTTTTC- 3'（配列番号３９）を使用した。(6) MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF-TEV fusion
Acquisition of DNA MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF-TE A blunt-ended fusion DNA according to the same procedure as in (1) of Example 1 except for the following points
I got V. -The fusion DNA obtained in the above (4), MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF and the above (3) as template DNAs for the first PCR reaction
Mix the DNA fragment TEV obtained in
The reaction was performed at 16 ° C for 30 minutes using a ligation kit.・ 5'-TT as a reverse primer for the first PCR reaction
GGAAGTACAGGTTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 39) was used.

【００６６】（７）MWPsp-MWPmp20-(His)₆融合DNAの取
得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆を取得
した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、実施例４の（１）
で得られたDNA断片、MWPsp-MWPmp20と実施例１の（２）
で得られたDNA断片(His)6を適量ずつ混ぜて宝酒造社のD
NA ligation kitで16℃、30分反応させたものを使用し
た。(7) Obtaining the MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ fusion DNA The fusion DNA blunt-ended according to the same procedure as (6) of Example 1 except for the following points, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ I got -As a template DNA for the first PCR reaction, (1) of Example 4
DNA fragment obtained in the above, MWPsp-MWPmp20 and Example 1 (2)
Mix the DNA fragment (His) 6 obtained in
The reaction was carried out at 16 ° C for 30 minutes using a NA ligation kit.

【００６７】（８）MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF融合DNA
の取得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGFを
取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、上記（７）で得ら
れた融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆と上記（２）で得
られたDNA断片EGFを適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA liga
tion kitで16℃、30分反応させたものを使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'- A
CGCAGTTCCCACCATTT- 3'（配列番号３８）を使用した。(8) MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF fusion DNA
Obtainment A blunt-ended fusion DNA, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF, was obtained according to the same procedure as in (1) of Example 1 except for the following points. -As the template DNA for the first PCR reaction, mix the appropriate amount of the fusion DNA obtained in (7) above, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ and the DNA fragment EGF obtained in (2) above, and DNA liga
The reaction kit was reacted at 16 ° C for 30 minutes. • 5'-A as a reverse primer for the first PCR reaction
CGCAGTTCCCACCATTT-3 '(SEQ ID NO: 38) was used.

【００６８】（９）MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV融合
DNAの取得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TE
Vを取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、上記（８）で得ら
れた融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGFと上記（３）
で得られたDNA断片TEVを適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA
ligation kitで16℃、30分反応させたものを使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'- T
TGGAAGTACAGGTTTTC- 3'（配列番号３９）を使用した。(9) MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV fusion
Obtaining DNA Fusion DNA blunt-ended according to the same procedure as (6) of Example 1 except for the following points, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TE
I got V. -The fusion DNA obtained in the above (8), MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF and the above (3) as template DNAs for the first PCR reaction
Mix the DNA fragment TEV obtained in
The reaction was carried out at 16 ° C for 30 minutes using a ligation kit. • 5'-T as a reverse primer for the first PCR reaction
TGGAAGTACAGGTTTTC-3 ′ (SEQ ID NO: 39) was used.

【００６９】（10） MWPsp-Somatostatin 28, MWPsp-MW
Pmp10-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin28, MWPsp-MWPmp10
-(His)₆-TEV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp20-(His)6-
EGF-TEV-Somatostatin 28融合DNAを組み込んだベクター
の取得 以下の点以外は全く実施例１の（８）と同様な手順に従
って各融合DNA、MWPsp-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp1
0-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp10-(H
is)₆-TEV-Somatostatin 28,MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-
TEV-Somatostatin 28が組み込まれたベクターを取得し
た。(10) MWPsp-Somatostatin 28, MWPsp-MW
Pmp10- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin28, MWPsp-MWPmp10
-(His) ₆ -TEV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp20- (His) 6-
Acquisition of EGF-TEV-Somatostatin 28 fusion DNA-integrated vector Except for the following points, each fusion DNA, MWPsp-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp1 was prepared according to the same procedure as in Example 1 (8).
0- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp10- (H
is) ₆ -TEV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-
A vector incorporating TEV-Somatostatin 28 was obtained.

【００７０】・第１回目のPCR反応の鋳型DNAとして、MW
Psp-Somatostatin 28については、実施例５の（１）で
得られたDNA断片MWPspと上記（１）で得られたDNA断片S
omatostatin 28とを、またMWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGF-T
EV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp10-(His)₆-TEV-Somat
ostatin28,MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatostati
n 28については、DNA断片Somatostatin 28と、上記
（５）、（６）、（９）で得られた融合DNA、MWPsp-MWP
mp10-(His)₆-TEV, MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGF-TEV,MWPs
p-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEVとを、それぞれ適量ずつ混ぜ
て宝酒造社のDNAligatioｎ kitで16℃、30分反応させて
得られたものを使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'-CT
AACAGGATGTGAAAGTCTT-3'（配列番号３６）を使用した。The MW was used as the template DNA for the first PCR reaction.
For Psp-Somatostatin 28, the DNA fragment MWPsp obtained in (1) of Example 5 and the DNA fragment S obtained in (1) above were used.
omatostatin 28 and also MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF-T
EV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -TEV-Somat
ostatin28, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostati
Regarding n28, the DNA fragment Somatostatin 28 and the fusion DNA obtained in the above (5), (6) and (9), MWPsp-MWP
mp10- (His) ₆ -TEV, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF-TEV, MWPs
A mixture obtained by mixing p-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV with an appropriate amount and reacting with a DNAligation kit from Takara Shuzo at 16 ° C. for 30 minutes was used. -5'-CT as a reverse primer for the first PCR reaction
AACAGGATGTGAAAGTCTT-3 ′ (SEQ ID NO: 36) was used.

【００７１】実施例７ MWPsp-Glucago n, MWPsp-MWPmp10-(His) ₆-Li nker-V8-Glu
cagon, MWPsp-MWPmp20-(His) ₆-Linker-V8-Glucagon（pG
CN）, MWPsp-MWPmp30 -(His) ₆-Linker-V8-Glucagon 融合D
NAを組み込んだベクタ- の構築 （１）DNA断片Glucagonの取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化したDNA断片Glucagonを取得し、さらにリン
酸化反応（ニッポンジーン社のT4 polynucleotide kina
seを使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、
リン酸化したDNA断片Glucagonを得た。 Example 7 MWPsp-Glucagon , MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-V8-Glu
cagon, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon (pG
CN), MWPsp-MWPmp30- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon fusion D
Construction of Vector Incorporating NA (1) Acquisition of DNA Fragment Glucagon Except for the following points, a blunt-ended DNA fragment Glucagon was obtained according to the same procedure as (1) in Example 1, and a phosphorylation reaction (Nippon Gene) was performed. T4 polynucleotide kina
using se, the method is according to the instruction manual),
A phosphorylated DNA fragment Glucagon was obtained.

【００７２】・鋳型DNAとして、Drucker, D. J.ら（J.
Biol. Chem., 263, 13475-13478, 1988）により決定さ
れたヒトグルカゴンの塩基配列をもとに有機合成したヒ
トグルカゴン一本鎖DNA： 5'- CACAGCCAAGGTACTTTCACAT
CCGACTACTCTAAATATCTGGATTCCCGTCGCGCTCAAGATTTCGTTCAA
TGGCTGATGAACACT-3'（配列番号５９）を10 ng用いた。 ・プライマーとして、以下のものを用いた。 順方向プライマー：5'-CACAGCCAAGGTACTTTC-3'（配列番
号４０） 逆方向プライマー：5'-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3'（配
列番号４１） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：50℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 10 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。As the template DNA, Drucker, DJ et al. (J.
Biol. Chem., 263 , 13475-13478, 1988) Single-stranded human glucagon DNA synthesized organically based on the nucleotide sequence of human glucagon: 5'-CACAGCCAAGGTACTTTCACAT
CCGACTACTCTAAATATCTGGATTCCCGTCGCGCTCAAGATTTCGTTCAA
10 ng of TGGCTGATGAACACT-3 '(SEQ ID NO: 59) was used. -The following primers were used. Forward primer: 5'-CACAGCCAAGGTACTTTC-3 '(SEQ ID NO: 40) Reverse primer: 5'-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3' (SEQ ID NO: 41) : 50 ℃-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ℃-10 sec
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００７３】（２）DNA断片V8-Glucagonの取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化したDNA断片V8-Glucagonを取得し、さらにリ
ン酸化反応（ニッポンジーン社のT4 polynucleotide ki
naseを使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行
い、リン酸化したDNA断片V8-Glucagonを得た。(2) Acquisition of DNA Fragment V8-Glucagon A blunt-ended DNA fragment V8-Glucagon was obtained according to the same procedure as in (1) of Example 1 except for the following points, and a phosphorylation reaction (Nippon Gene Co., Ltd.) T4 polynucleotide ki
Using nase, the method was in accordance with the instruction manual) to obtain a phosphorylated DNA fragment V8-Glucagon.

【００７４】・鋳型DNAとして、上記（１）で得られた
ヒトグルカゴンDNA、10 ngを用いた。 ・プライマーとして、以下のものを用いた。 順方向プライマー：5'-TTCCTGGAACACAGCCAA-3'（配列番
号４２） 逆方向プライマー：5'-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3'（配
列番号４１） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：50℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 10 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。As the template DNA, 10 ng of the human glucagon DNA obtained in the above (1) was used. -The following primers were used. Forward primer: 5'-TTCCTGGAACACAGCCAA-3 '(SEQ ID NO: 42) Reverse primer: 5'-TTAAGTGTTCATCAGCCATTG-3' (SEQ ID NO: 41) : 50 ℃-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ℃-10 sec
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００７５】（３）DNA断片MWPsp-MWPmp30の取得 以下の点以外は実施例１の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化した DNA断片MWPsp-MWPmp30を取得した。 ・逆方向プライマーとして、5'-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-
3'（配列番号４３）を用いた。(3) Obtaining DNA Fragment MWPsp-MWPmp30 A blunt-ended DNA fragment MWPsp-MWPmp30 was obtained in the same manner as in (1) of Example 1 except for the following points. -As a reverse primer, 5'-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-
3 ′ (SEQ ID NO: 43) was used.

【００７６】（４）MWPsp-MWPmp30-(His)₆融合DNAの取
得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp30-(His)6を取得
した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、上記（３）で得ら
れた融合DNA、MWPsp-MWPmp30と実施例１の（２）で得ら
れたDNA断片(His)₆を適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA lig
ation kitで16℃30分反応させたものを使用した。(4) Obtaining the MWPsp-MWPmp30- (His) ₆ Fusion DNA The fusion DNA blunt-ended according to the same procedure as (6) in Example 1 except for the following points, MWPsp-MWPmp30- (His) 6 I got -As the template DNA for the first PCR reaction, mix the appropriate amount of the fusion DNA obtained in (3) above, MWPsp-MWPmp30, and the DNA fragment (His) ₆ obtained in (2) of Example 1 to produce Takara Shuzo Co., Ltd. DNA lig
The reaction was performed at 16 ° C. for 30 minutes using an ation kit.

【００７７】（５）MWPsp-MWPmp20-, 30-(His)₆-Linker
融合DNAの取得 以下の点以外は実施例１の（６）と同様な手順に従って
平滑末端化した融合DNA、MWPsp-MWPmp20-, 30-(His)₆-L
inkerを取得した。 ・第１回目PCR反応の鋳型DNAとして、実施例１の（３）
で得られたDNA断片Linkerに対して、実施例６の（７）
で得られた融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆、上記
（４）で得られた融合DNA、MWPsp-MWPmp30-(His)₆をそ
れぞれ適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA ligation kitで16
℃、30分反応させたものを使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'- T
CCAGAAGGTACTGGAGAACC- 3'（配列番号１０）を使用し
た。(5) MWPsp-MWPmp20-, 30- (His) ₆ -Linker
Obtainment of fusion DNA MWPsp-MWPmp20-, 30- (His) ₆ -L, blunt-ended fusion DNA according to the same procedure as in Example 1, (6) except for the following points
got inker. -As a template DNA for the first PCR reaction, (3) of Example 1
Against the DNA fragment Linker obtained in (6) in Example 6 (7)
The fusion DNA obtained in the above, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ and the fusion DNA obtained in the above (4), MWPsp-MWPmp30- (His) ₆ are mixed in appropriate amounts, respectively, and mixed with Takara Shuzo's DNA ligation kit.
What reacted at 30 degreeC and 30 minutes was used. • 5'-T as a reverse primer for the first PCR reaction
CCAGAAGGTACTGGAGAACC-3 '(SEQ ID NO: 10) was used.

【００７８】（６）MWPsp-Glucagon, MWPsp-MWPmp10-,
20-, 30-(His)₆-Linker-V8-Glucagon融合DNAを組み込ん
だベクターの取得 以下の点以外は全く実施例１の（８）と同様な手順に従
って融合DNA、MWPsp-Glucagon、 MWPsp-MWPmp10-, 20-,
30-(His)₆-Linker-V8-Glucagonが組み込まれたベクタ
ーを取得した。 ・第１回目のPCR反応の鋳型DNAとして、MWPsp-Glucagon
については、実施例５の（１）で得られたDNA断片MWPsp
と上記（１）で得られたDNA断片Glucagon、MWPsp-MWPmp
10-, 20-, 30-(His)₆-Linker-V8-Glucagonについては、
上記（２）で得られたDNA断片V8-Glucagonに対して、実
施例１の（７）で得られた融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(Hi
s)₆-Linker、上記（５）で得られた融合DNA、MWPsp-MWP
mp20-, 30-(His)₆-Linkerをそれぞれ適量ずつ混ぜて宝
酒造社のDNA ligation kitで16℃、30分反応させたもの
を使用した。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5'-TT
AAGTGTTCATCAGCCATTG-3'（配列番号４１）を使用した。(6) MWPsp-Glucagon, MWPsp-MWPmp10-,
Acquisition of Vector Incorporating 20-, 30- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon Fusion DNA Fusion DNA, MWPsp-Glucagon, MWPsp- MWPmp10-, 20-,
A vector incorporating 30- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon was obtained. • MWPsp-Glucagon as the template DNA for the first PCR reaction
For the DNA fragment MWPsp obtained in Example 5 (1)
And the DNA fragment Glucagon, MWPsp-MWPmp obtained in (1) above
10-, 20-, 30- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon
With respect to the DNA fragment V8-Glucagon obtained in (2) above, the fusion DNA obtained in (7) of Example 1, MWPsp-MWPmp10- (Hi
s) _6- Linker, fusion DNA obtained in (5) above, MWPsp-MWP
An appropriate amount of each of mp20- and 30- (His) ₆ -Linker was mixed and reacted with a DNA ligation kit of Takara Shuzo Co. at 16 ° C. for 30 minutes.・ 5'-TT as a reverse primer for the first PCR reaction
AAGTGTTCATCAGCCATTG-3 '(SEQ ID NO: 41) was used.

【００７９】実施例８ 融合DNAの発現分泌と生成物の選択的切断 (1) 融合体のアミノ酸配列および塩基配列 実施例１〜７で得られた融合体のうち、代表例として以
下のものの塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号４８
〜５１、６２〜６５および図１〜４に示した。 MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proisulin(配列番号
４８、６２) MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulin(配列番号４９、６３) MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin 28(配列
番号５０、６４) MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Glucagon(配列番号５
１、６５) Example 8 Expression and Secretion of Fusion DNA and Selective Cleavage of Product (1) Amino Acid Sequence and Nucleotide Sequence of Fusion Among the fusions obtained in Examples 1 to 7, the following bases are representative examples SEQ ID NO: 48
51 to 62 to 65 and FIGS. MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proisulin (SEQ ID NOs: 48, 62) MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulin (SEQ ID NOs: 49, 63) MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin 28 (SEQ ID NOS: 50 and 64) MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon (SEQ ID NO: 5
1, 65)

【００８０】(2) 融合体の発現分泌 実施例１〜７で得られた各種の融合DNAによってコード
される融合蛋白質の発現を行った。代表例として上記の
４種の融合DNAを発現ベクターに組み込む様式を図５に
示した。即ち、上記の融合DNAを組み込んだベクター（p
PINS-1,-2, pSTN, pGCN）を制限酵素ApaL IとHind III
（融合DNAが塩基配列決定用M13プライマーに対して順方
向に挿入されている場合）、あるいは、ApaL IとKpn I
（M13プライマーに対して逆方向に挿入されている場
合）で処理して0.8%アガロース電気泳動を行い、それぞ
れの融合DNAを含むDNA断片を切り出した。切り出した融
合DNAと、ApaL IとHind III（逆方向に挿入されていた
融合DNAの場合はKpn I）でカットしたバチルス・ブレビ
ス用発現ベクターpNU211R2L5（特開平5−304962号公
報、特開平７-170984号公報）を適量ずつ混ぜ、宝酒造
社のDNA ligation kitで16℃30分反応させることにより
融合DNAを発現ベクターに組み込んだ。以上のようにし
て、それぞれの融合DNAを組み込んだ発現ベクター、pNU
-PINS-1,-2, pNU-STN, pNU-GCNを取得した。これらの発
現ベクターでバチルス・ブレビスの47-5Q株（FERM BP-1
664）を公知の方法（Methods in Enzymol.,217： 23−3
3， 1993）に従って形質転換してT2寒天培地［ポリペプ
トン（1 %）、肉エキス（0.5 %）、酵母エキス（0.2
%）、ウラシル（0.1 mg/ml）、グルコース（1 %）、エ
リスロマイシン（10μg/ml）、寒天（1.5 %）、pH 7］
に播いて、形質転換体を取得した。(2) Expression and secretion of fusions Fusion proteins encoded by the various fusion DNAs obtained in Examples 1 to 7 were expressed. As a representative example, the manner in which the above four kinds of fusion DNAs are incorporated into an expression vector is shown in FIG. That is, a vector (p
PINS-1, -2, pSTN, pGCN) with restriction enzymes ApaL I and Hind III
(If the fusion DNA is inserted in the forward direction with respect to the M13 primer for nucleotide sequencing), or ApaL I and Kpn I
(When inserted in the opposite direction to the M13 primer), and 0.8% agarose electrophoresis was performed to cut out a DNA fragment containing each fusion DNA. The excised fusion DNA and the expression vector pNU211R2L5 for Bacillus brevis cut with ApaL I and Hind III (Kpn I in the case of the fusion DNA inserted in the reverse direction) (JP-A-5-304962, JP-A-7-304) No. 170984), and the mixture was reacted at 16 ° C. for 30 minutes with a DNA ligation kit manufactured by Takara Shuzo to incorporate the fusion DNA into the expression vector. As described above, the expression vector incorporating each fusion DNA, pNU
-PINS-1, -2, pNU-STN, pNU-GCN were obtained. Bacillus brevis strain 47-5Q (FERM BP-1)
664) by a known method (Methods in Enzymol., 217 : 23-3).
3, 1993) and transformed into T2 agar medium [polypeptone (1%), meat extract (0.5%), yeast extract (0.2%).
%), Uracil (0.1 mg / ml), glucose (1%), erythromycin (10 µg / ml), agar (1.5%), pH 7]
To obtain a transformant.

【００８１】形質転換体はT2培地（T2寒天培地から寒天
を除いたもの）で37℃１日培養してから公知の方法（Mo
lecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory(1989)）でプラスミドDNAを
精製し、ApaL IとHind III（あるいは、Kpn I）で処理
してそれぞれの融合DNAが組み込まれているのを確認し
た。融合DNAが組み込まれていることが確認できた形質
転換体については、組み込まれた融合DNAでコードされ
る融合蛋白質の発現分泌を試験した。即ち、T2培地で37
℃で１日培養した菌懸濁液を1/1000容の割合で5YC培地
［ポリペプトン（3%）、酵母エキス（0.2 %）、グルコ
ース（3 %）、CaCl₂・2H₂O（0.01 %）、MgSO₄・7H₂O
（0.01 %）、FeSO₄・7H₂O（0.001 %）、MnSO₄・4H₂O
（0.001 %）、ZnSO₄・7H₂O（0.0001 %）、グリシン（0.
3 %）、エリスロマイシン（10μg/ml）、pH7］に添加し
て30℃で４日間振とう培養した。The transformant was cultured at 37 ° C. for 1 day in a T2 medium (T2 agar medium excluding agar), and then cultured in a known manner (Mo
lecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual, Cold
The plasmid DNA was purified at Spring Harbor Laboratory (1989) and treated with ApaL I and Hind III (or Kpn I) to confirm that the respective fusion DNAs had been incorporated. For the transformants in which the fusion DNA was confirmed to be integrated, the expression and secretion of the fusion protein encoded by the integrated fusion DNA were tested. That is, in T2 medium 37
The bacterial suspension cultivated for 1 day at a temperature of 5 ° C. was diluted to a 1/1000 volume with a 5YC medium [polypeptone (3%), yeast extract (0.2%), glucose (3%), CaCl ₂ .2H ₂ O (0.01%) , MgSO ₄ · 7H ₂ O
_{(0.01%), FeSO 4 ·} 7H 2 O (0.001%), MnSO 4 · 4H 2 O
_{(0.001%), ZnSO 4 ·} 7H 2 O (0.0001%), glycine (0.
3%), erythromycin (10 μg / ml), pH 7], followed by shaking culture at 30 ° C. for 4 days.

【００８２】培養後、培地を15,000 rpm、2分遠心して
培養上清を得て、公知の方法（Laemmli, U. K., Natur
e, 227, 680-685, (1970)）で電気泳動による蛋白質の
解析を行った。即ち、培養上清の18μlにバッファ１［1
25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20%glycerol, 4% SDS, 10%
2-mercaptoethanol］を２μl加えて５分間煮沸し、バッ
ファ２［250 mM Tris-HCl (pH 6.5), 50% glycerol, 0.
5% BPB］を４μl加えて市販の15/25％SDSポリアクリル
アミドゲル（第一化学社）にアプライして電気泳動（泳
動バッファ：100 mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1% SD
S）を行った。電気泳動後クマジ染色して発現分泌の有
無を調べた。After culturing, the medium was centrifuged at 15,000 rpm for 2 minutes to obtain a culture supernatant, which was obtained by a known method (Laemmli, UK, Natur.
e, 227 , 680-685, (1970)). That is, buffer 1 [1] was added to 18 µl of the culture supernatant.
25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% glycerol, 4% SDS, 10%
2-mercaptoethanol], add 2 μl and boil for 5 minutes. Buffer 2 [250 mM Tris-HCl (pH 6.5), 50% glycerol, 0.1%
5% BPB], apply to a commercially available 15/25% SDS polyacrylamide gel (Daiichi Kagaku), and perform electrophoresis (running buffer: 100 mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1% SD
S) was performed. After electrophoresis, the presence or absence of expression secretion was examined by Kumaji staining.

【００８３】外来ポリペプチドのプロインスリンのう
ち、MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 15-, 40
-, 50-, 100-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinの発現分泌
の結果を図６に示した。レーン５のMWPsp-MWPmp9-(His)
₆-Linker-Met-Proinsulinを除き、すべての融合体で発
現分泌が認められた。MWPsp-Proinsulin, MWPsp-MWPmp1
-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-,
13-, 14-, 15-, 17-, 20-, 50-Met-Proinsulinの発現分
泌の結果を図７に示した。レーン３のMWPsp-Proinsuli
n, レーン12のMWPsp-MWPmp9-Met-Proinsulinを除き、す
べての融合体で発現分泌が認められた。特に、MWPsp-MW
Pmp6-, 7-, 8-, 10-, 11-, 12-, 15-, 17-, 20-, 50-Me
t-Proinsulinではより高い発現分泌が認められた。外来
ポリペプチドのソマトスタチン28のうち、MWPsp-Somato
statin 28, MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EGF-TEV-Somatostat
in 28, MWPsp-MWPmp10-(His)₆-TEV-Somatostatin 28, M
WPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin 28の発現
分泌の結果を図８に示した。MWPsp-Somatostatin 28, M
WPsp-MWPmp10-(His)₆-TEV-Somatostatin 28では、発現
分泌が認められなかったが、 MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EG
F-TEV-Somatostatin 28,MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV
-Somatostatin 28では、発現分泌が認められた。特に、
MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin 28はより
高い発現分泌であった。外来ポリペプチドのグルカゴン
うち、MWPsp-Glucagon, MWPsp-MWPmp10-, 20-, 30-(Hi
s)₆-Linker-V8-Glucagonの発現分泌の結果を図９に示し
た。MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Glucagonにおい
てのみ発現分泌が認められた。Among the foreign polypeptides proinsulin, MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 15-, 40
FIG. 6 shows the results of expression and secretion of-, 50-, and 100- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin. MWPsp-MWPmp9- (His) in lane 5
Except for _6- Linker-Met-Proinsulin, expression was secreted in all fusions. MWPsp-Proinsulin, MWPsp-MWPmp1
-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-,
The results of 13-, 14-, 15-, 17-, 20-, 50-Met-Proinsulin expression and secretion are shown in FIG. MWPsp-Proinsuli in lane 3
n, except for MWPsp-MWPmp9-Met-Proinsulin in lane 12, expression and secretion were observed in all fusions. In particular, MWPsp-MW
Pmp6-, 7-, 8-, 10-, 11-, 12-, 15-, 17-, 20-, 50-Me
Higher expression and secretion of t-Proinsulin was observed. Of the foreign polypeptide somatostatin 28, MWPsp-Somato
statin 28, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostat
in 28, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -TEV-Somatostatin 28, M
FIG. 8 shows the results of expression and secretion of WPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin 28. MWPsp-Somatostatin 28, M
In WPsp-MWPmp10- (His) ₆ -TEV-Somatostatin 28, expression was not secreted, but MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EG
F-TEV-Somatostatin 28, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV
-In Somatostatin 28, expression secretion was observed. In particular,
MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin 28 had higher expression secretion. Of the foreign polypeptide glucagons, MWPsp-Glucagon, MWPsp-MWPmp10-, 20-, 30- (Hi
s) The results of _6- Linker-V8-Glucagon expression and secretion are shown in FIG. Expression and secretion was observed only in MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon.

【００８４】(3) プロインスリンの同定 プロインスリンの同定は、プロインスリン中のC-peptid
eに対する抗体を用いて免疫学的に行った。培地を15,00
0 rpm、２分遠心して得られた培養上清1μlを上記と同
様に電気泳動したのち、公知の方法（Towbin, H.ら、7
6, 4350-4354, (1979)）で電気的にニトロセルロースメ
ンブレンにブロットした。次に、メンブレンをバッファ
３［20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Twe
en 20］に溶かした5%スキムミルク溶液に１時間浸して
から、バッファ３で2000倍希釈したウサギ抗C-peptide
抗体（LINCO RESEARCH社製）に30分間振とうしながら浸
した。その後、バッファ３で10分間振とうしながら３回
洗浄し、バッファ３で2000倍希釈したペルオキシダーゼ
標識抗ウサギIgG抗体（E-Y Laboratories社製）に30分
間振とうしながら浸した。浸せき終了後、バッファ３で
10分間振とうしながら３回洗浄し、アマシャム社のECL
検出キットを用いてプロインスリンの存在を調べた。方
法はキットの取り扱い説明書に従った。図10、11に示さ
れるように、MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-,
15-, 40-, 50-, 100-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinで
は、融合DNAが入っていないpNU211R2L5とMWPsp-MWPmp9-
(His)₆-Linker-Met-Proinsulinを除いて、すべての融合
体に、一方、MWPsp-Proinsulin,MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3
-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14
-,15-, 17-, 20-, 50-Met-Proinsulinでは、pNU211R2L
5、MWPsp-Proinsulin、MWPsp-MWPmp9-Met-Proinsulinを
除いてすべての融合体にプロインスリンの存在を示すシ
グナルが検出できた。(3) Identification of proinsulin Identification of proinsulin was carried out using C-peptid in proinsulin.
Performed immunologically with an antibody against e. Medium 15,00
1 μl of the culture supernatant obtained by centrifugation at 0 rpm for 2 minutes was
After electrophoresis as described above, a known method (Towbin, H. et al.,7
6, 4350-4354, (1979)).
Blotted on membrane. Next, buffer the membrane
3 [20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Twe
en 20] for 1 hour in a 5% skim milk solution
Rabbit anti-C-peptide diluted 2000 times with buffer 3
Soak in antibody (LINCO RESEARCH) for 30 minutes with shaking
did. Then, 3 times while shaking for 10 minutes in buffer 3
Washed and diluted 2000 times with buffer 3 peroxidase
30 minutes with labeled anti-rabbit IgG antibody (E-Y Laboratories)
Soaked while shaking. After immersion, in buffer 3
Wash 3 times while shaking for 10 minutes, and use Amersham ECL
The presence of proinsulin was determined using a detection kit. One
The method followed the instruction manual of the kit. Shown in Figures 10 and 11
MWPsp-MWPmp6-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-,
15-, 40-, 50-, 100- (His)₆-With Linker-Met-Proinsulin
Indicates that pNU211R2L5 without fusion DNA and MWPsp-MWPmp9-
(His)₆All fusions except -Linker-Met-Proinsulin
In the body, on the other hand, MWPsp-Proinsulin, MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3
-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14
-, 15-, 17-, 20-, 50-Met-Proinsulin, pNU211R2L
5, MWPsp-Proinsulin, MWPsp-MWPmp9-Met-Proinsulin
All fusions except for those that show the presence of proinsulin
The signal was detected.

【００８５】(4) プロインスリンの切断 融合DNA、MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsuli
nを組み込んだ発現ベクターを含む形質転換体を培養し
て得られた培地を20,000 rpm、15分遠心し、その培養上
清に30% 飽和となるように硫安を加えた。さらに、20,0
00rpm、20分の遠心の後、ペレットを適量の2 mMリン酸
ナトリウムバッファ（pH 7）に溶かして同バッファに透
析した。透析後、溶液のバッファを20 mMリン酸ナトリ
ウム（pH7）、150 mM NaClとして、ファルマシア社のキ
レートカラムにアプライして300mMイミダゾール含む同
バッファで溶出することにより、他の夾雑蛋白質より融
合蛋白質のみを分離精製した。分離した融合蛋白質は上
記と同様に再度硫安による塩析、遠心による塩析物の回
収を行い、ペレットの塩析物は2 mMリン酸ナトリウムバ
ッファ（pH 7）に溶かして同バッファに透析した。(4) Cleavage of proinsulin Fusion DNA, MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsuli
The culture medium obtained by culturing the transformant containing the expression vector incorporating n was centrifuged at 20,000 rpm for 15 minutes, and ammonium sulphate was added to the culture supernatant to 30% saturation. In addition, 20,0
After centrifugation at 00 rpm for 20 minutes, the pellet was dissolved in an appropriate amount of 2 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and dialyzed against the same buffer. After dialysis, the buffer of the solution was changed to 20 mM sodium phosphate (pH 7) and 150 mM NaCl, applied to a Pharmacia chelate column, and eluted with the same buffer containing 300 mM imidazole to remove only the fusion protein from other contaminating proteins. Separated and purified. The separated fusion protein was subjected to salting out with ammonium sulfate and collection of the salting out substance by centrifugation again as described above, and the salting out substance in the pellet was dissolved in 2 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and dialyzed against the same buffer.

【００８６】次に、ぎ酸を最終濃度70%となるように添
加し、さらに臭化シアンを蛋白質のグラム当量に相当す
る分を加えて室温で一晩放置することにより、プロイン
スリンを融合蛋白質から化学的に切断した。その後、2
mMリン酸ナトリウムバッファ（pH 7）に透析してから、
再度キレートカラムにアプライして60 mMのイミダゾー
ルを含むバッファでプロインスリンを溶出した。図12に
は、キレートカラムで分離精製した切断前の融合蛋白質
MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinおよび臭化シア
ンにより切断されたプロインスリンを15/25%ポリアクリ
ルアミドゲルで電気泳動し、クマジ染色したものを示し
た。また、図13には、電気泳動した蛋白質をニトロセル
ロース膜にブロッティングして、抗C-peptide抗体を用
いてプロインスリンを同定したものを示した。融合蛋白
質から切断されたプロインスリンの存在が認められた。Next, formic acid was added to a final concentration of 70%, cyan bromide was added in an amount equivalent to gram equivalent of the protein, and the mixture was allowed to stand at room temperature overnight to convert proinsulin into a fusion protein. Was chemically cut. Then 2
dialyzed against mM sodium phosphate buffer (pH 7)
Proinsulin was eluted with a buffer containing 60 mM imidazole after applying to the chelating column again. Figure 12 shows the fusion protein before cleavage, separated and purified on a chelate column.
Proinsulin cleaved with MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin and cyanogen bromide was electrophoresed on a 15/25% polyacrylamide gel and stained with Kumazi. FIG. 13 shows the result of blotting the electrophoresed protein on a nitrocellulose membrane and identifying proinsulin using an anti-C-peptide antibody. The presence of proinsulin cleaved from the fusion protein was observed.

【００８７】(5) ソマトスタチン２８の切断 融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin
28を組み込んだ発現ベクターを含む形質転換体を培養
して得られた培地を20,000 rpm、15分遠心し、その培養
上清に50% 飽和となるように硫安を加えた。さらに、2
0,000rpm、20分の遠心の後、ペレットを適量の2 mMリン
酸ナトリウムバッファ（pH 7）に溶かして同バッファに
透析した。透析後、溶液のバッファを20 mMリン酸ナト
リウム（pH 7）、150 mM NaClに換えて、ファルマシア
社のキレートカラムにアプライして300 mMイミダゾール
含む同バッファで溶出することにより、他の夾雑蛋白質
より融合蛋白質MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin
28のみを分離精製した。精製した融合蛋白質（104, 52,
26μg）をTEVプロテアーゼ（GIBCO BRL社、10U）で処
理（方法は製品に添付されたプロトコールに従った）し
てソマトスタチン28を融合蛋白質から切り出した。図14
に、電気泳動終了後ニトロセルロース膜にブロッティン
グしたTEVプロテアーゼ処理前後の蛋白質について、ウ
サギ抗ソマトスタチン抗体（MEDAC社製、2000倍希
釈）、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体（E-Y Lab
oratories社製、2000倍希釈）を用いて検出した結果を
示した。TEVプロテアーゼにより、融合蛋白質からソマ
トスタチン28が切り出されることが示された。(5) Cleavage of Somatostatin 28 Fusion DNA, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin
The medium obtained by culturing the transformant containing the expression vector incorporating 28 was centrifuged at 20,000 rpm for 15 minutes, and ammonium sulphate was added to the culture supernatant so as to be 50% saturated. In addition, 2
After centrifugation at 000 rpm for 20 minutes, the pellet was dissolved in an appropriate amount of 2 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and dialyzed against the same buffer. After dialysis, the buffer of the solution was changed to 20 mM sodium phosphate (pH 7) and 150 mM NaCl, applied to a Pharmacia chelate column, and eluted with the same buffer containing 300 mM imidazole to remove other contaminating proteins. Fusion protein MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin
Only 28 was separated and purified. Purified fusion protein (104, 52,
26 μg) was treated with TEV protease (GIBCO BRL, 10 U) (the method followed the protocol attached to the product) to excise somatostatin 28 from the fusion protein. Fig. 14
In addition, the rabbit anti-somatostatin antibody (manufactured by MEDAC, diluted 2000-fold), peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (EY Lab)
oratories, 2000-fold dilution). TEV protease was shown to excise somatostatin 28 from the fusion protein.

【００８８】(6) グルカゴンの切断 融合DNA、MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Glucagonを
組み込んだ発現ベクターを含む形質転換体を培養して得
られた培地を20,000 rpm、15分遠心し、その培養上清に
50% 飽和となるように硫安を加えた。さらに、20,000rp
m、20分の遠心の後、ペレットを適量の2 mMリン酸ナト
リウムバッファ（pH 7）に溶かして同バッファに透析し
た。透析後、溶液のバッファを20 mMリン酸ナトリウム
（pH 7）、150 mM NaClに換えてて、ファルマシア社の
キレートカラムにアプライして300mMイミダゾール含む
同バッファで溶出することにより、他の夾雑蛋白質より
融合蛋白質MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Glucagonのみを
分離精製した。精製した融合蛋白質（90, 45, 22.5μ
g）を0.1 M炭酸アンモニウム中でV8プロテアーゼ（和光
純薬社、2μg）で処理してグルカゴンを融合蛋白質から
切り出した。図15に、電気泳動終了後ニトロセルロース
膜にブロッティングしたV8プロテアーゼ処理前後の蛋白
質について、ウサギ抗グルカゴン抗体（SANBIO社製、20
00倍希釈）、ペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgG抗体（E
-Y Laboratories社製、2000倍希釈）を用いて検出した
結果を示した。V8プロテアーゼにより、融合蛋白質から
グルカゴンが切り出されることが示された。(6) Cleavage of Glucagon A culture medium obtained by culturing a transformant containing an expression vector incorporating the fusion DNA, MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon, was cultured at 20,000 rpm for 15 minutes. Centrifuge and add to the culture supernatant
Ammonium sulfate was added to achieve 50% saturation. In addition, 20,000 rp
After centrifugation at m for 20 minutes, the pellet was dissolved in an appropriate amount of 2 mM sodium phosphate buffer (pH 7) and dialyzed against the same buffer. After dialysis, the buffer of the solution was changed to 20 mM sodium phosphate (pH 7) and 150 mM NaCl, applied to a Pharmacia chelate column, and eluted with the same buffer containing 300 mM imidazole to remove other contaminating proteins. Only the fusion protein MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon was separated and purified. Purified fusion protein (90, 45, 22.5μ
g) was treated with V8 protease (2 μg, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 0.1 M ammonium carbonate to excise glucagon from the fusion protein. FIG. 15 shows a rabbit anti-glucagon antibody (manufactured by SANBIO, 20
100-fold dilution), peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (E
-Y Laboratories, 2000-fold dilution). V8 protease was shown to excise glucagon from the fusion protein.

【００８９】(7) プロインスリンのアミノ酸分析 融合蛋白質MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinから
切断されたプロインスリンの同定をアミノ酸分析により
確認した。アミノ酸分析は、融合蛋白質の臭化シアン処
理後、キレートカラムで分離精製されたプロインスリン
を6N-HCl（0.1%フェノール含有）中で110℃、20時間加
水分解した後に、日立アミノ酸分析装置L - 8500型（日
立製作所製）を、用いて行った。表１に示されるよう
に、融合蛋白質から切断されたプロインスリンのアミノ
酸比は天然のプロインスリンのアミノ酸組成の理論値と
ほぼ一致した。(7) Amino acid analysis of proinsulin The identity of proinsulin cleaved from the fusion protein MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin was confirmed by amino acid analysis. Amino acid analysis is performed by treating the fusion protein with cyanogen bromide, hydrolyzing proinsulin separated and purified by a chelate column in 6N-HCl (containing 0.1% phenol) at 110 ° C for 20 hours, and then using the Hitachi amino acid analyzer L- The test was performed using Model 8500 (manufactured by Hitachi, Ltd.). As shown in Table 1, the amino acid ratio of proinsulin cleaved from the fusion protein almost coincided with the theoretical value of the amino acid composition of native proinsulin.

【００９０】[0090]

【表１】 [Table 1]

【００９１】(8) 生産量の推定 融合体MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinを
例にとり、培地中に分泌された融合蛋白質MWPmp10-(Hi
s)₆-Linker-Met-Proinsulinの生産量をウエスタンブロ
ッティング法により推定した。15,000rpmで２分遠心し
て得られた培地上清１μlとプロインスリン（Sigma社）
１μgについて、３ⁿの希釈系列をつくり電気泳動したの
ち、ニトロセルロース膜にブロッティングして抗Ｃペプ
チド抗体で検出されたシグナルの強度を比較した。図16
に示されるように、培地上清1/3（すなわち、3倍希釈）
のシグナル強度はプロインスリンの0.03〜 0.1μg間の
シグナル強度に匹敵すると考えられた。従って、MWPmp1
0-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinの生産量は、100〜300
mg/lの間に存在すると推定された。(8) Estimation of production amount Taking the fusion MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin as an example, the fusion protein MWPmp10- (His
s) The production of _6- Linker-Met-Proinsulin was estimated by Western blotting. 1 μl of the culture supernatant obtained by centrifugation at 15,000 rpm for 2 minutes and proinsulin (Sigma)
1 μg of a 3 ⁿ dilution series was prepared and electrophoresed, and then blotted on a nitrocellulose membrane to compare the signal intensities detected with the anti-C peptide antibody. FIG.
As shown in, the media supernatant is 1/3 (ie, 3 times diluted)
Was considered comparable to the signal intensity of proinsulin between 0.03 and 0.1 μg. Therefore, MWPmp1
0- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin production is 100-300
It was estimated to be between mg / l.

【００９２】実施例９ MWPsp-MWPmp20 -TEV-G〜GH融合ＤＮＡを組み込んだベク
ター（pG〜GH）の構築 （１）DNA断片MWPsp-MWPmp20の取得 平滑末端化DNA断片MWPsp-MWPmp20を実施例４の（１）に
記載されるものと同じ方法で作製したが、但しPCR反応
は、変性温度：94℃ - 1 min、アニール温度：53℃ - 1
min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 1 minを１サイクルとし
て30回繰り返すことによって行った。 Example 9 A vector incorporating the MWPsp-MWPmp20- TEV-G to GH fusion DNA
Construction of terpolymer (PG～GH) (1) was produced in the same manner as that described in DNA fragment MWPsp-MWPmp20 acquisition blunted DNA fragment MWPsp-MWPmp20 of Example 4 (1), except the PCR reaction The denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1
min, DNA chain elongation temperature: 72 ° C.-1 min was repeated 30 times with 1 cycle as one cycle.

【００９３】（２）DNA断片TEVの取得 遺伝暗号表（Molecular Cloning 2nd ed., A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）
に従ってTEVプロテアーゼにより認識されるアミノ酸配
列（AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln（配列
番号２））をコードする順方向オリゴヌクレオチド5' -
GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA - 3'（配
列番号５７）、逆方向オリゴヌクレオチド、5' - TTGGA
AGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC - 3'（配列番号
５８）を化学合成し、リン酸化反応（ニッポンジーン社
のT4 polynucleotide kinaseを使用し、方法は取り扱い
説明書に準じた）を行った後、10 mM Tris-HCl (pH8)、
5 mM MgCl₂溶液中で95℃、5 min処理し、37℃、15 min
でアニールさせた。アニールした二重鎖DNA断片TEVをフ
ェノール処理後、エタノール沈澱して真空乾燥して適量
の蒸留水に溶かした。(2) Obtaining DNA fragment TEV Genetic code table (Molecular Cloning 2nd ed., A Laborato
ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989))
A forward oligonucleotide 5'- encoding an amino acid sequence (AspTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln (SEQ ID NO: 2)) recognized by the TEV protease according to
GACTATGATATCCCGACCACTGAAAACCTGTACTTCCAA-3 '(SEQ ID NO: 57), reverse oligonucleotide, 5'-TTGGA
AGTACAGGTTTTCAGTGGTCGGGATATCATAGTC-3 '(SEQ ID NO: 58) was chemically synthesized, phosphorylated (using T4 polynucleotide kinase from Nippon Gene Co., Ltd., according to the instruction manual), and then 10 mM Tris-HCl (pH8) ,
Treat in 5 mM MgCl ₂ solution at 95 ° C for 5 min, 37 ° C for 15 min
Annealed. The annealed double-stranded DNA fragment TEV was treated with phenol, precipitated with ethanol, dried in vacuo, and dissolved in an appropriate amount of distilled water.

【００９４】（３） DNA断片、ヒト成長ホルモンGHの取
得 以下の点以外は（１）と同様な手順に従って平滑末端化
した DNA断片GHを取得した。 ・鋳型DNAとして、DNA断片GHを組み込んだプラスミドベ
クターを用いた。GHを組み込んだプラスミドベクターの
取得は次のようにして行った。市販のヒト脳下垂体mRNA
（CLONTECH社製）よりファルマシア社の1st strand cDN
A synthesis kitを用い、取り扱い説明書に従ってヒト
脳下垂体cDNAを合成した。このcDNAを鋳型として、Rosk
am, W.G.ら（Nucleic Acids Res., 7, 305-320, 1979）
およびMartial, J. A.ら（Science, 205, 602-607, 19
79）により決定されたヒト成長ホルモン遺伝子の塩基配
列をもとに合成された順方向プライマー5' - ATGGCTACA
GGCTCCCGGAC - 3'（配列番号４４）、逆方向プライマー
5' - CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配列番号４５）を用
いてPCR反応（条件：94℃ - 1 min, 55℃ - 1 min,72℃
- 1minを１サイクルとして35サイクル繰り返す）を行
い、得られたPCR産物、即ち、ヒト成長ホルモンDNAをpG
EM-Tベクター（Promega社製）にクローニングした。(3) Obtaining DNA Fragment, Human Growth Hormone GH A blunt-ended DNA fragment GH was obtained in the same manner as in (1) except for the following points. -A plasmid vector incorporating the DNA fragment GH was used as the template DNA. The plasmid vector incorporating GH was obtained as follows. Commercially available human pituitary mRNA
1st strand cDN of Pharmacia from (CLONTECH)
Using the A synthesis kit, human pituitary cDNA was synthesized according to the instruction manual. Using this cDNA as a template, Rosk
am, WG et al. (Nucleic Acids Res., 7, 305-320, 1979)
And Martial, JA et al. (Science, 205, 602-607, 19
79) Forward primer 5'-ATGGCTACA synthesized based on the nucleotide sequence of human growth hormone gene determined by 79)
GGCTCCCGGAC-3 '(SEQ ID NO: 44), reverse primer
PCR reaction using 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3 '(SEQ ID NO: 45) (conditions: 94 ° C-1 min, 55 ° C-1 min, 72 ° C)
-Repeat 35 cycles with 1 min as one cycle), and convert the obtained PCR product, that is, human growth hormone DNA, into pG
It was cloned into EM-T vector (Promega).

【００９５】・プライマーとして、順方向プライマー、
5' - TTCCCAACCATTCCCTTATC - 3'（配列番号４６）、逆
方向プライマー、5' - CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配
列番号４５）を用いた。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：55℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。A forward primer,
5'-TTCCCAACCATTCCCTTATC-3 '(SEQ ID NO: 46), reverse primer, 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3' (SEQ ID NO: 45) were used.・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 55 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-30 sec)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００９６】（４）DNA断片、Ｎ末端にGlyをもつ変異型
ヒト成長ホルモン（Ｇ〜GH）の取得 以下の点以外は（１）と同様な手順に従って平滑末端化
したDNA断片Ｇ〜GHを取得し、さらにリン酸化反応（ニ
ッポンジーン社のT4 polynucleotide kinaseを使用し、
方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、リン酸化した
DNA断片Ｇ〜GHを得た。 ・鋳型DNAとして、（３）より得られたGHのPCR産物10 n
ｇを用いた。 ・プライマーとして、順方向プライマー、5' - GGTTTCC
CAACCATTCCCTTATC - 3'（配列番号４７）、逆方向プラ
イマー、5' - CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配列番号４
５）を用いた。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：55℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。(4) Obtaining DNA fragments and mutant human growth hormones (G to GH) having Gly at the N-terminus DNA fragments G to GH having blunt ends according to the same procedure as (1) except for the following points The phosphorylation reaction (using T4 polynucleotide kinase from Nippon Gene,
The method was followed according to the instruction manual), and phosphorylation was performed.
DNA fragments G to GH were obtained. -As a template DNA, 10 n of the GH PCR product obtained from (3)
g was used.・ For primer, forward primer, 5 '-GGTTTCC
CAACCATTCCCTTATC-3 '(SEQ ID NO: 47), reverse primer, 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3 '(SEQ ID NO: 4)
5) was used.・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 55 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-30 sec)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【００９７】（５）MWPsp- MWPmp20-TEV融合DNAの取得 以下の点以外は（１）と同様な手順に従って平滑末端化
した融合MWPsp- MWPmp20-TEVを取得した。 ・第１回目のPCR反応の鋳型DNAとして、（１）で得られ
たDNA断片MWPsp-MWPmp20と（２）で得られたDNA断片TEV
を適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA ligation kitで16℃30
分反応させたものを用いた。 ・第１回目のPCR反応の逆方向プライマーとして、5' -
TTGGAAGTACAGGTTTTC -3'（配列番号３９）を用いた。 ・第１回目のPCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 mi
n、アニール温度：45℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃
- 30 secを１サイクルとして25回繰り返す）とした。(5) Obtaining MWPsp-MWPmp20-TEV Fusion DNA A blunt-ended fused MWPsp-MWPmp20-TEV was obtained according to the same procedure as (1) except for the following points. -The DNA fragment MWPsp-MWPmp20 obtained in (1) and the DNA fragment TEV obtained in (2) were used as template DNAs for the first PCR reaction.
Mix at appropriate temperature and use a DNA ligation kit from Takara Shuzo
The reaction was carried out for minutes. -As a reverse primer for the first PCR reaction, 5'-
TTGGAAGTACAGGTTTTC-3 '(SEQ ID NO: 39) was used. • Change the reaction conditions for the first PCR (denaturation temperature: 94 ° C-1 mi
n, annealing temperature: 45 ° C-1 min, DNA strand extension temperature: 72 ° C
-Repeat 30 times with 30 sec as one cycle).

【００９８】その後、ニッポンジーン社のT4 polynucle
otide kinaseを用い、取り扱い説明書に従ってPCR産物
のリン酸化を行った。リン酸化したPCR産物は、宝酒造
社のDNA ligation kitを用いて制限酵素Hinc IIでカッ
トしたベクター（STRATAGENE社製、Blue Script SKー）
に組み込み、公知の方法（Molecular Cloning 2nd ed.,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
f(1989)）に従って大腸菌DH5αを形質転換させ、形質転
換体からベクターであるプラスミドDNAを精製した。ベ
クターの塩基配列決定用順方向プライマー（M13 forwar
d primer）、あるいは逆方向プライマー（M13 reverse
preimer）を用いて塩基配列を決定してMWPsp- MWPmp20-
TEV融合DNAができていることを確認した。次に、MWPsp-
MWPmp20-TEVを組み込んだベクターを鋳型DNAとし、順
方向プライマー5' - GTCGTTAACAGTGTATTGCT - 3'（配列
番号６）と逆方向プライマー5'- TTGGAAGTACAGGTTTTC-
3'（配列番号３９）を用いて上記と同様な条件で第２回
目のPCR反応を行い、平滑末端化した融合DNA、MWPsp- M
WPmp20-TEVを取得した。Thereafter, T4 polynucle of Nippon Gene Co., Ltd.
The phosphorylation of the PCR product was performed using otide kinase according to the instruction manual. The phosphorylated PCR product was cut with the restriction enzyme Hinc II using Takara Shuzo's DNA ligation kit (STRATAGENE, Blue Script SK-).
Into a known method (Molecular Cloning 2nd ed.,
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory
f (1989)), Escherichia coli DH5α was transformed, and a plasmid DNA as a vector was purified from the transformant. Forward primer for vector sequencing (M13 forwar
d primer) or reverse primer (M13 reverse
preimer) to determine the nucleotide sequence and determine the MWPsp- MWPmp20-
It was confirmed that the TEV fusion DNA was made. Next, MWPsp-
Using a vector incorporating MWPmp20-TEV as a template DNA, a forward primer 5'-GTCGTTAACAGTGTATTGCT-3 '(SEQ ID NO: 6) and a reverse primer 5'-TTGGAAGTACAGGTTTTC-
A second PCR reaction was performed using 3 ′ (SEQ ID NO: 39) under the same conditions as above, and the blunt-ended fusion DNA, MWPsp-M
WPmp20-TEV was acquired.

【００９９】（６）MWPsp-MWPmp20-TEV-G〜GH融合DNAを
組み込んだベクターの取得 以下の点以外は（５）と同様な手順に従って融合DNA、M
WPsp-MWPmp20-TEV-G〜GHが組み込まれたベクター（pG〜
GH）を取得した。 ・鋳型DNAとして、（５）で得られた融合DNA、MWPsp-MW
Pmp20-TEVと（４）で得られたDNA断片、G〜GHを適量ず
つ混ぜて宝酒造社のDNA ligation kitで16℃30分反応さ
せたものを使用した。 ・プライマーとして、順方向プライマー、5' - GTCGTTA
ACAGTGTATTGCT - 3'（配列番号６）、逆方向プライマ
ー、5'- CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配列番号４５）
を使用した。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：53℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 1 min
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。(6) Obtaining a Vector Incorporating the MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH Fusion DNA The fusion DNA and M were obtained in the same manner as in (5) except for the following points.
WPsp-MWPmp20-TEV-G ~ GH integrated vector (pG ~
GH). -As a template DNA, the fusion DNA obtained in (5), MWPsp-MW
An appropriate amount of Pmp20-TEV, the DNA fragment obtained in (4), and G to GH were mixed and reacted at 16 ° C. for 30 minutes using a DNA ligation kit from Takara Shuzo.・ For primer, forward primer, 5 '-GTCGTTA
ACAGTGTATTGCT-3 '(SEQ ID NO: 6), reverse primer, 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3' (SEQ ID NO: 45)
It was used.・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-1 min)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【０１００】実施例１０ MWPsp-GH 融合DNAを組み込んだベクターの構築 （１）DNA断片MWPspの取得 以下の点以外は実施例９の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化した DNA断片MWPspを取得した。 ・プライマーとして、逆方向プライマー、 5' - TGCGA
AAGCCATTGGAGCAAC - 3'（配列番号３４）を用いた。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：53℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして30回繰り返す）とした。 Example 10 Construction of Vector Incorporating MWPsp-GH Fusion DNA (1) Obtaining DNA Fragment MWPsp A DNA fragment MWPsp blunt-ended according to the same procedure as (1) of Example 9 except for the following points I got it. -As a primer, reverse primer, 5 '-TGCGA
AAGCCATTGGAGCAAC-3 ′ (SEQ ID NO: 34) was used.・ Set the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1 min, DNA strand extension temperature: 72 ° C-30 sec)
Is repeated as one cycle for 30 times).

【０１０１】（２）MWPsp-GH融合DNAを組み込んだベク
ターの取得 以下の点以外は実施例９の（５）と同様な手順に従って
融合DNA、MWPsp-GHが組み込まれたベクターを取得し
た。 ・鋳型DNAとして、（１）で得られたDNA断片MWPspと実
施例９の（３）で得られたDNA断片GHを適量ずつ混ぜて
宝酒造社のDNA ligation kitで16℃30分反応させたもの
を使用した。 ・プライマーとして、順方向プライマー、5' - GTCGTTA
ACAGTGTATTGCT - 3'（配列番号６）、逆方向プライマ
ー、5'- CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配列番号４５）
を使用した。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：53℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 1 min
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。(2) Obtaining a Vector Incorporating the MWPsp-GH Fusion DNA A vector incorporating the fusion DNA and MWPsp-GH was obtained according to the same procedure as in (5) of Example 9 except for the following points. -As a template DNA, an appropriate amount of the DNA fragment MWPsp obtained in (1) and the DNA fragment GH obtained in (3) of Example 9 are mixed and reacted at 16 ° C. for 30 minutes using a DNA ligation kit from Takara Shuzo. It was used.・ For primer, forward primer, 5 '-GTCGTTA
ACAGTGTATTGCT-3 '(SEQ ID NO: 6), reverse primer, 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3' (SEQ ID NO: 45)
It was used.・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-1 min)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【０１０２】実施例１１ MWPsp-MWPmp1- , 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10
-, 1 1-, 12,- 14-, 30-TEV-G〜GHを組み込んだベクター
の構築 （１）DNA断片MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7
-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,- 14-, 30の取得 以下の点以外は実施例９の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化した DNA断片MWPsp-MWPmp1〜-MWPmp30を取得
した。[0102]Example 11 MWPsp-MWPmp1- , 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10
-, 1 Vectors incorporating 1-, 12,-14-, 30-TEV-G to GH
Building (1) DNA fragment MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7
Acquisition of-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,-14-, 30 According to the same procedure as (1) of Example 9 except for the following points.
Obtain blunt-ended DNA fragments MWPsp-MWPmp1 to -MWPmp30
did.

【０１０３】・逆方向プライマーとして、以下のものを
それぞれ用いた。 MWPmp1 : 5'-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3'（配列番号２４） MWPmp2 : 5'-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3'（配列番号２５） MWPmp3 : 5'-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3'（配列番号２６） MWPmp4 : 5'-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3'（配列番号２７） MWPmp5 : 5'-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3'（配列番号２８） MWPmp6 : 5'-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3'（配列番号１４） MWPmp7 : 5'-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3'（配列番号２９） MWPmp8 : 5'-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3'（配列番号１５） MWPmp9 : 5'-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3'（配列番号１６） MWPmp10 : 5'-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTCTGC-3'（配
列番号７） MWPmp11 : 5'-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3'（配列番号１７） MWPmp12 : 5'-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3'（配列番号１８） MWPmp14: 5'-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3'（配列番号３１） MWPmp30 : 5'-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-3'（配列番号４
３） ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：53℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして30回繰り返す）とした。The following primers were used respectively. MWPmp1: 5'-TGCTGCGAAAGCCATTGG-3 '(SEQ ID NO: 24) MWPmp2: 5'-TTCTGCTGCGAAAGCCAT-3' (SEQ ID NO: 25) MWPmp3: 5'-TTCTTCTGCTGCGAAAGC-3 '(SEQ ID NO: 26) MWPmp4: 5'-TGCTTCTTCTGCTGCGAA-3 '(SEQ ID NO: 27) MWPmp5: 5'-TGCTGCTTCTTCTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 28) MWPmp6: 5'-AGTTGCTGCTTCTTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 14) MWPmp7: 5'-AGTAGTTGCTGCTTCTTC-3' (SEQ ID NO: 29) MWPmp8: 5'-TGTAGTAGTTGCTGCTTC-3 '(SEQ ID NO: 15) MWPmp9: 5'-AGCTGTAGTAGTTGCTGC-3' (SEQ ID NO: 16) MWPmp10: 5'-TGGAGCTGTAGTAGTTGCTGCTTCTTCTGC-3 '(SEQ ID NO: 7) MWPmp11: 5'-TTTTGGAGCTGTAGTAGT-3' (SEQ ID NO: 7) SEQ ID NO: 17) MWPmp12: 5'-CATTTTTGGAGCTGTAGT-3 '(SEQ ID NO: 18) MWPmp14: 5'-AGCGTCCATTTTTGGAGC-3' (SEQ ID NO: 31) MWPmp30: 5'-TGCTACCAGGCCAAGAGCTT-3 '(SEQ ID NO: 4)
3) ・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-30 sec)
Is repeated as one cycle for 30 times).

【０１０４】（２）DNA断片TEV-G〜GHの取得 以下の点以外は実施例９の（１）と同様な手順に従って
平滑末端化したDNA断片TEV-G〜GHを取得し、さらにリン
酸化反応（ニッポンジーン社のT4 polynucleotide kina
seを使用し、方法は取り扱い説明書に準じた）を行い、
リン酸化したDNA断片TEV-G〜GHを得た。 ・鋳型DNAとして、実施例９の（６）より得られたMWPsp
-MWPmp20-TEV-G〜GH融合DNAを組み込んだベクターpG〜G
H、10 nｇを用いた。 ・プライマーとして、順方向プライマー、5' - GACTATG
ATATCCCGACCACT - 3'（配列番号６０）、逆方向プライ
マー、5' - CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配列番号４
５）を用いた。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：55℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 30 sec
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。(2) Obtaining DNA Fragments TEV-G to GH Except for the following points, blunt-ended DNA fragments TEV-G to GH were obtained according to the same procedure as (1) in Example 9, and further phosphorylated. Reaction (T4 polynucleotide kina from Nippon Gene)
using se, the method is according to the instruction manual),
The phosphorylated DNA fragments TEV-G to GH were obtained. -As a template DNA, MWPsp obtained from (6) of Example 9
-MWPmp20-TEV-G to GH fusion DNA vector pG to G
H, 10 ng was used.・ For primer, forward primer, 5'-GACTATG
ATATCCCGACCACT-3 '(SEQ ID NO: 60), reverse primer, 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3 '(SEQ ID NO: 4)
5) was used.・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 55 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-30 sec)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【０１０５】（３）MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6
-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,- 14-,30-TEV-G〜GHを組
み込んだベクターの取得 以下の点以外は実施例９の（５）と同様な手順に従って
融合DNA、MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8
-, 9-, 10-, 11-, 12,- 14-, 30-TEV-G〜GHが組み込ま
れたベクターを取得した。 ・鋳型DNAとして、（１）で得られたDNA断片MWPsp-MWPm
p1-, 2-, 3-, 4-, 5-,6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,-
14-, 30と、（２）で得られたDNA断片TEV-G〜GHをそれ
ぞれ適量ずつ混ぜて宝酒造社のDNA ligation kitで16℃
30分反応させたものを使用した。 ・プライマーとして、順方向プライマー、5' - GTCGTTA
ACAGTGTATTGCT - 3'（配列番号６）、逆方向プライマ
ー、5'- CTAGAAGCCACAGCTGCCCT - 3'（配列番号４５）
を使用した。 ・PCRの反応条件を（変性温度：94℃ - 1 min、アニー
ル温度：53℃ - 1 min、DNA鎖伸長温度：72℃ - 1 min
を１サイクルとして25回繰り返す）とした。(3) MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6
-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,-14-, 30-Acquisition of vectors incorporating TEV-G to GH Same as (5) in Example 9 except for the following: DNA, MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8
-, 9-, 10-, 11-, 12,-14-, 30-TEV-G to GH integrated vectors were obtained. -As a template DNA, the DNA fragment MWPsp-MWPm obtained in (1)
p1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,-
14-, 30 and the DNA fragments TEV-G to GH obtained in (2) are mixed in an appropriate amount, respectively, and mixed at 16 ° C. with a DNA ligation kit of Takara Shuzo.
What reacted for 30 minutes was used.・ For primer, forward primer, 5 '-GTCGTTA
ACAGTGTATTGCT-3 '(SEQ ID NO: 6), reverse primer, 5'-CTAGAAGCCACAGCTGCCCT-3' (SEQ ID NO: 45)
It was used.・ Change the PCR reaction conditions (denaturation temperature: 94 ° C-1 min, annealing temperature: 53 ° C-1 min, DNA strand elongation temperature: 72 ° C-1 min)
Is repeated as one cycle and repeated 25 times).

【０１０６】実施例１２ 融合蛋白質の発現分泌と生成物の選択的切断 （１）融合体のアミノ酸および塩基配列 実施例９〜１１で得られた融合体のうち、以下のものの
塩基配列およびアミノ酸配列を配列番号５２、６６およ
び図１７に示した。 MWPsp-MWPmp20-TEV-G〜GH（配列番号５２、６６） Example 12 Expression and Secretion of Fusion Protein and Selective Cleavage of Product (1) Amino Acid and Nucleotide Sequence of the Fusion Among the fusions obtained in Examples 9 to 11, the following nucleotide sequence and amino acid sequence Are shown in SEQ ID NOs: 52 and 66 and FIG. MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH (SEQ ID NOS: 52 and 66)

【０１０７】（２）融合体の発現分泌 実施例９〜１１で得られた各種の融合DNAによってコー
ドされる融合蛋白質の発現を行った。代表例として、MW
Psp-MWPmp20-TEV-G〜GHを発現ベクターに組み込む様式
を図１８に示した。即ち、実施例９〜１１で得られた融
合DNAを組み込んだベクターを制限酵素ApaL IとHind II
I（融合DNAが塩基配列決定用M13プライマーに対して順
方向に挿入されている場合）、あるいは、ApaL IとKpn
I（M13プライマーに対して逆方向に挿入されている場
合）で処理して0.8%アガロース電気泳動を行い、それぞ
れの融合DNAを含むDNA断片を切り出した。切り出したDN
A断片と、ApaL IとHind III（逆方向に挿入されていた
融合DNAの場合はKpn I）でカットしたバチルス・ブレビ
ス用発現ベクターpNU211R2L5（特開平5-304962号公報）
を適量ずつ混ぜ、宝酒造社のDNA ligation kitで16℃30
分反応させることにより融合DNAを発現ベクターに組み
込んだ。得られた発現ベクターでバチルス・ブレビスの
47-5Q株（FERM P-7224、FERM BP-1664 :特開昭60-58074
号公報、特開昭62-201589号公報参照）を公知の方法（M
ethods in Enzymol., 217, 23, (1993)）に従って形質
転換してT2寒天培地（T2寒天培地：ポリペプトン（1
%）、肉エキス（0.5 %）、酵母エキス（0.2 %）、ウラ
シル（0.1 mg/ml）、グルコース（1 %）、エリスロマイ
シン（10μg/ml）、寒天（1.5 %）、pH 7）に播いて、
形質転換体を取得した。(2) Expression and secretion of fusions Fusion proteins encoded by the various fusion DNAs obtained in Examples 9 to 11 were expressed. A typical example is MW
The manner in which Psp-MWPmp20-TEV-G to GH are incorporated into the expression vector is shown in FIG. That is, the vector into which the fusion DNA obtained in Examples 9 to 11 was incorporated was subjected to restriction enzymes ApaL I and Hind II.
I (if the fusion DNA is inserted in the forward direction with respect to the M13 primer for nucleotide sequencing), or ApaL I and Kpn
The mixture was treated with I (when inserted in the opposite direction to the M13 primer) and subjected to 0.8% agarose electrophoresis to cut out a DNA fragment containing each fusion DNA. Cut out DN
Expression vector pNU211R2L5 for Bacillus brevis cut with A fragment and ApaL I and Hind III (Kpn I in the case of fusion DNA inserted in the reverse direction) (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-304962)
Mix at appropriate temperature and use a DNA ligation kit from Takara Shuzo
After the reaction, the fusion DNA was incorporated into the expression vector. Bacillus brevis
47-5Q strain (FERM P-7224, FERM BP-1664: JP-A-60-58074)
JP-A-62-201589) and a known method (M
ethods in Enzymol., 217, 23, (1993)) and transformed into T2 agar medium (T2 agar medium: polypeptone (1
%), Meat extract (0.5%), yeast extract (0.2%), uracil (0.1mg / ml), glucose (1%), erythromycin (10μg / ml), agar (1.5%), pH 7) ,
A transformant was obtained.

【０１０８】形質転換体はT2培地（T2寒天培地から寒天
を除いたもの）で37℃１日間培養してから公知の方法
（Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratoryf(1989)）でプラスミド
DNAを精製し、ApaL IとHind III（あるいは、Kpn I）で
処理してそれぞれの融合DNAが組み込まれているのを確
認した。融合DNAが組み込まれていることが確認できた
形質転換体については、組み込まれた融合DNAでコード
される融合蛋白質の発現分泌を試みた。即ち、T2培地で
37℃で１日培養した菌懸濁液を1/1000容の割合で培地
（ポリペプトン（3%）、酵母エキス（0.４ %）、グルコ
ース（3 %）、MgSO4・7H2O（0.01 %）、MnSO4・4H2O
（0.001 %）、エリスロマイシン（10μg/ml）、pH８）
に添加して30℃で４日間、試験管（2 ml / 20 ml試験
管）あるいは三角フラスコ（50 ml / 500ml三角フラス
コ）で振とう培養した。Transformants were cultured in a T2 medium (T2 agar medium without agar) at 37 ° C. for 1 day, and then cultured in a known manner (Molecular Cloning 2nd ed., A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratoryf (1989))
The DNA was purified and treated with ApaL I and Hind III (or Kpn I) to confirm that each fusion DNA had been incorporated. For the transformants in which the fusion DNA was confirmed to be integrated, expression and secretion of the fusion protein encoded by the integrated fusion DNA were attempted. That is, in T2 medium
The bacterial suspension cultured at 37 ° C. for 1 day was mixed with a medium (polypeptone (3%), yeast extract (0.4%), glucose (3%), MgSO4.7H2O (0.01%) at a rate of 1/1000 volume, MnSO4 ・ 4H2O
(0.001%), erythromycin (10 μg / ml), pH 8)
And shake culture was performed in a test tube (2 ml / 20 ml test tube) or an Erlenmeyer flask (50 ml / 500 ml Erlenmeyer flask) at 30 ° C. for 4 days.

【０１０９】培養後、培地を15,000 rpm、2分遠心して
培養上清を得て、公知の方法（Laemmli, U. K., Natur
e, 227, 680-685, (1970)）で電気泳動による蛋白質の
解析を行った。即ち、培養上清の18μlにバッファ１（1
25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20%glycerol, 4% SDS, 10%
2-mercaptoethanol）を２μl加えて５分間煮沸し、バッ
ファ２（250 mM Tris-HCl (pH 6.5), 50% glycerol, 0.
5% BPB）を４μl加えて市販の15/25％SDSポリアクリル
アミドゲル（第一化学社製）にアプライして電気泳動
（泳動バッファ：100 mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1%
SDS）を行った。電気泳動後クマジ染色して発現分泌の
有無を調べた。After the culture, the medium was centrifuged at 15,000 rpm for 2 minutes to obtain a culture supernatant, which was obtained by a known method (Laemmli, UK, Natur).
e, 227, 680-685, (1970)). That is, buffer 1 (1
25 mM Tris-HCl (pH 6.8), 20% glycerol, 4% SDS, 10%
Add 2 μl of 2-mercaptoethanol and boil for 5 minutes. Buffer 2 (250 mM Tris-HCl (pH 6.5), 50% glycerol, 0.
4 μl of 5% BPB) was applied to a commercially available 15/25% SDS polyacrylamide gel (manufactured by Daiichi Kagaku) and electrophoresed (electrophoresis buffer: 100 mM Tris, 100 mM Tricine, 0.1%
SDS). After electrophoresis, the presence or absence of expression secretion was examined by Kumaji staining.

【０１１０】ヒト成長ホルモン配列をMWPシグナルペプ
チド配列の直後に連結させたMWPsp-GH、TEVプロテアー
ゼ認識配列と変異型ヒト成長ホルモンＧ〜ＧＨとの融合
体、TEV-Ｇ〜ＧＨをMWPシグナルペプチド配列の直後（M
WPsp-TEV-Ｇ〜ＧＨ）、あるいは、MWP蛋白質のＮ末端か
らの１個以上のアミノ酸残基からなる配列の後に連結さ
せたもの（MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8
-, 9-, 10-, 11-, 12,- 14-, 20-, 30-TEV-Ｇ〜ＧＨ）
の発現分泌の結果を図１９に示した。MWPsp-GHの電気泳
動像は、外来ポリペプチド遺伝子が全く組み込まれてい
ないpNU211R2L5と同様であり、成長ホルモンに相当する
明確なバンドは認められなかった。一方、MWPsp-TEV-Ｇ
〜ＧＨおよびMWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-,
8-, 9-,10-, 11-, 12,- 14-, 20-, 30-TEV-Ｇ〜ＧＨで
は、全てにおいてそれぞれの融合蛋白質（矢印）の発現
分泌が認められた。特に、MWPmp1以降に連結された融合
体（MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-,
10-, 11-, 12,- 14-, 20-, 30-TEV-Ｇ〜ＧＨ）の発現
量はMWPsp-TEV-Ｇ〜ＧＨより多かった。MWPsp-GH in which a human growth hormone sequence was ligated immediately after an MWP signal peptide sequence, a fusion of a TEV protease recognition sequence with mutant human growth hormones G to GH, and TEV-G to GH an MWP signal peptide sequence Immediately after (M
WPsp-TEV-G to GH), or those ligated after a sequence consisting of one or more amino acid residues from the N-terminus of the MWP protein (MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5) -, 6-, 7-, 8
-, 9-, 10-, 11-, 12,-14-, 20-, 30-TEV-G to GH)
The results of expression and secretion of are shown in FIG. The electrophoresis image of MWPsp-GH was similar to that of pNU211R2L5 in which no foreign polypeptide gene had been incorporated, and a clear band corresponding to growth hormone was not observed. On the other hand, MWPsp-TEV-G
~ GH and MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-,
In all of 8-, 9-, 10-, 11-, 12,-14-, 20-, and 30-TEV-G to GH, expression and secretion of each fusion protein (arrow) was observed. In particular, fusions linked after MWPmp1 (MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-,
10-, 11-, 12,-14-, 20-, 30-TEV-G to GH) were more expressed than MWPsp-TEV-G to GH.

【０１１１】（３）ヒト成長ホルモン、GHおよび変異型
ヒト成長ホルモン、Ｇ〜ＧＨの同定 ヒト成長ホルモン、変異型ヒト成長ホルモンの同定は、
ヒト成長ホルモンに対する抗体を用いて免疫学的に行っ
た（ウエスタンブロッティング法）。（２）で得られた
それぞれの形質転換体を培養して得られた培地を1.5000
rpm、２分遠心、その培養上清1μlを（２）と同様に電
気泳動したのち、公知の方法（Towbin,H.ら、76, 4350-
4354, (1979)）で電気的にニトロセルロースメンブレン
にブロットした。次に、メンブレンをバッファ３（20 m
M Tris-HCl (pH 7.4), 150 mMNaCl, 0.1% Tween 20）に
溶かした5%スキムミルク溶液に15 min浸してから、バッ
ファ３で2000倍希釈したウサギ抗ヒト成長ホルモン抗体
（Biostride, Inc.社製）に30分間振とうしながら浸し
た。その後、バッファ３で10分間振とうしながら３回洗
浄し、バッファ３で2000倍希釈したペルオキシダーゼ標
識抗ウサギIgG抗体（E-Y Laboratories社製）に30分間
振とうしながら浸した。浸せき終了後、バッファ３で10
分間振とうしながら３回洗浄し、アマシャム社のECL検
出キットを用いてGHおよびＧ〜ＧＨの存在を調べた。方
法はキットの取り扱い説明書に従った。図２０に示され
るように、外来ポリペプチド遺伝子が全く組み込まれて
いないpNU211R2L5を除いた全ての融合体、即ち、MWPsp-
GH、MWPsp-TEV-Ｇ〜ＧＨ、MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-,
5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,- 14-, 20-,30-TE
V-Ｇ〜ＧＨにシグナルが検出された。ヒト成長ホルモン
配列をMWPシグナルペプチド配列の直後に連結させたMWP
sp-GHにおいては、SDS-PAGE後のクマジ染色でヒト成長
ホルモンに相当するバンドが検出されなかったが、ウエ
スタンブロッティング法ではシグナルが検出された。ウ
エスタンブロッティング法はクマジ染色に比べて検出感
度が優れている点を考慮すると、ヒト成長ホルモンはMW
Pシグナルペプチドの直後に連結されて発現分泌はする
が発現量は少ないことを示している。(3) Identification of Human Growth Hormone, GH and Mutant Human Growth Hormone, G to GH
It was performed immunologically using an antibody against human growth hormone (Western blotting method). The culture medium obtained by culturing each of the transformants obtained in (2) was 1.5000
After centrifugation at 2 rpm for 2 minutes and electrophoresis of 1 µl of the culture supernatant in the same manner as in (2), a known method (Towbin, H. et al., 76 , 4350-
4354, (1979)). Next, store the membrane in buffer 3 (20 m
A rabbit anti-human growth hormone antibody (Biostride, Inc.) diluted 2,000-fold with Buffer 3 after immersion for 15 min in a 5% skim milk solution dissolved in M Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) ) With shaking for 30 minutes. Thereafter, the plate was washed three times with shaking in buffer 3 for 10 minutes, and immersed in a peroxidase-labeled anti-rabbit IgG antibody (manufactured by EY Laboratories) diluted 2000 times with buffer 3 for 30 minutes with shaking. After immersion, 10 in buffer 3
After washing three times while shaking for 1 minute, the presence of GH and G to GH was examined using an ECL detection kit from Amersham. The method followed the instruction manual of the kit. As shown in FIG. 20, all fusions except for pNU211R2L5 in which no foreign polypeptide gene has been integrated, ie, MWPsp-
GH, MWPsp-TEV-G to GH, MWPsp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-,
5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12,-14-, 20-, 30-TE
Signals were detected in V-G to GH. MWP with a human growth hormone sequence linked immediately after the MWP signal peptide sequence
In sp-GH, a band corresponding to human growth hormone was not detected by Kumazi staining after SDS-PAGE, but a signal was detected by Western blotting. Considering that the Western blotting method has better detection sensitivity than Kumazi staining, human growth hormone is MW
This indicates that the gene is secreted immediately after the P signal peptide, and the expression level is small.

【０１１２】（４）変異型ヒト成長ホルモンの切断 融合DNA、MWPsp-MWPmp20-TEV-Ｇ〜ＧＨを組み込んだ発
現ベクターを含む形質転換体を１晩培養して得られた培
養懸濁液1/1000容を（２）の発現に用いたものと同じ培
地を50 ml含んだ500 mlの三角フラスコ（10本）に加え
て30℃、４日間振とう培養した。得られた培地を４℃で
10,000 rpm、20 min遠心し、その培養上清にEDTA（最終
濃度5mM ）を加え、さらに飽和硫安60%として塩析し
た。10,000rpm、20 minの遠心の後、ペレットを適量の
トリスー塩酸バッファ（20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, p
H 8）に溶かし、Sephadex G-25（ファルマシア社製）に
アプライしてバッファ交換を行った。次に、バッファＡ
（ 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 M Urea, 20% propan
ol, pH 8）で平衡化させた陰イオン交換樹脂（ファルマ
シア社製、QXL）にアプライして樹脂に吸着させ、バッ
ファＡに1 M NaClを含んだバッファＢでグラジェントを
かけて溶出した。220〜300 mM NaCl付近で溶出された抗
ヒト成長ホルモン抗体陽性の画分をバッファＣ（0.1% T
FA, 10% アセトニトリル）で置換しながらウルトラフリ
ー（ミリポア社製、UFV2BCC40）で濃縮した。次に、フ
ァルマシア社製のRPCカラムにアプライして逆相クロマ
トグラフィーを行った。バッファＤ（0.1% TFA, 60% ア
セトニトリル）でグラジェントをかけながら溶出したと
ころ、目的の融合蛋白質、MWPmp20-TEV-Ｇ〜ＧＨは45〜
50%のアセトニトリルで溶出された。得られた融合蛋白
質は、 2 mM Tris -HCl （pH8）に透析してからTEVプロ
テアーゼ処理実験に用いた。融合蛋白質5 μgをTEVプロ
テアーゼ（GIBCO BRL社、5U）で処理（方法は製品に添
付されたプロトコールに従った）して変異型ヒト成長ホ
ルモンＧ〜ＧＨを切り出した。図２１に切断の様子のSD
S-PAGE像、図２２にウエスタンブロッティング像を示し
た。SDS-PAGE、ウエスタンブロッティングはそれぞれ
（２）、（３）と同様な方法で行った。陽性対象として
アプライした市販のヒト成長ホルモンと同じ位置（矢
印）に、Ｎ末端に余分なGlyをもつ変異型ヒト成長ホル
モンＧ〜ＧＨが切り出されてくることが示された。(4) Cleavage of Mutant Human Growth Hormone A culture suspension obtained by culturing overnight a transformant containing an expression vector into which the fusion DNA and MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH have been incorporated. 1000 volumes were added to 500 ml Erlenmeyer flasks (10 tubes) containing 50 ml of the same medium used for expression in (2), and cultured with shaking at 30 ° C. for 4 days. The obtained medium is heated at 4 ° C.
The mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 20 minutes, and EDTA (final concentration: 5 mM) was added to the culture supernatant. After centrifugation at 10,000 rpm for 20 min, the pellet was washed with an appropriate amount of Tris-HCl buffer (20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, p
H8) and applied to Sephadex G-25 (Pharmacia) to exchange the buffer. Next, buffer A
(20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 M Urea, 20% propan
ol, pH 8), applied to an anion exchange resin (QXL, manufactured by Pharmacia), adsorbed to the resin, and eluted with a buffer B containing 1 M NaCl in buffer A with a gradient. The anti-human growth hormone antibody-positive fraction eluted around 220 to 300 mM NaCl was buffer C (0.1% T
The solution was concentrated with Ultrafree (UFV2BCC40, manufactured by Millipore) while replacing with FA, 10% acetonitrile). Next, the mixture was applied to an RPC column manufactured by Pharmacia and subjected to reverse phase chromatography. When eluted with buffer D (0.1% TFA, 60% acetonitrile) while applying a gradient, the target fusion protein, MWPmp20-TEV-G to GH was 45-
Eluted with 50% acetonitrile. The obtained fusion protein was dialyzed against 2 mM Tris-HCl (pH 8) and then used in a TEV protease treatment experiment. 5 μg of the fusion protein was treated with TEV protease (GIBCO BRL, 5U) (method according to the protocol attached to the product) to cut out mutant human growth hormones G to GH. Figure 21 shows the cutting SD
An S-PAGE image and a western blotting image are shown in FIG. SDS-PAGE and Western blotting were performed in the same manner as in (2) and (3), respectively. It was shown that mutant human growth hormones G to GH having an extra Gly at the N-terminus were cut out at the same position (arrow) as a commercially available human growth hormone applied as a positive control.

【０１１３】なお補足として、その他のポリペプチドと
してｈNGF、ｍLIF、ｂSCF、ｈPDGF-Bを上記実施例と同
様の手法で発現を試みたが、MWPのN末端からのアミノ酸
残基数を10、40および100個としたときには全く分泌は
認められなかった。このことは、MWPのN末端からの1個
以上のアミノ酸残基との融合により分泌が可能になるか
否かは外来ポリペプチドの種類に依存する可能性を示し
ている。As a supplement, expression of hNGF, mlIF, bSCF and hPDGF-B as other polypeptides was attempted in the same manner as in the above Examples, but the number of amino acid residues from the N-terminal of MWP was 10, 40. No secretion was observed at 100 and 100. This indicates that whether fusion with one or more amino acid residues from the N-terminus of MWP enables secretion may depend on the type of foreign polypeptide.

【０１１４】[0114]

【発明の効果】本発明により、バチルス属の発現系にお
いて、外来ポリペプチドを新規な融合形態で高発現分泌
を可能にし、かつ選択的な化学的または酵素的切断によ
る天然型構造をもつポリペプチドの製造を可能にした。Industrial Applicability According to the present invention, in a Bacillus genus expression system, a foreign polypeptide can be highly expressed and secreted in a novel fusion form, and has a natural structure by selective chemical or enzymatic cleavage. Made possible.

【０１１５】[0115]

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> ITOHAM FOODS INC. and Shigezo Udaka <120> DNAS ENCODING NEW FUSION PROTEINS AND PROCESSES FOR PREPARING USEF UL POLYPEPTIDES THROUGH EXPRESSION OF THE DNAS <130> P99-0068 <150> JP10-87339 <151> 1998-03-31 <160> 61 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a linker useful for expression and secretion of a fu sion protein. <400> 1 Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a sequence required for cleaving out a polypeptide o f interest with TEV protease. <400> 2 Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus brevis <300> <303> J. Bacteriol. <304> 169 <306> 1239-1245 <307> 1987 <400> 3 Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus brevis <300> <303> J. Bacteriol. <304> 170 <306> 176-186 <307> 1988 <400> 4 Ala Pro Lys Asp Gly Ile Tyr Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus brevis <300> <303> J. Bacteriol. <304> 172 <306> 1312-1320 <307> 1990 <400> 5 Ala Glu Asp Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus brevis <300> <303> J. Bacteriol. <304> 169 <306> 1239-1245 <307> 1987 <400> 6 gtcgttaaca gtgtattgct 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Bacillus brevis <300> <303> J. Bacteriol. <304> 170 <306> 935-945 <307> 1988 <400> 7 tggagctgta gtagttgctg cttcttctgc 30 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward oligonucleotide encoding (His)₆. <400> 8 catcatcatc atcatcac 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse oligonucleotide encoding (His)₆. <400> 9 gtgatgatga tgatgatg 18 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse oligonucleotide encoding the linker Gly Se r Pro Val Pro Ser Gly. <400> 10 tccagaaggt actggagaac c 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <303> Nature <304> 282 <306> 525-527 <307> 1979 <400> 11 atggccctgt ggatgcgcc 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <303> Nature <304> 282 <306> 525-527 <307> 1979 <400> 12 ctagttgcag tagttctcc 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward primer for PCR amplification of human proi nsulin DNA. <400> 13 tttgtgaacc aacacctg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p6 DNA. <400> 14 agttgctgct tcttctgc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p8 DNA. <400> 15 tgtagtagtt gctgcttc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p9 DNA. <400> 16 agctgtagta gttgctgc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p11 DNA. <400> 17 ttttggagct gtagtagt 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p12 DNA. <400> 18 catttttgga gctgtagt 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p15 DNA. <400> 19 atcagcgtcc atttttgg 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p40 DNA. <400> 20 gtctacaccg tattcgccgt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p50 DNA. <400> 21 agtagcgaac tctgcacgag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p100 DNA. <400> 22 agatttgtcc gggaaacctt 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of (His)₆-Lin ker-Met-Proinsulin DNA. <400> 23 ctagttgcag tagttctc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p1 DNA. <400> 24 tgctgcgaaa gccattgg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p2 DNA. <400> 25 ttctgctgcg aaagccat 18 <210> 26 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p3 DNA. <400> 26 ttcttctgct gcgaaagc 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p4 DNA. <400> 27 tgcttcttct gctgcgaa 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p5 DNA. <400> 28 tgctgcttct tctgctgc 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p7 DNA. <400> 29 agtagttgct gcttcttc 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p13 DNA. <400> 30 gtccattttt ggagctgt 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p14 DNA. <400> 31 agcgtccatt tttggagc 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p17 DNA. <400> 32 ttccatatca gcgtccat 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p20 DNA. <400> 33 tacggttttt tccatatcag c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp DNA. <400> 34 tgcgaaagcc attggagcaa c 21 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tctgctaact caaacccg 18 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ctaacaggat gtgaaagtct t 21 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 aactctgact ccgaatgc 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 acgcagttcc caccattt 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p10-(His)₆-TEV DNA. <400> 39 ttggaagtac aggttttc 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 cacagccaag gtactttc 18 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of human gluc agon DNA. <400> 41 ttaagtgttc atcagccatt g 21 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward primer for PCR amplification of V8-Glucago n DNA. <400> 42 ttcctggaac acagccaa 18 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p30 DNA. <400> 43 tgctaccagg ccaagagctt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <303> Nucleic Acids Res. <304> 7 <306> 305-320 <307> 1979 <400> 44 atggctacag gctcccggac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <300> <303> Science <304> 205 <306> 602-607 <307> 1979 <400> 45 ctagaagcca cagctgccct 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward primer for PCR amplification of human grow th hormone DNA. <400> 46 ttcccaacca ttcccttatc 20 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward primer for PCR amplification of DNA for m utant human growth hormone with Gly at the N-terminus (G-GH). <400> 47 ggtttcccaa ccattccctt atc 23 <210> 48 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp10-(His)₆- Linker-Met-Proinsulin. <400> 48 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca catcatcatc atcatcacgg ttctccagta 120 ccttctggaa tgtttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 180 ctagtgtgcg gggaaagagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 240 ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 300 gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 360 tccctctacc agctggagaa ctactgcaac 390 <210> 49 <211> 351 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp10-Met-Pro insulin. <400> 49 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca atgtttgtga accaacacct gtgcggctca 120 cacctggtgg aagctctcta cctagtgtgc ggggaaagag gcttcttcta cacacccaag 180 acccgccggg aggcagagga cctgcaggtg gggcaggtgg agctgggcgg gggccctggt 240 gcaggcagcc tgcagccctt ggccctggag gggtccctgc agaagcgtgg cattgtggaa 300 caatgctgta ccagcatctg ctccctctac cagctggaga actactgcaa c 351 <210> 50 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp20-(His)₆- EGF-TEV-Somatostatin 28. <400> 50 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120 catcatcatc atcatcacaa ctctgactcc gaatgcccgc tgtctcacga cggttattgc 180 ctgcatgatg gtgtttgtat gtatatcgaa gctctggaca aatatgcttg caactgtgtt 240 gttggttaca tcggtgagcg ttgccagtat cgcgacctga aatggtggga actgcgtgac 300 tatgatatcc cgaccactga aaacctgtac ttccaatctg ctaactcaaa cccggctatg 360 gcaccccgag aacgcaaagc tggctgcaag aatttcttct ggaagacttt cacatcctgt 420 <210> 51 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp20-(His)₆- Linker-V8-Glucagon. <400> 51 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120 catcatcatc atcatcacgg ttctccagta ccttctggat tcctggaaca cagccaaggt 180 actttcacat ccgactactc taaatatctg gattcccgtc gcgctcaaga tttcgttcaa 240 tggctgatga acact 255 <210> 52 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp20-TEV-G-G H. <400> 52 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120 gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaag gtttcccaac cattccctta 180 tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac 240 acctaccagg agtttgaaga agcctatatc ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag 300 aacccccaga cctccctctg tttctcagag tctattccga caccctccaa cagggaggaa 360 acacaacaga aatccaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg 420 ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct 480 gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg 540 aggctggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600 gacacaaact cacacaacga tgacgcacta ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc 660 aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag 720 ggcagctgtg gcttc 735 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward oligonucleotide encoding the linker Gly Se r Pro Val Pro Ser Gly. <400> 53 ggttctccag taccttctgg a 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward oligonucleotide for PCR amplification of M et-Proinsulin DNA. <400> 54 atgtttgtga accaacacct g 21 <210> 55 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 55 tctgctaact caaacccggc tatggcaccc cgagaacgca aagctggctg caagaatttc 60 ttctggaaga ctttcacatc ctgttag 87 <210> 56 <211> 169 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 aactctgact ccgaatgccc gctgtctcac gacggttatt gcctgcatga tggtgtttgt 60 atgtatatcg aagctctgga caaatatgct tgcaactgtg ttgttggtta catcggtgag 120 cgttgccagt atcgcgacct gaaatggtgg gaactgcgtt ctgctaact 169 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward oligonucleotide encoding an amino acid seq uence recognized by TEV protease. <400> 57 gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaa 39 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a reverse oligonucleotide encoding an amino acid seq uence recognized by TEV protease <400> 58 ttggaagtac aggttttcag tggtcgggat atcatagtc 39 <210> 59 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 cacagccaag gtactttcac atccgactac tctaaatatc tggattcccg tcgcgctcaa 60 gatttcgttc aatggctgat gaacact 87 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a forward primer for PCR amplification of TEV-G-GH D NA. <400> 60 gactatgata tcccgaccac t 21 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is a tag for separation/purification of a fusion protei n. <400> 61 His His His His His His 15 <210> 62 <211> 130 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linke r-Met-Proinsulin. <400> 62 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro His His 20 25 30 His His His His Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly Met Phe Val Asn Gln 35 40 45 His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly 50 55 60 Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val 100 105 110 Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr 115 120 125 Cys Asn 130 <210> 63 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsul in. <400> 63 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Met Phe 20 25 30 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 35 40 45 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly 65 70 75 80 Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg 85 90 95 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 100 105 110 Glu Asn Tyr Cys Asn 115 <210> 64 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-T EV-Somatostatin 28. <400> 64 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 20 25 30 Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asn Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly 50 55 60 Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val 65 70 75 80 Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp 85 90 95 Glu Leu Arg Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 100 105 110 Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 115 120 125 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 130 135 140 <210> 65 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linke r-V8-Glucagon. <400> 65 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 20 25 30 Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Gly Ser 35 40 45 Pro Val Pro Ser Gly Phe Leu Glu His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser 50 55 60 Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln 65 70 75 80 Trp Leu Met Asn Thr 85 <210> 66 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20-TEV-G-GH. <400> 66 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 20 25 30 Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu 35 40 45 Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe 50 55 60 Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp 65 70 75 80 Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr 85 90 95 Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile 100 105 110 Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu 115 120 125 Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 130 135 140 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser 145 150 155 160 Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln 165 170 175 Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile 180 185 190 Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp 195 200 205 Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met 210 215 220 Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu 225 230 235 240 Gly Ser Cys Gly Phe 245[Sequence List] SEQUENCE LISTING <110> ITOHAM FOODS INC. And Shigezo Udaka <120> DNAS ENCODING NEW FUSION PROTEINS AND PROCESSES FOR PREPARING USEF UL POLYPEPTIDES THROUGH EXPRESSION OF THE DNAS <130> P99-0068 <150> JP10-87339 <151 > 1998-03-31 <160> 61 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a linker useful for expression and secretion of a fu sion protein. <400> 1 Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly 1 5 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a sequence required for cleaving out a polypeptide of interest with TEV protease. <400> 2 Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus brevis <300><303> J. Bacteriol. <304> 169 <306> 1239-1245 <307> 1987 <400> 3 Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Thr Ala Pro 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus brevis <300><303> J. Bacteriol. <304> 170 <306> 176-186 <307> 1988 <400> 4 Ala Pro Lys Asp Gly Ile T yr Ile Gly Gly 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Bacillus brevis <300><303> J. Bacteriol. <304> 172 <306> 1312-1320 <307> 1990 <400 > 5 Ala Glu Asp Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 1 5 10 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Bacillus brevis <300><303> J. Bacteriol. <304> 169 <306> 1239 -1245 <307> 1987 <400> 6 gtcgttaaca gtgtattgct 20 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Bacillus brevis <300><303> J. Bacteriol. <304> 170 <306> 935-945 <307> 1988 <400> 7 tggagctgta gtagttgctg cttcttctgc 30 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward oligonucleotide encoding (His) _6. <400> 8 catcatcatc atcatcac 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse oligonucleotide encoding (His) _6. <400> 9 gtgatgatga tgatgatg 18 <210> 10 <211 > 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse oligonucleotide encoding the linker Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly. <400> 10 tccagaaggt actggagaac c 21 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <300><303> Nature <304> 282 <306> 525-527 <307> 1979 <400> 11 atggccctgt ggatgcgcc 19 <210> 12 <211> 19 <212 > DNA <213> Homo sapiens <300><303> Nature <304> 282 <306> 525-527 <307> 1979 <400> 12 ctagttgcag tagttctcc 19 <210> 13 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward primer for PCR amplification of human proi nsulin DNA. <400> 13 tttgtgaacc aacacctg 18 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p6 DNA. <400> 14 agttgctgct tcttctgc 18 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p8 DNA. <400> 15 tgtagtagtt gctgcttc 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p9 DNA. <400> 16 agctgtagta gttgctgc 18 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial S equence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p11 DNA. <400> 17 ttttggagct gtagtagt 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p12 DNA. <400> 18 catttttgga gctgtagt 18 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p15 DNA. <400> 19 atcagcgtcc atttttgg 18 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p40 DNA. <400> 20 gtctacaccg tattcgccgt 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p50 DNA. <400> 21 agtagcgaac tctgcacgag 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p100 DNA. <400> 22 agatttgtcc gggaaacct t 20 <210> 23 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin DNA. <400> 23 ctagttgcag tagttctc 18 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p1 DNA. <400> 24 tgctgcgaaa gccattgg 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p2 DNA. <400> 25 ttctgctgcg aaagccat 18 <210> 26 <211 > 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p3 DNA. <400> 26 ttcttctgct gcgaaagc 18 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p4 DNA. <400> 27 tgcttcttct gctgcgaa 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplifi cation of MWPsp-MWPm p5 DNA. <400> 28 tgctgcttct tctgctgc 18 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p7 DNA. <400> 29 agtagttgct gcttcttc 18 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p13 DNA. <400 > 30 gtccattttt ggagctgt 18 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p14 DNA. <400> 31 agcgtccatt tttggagc 18 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p17 DNA. <400> 32 ttccatatca gcgtccat 18 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p20 DNA. <400> 33 tacggttttt tccatatcag c 21 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp DNA. <400> 34 tgcgaaagcc attggagcaa c 21 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 tctgctaact caaacccg 18 <210> 36 <211 > 21 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 ctaacaggat gtgaaagtct t 21 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 aactctgact ccgaatgc 18 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 38 acgcagttcc caccattt 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp -MWPm p10- (His) ₆ -TEV DNA. <400> 39 ttggaagtac aggttttc 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 40 cacagccaag gtactttc 18 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of human glucagon DNA. <400> 41 ttaagtgttc atcagccatt g 21 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward primer for PCR amplification of V8-Glucago n DNA. <400> 42 ttcctggaac acagccaa 18 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPm p30 DNA. <400 > 43 tgctaccagg ccaagagctt 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <300><303> Nucleic Acids Res. <304> 7 <306> 305-320 <307> 1979 <400> 44 atggctacag gctcccggac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <300><303> Science <304> 205 <306> 602-607 <307> 1979 <400> 45 ctagaagcca cagctgccct 20 <210 > 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward primer for PCR amplification of human grow th hormone DNA. <400> 46 ttcccaacca ttcccttatc 20 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward primer for PCR amplification of DNA for mutant human growth hormone with Gly at the N-terminus (G-GH). <400> 47 ggtttcccaa ccattccctt atc 23 <210> 48 <211> 390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a nucle otide sequence encoding MWPsp-MWPmp10- (His ) 6 -. Linker-Met-Proinsulin <400> 48 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca catcatcatc atcatcacgg ttctccagta 120 ccttctggaa tgtttgtgaa ccaacacctg tgcggctcac acctggtgga agctctctac 180 ctagtgtgcg gggaaagagg cttcttctac acacccaaga cccgccggga ggcagaggac 240 ctgcaggtgg ggcaggtgga gctgggcggg ggccctggtg caggcagcct gcagcccttg 300 gccctggagg ggtccctgca gaagcgtggc attgtggaac aatgctgtac cagcatctgc 360 tccctcc ag <tg>cta><file><m><file> -Met-Pro insulin. <400> 49 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca atgtttgtga accaacacct gtgcggctca 120 cacctggtgg aagctctcta cctagtgtgc ggggaaagag gcttcttcta cacacccaag 180 acccgccggg aggcagagga cctgcaggtg gggcaggtgg agctgggcgg gggccctggt 240 gcaggcagcc tgcagccctt ggccctggag gggtccctgc agaagcgtgg cattgtggaa 300 caatgctgta ccagcatctg ctccctctac cagctggaga actactgcaa c 351 <210> 50 <211> 420 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp20- (His) 6 - EGF -TEV-Somatostatin 28. <400> 50 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120 catcatcatc atcatcacaa ctctgactcc gaatgcccgc tgtctcacga cggttattgc 180 ctgcatgatg gtgtttgtat gtatatcgaa gctctggaca aatatgcttg caactgtgtt 240 gttggttaca tcggtgagcg ttgccagtat cgcgacctga aatggtggga actgcgtgac 300 tatgatatcc cgaccactga aaacctgtac ttccaatctg ctaactcaaa cccggctatg 360 gcaccccgag aacgcaaagc tggctgcaag aatttcttct ggaagacttt cacatcctgt 420 <210> 51 <211> 255 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8 -Glucagon. <400> 51 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaa g cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120 catcatcatc atcatcacgg ttctccagta ccttctggat tcctgtgagaca cagccaaggt 180 actttcacat ccgactactc taaatatctg gattccc <c>gt><ac> tac tacgt tca tca tca tca tca tca tca tca tca tca tca> nucleotide sequence encoding MWPsp-MWPmp20-TEV-GG H. <400> 52 gtcgttaaca gtgtattggc tagtgcactc gcacttactg ttgctccaat ggctttcgca 60 gcagaagaag cagcaactac tacagctcca aaaatggacg ctgatatgga aaaaaccgta 120 gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaag gtttcccaac cattccctta 180 tccaggcttt ttgacaacgc tatgctccgc gcccatcgtc tgcaccagct ggcctttgac 240 acctaccagg agtttgaaga agcctatatc ccaaaggaac agaagtattc attcctgcag 300 aacccccaga cctccctctg tttctcagag tctattccga caccctccaa cagggaggaa 360 acacaacaga aatccaacct agagctgctc cgcatctccc tgctgctcat ccagtcgtgg 420 ctggagcccg tgcagttcct caggagtgtc ttcgccaaca gcctggtgta cggcgcctct 480 gacagcaacg tctatgacct cctaaaggac ctagaggaag gcatccaaac gctgatgggg 540 aggc tggaag atggcagccc ccggactggg cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600 gacacaaact cacacaacga tgacgcacta ctcaagaact acgggctgct ctactgcttc 660 aggaaggaca tggacaaggt cgagacattc ctgcgcatcg tgcagtgccg ctctgtggag 720 ggcagctgtg gcttc 735 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward oligonucleotide encoding the linker Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly. <400> 53 ggttctccag taccttctgg a 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward oligonucleotide for PCR amplification of Met-Proinsulin DNA. <210> 56 <211> 169 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 aactctgact ccgaatgccc gctgtctcac gacggttatt gcctgcatga tggtgtttgt 60 atgtatatcg aagctctgga caaatatgct tgcaactgtg ttgttggg 120g cgtt ctgctaact 169 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a forward oligonucleotide encoding an amino acid seq uence recognized by TEV protease. <400> 57 gactatgata tcccgaccac tgaaaacctg tacttccaa 39 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a reverse oligonucleotide encoding an amino acid seq uence recognized by TEV protease <400> 58 ttggaagtac aggttttcag tggtcgggat atcatagtc 39 <210 > 59 <211> 87 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 59 cacagccaag gtactttcac atccgactac tctaaatatc tggattcccg tcgcgctcaa 60 gatttcgttc aatggctgat gaacact 87 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <223> Designated is a forward primer for PCR amplification of TEV-G-GH DNA. <400> 60 gactatgata tcccgaccac t 21 <210> 61 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is a tag for separation / purification of a fusion protei n. <400> 61 His His His His His His 15 <210> 62 <211> 130 <212> PRT <213> A rtificial Sequence <220><223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker r-Met-Proinsulin. <400> 62 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro His His 20 25 30 His His His His Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly Met Phe Val Asn Gln 35 40 45 His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly 50 55 60 Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu Ala Glu Asp 65 70 75 80 Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg Gly Ile Val 100 105 110 Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr 115 120 125 Cys Asn 130 <210> 63 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsul in. <400> 63 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Th r Ala Pro Met Phe 20 25 30 Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 35 40 45 Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Glu 50 55 60 Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro Gly 65 70 75 80 Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys Arg 85 90 95 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu 100 105 110 Glu Asn Tyr Cys Asn 115 <210> 64 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF -T EV-Somatostatin 28. <400> 64 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 20 25 30 Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His His Asn Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Cys Pro Leu Ser His Asp Gly Tyr Cys Leu His Asp Gly 50 55 60 Val Cys Met Tyr Ile Glu Ala Leu Asp Lys Tyr Ala Cys Asn Cys Val 65 70 75 80 Val Gly Tyr Ile Gly Glu Arg Cys Gln Tyr Arg Asp Leu Lys Trp Trp 85 90 95 Glu Leu Arg Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu Asn Leu Tyr Phe Gln 100 105 110 Ser Ala Asn Ser Asn Pro Ala Met Ala Pro Arg Glu Arg Lys Ala Gly 115 120 125 Cys Lys Asn Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys 130 135 140 <210> 65 <211> 85 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20- (His) _6- Linker r-V8-Glucagon. <400> 65 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 20 25 30 Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val His His His His His Gly Ser 35 40 45 Pro Val Pro Ser Gly Phe Leu Glu His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser 50 55 60 Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln 65 70 75 80 Trp Leu Met Asn Thr 85 <210> 66 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220><223> Designated is an amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20-TEV- G-GH. <400> 66 Val Val Asn Ser Val Leu Ala Ser Ala Leu Ala Leu Thr Val Ala Pro 1 5 10 15 Met Ala Phe Ala Ala Glu Glu Ala Ala Thr Thr Thr Ala Pro Lys Met 20 25 30 Asp Ala Asp Met Glu Lys Thr Val Asp Tyr Asp Ile Pro Thr Thr Glu 35 40 45 Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe 50 55 60 Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp 65 70 75 80 Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr 85 90 95 Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile 100 105 110 Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu 115 120 125 Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val 130 135 140 Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser 145 150 155 160 Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln 165 170 175 Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile 180 185 190 Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp 195 200 205 Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met 210 215 220 Asp Lys Val Gl u Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu 225 230 235 240 Gly Ser Cys Gly Phe 245

【０１１６】[0116]

【配列表フリーテキスト】配列番号１：融合蛋白の発現
・分泌に有用なリンカーを示す。 配列番号２： TEVにより目的ポリペプチドを切り出すの
に必要とされる配列を示す。 配列番号８：（His）₆をコードする順方向オリゴヌクレ
オチドを示す。 配列番号９：（His）₆をコードする逆方向オリゴヌクレ
オチドを示す。 配列番号１０： Gly Ser Pro Val Pro Ser Glyなるリン
カーをコードする逆方向オリゴヌクレオチドを示す。[Sequence List Free Text] SEQ ID NO: 1: Shows a linker useful for expression and secretion of fusion protein. SEQ ID NO: 2 shows a sequence required to excise a target polypeptide by TEV. SEQ ID NO: 8: shows a forward oligonucleotide encoding (His) ₆ SEQ ID NO: 9: shows a reverse oligonucleotide encoding (His) ₆ SEQ ID NO: 10 shows an inverted oligonucleotide encoding a linker Gly Ser Pro Val Pro Ser Gly.

【０１１７】配列番号１３：ヒトプロインスリンDNAのP
CR増幅用の順方向プライマーを示す。 配列番号１４： MWPsp-MWPmp6 DNAのPCR増幅用の逆方向
プライマーを示す。 配列番号１５： MWPsp-MWPmp８ DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。 配列番号１６： MWPsp-MWPmp９ DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。 配列番号１７： MWPsp-MWPmp１１ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。SEQ ID NO: 13: P of human proinsulin DNA
3 shows a forward primer for CR amplification. SEQ ID NO: 14: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp6 DNA SEQ ID NO: 15: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp8 DNA SEQ ID NO: 16: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp9 DNA SEQ ID NO: 17 shows a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp11 DNA.

【０１１８】配列番号１８： MWPsp-MWPmp１２ DNAのPC
R増幅用の逆方向プライマーを示す。 配列番号１９： MWPsp-MWPmp１５ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号２０： MWPsp-MWPmp４０ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号２１： MWPsp-MWPmp５０ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号２２： MWPsp-MWPmp100 DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。SEQ ID NO: 18: PC of MWPsp-MWPmp12 DNA
The reverse primer for R amplification is shown. SEQ ID NO: 19: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp15 DNA SEQ ID NO: 20: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp40 DNA SEQ ID NO: 21: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp50 DNA SEQ ID NO: 22: shows a reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp100 DNA.

【０１１９】配列番号２３： (His)₆-Linker-Met-Proin
sulin DNAのPCR増幅用の逆方向プライマーを示す。SEQ ID NO: 23: (His) ₆ -Linker-Met-Proin
The reverse primer for PCR amplification of sulin DNA is shown.

【０１２０】配列番号２４： MWPsp-MWPmp１ DNAのPCR
増幅用の逆方向プライマーを示す。 配列番号２５： MWPsp-MWPmp２ DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。 配列番号２６： MWPsp-MWPmp３ DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。 配列番号２７： MWPsp-MWPmp４ DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。 配列番号２８： MWPsp-MWPmp５ DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。SEQ ID NO: 24: PCR of MWPsp-MWPmp1 DNA
2 shows a reverse primer for amplification. SEQ ID NO: 25: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp2 DNA. SEQ ID NO: 26: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp3 DNA. SEQ ID NO: 27: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp4 DNA. SEQ ID NO: 28: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp5 DNA.

【０１２１】配列番号２９： MWPsp-MWPmp７ DNAのPCR
増幅用の逆方向プライマーを示す。 配列番号３０： MWPsp-MWPmp１３ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号３１： MWPsp-MWPmp１４ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号３２： MWPsp-MWPmp１７ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号３３： MWPsp-MWPmp２０ DNAのPCR増幅用の逆
方向プライマーを示す。 配列番号３４： MWPsp DNAのPCR増幅用の逆方向プライ
マーを示す。SEQ ID NO: 29: PCR of MWPsp-MWPmp7 DNA
2 shows a reverse primer for amplification. SEQ ID NO: 30: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp13 DNA. SEQ ID NO: 31: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp14 DNA. SEQ ID NO: 32: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp17 DNA. SEQ ID NO: 33: Reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp20 DNA SEQ ID NO: 34: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp DNA.

【０１２２】配列番号３９： MWPsp-MWPmp10-(His)₆-TE
V DNAのPCR増幅用の逆方向プライマーを示す。 配列番号４１：ヒトグルカゴンDNAのPCR増幅用の逆方向
プライマーを示す。 配列番号４２： V8-グルカゴンDNAのPCR増幅用の順方向
プライマーを示す。 配列番号４３： MWPsp-MWPmp30 DNAのPCR増幅用の逆方
向プライマーを示す。 配列番号４６：ヒト成長ホルモンDNAのPCR増幅用の順方
向プライマーを示す。SEQ ID NO: 39: MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -TE
5 shows reverse primers for PCR amplification of V DNA. SEQ ID NO: 41: This shows a reverse primer for PCR amplification of human glucagon DNA. SEQ ID NO: 42: This shows the forward primer for PCR amplification of V8-glucagon DNA. SEQ ID NO: 43: This shows the reverse primer for PCR amplification of MWPsp-MWPmp30 DNA. SEQ ID NO: 46: This shows the forward primer for PCR amplification of human growth hormone DNA.

【０１２３】配列番号４７： N末端にGlyをもつ変異体
ヒト成長ホルモン（G-GH）DNAのPCR増幅用の順方向プラ
イマーを示す。 配列番号４８： MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Proinsu
linをコードする塩基配列を示す。 配列番号４９： MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulinをコー
ドする塩基配列を示す。 配列番号５０： MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somato
statin 28をコードする塩基配列を示す。 配列番号５１： MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Gluc
agonをコードする塩基配列を示す。SEQ ID NO: 47: This shows the forward primer for PCR amplification of mutant human growth hormone (G-GH) DNA having Gly at the N-terminus. SEQ ID NO: 48: MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Proinsu
Shows the nucleotide sequence encoding lin. SEQ ID NO: 49: This shows the base sequence encoding MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulin. SEQ ID NO: 50: MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somato
The nucleotide sequence encoding statin 28 is shown. SEQ ID NO: 51: MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Gluc
Shows the base sequence encoding agon.

【０１２４】配列番号５２： MWPsp-MWPmp20-TEV-G〜GH
をコードする塩基配列を示す。 配列番号５３： Gly Ser Val Pro Ser Glyなるリンカー
をコードする順方向オリゴヌクレオチドを示す。 配列番号５４： Met-Proinsulin DNAのPCR増幅用の順方
向オリゴヌクレオチドを示す。 配列番号５７： TEVプロテアーゼによって認識されるア
ミノ酸配列をコードする順方向オリゴヌクレオチドを示
す。 配列番号５８： TEVプロテアーゼによって認識されるア
ミノ酸配列をコードする逆方向オリゴヌクレオチドを示
す。 配列番号６０： TEV-G〜GH DNAのPCR増幅用の順方向プ
ライマーを示す。SEQ ID NO: 52: MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH
Shows the nucleotide sequence encoding SEQ ID NO: 53: forward oligonucleotide encoding linker Gly Ser Val Pro Ser Gly SEQ ID NO: 54: This shows a forward oligonucleotide for PCR amplification of Met-Proinsulin DNA. SEQ ID NO: 57: This shows a forward oligonucleotide encoding an amino acid sequence recognized by TEV protease. SEQ ID NO: 58: shows an inverted oligonucleotide encoding the amino acid sequence recognized by TEV protease. SEQ ID NO: 60: This shows the forward primer for PCR amplification of TEV-G to GH DNA.

【０１２５】配列番号６１：融合蛋白質の分離/精製用
タグを示す。 配列番号６２： MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Proinsu
linのアミノ酸配列を示す。 配列番号６３： MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulinのアミ
ノ酸配列を示す。 配列番号６４： MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somato
statin 28のアミノ酸配列を示す。 配列番号６５： MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Gluc
agonのアミノ酸配列を示す。 配列番号６６： MWPsp-MWPmp20-TEV-G〜GHのアミノ酸配
列を示す。SEQ ID NO: 61: tag for separation / purification of fusion protein SEQ ID NO: 62: MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Proinsu
2 shows the amino acid sequence of lin. SEQ ID NO: 63: This shows the amino acid sequence of MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulin. SEQ ID NO: 64: MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somato
2 shows the amino acid sequence of statin 28. SEQ ID NO: 65: MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Gluc
2 shows the amino acid sequence of agon. SEQ ID NO: 66: This shows the amino acid sequence of MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】融合体MWPsp-MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proi
nsulinのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオ
チド配列。Fig. 1 Fusion MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proi
Amino acid sequence of nsulin and nucleotide sequence encoding it.

【図２】融合体MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulinのアミノ
酸配列およびそれをコードするヌクレオチド配列。FIG. 2 shows the amino acid sequence of the fusion MWPsp-MWPmp10-Met-Proinsulin and the nucleotide sequence encoding it.

【図３】融合体MWPsp-MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatos
tatin 28のアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレ
オチド配列。FIG. 3. Fusion MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatos
Amino acid sequence of tatin 28 and the nucleotide sequence encoding it.

【図４】融合体MWPsp-MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Gluca
gonのアミノ酸配列およびそれをコードするヌクレオチ
ド配列。FIG. 4 Fusion MWPsp-MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Gluca
The amino acid sequence of gon and the nucleotide sequence encoding it.

【図５】融合DNAをバチルス・ブレビスの発現ベクター
（pNU211R2L5）に組み込む概略図。FIG. 5 is a schematic diagram of integrating a fusion DNA into a Bacillus brevis expression vector (pNU211R2L5).

【図６】各種の形質転換体の培養によって産生されたHi
s-タグを含むプロインスリンの培地の電気泳動写真。こ
こで、サンプルはマーカーペプチド（レーン１）、陰性
対照（外来タンパクを含まないプラスミドpNU211R2L5だ
けの形質転換体：レーン２）、形質転換体MWPsp-MWPmp6
-（レーン３）, 8-（レーン４）, 9-（レーン５）, 10-
（レーン６）, 11-（レーン７）, 12-（レーン８）, 15
-（レーン９）,40-（レーン10）, 50-（レーン11）, 10
0-（レーン12）-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinであ
る。FIG. 6. Hi produced by culture of various transformants
Electrophoresis photograph of a proinsulin-containing medium containing an s-tag. Here, the sample was a marker peptide (lane 1), a negative control (transformant containing only plasmid pNU211R2L5 containing no foreign protein: lane 2), and a transformant MWPsp-MWPmp6
-(Lane 3), 8- (lane 4), 9- (lane 5), 10-
(Lane 6), 11- (lane 7), 12- (lane 8), 15
-(Lane 9), 40- (lane 10), 50- (lane 11), 10
0- (lane 12)-(His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin.

【図７】各種の形質転換体の培養によって産生されたHi
s-タグを含まないプロインスリンの培地の電気泳動写
真。ここで、サンプルはマーカーペプチド（レーン
１）、陰性対照（プラスミドpNU211R2L5だけの形質転換
体：レーン２）、形質転換体MWPsp-Proisulin（レーン
３）、形質転換体MWPsp-MWPmp1-（レーン４）, 2-（レ
ーン５）, 3-（レーン６）, 4-（レーン７）, 5-（レー
ン８）, 6-（レーン９）,7-（レーン10）, 8-（レーン1
1）, 9-（レーン12）, 10-（レーン13）, 11-（レーン1
4）, 12-（レーン15）, 13-（レーン16）, 14-（レーン
17）, 15-（レーン18）, 17-（レーン19）, 20-（レー
ン20）, 50（レーン21）-Met-Proinsulinである。FIG. 7 shows Hi produced by culture of various transformants.
Electrophoresis photograph of the medium of proinsulin without s-tag. Here, the samples were a marker peptide (lane 1), a negative control (transformant containing only plasmid pNU211R2L5: lane 2), a transformant MWPsp-Proisulin (lane 3), a transformant MWPsp-MWPmp1- (lane 4), 2- (lane 5), 3- (lane 6), 4- (lane 7), 5- (lane 8), 6- (lane 9), 7- (lane 10), 8- (lane 1)
1), 9- (lane 12), 10- (lane 13), 11- (lane 1)
4), 12- (lane 15), 13- (lane 16), 14- (lane
17), 15- (lane 18), 17- (lane 19), 20- (lane 20), 50 (lane 21) -Met-Proinsulin.

【図８】各種の形質転換体の培養によって産生されたソ
マトスタチンの培地の電気泳動写真。ここで、サンプル
はマーカーペプチド（レーン１）、形質転換体MWPsp-So
matostatin 28（レーン２）, MWPsp-MWPmp10-(His)₆-EG
F-TEV-Somatostatin 28（レーン3）, MWPsp-MWPmp10-(H
is)₆-TEV-Somatostatin 28（レーン４）, MWPsp-MWPmp2
0-(His)₆-EGF-TEV-Somatostatin 28（レーン５）であ
る。FIG. 8 is an electrophoretic photograph of a somatostatin medium produced by culturing various transformants. Here, the sample was the marker peptide (lane 1), the transformant MWPsp-So
matostatin 28 (lane 2), MWPsp-MWPmp10- (His) ₆ -EG
F-TEV-Somatostatin 28 (lane 3), MWPsp-MWPmp10- (H
is) ₆ -TEV-Somatostatin 28 (lane 4), MWPsp-MWPmp2
0- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatostatin 28 (lane 5).

【図９】各種の形質転換体の培養によって産生されたグ
ルカゴンの培地の電気泳動写真。ここで、サンプルはマ
ーカーペプチド（レーン１）、形質転換体MWPsp-Glucag
on（レーン２）, MWPsp-MWPmp10-（レーン３）, 20-
（レーン４）, 30（レーン５）-(His)₆-Linker-V8-Gluc
agonである。FIG. 9 is an electrophoretic photograph of glucagon medium produced by culturing various transformants. Here, the sample is the marker peptide (lane 1), the transformant MWPsp-Glucag
on (lane 2), MWPsp-MWPmp10- (lane 3), 20-
(Lane 4), 30 (Lane 5)-(His) ₆ -Linker-V8-Gluc
agon.

【図１０】各種の形質転換体の培養によって産生された
His-タグを含むプロインスリンの培地の電気泳動／ウエ
スタンブロッティング写真。ここで、サンプルは陰性対
照（プラスミドpNU211R2L5だけによる形質転換体：レー
ン１）、形質転換体MWPsp-MWPmp6-（レーン２）, 8-
（レーン３）, 9-（レーン４）, 10-（レーン５）, 11-
（レーン６）, 12-（レーン７）, 15-（レーン８）, 40
-（レーン９）, 50-（レーン10）, 100（レーン11）-(H
is)₆-Linker-Met-Proinsulinである。FIG. 10: Produced by culture of various transformants
Electrophoresis / Western blotting photographs of a proinsulin medium containing a His-tag. Here, the samples were negative control (transformant only with plasmid pNU211R2L5: lane 1), transformant MWPsp-MWPmp6- (lane 2), 8-
(Lane 3), 9- (lane 4), 10- (lane 5), 11-
(Lane 6), 12- (lane 7), 15- (lane 8), 40
-(Lane 9), 50- (lane 10), 100 (lane 11)-(H
is) ₆ -Linker-Met-Proinsulin.

【図１１】各種の形質転換体の培養によって産生された
His-タグを含まないプロインスリンの培地の電気泳動／
ウエスタンブロッティング写真。ここで、サンプルは陰
性対照（プラスミドpNU211R2L5だけによる形質転換体：
レーン１）、形質転換体MWPsp-Proisulin（レーン
２）、形質転換体MWPsp-MWPmp1-（レーン３）, 2-（レ
ーン４）, 3-（レーン５）, 4-（レーン６）, 5-（レー
ン７）, 6-（レーン８）,7-（レーン９）, 8-（レーン1
0）, 9-（レーン11）, 10-（レーン12）, 11-（レーン1
3）, 12-（レーン14）, 13-（レーン15）, 14-（レーン
16）, 15-（レーン17）, 17-（レーン18）, 20-（レー
ン19）, 50（レーン20）-Met-Proinsulinである。FIG. 11: Produced by culture of various transformants
Electrophoresis of proinsulin medium without His-tag /
Western blotting photo. Here, the sample is a negative control (transformant with plasmid pNU211R2L5 only:
Lane 1), transformant MWPsp-Proisulin (lane 2), transformant MWPsp-MWPmp1- (lane 3), 2- (lane 4), 3- (lane 5), 4- (lane 6), 5- (Lane 7), 6- (lane 8), 7- (lane 9), 8- (lane 1)
0), 9- (lane 11), 10- (lane 12), 11- (lane 1)
3), 12- (lane 14), 13- (lane 15), 14- (lane
16), 15- (lane 17), 17- (lane 18), 20- (lane 19), 50 (lane 20) -Met-Proinsulin.

【図１２】分離精製された融合蛋白質MWPmp10-(His)₆-L
inker-Met-Proinsulin、および臭化シアン処理によって
切断されたプロインスリンの電気泳動写真。ここで、サ
ンプルはレーン１：マーカーペプチド、レーン２：分離
精製された融合蛋白質MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proi
nsulin（30μg）、レーン３：臭化シアンにより切断さ
れたプロインスリン（30μg）、レーン４：プロインス
リン（Sigma社製、2μg）である。FIG. 12: Separated and purified fusion protein MWPmp10- (His) ₆ -L
Electrophoresis photograph of inker-Met-Proinsulin and proinsulin cleaved by cyanogen bromide treatment. Here, the sample is lane 1: marker peptide, lane 2: separated and purified fusion protein MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proi
nsulin (30 μg), lane 3: proinsulin cleaved with cyanogen bromide (30 μg), lane 4: proinsulin (Sigma, 2 μg).

【図１３】分離精製された融合蛋白質MWPmp10-(His)₆-L
inker-Met-Proinsulin、および臭化シアン処理によって
切断されたプロインスリンの電気泳動／ウエスタンブロ
ッティング写真。ここで、サンプルはレーン１：分離精
製された融合蛋白質MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proins
ulin（0.3 μg）、レーン２：臭化シアンにより切断さ
れたプロインスリン（0.3 μg）、レーン３：プロイン
スリン（Sigma社製、0.3 μg）である。FIG. 13: Separated and purified fusion protein MWPmp10- (His) ₆ -L
Electrophoresis / Western blotting photographs of inker-Met-Proinsulin and proinsulin cleaved by cyanogen bromide treatment. Here, the sample is Lane 1: the separated and purified fusion protein MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proins
ulin (0.3 μg), lane 2: proinsulin cleaved with cyanogen bromide (0.3 μg), lane 3: proinsulin (Sigma, 0.3 μg).

【図１４】分離精製された融合蛋白質MWPmp20-(His)₆-E
GF-TEV-Somatostatin 28、およびTEVプロテアーゼ処理
によって切断されたソマトスタチン28の電気泳動／ウエ
スタンブロッティング写真。ここで、サンプルは分離精
製された融合蛋白質MWPmp20-(His)₆-EGF-TEV-Somatosta
tin 28（レーン１：104μg、レーン３：52μg、レーン
５：26μg）、それぞれをTEVプロテアーゼ処理したもの
（レーン２：104μgを処理、レーン４：52μgを処理、
レーン６：26μgを処理）、ソマトスタチン28（BACHEM
社製、レーン７：4.5μg、レーン８：1.5μg）である。FIG. 14: Separated and purified fusion protein MWPmp20- (His) ₆ -E
Electrophoresis / Western blotting photographs of GF-TEV-Somatostatin 28 and somatostatin 28 cleaved by TEV protease treatment. Here, the sample was separated and purified fusion protein MWPmp20- (His) ₆ -EGF-TEV-Somatosta
tin 28 (lane 1: 104 μg, lane 3: 52 μg, lane 5: 26 μg), each treated with TEV protease (lane 2: 104 μg, lane 4: 52 μg;
Lane 6: 26 μg treated), somatostatin 28 (BACHEM
(Lane 7: 4.5 μg, lane 8: 1.5 μg).

【図１５】分離精製された融合蛋白質MWPmp20-(His)₆-L
inker-V8-Glucagon、およびV8プロテアーゼ処理によっ
て切断されたグルカゴンの電気泳動／ウエスタンブロッ
ティング写真。ここで、サンプルは分離精製された融合
蛋白質MWPmp20-(His)₆-Linker-V8-Glucagon（レーン
１：90μg、レーン３：45μg、レーン５：22.5μg）、
それぞれをV8プロテアーゼ処理したもの（レーン２：90
μgを処理、レーン４：45μgを処理、レーン６：22.5μ
gを処理）、グルカゴン（清水製薬社製、レーン７：1.5
μg）である。FIG. 15: Separated and purified fusion protein MWPmp20- (His) ₆ -L
Electrophoresis / Western blotting photographs of inker-V8-Glucagon and glucagon cleaved by V8 protease treatment. Here, the sample is a fusion protein MWPmp20- (His) ₆ -Linker-V8-Glucagon separated and purified (lane 1: 90 μg, lane 3: 45 μg, lane 5: 22.5 μg),
Each was treated with V8 protease (lane 2:90).
μg, lane 4: 45 μg, lane 6: 22.5 μ
g), glucagon (manufactured by Shimizu Pharmaceutical Co., lane 7: 1.5
μg).

【図１６】電気泳動／ウエスタンブロッティングによる
融合蛋白質MWPmp10-(His)₆-Linker-Met-Proinsulinの生
産量の推定。ここで、サンプルは形質転換体MWPmp10-(H
is)₆-Linker-Met-Proinsulinの培養後の培地（レーン
１：１μl、レーン２：1/3μl、レーン３：1/3² μl、
レーン４：1/3³ μl、レーン５：1/3⁴ μl）、プロイン
スリン（Sigma社製、レーン６：1 μg、レーン７：0.3
μg、レーン８：0.1μg、レーン９：0.03μg、レーン1
0：0.01μg）である。FIG. 16: Estimation of the production amount of the fusion protein MWPmp10- (His) ₆ -Linker-Met-Proinsulin by electrophoresis / Western blotting. Here, the sample was the transformant MWPmp10- (H
is) after the ₆ -Linker-Met-Proinsulin culture medium (lane 1: 1μl, lane 2: 1 / 3μl, lane 3: 1/3 ² μl,
Lane 4: 1/3 ³ μl, Lane 5: 1/3 ⁴ μl), proinsulin (Sigma, lane 6: 1 μg, lane 7: 0.3)
μg, lane 8: 0.1 μg, lane 9: 0.03 μg, lane 1
0: 0.01 μg).

【図１７】融合体MWPsp-MWPmp20-TEV-Ｇ〜ＧＨのアミノ
酸配列およびそれをコードするDNA。FIG. 17 shows the amino acid sequence of the fusion MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH and the DNA encoding the same.

【図１８】融合体MWPsp-MWPmp20-TEV-Ｇ〜ＧＨをバチル
ス・ブレビスの発現ベクター（pNU211R2L5）に組み込む
概略図。FIG. 18 is a schematic diagram of incorporating the fusion MWPsp-MWPmp20-TEV-G to GH into a Bacillus brevis expression vector (pNU211R2L5).

【図１９】各種の形質転換体の培養によって産生された
ヒト成長ホルモンを含む培地の電気泳動写真。レーン
１：マーカー蛋白質、レーン２：陰性対照（プラスミド
pNU211R2L5のみによる形質転換体）、レーン３：MWPsp-
GH、レーン４：MWPsp-TEV-Ｇ〜ＧＨ、レーン５〜19：MW
Psp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-,
11-, 12-, 14-, 20-, 30-TEV-Ｇ〜ＧＨ。FIG. 19 is an electrophoretic photograph of a medium containing human growth hormone produced by culturing various transformants. Lane 1: marker protein, Lane 2: negative control (plasmid
Transformant only with pNU211R2L5), lane 3: MWPsp-
GH, lane 4: MWPsp-TEV-G to GH, lanes 5 to 19: MW
Psp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-,
11-, 12-, 14-, 20-, 30-TEV-G to GH.

【図２０】各種の形質転換体の培養によって産生された
ヒト成長ホルモンを含む培地のウエスタンブロッティン
グの結果を示す写真。レーン１：陰性対照（プラスミド
pNU211R2L5のみによる形質転換体）、レーン２：MWPsp-
GH、レーン３：MWPsp-TEV-Ｇ〜ＧＨ、レーン４〜18：MW
Psp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-,
11-, 12-, 14-, 20-, 30-TEV-Ｇ〜ＧＨ。FIG. 20 is a photograph showing the results of Western blotting of a medium containing human growth hormone produced by culturing various transformants. Lane 1: negative control (plasmid
Transformant with pNU211R2L5 alone), lane 2: MWPsp-
GH, lane 3: MWPsp-TEV-G to GH, lanes 4 to 18: MW
Psp-MWPmp1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-,
11-, 12-, 14-, 20-, 30-TEV-G to GH.

【図２１】分離精製された融合蛋白質MWPmp20-TEV-Ｇ〜
ＧＨ、およびTEVプロテアーゼ処理により切り出された
変異型ヒト成長ホルモンＧ〜ＧＨの電気泳動写真。レー
ン１：マーカー蛋白質、レーン２：分離精製された融合
蛋白質MWPmp20-TEV-Ｇ〜ＧＨ、レーン３：TEVプロテア
ーゼにより切り出された変異型ヒト成長ホルモンＧ〜Ｇ
Ｈ、レーン４：ヒト成長ホルモン（Biogenesis社製）各
5 μg。FIG. 21: Separated and purified fusion protein MWPmp20-TEV-G ~
Electrophoretic photographs of GH and mutant human growth hormones G to GH cut out by TEV protease treatment. Lane 1: marker protein, lane 2: separated and purified fusion protein MWPmp20-TEV-G to GH, lane 3: mutant human growth hormone G to G cut out by TEV protease
H, lane 4: human growth hormone (Biogenesis)
5 μg.

【図２２】分離精製された融合蛋白質MWPmp20-TEV-Ｇ〜
ＧＨ、およびTEVプロテアーゼ処理により切り出された
変異型ヒト成長ホルモンＧ〜ＧＨのウエスタンブロッテ
ィング写真。レーン１：分離精製された融合蛋白質MWPm
p20-TEV-Ｇ〜ＧＨ、レーン２：TEVプロテアーゼにより
切り出された変異型ヒト成長ホルモンＧ〜ＧＨ、レーン
３：ヒト成長ホルモン（Biogenesis社製）各0.1 μg。FIG. 22: Separated and purified fusion protein MWPmp20-TEV-G ~
Western blotting photographs of GH and mutant human growth hormones G to GH cut out by treatment with TEV protease. Lane 1: Separated and purified fusion protein MWPm
p20-TEV-G to GH, lane 2: mutant human growth hormones G to GH cut out by TEV protease, lane 3: human growth hormone (manufactured by Biogenesis) 0.1 μg each.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｅ Ｈ Ｃ１２Ｒ 1:08） Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者 東久邇 眞彦 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２ 番 伊藤ハム株式会社 中央研究所内 (72)発明者 工藤 季之 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２ 番 伊藤ハム株式会社 中央研究所内 (72)発明者 近藤 雅昭 茨城県北相馬郡守谷町久保ヶ丘１丁目２ 番 伊藤ハム株式会社 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平６−38741（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−251185（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−51072（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−253862（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 21/00 - 21/08 C07K 14/00 - 19/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＤＤＢＪ／ＥＭＢＬ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI C07K 19/00 C12N 1/21 C12N 1/21 C12P 21/02 C C12P 21/02 E H C12R 1:08) C12R 1:08 (C12P 21/02 (C12P 21/02 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:08) (72) Inventor Masahiko Higashikuni 1-2-2 Kubogaoka, Moriya-cho, Kitasoma-gun, Ibaraki Pref. (72) Inventor Kinoyuki Kudo 1-2-2 Kubogaoka, Moriya-cho, Kitasoma-gun, Ibaraki Pref. Inside the Central Research Laboratory of Itoham Co., Ltd. (72) Masaaki Kondo 1-2-2 Kubogaoka, Moriya-cho, Kitasoma-gun, Ibaraki (56) References JP-A-6-37841 (JP, A) JP-A-3-251185 (JP, A) JP-A-7-51072 (JP, A) JP 6-253862 (JP, A) (58 ) investigated the field (Int.Cl. ^7, DB name) C12N 15/00 - 15/90 C12N 1/00 - 1/38 C12P 21/00 - 21/08 C07K 14 / 00-19/00 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG) MEDLINE (STN) GenBank / DDBJ / EMBL

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 バチルス属細菌の細胞壁蛋白質（CWP）
の一つであるMWPのシグナルペプチド配列と、MWPのN末
端から６，７，８，１０，１１，１２，１５，１７，２
０または５０個のアミノ酸残基からなる配列と、ポリペ
プチドを化学的に切断するために必要とされるメチオニ
ン残基と、およびヒトプロインスリンのポリペプチド配
列とをこの順序で互いに直鎖状に連結して含む融合蛋白
質をコードするDNA配列を、バチルス属由来のプロモー
ター領域を含有するDNA配列の３’末端に結合させてな
るDNA。1. A Bacillus bacterium cell wall protein (CWP)
A signal peptide sequence of MWP which is one of, 6,7,8,10,11,12,15,17,2 from the N-terminus of MWP
A sequence consisting of 0 or 50 amino acid residues and a polypeptide
Methioni required to chemically cleave peptides
Residues and the polypeptide sequence of human proinsulin
Fusion proteins comprising linked to each other in a linear chain and a column in this order
DNA obtained by binding a DNA sequence encoding a protein to the 3 ′ end of a DNA sequence containing a promoter region derived from Bacillus. 【請求項２】 バチルス属細菌の細胞壁蛋白質（CWP）
の一つであるMWPのシグナルペプチド配列と、MWPのN末
端から６，７，８，１０，１１，１２，１５，１７，２
０または５０個のアミノ酸残基からなる配列と、分離精
製用タグとしての６個のヒスチジン残基からなる配列
と、リンカーとしてのアミノ酸配列GlySerProValProSer
Glyと、ポリペプチドを化学的に切断するために必要と
されるメチオニン残基と、およびヒトプロインスリンの
ポリペプチド配列とをこの順序で互いに直鎖状に連結し
て含む融合蛋白質をコードするDNA配列を、バチルス属
由来のプロモーター領域を含有するDNA配列の３’末端
に結合させてなるDNA。2. A Bacillus bacterium cell wall protein (CWP).
The signal peptide sequence of MWP, which is one of the following, and 6,7,8,10,11,12,15,17,2
A sequence consisting of 0 or 50 amino acid residues, a sequence consisting of 6 histidine residues as a tag for separation and purification, and an amino acid sequence GlySerProValProSer as a linker
And Gly, and methionine residues required to chemically cleave polypeptide, and connects the <br/> polypeptide sequence of human proinsulin to each other in a linear chain in this order
DNA sequence encoding the fusion protein containing Bacillus sp.
3 'end of DNA sequence containing promoter region derived from
DNA made to bind to . 【請求項３】 バチルス属細菌の細胞壁蛋白質（CWP）
の一つであるMWPのシグナルペプチド配列と、MWPのN末
端から２０個のアミノ酸残基からなる配列と、分離精製
用タグとしての６個のヒスチジン残基からなる配列と、
リンカーとしてのアミノ酸配列GlySerProValProSerGly
と、ポリペプチドをV8プロテアーゼにより切り出すため
に必要とされるアミノ酸配列PheLeuGluと、およびヒト
グルカゴンのポリペプチド配列とをこの順序で互いに直
鎖状に連結して含む融合蛋白質をコードするDNA配列
を、バチルス属由来のプロモーター領域を含有するDNA
配列の３’末端に結合させてなるDNA。3. A Bacillus bacterium cell wall protein (CWP).
A signal peptide sequence of MWP which is one of sequences consisting of N-terminal or et 2 0 amino acid residues of the MWP, the sequence consisting of six histidine residues as a tag for separation and purification,
Amino acid sequence GlySerProValProSerGly as linker
When an amino acid sequence PheLeuGlu required to cut by a polypeptide V8 protease, and human
DNA sequence encoding a fusion protein containing the glucagon polypeptide sequence in this order linearly linked to each other
DNA containing a Bacillus-derived promoter region
DNA joined to the 3 'end of the sequence . 【請求項４】 バチルス属細菌の細胞壁蛋白質（CWP）
の一つであるMWPのシグナルペプチド配列と、MWP蛋白質
のN末端から１〜１２，１４，２０または３０個のアミ
ノ酸残基からなる配列と、ポリペプチドをTEVプロテア
ーゼにより切り出すために必要とされるアミノ酸配列As
pTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGlnと、N末端がGl
yである変異型ヒト成長ホルモンのポリペプチド配列と
をこの順序で互いに直鎖状に連結して含む融合蛋白質を
コードするDNA配列を、バチルス属由来のプロモーター
領域を含有するDNA配列の３’末端に結合させてなるDN
A。4. A Bacillus bacterium cell wall protein (CWP)
Cutting of the signal peptide sequence of MWP which is one, sequence consisting of amino <br/> Roh acid residues from the N-terminus 1～12,14,20 or 30 of MWP protein, a polypeptide by TEV protease Amino acid sequence As required for
pTyrAspIleProThrThrGluAsnLeuTyrPheGln and N-terminal Gl
a fusion protein comprising the polypeptide sequence of the mutant human growth hormone that is y and linearly linked to each other in this order.
The DNA sequence to be coded is a Bacillus-derived promoter
DN attached to the 3 'end of the DNA sequence containing the region
A. 【請求項５】 バチルス属細菌の細胞壁蛋白質（CWP）
の一つであるMWPのシグナルペプチド配列と、MWPのN末
端から１０または２０個のアミノ酸残基からなる配列
と、分離精製用タグとしての６個のヒスチジン残基から
なる配列と、リンカーとしてのヒト上皮細胞増殖因子配
列と、ポリペプチドをTEVプロテアーゼにより切り出す
ために必要とされるアミノ酸配列AspTyrAspIleProThrTh
rGluAsnLeuTyrPheGlnと、ヒトソマトスタチン２８のポ
リペプチド配列とをこの順序で互いに直鎖状に連結して
含む融合蛋白質をコードするDNA配列を、バチルス属由
来のプロモーター領域を含有するDNA配列の３’末端に
結合させてなるDNA。5. A Bacillus bacterium cell wall protein (CWP).
A signal peptide sequence of MWP which is one of the following, a sequence consisting of 10 or 20 amino acid residues from the N-terminal of MWP, a sequence consisting of 6 histidine residues as a tag for separation and purification, and a linker and human epidermal growth factor sequence, the amino acid sequence AspTyrAspIleProThrTh required to excise the polypeptide by TEV protease
and RGluAsnLeuTyrPheGln, and connects the port <br/> Ripepuchido sequence of human somatostatin 28 linearized with each other in this order
DNA sequence encoding the fusion protein containing
At the 3 'end of the DNA sequence containing the native promoter region
DNA that is ligated . 【請求項６】 バチルス属細菌がバチルス・ブレビスで
あることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に
記載のDNA。6., wherein the Bacillus bacterium is Bacillus brevis, DNA of any one of claims 1 to 5. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれか１項に記載のDN
Aを含むベクター。7. The DN according to any one of claims 1 to 6,
Vector containing A. 【請求項８】 請求項７に記載のベクターで形質転換さ
れたバチルス属に属する細菌。8. A bacterium belonging to the genus Bacillus transformed with the vector according to claim 7 . 【請求項９】 細菌がバチルス・ブレビスであることを
特徴とする、請求項８に記載の細菌。9. The bacterium according to claim 8 , wherein the bacterium is Bacillus brevis. 【請求項１０】 ヒトプロインスリン、ヒトグルカゴ
ン、N末端がGlyである変異型ヒト成長ホルモン、および
ヒトソマトスタチン２８からなる群から選択される組換
えポリペプチドの製造方法であって、請求項８または９
に記載の細菌を培地に培養し、融合蛋白質を菌体外に蓄
積せしめ、該培地から該融合蛋白質を取り出し、取り出
された融合蛋白質から該ポリペプチドを化学的または酵
素的に切り出し、該ポリペプチドを回収することを含
む、上記方法。10. Human proinsulin, human glucago
A mutant human growth hormone wherein the N-terminus is Gly, and
A method of manufacturing a recombinant polypeptide selected from the group consisting of human somatostatin 28, claim 8 or 9
Bacteria were cultured in medium described, the fusion protein allowed accumulate extracellularly, removed the fusion protein from the medium, collected Ride <br/> chemical or enzyme polypeptide from the fusion protein The above method, comprising excising the polypeptide and recovering the polypeptide.