JP3293622B2 - 形質転換された魚類の製造用の遺伝子構築体 - Google Patents
形質転換された魚類の製造用の遺伝子構築体Info
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は形質転換された魚類および形質転換魚類を発
生するのに有用な「全魚類」プロモータ配列に関するも
のである。
生するのに有用な「全魚類」プロモータ配列に関するも
のである。
発明の背景 本明細書全体を通して、本発明に関連する補足的な情
報を与えるために幾つかの文献を参照する。これら参考
文献の完全な引用を以下に与える。
報を与えるために幾つかの文献を参照する。これら参考
文献の完全な引用を以下に与える。
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gration and germ line transmission of foreign gene
s microinjected into fertilized trout eggs）,Bioch
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サケ（マクロゾアルセスアメリカヌス）由来の不凍化ポ
リペプチド：多種のかつ構成的に多様な成分（Antifree
ze polypeptides from the Newfoundland ocean pout,M
acrozoarces americanus:Presence of multiple and co
mpositionally diverse components）,J.コンパラティ
ブフィジオロジー（Comparative Physiology）B,155:81
−88. ヒュー（Hew）,C.L.,ワン（Wang）,N.C.,ジョッシ（J
oshi）,S.B.,フレッチャー（Fletcher）,G.L.,スコット
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ettner）,B.＆デービース（Davies）,P.L.,（1988），
同義遺伝子はゲンゲ（マクロゾアーセスアメリカヌス
（Macrozoarces americanus））における不凍化タンパ
クの多様性および用量の基礎を与える（Multiple genes
provide the basis for antifreeze protein diversit
y and dosage in the Ocean Pout（Macrozoarces ameri
canus））,J.Biol.Chem.,263:12049−12055. ヒュー（Hew）,C.L.,トリン（Trinh）,K.Y.,デュー
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nduction of a specific pigment cell type by total
genomic DNA injected into the neural crest region
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スグルヌスアンギリカウダツス（Misgurnus anguillica
udatus）の受精卵に微注入されたヒト成長ホルモン遺伝
子の生物学的効果（Biological effects of human grow
th hormone gene microinjected into the fertilized
eggs of loach（Misgurnus anguillicaudatus）），ケ
クシュートングバオ（Kexue Tongbao）,31:988−990. 形質転換した魚類および他の動物の成長における様々
な試みがなされ、かつ成功している。成長ホルモンは過
去の研究において特に興味がもたれていた。成長ホルモ
ンは一本鎖ポリペプチドホルモンであり、動物における
体細胞の成長および発現の調節において主要な役割を演
じている。成長ホルモンにより魚類の成長を促進するた
めの多くの研究がなされている。これらの研究は下垂体
抽出物の給餌（タックマン（Tuckmann）,1936,カンチロ
＆レガラド（Cantilo and Regalado）,1940）、精製し
た組み換え体由来の成長ホルモンの注入または挿入（ギ
ル（Gill）等,1985;セキネ（Sekine）等,1985;カワウチ
（Kawauchi）等,1986;アゲロン（Agellon）等,1988）を
包含する。これら結果の全ては、単独の成長ホルモンが
魚類の成長を刺激する上で有効であることを明白に示し
た。しかしながら、これら全ての研究は養殖における用
途に制限されており、その主な欠点の一つはその表現型
が遺伝し得ないことである。
（1986），ニジマスの成長ホルモン:cDNAの分子クロー
ニングおよびE.コリにおける発現（Rainbow trout grow
th hormone:Molecular cloning of cDNA and expressio
n in E.coli.）,DNA,5:463−477. アゲロン（Agellon）,L.B.,エメリー（Emery）,C.J.,
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−特異的プロモータエレメントHPIは哺乳動物肝細胞の
転写因子と相互作用する（Hepatocyte−specific promo
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ing and expression of cDNA for salmon growth hormo
ne in E.coli）,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,82:4306−
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イヨウサケ（サルモサラー（Salmo Salar））における
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ォラス（Xiphophorus）の魚類胚の神経堤領域に注入さ
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nduction of a specific pigment cell type by total
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Genet.,185:379−389. バイズ（Vize）,P.D.,ミカルスカ（Michalska）,A.
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lls）,J.R.E.＆シーマーク（Seamark）,P.F.,（198
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nham）,R.,チェン（Chen）,T.T.＆パワーズ（Powers）,
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rinus carpio;リヌース（Linnaeus））におけるpRSV−
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ransfer expression and inheritance of pRSV−rainbo
w trout GHcDNA in the common carp.Cyprinus carpio
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ディベロップメント（Molecular Reproduction and Dev
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ニアウイルス発現ヒト乳頭腫ウイルスタイプ16 L1によ
る細胞毒性Ｔ−リンパ細胞プリカーサ細胞の誘発（The
introduction of cytotoxic T−lymphocyte precursor
cells by recombinant vaccinia virus expressing hum
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ータス（Carassius auratus）L.1758）の受精卵への新
規な遺伝子の転移（Novel gene transfer into−fertil
ized eggs of goldfish（Carassius auratus L.1758）,
Z.Angew.Ichthyol.,1:31−34. ツー（Zhu）,Z.,クス（Xu）,K.,リー（Li）,G.,クシ
ー（Xie）,Y.＆ヒー（He）,L.,（1986），ドジョウ（ミ
スグルヌスアンギリカウダツス（Misgurnus anguillica
udatus）の受精卵に微注入されたヒト成長ホルモン遺伝
子の生物学的効果（Biological effects of human grow
th hormone gene microinjected into the fertilized
eggs of loach（Misgurnus anguillicaudatus）），ケ
クシュートングバオ（Kexue Tongbao）,31:988−990. 形質転換した魚類および他の動物の成長における様々
な試みがなされ、かつ成功している。成長ホルモンは過
去の研究において特に興味がもたれていた。成長ホルモ
ンは一本鎖ポリペプチドホルモンであり、動物における
体細胞の成長および発現の調節において主要な役割を演
じている。成長ホルモンにより魚類の成長を促進するた
めの多くの研究がなされている。これらの研究は下垂体
抽出物の給餌（タックマン（Tuckmann）,1936,カンチロ
＆レガラド（Cantilo and Regalado）,1940）、精製し
た組み換え体由来の成長ホルモンの注入または挿入（ギ
ル（Gill）等,1985;セキネ（Sekine）等,1985;カワウチ
（Kawauchi）等,1986;アゲロン（Agellon）等,1988）を
包含する。これら結果の全ては、単独の成長ホルモンが
魚類の成長を刺激する上で有効であることを明白に示し
た。しかしながら、これら全ての研究は養殖における用
途に制限されており、その主な欠点の一つはその表現型
が遺伝し得ないことである。
遺伝子転移技術は動物および植物両者の遺伝的かつ表
現型特性の操作のための新規かつ強力な手段となってい
る。形質転換魚類の製造に関して種々の報告が提示され
ている。最初の魚類の形質転換に関する研究はフィール
キント（Vielkind）等（1982）により報告された。これ
らの研究者はプラティ（Platyfish）にカブトガニの腫
瘍遺伝子を注入し、該注入されたカブトガニのTu遺伝子
がTu−を含まないプラティ中にＴ−黒色素胞を誘発でき
ることを見出した。1985および1986年に、ツー（Zhu）
等は成長ホルモン遺伝子転移による形質転換した魚類の
製造を報告している。ヒトGH構造遺伝子に連結したマウ
スメタロチオネインプロモータを使用して、これらの研
究者は形質転換したドジョウ、金魚およびハクレン（si
lver carp）を上首尾で製造した。平均して、該形質転
換された魚類はコントロールよりも１〜３倍大きい。そ
れ以来、同様な遺伝子構築体を利用した幾つかの報告が
公開された（ロッコンズ（Rokkones）等,1989;ギヨマー
ル（Guyomard）等,1989;チェン（Chen）等,1990）。こ
れら以外の研究も報告されている（マクレアン（Maclea
n）等,1987;ヒュー（Hew）,1989;マクレアン＆ペンマン
（Maclean and Penman）,1990;およびフレッチャー＆デ
ービース（Fletcher and Davies）,1991）。魚類に関す
る初期のGH遺伝子転移の研究は哺乳動物のメタロチオネ
インプロモータまたはウイルスプロモータとヒトまたは
ラットのGH遺伝子とを使用して実施していた（ツー（Zh
u）等,1986;ロッコンズ（Rokkones）等,1989;ギヨマー
ル（Guyomard）等,1989;チェン（Chen）等,1990）。こ
れら異種の遺伝子構築体の使用に関連する問題が２つあ
る。第一に、哺乳動物のGH遺伝子を使用して製造した形
質転換魚類はヒトが消費するのに不適当であるか、もし
くは許容されない。第二に、フリーデンライヒおよびス
カートル（Friedenreich and Schartl;1990）は、哺乳
類のGH遺伝子はインビトロにおいて魚類の細胞系では十
分にスプライシングされ得ず、また魚類細胞中に該GH遺
伝子の発現を検出できなかったことを報告している。こ
のことは、何故ロッコンズ（Rokkones）等,1989および
ギヨマール（Guyomard）等,1989が哺乳類メタロチオネ
イン−哺乳類GH融合体またはウイルスプロモータ−哺乳
類GH遺伝子を使用することによる形質転換魚類に迅速な
成長を観測し得なかったかを説明しているように考えら
れる。ツァン（Zhang）等（1990）およびチェン（Che
n）等（1990）は、レトロウイルスプロモータを利用し
た鯉およびドジョウにおける遺伝子転移に対してニジマ
スのGHホルモンを使用した。しかしながら、これら研究
において形質転換した魚類はコントロールよりも僅かに
20％大きかったに過ぎず、しかも使用した該ニジマスの
GH遺伝子は適当なGHの分泌および作用に必要なシグナル
配列に乏しいものであった。
現型特性の操作のための新規かつ強力な手段となってい
る。形質転換魚類の製造に関して種々の報告が提示され
ている。最初の魚類の形質転換に関する研究はフィール
キント（Vielkind）等（1982）により報告された。これ
らの研究者はプラティ（Platyfish）にカブトガニの腫
瘍遺伝子を注入し、該注入されたカブトガニのTu遺伝子
がTu−を含まないプラティ中にＴ−黒色素胞を誘発でき
ることを見出した。1985および1986年に、ツー（Zhu）
等は成長ホルモン遺伝子転移による形質転換した魚類の
製造を報告している。ヒトGH構造遺伝子に連結したマウ
スメタロチオネインプロモータを使用して、これらの研
究者は形質転換したドジョウ、金魚およびハクレン（si
lver carp）を上首尾で製造した。平均して、該形質転
換された魚類はコントロールよりも１〜３倍大きい。そ
れ以来、同様な遺伝子構築体を利用した幾つかの報告が
公開された（ロッコンズ（Rokkones）等,1989;ギヨマー
ル（Guyomard）等,1989;チェン（Chen）等,1990）。こ
れら以外の研究も報告されている（マクレアン（Maclea
n）等,1987;ヒュー（Hew）,1989;マクレアン＆ペンマン
（Maclean and Penman）,1990;およびフレッチャー＆デ
ービース（Fletcher and Davies）,1991）。魚類に関す
る初期のGH遺伝子転移の研究は哺乳動物のメタロチオネ
インプロモータまたはウイルスプロモータとヒトまたは
ラットのGH遺伝子とを使用して実施していた（ツー（Zh
u）等,1986;ロッコンズ（Rokkones）等,1989;ギヨマー
ル（Guyomard）等,1989;チェン（Chen）等,1990）。こ
れら異種の遺伝子構築体の使用に関連する問題が２つあ
る。第一に、哺乳動物のGH遺伝子を使用して製造した形
質転換魚類はヒトが消費するのに不適当であるか、もし
くは許容されない。第二に、フリーデンライヒおよびス
カートル（Friedenreich and Schartl;1990）は、哺乳
類のGH遺伝子はインビトロにおいて魚類の細胞系では十
分にスプライシングされ得ず、また魚類細胞中に該GH遺
伝子の発現を検出できなかったことを報告している。こ
のことは、何故ロッコンズ（Rokkones）等,1989および
ギヨマール（Guyomard）等,1989が哺乳類メタロチオネ
イン−哺乳類GH融合体またはウイルスプロモータ−哺乳
類GH遺伝子を使用することによる形質転換魚類に迅速な
成長を観測し得なかったかを説明しているように考えら
れる。ツァン（Zhang）等（1990）およびチェン（Che
n）等（1990）は、レトロウイルスプロモータを利用し
た鯉およびドジョウにおける遺伝子転移に対してニジマ
スのGHホルモンを使用した。しかしながら、これら研究
において形質転換した魚類はコントロールよりも僅かに
20％大きかったに過ぎず、しかも使用した該ニジマスの
GH遺伝子は適当なGHの分泌および作用に必要なシグナル
配列に乏しいものであった。
これら研究の全体ではないとしても、その多くが哺乳
類GHまたは哺乳類遺伝子とウイルスプロモータとを使用
して実施していた。養殖に適用可能であるためには、形
質転換した魚類において使用された該プロモータおよび
遺伝子は、好ましくは魚類タンパク遺伝子由来のものを
使用して、あらゆる高い健康阻害の可能性を回避すべき
である。更に、経済的に重要な種、例えば「全魚類」遺
伝子構築体をもつサケ等の迅速成長魚類の種の製造は魚
類の養殖にとって有益であろう。
類GHまたは哺乳類遺伝子とウイルスプロモータとを使用
して実施していた。養殖に適用可能であるためには、形
質転換した魚類において使用された該プロモータおよび
遺伝子は、好ましくは魚類タンパク遺伝子由来のものを
使用して、あらゆる高い健康阻害の可能性を回避すべき
である。更に、経済的に重要な種、例えば「全魚類」遺
伝子構築体をもつサケ等の迅速成長魚類の種の製造は魚
類の養殖にとって有益であろう。
最近、鯉のβ−アクチンプロモータを使用した「全魚
類」発現ベクターが提案された（リュー（Liu）等,1990
b）。このベクターに大きく関連する一つの問題は該ベ
クターがその転写終止シグナルとしてマスノスケのGH c
DNA（ヒュー（Hew）等,1989）由来のポリアデニル化シ
グナルを使用していることにある。しかし、転写終止は
機能的ポリアデニル化シグナルおよびGTに富む下流域エ
レメント両者を必要とする（コネリー（Connelly）＆マ
ネリー（Manely）,1988;プラウドフット（Proudfoot）,
1989）。従って、該GHcDNAの該ポリアデニル化シグナル
は転写終止シグナルとして十分に機能することはない。
第二に、該β−アクチンプロモータは組織の全部ではな
くともその殆どにおいて発現されるか、あるいは組織−
特異性に劣る。
類」発現ベクターが提案された（リュー（Liu）等,1990
b）。このベクターに大きく関連する一つの問題は該ベ
クターがその転写終止シグナルとしてマスノスケのGH c
DNA（ヒュー（Hew）等,1989）由来のポリアデニル化シ
グナルを使用していることにある。しかし、転写終止は
機能的ポリアデニル化シグナルおよびGTに富む下流域エ
レメント両者を必要とする（コネリー（Connelly）＆マ
ネリー（Manely）,1988;プラウドフット（Proudfoot）,
1989）。従って、該GHcDNAの該ポリアデニル化シグナル
は転写終止シグナルとして十分に機能することはない。
第二に、該β−アクチンプロモータは組織の全部ではな
くともその殆どにおいて発現されるか、あるいは組織−
特異性に劣る。
発明の概要 本発明の一局面によれば、魚類のゲノムに組み込ん
で、形質転換魚類を製造するためのキメラ遺伝子構築体
を形成するのに使用するプロモータ配列は、以下の第1A
図に示されるOP−AFP遺伝子配列のBam H1−Bg1 IIフラ
グメントとして、サケ由来の不凍化タンパク2.1kbプロ
モータに機能的に対応る特性をもつDNA配列を含む。
で、形質転換魚類を製造するためのキメラ遺伝子構築体
を形成するのに使用するプロモータ配列は、以下の第1A
図に示されるOP−AFP遺伝子配列のBam H1−Bg1 IIフラ
グメントとして、サケ由来の不凍化タンパク2.1kbプロ
モータに機能的に対応る特性をもつDNA配列を含む。
本発明のもう一つの局面によれば、プロモータ配列が
提供され、該プロモータ配列は以下の第Ｖ表に示される
５′末端から塩基対位置１〜塩基対位置2115までの配列
を含む。
提供され、該プロモータ配列は以下の第Ｖ表に示される
５′末端から塩基対位置１〜塩基対位置2115までの配列
を含む。
本発明の別の局面では、魚類ゲノムに組み込んで形質
転換魚類を製造するためのキメラ遺伝子構築体を作成す
るのに利用する転写終止配列を提供する。この終止配列
は以下の第1B図に示されるOP5配列のHpa−Ｉ−Aat IIフ
ラグメントに機能的に対応する特徴をもつDNA配列を含
む。
転換魚類を製造するためのキメラ遺伝子構築体を作成す
るのに利用する転写終止配列を提供する。この終止配列
は以下の第1B図に示されるOP5配列のHpa−Ｉ−Aat IIフ
ラグメントに機能的に対応する特徴をもつDNA配列を含
む。
本発明の更に別の局面では、魚類ゲノムに組み込むた
めのキメラ遺伝子構築体を作成するのに利用するプロモ
ータ／転写終止配列を提供する。この組み換え配列は該
プロモータと終止配列との間に５′未翻訳配列を含む。
この組み換え配列は塩基対位置2116にBg1 IIおよび塩基
対位置2188にHpa Iの固有の制限サイトをもつ以下の第
Ｖ表に示す配列をもつ。
めのキメラ遺伝子構築体を作成するのに利用するプロモ
ータ／転写終止配列を提供する。この組み換え配列は該
プロモータと終止配列との間に５′未翻訳配列を含む。
この組み換え配列は塩基対位置2116にBg1 IIおよび塩基
対位置2188にHpa Iの固有の制限サイトをもつ以下の第
Ｖ表に示す配列をもつ。
本発明のもう一つの局面によれば、該プロモータ／終
止配列は、該Bg1 IIサイトまたはHpa Iサイトに挿入さ
れ、かつ魚類ホルモン、魚類成長ホルモン、不凍化タン
パクまたは疾病抵抗性タンパクをコードするキメラ遺伝
子配列を発現するように作成されている。
止配列は、該Bg1 IIサイトまたはHpa Iサイトに挿入さ
れ、かつ魚類ホルモン、魚類成長ホルモン、不凍化タン
パクまたは疾病抵抗性タンパクをコードするキメラ遺伝
子配列を発現するように作成されている。
本発明の更に他の局面によれば、遺伝子発現ビヒクル
は以下の第11図に示した制限マップをもつ。この遺伝子
は該Bg1 IIサイトまたはHpa Iサイトに挿入された配列
をもつ。
は以下の第11図に示した制限マップをもつ。この遺伝子
は該Bg1 IIサイトまたはHpa Iサイトに挿入された配列
をもつ。
本発明の他の局面によれば、プロモータ配列は魚類中
でキメラ遺伝子配列の発現を促進するためのDNA配列を
もつ。このプロモータ配列は魚類ゲノムの不凍化タンパ
ク（AFP）または不凍化糖タンパク（AFGP）由来のもの
である。このプロモータ配列は、発現ビヒクル中に与え
られた場合には、以下の第Ｖ表に示した該Bg1 IIサイト
の５′末端からのプロモータ配列と同様に機能する。
でキメラ遺伝子配列の発現を促進するためのDNA配列を
もつ。このプロモータ配列は魚類ゲノムの不凍化タンパ
ク（AFP）または不凍化糖タンパク（AFGP）由来のもの
である。このプロモータ配列は、発現ビヒクル中に与え
られた場合には、以下の第Ｖ表に示した該Bg1 IIサイト
の５′末端からのプロモータ配列と同様に機能する。
更に別の本発明の局面によれば、プロモータ配列は更
にDNA応答性エレメントを含み、該エレメントは該プロ
モータ配列をインビボで該エレメントに対して応答性の
ものとする。
にDNA応答性エレメントを含み、該エレメントは該プロ
モータ配列をインビボで該エレメントに対して応答性の
ものとする。
本発明の別の局面によれば、プロモータ配列が提供さ
れ、そのDNA配列はそのプロモータ活性を変えるために
その幾つかの部分で変性されている。
れ、そのDNA配列はそのプロモータ活性を変えるために
その幾つかの部分で変性されている。
更に他の本発明の局面によれば、この課題とするプロ
モータを含む該キメラ遺伝子構築体で形質転換された宿
主が提供される。
モータを含む該キメラ遺伝子構築体で形質転換された宿
主が提供される。
本発明の更に別の局面によれば、ゲノムに以下のよう
なキメラ遺伝子構築体を組み込んだことを特徴とする形
質転換した魚類が提供され、ここで該キメラ遺伝子構築
体は ｉ）上記プロモータ配列、および ii）発現した場合に該形質転換魚類に所定の特徴を与え
る遺伝子配列 を含む。
なキメラ遺伝子構築体を組み込んだことを特徴とする形
質転換した魚類が提供され、ここで該キメラ遺伝子構築
体は ｉ）上記プロモータ配列、および ii）発現した場合に該形質転換魚類に所定の特徴を与え
る遺伝子配列 を含む。
本発明の更に他の局面によれば、形質転換した魚類の
製法が提供され、該方法は ｉ）上記プロモータ配列の一部であるDNA配列を有する
魚類ゲノム部分をPCR法により増幅する工程、および ii）発形質転換した魚類を示す該増幅された部分の存在
を検出する工程 を含む。
製法が提供され、該方法は ｉ）上記プロモータ配列の一部であるDNA配列を有する
魚類ゲノム部分をPCR法により増幅する工程、および ii）発形質転換した魚類を示す該増幅された部分の存在
を検出する工程 を含む。
本発明の一局面によれば、ゲンゲ不凍化遺伝子（OP−
AFP）由来の魚類遺伝子プロモータ（ヒュー（Hew）等,1
988）およびマスノスケ由来の上記GHcDNA（ヒュー（He
w）等,1989）を使用することにより、形質転換したタイ
セイヨウサケを首尾よく製造する。
AFP）由来の魚類遺伝子プロモータ（ヒュー（Hew）等,1
988）およびマスノスケ由来の上記GHcDNA（ヒュー（He
w）等,1989）を使用することにより、形質転換したタイ
セイヨウサケを首尾よく製造する。
本発明の更に別の局面では、キメラ遺伝子構築体を作
成するのに使用する「全魚類」プロモータを提供する。
このプロモータはゲンゲ由来の該AFPプロモータおよび
正常なRNA転写終止シグナルを含む３′配列と機能的に
対応する諸特性をもつ不凍化遺伝子（AFP）プロモータ
を含む。このプロモータは以下の第1a図、第1b図および
第Ｉ表に記載のOP−AFPの2kbBam H1−Bg1 IIフラグメン
トにより特徴付けられる。該３′配列は以下の第1b図に
示す1kbHpa I−Hing IIIフラグメントにより特徴付けら
れる。オオカミウオ（WO）、ケムシカジカ（sea rave
n）（SR）およびウインタフロウンダ（winter flounde
r）（WF）から単離されたものを含む、他の不凍化遺伝
子プロモータの機能的分析は、これらが同様に利用でき
ることを示している（第II表）。ここでは、ゲンゲ不凍
化タンパクプロモータのみを形質転換した魚類の製造に
おいて１例として使用する。
成するのに使用する「全魚類」プロモータを提供する。
このプロモータはゲンゲ由来の該AFPプロモータおよび
正常なRNA転写終止シグナルを含む３′配列と機能的に
対応する諸特性をもつ不凍化遺伝子（AFP）プロモータ
を含む。このプロモータは以下の第1a図、第1b図および
第Ｉ表に記載のOP−AFPの2kbBam H1−Bg1 IIフラグメン
トにより特徴付けられる。該３′配列は以下の第1b図に
示す1kbHpa I−Hing IIIフラグメントにより特徴付けら
れる。オオカミウオ（WO）、ケムシカジカ（sea rave
n）（SR）およびウインタフロウンダ（winter flounde
r）（WF）から単離されたものを含む、他の不凍化遺伝
子プロモータの機能的分析は、これらが同様に利用でき
ることを示している（第II表）。ここでは、ゲンゲ不凍
化タンパクプロモータのみを形質転換した魚類の製造に
おいて１例として使用する。
本発明は特定の態様、例えばサケ細胞系および日本産
メダガ胚における該OP−AFP遺伝子プロモータの活性の
一時的発現の分析、AFP−GH融合遺伝子の構築、および
微注入による該遺伝子転移、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）による形質転換サケのスクリーニング並びに寸法お
よび成長速度の測定を与える。
メダガ胚における該OP−AFP遺伝子プロモータの活性の
一時的発現の分析、AFP−GH融合遺伝子の構築、および
微注入による該遺伝子転移、ポリメラーゼ連鎖反応（PC
R）による形質転換サケのスクリーニング並びに寸法お
よび成長速度の測定を与える。
図面の簡単な説明 第１図：（Ａ）サケ細胞系および日本産メダカ胚にお
ける一時的CATアッセイのためのpOP−CATの構築。この
プラスミドをpOP5Bと命名する。（Ｂ）遺伝子転移用の
全魚類キメラ遺伝子（pOP−GHe）の構築。
ける一時的CATアッセイのためのpOP−CATの構築。この
プラスミドをpOP5Bと命名する。（Ｂ）遺伝子転移用の
全魚類キメラ遺伝子（pOP−GHe）の構築。
第２図:PCR分析法。３組のプライマーを形質転換遺伝
子（transgene）の検出のために使用した。プライマー
間の距離はプライマーＡとＢについて813bp、プライマ
ーＡとＤについて335bp、プライマーＣとＤについて119
bp（配列決定研究はプライマー間の距離より精密なデー
タを与えた、即ちプライマーＡとＢについて855bp、プ
ライマーＡとＤについて333bp、プライマーＣとＤにつ
いて199bp）。
子（transgene）の検出のために使用した。プライマー
間の距離はプライマーＡとＢについて813bp、プライマ
ーＡとＤについて335bp、プライマーＣとＤについて119
bp（配列決定研究はプライマー間の距離より精密なデー
タを与えた、即ちプライマーＡとＢについて855bp、プ
ライマーＡとＤについて333bp、プライマーＣとＤにつ
いて199bp）。
第３図:CATアッセイによるニジマス肝癌細胞における
OP−AFPプラスミド活性の分析。このゲンゲ−CATプラス
ミドはpOP5Bである。
OP−AFPプラスミド活性の分析。このゲンゲ−CATプラス
ミドはpOP5Bである。
第４図:OP−CAT（pOP％Ｂ）を注入した胚におけるCAT
発現の経時（time course）分析。５種の胚のプールを
１日、２日、４日、６日、８日および11日目の胚のCAT
アッセイのために使用した。個々の幼魚を孵化したメダ
カ（孵化後１日目）の該CATアッセイのために使用し
た。pBLCAT3を注入した胚を負のコントロールとして使
用した。
発現の経時（time course）分析。５種の胚のプールを
１日、２日、４日、６日、８日および11日目の胚のCAT
アッセイのために使用した。個々の幼魚を孵化したメダ
カ（孵化後１日目）の該CATアッセイのために使用し
た。pBLCAT3を注入した胚を負のコントロールとして使
用した。
第５図：プライマーA/Bを使用したPCR法による形質転
換したサケのスクリーニング。（Ａ）アガロースゲル電
気泳動法によるPCR法で増幅した生成物の分析。（Ｂ）G
H特異的プローブＥを使用した該PCRにより増幅した生成
物のサザーンブロット分析。
換したサケのスクリーニング。（Ａ）アガロースゲル電
気泳動法によるPCR法で増幅した生成物の分析。（Ｂ）G
H特異的プローブＥを使用した該PCRにより増幅した生成
物のサザーンブロット分析。
第６図：（Ａ）プライマーC/Dを用いたPCR法による形
質転換したサケの確認、（Ｂ）プライマーA/Bを使用し
たPCR法による形質転換遺伝子の組み込み度（integrit
y）の研究。
質転換したサケの確認、（Ｂ）プライマーA/Bを使用し
たPCR法による形質転換遺伝子の組み込み度（integrit
y）の研究。
第７図：形質転換したサケおよび形質転換されていな
いサケのサイズ分布。
いサケのサイズ分布。
第８図：形質転換したサケ対形質転換されていないサ
ケの比。
ケの比。
第９図：ニジマス肝癌細胞系RTH−149およびマスノス
ケの胚細胞系CHSE−214を含む２種のサケ細胞系におけ
るCATアッセイによる該opAFP遺伝子プロモータ活性の分
析。右側のACおよびＣにより示されたアセチル化したま
たはアセチル化されていないクロラムフェニコールを薄
層クロマトグラフィー処理および引き続き行われるオー
トラジオグラフィーにより分離した。
ケの胚細胞系CHSE−214を含む２種のサケ細胞系におけ
るCATアッセイによる該opAFP遺伝子プロモータ活性の分
析。右側のACおよびＣにより示されたアセチル化したま
たはアセチル化されていないクロラムフェニコールを薄
層クロマトグラフィー処理および引き続き行われるオー
トラジオグラフィーにより分離した。
第10図:opAFP−CATを注入した胚の種々の段階におけるC
AT発現。個々の胚を各CATアッセイのために使用した。
該アセチル化しまたはアセチル化されていないクロラム
フェニコールは右側のACおよびＣにより示される。分析
した時点は１日、２日、６日、９日および11日目であっ
た。
AT発現。個々の胚を各CATアッセイのために使用した。
該アセチル化しまたはアセチル化されていないクロラム
フェニコールは右側のACおよびＣにより示される。分析
した時点は１日、２日、６日、９日および11日目であっ
た。
第11図は、opAFP−Ｖを示す図であり、ここで白抜き
の矩形はゲンゲのAFP遺伝子プロモータおよび遺伝子
３′−フランキング配列であり、斜線を施した矩形はゲ
ンゲのAFP遺伝子５′−未翻訳配列であり、黒塗りの矩
形はゲンゲのAFP遺伝子３′−未翻訳配列であり、−−
−はpUCプラスミドDNA配列であり、アヤ目陰影を付した
矩形はアンピシリン耐性遺伝子を表す。TATAボックス、
ポリ（Ａ）シグナル（AATAAA）および推定転写終止シグ
ナル（TTTTTCT）が示されている。制限サイトに関連し
て、ＡはAat IIであり、BaはBamH Iであり、BgはBgl II
であり、ＥはEcoR Iであり、ＨはHind IIIであり、Hpは
Hpalであり、ＫはKpnlであり、SacはSaclであり、Salは
Sallであり、またSmはSmalである。
の矩形はゲンゲのAFP遺伝子プロモータおよび遺伝子
３′−フランキング配列であり、斜線を施した矩形はゲ
ンゲのAFP遺伝子５′−未翻訳配列であり、黒塗りの矩
形はゲンゲのAFP遺伝子３′−未翻訳配列であり、−−
−はpUCプラスミドDNA配列であり、アヤ目陰影を付した
矩形はアンピシリン耐性遺伝子を表す。TATAボックス、
ポリ（Ａ）シグナル（AATAAA）および推定転写終止シグ
ナル（TTTTTCT）が示されている。制限サイトに関連し
て、ＡはAat IIであり、BaはBamH Iであり、BgはBgl II
であり、ＥはEcoR Iであり、ＨはHind IIIであり、Hpは
Hpalであり、ＫはKpnlであり、SacはSaclであり、Salは
Sallであり、またSmはSmalである。
第12図：形質転換したサケ および形質転換されていない同胞種（平均体重５〜7g）
を示す図である。
を示す図である。
第13図：サケのサイズ−頻度分布を示す。（Ａ）魚
（200）の体重を1990年10月に計り、かつ50匹を獲得し
て、DNA分析のために採血した（実線の棒）。個々の形
質転換された魚の存在はＴで示されている。（Ｔ）はス
ケール（Scale）DNA解析のみで断定可能（posisible）
であることが分かった形質転換した魚を示す。（Ｂ）水
槽中の全ての魚（484）を1991年１月に秤量し、DNA分析
のために採血した。Ｔは形質転換された魚の存在を示
し、（Ｔ）はスケールDNA解析のみで正であることが分
かった形質転換魚を示す。
（200）の体重を1990年10月に計り、かつ50匹を獲得し
て、DNA分析のために採血した（実線の棒）。個々の形
質転換された魚の存在はＴで示されている。（Ｔ）はス
ケール（Scale）DNA解析のみで断定可能（posisible）
であることが分かった形質転換した魚を示す。（Ｂ）水
槽中の全ての魚（484）を1991年１月に秤量し、DNA分析
のために採血した。Ｔは形質転換された魚の存在を示
し、（Ｔ）はスケールDNA解析のみで正であることが分
かった形質転換魚を示す。
好ましい態様の詳細な説明 本発明は所定の遺伝的特徴を劇的に発現する形質転換
された魚を上首尾で製造する。本発明の１態様によれ
ば、マスノスケGHcDNAクローンに連結された不凍化プロ
モータを使用してキメラ遺伝子pOP−GHeを構築した。こ
の遺伝子構築体pOP−GHeを非活性化タイセイヨウサケの
受精卵にマイクロパイル（micropyles）により微注入し
た。この注入は本出願人の出願中の1988年12月１日付け
の米国特許出願第278,463号および1991年12月12日付け
の米国特許出願第805,948号に記載された技術に従って
実施した。該特許の要旨を本発明の参考文献とする。該
形質転換遺伝子を担持する形質転換されたタイセイヨウ
サケが少なくとも２％の組み込み頻度で発生した。形質
転換遺伝子の存在は特異的オリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用したポリメラーゼ連鎖反応法により検出され
た。これらの形質転換された魚はその体重および成長速
度における顕著な増加を示した。８カ月令において、該
形質転換された魚の平均体重増加は４倍であり、かつ最
大の形質転換された魚は形質転換されていないコントロ
ールに比して８倍も大きかった。これらの研究は該AFP
プロモータが大きな形質転換されたサケを生産する上で
有効であり、また魚類の多くの異なる種にも適用可能で
あろうことを立証した。本発明のプロモータをもつ魚類
成長ホルモンの使用はコントロールよりも８倍程度まで
大きな形質転換魚類を与えるであろう。これは、形質転
換された魚類に関してこれまでに報告された中で最も高
い増加率である。形質転換されたマウス（パルミッター
（Palmiter）等,1982）および形質転換されたブタ（バ
イズ（Vize）等,1988）における２−倍という増加率と
比較すると、これらの研究は形質転換されたサケの成長
がより一層顕著であることを示している。
された魚を上首尾で製造する。本発明の１態様によれ
ば、マスノスケGHcDNAクローンに連結された不凍化プロ
モータを使用してキメラ遺伝子pOP−GHeを構築した。こ
の遺伝子構築体pOP−GHeを非活性化タイセイヨウサケの
受精卵にマイクロパイル（micropyles）により微注入し
た。この注入は本出願人の出願中の1988年12月１日付け
の米国特許出願第278,463号および1991年12月12日付け
の米国特許出願第805,948号に記載された技術に従って
実施した。該特許の要旨を本発明の参考文献とする。該
形質転換遺伝子を担持する形質転換されたタイセイヨウ
サケが少なくとも２％の組み込み頻度で発生した。形質
転換遺伝子の存在は特異的オリゴヌクレオチドプライマ
ーを使用したポリメラーゼ連鎖反応法により検出され
た。これらの形質転換された魚はその体重および成長速
度における顕著な増加を示した。８カ月令において、該
形質転換された魚の平均体重増加は４倍であり、かつ最
大の形質転換された魚は形質転換されていないコントロ
ールに比して８倍も大きかった。これらの研究は該AFP
プロモータが大きな形質転換されたサケを生産する上で
有効であり、また魚類の多くの異なる種にも適用可能で
あろうことを立証した。本発明のプロモータをもつ魚類
成長ホルモンの使用はコントロールよりも８倍程度まで
大きな形質転換魚類を与えるであろう。これは、形質転
換された魚類に関してこれまでに報告された中で最も高
い増加率である。形質転換されたマウス（パルミッター
（Palmiter）等,1982）および形質転換されたブタ（バ
イズ（Vize）等,1988）における２−倍という増加率と
比較すると、これらの研究は形質転換されたサケの成長
がより一層顕著であることを示している。
本明細書に以下で提示するデータは、更に魚類遺伝子
由来のDNA構築体を使用することによる上首尾の形質転
換されたサケの生産を立証する。本発明の一局面によれ
ば、ゲンゲの不凍化遺伝子プロモータおよび転写終止シ
グナルがマスノスケのGH遺伝子と連結された。これら両
者は魚類遺伝子由来のものであり、従って商業的に重要
な魚類における遺伝子転移のために哺乳類またはウイル
ス遺伝子を使用したことに関連する諸問題点を回避する
ことができる。
由来のDNA構築体を使用することによる上首尾の形質転
換されたサケの生産を立証する。本発明の一局面によれ
ば、ゲンゲの不凍化遺伝子プロモータおよび転写終止シ
グナルがマスノスケのGH遺伝子と連結された。これら両
者は魚類遺伝子由来のものであり、従って商業的に重要
な魚類における遺伝子転移のために哺乳類またはウイル
ス遺伝子を使用したことに関連する諸問題点を回避する
ことができる。
以下の略号を使用する。
opAFP:ゲンゲの不凍化タンパク。
opAFP−CAT:バクテリア由来のロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼと連結した該ゲンゲの不凍化
タンパクプロモータからなるキメラプラスミド（元々、
この生成物は「pOP−CAT」と呼ばれていた。更なる開発
中に、本発明者等はこれを「opAFP−CAT」と命名するこ
とを選択した）。
セチルトランスフェラーゼと連結した該ゲンゲの不凍化
タンパクプロモータからなるキメラプラスミド（元々、
この生成物は「pOP−CAT」と呼ばれていた。更なる開発
中に、本発明者等はこれを「opAFP−CAT」と命名するこ
とを選択した）。
opAFP−GHe:魚類成長ホルモンcDNA遺伝子に連結した
該ゲンゲの不凍化タンパクプロモータと３′未翻訳配列
からなる「全魚類」キメラ遺伝子。（元々、この生成物
は「pOP−GHe」と呼ばれていた。更なる開発中に、本発
明者等はこれを「opAFP−GHc」と命名することを選択し
た）。
該ゲンゲの不凍化タンパクプロモータと３′未翻訳配列
からなる「全魚類」キメラ遺伝子。（元々、この生成物
は「pOP−GHe」と呼ばれていた。更なる開発中に、本発
明者等はこれを「opAFP−GHc」と命名することを選択し
た）。
opAFP−V:該ゲンゲの不凍化プロモータと３′未翻訳
配列とを使用したことに基く「全魚類」遺伝子カセッ
ト。
配列とを使用したことに基く「全魚類」遺伝子カセッ
ト。
該プロモータのOP−AFP特性をもつ2kbのBamH I−Bg1
IIフラグメントは、配列決定研究により、2.1kbの長さ
をもつことが示された。該３′配列Hpa I−Hind IIIフ
ラグメントは1.1kbの長さをもつことが示された。
IIフラグメントは、配列決定研究により、2.1kbの長さ
をもつことが示された。該３′配列Hpa I−Hind IIIフ
ラグメントは1.1kbの長さをもつことが示された。
ゲンゲのAFPはタイプ３のAFPの一員である（デービー
ス（Davies）およびヒュー（Hew）,1990）。これは約15
0の遺伝子コピーをもつ（ヒュー（Hew）等,1988;デービ
ース（Davies）等,1989）。このAFPのゲノム構造および
タンパクは本発明者等により十分に特徴付けされている
（ヒュー（Hew）等,1984,1988;リー（Li）等,1985,198
9）。より最近になって、そのプロモータ配列がサケ細
胞系および日本産のメダカ胚両者内で研究された（ゴン
グおよびヒュー（Gong and Hew）、未発表；ゴング（Go
ng）等,1991;第II表参照）。このゲンゲのAFP遺伝子は
支配的に肝細胞内で発現される（ゴング（Gong）等,199
1）。これら全ての文献を本発明の参考文献とする。
ス（Davies）およびヒュー（Hew）,1990）。これは約15
0の遺伝子コピーをもつ（ヒュー（Hew）等,1988;デービ
ース（Davies）等,1989）。このAFPのゲノム構造および
タンパクは本発明者等により十分に特徴付けされている
（ヒュー（Hew）等,1984,1988;リー（Li）等,1985,198
9）。より最近になって、そのプロモータ配列がサケ細
胞系および日本産のメダカ胚両者内で研究された（ゴン
グおよびヒュー（Gong and Hew）、未発表；ゴング（Go
ng）等,1991;第II表参照）。このゲンゲのAFP遺伝子は
支配的に肝細胞内で発現される（ゴング（Gong）等,199
1）。これら全ての文献を本発明の参考文献とする。
タイプ１とは異なり、ウインタフロウンダ由来のアラ
ニンに富むAFPはウインタにおいてのみ合成され、該ゲ
ンゲのAFPは一年を通じて存在するが、冬季には高濃度
で存在する（フレッチャー（Fletcher）等,1989）。以
下のデータは該OP−AFPプロモータが魚、例えばタイセ
イヨウサケ内でCATおよびGH遺伝子または他の所定のこ
れらに匹敵する遺伝子の発現を誘発するのに極めて有効
なプロモータである。サケ科魚類またはメダカゲノムに
は不凍化（AFP）遺伝子は存在しないが、このOP−AFP遺
伝子発現を制御する転写因子がサケおよび他の全ての魚
類中に存在することは、本発明の上首尾の実施の観点か
ら期待できそうなことである。ウインタフロウンダ由来
のタイプＩ不凍化タンパク遺伝子を使用した形質転換さ
れたタイセイヨウサケの生産における本発明者等の初期
の研究の結果と一致する（フレッチャー（Fletcher）
等,1988）。この研究では、該AFP遺伝子のゲノム配列お
よびその５′および３′フランキング配列をコードする
DNAを使用した。形質転換された動物フロウンダおよび
その血清中を循環するAFP産生F1世代が得られた（シェ
アーズ（Shears）等,1991）。サケ科魚類細胞系、日本
産メダカ胚における該ゲンゲプロモータの研究および該
形質転換されたタイセイヨウサケについて得られた結果
は該プロモータが種々の魚類種において有用であること
を示している。本発明のAFP遺伝子構築体は、更に興味
ある多くの他の魚類遺伝子を挿入し得る遺伝子カセット
に発展させることが可能である。
ニンに富むAFPはウインタにおいてのみ合成され、該ゲ
ンゲのAFPは一年を通じて存在するが、冬季には高濃度
で存在する（フレッチャー（Fletcher）等,1989）。以
下のデータは該OP−AFPプロモータが魚、例えばタイセ
イヨウサケ内でCATおよびGH遺伝子または他の所定のこ
れらに匹敵する遺伝子の発現を誘発するのに極めて有効
なプロモータである。サケ科魚類またはメダカゲノムに
は不凍化（AFP）遺伝子は存在しないが、このOP−AFP遺
伝子発現を制御する転写因子がサケおよび他の全ての魚
類中に存在することは、本発明の上首尾の実施の観点か
ら期待できそうなことである。ウインタフロウンダ由来
のタイプＩ不凍化タンパク遺伝子を使用した形質転換さ
れたタイセイヨウサケの生産における本発明者等の初期
の研究の結果と一致する（フレッチャー（Fletcher）
等,1988）。この研究では、該AFP遺伝子のゲノム配列お
よびその５′および３′フランキング配列をコードする
DNAを使用した。形質転換された動物フロウンダおよび
その血清中を循環するAFP産生F1世代が得られた（シェ
アーズ（Shears）等,1991）。サケ科魚類細胞系、日本
産メダカ胚における該ゲンゲプロモータの研究および該
形質転換されたタイセイヨウサケについて得られた結果
は該プロモータが種々の魚類種において有用であること
を示している。本発明のAFP遺伝子構築体は、更に興味
ある多くの他の魚類遺伝子を挿入し得る遺伝子カセット
に発展させることが可能である。
このゲンゲAFP遺伝子プロモータは幾つかの点で魅力
がある。第一に、これは支配的に肝臓で発現され、その
組織は高い合成能および分泌能を有する。肝臓における
形質転換遺伝子の発現は遺伝子転移の研究において最も
一般的な方法の一つである。第二に、このAFP遺伝子は
ほんの僅かな数の魚類種にのみ存在する。その発現は宿
主ゲノムにより影響を受けない。といのは、相同の内因
性遺伝子をもたないからである。その上、殆どの魚類ゲ
ノムにおいて該AFP遺伝子が存在しないことは、該宿主D
NAからの如何なるバックグラウンドの寄与もなしに簡単
に該AFP由来の遺伝子構築体を検出することを可能とす
る。このことは本発明者等の形質転換されたタイセイヨ
ウサケの研究で明らかに例示された（デュー（Du）等,1
992）。最後に、該opAFP遺伝子プロモータ中の幾つかの
正および負のシス−作用（cis−acting）エレメントが
存在することが示された（ゴング（Gong）等,1991）。
このことは、このベクターを形質転換遺伝子発現の種々
の要件を満たすように変性する機会を与える。
がある。第一に、これは支配的に肝臓で発現され、その
組織は高い合成能および分泌能を有する。肝臓における
形質転換遺伝子の発現は遺伝子転移の研究において最も
一般的な方法の一つである。第二に、このAFP遺伝子は
ほんの僅かな数の魚類種にのみ存在する。その発現は宿
主ゲノムにより影響を受けない。といのは、相同の内因
性遺伝子をもたないからである。その上、殆どの魚類ゲ
ノムにおいて該AFP遺伝子が存在しないことは、該宿主D
NAからの如何なるバックグラウンドの寄与もなしに簡単
に該AFP由来の遺伝子構築体を検出することを可能とす
る。このことは本発明者等の形質転換されたタイセイヨ
ウサケの研究で明らかに例示された（デュー（Du）等,1
992）。最後に、該opAFP遺伝子プロモータ中の幾つかの
正および負のシス−作用（cis−acting）エレメントが
存在することが示された（ゴング（Gong）等,1991）。
このことは、このベクターを形質転換遺伝子発現の種々
の要件を満たすように変性する機会を与える。
我々は、また選択された遺伝子の十分な発現が我々の
ベクターopAFP−Ｖ中に1.2kbのopAFP遺伝子の３′配列
を配置することにより達成できることを立証した。DNA
配列解析は、これが典型的なポリアデニル化シグナルAA
TAAAを含むことを示す。更に、7bp配列モチーフ（TTTTT
CT）が該ポリ（Ａ）シグナルの26bp下流側にあることを
見出した。この7bpモチーフはウイルスにおけるような
適当な転写終止シグナル（TTTTTNT）である（ツォー（Z
hou）等,1991）。該1.2kbの配列は、従って遺伝子発現
における一般的な転写終止シグナルとして機能できる。
ベクターopAFP−Ｖ中に1.2kbのopAFP遺伝子の３′配列
を配置することにより達成できることを立証した。DNA
配列解析は、これが典型的なポリアデニル化シグナルAA
TAAAを含むことを示す。更に、7bp配列モチーフ（TTTTT
CT）が該ポリ（Ａ）シグナルの26bp下流側にあることを
見出した。この7bpモチーフはウイルスにおけるような
適当な転写終止シグナル（TTTTTNT）である（ツォー（Z
hou）等,1991）。該1.2kbの配列は、従って遺伝子発現
における一般的な転写終止シグナルとして機能できる。
このopAFP遺伝子カセット、即ちopAFP−Ｖの開発は、
遺伝子転移のための他の遺伝子の挿入を大幅に簡単化し
た。形質転換されたサケおよび形質転換された魚類の他
の種は、この発現ベクターを使用して、他の下垂体ホル
モン、多くの他のタンパクおよびポリペプチドと共に生
産し得る。
遺伝子転移のための他の遺伝子の挿入を大幅に簡単化し
た。形質転換されたサケおよび形質転換された魚類の他
の種は、この発現ベクターを使用して、他の下垂体ホル
モン、多くの他のタンパクおよびポリペプチドと共に生
産し得る。
実験手順−本発明の第一の態様群 Ａ−1 タイセイヨウサケ卵の採集 成熟タイセイヨウサケ（サルモサラー（Salmo sala
r））を産卵前に、ニューファンドランドのエクスプロ
イツ＆コリネット川（exploits and Colinet river）系
から捕獲し、生きたままニューファンドランドのメモリ
アルユニバーシティ（Memorial University）のオーシ
ャンサイエンスズセンター（ocean Sciences Centre）
に輸送した。この魚を季節的な周囲の光周期にて、新鮮
な水および空気を供給した２×２×0.5mの水槽中で飼育
した。
r））を産卵前に、ニューファンドランドのエクスプロ
イツ＆コリネット川（exploits and Colinet river）系
から捕獲し、生きたままニューファンドランドのメモリ
アルユニバーシティ（Memorial University）のオーシ
ャンサイエンスズセンター（ocean Sciences Centre）
に輸送した。この魚を季節的な周囲の光周期にて、新鮮
な水および空気を供給した２×２×0.5mの水槽中で飼育
した。
ｔ−アミルアルコールの希薄液で麻酔したサケから卵
および***を取り出した。卵は４℃に維持し、微注入の
前２時間に渡り受精し、氷冷したサケリンゲル液で数回
すすいだ。該卵を微注入後新鮮な水中に配置した際に活
性化が生じた（フレッチャー（Fletcher）等,1988）。
および***を取り出した。卵は４℃に維持し、微注入の
前２時間に渡り受精し、氷冷したサケリンゲル液で数回
すすいだ。該卵を微注入後新鮮な水中に配置した際に活
性化が生じた（フレッチャー（Fletcher）等,1988）。
Ａ−2 メダカの卵の採集 日本産メダカ（オリジアスラチペス（Oryzias latipe
s））は、バンクーバーのキャンサーリサーチセンター
（Cancer Research Cetre）におけるDr.J.フィールキン
ト（Vielkind）の研究室に保有されていた。成体の再生
活性を10時間の暗所配置および14時間の光照射という人
工的な光周期により誘発した。雌に付着した受精卵を光
の照射の１〜２時間後に採集し、注入前に12℃にてリン
ゲル液（0.75％NaCl,0.02％KCl,0.02％CaCl2;pH7.3）中
に維持した。注入処理したメダカ胚を0.1％のNaCl、0.0
03％のKCl、0.004％のCaCl2・2H2O、0.016％のMgSO4・7
H2O、0.0001％のメチレンブルーを含む培地中で成長さ
せ、孵化後即座に水槽に移した（チョン＆フィールキン
ト（Chong and Vielkind）,1989）。
s））は、バンクーバーのキャンサーリサーチセンター
（Cancer Research Cetre）におけるDr.J.フィールキン
ト（Vielkind）の研究室に保有されていた。成体の再生
活性を10時間の暗所配置および14時間の光照射という人
工的な光周期により誘発した。雌に付着した受精卵を光
の照射の１〜２時間後に採集し、注入前に12℃にてリン
ゲル液（0.75％NaCl,0.02％KCl,0.02％CaCl2;pH7.3）中
に維持した。注入処理したメダカ胚を0.1％のNaCl、0.0
03％のKCl、0.004％のCaCl2・2H2O、0.016％のMgSO4・7
H2O、0.0001％のメチレンブルーを含む培地中で成長さ
せ、孵化後即座に水槽に移した（チョン＆フィールキン
ト（Chong and Vielkind）,1989）。
Ａ−3 プラスミドの作成 a.ゲンゲ不凍化プラスミド−CAT融合遺伝子（pOP−CA
T） このOP−AFPプロモータを含む2kbのBam H1−Bg1 IIフ
ラグメントを、継代培養によりプラスミドpBLCAT3中のB
am H IおよびHg1 IIサイトに組み込んで、OP−CAT融合
遺伝子を生成した（第1A図）。トランスフェクション用
の高次コイルプラスミドをエチジウムブロミドCsCl勾配
遠心法により調製した。この2kbのBam H1−Bgl IIフラ
グメントを、ヒュー（Hew）等（1988）により記載され
た如く、ゲンゲのAFP遺伝子の遺伝子配列から単離し
た。プラスミドOp5の制限マップを第Ｉ表に示す。他の
魚類からの他の不凍化プロモータの構築およびそのプロ
モータ活性も第II表に掲載した。
T） このOP−AFPプロモータを含む2kbのBam H1−Bg1 IIフ
ラグメントを、継代培養によりプラスミドpBLCAT3中のB
am H IおよびHg1 IIサイトに組み込んで、OP−CAT融合
遺伝子を生成した（第1A図）。トランスフェクション用
の高次コイルプラスミドをエチジウムブロミドCsCl勾配
遠心法により調製した。この2kbのBam H1−Bgl IIフラ
グメントを、ヒュー（Hew）等（1988）により記載され
た如く、ゲンゲのAFP遺伝子の遺伝子配列から単離し
た。プラスミドOp5の制限マップを第Ｉ表に示す。他の
魚類からの他の不凍化プロモータの構築およびそのプロ
モータ活性も第II表に掲載した。
b.ゲンゲ不凍化プロモータ−サケ成長ホルモン融合遺伝
子（pOP−GHe） 第Ｉ表のOP−AFPプロモータを含むプラスミドOP5から
の217bpのHing III−Sau 3Aフラグメント（ヒュー（He
w）等,1988）を継代培養により、第1B図に示したよう
に、pUC 18（ラッコー＆シュッ（Luckow and Schutz）,
1987）のプラスミドpBLCAT3のHind III、Bam H Iサイト
に組み込んだ。このプラスミドをBg1 IIで消化し、次い
でマスノスケGH遺伝子（デュー＆ヒュー（Du and He
w），未発表）の５′−未翻訳の配列を含む73bpのBg1 I
I−Pst I合成リンカーで連結した。このGH遺伝子はヒュ
ー（Hew）等（1989）において特徴付けされており、第I
II表のサケ成長ホルモン配列に具体的に記されている。
この連結されたDNAをPst IおよびEcoR Iで消化し、該OP
−AFPプロモータ、マスノスケGH5′−未翻訳配列および
pUC 18配列を含む大きなフラグメントをゲル溶出法によ
り精製した。この大きなフラグメントを、次にマスノス
ケGHコード配列および５′および３′−未翻訳領域の一
部を含む709bpPst I−EcoR Iフラグメントと連結した
（ヒュー（Hew）等,1989）。得られたプラスミドをHind
IIIで切断し、ゲンゲ不凍化遺伝子プロモータからの2k
bのBam H I−Hind IIIフランキング配列を含むプラスミ
ドにクローン化した（ヒュー（Hew）等,1988）。このプ
ラスミドを、次にStu IおよびAat IIで消化し、OP−AFP
プロモータおよびGHコード領域およびGH3′−未翻訳配
列の一部を含む大きなフラグメントを、次いでOP5プラ
スミドからの1kbのHpa I−Aat IIフラグメントに連結し
た。ここでOP5プラスミドはOP−AFP遺伝子ポリアデニル
化および転写終止シグナルを含む（ヒュー（Hew）等,19
88）。後のDNA配列決定は、1kbのHpa I−Aat IIフラグ
メントのサイズが1.6kbであることを示した。これはOP5
プラスミドとpUCプラスミドからの0.5kbHind III−Aa I
フラグメントとの間に1.1kbのHpa I−Hind IIIフラグメ
ントを含む。この最終的な構築体をpOP−GHeと命名した
（第1B図）。
子（pOP−GHe） 第Ｉ表のOP−AFPプロモータを含むプラスミドOP5から
の217bpのHing III−Sau 3Aフラグメント（ヒュー（He
w）等,1988）を継代培養により、第1B図に示したよう
に、pUC 18（ラッコー＆シュッ（Luckow and Schutz）,
1987）のプラスミドpBLCAT3のHind III、Bam H Iサイト
に組み込んだ。このプラスミドをBg1 IIで消化し、次い
でマスノスケGH遺伝子（デュー＆ヒュー（Du and He
w），未発表）の５′−未翻訳の配列を含む73bpのBg1 I
I−Pst I合成リンカーで連結した。このGH遺伝子はヒュ
ー（Hew）等（1989）において特徴付けされており、第I
II表のサケ成長ホルモン配列に具体的に記されている。
この連結されたDNAをPst IおよびEcoR Iで消化し、該OP
−AFPプロモータ、マスノスケGH5′−未翻訳配列および
pUC 18配列を含む大きなフラグメントをゲル溶出法によ
り精製した。この大きなフラグメントを、次にマスノス
ケGHコード配列および５′および３′−未翻訳領域の一
部を含む709bpPst I−EcoR Iフラグメントと連結した
（ヒュー（Hew）等,1989）。得られたプラスミドをHind
IIIで切断し、ゲンゲ不凍化遺伝子プロモータからの2k
bのBam H I−Hind IIIフランキング配列を含むプラスミ
ドにクローン化した（ヒュー（Hew）等,1988）。このプ
ラスミドを、次にStu IおよびAat IIで消化し、OP−AFP
プロモータおよびGHコード領域およびGH3′−未翻訳配
列の一部を含む大きなフラグメントを、次いでOP5プラ
スミドからの1kbのHpa I−Aat IIフラグメントに連結し
た。ここでOP5プラスミドはOP−AFP遺伝子ポリアデニル
化および転写終止シグナルを含む（ヒュー（Hew）等,19
88）。後のDNA配列決定は、1kbのHpa I−Aat IIフラグ
メントのサイズが1.6kbであることを示した。これはOP5
プラスミドとpUCプラスミドからの0.5kbHind III−Aa I
フラグメントとの間に1.1kbのHpa I−Hind IIIフラグメ
ントを含む。この最終的な構築体をpOP−GHeと命名した
（第1B図）。
Ａ−4 サケ細胞系における一時的CATアッセイ RTH−149、ニジマス肝癌細胞系は親切にもDr.L.ゲダ
ム（Gedamu）により提供された。この細胞を、25mM HEP
ESバッファー（Gibco）を補充した最少必須培地中で18
℃に維持した。この魚類細胞をグリセロールショックを
伴う燐酸カルシウム共−沈殿法によりDNAでトランスフ
ェクションし、CATアッセイを本質的にデービース（Dav
ies）等（1986）の方法に従い、かつザファルラー（Zaf
arullah）等（1988）により魚類細胞用に改良した方法
で実施した。
ム（Gedamu）により提供された。この細胞を、25mM HEP
ESバッファー（Gibco）を補充した最少必須培地中で18
℃に維持した。この魚類細胞をグリセロールショックを
伴う燐酸カルシウム共−沈殿法によりDNAでトランスフ
ェクションし、CATアッセイを本質的にデービース（Dav
ies）等（1986）の方法に従い、かつザファルラー（Zaf
arullah）等（1988）により魚類細胞用に改良した方法
で実施した。
Ａ−5 日本産メダカにおける一時点CATアッセイ 高次コイルpOP−CATプラスミドDNA（約500pl,10sコピ
ー）を、開裂前またはその直後に、メダカ受精卵の細胞
質に微注入した。フェノールレッドを最終濃度0.25％ま
で該DNAに添加して、注入を可視化した、CATアッセイを
チョン＆フィールキント（Chong and Vielkind;1989）
の方法に従って実施した。５日目の胚につき、５個の胚
のバッチをCATアッセイのために使用した。孵化した魚
に対しては、個々の幼魚をCATアッセイのために使用し
た。
ー）を、開裂前またはその直後に、メダカ受精卵の細胞
質に微注入した。フェノールレッドを最終濃度0.25％ま
で該DNAに添加して、注入を可視化した、CATアッセイを
チョン＆フィールキント（Chong and Vielkind;1989）
の方法に従って実施した。５日目の胚につき、５個の胚
のバッチをCATアッセイのために使用した。孵化した魚
に対しては、個々の幼魚をCATアッセイのために使用し
た。
Ａ−6 微注入によるタイセイヨウサケにおける遺伝子転
移 pOP−GHe中の4kbのインサートをEcoR Iにより切除
し、塩水バッファー中に３μg/mlの濃度で溶解した。該
DNAインサートの約２−3nl（106コピー）をマイクロパ
イルを介して、非−活性化サケ受精卵の細胞質（フレッ
チャー（Fletcher）等,1988）中に、上記の米国特許出
願第278,463号に記載の手順に従って注入した。約500個
の卵に注入した。その生存率は非注入コントロールに比
して80％であった。
移 pOP−GHe中の4kbのインサートをEcoR Iにより切除
し、塩水バッファー中に３μg/mlの濃度で溶解した。該
DNAインサートの約２−3nl（106コピー）をマイクロパ
イルを介して、非−活性化サケ受精卵の細胞質（フレッ
チャー（Fletcher）等,1988）中に、上記の米国特許出
願第278,463号に記載の手順に従って注入した。約500個
の卵に注入した。その生存率は非注入コントロールに比
して80％であった。
Ａ−7 PCR用のオリゴヌクレオチドプライマーの合成 PCR分析のために、４種のプライマーを、バイオテッ
クサービスセンター（Biotech Service Centre）、ホス
ピタルフォーシックチルドレン（Hospital for Sick Ch
ildren）、トロント、カナダで合成した。第２図に示し
た如く、TATAボックスに関して＋27〜＋47位に位置する
プライマーＡはOP−AFP遺伝子プロモータのセンス鎖由
来のものであり、該TATAボックスに関して＋861〜＋881
位に位置するプライマーＢは該OP−AFP遺伝子３、フラ
ンキング領域のアンチセンス鎖由来のものであり、＋16
1〜＋181位に位置するプライマーＣはGHコード配列のセ
ンス鎖由来のものであり、＋339〜＋359位に位置するプ
ライマーＤは該GH遺伝子のアンチセンス鎖由来のもので
ある。
クサービスセンター（Biotech Service Centre）、ホス
ピタルフォーシックチルドレン（Hospital for Sick Ch
ildren）、トロント、カナダで合成した。第２図に示し
た如く、TATAボックスに関して＋27〜＋47位に位置する
プライマーＡはOP−AFP遺伝子プロモータのセンス鎖由
来のものであり、該TATAボックスに関して＋861〜＋881
位に位置するプライマーＢは該OP−AFP遺伝子３、フラ
ンキング領域のアンチセンス鎖由来のものであり、＋16
1〜＋181位に位置するプライマーＣはGHコード配列のセ
ンス鎖由来のものであり、＋339〜＋359位に位置するプ
ライマーＤは該GH遺伝子のアンチセンス鎖由来のもので
ある。
Ａ−8 PCRのための、血液細胞からのDNAの単離 30μｌの血液を１年令の魚から集めた。該血液１μｌ
を50μｌの10mMNaCl中で溶解し、３分間水浴中で沸騰さ
せ、次いで３分間遠心処理した。得られた上澄２μｌを
直接PCRのために使用した。
を50μｌの10mMNaCl中で溶解し、３分間水浴中で沸騰さ
せ、次いで３分間遠心処理した。得られた上澄２μｌを
直接PCRのために使用した。
Ａ−9 PCR増幅 50mMKCl、10mMのトリス（Tris）、2.5mMのMgCl、１μ
Ｍの各プライマー、各200μＭの４種のデオキシリボヌ
クレオチドトリホスフェートおよび2.5単位のTaq DNAポ
リメラーゼ（プロメガ（Promega）社）を含む70μｌの
反応溶液中でPCRを実施し、100μｌの無機オイルを添加
して、凝縮を防止した。92℃にて３分間DNAを変性する
ことにより増幅を開始し、次いで30回PCRサイクルを繰
り返した。各PCRサイクルは１分間の92℃における処理
（変性）、１分間の60℃における処理（アニール）およ
び２分間の72℃における処理（伸張（extension））を
含んでいた。第一のサイクル後、この反応を72℃にて更
に10分間維持し、全ての反応を完結させた。PTC−100プ
ログラマブルサーマルコントローラー（programmable T
hermal Controller;MJリサーチ社（MJ Research In
c.）、オカラ（Ocala）,FL）を使用してPCRを実施し
た。
Ｍの各プライマー、各200μＭの４種のデオキシリボヌ
クレオチドトリホスフェートおよび2.5単位のTaq DNAポ
リメラーゼ（プロメガ（Promega）社）を含む70μｌの
反応溶液中でPCRを実施し、100μｌの無機オイルを添加
して、凝縮を防止した。92℃にて３分間DNAを変性する
ことにより増幅を開始し、次いで30回PCRサイクルを繰
り返した。各PCRサイクルは１分間の92℃における処理
（変性）、１分間の60℃における処理（アニール）およ
び２分間の72℃における処理（伸張（extension））を
含んでいた。第一のサイクル後、この反応を72℃にて更
に10分間維持し、全ての反応を完結させた。PTC−100プ
ログラマブルサーマルコントローラー（programmable T
hermal Controller;MJリサーチ社（MJ Research In
c.）、オカラ（Ocala）,FL）を使用してPCRを実施し
た。
Ａ−10 アガロースゲル電気泳動法およびサザーンプロ
ット法による該PCR生成物の分析 20μｌの上記増幅した生成物を0.8％アガロースゲル
上での電気泳動にかけ、該DNA生成物をエチジウムブロ
ミド染色により可視化した。このDNAをサザーン分析の
ためにナイロン膜（アマーシャム（Amersham）に転写し
た。マスノスケGHcDNA（＋277〜＋294）からの17bpのGH
特異的オリゴヌクレオチドプローブ、５′−GAAAATGTTC
AATGACT−３′の末端をT4キナーゼによりP32で標識し、
かつサザーンブロット法のプローブとして使用した。
ット法による該PCR生成物の分析 20μｌの上記増幅した生成物を0.8％アガロースゲル
上での電気泳動にかけ、該DNA生成物をエチジウムブロ
ミド染色により可視化した。このDNAをサザーン分析の
ためにナイロン膜（アマーシャム（Amersham）に転写し
た。マスノスケGHcDNA（＋277〜＋294）からの17bpのGH
特異的オリゴヌクレオチドプローブ、５′−GAAAATGTTC
AATGACT−３′の末端をT4キナーゼによりP32で標識し、
かつサザーンブロット法のプローブとして使用した。
実験プロトコール−本発明の第二の一連の態様 Ｂ−1 ゲンゲ不凍化プロモータ−CAT融合遺伝子（opAFP
−CAT）構築のもう一つの態様 該opAFP遺伝子プロモータを含む2.1kbのBamH1−Bg111
フラグメントをプラスミドopAFP−GHc2（デュー（Du）
等、未発表の文献）から切り出し、次いでプラスミドpB
LCAT3（ラッコー＆シュッツ（Luckow and Schutz）,198
7）の該Bam H IおよびBg1 IIサイトにクローン化して、
oPAFP−CAT融合遺伝子を形成した。
−CAT）構築のもう一つの態様 該opAFP遺伝子プロモータを含む2.1kbのBamH1−Bg111
フラグメントをプラスミドopAFP−GHc2（デュー（Du）
等、未発表の文献）から切り出し、次いでプラスミドpB
LCAT3（ラッコー＆シュッツ（Luckow and Schutz）,198
7）の該Bam H IおよびBg1 IIサイトにクローン化して、
oPAFP−CAT融合遺伝子を形成した。
Ｂ−2 「全魚類」発現カセットopAFP−Ｖの別の構築法 73bpのGH遺伝子５′−未翻訳配列を72bpのopAFP遺伝
子５′−未翻訳配列で置換することによりopAFP−GHcか
ら誘導したプラスミドopAFP−GHc2（デュー（Du）等、
未発表の文献）をPst 1で消化し、次いでT4DNAポリメラ
ーゼで平滑化し、子牛腸管アルカリホウファターゼで脱
ホスホリル化した。次いで、これをホスホリル化された
8bpのHpa Iリンカー（５′−CGTTAACG−３′）に連結し
た。該21.kbのopAFP遺伝子プロモータ、63bpのopAFP遺
伝子５′−未翻訳配列およびプラスミドpUCを含むこの
生成したプラスミドをHpa IおよびSal Iで消化し、次い
で該opAFP遺伝子３′−配列を含むOP−５（ヒュー（He
w）等,1988）からの1.2kbHpa I−Sal Iフラグメントに
連結した。この最終的構築体をベクターopAFP−Ｖと命
名した。第11図に示した如く、Baから開始し、かつ該第
二のHind IIIサイトＨにまで伸びたこのDNA配列は第Ｖ
表に示すように3350bpを含む。
子５′−未翻訳配列で置換することによりopAFP−GHcか
ら誘導したプラスミドopAFP−GHc2（デュー（Du）等、
未発表の文献）をPst 1で消化し、次いでT4DNAポリメラ
ーゼで平滑化し、子牛腸管アルカリホウファターゼで脱
ホスホリル化した。次いで、これをホスホリル化された
8bpのHpa Iリンカー（５′−CGTTAACG−３′）に連結し
た。該21.kbのopAFP遺伝子プロモータ、63bpのopAFP遺
伝子５′−未翻訳配列およびプラスミドpUCを含むこの
生成したプラスミドをHpa IおよびSal Iで消化し、次い
で該opAFP遺伝子３′−配列を含むOP−５（ヒュー（He
w）等,1988）からの1.2kbHpa I−Sal Iフラグメントに
連結した。この最終的構築体をベクターopAFP−Ｖと命
名した。第11図に示した如く、Baから開始し、かつ該第
二のHind IIIサイトＨにまで伸びたこのDNA配列は第Ｖ
表に示すように3350bpを含む。
Ｂ−3 サケ細胞系における一時的CATアッセイ ニジマス肝癌細胞系RTH−149およびマスノスケ胚細胞
系CHSE−214は親切にもDr.L.ゲダム（Gedamu）（カナダ
のカルガリーユニバーシティ（University of Calgar
y）により提供された。これらの細胞を25mMのヘペス（H
EPES）バッファー（ギブコ（Gibco））を補充した最少
必須培地中で18℃に維持した。この魚細胞をグリセロー
ルショックを伴う燐酸カルシウム共−沈殿法によりDNA
でトランスフェクションした。本質的にデービース（Da
vies）等（1986）の方法に従い、かつザファルラー（Za
farullah）等（1988）の方法に従って魚類用に改良した
方法でCATアッセイを実施した。
系CHSE−214は親切にもDr.L.ゲダム（Gedamu）（カナダ
のカルガリーユニバーシティ（University of Calgar
y）により提供された。これらの細胞を25mMのヘペス（H
EPES）バッファー（ギブコ（Gibco））を補充した最少
必須培地中で18℃に維持した。この魚細胞をグリセロー
ルショックを伴う燐酸カルシウム共−沈殿法によりDNA
でトランスフェクションした。本質的にデービース（Da
vies）等（1986）の方法に従い、かつザファルラー（Za
farullah）等（1988）の方法に従って魚類用に改良した
方法でCATアッセイを実施した。
Ｂ−4 日本産メダカにおける一時的CATアッセイ 日本産メダカ（オリジアスラチペス（Oryzias latipe
s））はバンクーバーのキャンサーリサーチセンター（C
ancer Research Centre）のDr.J.フィールキント（Viel
kind）の研究室に保有されていた。該成魚の再生活性を
チョン＆フィールキント（Chong and Vielkind;1989）
により報告された方法により人工的に光周期処理するこ
とにより誘発させた。雌に付着した受精卵を光の照射後
１〜２時間目に採集し、注入前に、12℃にてリンゲル溶
液（0.75％NaCl、0.02％KCl、0.02％CaCl2、pH7.3）中
に維持した。注入されたメダカ胚を0.1％NaCl、0.003％
KCl、0.004％CaCl2・2H2O、0.016％MgSO4・7H2O、0.000
1％メチレンブルーを含有する培地中で育て、孵化後直
ちに水槽水中に移した。
s））はバンクーバーのキャンサーリサーチセンター（C
ancer Research Centre）のDr.J.フィールキント（Viel
kind）の研究室に保有されていた。該成魚の再生活性を
チョン＆フィールキント（Chong and Vielkind;1989）
により報告された方法により人工的に光周期処理するこ
とにより誘発させた。雌に付着した受精卵を光の照射後
１〜２時間目に採集し、注入前に、12℃にてリンゲル溶
液（0.75％NaCl、0.02％KCl、0.02％CaCl2、pH7.3）中
に維持した。注入されたメダカ胚を0.1％NaCl、0.003％
KCl、0.004％CaCl2・2H2O、0.016％MgSO4・7H2O、0.000
1％メチレンブルーを含有する培地中で育て、孵化後直
ちに水槽水中に移した。
高次コイルopAFP−CATプラスミドDNA（約500pl,106コ
ピー）を、１または２細胞段階においてメダカの受精卵
の細胞質に微注入した。該DNAに、最終濃度が0.25％と
なるようにフェノールレッドを添加して、注入中これを
可視化した。CATアッセイをチョン＆フィールキント（C
hong and Vielkind;1989）の方法に従って実施した。個
々の胚を各CATアッセイに使用した。
ピー）を、１または２細胞段階においてメダカの受精卵
の細胞質に微注入した。該DNAに、最終濃度が0.25％と
なるようにフェノールレッドを添加して、注入中これを
可視化した。CATアッセイをチョン＆フィールキント（C
hong and Vielkind;1989）の方法に従って実施した。個
々の胚を各CATアッセイに使用した。
Ｂ−5 DNA配列決定 opAFP−Ｖの配列決定のために、ジデオキシ鎖ターミ
ネータ配列決定法を利用した。異なる長さのDNAフラグ
メントを含む一連のクローンをEXO−３ヌクレアーゼ欠
失（プロメガエレーズ−ａ−ベース欠失キット（Promeg
a Erase−ａ−Base deletion kit）により発生させた。
これらのクローンから精製した二本鎖DNAをDNA配列決定
鋳型（ファマシア（Phamacia）配列決定キット）として
使用した。
ネータ配列決定法を利用した。異なる長さのDNAフラグ
メントを含む一連のクローンをEXO−３ヌクレアーゼ欠
失（プロメガエレーズ−ａ−ベース欠失キット（Promeg
a Erase−ａ−Base deletion kit）により発生させた。
これらのクローンから精製した二本鎖DNAをDNA配列決定
鋳型（ファマシア（Phamacia）配列決定キット）として
使用した。
上記手順のテスト結果−該第一の群の態様に従う 1.ゲンゲのAFPプロモータはインビトロでサケ細胞内で
機能できる 該OP−AFPプロモータの有効性をテストするために、
該OP−CAT構築体をCATアッセイ用のRTH−149細胞系内に
トランスフェクションした。第３図に示した如く、明ら
かにCAT活性が検出された。OP−CAT由来のCAT活性のレ
ベルは単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼプロモ
ータを有するpBLCAT2由来のものに匹敵するが、これら
の細胞をpBLCAT3でトランスフェクショすると、僅かに
または全くCAT活性をもたないプロモータのないCAT構築
体が検出された。同様な結果がマスノスケ胚細胞（CHSE
−124）およびシロザケ（Chum salmon）の心臓細胞（CH
H−１）についても得られた。これらの結果はOP−AFPプ
ロモータがサケ科魚類における該GH遺伝子発現を達成す
るのに使用できることを示唆している。ニジマスを包含
するサケ科魚類は該AFP遺伝子に乏しいが、これらの細
胞は該AFP遺伝子の発現に必要とされる全ての転写因子
を含む。
機能できる 該OP−AFPプロモータの有効性をテストするために、
該OP−CAT構築体をCATアッセイ用のRTH−149細胞系内に
トランスフェクションした。第３図に示した如く、明ら
かにCAT活性が検出された。OP−CAT由来のCAT活性のレ
ベルは単純疱疹ウイルスからのチミジンキナーゼプロモ
ータを有するpBLCAT2由来のものに匹敵するが、これら
の細胞をpBLCAT3でトランスフェクショすると、僅かに
または全くCAT活性をもたないプロモータのないCAT構築
体が検出された。同様な結果がマスノスケ胚細胞（CHSE
−124）およびシロザケ（Chum salmon）の心臓細胞（CH
H−１）についても得られた。これらの結果はOP−AFPプ
ロモータがサケ科魚類における該GH遺伝子発現を達成す
るのに使用できることを示唆している。ニジマスを包含
するサケ科魚類は該AFP遺伝子に乏しいが、これらの細
胞は該AFP遺伝子の発現に必要とされる全ての転写因子
を含む。
2.ゲンゲのAFPプロモータはインビボで日本産メダカに
おいて機能できる 該OP−AFPプロモータの遺伝子転移における適性を更
に研究するために、該OP−CAT構築体をメダカの卵中に
微注入した。CAT活性は発生中の種々の時点における胚
について決定した。第４図に示したように、このCAT活
性は該注入後48時間目に初めて検出され、該活性は６−
７日目に最大値に達し、次いでこのCAT活性は低下し始
めた。しかしながら、このCAT活性は依然として孵化し
た魚（11−12日目）においてさえ検出可能であった。こ
れとは対照的に、該CAT活性は注入しなかった胚またはp
BLCAT3を注入した胚では検出されなかった。この結果は
該OP−AFPプロモータが種々の魚類種において活性であ
ることを確証している。
おいて機能できる 該OP−AFPプロモータの遺伝子転移における適性を更
に研究するために、該OP−CAT構築体をメダカの卵中に
微注入した。CAT活性は発生中の種々の時点における胚
について決定した。第４図に示したように、このCAT活
性は該注入後48時間目に初めて検出され、該活性は６−
７日目に最大値に達し、次いでこのCAT活性は低下し始
めた。しかしながら、このCAT活性は依然として孵化し
た魚（11−12日目）においてさえ検出可能であった。こ
れとは対照的に、該CAT活性は注入しなかった胚またはp
BLCAT3を注入した胚では検出されなかった。この結果は
該OP−AFPプロモータが種々の魚類種において活性であ
ることを確証している。
3.PCRに基づいたスクリーニング法 形質転換されたサケの存在をスクリーニングするため
に、異なる３組のプライマー、即ちプライマーA/D、プ
ライマーC/DおよびプライマーA/B（第２図）を使用し
た。プライマーA/Bを使用した理由は、プライマーＡお
よびプライマーＢの配列がOP−AFP遺伝子に対して特異
的であり、これらはタイセイヨウサケには存在せず、従
って非形質転換サケ由来のDNAはPCRに対してプライマー
A/Bを使用した場合には増幅し得ないからである。該形
質転換された魚由来のDNAのみがプライマーA/Bを使用す
ることにより増幅でき、PCRにより855bpのDNAフラグメ
ントを発生するであろう。
に、異なる３組のプライマー、即ちプライマーA/D、プ
ライマーC/DおよびプライマーA/B（第２図）を使用し
た。プライマーA/Bを使用した理由は、プライマーＡお
よびプライマーＢの配列がOP−AFP遺伝子に対して特異
的であり、これらはタイセイヨウサケには存在せず、従
って非形質転換サケ由来のDNAはPCRに対してプライマー
A/Bを使用した場合には増幅し得ないからである。該形
質転換された魚由来のDNAのみがプライマーA/Bを使用す
ることにより増幅でき、PCRにより855bpのDNAフラグメ
ントを発生するであろう。
プライマーA/Dを使用する理由は、プライマーA/Bを使
用した理由と同様である。プライマーＤはマスノスケGH
cDNA由来のものであり、内在性のタイセイヨウサケGH遺
伝子とハイブリッド化し得、プライマーＡはOP−AFP遺
伝子に対して特異的である。その結果、形質転換されて
いない魚由来のDNAはプライマーA/Bを使用しても増幅し
得ず、形質転換された魚由来のDNAのみを増幅でき、333
bpのDNAフラグメントを発生する。
用した理由と同様である。プライマーＤはマスノスケGH
cDNA由来のものであり、内在性のタイセイヨウサケGH遺
伝子とハイブリッド化し得、プライマーＡはOP−AFP遺
伝子に対して特異的である。その結果、形質転換されて
いない魚由来のDNAはプライマーA/Bを使用しても増幅し
得ず、形質転換された魚由来のDNAのみを増幅でき、333
bpのDNAフラグメントを発生する。
プライマーC/Dを使用した理由は、他の２組のプライ
マーを使用した理由とは異なっている。両プライマーＣ
およびＤの配列はマスノスケGHcDNA由来のものであり、
タイセイヨウサケのGH遺伝子とハイブリッド化し得、従
ってタイセイヨウサケのDNAはプライマーのC/Dを使用す
ることにより増幅できる。しかしながら、プライマーＣ
とプライマーＤとの間にはイントロン（イントロン２）
があり、プライマーＣとプライマーＤとの間の距離は34
4bpである（デュー＆ヒュー（Du and Hew）、未発表の
文献）。プライマーC/Dは全てのDNA試料中に344bpのフ
ラグメントを生成するであろう。形質転換遺伝子pOP−G
Heは該イントロンを欠くマスノスケGHcDNAを使用して構
築され、プライマーＣとプライマーＤとの間の距離は19
9bpである。プライマーC/Dは形質転換されたサケ内に２
種のフラグメント、即ち内在性のGH遺伝子由来の344bp
のフラグメントおよびGHcDNAインサート由来の199bpの
フラグメントを生成するであろう。
マーを使用した理由とは異なっている。両プライマーＣ
およびＤの配列はマスノスケGHcDNA由来のものであり、
タイセイヨウサケのGH遺伝子とハイブリッド化し得、従
ってタイセイヨウサケのDNAはプライマーのC/Dを使用す
ることにより増幅できる。しかしながら、プライマーＣ
とプライマーＤとの間にはイントロン（イントロン２）
があり、プライマーＣとプライマーＤとの間の距離は34
4bpである（デュー＆ヒュー（Du and Hew）、未発表の
文献）。プライマーC/Dは全てのDNA試料中に344bpのフ
ラグメントを生成するであろう。形質転換遺伝子pOP−G
Heは該イントロンを欠くマスノスケGHcDNAを使用して構
築され、プライマーＣとプライマーＤとの間の距離は19
9bpである。プライマーC/Dは形質転換されたサケ内に２
種のフラグメント、即ち内在性のGH遺伝子由来の344bp
のフラグメントおよびGHcDNAインサート由来の199bpの
フラグメントを生成するであろう。
4.PCRによる形質転換されたサケの同定 100個の１カ月令サケ胚から抽出したDNAの以前の分析
は、その２つ（２％）が注入された配列（pOP−GHe）を
含むことを示した。
は、その２つ（２％）が注入された配列（pOP−GHe）を
含むことを示した。
孵化後８カ月目に、該サケは同定の目的でタッグを付
するのに十分な大きさに成長した。この時点で、１つの
水槽中の約500匹のサケの内の50匹を秤量し、PCR分析用
の血液試料を採取した。これら50匹のサケは水槽中で最
も大きな14匹のサケ（体重＞8g）と、５〜14gの範囲の
体重をもつ36匹の付随的な魚とを含んでいた。
するのに十分な大きさに成長した。この時点で、１つの
水槽中の約500匹のサケの内の50匹を秤量し、PCR分析用
の血液試料を採取した。これら50匹のサケは水槽中で最
も大きな14匹のサケ（体重＞8g）と、５〜14gの範囲の
体重をもつ36匹の付随的な魚とを含んでいた。
このPCR分析は該魚の何れかのサイズを特定する分析
を実施することなしに行った。即ち、該分析のあらゆる
先入観の排除を保証するべく、この分析を「ブラインド
（blind）」で実施した。
を実施することなしに行った。即ち、該分析のあらゆる
先入観の排除を保証するべく、この分析を「ブラインド
（blind）」で実施した。
1989年11月にpOP−GHeを注入した卵から発生させた８
カ月令のタイセイヨウサケを1990年10月に失血させた。
有核血液細胞由来のDNAを、プライマーA/Dを使用したPC
R分析で直接使用して、該pOP−GHe形質転換遺伝子の存
在を決定した。分析した50匹の魚のうち、８匹が正であ
ることが示された。第5A図に示した如く333bpフラグメ
ントがサケ および正のコントロール（pOP−GHe）により生成され、
これとは対照的にこの333bpフラグメントは注入しなか
ったサケには存在しなかった。この増幅されたフラグメ
ント（333bp）のサイズは該形質転換遺伝子配列から予
測されたサイズに対応していた。
カ月令のタイセイヨウサケを1990年10月に失血させた。
有核血液細胞由来のDNAを、プライマーA/Dを使用したPC
R分析で直接使用して、該pOP−GHe形質転換遺伝子の存
在を決定した。分析した50匹の魚のうち、８匹が正であ
ることが示された。第5A図に示した如く333bpフラグメ
ントがサケ および正のコントロール（pOP−GHe）により生成され、
これとは対照的にこの333bpフラグメントは注入しなか
ったサケには存在しなかった。この増幅されたフラグメ
ント（333bp）のサイズは該形質転換遺伝子配列から予
測されたサイズに対応していた。
この増幅された333bpDNAフラグメントが該pOP−GHe形
質転換遺伝子由来のものであることを確認するために、
このDNAをサザーンブロット用のナイロン膜に転写し、
該プライマーＡとプライマーＤとの間の配列由来のもの
であるGH特異的プローブＥ（第２図）でハイブリッド化
したところ、得られた結果は該333bpDNAの全てが該プロ
ーブＥとハイブリッド化したことを示した（第5B図）。
このことは該333bpDNAフラグメントが実際に該形質転換
遺伝子pOP−GHe由来のものであることを立証している。
質転換遺伝子由来のものであることを確認するために、
このDNAをサザーンブロット用のナイロン膜に転写し、
該プライマーＡとプライマーＤとの間の配列由来のもの
であるGH特異的プローブＥ（第２図）でハイブリッド化
したところ、得られた結果は該333bpDNAの全てが該プロ
ーブＥとハイブリッド化したことを示した（第5B図）。
このことは該333bpDNAフラグメントが実際に該形質転換
遺伝子pOP−GHe由来のものであることを立証している。
該分析に対して正の検体における形質転換遺伝子pOP
−GHeの存在を更に確認するために、該DNAプライマーC/
Dを使用して増幅した。上でスクリーニング法に関連し
て議論したように、内在性タイセイヨウサケGH遺伝子由
来の予想された344bpDNAフラグメントは分析した全ての
サケに見られた。付随的なより小さなDNAフラグメント
（199bp）はサケ に見出された（第6A図）。該119bpフラグメントはマス
ノスケGH形質転換遺伝子由来のものであった。これら正
の魚はプライマーA/Dを使用して得たものと同一であ
り、従ってこのことは魚 が形質転換されたサケであることを立証している。
−GHeの存在を更に確認するために、該DNAプライマーC/
Dを使用して増幅した。上でスクリーニング法に関連し
て議論したように、内在性タイセイヨウサケGH遺伝子由
来の予想された344bpDNAフラグメントは分析した全ての
サケに見られた。付随的なより小さなDNAフラグメント
（199bp）はサケ に見出された（第6A図）。該119bpフラグメントはマス
ノスケGH形質転換遺伝子由来のものであった。これら正
の魚はプライマーA/Dを使用して得たものと同一であ
り、従ってこのことは魚 が形質転換されたサケであることを立証している。
5.該形質転換遺伝子の該GHコード領域は該形質転換され
たサケにおいて完全である。
たサケにおいて完全である。
該形質転換遺伝子のGHコード配列の完全性を調べるた
めに、PCR分析用にプライマーA/Bを使用した。プライマ
ーＡおよびプライマーＢは該OP−AFP遺伝子の５′およ
び３′配列由来のものであり、該形質転換遺伝子の該GH
コード配列の５′および３′の外部に位置し、従って該
形質転換遺伝子の該GHコードが該形質転換された魚中で
完全である場合には、該形質転換された魚由来のDNAを
増幅するのにプライマーA/Bを使用することにより855bp
DNAフラグメントが生成されるはずである。第6B図に示
したように、855bpフラグメントが８匹の正の検体全て
において見出された。このことは、該GH形質転換遺伝子
が該形質転換されたサケ内で完全であることを示してい
る。
めに、PCR分析用にプライマーA/Bを使用した。プライマ
ーＡおよびプライマーＢは該OP−AFP遺伝子の５′およ
び３′配列由来のものであり、該形質転換遺伝子の該GH
コード配列の５′および３′の外部に位置し、従って該
形質転換遺伝子の該GHコードが該形質転換された魚中で
完全である場合には、該形質転換された魚由来のDNAを
増幅するのにプライマーA/Bを使用することにより855bp
DNAフラグメントが生成されるはずである。第6B図に示
したように、855bpフラグメントが８匹の正の検体全て
において見出された。このことは、該GH形質転換遺伝子
が該形質転換されたサケ内で完全であることを示してい
る。
6.該形質転換された魚の成育特性 a.形質転換された魚の体重 PCR分析は８匹の魚が形質転換体であることを示し
た。２匹の魚 は1990年７月に死亡した。従って、残された６匹の形質
転換された魚を分析した。
た。２匹の魚 は1990年７月に死亡した。従って、残された６匹の形質
転換された魚を分析した。
該成長ホルモン遺伝子構築体に関して形質転換された
ことが分かっている６匹のサケのうち、５匹は上記水槽
中の最大の６匹の魚のうちの５匹であった。併発により
生ずる観測の変化は非常に低い。これら６匹の形質転換
された魚の平均体重は29.2±0.3gであった。該水槽中の
459匹の魚全てについての平均体重は5.06±1.0gであっ
た。かくして、該形質転換された魚は形質転換されてい
ないコントロールよりも平均して４倍大きく、該水槽中
のサケの平均のサイズの約６倍であった。該水槽中の最
も大きな形質転換された魚は形質転換されていないコン
トロールの８倍であった。
ことが分かっている６匹のサケのうち、５匹は上記水槽
中の最大の６匹の魚のうちの５匹であった。併発により
生ずる観測の変化は非常に低い。これら６匹の形質転換
された魚の平均体重は29.2±0.3gであった。該水槽中の
459匹の魚全てについての平均体重は5.06±1.0gであっ
た。かくして、該形質転換された魚は形質転換されてい
ないコントロールよりも平均して４倍大きく、該水槽中
のサケの平均のサイズの約６倍であった。該水槽中の最
も大きな形質転換された魚は形質転換されていないコン
トロールの８倍であった。
b.該形質転換された魚の成長速度 成長速度を評価するために、血液試料を採取し、かつ
タッグを付した50匹の魚を100日後に再度秤量した。こ
の期間中の該６匹の形質転換されたサケの平均成長速度
は１日当たり0.766±0.18％であり、また24匹の形質転
換されていない魚の平均成長速度は１日当たり0.244±
0.03％であった。この差は統計的に有意である。
タッグを付した50匹の魚を100日後に再度秤量した。こ
の期間中の該６匹の形質転換されたサケの平均成長速度
は１日当たり0.766±0.18％であり、また24匹の形質転
換されていない魚の平均成長速度は１日当たり0.244±
0.03％であった。この差は統計的に有意である。
c.該形質転換された魚の体重 1990年７月に死亡した２匹 の形質転換されたサケの体重はそれぞれ8.07gおよび12.
1gであった。これらのサケはその死亡時点における該水
槽中の他のサケ全体よりもかなり大きかった。該水槽中
の約500匹の魚から無作為に選択した10匹の魚の平均体
重は1.4±0.17gであった。
1gであった。これらのサケはその死亡時点における該水
槽中の他のサケ全体よりもかなり大きかった。該水槽中
の約500匹の魚から無作為に選択した10匹の魚の平均体
重は1.4±0.17gであった。
失血され、かつタッグを付された上記50匹の魚を含
む、1990年10月に秤量された全体で200匹のサケのサイ
ズ頻度分布を第13A図に示した。サンプリングした50匹
の魚の中に見出された７匹の形質転換されたサケのうち
の、６匹が該水槽中で最も大きな魚であった 該200匹の魚の平均体重は5.91±0.43gであった。３匹の
最も大きな形質転換されたサケの体重はこの平均値より
も標準偏差２に相当するだけ大きかった。７匹の形質転
換されたサケの平均体重は27.3±7.9gであり、一方43匹
の形質転換されていない同胞魚を秤量したところ7.4±
0.26gであった。かくして、該形質転換体は平均して形
質転換されていない同胞魚よりも3.7倍大きかった。最
も大きな形質転換されたサケ は該コントロールの平均体重の8.9倍であった。３匹の
最大の形質転換されたサケはパールマーキングズ（parr
markings）の全ての証拠を喪失し、タイセイヨウサケ
の銀色様の外観を呈した（第12図）。成長ホルモンはこ
の過程に関連していた。
む、1990年10月に秤量された全体で200匹のサケのサイ
ズ頻度分布を第13A図に示した。サンプリングした50匹
の魚の中に見出された７匹の形質転換されたサケのうち
の、６匹が該水槽中で最も大きな魚であった 該200匹の魚の平均体重は5.91±0.43gであった。３匹の
最も大きな形質転換されたサケの体重はこの平均値より
も標準偏差２に相当するだけ大きかった。７匹の形質転
換されたサケの平均体重は27.3±7.9gであり、一方43匹
の形質転換されていない同胞魚を秤量したところ7.4±
0.26gであった。かくして、該形質転換体は平均して形
質転換されていない同胞魚よりも3.7倍大きかった。最
も大きな形質転換されたサケ は該コントロールの平均体重の8.9倍であった。３匹の
最大の形質転換されたサケはパールマーキングズ（parr
markings）の全ての証拠を喪失し、タイセイヨウサケ
の銀色様の外観を呈した（第12図）。成長ホルモンはこ
の過程に関連していた。
1991年１月に生存していた全体で494匹の魚のサイズ
頻度分布および個々の形質転換された魚の体重を第12B
図に示す。1990年10月にサンプリングした最大の形質転
換サケ は血液採取後に死亡したので、本図に図示されていな
い。
頻度分布および個々の形質転換された魚の体重を第12B
図に示す。1990年10月にサンプリングした最大の形質転
換サケ は血液採取後に死亡したので、本図に図示されていな
い。
この水槽中の全サケ（484）の平均体重は6.36±0.26g
であった。形質転換されていないサケ（476匹の魚）の
平均体重は5.94±0.14gであり、一方形質転換されたサ
ケの平均体重は37.0±10.2gであり、該形質転換されて
いないサケよりも約６倍大きかった。この群の８匹の形
質転換されたサケのうちの５匹の体重はこの水槽中のサ
ケに関する平均値よりも標準偏差２だけ大きかった。47
6匹の形質転換されていないサケのうちの２匹の体重も
この水槽中のサケに関する平均値よりも標準偏差２だけ
大きかった。1991年１月の時点で最大の形質転換サケ は該コントロールの平均体重の約13倍であった。
であった。形質転換されていないサケ（476匹の魚）の
平均体重は5.94±0.14gであり、一方形質転換されたサ
ケの平均体重は37.0±10.2gであり、該形質転換されて
いないサケよりも約６倍大きかった。この群の８匹の形
質転換されたサケのうちの５匹の体重はこの水槽中のサ
ケに関する平均値よりも標準偏差２だけ大きかった。47
6匹の形質転換されていないサケのうちの２匹の体重も
この水槽中のサケに関する平均値よりも標準偏差２だけ
大きかった。1991年１月の時点で最大の形質転換サケ は該コントロールの平均体重の約13倍であった。
1990年10月乃至1991 1月までの形質転換されたサケ
（６）および形質転換されていない幼魚（43）の成長速
度を以下の第VI表に示す。平均して、該形質転換された
サケが同一の水槽で飼育された形質転換されていない魚
よりも、著しく大きくなり、かつ著しく迅速に成長した
ことは明らかである。更に、該形質転換された魚の状態
因子（condition factors）は僅かであり、しかも該コ
ントロールの状態因子よりも大幅に低い。該形質転換さ
れた魚の体重における増加は１日当たり0.48〜1.6％で
あった。該43匹の形質転換されていない魚の僅かに２匹
のみが最も成長の遅い形質転換された魚の成長速度を越
えたに過ぎなかった。
（６）および形質転換されていない幼魚（43）の成長速
度を以下の第VI表に示す。平均して、該形質転換された
サケが同一の水槽で飼育された形質転換されていない魚
よりも、著しく大きくなり、かつ著しく迅速に成長した
ことは明らかである。更に、該形質転換された魚の状態
因子（condition factors）は僅かであり、しかも該コ
ントロールの状態因子よりも大幅に低い。該形質転換さ
れた魚の体重における増加は１日当たり0.48〜1.6％で
あった。該43匹の形質転換されていない魚の僅かに２匹
のみが最も成長の遅い形質転換された魚の成長速度を越
えたに過ぎなかった。
サケの成長（smolting）は多くの形態的並びに生理的
変化を包含する極めて複雑な形質転換過程である（ホア
ー（Hoar）,1988の概説を参照のこと）。該形態的変化
の１つはサケの銀色化（silvering）である。我々の研
究では、該形質転換されたサケは該コントロールよりも
早期に銀色化し、このことは形質転換されたサケがより
早期に成長することを示唆している（第８図）。該魚の
サイズおよび成長速度はサケの成長を調節する上で重要
な因子であると考えられ（ホアー（Hoar）,1988の概説
を参照のこと）、このことは形質転換されたサケがその
コントロールよりも早期に成長するという我々の観測に
より支持される。従って、該形質転換されたサケは、サ
ケ成長に関する研究用の良好なモデルであると思われ
る。
変化を包含する極めて複雑な形質転換過程である（ホア
ー（Hoar）,1988の概説を参照のこと）。該形態的変化
の１つはサケの銀色化（silvering）である。我々の研
究では、該形質転換されたサケは該コントロールよりも
早期に銀色化し、このことは形質転換されたサケがより
早期に成長することを示唆している（第８図）。該魚の
サイズおよび成長速度はサケの成長を調節する上で重要
な因子であると考えられ（ホアー（Hoar）,1988の概説
を参照のこと）、このことは形質転換されたサケがその
コントロールよりも早期に成長するという我々の観測に
より支持される。従って、該形質転換されたサケは、サ
ケ成長に関する研究用の良好なモデルであると思われ
る。
上記第二群の態様に従う手順のテスト結果 1.ゲンゲAFPプロモータはインビトロでのサケ科魚類に
おいて機能できる。
おいて機能できる。
CATアッセイを、opAFPプロモータの有効性のテストに
使用した。該opAFP−CAT構築体を２種のサケ科魚類細胞
系、即ちニジマス肝癌細胞系RTH 149およびマスノスケ
胚細胞系CHSE−214にトランスフェクションした。第９
図に示したように、CAT活性はこれら両者において明ら
かに検出された。opAFP−CATにより生ずるCAT活性のレ
ベルは、単純疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼプロ
モータを有するpBLCAT2由来のものに匹敵した。これら
の細胞をpBLCAT3でトランスフェクションした場合に
は、殆どまたは全くCAT活性をもたないプロモータを含
まないCAT構築体が検出された。これらの結果は、該サ
ケ科魚類の細胞は該AFP遺伝子に乏しいが、これら細胞
が該AFP遺伝子の根本的な発現に必要とされる転写因子
を含むことを示唆しており、形質転換研究における有用
性を示している。
使用した。該opAFP−CAT構築体を２種のサケ科魚類細胞
系、即ちニジマス肝癌細胞系RTH 149およびマスノスケ
胚細胞系CHSE−214にトランスフェクションした。第９
図に示したように、CAT活性はこれら両者において明ら
かに検出された。opAFP−CATにより生ずるCAT活性のレ
ベルは、単純疱疹ウイルス由来のチミジンキナーゼプロ
モータを有するpBLCAT2由来のものに匹敵した。これら
の細胞をpBLCAT3でトランスフェクションした場合に
は、殆どまたは全くCAT活性をもたないプロモータを含
まないCAT構築体が検出された。これらの結果は、該サ
ケ科魚類の細胞は該AFP遺伝子に乏しいが、これら細胞
が該AFP遺伝子の根本的な発現に必要とされる転写因子
を含むことを示唆しており、形質転換研究における有用
性を示している。
2.ゲンゲAFPプロモータはインビボでの日本産メダカに
おいて機能する 遺伝子転移における該opAFP遺伝子プロモータの使用
の適性を更に調べるために、該opAFP−CAT構築体を１ま
たは２細胞段階におけるメダカ胚に微注入した。CAT活
性を胚の成育中の種々の時点において個々の胚につき測
定した。第10図に示した如く、CAT活性は最初に注入後
２日目に検出され、該活性は６〜８日後に最大値に達
し、次いでCAT活性は低下し始めた。しかしながら、CAT
活性は孵化した魚においても依然として検出された（11
日目）。これとは対照的に、注入されなかった胚または
pBLCAT3を注入した胚には殆どまたは全くCAT活性が検出
されなかった（データは提示せず）。これらの結果は、
更に該opAFP遺伝子プロモータが該AFP遺伝子をもたない
種々の種の魚において、インビボで活性であることを立
証している。
おいて機能する 遺伝子転移における該opAFP遺伝子プロモータの使用
の適性を更に調べるために、該opAFP−CAT構築体を１ま
たは２細胞段階におけるメダカ胚に微注入した。CAT活
性を胚の成育中の種々の時点において個々の胚につき測
定した。第10図に示した如く、CAT活性は最初に注入後
２日目に検出され、該活性は６〜８日後に最大値に達
し、次いでCAT活性は低下し始めた。しかしながら、CAT
活性は孵化した魚においても依然として検出された（11
日目）。これとは対照的に、注入されなかった胚または
pBLCAT3を注入した胚には殆どまたは全くCAT活性が検出
されなかった（データは提示せず）。これらの結果は、
更に該opAFP遺伝子プロモータが該AFP遺伝子をもたない
種々の種の魚において、インビボで活性であることを立
証している。
3.汎用遺伝子転移カセット、opAFP−Ｖの設計および構
築 上記のサケ科魚類の細胞系およびメダカ胚のCATアッ
セイの結果は、該opAFPプロモータが名目上AFPを発現し
ない魚類において活性であることを示唆している。この
ことは、更にタイセイヨウサケにおけるGH遺伝子転移に
関する最近の我々の研究によっても支持される。該opAF
P遺伝子プロモータおよびタイセイヨウサケに微注入さ
れた該融合遺伝子がサケのGHcDNAと連結された場合、得
られる形質転換されたサケは成長速度の顕著な増大を示
した（デュー（Du）等,1992）。これら実験は全体とし
て、該opAFPプロモータが種々の魚類種において活性で
あることを示す。
築 上記のサケ科魚類の細胞系およびメダカ胚のCATアッ
セイの結果は、該opAFPプロモータが名目上AFPを発現し
ない魚類において活性であることを示唆している。この
ことは、更にタイセイヨウサケにおけるGH遺伝子転移に
関する最近の我々の研究によっても支持される。該opAF
P遺伝子プロモータおよびタイセイヨウサケに微注入さ
れた該融合遺伝子がサケのGHcDNAと連結された場合、得
られる形質転換されたサケは成長速度の顕著な増大を示
した（デュー（Du）等,1992）。これら実験は全体とし
て、該opAFPプロモータが種々の魚類種において活性で
あることを示す。
該opAFP遺伝子プロモータの遺伝子転移研究用の有用
なビヒクルとしての使用を簡単化するため、またこのプ
ロモータを使用した他の融合遺伝子の構築を簡単化する
ために、発現ベクターopAFP−Ｖを該opAFP遺伝子プロモ
ータ、その５′−未翻訳配列およびopAFP遺伝子の３′
配列を使用してpUCにクローン化した。該2.1kbプロモー
タは活性な転写のために必要とされ、該1.2kbの３′−
配列はポリアデニル化および転写終止のために好まし
い。第11図に示した如く、該2.1kbopAFP遺伝子プロモー
タは固有のBg IIIサイトで63bpのopAFP遺伝子５′未翻
訳配列と連結され、該５′未翻訳配列は固有のHpalサイ
トで該３′配列に連結された。このベクターの如何に遺
伝子を挿入するかおよび如何にして挿入するかは挿入す
べき遺伝子、即ち自身の５′未翻訳配列をもつまたはも
たないcDNAまたはゲノムDNAの特性に依存する。
なビヒクルとしての使用を簡単化するため、またこのプ
ロモータを使用した他の融合遺伝子の構築を簡単化する
ために、発現ベクターopAFP−Ｖを該opAFP遺伝子プロモ
ータ、その５′−未翻訳配列およびopAFP遺伝子の３′
配列を使用してpUCにクローン化した。該2.1kbプロモー
タは活性な転写のために必要とされ、該1.2kbの３′−
配列はポリアデニル化および転写終止のために好まし
い。第11図に示した如く、該2.1kbopAFP遺伝子プロモー
タは固有のBg IIIサイトで63bpのopAFP遺伝子５′未翻
訳配列と連結され、該５′未翻訳配列は固有のHpalサイ
トで該３′配列に連結された。このベクターの如何に遺
伝子を挿入するかおよび如何にして挿入するかは挿入す
べき遺伝子、即ち自身の５′未翻訳配列をもつまたはも
たないcDNAまたはゲノムDNAの特性に依存する。
短い５′未翻訳配列または該領域をもたないcDNA配列
をopAFP−Ｖに挿入するためには、該opAFP遺伝子５′未
翻訳配列の直後にある該Hpa Iサイトに該挿入を行うべ
きである。このHpa Iサイトは該ベクター中の唯一のHpa
Iサイトであり、従って単一のHpa I消化により開裂で
き、該５′未翻訳配列をもたない対象とするcDNAクロー
ンはこの固有のHpa Iサイトに直接クローン化できる。o
pAFP遺伝子の該５′未翻訳配列は翻訳開始のためのリボ
ソームの操作のリーダー配列として機能し得る。
をopAFP−Ｖに挿入するためには、該opAFP遺伝子５′未
翻訳配列の直後にある該Hpa Iサイトに該挿入を行うべ
きである。このHpa Iサイトは該ベクター中の唯一のHpa
Iサイトであり、従って単一のHpa I消化により開裂で
き、該５′未翻訳配列をもたない対象とするcDNAクロー
ンはこの固有のHpa Iサイトに直接クローン化できる。o
pAFP遺伝子の該５′未翻訳配列は翻訳開始のためのリボ
ソームの操作のリーダー配列として機能し得る。
比較的長い５′未翻訳配列をもつcDNA配列を挿入する
ためには、該opAFP遺伝子の該５′未翻訳配列の前方に
ある固有のBg IIIサイトで挿入すべきである。過度の該
opAFP遺伝子該５′未翻訳配列をもつことを回避するた
めに、該opAFP遺伝子該５′未翻訳配列はBg1 II/Hpa I
消化により除去することができる。また該Hpa Iサイト
でこの挿入を行ってもよく、この場合には長い融合５′
未翻訳配列をもつmRNAを形成する。
ためには、該opAFP遺伝子の該５′未翻訳配列の前方に
ある固有のBg IIIサイトで挿入すべきである。過度の該
opAFP遺伝子該５′未翻訳配列をもつことを回避するた
めに、該opAFP遺伝子該５′未翻訳配列はBg1 II/Hpa I
消化により除去することができる。また該Hpa Iサイト
でこの挿入を行ってもよく、この場合には長い融合５′
未翻訳配列をもつmRNAを形成する。
ゲノム遺伝子は転写終止体として機能するそれ自身の
３′配列を含むので、該３′opAFP遺伝子配列はゲノム
遺伝子のクローニングには不必要である。このopAFP遺
伝子の３′配列は、該挿入されたゲノム遺伝子中の該
５′未翻訳配列の長さに依存して、Bg1 II/Sa IIまたは
Hpal/Sa II消化により該ベクターから除去できる。
３′配列を含むので、該３′opAFP遺伝子配列はゲノム
遺伝子のクローニングには不必要である。このopAFP遺
伝子の３′配列は、該挿入されたゲノム遺伝子中の該
５′未翻訳配列の長さに依存して、Bg1 II/Sa IIまたは
Hpal/Sa II消化により該ベクターから除去できる。
第11図に示した如く、幾つかの付随的な制限サイトが
該ベクターの５′−および３′末端、例えば５′−末端
におけるEcoR I、Ppn1、SmalおよびBamH Iおよび３′−
末端におけるPst1、Sa II、BamH I、SmalおよびEcoR I
位に存在する。これらは該ベクターからの完全な融合遺
伝子の切除を可能ならしめる。
該ベクターの５′−および３′末端、例えば５′−末端
におけるEcoR I、Ppn1、SmalおよびBamH Iおよび３′−
末端におけるPst1、Sa II、BamH I、SmalおよびEcoR I
位に存在する。これらは該ベクターからの完全な融合遺
伝子の切除を可能ならしめる。
4.OpAFP−Ｖの完全なDNA配列 このベクターによる該形質転換遺伝子の組み込みおよ
び発現の分析を補助するために、opAFP−Ｖの完全なDNA
配列を決定した。このopAFP−Ｖの全長は、pUC由来の26
77bp（ヤニッシュ−ペロン（Yanisch−Perron）等,198
5）およびopAFP DNA配列由来の3350bpを含む6027bpであ
る。この完全なopAFP DNA配列を第Ｖ表に示す。このopA
FP遺伝子プロモータは長さ2.1kbであり、これはそれぞ
れ2006および2049に位置する“CAAT"ボックスおよび“T
ATA"ボックスをもつ。このプロモータ配列の後には該op
AFP遺伝子の５′−未翻訳配列があり、これは合成Bg1 I
Iリンカーにより該プロモータに連結されている（位置2
116）。この５′−未翻訳配列の正確なサイズは未知で
ある。というのは、ゲンゲが、極めて類似するが同一で
はない遺伝子構造を有するAFP遺伝子の150コピーを有し
（ヒュー（Hew）等,1988）、従ってこの特定のAFP遺伝
子のCAPサイトを決定することは困難である。真核生物
の遺伝子において、CAPサイトは通常該“TATA"ボックス
から25−30bp下流側に位置する。従って、opAFP遺伝子
の５′−未翻訳配列は約90bpである。opAFP−Ｖ中に存
在する該５′−未翻訳配列は長さ63bpに相当し、これは
Bg IIIサイトとHpalサイトとの間に位置している。該op
AFP遺伝子の３′配列は該プロモータに連結され、かつ
固有のHpalサイトにより該５′−未翻訳配列に連結され
ている（位置2188）。該３′配列の長さは1.2kbであ
り、これは80−90bpの３′−未翻訳配列および1.1kbの
３′フランキング配列を含む。ポリ（Ａ）シグナル“AA
TAAA"および潜在的な転写終止シグナル“CT"はそれぞれ
2253および2285位に位置する。
び発現の分析を補助するために、opAFP−Ｖの完全なDNA
配列を決定した。このopAFP−Ｖの全長は、pUC由来の26
77bp（ヤニッシュ−ペロン（Yanisch−Perron）等,198
5）およびopAFP DNA配列由来の3350bpを含む6027bpであ
る。この完全なopAFP DNA配列を第Ｖ表に示す。このopA
FP遺伝子プロモータは長さ2.1kbであり、これはそれぞ
れ2006および2049に位置する“CAAT"ボックスおよび“T
ATA"ボックスをもつ。このプロモータ配列の後には該op
AFP遺伝子の５′−未翻訳配列があり、これは合成Bg1 I
Iリンカーにより該プロモータに連結されている（位置2
116）。この５′−未翻訳配列の正確なサイズは未知で
ある。というのは、ゲンゲが、極めて類似するが同一で
はない遺伝子構造を有するAFP遺伝子の150コピーを有し
（ヒュー（Hew）等,1988）、従ってこの特定のAFP遺伝
子のCAPサイトを決定することは困難である。真核生物
の遺伝子において、CAPサイトは通常該“TATA"ボックス
から25−30bp下流側に位置する。従って、opAFP遺伝子
の５′−未翻訳配列は約90bpである。opAFP−Ｖ中に存
在する該５′−未翻訳配列は長さ63bpに相当し、これは
Bg IIIサイトとHpalサイトとの間に位置している。該op
AFP遺伝子の３′配列は該プロモータに連結され、かつ
固有のHpalサイトにより該５′−未翻訳配列に連結され
ている（位置2188）。該３′配列の長さは1.2kbであ
り、これは80−90bpの３′−未翻訳配列および1.1kbの
３′フランキング配列を含む。ポリ（Ａ）シグナル“AA
TAAA"および潜在的な転写終止シグナル“CT"はそれぞれ
2253および2285位に位置する。
該opAFP遺伝子のDNA配列を、あらゆる肝−特異的配列
の存在について分析した。アフリカツメガエルのアルブ
ミン遺伝子（スコルプ（Schorpp）等,1988）の肝−特異
的プロモータエレメントHPIに対して70％の類似性をも
つ２個の17bpのフラグメントが位置1004〜1020および19
44〜1960に存在することを明らかにした（第Ｖ表）。こ
れら２種のフラグメントはそれぞれ該CAPサイトの約−1
kbおよび−100bp上流に存在した。該アフリカツメガエ
ルのアルブミンHPI配列は、肝−特異的転写因子LF−B1
（ドゥシモン＆コルテス（De Simone and Cortese）,19
88）に対する結合サイトであると示唆されている。しか
しながら、これら２種の推定上の肝−特異的配列の機能
は研究の余地が残されている。
の存在について分析した。アフリカツメガエルのアルブ
ミン遺伝子（スコルプ（Schorpp）等,1988）の肝−特異
的プロモータエレメントHPIに対して70％の類似性をも
つ２個の17bpのフラグメントが位置1004〜1020および19
44〜1960に存在することを明らかにした（第Ｖ表）。こ
れら２種のフラグメントはそれぞれ該CAPサイトの約−1
kbおよび−100bp上流に存在した。該アフリカツメガエ
ルのアルブミンHPI配列は、肝−特異的転写因子LF−B1
（ドゥシモン＆コルテス（De Simone and Cortese）,19
88）に対する結合サイトであると示唆されている。しか
しながら、これら２種の推定上の肝−特異的配列の機能
は研究の余地が残されている。
最近、PCRは、DNA源が制限されている場合の該DNAを
分析するための有用な手段となっている。PCRは形質転
換されたマウスのスクリーニングにおいて利用され（チ
ェン＆エバンス（Chen and Evans）,1990）、その血液
細胞はSDSで溶解され、該DNAが直接PCRのために使用さ
れている。最近、ハンレイ＆メリル（Hanley and Meril
e）,1991）は未精製のテールDNAを使用したPCRによる、
マウス中の形質転換遺伝子の検出を報告した。我々のデ
ータは、PCRによる形質転換された魚の直接的なスクリ
ーニングに対しては１μｌの血液で十分であることを明
らかにした。このプロトコールが数千個の試料の検出を
行うための研究室での毎日の分析に採用されている。
分析するための有用な手段となっている。PCRは形質転
換されたマウスのスクリーニングにおいて利用され（チ
ェン＆エバンス（Chen and Evans）,1990）、その血液
細胞はSDSで溶解され、該DNAが直接PCRのために使用さ
れている。最近、ハンレイ＆メリル（Hanley and Meril
e）,1991）は未精製のテールDNAを使用したPCRによる、
マウス中の形質転換遺伝子の検出を報告した。我々のデ
ータは、PCRによる形質転換された魚の直接的なスクリ
ーニングに対しては１μｌの血液で十分であることを明
らかにした。このプロトコールが数千個の試料の検出を
行うための研究室での毎日の分析に採用されている。
本発明に従って、同様に形質転換された遺伝子構築体
中で機能する他のプロモータ系が存在することを理解す
べきである。これらはオオカミウオ、ウインタフロウン
タ、ケムシカジカおよび他のAFPまたはAFP−含有魚類か
ら単離されたプロモータ配列を包含する。
中で機能する他のプロモータ系が存在することを理解す
べきである。これらはオオカミウオ、ウインタフロウン
タ、ケムシカジカおよび他のAFPまたはAFP−含有魚類か
ら単離されたプロモータ配列を包含する。
プロモータ、随意成分の遺伝子プリカーサとしての
５′未翻訳配列および３′末端配列に関連する本発明の
種々の態様に関する上記議論から、勿論上記した配列、
即ち第Ｖ表に掲載した特定の配列ばかりでなく、ゲンゲ
以外の他の種、即ち第IV表に関連して記載した如きオオ
カミウオ等から単離したようなプロモータ配列によって
立証されるようなものと機能的に等価な多くのものをも
包含することを理解すべきである。本発明によるプロモ
ータ配列は種々の遺伝子製品に適用可能である。という
のは、これらが魚類遺伝子由来のものであり、かつ種々
の型の魚類と相容性であるからである。従って、該プロ
モータ配列は「全魚類」遺伝子構築体と呼ばれる。発現
に関して、形質転換遺伝子生成物の合成および分泌に非
常に適した組織である肝臓に対して特異的または肝−支
配的であるという該プロモータ配列の利点から、「全魚
類」遺伝子構築体の製造に有用な様々なAFP/AFGPプロモ
ータがある（ゴング（Gong）等,1992）。
５′未翻訳配列および３′末端配列に関連する本発明の
種々の態様に関する上記議論から、勿論上記した配列、
即ち第Ｖ表に掲載した特定の配列ばかりでなく、ゲンゲ
以外の他の種、即ち第IV表に関連して記載した如きオオ
カミウオ等から単離したようなプロモータ配列によって
立証されるようなものと機能的に等価な多くのものをも
包含することを理解すべきである。本発明によるプロモ
ータ配列は種々の遺伝子製品に適用可能である。という
のは、これらが魚類遺伝子由来のものであり、かつ種々
の型の魚類と相容性であるからである。従って、該プロ
モータ配列は「全魚類」遺伝子構築体と呼ばれる。発現
に関して、形質転換遺伝子生成物の合成および分泌に非
常に適した組織である肝臓に対して特異的または肝−支
配的であるという該プロモータ配列の利点から、「全魚
類」遺伝子構築体の製造に有用な様々なAFP/AFGPプロモ
ータがある（ゴング（Gong）等,1992）。
該AFPプロモータ配列が殆どの魚類種に存在しないと
いう観点から、形質転換された種はPCR法および他の遺
伝子配列増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応法により容易
に検出される。更に、多くの魚類はこれらのAFP遺伝子
を含まないので、内在性遺伝子の性能に影響を与えるこ
となく該AFPプロモータを使用して該形質転換遺伝子を
変性することは容易である。また、該５′および３′末
端両者を含む該AFP遺伝子配列は正常なDNA転写および終
止並びに組織特異的発現にとって重要な機能的DNA配列
を含む。これらのDNA配列を変更して、随意にその経験
的レベル（experience level）を改善することができ、
また多くの外的シグナル、例えばホルモン類、成長因子
類等に応答性のものとすることができる。
いう観点から、形質転換された種はPCR法および他の遺
伝子配列増幅法、例えばリガーゼ連鎖反応法により容易
に検出される。更に、多くの魚類はこれらのAFP遺伝子
を含まないので、内在性遺伝子の性能に影響を与えるこ
となく該AFPプロモータを使用して該形質転換遺伝子を
変性することは容易である。また、該５′および３′末
端両者を含む該AFP遺伝子配列は正常なDNA転写および終
止並びに組織特異的発現にとって重要な機能的DNA配列
を含む。これらのDNA配列を変更して、随意にその経験
的レベル（experience level）を改善することができ、
また多くの外的シグナル、例えばホルモン類、成長因子
類等に応答性のものとすることができる。
本明細書には、本発明の好ましい態様を詳細に記載し
てきたが、本発明の精神並びに添付した請求の範囲を逸
脱することなしに、種々の変更がなし得ることを当業者
は理解するであろう。
てきたが、本発明の精神並びに添付した請求の範囲を逸
脱することなしに、種々の変更がなし得ることを当業者
は理解するであろう。
形質転換されたサケおよびその同胞種をGH遺伝子構築
体の注入された卵から発生させ、同一の水槽で培養し
た。コントロールサケは注入しなかった卵から発生させ
た。状態因子は単位体長当たりの体重の尺度であり、体
重／（体長）３×1000として算出される。全ての値は平
均±標準誤差として示された。括弧内に与えられた数値
は魚の数、あるいは分析した試料の数を表す。統計的な
比較は形質転換されたサケと同胞種またはコントロール
との間で行った。
体の注入された卵から発生させ、同一の水槽で培養し
た。コントロールサケは注入しなかった卵から発生させ
た。状態因子は単位体長当たりの体重の尺度であり、体
重／（体長）３×1000として算出される。全ての値は平
均±標準誤差として示された。括弧内に与えられた数値
は魚の数、あるいは分析した試料の数を表す。統計的な
比較は形質転換されたサケと同胞種またはコントロール
との間で行った。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 シーブライト コーポレイション リミ テッド カナダ ニューファンドランド エイエ ルシー ５エス７ セント ジョンズ ピーオーボックス 4200 メモリアル ユニヴァーシティ オブ ニューファン ドランド内 (72)発明者 ヒュー チョイ エル カナダ オンタリオ エル４ジェイ ２ エイ３ ソーンヒル グレン マナー ウェイ 117 (72)発明者 フレッチャー ガース エル カナダ ニューファンドランド エイエ ルシー ５エイチ４ セント ジョンズ サイト 76 ボックス 27 (56)参考文献 Ｚｈａｎｇ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ ｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，ｖｏｌ. 25，ｐ．３−13（１ Ｈｅｗ Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｆｉ ｓｈ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅ ｍ．，ｖｏｌ．７，ｐ．３ Ｈｅｗ Ｃ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ. Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．263 （24），ｐ．1204 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01K 67/027 ZNA A01K 61/00 ZNA C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩＤＳ（ＳＴＮ)
Claims (7)
- 【請求項１】下記の工程を含むサケ科魚類の成長速度を
増進する方法。 （ａ）サケ科魚類の生殖細胞系に、タイプ３不凍化タン
パクプロモーターに機能的に結合したサケ科魚類成長ホ
ルモンをコードする遺伝子を導入する工程；及び （ｂ）前記サケ科魚類の成長速度が、前記不凍化タンパ
クプロモーターに機能的に結合したサケ科魚類成長ホル
モンをコードする遺伝子を持たないサケ科魚類の成長速
度に対して少なくとも４倍となるようなレベルで、前記
魚類が前記成長ホルモン遺伝子を発現するような条件下
で前記魚類を飼育する工程。 - 【請求項２】前記不凍化タンパクプロモーターが、ゲン
ゲ由来のものであり、前記成長ホルモン遺伝子が、内在
性成長ホルモン遺伝子である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】前記サケ科魚類が、タイセイヨウサケ及び
マスノスケからなる群から選ばれる請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】タイプ３不凍化タンパクプロモーターに機
能的に結合したサケ科魚類成長ホルモンをコードする遺
伝子を生殖細胞系に有する遺伝子導入サケ科魚類であっ
て、その成長速度が、前記不凍化タンパクプロモーター
に機能的に結合したサケ科魚類成長ホルモンをコードす
る遺伝子を持たないサケ科魚類の成長速度に対して少な
くとも４倍となるようなレベルで、前記成長ホルモン遺
伝子を発現する遺伝子導入サケ科魚類。 - 【請求項５】前記不凍化タンパクプロモーターが、ゲン
ゲ由来のものであり、前記成長ホルモン遺伝子が、内在
性成長ホルモン遺伝子である請求項４記載の遺伝子導入
サケ科魚類。 - 【請求項６】前記サケ科魚類が、タイセイヨウサケ及び
マスノスケからなる群から選ばれる請求項４記載の遺伝
子導入サケ科魚類。 - 【請求項７】前記サケ科魚類が、タイセイヨウサケであ
る請求項５記載の遺伝子導入サケ科魚類。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US66976591A | 1991-03-15 | 1991-03-15 | |
| US669,765 | 1991-03-15 | ||
| PCT/CA1992/000109 WO1992016618A1 (en) | 1991-03-15 | 1992-03-12 | Gene construct for production of transgenic fish |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06505870A JPH06505870A (ja) | 1994-07-07 |
| JP3293622B2 true JP3293622B2 (ja) | 2002-06-17 |
Family
ID=24687639
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50579192A Expired - Lifetime JP3293622B2 (ja) | 1991-03-15 | 1992-03-12 | 形質転換された魚類の製造用の遺伝子構築体 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5545808A (ja) |
| EP (1) | EP0578653B1 (ja) |
| JP (1) | JP3293622B2 (ja) |
| AT (1) | ATE203269T1 (ja) |
| AU (1) | AU669844B2 (ja) |
| CA (2) | CA2106315C (ja) |
| DE (1) | DE69231947T2 (ja) |
| ES (1) | ES2163398T3 (ja) |
| NO (1) | NO321650B1 (ja) |
| WO (1) | WO1992016618A1 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| GB9216851D0 (en) * | 1992-08-07 | 1992-09-23 | Univ Manitoba | Dna sequences of rat probasin gene |
| EP0711309A1 (en) * | 1993-06-10 | 1996-05-15 | Novo Nordisk A/S | Mutant dna encoding insulin receptor substrate 1 |
| US5650298A (en) | 1993-06-14 | 1997-07-22 | Basf Aktiengesellschaft | Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters |
| US5912411A (en) * | 1993-06-14 | 1999-06-15 | University Of Heidelberg | Mice transgenic for a tetracycline-inducible transcriptional activator |
| US5866755A (en) * | 1993-06-14 | 1999-02-02 | Basf Aktiengellschaft | Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor |
| US5888981A (en) | 1993-06-14 | 1999-03-30 | Basf Aktiengesellschaft | Methods for regulating gene expression |
| US5859310A (en) | 1993-06-14 | 1999-01-12 | Basf Aktiengesellschaft | Mice transgenic for a tetracycline-controlled transcriptional activator |
| GB9316727D0 (en) * | 1993-08-12 | 1993-09-29 | Inst Of Psychiatry | Models of alzheimers's disease |
| US5789655A (en) | 1994-05-13 | 1998-08-04 | The Regents Of The University Of California | Transgenic animals expressing artificial epitope-tagged proteins |
| CA2126138C (en) * | 1994-06-17 | 2001-08-21 | Robert H. Devlin | Transgenic fish and vectors therefor |
| US5907078A (en) * | 1994-12-09 | 1999-05-25 | Greenberg; Norman M. | Transgenic mouse model for prostate cancer |
| WO1996032087A2 (en) * | 1995-04-06 | 1996-10-17 | Dalhousie University | Transgenic fish in the treatment of diabetes |
| US5986054A (en) * | 1995-04-28 | 1999-11-16 | The Hospital For Sick Children, Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| US6210919B1 (en) * | 1995-04-28 | 2001-04-03 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Genetic sequences and proteins related to alzheimer's disease |
| US6531586B1 (en) | 1995-04-28 | 2003-03-11 | The Hospital For Sick Children | Genetic sequences related to Alzheimer's Disease |
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