JP3310295B2 - グルコース測定用試薬 - Google Patents
グルコース測定用試薬Info
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Description
細には、長期間安定なグルコース測定用の改良された液
状試薬に関するものである。
や低血糖症等の種々の疾病の診断や、治療経過の観察の
重要な項目の一つである。現在、臨床検査におけるグル
コーの測定法としては、還元法、酵素法、縮合法と簡易
測定法等に大別される。これらのうち還元法はグルコー
ス以外に他の還元物質なども測定されるため、1950年代
より特異性に優れた酵素法(グルコースオキシダーゼ
法)が導入された。また、より特異的なグルコース測定
法として、ヘキソキナーゼ(以下、HKと略記する)とグ
ルコース−6−燐酸脱水素酵素(以下、G6PDHと略記す
る)とを用いるHK−G6PDH法が標準法として採用されて
いる。
とができる有用な測定法であるが、試薬構成成分が不安
定な物質から構成されているので、長期保存が難しい。
そこで、一般的に酵素や基質等は凍結乾燥品として供給
され、使用時に緩衝液等で溶解して用いられていた。し
かし、作業性やコスト面からも溶解後の試薬の安定性が
要求されるようになり、例えば特開昭56−140899号公報
のようにグルコース測定用試薬の安定性に関する技術が
開示されている。
合物(例えば還元型グルタチオン、N−アセチルシステ
イン)及び/又はキレート剤(例えばEDTA、EGTA)並び
に殺菌剤及びpH緩衝剤を存在させることにより、試薬の
安定性を図った技術が記載されている。この技術は、基
本的には凍結乾燥品を溶解して混合した試薬を主眼に構
成されており、補酵素以外の成分の水溶液(B液)の安
定性を改善するもので、その安定性はせいぜい10日程度
である。
上)保存可能なグルコース定量用安定化液体酵素組成物
に関する技術が開示されている。これは試薬構成を酵素
試薬(ヘキソキナーゼ及びG6PDH)と補酵素試薬(ATP及
びNAD)の2試薬系として、酵素試薬には約20〜40%(v
/v)のポリオール有機溶媒、安定剤系のEDTA、アルブミ
ンやポリビニルピロリドン等の酸化防止剤及びアジ化ナ
トリウムの微生物抑制剤を添加して、pHを約7.5に調整
する。更に補酵素試薬には約5〜20%(v/v)のポリオ
ール有機溶媒を添加して、pHを約7.5に調整するという
ものである。
自体が粘性を有しており、更に酸化防止剤としてポリビ
ニルピロリドンを併用すると試薬の粘性が高くなり、自
動分析装置において、試薬分注精度の低下等の不都合が
生じ、また、特に補酵素NAD、ATPの安定性が不十分であ
る等の問題を有している。
の作業性を向上させることが求められている。また、こ
れらの試薬は多くの場合、自動分析機にて使用されるの
で、試薬構成を2試薬系とし、しかも試薬組成物の安定
性を長期間(例えば半年から1年)維持する必要があ
る。
る。
デノシン5'−二燐酸、NADP+は酸化型ニコチンアミドア
デニンジヌクレオチド燐酸である。
存在するので、それらの成分を配合してなるグルコース
測定用試薬の安定性も各成分の組み合わせにより相乗的
に向上したり、逆に不安定になる場合があった。
料と混合して測定が実施されていたが、自動分析機の普
及によって2試薬系が通常となっている。これらの2試
薬系において、試薬組成の組み合わせは、一般的に初発
酵素の基質であるATPを開始試薬(第二試薬)に含有さ
せ、残りの成分をすべて第一試薬に含有されるケースが
多い。その他には、第二試薬としてHK又はG6PDH(もし
くは両酵素とも)などの酵素を使用する場合があった
が、この場合には酵素の安定性が問題であった。また第
二試薬にATPを用いた場合でも充分な保存性を得ること
はできなかった。
って有害な共雑酵素を除去することや、耐熱酵素類、例
えばバチルス・ステアロサーモフィルス(Batillus st
earothermophilus)由来のグルコキナーゼ(以下、GlcK
と略す)、遺伝子組換えによる酵母由来のHKなどやそれ
らの化学修飾酵素を用いることによって改善されてきた
が、液状試薬全体としての保存安定性を得ることは難し
かった。
要因の最も大きな成分は、補酵素であるNADP+や基質で
あるATPであり、特にNADP+の劣化が保存安定性を阻害す
る原因であった。
鋭意検討した結果、液状試薬としての充分な保存安定性
を有する試薬組成を見出した。本発明は、こうした知見
に基づくものである。
キソキナーゼ(HK)、グルコース−6−燐酸脱水素酵素
(G6PDH)及びアデノシン5'−三燐酸(ATP)を含む第一
試薬と、少なくとも酸化型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチド燐酸(NADP+)を含む第二試薬とからなり、
第一試薬のpHが7.5〜9.5であり、第二試薬のpHが3〜5
であり、そしてそれぞれ液状試薬であることを特徴とす
る、グルコース測定用試薬に関する。
を示すグラフである。
を示すグラフである。
を示すグラフである。
定試薬は、1試薬で使用されていたが、自動分析機の発
達とともに測定物(グルコース)と始めに反応するHKの
補酵素(基質)であるATPを開始試薬とした2試液型試
薬が多くなった。その理由としては、グルコースと最初
に反応する初発酵素のHKとATPのうちいずれかを後から
加えることによって、G6PDH反応以下の検体ブランクを
差し引くことができるからである。また、ATPを使用す
る理由としては、タンパク質であるHKに比べて扱いやす
いためであった。
にはごく一般的であった。しかし、高度に精製した酵素
及び基質標品が手に入る現在においては、より安定な条
件を設定することに重点をおくことができるのである。
従って、まったく従来では考えつかなかった試薬組成の
組み合わせが開発されたのである。
〜9.5の液状第一試薬と、 (2)NADP+を含み、pHが3〜5の液状第二試薬と から構成される。
緩衝液中で安定であるので、第一試薬は、pH7.5〜9.5の
緩衝液に溶解させる。pH9.5を越えるpHは酵素安定性の
点から好ましくない。また緩衝液としては、前記の範囲
のpH値で通常使用される任意の緩衝液、例えばトリス
(ヒドロキシメチル)アミノメタン(以下、トリスと略
する)緩衝液(pH9.0)を用いることができる。
9.5)にある酵素、例えば酵母由来のHKやバチルス・ス
テアロサーモフィルス(Batillus stearothermophilu
s)由来のGlcKなどを用いるのが好ましく、配合量は、
酵素活性を発現し得る量を添加すればよく、少なくとも
0.2U以上添加して用いるのが好ましい。上限は特に限定
されないが、コスト等を考慮して0.2〜100Uの範囲で用
いればよい。
にある酵素、例えばリュウコノストック・メセンテロイ
デス(Leuconostoc mesenteroides)由来の酵素が好適
であり、配合量は、酵素活性を発現し得る量を添加すれ
ばよく、少なくとも0.5U以上添加して用いるのが好まし
い。上限は特に限定されないが、コスト等を考慮して0.
5〜100Uの範囲で用いればよい。
の量で配合する。第一試薬には、その他必要に応じて、
マグネシウム塩やキレート剤〔例えば、エチレンジアミ
ン四酢酸(以下、EDTAと略する)〕などを添加してもよ
い。
あるので、NADP+をpH3〜5の緩衝液に溶解して、第二試
薬を調製することができる。また緩衝液としては、前記
の範囲のpH値で通常使用される任意の緩衝液、例えば酢
酸緩衝液(pH4.0)を用いることができる。NADP+は、好
ましくは1〜20mM、より好ましくは5〜10mMの量で配合
することができる。第二試薬には、そのほか必要に応じ
てマグネシウム塩を添加してもよい。第一試薬と第二試
薬とを混合した後に、混合液が約pH7.5〜8.5になるよう
にすることが好ましく、第一試薬と第二試薬の緩衝液濃
度や、その混合比を適宜設定すればよい。
これらは本発明の範囲を限定するものではない。
に4℃又は10℃で保存し、一定期間経過後にグルコース
の自動分析に使用した。測定実施までの保存期間は、第
1図及び第2図に示すとおり、4℃保存試薬に関して、
調製直後、1週間後、2週間後、1月後、3月後、6月
後、9月後、12月後、13月後、15月後及び18月後であ
り、10℃保存試薬に関して、調製直後、2週間後、1月
後、3月後、6月後、9月後、12月後、13月後及び15月
後であった。
わち、760mg/dlグルコース水溶液(図中の□)、570mg/
dlグルコース水溶液(図中の△)、380mg/dlグルコース
水溶液(図中の○)若しくは190mg/dlグルコース水溶液
(図中の*)〕、そして2種の血清(図中の●及び▲)
を用いた。
7℃で5分間加温した後、第二試薬80μlを加え、37℃
で5分間保温した後に、340nmの吸光度を測定した。
2図(10℃保存試薬)に示す。
薬を調製した。
試薬を10℃にて保存し、調製直後、2週間後、1月後、
2月後、3月後、4月後、5月後及び6月後に前記実施
例と同様の試験を行い、試薬の安定性を確認した。結果
を第3図に示す。検体としては、2種のグルコース水溶
液〔すなわち、760mg/dlグルコース水溶液(図中の
□)、380mg/dlグルコース水溶液(図中の○)〕、そし
て2種の血清(図中の●及び▲)を用いた。
所又は明所にて、常温ないし低温下で長期間(少なくと
も2年程度)にわたって安定に貯蔵することができる。
従って、臨床検査を実施する現場で長期に保存してお
き、使用に際しては、溶解操作の必要もなく、そのまま
自動分析機などに挿入することができる。
者に自明の変形は本発明の範囲に含まれる。
Claims (8)
- 【請求項1】少なくともグルコキナーゼ又はヘキソキナ
ーゼ、グルコース−6−燐酸脱水素酵素及びアデノシン
5'−三燐酸を含む第一試薬と、少なくとも酸化型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド燐酸を含む第二試薬と
からなり、第一試薬のpHが7.5〜9.5であり、第二試薬の
pHが3〜5であり、そしてそれぞれ液状試薬であること
を特徴とする、グルコース測定用試薬。 - 【請求項2】第一試薬がグルコキナーゼ又はヘキソキナ
ーゼを0.2U以上含有する請求項1に記載の試薬。 - 【請求項3】第一試薬がグルコース−6−燐酸脱水素酵
素を0.5U以上含有する請求項1に記載の試薬。 - 【請求項4】第一試薬がアデノシン5'−三燐酸を0.5〜5
mM含有する請求項1に記載の試薬。 - 【請求項5】第一試薬がマグネシウム塩又はキレート剤
を更に含有する請求項1に記載の試薬。 - 【請求項6】第二試薬が酸化型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド燐酸を1〜20mM含有する請求項1に記載
の試薬。 - 【請求項7】第二試薬がマグネシウム塩を更に含有する
請求項1に記載の試薬。 - 【請求項8】第一試薬と第二試薬との混合液のpHが7.5
〜8.5となるように第一試薬及び第二試薬の緩衝液濃度
を調整した、請求項1に記載の試薬。
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