BR112012012254B1 - Construto de expressao isolado, e, metodos para produzir um peixe femea de finalizaqao de linhagem, para propagar peixes transgenicos com construto de esterilidade materna, e para gerar uma geraqao esteril de peixes - Google Patents

Abstract

CONSTRUTO DE EXPRESSÃO ISOLADO, E , MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA FÊMEA DE FINALIZAÇÃO DE LINHAGEM, PARA PROPAGAR ANIMAIS TRANSGÊNICOS COM CONSTRUTO DE ESTERILIDADE MATERNA, E PARA GERAR UMA GERAÇÃO ESTÉRIL ANIMAIS. A presente invenção fornece construtos de esterilidade materna (MSC) e métodos de produzir progénie estéril que não apresenta células germinativas. As fêmeas que carregam o transgene MSC darão origem a uma geração estéril, uma vez que o MSC elimina especificamente as células germinativas progenitoras (PGCs) de suas progénie. Estas fêmeas são denominadas fêmeas de finalização de linhagem.Os machos que carregam o transgene de MSC, entretanto, dão origem à progénie fértil (presumindo que o macho não é derivado de uma fêmea transgênica com MSC).Assim, os machos transgÊnicos com MSC podem ser usados para propagar a linhagem transgênica. A invenção pode ser vantajosamente aplicada para eliminar pestes invasivas, ou para fornecer controle eficiente da população e melhorar o desempenho da cultura de espécies de cultivo, tais como peixe e marisco.

Description

REFERÊNCIAS CRUZADAS AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica a prioridade do pedido provisório U.S. 61/263.468, depositado em 23 de novembro de 2009, cuja revelação é aqui incorporada na sua íntegra.

DECLARAÇÃO COM RELAÇÃO AOS DIREITOS PARA INVENÇÕES REALIZADAS EM PESQUISAS E DESENVOLVIMENTO PATROCIANDOS PELO GOVERNO FEDERAL

[002] Esta invenção foi financiada em parte por fundos do governo no National Institute of Science and Technology Advance Technology Program (NIST-ATP), Acordo #70NANB3H3043, e concessão do National Science Foundation SBIR #0912837.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003]Existe uma necessidade de uma tecnologia para controlarespécies invasivas e pestes, por exemplo, peixe, anfíbios, moluscos, crustáceos e insetos, que pode substituir machos estéreis induzidos por radiação por meio de liberações em massa. As técnicas de esterilização confiáveis também seriam valiosas para a aplicação da engenharia genética nas espécies benéficas, com relação à melhores características (por exemplo, resistência à doença, melhor crescimento ou desenvolvimento, resistência à inseticidas, interrupção de mecanismo para a transmissão de doença).

[004]De maneira tradicional, em aquicultura comercial, o peixeestéril tem sido produzido por indução triplóide (a adição de um conjunto extra de cromossomos). Entretanto, sabe-se em geral que a triploidia impacta negativamente o desempenho de muitas espécies, e os protocolos ideias sãodependentes da espécie.A aplicação da tecnologia é trabalhosa e é difícil garantir que 100 % dos peixes sejam triplóides e, portanto, estéreis.

[005]Uma solução mais fácil seria mediar a esterilidade com umtransgene ou mutação. Várias abordagens transgênicas foram propostas e testadas para atingir a esterilidade, mas, até o momento, estes métodos têm sido, na melhor das hipóteses, parcialmente satisfatórios. A esterilidade no nível fisiológico, celular e molecular não foi demonstrada (Thresher et al. (2009) Aquaculture 290: 104-09 e Wong & van Eenennaam (2008) Aquaculture 275: 1 - 12).

[006]Um obstáculo importante é a exigência de uma esterilidadetemporariamente reversível para propagar a linhagem. Seria desejável uma solução que não exige tratamento repetido em cada geração.

[007] A maioria dos estudos que tem como objetivo desenvolver peixe estéril de maneira transgênica foca em métodos para inativar hormônios envolvidos no crescimento, diferenciação e maturação gonadal. Os alvos hormonais propostos incluem o hormônio de liberação de gonadotropina, hormônio do folículo estimulante e hormônio luteinizante. O silenciamento destes genes chave pode levar, a princípio, a peixe sexualmente imaturo e estéril, cuja fertilidade pode ser recuperada por distribuição exógena do hormônio que falta.

[008] Embora refinada em teoria, muitas dificuldades são inerentes nestas abordagens. Um primeiro problema é a existência de elementos da família de gene de hormônios múltiplos em alguns genomas de peixe. Além disso, estes hormônios apresentam função biológica além da fertilidade. Finalmente, em modelos que dependem da tecnologia knockdown, a esterilidade não é 100 % e a redução na fertilidade varia entre o sexo e as linhagens iniciais.

[009] Uma abordagem alternativa para silenciar os genes de reprodução endógena é criar linhagens transgênicas com genes determinadospara interromper as vias de sinalização chave na padronização do desenvolvimento embrionário inicial, levando à morte do embrião. Esta abordagem usa tanto a tecnologia de knockdown de gene, tal como RNA e RNAds antissenso, quando usa a expressão incorreta de um morfogene. Estes desreguladores embrionários são colocados no controle de promotores específicos embrionários, que são expressos durante o desenvolvimento embrionário.

[0010] Para atingir a reversibilidade, e permitir a propagação das linhagens, o construto é determinado com um sistema de repressão bacteriana colocado entre o promotor e o desregulador do gene de desenvolvimento importante. O sistema usa um promotor PhCMV*-ll responsivo à Tet disponível comercialmente. Em teoria, o peixe pode ser reproduzido em cativeiro se um medicamento (por exemplo, tetraciclina ou um derivado desta) for aplicado rapidamente durante a embriogênese, bloqueando a expressão do gene desregulador e fornecendo o controle reversível na reprodução. Até o momento, os esforços para produzir linhagens estéreis têm se mostrado não satisfatórios. As dificuldades em criar estas linhagens podem ser em virtude da perda no promotor responsivo a Tet, resultando em baixos níveis de expressão do gene desregulador embrionário e subsequente seleção contra a criação de linhagens iniciais. O sistema também exige o uso de um gene bacteriano e sistema de promotor, que complica o processo de revisão regulatória para a comercialização. Um obstáculo adicional desta abordagem é a necessidade de usar tetraciclina (ou seus derivados), que aumentará o custo da produção e produzirá um ambiente nocivo.

[0011] A presente invenção considera muitos dos obstáculos dos métodos anteriores.A invenção fornece uma plataforma de tecnologia transgênica capaz de esterilizar eficientemente diferentes espécies de animais vertebrados e invertebrados. A linhagem transgênica pode ainda ser facilmente propagada sem o uso de agentes potencialmente tóxicos ounocivos. A presente tecnologia pode tomar a produção comercial de espécies benéficas mais proveitosas e mais ecológicas. Por exemplo, a esterilização de espécies aquáticas cultivadas: 1) prevenirá o fluxo gênico para as populações selvagens e a colonização de novos habitats por espécies não nativas cultivadas (bioconfinamento); 2) protegerá linhagens caras com melhorias genéticas; 3) aumentará o desempenho reduzindo o gasto energético no desenvolvimento da gônada e diferenciação sexual, ou permitindo a produção de populações apenas de machos. Uma população apenas de machos pode ser vantajosa se os machos de uma espécie crescerem mais rápido que as fêmeas.Os métodos de esterilização que são essencialmente 100 % eficientes possibilitarão o desenvolvimento de tecnologias transgênicas com risco reduzido, e prometem melhorias notáveis com relação às tecnologias de contenção atuais.

[0012] Assim, a invenção fornece vantagens significativas, incluindo: (i) 100 % de eficiência, (ii) menor custo comparado às outras abordagens (sem trabalho ou tratamento necessários para propagar ou esterilizar a linhagem), (iii) os produtos do gene expresso não impactam de maneira negativa o desempenho do hospedeiro ou exigem o uso de genes de toxinas ou agentes com riscos potenciais de saúde ou ambientais, (vi) ampla aplicação da estratégia entre os diferentes organismos, (vii) ampla faixa de espécies alvo usando o mesmo construto, e (viii) fácil propagação de linhagens transgênicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0013] A invenção fornece composições e métodos para gerar uma fêmea de finalização de linhagem transgênica que produzirá uma geração de progénie estéril. São também fornecidos composições e métodos para propagar a linhagem transgênica usando machos transgênicos.

[0014] Em algumas modalidades, a invenção fornece um construto de esterilidade materna (MSC), isto é, um construto de expressão quecompreende: (i) um promotor de MSC, (ii) uma sequência de polinucleotídeos capaz de eliminar as células germinativas primordiais (PGCs), e (iii) pelo menos um elemento de ação cis específico da célula germinal, em que (i), (ii), e (iii) são operavelmente ligados. Em algumas modalidades, o promotor de MSC é um promotor materno, por exemplo, o promotor dos genes askopos (kop) ou zona pellucida (zpc). Em algumas modalidades, o(s) elemento(s) de ação cis específico(s) da célula germinal compreende(m) a sequência 3’-UTR de um gene da linhagem germinal, por exemplo, as sequências 3’-UTR dos genes dead-end (dnd) ou nanos (nos).

[0015] Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos capaz de eliminar PGCs é uma sequência pró-apoptótica. Em algumas modalidades, a sequência pró-apoptótica age diretamente na apoptose de PGCs e codifica uma proteína pró-apoptótica tal como Bax, Bak, Bok, Bad, Bik, Puma, Noxa, ou uma caspase efetora. Em algumas modalidades, a sequência pró-apoptótica age indiretamente, por exemplo, reduzindo a expressão de um gene anti-apoptótico, por exemplo, bcl-2, bcl-xl, bcl-w. Em algumas modalidades, as sequências pró-apoptóticas agem indiretamente reduzindo a expressão de um gene necessário para a migração ou especificação adequadas de PGCs, por exemplo, CXCR4-β, receptor lb do tipo insulina, fox cl, ou nanos.

[0016] Em algumas modalidades, a invenção fornece animais transgênicos que carregam o transgene do MSC descrito anteriormente. Em algumas modalidades, o animal transgênico com MSC é uma fêmea de finalização de linhagem. Em algumas modalidades, o animal transgênico com MSC é selecionado do grupo que consiste em: peixe, molusco, crustáceo, anfíbio, inseto e artrópodes. Em algumas modalidades, o animal transgênico com MSC carrega pelo menos um transgene adicional.

[0017] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de produzir uma fêmea de finalização de linhagem, compreendendo as etapas de: (i) introduzir um MSC em uma célula progenitora do animal (por exemplo, uma célula embrionária) para gerar um animal fundador transgênico com MSC que carrega o MSC em suas células germinativas, (ii) reproduzir o animal fundador transgênico com MSC da etapa (i) para produzir um macho transgênico com MSC hemizigoto, (iii) reproduzir o macho transgênico com MSC com uma fêmea que não apresenta o MSC, e (iv) selecionar a progénie de fêmea transgênica com MSC da etapa (iii) para obter uma fêmea de finalização de linhagem. Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente uma etapa de cruzar a fêmea de finalização de linhagem da etapa (iv) com um macho para produzir uma geração de progénie estéril. Em algumas modalidades, a fêmea de finalização de linhagem carrega pelo menos um transgene adicional.

[0018] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de produzir uma geração de animais estéreis, compreendendo cruzar uma fêmea de finalização de linhagem com um macho para produzir progénie estéril. Em algumas modalidades, a progénie estéril carrega pelo menos um transgene adicional.

[0019] Em algumas modalidades, apenas metade da progénie de uma fêmea de finalização de linhagem herda o transgene do MSC, embora toda a progénie seja estéril (Figura 1). Como uma população de animais não transgênicos, mas estéreis, pode apresentar valor, em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente detectar a presença do transgene do MSC e separar a progénie estéril transgênica com MSC da progénie estéril transgênica sem MSC. Em algumas modalidades, o transgene do MSC é detectado usando um marcador fluorescente ou um marcador colorido (por exemplo, adicionando uma sequência codificante adicional ao marcador para o transgene do MSC). Em algumas modalidades, o transgene do MSC é detectado por meio da morte da progénie estéril transgênica com MSC (por exemplo, adicionando uma sequência codificante letal ao transgene do MSCno controle de um promotor específico de estágio condicional ou de desenvolvimento).

[0020] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos de propagar animais transgênicos com MSC, compreendendo: (i) introduzir um MSC em uma célula progenitora do animal para gerar um animal fundador transgênico com MSC que carrega o MSC em suas células germinativas; (ii) reproduzir o animal fundador transgênico com MSC da etapa (i) para produzir um macho transgênico com MSC hemizigoto; (iii) reproduzir o macho transgênico com MSG com uma fêmea que não apresenta o MSC; e (iv) selecionar o macho transgênico com MSC progénie da etapa (iii) para reproduzir e propagar uma outra geração de animais transgênicos com MSC.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A figura 1 mostra um fluxograma que representa um exemplo de gerar animais estéreis e propagar uma linhagem transgênica com MSC.

[0022] A figura 2 mostra a marcação inicial de PGCs em embriões vivos de fêmeas transgênicas que carregam os transgenes. (A) askopos\ eGFP-dnd 3’UTR; ou (B) zpc: eGFP-dnd 3’UTR. Os embriões resultam de fêmeas transgênicas cruzadas com machos tipo selvagem. GFP é distribuído uniformemente no blastodisco até o estágio oval (A e B 1-2). O ponto de tempo mais inicial quando as células germinativas podem ser distinguidas das células somáticas é durante a gastrulação inicial (4 horas após a fertilização, A2 e B2). A3, B3: embriões em somitogênese posterior, e A4, B4: embriões 30-48 horas após a fertilização (hpf).

[0023] A figura 3 mostra imagens de microscopia fluorescente de fêmeas transgênicas. (A) A vista lateral de um fêmea de 1 mês (zpc: eGFP- dnd 3’UTR) mostra a gônada GFP através da parede do corpo. (B) e(C) mostram ovários dissecados de fêmea de 3 meses (askopos: eGFP-dnd 3’UTR), onde a expressão mais forte de GFP é observada nos oócitos em estágio I e II.

[0024] A figura 4 mostra a remoção de PGCs mediada por Bax. (A) Representação do construto Litmus 28i bax:dnd 3’UTR usado para a expressão de RNAm bax: dnd sintético com adição de nucleotideo guanina modificado. (B) RNAm Bax:dnd de (A) visualizado em gel de agarose. (C) Bax de peixe zebra pró-apoptótico induz a morte de uma maneira dose- dependente. (D-G) Imagens fluorescentes de embriões 24-hpf (D e F) e 48- hpf (E e G). (D e E) mostram embriões injetados de maneira simulada (grupo controle). (F e G) mostram embriões injetados com RNAm bax:dnd 3’UTR sintético (grupo de teste). (H-J) Quadro do tempo decorrido de um agrupamento de PGCs durante a somitogênese inicial nos embriões dos grupos de teste. Note o GFP difuso nas extremidades das células sugerindo a formação de bolha na membrana (H), e subsequente fracionamento nos fragmentos de célula pequena (I, J) característico de corpos apoptóticos. (K) Razão de sexo com base na análise de 20 embriões nos grupos controle e de teste. (L) Gônadas dissecadas de embriões de 3 meses injetados com controle. (M) Gônadas dissecadas de embriões injetados com RNA bax:dnd 3’UTR.

[0025] A figura 5 mostra (A) representação esquemática de construtos MSCzpc e MSCkop. A PCR na junção entre bax e dnd foi usada para identificar peixes transgênicos por qRT-PCR. (B) Representação de linhagens transgênicas com MSC estabelecida a partir de machos fundadores F0 (em negrito). As barras verticais representam o genótipo da progénie F1 positiva para o transgene do MSC sozinho (em preto) ou com os transgenes tanto MSC quanto GFP (barra verde e dupla preta). O sexo fenotípico e o número da progénie F1 são indicados da maneira a seguir: machos (ml, m2, m3...) e fêmeas (fl, f2, f3...). O percentual da progénie de macho F2 e o número total de descendentes F2 (n) a partir das diferentes linhagens Fl são indicados. A progénie de fêmeas Fl circulada na figura foi selecionada para estudar o efeito do transgene herdado matemalmente nas PGCs (que expressam GFP). (Cl) Mostra as PGCs em um embrião de uma fêmea MSCzpc3 Fl que exibecaracterísticas de células submetidas à apoptose com formação de bolha na membrana (GFP difuso nas extremidades da célula), e a formação de corpos apoptóticos (mostrada por setas). (C2) Mostra microscopia fluorescente de embrião tratado com laranja de acridina derivado de fêmea MSCzpc 11 Fl(fl). (D) Mostra imagens fluorescentes de embriões 24hpf e 48hpf de fêmea F1 (f2) MSCzpc3 que exibe deficiências variáveis em PGCs. Os embriões no grupo A exibiram contagem normal de PGC, enquanto o grupo B mostrou um número reduzido de PGC e o grupo C não apresentou PGCs visíveis em 48 hpf. (E) Mostra o número médio de PGCs marcadas com GFP na progénie de diferentes linhagens com MSC. Os embriões derivados de fêmeas com MSC (à esquerda) mostram redução significativa de PGCs (até 90 %), enquanto os embriões derivados de um macho com MSC (à direita) exibem números normais de PGC.Aproximadamente 20 embriões foram usados para calcular o número médio de PGCs para cada linhagem transgênica testada.As barras verticais representam o desvio padrão.

[0026] A figura 6 mostra a aparência externa da gônada no peixe macho. (A) Mostra o peixe estéril (MSCzpc22) e (B) mostra a baixa taxa de fertilização do peixe do grupo MSCzp3 com 0-3 PGCs, que exibe uma gônada normal em apenas um lado, sem ser o par normal. (C-N) Mostram a seção histológica das gônadas coradas com hematoxilina e eosina (H&E).Seção transversa de gônadas (C) estéreis (D) tipo selvagem e (E) atróficas. O tecido é organizado em túbulos circundados pela membrana basal. Nos túbulos, os espermatozóides (S) podem ser observados em alta densidade no peixe tipo selvagem e em densidade menor em peixes parcialmente férteis, enquanto nenhum espermatozóide pode ser detectado no lumem do lóbulo de indivíduos estéreis. As células de Sertoli são encontradas nos túbulos e as células de Leydig estão nos espaços intersticiais. (F-N) Mostra a seção longitudinal de progénie estéril da mesma idade F2 e progénie fértil de macho MSCzpc9 Fl (F) e fêmea irmã (I, L), macho MSCzpc22 Fl (G) e fêmea irmã (J, M) e macho MSCkop2 Fl (H) e fêmea irmã (K, N).

[0027] A figura 7 mostra a avaliação do fenótipo da esterilidade: (A) Mostra gônadas sem célula germinal adulta (dissecadas de peixe estéril F2 na linhagem MSCzpc22) que exibiram a expressão do marcador específico de macho sox 9a em níveis similares aos testes tipo selvagem. Ao contrário, não foi possível detectar a expressão do marcador do folículo ovariano cypl9ala. Cada experimento foi realizado em triplicata. (B e C) mostram que as gônadas deficientes em célula germinal adulta não exibem a expressão do marcador específico de célula germinal vasa. (B) Mostra a análise de RT-PCR dos genes sox9a e vasa a partir do tecido gonadal dissecado de 4 peixes tipo selvagem (2 machos e 2 fêmeas) e 3 peixes estéreis. Os controles negativos que não apresentam transcriptase reversa (sem RT) são mostrados na canaleta 1. (C) Mostra que a análise de Q-RT-PCR foi realizada em gônadas dissecadas de 6 machos estéreis, 5 machos com fertilidade reduzida, e macho tipo selvagem e fêmea controle. Utilizou-se o gene de manutenção β-actina, para normalizar o nível de RNA entre as amostras.Nenhuma expressão de vasa foi detectada nas amostras de peixe estéril.Os níveis relacionados da expressão de vasa em gônada de peixe com taxas reduzidas de fertilidade foram 60-90 % menores que macho e fêmea tipo selvagem. (D) Mostra a taxa de fertilização da progénie de fêmeas MSCzpc9, MSCzpc22 e MSCkop2 Fl. As barras vermelhas (porção superior, onde presente) indicam o número de ovos fertilizados e as barras azuis mostram ovos não fertilizados.

[0028] A figura 8 mostra (Ale A2) o construto do gene repórter GFP fundido à dnd UTR 3’ e nanos 3’UTR de peixe zebra. (Z1 -4) Mostram as imagens fluorescentes de embriões de peixe zebra injetados com 60 pg de RNA com adição de nucleotídeo guanina modificado sintético eGFP: dnd (Z1 :20hpf-Z2:24hpf) e eGFPmosl 3’UTR (Z3: 4hpf, Z4: 48hpf). (Tl-4) mostram embriões de truta com 30 dias injetados no período de fertilização com 200pg de RNA com adição de nucleotídeo guanina modificado sintético eGFP: dnd (Tl, T2) e eGFP:nosl (T3, T4). (SI, S2) mostram embriões de salmão** de 20 dias injetados com 200pg de RNA com adição de nucleotideo guanina modificado eGFP:nosl. As setas indicam GFP-PGCs na posição dorsal com relação ao trato digestivo (DT), mostrando auto-fluorescência. A vista lateral da truta* de trinta dias no estágio olho com e embriões de salmão** de 20 dias sem o vitelo são mostrados. A medida que o desenvolvimento embrionário continua, as células somáticas mostram menos fluorescência, enquanto a continuidade e intensidade de GFP são observadas em PGCs. (Cl) Mostra a representação esquemática do vetor de expressão que direciona Salmo salar bax fundido à nosl 3’UTR de peixe zebra. (C2) Mostra as imagens fluorescentes de embriões de peixe zebra reprodutores fêmea de controle de GFP (injetados de maneira simulada) ou injetados com ~10pg de RNA com adição de nucleotideo guanina modificado sintético ssbaxmosl em 24 hpf e 48 hpf. (C3) Mostra o número médio de PGCs em embriões de peixe zebra controle (barras azuis, à direita), e embriões de peixe zebra injetados com ssbaxmosl (barras vermelhas, à esquerda) em 24 e 48hpf (n=8). As barras verticais representam o desvio padrão.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I.Introdução

[0029] A invenção fornece composições e métodos para gerar animais estéreis de uma maneira eficiente economicamente. A tecnologia usa a distribuição específica espacial e temporal de um produto do transgene que elimina as células germinativas primordiais (PGCs) em um embrião em desenvolvimento. Sem as células germinativas, os embriões amadurecem em animais estéreis. O transgene indutor de esterilidade é um construto de esterilidade materna (MSC) que exige três elementos: um promotor de MSC que direciona uma sequência de polinucleotídeos capaz de eliminar PGC fundidas aos elementos cis-regulatórios específicos de célula germinal (por exemplo, 3’UTR). A presença do transgene do MSC em uma fêmea fará comque sua progénie fique estéril, independente se o macho pai carrega o transgene do MSC. Os machos transgênicos com MSC podem ser cruzados com as fêmeas tipo selvagem para propagar a linhagem, e esta progénie não é estéril.

[0030] A figura 1 ilustra como o transgene do MSC pode ser tanto mantido quanto usado para produzir animais estéreis. Na etapa 1, o transgene é introduzido em células progenitoras (por exemplo, células troco embrionárias) para produzir um animal fundador transgênico com MSC. Os animais fundadores capazes de transmitir a linhagem germinal do transgene do MSC são cruzados com um animal sem MSC para dar origem a uma geração Fl de animais transgênicos com MSC (Etapa 2). A presença do transgene na descendência pode ser detectada de acordo com métodos padrões, por exemplo, PCR, ou pela adição de um gene que codifica uma característica facilmente visível no MSC.

[0031] Os machos transgênicos com MSC hemizigotos são usados para propagar a linhagem (Etapa 3).Isto é em decorrência da sequência capaz de remover as PGCs não ser expressa em células germinativas de macho.A progénie de machos transgênicos com MSC desenvolve células germinativas normalmente e é fértil.

[0032] As fêmeas que carregam o transgene do MSC são as fêmeas de finalização de linhagem. Da maneira aqui explicada e ilustrada, a sequência que remove PGC é expressa nas células germinativas maternas a partir do promotor específico de oócito. O produto que remove a PGC é passado para sua progénie, resultando em descendentes sem células germinativas. A fêmea de finalização de linhagem produzirá descendentes estéreis independente do estado de MSC do pai. Os descendentes de uma fêmea de finalização de linhagem serão estéreis se forem negativos para MSC, hemizigotos ou homozigotos.

[0033] Mais particularmente, o sistema revelado permite o controleespacial e temporal da expressão da sequência de polinucleotídeos anterior à morte, primeiro no oócito e posteriormente nas PGCs (no embrião em desenvolvimento derivado do mesmo ovo).A apoptose do oócito é regulada por múltiplas vias de sinalização pró e anti-apoptóticas (ver, por exemplo, Morita et al. (2000) Nat. Med. 6: 1 109-14; Sasaki e Chiba (2004) Mol. Biol. Cell 15: 1387-96; Andersen et al. (2009) EMBO 28:3216-27). Os oócitos são mais resistentes à apoptose do que muitos tipos celulares, e a sobrexpressão ectópica de bax sozinho não suficiente para promover a apoptose do oócito. Assim, o transgene pode ser expresso em ambos os tipos celulares, mas resultam apenas na remoção de PGCs.

[0034] A atividade pró-apoptótica pode ser adicionalmente limitada às PGCs com elementos de RNA de ação cis, que estão na 3’UTR do RNA do germoplasma. Estes elementos alvejam a tradução do RNA nas PGCs. Primeiro, permitem a localização dos RNAms em uma região citoplasmática especializada, denominada germoplasma. Esta região é herdada pelas PGCs futuras e é necessária para sua especificação (Yoon (1997) Development 124:3157-65; Koprunner et al (2001) Genes & Dev. 15:2877-85; Weidinger et al. (2003) Cur. Biol. 13; 1429-34). Segundo, inibem a tradução produtiva de RNAms, que não conseguem localizar adequadamente e migram para as células somáticas. Terceiro, permitem a rápida degradação do RNAm em células somáticas, estabilizando ao mesmo tempo aquele mesmo RNAm em PGCs (Wolke et al. (2002) Cur. Biol. 12:289-94).

[0035] A natureza evolutivamente conservada da maquinaria responsável pela tradução do RNAm da célula germinal materna nas PGCs toma o uso de 3’UTR de célula germinal particularmente atraente para a distribuição de RNAm heterólogo específico em PGCs, e permite a aplicação desta abordagem em uma ampla faixa de espécies de hospedeiro alvo.

[0036] A presente invenção fornece um meio eficiente para conter a população. No caso de espécies cultivadas, as fêmeas transgênicas com MSCpodem produzir gerações múltiplas de progénie estéril, enquanto os machos transgênicos com MSC podem ser usados para propagar uma população transgênica com MSC fértil. Para as espécies invasivas e pestes, uma liberação única de machos transgênicos com MSC férteis na população pode resultar em diminuição ou erradicação acentuada em poucas gerações, dependendo do número de indivíduos liberados e do tamanho da população endógena. Nesta situação, os machos transgênicos com MSC carregam o “gene Trojan”, permitindo a geração contínua de fêmeas transgênicas com MSC e, assim, a produção contínua de machos estéreis. Os machos estéreis competem com machos não transgênicos pelas fêmeas, e a próxima geração é reduzida em tamanho. Um resultado similar pode ser atingido usando liberação em massa de machos estéreis, por exemplo, descendentes estéreis de uma fêmea transgênica com MSC. A liberação em massa de machos estéreis foi usada satisfatoriamente para reduzir a população de várias espécies de inseto (por exemplo, mosca varejeira, mosca do Mediterrâneo), usando irradiação como o método de esterilização (técnica de inseto estéril ou SIT).

II.Definições

[0037] Da maneira aqui usada, um “construto de expressão” refere-se amplamente a um construto de ácido nucleico, gerado recombinantemente ou sinteticamente, com uma série de elementos especificados de ácido nucleico, que permitem a transcrição de um ácido nucleico particular em uma célula hospedeira. O vetor de expressão pode ser parte de um plasmídeo, vírus ou fragmento de ácido nucleico. Tipicamente, o vetor de expressão inclui um ácido nucleico a ser transcrito operavelmente ligado a um promotor.

[0038] Um “construto de esterilidade materna” (MSC) refere-se a um construto de expressão que confere esterilidade na progénie de uma fêmea fértil, que carrega o MSC em suas células germinativas. O MSC compreende três elementos: um promotor específico de oócito que direciona a expressão de uma sequência de polinucleotídeos capaz de eliminar PGCs (por exemplo,uma sequência pró-apoptótica), e pelo menos um elemento de ação cis específico de célula germinal, tais como aqueles presentes na UTR 3’ de genes específicos da célula germinal. O elemento de ação cis(s) na 3 ‘UTR de genes específicos da célula germinal direciona o RNAm para o germoplasma no oócito/zigoto, e a seguir para PGCs. A presença do MSC na célula germinal da fêmea causa apoptose nas células germinativas primordiais (PGCs) de sua progénie, resultando em uma geração estéril.

[0039] Um “promotor” é amplamente definido como uma sequência de ácidos nucleicos controles que direciona a transcrição de um ácido nucleico. Um promotor pode incluir sequências necessárias de ácidos nucleicos próximas ao sítio de transcrição inicial, tal como, no caso de um promotor do tipo polimerase II, um elemento TATA. Os promotores podem ser constitutivos, indutíveis ou específicos de tecido.

[0040] Um “promotor de MSC” direciona a expressão de uma sequência de polinucleotídeos operavelmente ligadas durante a oogênese. Existem dois tipos de promotores de MSC: i) promotores de genes matemos e ii) promotores para a oogênese. Os genes matemos (tais como vasa e askopos) são expressos durante a oogênese pela mãe, e os produtos de gene (RNAm e proteína) são depositados ou mantidos no ovo maduro. Os produtos de gene materno estão envolvidos no destino celular e funções celulares básicas no desenvolvimento inicial. Os promotores para a oogênese (por exemplo, o promotor da zona pelúcida) são expressos durante a oogênese, mas os produtos de gene associados não são necessários para a função do embrião inicial. Da maneira aqui usada, os promotores de MSC também podem incluir aqueles das células auxiliares de inseto.Em algumas espécies de inseto, os oócitos são conectados às células auxiliares, que fornecem uma quantidade significativa de RNA e proteína ao oócito por meio de pontes citoplasmáticas.

[0041] Uma “sequência de polinucleotídeos capaz de eliminar ascélulas germinativas primordiais” (PGCs) refere-se a uma sequência de polinucleotídeos que, mediante a expressão de um MSC, resulta na morte de PGCs. Tais polinucleotídeos podem agir diretamente, por exemplo, codificando um gene pró-apoptótico tal como bax. O polinucleotídeo também pode agir indiretamente. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos inclui polinucleotídeos antissenso ou inibitórios (por exemplo, RNAsi ou RNAds) que reduzem especificamente a expressão de um gene anti-apoptótico tal como bcl-2. As PGCs também podem ser indiretamente eliminadas, bloqueando a migração ou o desenvolvimento adequado que resulta em apoptose. Assim, as sequências de polinucleotídeos que são capazes de remover PGCs incluem, por exemplo, polinucleotídeos para reduzir a expressão de receptores de quimiocina e aqueles que codificam receptores de quimiocina dominantes negativos.

[0042] Uma “sequência de polinucleotídeos pró-apoptóticos” refere- se a uma sequência de polinucleotídeos que, quando expresso em uma célula, causa apoptose na célula. A sequência de polinucleotídeos pró-apoptóticos pode compreender uma sequência codificante para um fator pró-apoptótico (por exemplo, Bax), ou uma sequência de polinucleotídeos inibidores para um fator anti-apoptótico (por exemplo, Bcl-2).

[0043] Um “elemento de ação cis específico de célula germinal”, ou “UTR 3’ específica de célula germinal”, é um intervalo não traduzido de sequência transcrita que direciona fisicamente o transcrito em uma parte da célula que é passado para PGCs. Por exemplo, um transcrito que compreende uma UTR 3’ específica de célula germinal e é produzido em um oócito será direcionado para uma parte do citoplasma (o germoplasma), que é herdado por PGCs futuras. É possível criar 3’UTRs sintéticas, ou usar combinações inéditas de elementos de ação cis específicos de célula germinal de 3’UTR, de diferentes origens, para atingir o mesmo efeito.

[0044] O termo "operavelmente ligado" refere-se a uma ligacao funcional entre uma sequência de controle de expressão de ácido nucleico (tal como um promotor, ou arranjo de sítios de ligação do fator de transcrição), e uma segunda sequência de ácidos nucleicos, em que a sequência de controle de expressão direciona a transcrição do ácido nucleico que corresponde à segunda sequência.

[0045] A frase “uma sequência codificante de ácido nucleico” refere- se a um ácido nucleico, que contém informação de sequência para uma sequência primária de aminoácidos de uma proteína ou peptídeo específico, uma sequência de polinucleotídeos inibidores que inibe especificamente a expressão de um gene particular, ou um sítio de ligação para um agente regulatório de ação trans. Esta frase inclui especificamente os códons degenerados (isto é, códons diferentes que codificam um aminoácido único) da sequência ou sequências naturais, que podem ser introduzidas para se ajustar ao códon de preferência em uma célula hospedeira específica.

[0046] Uma sequência de polinucleotídeos inibidores é uma que inibe a expressão de um gene alvo específico. Os polinucleotídeos inibidores incluem construtos antissenso ou construtos que expressam sequências invertidas (por exemplo, RNAsi, RNAsh) e aptâmeros, da maneira descrita com mais detalhes a seguir.

[0047] O termo “recombinante”, quando usado com relação, por exemplo, a uma célula ou ácido nucleico, proteína ou vetor, indica que a célula, ácido nucleico, proteína ou vetor foi modificado pela introdução de um ácido nucleico ou proteína heteróloga, ou pela alteração de um ácido nucleico ou proteína natural, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, um vetor de expressão recombinante pode incluir elementos de sequência que não são encontrados na proximidade de uma célula não recombinante.

[0048] Uma “fêmea de finalização de linhagem” é um animal que carrega um transgene do MSC em suas células germinativas. A progénie dafêmea de finalização de linhagem é estéril.

[0049] O termo “animal transgênico” refere-se a um animal que carrega uma sequência heteróloga de polinucleotídeos (transgene) em seu genoma, que é intencionalmente introduzida por técnicas recombinantes familiares na tecnologia. Os transgenes incluem em geral elementos de sequência que permitem a inserção no genoma do organismo hospedeiro, um promotor e/ ou outro elemento de expressão, um gene ou sequência de DNAc que codifica uma proteína ou uma sequência que inibe a expressão de um outro gene (por exemplo, uma sequência antissenso).

[0050] Um “animal fundador” refere-se a um animal de primeira geração que resulta da introdução recombinante de um transgene em uma célula embrionária ou outra célula progenitora. Em muitos casos, tais animais são mosaicos, de maneira tal que apenas algumas das células são derivadas da célula transgênica. É possível, entretanto, criar um animal a partir de uma única célula ou população de células, em que todas incluam o transgene.Se o animal fundador for de “linhagem germinal transformada”, ou carregar o transgene em suas células germinativas, ele pode produzir descendentes transgênicos.

[0051] Os termos “hemizigoto” e “homozigoto” são usados para se referir a organismos diplóides, e podem se referir a animais transgênicos.

[0052] Da maneira aqui usada, um animal transgênico hemizigoto carrega uma cópia do cromossomo onde o transgene está inserido, mas o pareamento de cromossomos não apresenta o transgene. Em alguns casos, o termo heterozigoto é usado indiferentemente com hemizigoto, refereindo-se ao mesmo tempo a um animal que carrega uma cópia de um cromossomo transgênico. Em um animal que é homozigoto com relação ao transgene, ambas as cópias do cromossomo incluem o transgene, de maneira tal que o animal carregue duas cópias do cromossomo transgênico.geral a um animal que não carrega o transgene do MSC.

[0053] O termo “estéril” refere-se a um individual ou população de indivíduos com capacidade significativamente diminuída para gerar descendentes, comparado aos indivíduos normais da mesma idade, espécie, etc.

[0054] Os termos “inibir”, ou “ativar”, ou “modular,” que se referem ao mesmo tempo à expressão ou atividade, não pretendidos como termos absolutos. Por exemplo, se um agente “não inibir” ou “não ativar” uma atividade, isto significa em geral que o agente não apresenta um efeito significativo, por exemplo, comparado a um controle ou uma faixa de controles. Os termos “reduzir”, “induzir” e “aumentar” e os termos similares relacionados são aqui usados para se referir às reduções, aumentos, etc., com relação a um valor controle. Os versados na técnica são capazes de determinar um controle apropriado para cada situação. Por exemplo, se um agente é dito para inibir a expressão do gene X, o nível de expressão X na presença do agente é reduzido comparado ao nível na ausência do agente. Se um agente é dito para induzir a esterilidade em uma dada população, o nível de esterilidade será aumentado na presença do agente comparado ao nível na ausência do agente.

[0055] Uma amostra ou valor “controle” refere-se a um amostra ou conjunto de condições que funcionam como uma referência, em geral uma referência conhecida, para comparação com uma amostra de teste. Por exemplo, uma amostra controle apropriada na presente invenção pode ser, por exemplo, gônadas ou células gonadais de um animal tipo selvagem. Um controle como este pode então ser comparado a uma amostra obtida de um animal que carrega um transgene do MSC ou um componente deste, ou um animal suspeito de carregar um transgene do MSC ou um componente deste. Um controle também pode representar um valor médio obtido de uma população de indivíduos similares, por exemplo, animais tipo selvagem com um perfil, idade, peso similares, etc. Os versados na técnica reconhecerão que os controles podem ser determinados para avaliação de qualquer número de parâmetros. Os controles também podem ser determinados para aplicações in vitro, por exemplo, testando a atividade de vários construtos em células cultivadas.

III.Técnicas recombinantes

[0056] A invenção envolve técnicas de rotina no campo da genética recombinante, por exemplo, para a preparação de MSCs. Os textos básicos que revelam os métodos geras de uso nesta invenção incluem Sambrook & Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (3a Ed, 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); e Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994- 1999).

[0057] As células eucarióticas e procarióticas podem ser usadas para clonagem e expressão de rotina. Estas incluem células animais, células de inseto, bactérias, fungos e leveduras, muitas das quais são disponíveis comercialmente. Os métodos para a introdução e expressão de ácidos nucleicos isolados ou heterólogos em uma célula são bem conhecidos e podem ser encontrados, por exemplo, na referência geral, supra. Dessa maneira, esta invenção também fornece células hospedeiras e vetores de expressão que compreendem as sequências de ácidos nucleicos aqui descritas.

[0058] Os ácidos nucleicos que incluem MSCs e componentes de MSC (descritos com mais detalhes a seguir) podem ser preparados usando técnicas recombinantes padrões ou sintéticas.Os ácidos nucleicos podem ser RNA, DNA, ou híbridos destes. Os versados na técnica podem construir uma variedade de clones contendo ácidos nucleicos fimcionalmente equivalentes, tais como ácidos nucleicos que codificam o mesmo polipeptídeo. As metodologias de clonagem para atingir estas finalidades e os métodos de sequenciamento para verificar a sequência de ácidos nucleicos são bem conhecidos na técnica.

[0059] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são sintetizados in vitro.Os desoxinucleotídeos podem ser sintetizados quimicamente de acordo com o método de fase sólida de triéster de fosforamidita descrito por Beaucage & Caruthers, Tetrahedron Letts. 22(20): 1859-1862 (1981), usando um sintetizador automatizado, por exemplo, da maneira descrita em Needham-VanDevanter, et al., Nucleic Acids Res. 12:6159-6168 (1984). Em outras modalidades, a sequência desejada de ácidos nucleicos pode ser obtida por uma reação de amplificação, por exemplo, PCR.

[0060] Os versados na técnica reconhecerão muitas outras maneiras de gerar alterações ou variantes de um dado polinucleotídeo ou sequência de polipeptídeos. Um ácido nucleico ou polipeptídeo desejado da invenção baseou-se nas sequências aqui referidas e no conhecimento facilmente disponível na técnica, com relação aos fatores pró e anti-apoptose, promotores específicos de tecido e elementos de ação cis.

[0061] Para obter expressão de alto nível de uma sequência desejada (por exemplo, uma sequência que resulta em remoção de PGCs), um vetor de expressão que é construído inclui tais elementos como um promotor para direcionar a transcrição, um finalizador de transcrição/tradução, um sítio de ligação de ribossomo para início da tradução e similares. Os promotores bacterianos adequados são bem conhecidos na técnica e descritos, por exemplo, nas referências que fornecem os métodos e protocolos de clonagem de expressão citados aqui anteriormente. Os sistemas de expressão bacteriana para expressar a ribonuclease são disponíveis em, por exemplo, E. coli, Bacillus sp. e Salmonella (ver também, Paiva, et al, Gene 22:229-235 (1983); Mosbach, et al, Nature 302:543-545 (1983). Os estojos para tais sistemas de expressão são disponíveis comercialmente. Os sistemas de expressão eucarióticos para células de mamífero, levedura e células de inseto são bem conhecidos na técnica e são disponíveis comercialmente.

[0062] Além do promotor, o vetor de expressão contém tipicamenteuma unidade de transcrição ou cassete de expressão que contém todos os elementos adicionais exigidos para a expressão do ácido nucleico em células hospedeiras. Um cassete de expressão típico contém assim um promotor operavelmente ligado à sequência de ácidos nucleicos que codifica a proteína ou polinucleotídeo inibidor, e sinais exigidos para poliadenilação eficiente do transcrito, sítios de ligação de ribossomo e finalização de tradução.

[0063] Da maneira observada anteriormente, o cassete de expressão também pode conter uma região de finalização de transcrição à jusante do gene estrutural para fornecer finalização eficiente. A região de finalização pode ser obtida a partir do mesmo gene, como a sequência promotora, ou pode ser obtida de genes diferentes.

[0064] O vetor de expressão particular usado para transportar a informação genética na célula não é particularmente importante. Qualquer dos vetores convencionais usados para a expressão em células eucarióticas ou células procarióticas pode ser usado. Os vetores de expressão bacterianos padrões incluem plasmídeos, tais como plasmídeos a base de pBR322, pSKF, pET15b, pET23D, pET-22b(+), e sistemas de expressão de fusão tais como GST e LacZ. As marcas de epítopo também podem ser adicionadas às proteínas recombinantes para fornecer métodos convenientes de isolamento, por exemplo, 6-his. Estes vetores compreendem, além do cassete de expressão que contém a sequência codificante, o promotor T7, iniciador e finalizador de transcrição, o sítio pBR322 ori, uma sequência codificante bla e um operador lacl.

[0065] Os vetores que compreendem as sequências de ácidos nucleicos com MSC podem ser expressos em uma variedade de células hospedeiras, incluindo E. coli, outros hospedeiros bacterianos, leveduras e várias células eucarióticas superiores, tais como as linhagens celulares COS, CHO e HeLa, e linhagens celulares de mieloma. Além das células, os vetores podem ser expressos por animais transgênicos.

[0066] Os vetores de expressão ou plasmídeos da invenção podem ser transferidos para a célula hospedeira escolhida por métodos bem conhecidos, tais como transformação por cloreto de cálcio para E. coli e tratamento com fosfato de cálcio, fusão lipossomal ou eletroporação para células de mamíferos. As células transformadas pelos plasmídeos podem ser selecionadas pela resistência aos antibióticos, conferida por genes contidos nos plasmídeos, tais como os genes amp, gpt, neo e hyg.

[0067] O nível de expressão de um gene pode ser determinado detectando RNAm, proteína, ou atividade de acordo com técnicas conhecidas na tecnologia. Por exemplo, os níveis de RNAm podem ser detectados usando Northern blots, PCR de transcrição reversa (RT-PCR), ou RT-PCR quantitativa (algumas vezes denominada PCR em tempo real). Tais técnicas são revisadas, por exemplo, em VanGuilder et al. (2008) Biotechniques 44:619 e Real-Time PCR: Current Tecnology and Applications, Caister Academic Press (2009). Os níveis de proteína podem ser detectados usando ensaios a base de anticorpo, por exemplo, Western blots ou ELISAs. Em algumas modalidades, a expressão de proteína pode ser confirmada detectando uma marca de proteína operavelmente ligada, por exemplo, GFP, 6-histina, ou biotina.

IV.Ácidos nucleicos inibitórios

[0068] Os ácidos nucleicos inibitórios incluem aqueles a base de tecnologia antissenso e pareamento de Watson-Crick, bem como aptâmeros. Os aptâmeros são sequências curtas (em geral 20-200 bases em comprimento) que se ligam a uma molécula alvejada por meio de interações não Watson- Crick, e podem incluir ácidos nucleicos modificados. O desenho e a seleção de aptâmeros específicos do alvo são conhecidos na técnica, por exemplo, da maneira descrita nas patentes U.S. 5270163, 5567588 e 5475096, e Klug e Famulok (1994) Mol. Biol. Reports 20:97-107. Os aptâmeros podem ser determinados para se ligar seletivamente e inibir um polipeptídeo antiapoptótico, similar a um anticorpo, de acordo com métodos conhecidos.

[0069] Um “ácido nucleico antissenso” é uma molécula de ácido nucleico não enzimático que se liga ao RNA alvo por meio de interações RNA-RNA ou RNA-DNA ou RNA-PNA e altera a atividade do RNA alvo (para uma revisão, ver Stein e Cheng ( 1993) Science 261 : 1004 e Woolf et al., patente U.S. 5.849.902). Tipicamente, as moléculas antissenso são complementares a uma sequência alvo ao longo uma sequência contíguo única da molécula antissenso. Para uma revisão de estratégias antissenso, ver Schmajuk et al. (1999) J. Biol. Chem., 274, 21783-21789, Delihas et al. (1997) Nature, 15, 751 -753, Stein et al. (1997) Antisense N. A. Drug Dev., 7, 15 1, Crooke (2000) Methods Enzymol, 313, 3-45; Crooke (1998) Biotech. Genet.Eng. Rev., 15, 121 - 1 57, Crooke (1997) Ad. Pharmacol, 40, 1-49. Além disso, o DNA antissenso pode ser usado para alvejar o RNA por meio de interações DNA-RNA, ativando por meio disso RNase H que digere o RNA alvo no duplex.Os oligonucleotídeos antissenso podem compreender uma ou mais regiões que ativam RNAse H, que é capaz de ativar a divagem da RNAse H de um RNA alvo. O DNA antissenso pode ser sintetizado quimicamente ou ser expresso por meio do uso de um vetor de expressão de DNA de fita simples, ou equivalente deste.

[0070] O RNA de interferência pequeno (RNAsi) pode ser usado para inibir a expressão de um gene anti-apoptótico. O RNAsi alvejado contra os transcritos reversos de HIV-1 foi satisfatório em células humanas (Nature Biotechnol. 20:500-505; Miyagishi M, e Taira K. (2002)). Os RNAsis direcionados ao promotor U6 com quatro projeções de uridina 3’ suprimem eficientemente a expressão alvejada de gene em células de mamífero (Nature Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. Genes & Dev. 16:948-958; Paul et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:505-508; Sui et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99(6):5515-5520; Yu (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99(9):6047- 6052.

[0071] “RNA de fita dupla” ou “RNAds” significa um RNA de fita dupla que se pareia com uma sequência de genes pré-determinada que é capaz de ativar enzimas celulares que degradam os transcritos de RNA mensageiro correspondente do gene. Estes RNAdss são referidos como RNAs de interferência pequenos (RNAsi) e podem ser usados para inibir a expressão do gene. O termo “RNA de fita dupla” ou “RNAds”, da maneira aqui usada, refere-se a uma molécula de RNA de fita dupla capaz de interferir no RNA, “RNAi”, incluindo RNA de interferência pequeno “RNAsi” (ver, por exemplo, WO 00/44895; WO 01/36646; WO 01/29058; WO 00/44914).

[0072] Uma molécula de ácido nucleico inibitória da presente invenção pode ter entre cerca de 10 e 100 nucleotídeos de tamanho. Por exemplo, as moléculas de ácido nucleico RNAi da invenção podem ter entre cerca de 15 e 50 nucleotídeos de tamanho, mais preferivelmente entre cerca de 25 e 40 nucleotídeos de tamanho (por exemplo, ver Jarvis et al. (1996) J. Biol. Chem., 271, 29107 291 12). Os versados na técnica reconhecerão que é exigido que a molécula de ácido nucleico seja de tamanho suficiente e conformação adequada para a molécula de ácido nucleico interagir com seu alvo.

V.Técnicas transgênicas

[0073] Os métodos de gerar animais transgênicos são conhecidos para inúmeras espécies. As referências gerais incluem: Transgenesis Techniques: Principles and Protocols, Clarke ed. 2002; Germ cell Protocols: Sperm and Oocyte Analysis, Schatten ed. 2004; e Fish Development and Genetics: The Zebrafish and Medaka Models, Gong & Korzh ed. 2004.

[0074] Resumidamente, um construto de expressão que compreende um transgene é introduzido em uma célula capaz de dar origem a um animal, tal como uma célula espermática, uma célula tronco embrionária ou outra célula progenitora. Isto pode ser realizado usando, por exemplo, técnicas de microinjeção ou eletroporéticas.A célula (ou células) progenitora que carregao transgene é então cultivada para produzir um animal que carrega o transgene.

[0075] Em muitos casos, o animal fundador carregará o transgene apenas em algumas das células, de maneira tal que o animal seja um mosaico genético. Entretanto, em alguns métodos, um animal pode ser crescido diretamente a partir de uma única célula progenitora que é transformada estavelmente para carregar o transgene. No último caso, o animal não será mosaico. O animal fundador é frequentemente referido como a geração F0. Os animais fundadores são cruzados, e os que assumem a transformação da linhagem germinal do fundador darão origem à geração Fl, com algumas destas progénies carregando o transgene.

[0076] Os métodos para gerar peixes transgênicos são revelados, por exemplo, em Mori & Devlin (1999) Mol. Cell.Endocrin.149: 129 e Collas & Alestrom (1997) Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 6:48-58. A transformação transgênica de insetos é descrita, por exemplo, em Kaiser & Goodwin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1686-90. Os métodos de gerar moluscos transgênicos são revelados, por exemplo, em Boulo et al. (1996) Mol. Mar. Bio.Biotechnol. 5: 167-74. Os métodos para gerar artrópodes transgênicos podem ser encontrados, por exemplo, em Presnail & Hoy (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7732-36. Os métodos de gerar anfíbios transgênicos (Xenopus) são revelados em Beck et al. (2001) Genome Biol. 2: 1029.

[0077] A presença do transgene do MSC pode ser acompanhada pela detecção direta do transgene, por exemplo, usando técnicas de PCR padrão ou hibridização específicas para sequências transgênicas. Assim como nos exemplos aqui descritos, os oligonucleotídeos iniciadores específicos para a junção entre bax e dead-end 3’UTR podem ser usados. Esta junção não existe no genoma do peixe tipo selvagem peixe. O transgene também pode ser determinado para incluir um marcador de gene dominante que codifica uma marca ou característica facilmente detectável. Por exemplo, podem ser usadosos genes que afetam a cor, pigmentação ou forma do corpo, ou que permitem a seleção condicional.

[0078] Uma abordagem é um processo seletivo que resulta na remoção (morte) de indivíduos que carregam o gene dominante ligado ao MSC. Por exemplo, a aplicação de um estímulo ou estresse que resulta na morte do indivíduo que carrega o gene dominante, ou a remoção de um estímulo/condição exigida para manutenção do transgene. Um outro método para selecionar os transgênicos pode ser realizado usando técnicas de seleção fluorescente, por meio das quais o gene dominante expressa as proteínas fluorescentes para possibilitar a identificação de indivíduos que carregam o transgene.

VI.Promotor de MSC

[0079] Os promotores de MSC que podem ser usados de acordo com a invenção são aqueles que são ativos durante a oogênese. A escolha do promotor para o MSC pode determinar a facilidade e eficiência do MSC em gerar fêmeas de finalização de linhagem e progénie estéril. Os promotores que direcionam a expressão de transcritos fornecidos matemalmente (promotores de genes matemos), que são produzidos durante a oogênese e estão presentes no ovo na fertilização, podem ser usados para alvejar os PGCs em embriões precoces. Os promotores adicionais (promotores para oogênese) que podem ser usados de acordo com a invenção são aqueles que são especificamente ativos em oócitos durante a oogênese, e cujo produto não é exigido para o desenvolvimento embrionário. Um promotor de MSC usado i) apresenta a atividade promotora restrita às fêmeas, ii) é ativo durante a oogênese e iii) é preferivelmente não ativo em outra parte, espacialmente ou temporalmente, no animal.

[0080] Os produtos de genes matemos (RNAm e proteína) são armazenados nos ovos maduros, onde estão envolvidos no destino celular e funções celulares básicas no desenvolvimento inicial. Estes produtos de genesão ativos em geral antes da ativação do genoma zigótico na transição média da blástula (Kane e Kimmel ( 1993) Dev. 119:447-56). Os genes estritamente matemos são expressos durante a oogênese, e esta expressão materna é tanto exigida quanto suficiente para realizar todas as funções do gene no embrião inicial. Os genes estritamente matemos, portanto, funcionam independentemente dos genótipos do embrião e do pai. No peixe zebra, esta categoria de genes inclui genes tais como futile cycle, janus, nebel e ichabod.

[0081] Um promotor de MSC, ligado à UTR 3’ apropriada, que é temporalmente e espacialmente restrito ao oócito, é vantajoso em decorrência de: 1) contribuição materna dos transcritos para os oócitos que alvejam PGCs precoces durante o desenvolvimento embrionário, quando a população de PGC é pequena e pode ser completamente eliminada, e 2) a expressão do transgene apenas da fêmea permitir a propagação da linhagem estéril por meio dos machos transgênicos. Os machos transgênicos que carregam o MSC não expressarão o transgene e permanecerão férteis. Esta abordagem, portanto, elimina a necessidade de algum mecanismo para a esterilidade reversa. Em decorrência da expressão do transgene ocorrer nos oócitos antes da meiose ter ocorrido, o produto do transgene estará presente em todos os ovos produzidos por fêmeas transgênicas heterozigotas. Embora apenas a metade da progénie das fêmeas com MSC herdem o transgene, toda a progénie será estéril.

[0082] Os exemplos s seguir descrevem o uso da região regulatória à montante do gene askopos, específico materno (4.623kb:kop), e o gene zona pellucida, específico de oogênese (634 bp:zpc3b), para uso no MSC (Baler et al. (2005) J. Cell Sei. 11 8:4027-38; Onichtchouk et al. (2003) Dev. Dynamics 228:393-404).

[0083] Vários outros promotores do gene candidato podem ser usados para atingir a expressão materna, incluindo promotores de outros genes específicos de germoplasma. Os promotores específicos de oogênese, taiscomo zorg e OORP-T (Dai et al. (2009) Theriogenology 71 :441 -49; Ramachandra et al. (2007) Mol. Reprod. Dev. 74) também podem ser usados.

[0084] Em Drosophila, os exemplos de promotores de genes matemos incluem aqueles dos genes bicoid, hunchback, nanos e caudal. Estes genes participam do estabelecimento de eixos e linhagem germinal. Nos peixes zebra, os genes específicos matemos que controlam o desenvolvimento foram identificados tanto por meio de seleção genética funcional quanto por hibridização in situ, seguido por análise de redução da função do gene (por exemplo, askopos).

[0085] Uma ampla categoria de promotores de genes matemos pode ser obtida de genes que foram mais extensivamente estudados em invertebrados e vertebrados. Estes são genes específicos de linhagem germinal, cujo o RNAm é encontrado no germoplasma, e incluem: nanos, dead-end (dnd), DazL, GasZ, granulito, tudor, bruno-like, vasa, oskar, tudor (TDR7), ziwi, zorg, germ-cell-less (gel) (Strasser et al. (2008) BMC Dev. Biol. 8:58; Suzuki et al. (2000) Mech. Dev. 93:205-09).

[0086] Em Anopheles gambiae, o promotor vasa foi caracterizado (Papathanos et al. (2009) BMC Mol. Biol. 10:65) e o estudo de uma proteína vasa de crustáceo sustenta a contribuição materna.Em Xenopus, os genes matemos incluem aqueles que codificam Vg-1 e VegT, Xcat2, Xpat, e Xdazl.

[0087] Os promotores adicionais para a oogênese, que podem ser usados de acordo com a invenção, são aqueles que são ativos especificamente nos oócitos durante oogênese e cujo produto não é exigido para o desenvolvimento embrionário. Muitos genes nesta categoria estão no controle de um promotor único e codificam proteínas que são vitais para a oogênese, foliculogênese ovariana e fertilização tal como, por exemplo, proteínas da zona pelúcida, OORP-T, fator em linhagem germinal alfa (FIGLa), fator de crescimento 9 (GDF9) e proteína morfogenética do osso 15 (BMP-15). Os promotores da família do gene zona pellucida (zpc) podem ser usados. Ospeixe zebra transgênico contendo cópias estavelmente integradas de promotores de peixe zebra zpc3 ligados à proteína verde fluorescente (GFP) foram gerados, e resultam na expressão de GFP em um padrão de montagem daqueles dos genes endógenos zpc. A primeira linhagem transgênica usou 412 bp de sequência à montante do códon ATG de um homólogo zpc3 de única cópia (Onichtchouk D. et al., 2003; Del Giacco L. et al., 2000)) (Liu X. et al., 2006). Os elementos de sequência conservada CCAAT dos genes de peixe zebra arranjados em tandem, zpc2 e zpc3, são necessários para esta expressão no desenvolvimento de oócitos (Mold et al., 2009). Uma outra categoria de genes inclui aqueles que se alteram de um promotor somático para um promotor de oogênese, tal como o gene Xenopus TFIIIA, que é transcrito a partir de promotores separados no oócito e tecido somático (Kim et al. (1990) Genes Dev. 4: 1602).

[0088] As sequências aqui referidas foram caracterizadas para muitas espécies, e as sequências são publicamente disponíveis, por exemplo, no Genbank. Os versados na técnica podem determinar qual sequência (por exemplo, espécies homólogas, poucos variantes) pode ser usada vantajosamente em cada situação sem experimentação indevida.

[0089] A capacidade de um promotor candidato direcionar a expressão de gene em um estágio particular pode ser determinada de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, tal como pelos métodos revelados nas referências anteriores. De maneira ideal, a identidade da célula (por exemplo, linhagem e estágio do desenvolvimento) é detectada simultaneamente com um marcador celular conhecido. Por exemplo, as PGCs podem ser marcadas com um construto que expressa GFP, da maneira descrita nos exemplos (promotor zpc - egfp - dnd 3’UTR). Pode-se detectar a expressão de um transcrito ou produto de proteína à jusante do promotor candidato usando técnicas padrões de biologia molecular, por exemplo, RTPCR, qRTPCR, Northern ou Western blots. Altemativamente, o transcritoou produto de proteína pode ser detectado microscopicamente, usando uma soda ou anticorpo marcado detectavelmente. Por exemplo, um promotor candidato pode ser ligado a uma sequência que codifica GFP ou proteína fluorescente liminar, e ser inserido em uma população de células, tais como oócitos. A expressão do promotor pode então ser acompanhada e comparada, por exemplo, à expressão de um promotor conhecido.

VII.Sequências de polinucleotídeos capazes de remover células germinativas primordiais

[0090] A invenção inclui um elemento para remover PGC, expresso em PGCs. Entretanto, a expressão também pode ocorrer em oócitos e embriões iniciais (da maneira ilustrada com o construto do gene repórter na figura 2, A1-2 e BI-2, e Figura 3). A fim de remover especificamente apenas PGCs, o gene efetor pode não apresentar ou apresentar apenas efeito limitado nos oócitos e células somáticas em embriões iniciais. Com isto em mente, os reguladores de gene apoptótico são de particular interesse neste sistema, em decorrência dos oócitos e embriões antes da gastrulação serem naturalmente resistentes à apoptose.

[0091] Os polinucleotídeos e polipeptídeos aqui referidos foram caracterizados para muitas espécies, e a sequências são disponíveis publicamente, por exemplo, no Genbank. Os versados na técnica podem determinar qual sequência (por exemplo, homólogos de espécies, poucos variantes) pode ser vantajosamente usada em cada situação sem experimentação indevida. Por exemplo, uma base de dados disponível publicamente que descreve os elementos da família Bcl-2 pode ser encontrada em bcl2db.ibcp.fr/site/.

[0092] Os estudos aqui descritos dependem de bax como o gene para promover a apoptose em PGCs. Os genes pró-apoptóticos substitutos incluem outros elementos da família bax, tais como bak e bok, e aqueles que incluem a classe de proteína apenas BH3, tais como Bad, Bik, Puma e Noxa. Emexperimentos preliminares, observa-se que o RNAm zbik-dnd 3’UTR pode induzir o desaparecimento de PGCs marcadas com GFP em embriões 24 horas após a injeção, similar àquele observado em experimentos realizados com RNAm bax-dnd 3’UTR.

[0093] A apoptose é realizada pela ativação de caspases à jusante. A conversão de uma pró-caspase inativa em uma caspase efetora induz a clivagem de substrato específico, ativação de DNAses, e a demolição da célula. Assim, as caspases efetoras podem ser usadas de acordo com a invenção para eliminar especificamente PGCs. Entretanto, se a resistência de oócitos e células somáticas embrionárias iniciais à apoptose derivar de uma etapa inicial na via (por exemplo, antes da liberação do citocromo c), existe um risco de que estas células também se submeterão à apoptose.

[0094] A apoptose é regulada pelo equilíbrio entre moléculas pró e anti-apoptóticas. O limite apoptótico de uma célula pode ser rompido tanto por meio da maior expressão de genes pró-apoptóticos, quanto por menor expressão de genes de pró-sobrevivência. Como tal, a regulação negativa alvejada de genes anti-apoptóticos tal como bcl-2, bcl-xl, ou bcl-w, também pode levar à morte celular. A regulação negativa alvejada de genes anti- apoptóticos pode ser atingida usando ácidos nucleicos inibitórios (por exemplo, antissenso).As proteínas da família de anti-apoptótica Bcl-2 podem formar heterodímeros com bax e outras proteínas pró-apoptóticas, e funcionam à montante da via apoptótica. Esta abordagem é, portanto, preferível para a estratégia de gene de pró-caspase gene para preservar não PGCs.

[0095] A remoção de células germinativas primordiais pode ser atingida indiretamente por meio da alteração do mecanismo envolvido em sua migração ou especificação. Durante a migração normal, as células germinativas que migram inadequadamente morrem em decorrência de não conseguirem atingir regiões do embrião que permitem a sobrevivência. Amolécula responsável por atrair as PGCs de peixe zebra para a gônada futura é SDF-I a, uma quimiocina secretada por células somáticas.As PGCs expressam o receptor correspondente, CXCR4p. A regulação negativa do receptor por um promotor específico de oócito alterará a migração de PGC e levará à ativação da apoptose nestas células. Novamente, a regulação negativa de genes específicos em PGCs pode ser atingida usando ácidos nucleicos inibitórios, tal como antissenso. Nenhuma proteína adicional é expressa nas abordagens antissenso, assim, o processo de revisão regulatória pode ser facilitado. O sucesso desta estratégia depende da ausência da função redundante ou adicional, realizada pelo gene regulado de forma negativa durante o desenvolvimento inicial. Outros genes implicados na migração de PGC, e usados para a presente invenção, incluem ggtl, hmgcr e dead-end. Os genes implicados na especificação de PGC incluem, por exemplo, vasa e nanos.

[0096] Uma outra estratégia para remover PGCs é a expressão de um alelo mutante negativo dominante do receptor de membrana c-kit ou CXCR4P (Fleischman (1992) J. Clin. Invest. 89: 1713; Spritz et al. (1992) Am. J. Hum. Genetics 50:261). A expressão do receptor negativo dominante em PGCs poderia interromper o fator de crescimento de Steel e a sinalização mediada por SDF-I a, respectivamente.

[0097] A capacidade de um elemento candidato para remover PGC causar a morte celular em PGCs pode ser testada de acordo com métodos conhecidos. A sequência candidata de polinucleotídeos para remover PGC pode ser expressa in vitro em uma população de PGCs e comparada a: (i) uma população de PGCs sem a expressão, e/ ou (ii) uma população de PGCs que expressa uma sequência conhecida por causar a morte celular em PGCs, por exemplo, bax.

[0098] A morte celular por apoptose é detectável em geral usando um microscópio para observar as células.A apoptose causa vários efeitosexclusivamente reconhecidos em células: encolhimento, vesículas do tipo bolha na superfície, degradação da cromatina, rompimento mitocondrial e liberação de citocromo c, ruptura em pequenos fragmentos envolvidos por membrana, exposição da fosfatidilserina na superfície celular. A inflamação é inibida por células fagocíticas locais que secretam, por exemplo, IL-10 e TGF-β. Muitos destes sinais apoptóticos podem ser facilmente observados, e estojos disponíveis comercialmente também podem ser usados para detectar a apoptose, por exemplo, estojos de ELISA e de ensaio TUNEL.

VIII.3’UTR específica de célula germinal

[0099] Os elementos de ação cis podem determinar a localização de um transcrito no citoplasma antes da tradução começar. Estes elementos de ação cis são comumente localizados na região não traduzida 3’ (3’UTR). As sequências na 3’UTR são reconhecidas e direcionadas dessa maneira, por exemplo, por motores moleculares ou proteínas de sequestro. Uma revisão dos elementos de ação cis pode ser encontrada, por exemplo, em Jambhekar et al. (2007) RNA 13:625-42.

[00100] Um dos primeiros exemplos reconhecidos deste fenômeno foi a proteína bicóide de Drosophila. Os transcritos bicóides são direcionados para uma extremidade de um oócito em desenvolvimento e, mediante tradução, o bicóide é localizado na porção anterior da célula. Isto permite a localização adequada da atividade bicóide para a formação da cabeça e tórax no embrião em desenvolvimento.

[00101] Certos elementos de 3’UTR estão envolvidos na localização de RNAm em oócitos, e direcionam transcritos para o germoplasma, que se desenvolve em células germinativas primordiais. Estes elementos são 3’UTRs específicas de célula germina. As sequências de 3’UTRs específicas de célula germinal são altamente conservadas de maneira evolutiva entre os animais, onde as células germinativas são especificadas por um determinante herdado matemalmente, isto é, pré-formação (ver Extravour e Akam (2003)Development 130:5869-84). A 3’UTR dos genes dead-end (dnd 3’UTR) e nanosl (nanos 3’UTR) de peixe zebra pode ser usada para atingir a expressão específica em PGCs. Em peixe zebra, ambos os genes foram identificados originalmente como um RNAm maternal que se localiza nas células germinativas primordiais (Koprunner et al. (2001) Genes & Dev. 15:2877-85; Weidinger et al. (2003) Curr. Biol. 13 : 1429-34). Esta localização foi presumidamente por meio da ação de um elemento de RNA de ação cis em sua 3’UTR.

[00102] Além daquelas de dead-end e nanos, várias outras 3’UTR que pertencem aos RNAms específicos do germoplasma podem ser usadas neste sistema. Estas incluem aquelas de DazL, GasZ, vasa, tudor7, do tipo bruno e granulito.

[00103] A repressão translacional e estabilidade diferencial de RNA de germoplasma são sintonizadas por RNAmicro e repressores de RNAmicro. Junto com os motivos de ação cis na 3’UTR do RNA de germoplasma, observa-se que o RNAmicro e seus repressores são evolutivamente conservados e funcionalmente permutáveis através de vertebrados inferiores que variam de peixes a sapos (Knaut et al. (2002) Cur. Biol. 12:545-66).

[00104] Dada a natureza altamente conservada dos elementos de ação cis específicos da célula germinal, estas sequências podem ser determinadas sinteticamente, por exemplo, de fragmentos de elementos conhecidos.Qualquer região não traduzida que direciona os transcritos de RNAm no germoplasma ou PGC pode ser usada, de acordo com os métodos da invenção.

[00105] A atividade de localização específica de célula germinal pode ser detectada de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, a localização de um transcrito de RNAm compreendendo um elemento de ação cis específico de célula germinal candidata pode ser detectada usando técnicas de hibridização, por exemplo, com uma sonda de oligonucleotídeo marcadadetectavelmente específica para uma subsequência do transcrito de RNAm. Altemativamente, o produto de proteína pode ser detectado, por exemplo, usando uma marca de proteína, tal como GFP. A capacidade de uma sequência particular direcionar os produtos de gene no germoplasma pode ser testada ligando a sequência de teste à uma sequência que codifica GFP, ou alguma outra proteína detectável, e pode ser visualizada usando técnicas de microscopia.

IX.Animais e aplicações da invenção

[00106] Da maneira explicada anteriormente, a invenção pode ser usada para produzir populações de animais estéreis, e é aplicada vantajosamente em espécies cultivadas comercialmente, bem como espécies invasivas ou pestes.

[00107] A invenção pode ser usada para animais cujas células germinativas são especificadas por determinantes herdados matemalmente, de acordo com um processo de “pré-formação”. Estes determinantes maternais estão presentes no germoplasma (ou plasma polar), uma zona encontrada no citoplasma das células de ovo de organismos evolutivamente distantes (por exemplo, Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster, peixe zebra e Xenopus laevis). Dessa maneira, a invenção pode ser usada, por exemplo, em peixe, anfíbio, marisco, crustáceos, moluscos, insetos e outros artrópodes. À medida que o zigoto se submete às divisões mitóticas, o germoplasma é finalmente restrito a poucas células do embrião. Estas células germinativas migram então para as gônadas e se diferencial eventualmente em ovos ou esperma funcionais.

[00108] O peixe e marisco são um foco principal em decorrência destes animais (i) poderem reproduzir e sobreviver em um ambiente selvagem e serem propensas a estabelecer populações selvagens, (ii) apresentarem parentes naturais, aumentando a possibilidade do gene fluir nestes ou em competição com eles, (iii) poder ser geneticamente modificados para produzirlinhagens com melhores taxas de crescimento, resistência à doença, ou razão de conversão de alimento. A proteção de propriedade intelectual também é importante para certas espécies de peixe de aquário ou de estimação, tal como GlowFish®. Esta tecnologia fornece um meio para produzir populações de macho monossexuais sem o tratamento hormonal (que é indesejável por razões ambientais). Todas as populações de macho são vantajosas em espécies onde os machos crescem mais rápido que as fêmeas (por exemplo, tilápia).

[00109] Existem vantagens econômicas para o peixe estéril. O peixe estéril melhora o desempenho da cultura. Na aquicultura moderna de peixe ósseo, taxas elevadas de crescimento fazem com que os peixes cativos amadureçam sexualmente mais cedo do que os animais tipo selvagem, e antes do peixe atingir o tamanho comercial ideal. A maturação sexual precoce reduz o crescimento, deteriora a qualidade da came (cor, sabor e textura) e aumenta a mortalidade. Os peixes estéreis nunca se submetem à maturação sexual e, como uma consequência, apresentam (i) uma melhor razão de conversão de alimento, uma vez que a energia não é perdida no desenvolvimento da gônada; (ii) melhor taxa de crescimento e (iii) uma condição comercial principal, que é mantida em todo o período de reprodução.

[00110] Os insetos são uma outra aplicação importante. Existe uma necessidade crescente de uma tecnologia para controlar insetos do tipo peste que podem substituir machos estéreis induzidos por radiação para liberações em massas (SIT). Os obstáculos de SIT, que dependem da irradiação, incluem (i) a necessidade de liberações repetidas, (ii) separação de sexo demorada para evitar a liberação de insetos fêmea (que frequentemente apresentam mais impactos negativos em humanos, gado e culturas agrícolas), (iii) radiação por ionização frequentemente afeta a saúde do macho, tempo de vida e desempenho do acasalamento, que toma-os menos capazes de competir com os machos selvagens, (iv) a técnica é espécie-específica, e (v) custos elevados.

[00111] As técnicas de esterilidade induzida matemalmente da invenção removem a necessidade de facilidades de radiação, permitem a produção barata de populações estéreis de macho monossexuais; resultam em machos estéreis ajustados e saudáveis, e aplicam-se a um amplo arranjo de espécies.

[00112] Notavelmente, uma liberação única de indivíduos estéreis de acordo com a invenção pode ser usada para controlar pestes e espécies invasivas. As espécies alvo exemplares incluem moluscos (por exemplo, mexilhão zebra, Ampullariidae, Bithynia tentaculata, Cipangopaludina chinensis, Corbicula fluminea, Dreissena polymorpha, Potamopyrgus antipodarum, Rapana venosa), peixes (por exemplo, Alosa pseudoharengus, Channa argus, Cyprinus carpio, Gymnocephalus cemuus, Hypophthalmichthys molitrix, Hypophthalmichthys nobilis, Monopterus albus, Neogobius melanostomus, Oreochromis aureus, Petromyzon marinus, Pylodictis olivaris) e insetos (por exemplo, hemiptera (Aphis melinus), diptera (mosquitos e moscas, tais como mosca tsetse, Rhagoletis pomonella, Ceratitis capitata, Anastrepha ludens), lepidoptera (por exemplo, Agrotis munda, Euxoa auxiliaris) e coleoptera (por exemplo, o besouro do pinho da montanha Dendroctonus ponderosae, Xyleborus glabratus, Diaprepes abbreviatus).

[00113] Uma linhagem facilmente reprodutível de insetos estéreis permitiria a modificação genética de espécies benéficas (por exemplo, abelhas) para melhorar as características desejáveis (resistência à doença, resistência aos inseticidas), ou introduzir o mecanismo para interromper a transmissão de doença em mosquitos ou outros insetos vetores. Para fundamentar estas aplicações, ver, por exemplo, os artigos de Braig & Yan e Spielman em Genetically engineered organisms: assessing environmental and human health effects (2002), páginas 251 e 315, respectivamente; e Wimmer (2003) Nat. Rev. Gen. 4:225-32.

[00114] A invenção também pode ser usada para gerar embriõesdesprovidos de PGCs endógenas para funcionar como hospedeiros para o transplante de células germinativas derivadas de espécies evolutivamente distantes. As PGCs podem ser marcadas facilmente (da maneira aqui descrita) e isoladas de organismos vivos (por exemplo, usando dissecção de tecido enzimático e citometria de fluxo).As PGCs também podem ser transplantadas nos embriões, onde podem se diferenciar adicionalmente em esperma funcional ou ovos no organismo receptor. O transplante xenogênico foi realizado satisfatoriamente e mostra que as PGCs transplantadas se desenvolvem em sincronia com gametas endógenos e são funcionais (Ciruna et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 99: 14919-24; Takeuchi et al. (2004) Nature 430:629-30; Saito et al. (2008) Biol. Reprod. 78: 159).

[00115] Se o tempo necessário para atingir a maturação sexual for menor para a espécie hospedeira do que para a espécie doadora, ou se a espécie hospedeira puder ser criada mais eficientemente (tamanho menor, técnicas de criação mais fáceis), esta tecnologia pode reduzir o tempo, custo, espaço de criação e trabalho associado com a produção de descendente para aquicultura comercial. Além do mais, o xenotransplante pode ser usado para conservação genética. A aplicação em grande escala desta tecnologia exige: (i) substituição completa da linhagem germinal e (ii) produção barata e eficiente de embriões hospedeiro para o transplante. Ambas estas exigências são atendidas usando a tecnologia de aqui descrita.

[00116] Entende-se que os exemplos e modalidades aqui descritos são apenas para propósitos ilustrativos. Os versados na técnica entenderão que várias modificações ou mudanças na invenção atualmente revelada devem ser incluídas no espírito e no alcance desta revelação, e no escopo das reivindicações em anexo. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados pela referência na sua íntegra para todos os propósitos.

X.Exemplos Material e Métodos

[00117] Manutenção do animal, produção e fertilização do ovo: Os peixes zebra (cepa tipo selvagem e linhagens transgênicas) foram mantidos em sistemas de cultivo de recirculação e cultivados em água condicionada a 28,5 °C em um ciclo de 14 horas na luz/10 horas no escuro. Os peixes zebra adultos foram alimentados diariamente com alimento em flocos (TretraMin).Os embriões obtidos por desova espontânea foram alimentados duas vezes ao dia com camarão de água salgada vivo.Os embriões foram coletados e separados por estágio da maneira descrita (Kimmei et al (1995) Dev. Dyn. 203, 253-310).Todos os experimentos foram conduzidos em um protocolo aprovado pela IACUC. Para a truta arco-íris (O. mykiss) e o salmão do atlântico (Salmo salar), os gametas foram mantidos a 4 °C em oxigênio por no mínimo 4 dias. A cada dia, um a dois lotes de ovos foram fertilizados (25 mL de ovos com 1-2 mL de esperma).A ativação e fertilização do esperma foram realizadas em solução de Ringers para prevenir o endurecimento do córion do ovo. Para cada lote de ovos injetados, -100 de ovos não microinjetados foram mantidos para controle da fertilização. Os ovos injetados e não injetados foram colocados no sistema incubador/de criação (água de recirculação a 8-10 °C). A taxa de fertilização/sobrevivência foi ensaiada em lotes de ovos controle a -20 dias após a fertilização.

[00118] Construtos: Vetores I-Scel zpc:zbax:dnd (MSCzpc) e I-Scel kop:zbax:dnd (MSCkop): Um fragmento de 1.093 bp de Ncol-Pstl, contendo bax:dnd 3’UTR, foi digerido e purificado a partir do vetor que foi desenvolvido para uso nos estudos preliminares (Litmus 28i-bax dnd). O fragmento purificado foi subclonado em Ncol-Pstl digerido e em partes principais do vetor purificado em gel I-Scel zpc:egfp:dnd ou kop:egfp:dnd. As ligações foram transformadas em células competentes 10F’ (Invitrogen), plaqueadas e as colônias transformantes foram selecionadas para identificaros dois plasmídeos que carregam os cassetes de expressão Bax flanqueados pelos sítios I-Scel.

[00119] Vetor Litmus 28i-eGFP:nosl: Os oligonucleotídeos iniciadores foram determinados para amplificar uma 3’UTR nanos 1 (nosl) de 610 pb: (sentido: 5’-GCGAAGCTTGATGCTCCGGGAGATTTG-3’ (SEQ ID NO: 1) e antissenso 5’-CCCAAGCTTAGAGAAAATGTTTAT ATTTTCC-3 ‘ (SEQ ID NO:2)), ambos os quais incluíram o sítio de restrição Hindlll na extremidade dos oligonucleotídeos iniciadores. A PCR foi realizada usando o DNA genômico de peixes zebra (20ng e 600ng). A reação foi realizada por 30 ciclos na condição térmica a seguir: 94 °C por 30 segundos, 56 °C por 30 segundos, e 72 °C por 55 segundos. O produto de PCR foi clonado no vetor de plasmídeo PCR-TOP02.1 (Invitrogen). 3’UTR nanos 1 foi então subclonada entre os sítios Hindlll de Litmus 28i-eGFP:dnd para gerar Litmus 28i-eGFP:nosl (Figura 3A2). Os plasmídeos com nosl na orientação correta, (análise de digestão de restrição Sphl) foram selecionados para a reação de transcrição.

[00120] Litmus 28i-ss bax:nosl: Os oligonucleotídeos iniciadores que flanqueiam uma sequência bax de Salmo salar (acesso NCBI # BT048648) foram determinados usando seleção de oligonucleotídeo iniciador (5’- ATGGCAGACTCCCGAGAAAGAAG-3’ (SEQ ID NO:3) e 5’-TCAGCG TGTTTTCCTCCAGTAA-3’ (SEQ ID NO:4)), e foram usados para amplificar uma sequência codificante ssbax de 615 pb. A PCR foi realizada usando DNAc de salmão atlântico (20ng e 600ng) gerado do músculo, glândula pituitária e tecido do baço. A reação foi realizada por 30 ciclos na condição térmica a seguir: 94 °C por 30 segundos, 60 °C por 30 segundos, e 72 °C por 40 segundos. Um produto de PCR do tamanho esperado foi identificado em gel de agarose a partir da reação contendo DNAc do baço. O produto de PCR foi clonado no vetor de plasmídeo PCR-TOP02.1 (Invitrogen). O fragmento ssbax EcoRI de ~620pb foi digerido a partir dovetor TOPO, purificado por gel e ligado no Limus 28i-eGFP:nosl previamente linearizado com EcoRI, purificação em gel e tratado com fosfatase alcalina. Os novos construtos resultantes (Litmus 28i-ssbax:nosF) com o inserto na orientação sentido e antissenso foram transformados em células competentes de E.coli (Invitrogen). Os plasmídeos clonados foram selecionados por digestão de restrição (Hind III) para selecionar o vetor de expressão apropriado.

[00121] Microinjeção: Os embriões de peixe zebra foram microinjetados usando tecnologias estabelecidas com um Microinjetor de pressão (FemtoJet, Eppendorf, Alemanha). Antes da microinjeção, os 2 construtos com MSC foram amplificados, purificados (estojo maxiprep da Qiagen (Qiagen, USA)) e linearizados com Iscei (New England Biolab). Os dois plasmídeos foram microinjetados com meganuclease I-Scel (DNA: 10 g/pL; tampão comercial de meganuclease (Tampão da New England, USA): 0,5 mL de meganuclease I-Scel: 1 unidade/pL; 0,1 % de vermelho fenol) por meio do córion no citoplasma dos embriões em estágio de uma célula.

[00122] Detecção dos transgenes de MSCs e GFP p qRT-PCR: Todos os peixes zebra injetados apurados com ~1 mês de idade foram anestesiados, tiveram as nadadeiras recortadas foram colocados individualmente em jarras pequenas, enquanto seu DNA da nadadeira foi extraído (sistema robótico de R Corbett) e foi genotipado usando PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) para identificar peixes mosaicos. Os ovos fertilizados a partir do cultivo de um macho mosaico com uma fêmea tipo selvagem foram coletados e o DNA foi extraído a partir de 3 lotes de 7 embriões. O DNA foi amplificado por PCR em condições definidas (94 °C, 30 segundos, 58 °C, 30 segundos, 72 °C, 45 segundos) usando oligonucleotídeos iniciadores determinados para amplificar a junção específica com MSC entre bax e dnd (bax sentido: 5’-GTTATTTTGGCACCCCCACCTG-3 ‘ (SEQ ID NO:5), dead end reverso: 5’-CAATCACATTCGATCAAGCCATAA-3’ (SEQ ID NO:6). O transgene de GFP foi detectado usando um conjunto de oligonucleotídeos iniciadores específicos de GFP, sentido: 5’-TACGGCG TGCAGTGCCTTC-3’ (SEQ ID NO:7), reverso: 5’-TGCGCTCCTGGAGT AGC-3’ (SEQ ID NO:8). O DNA que codifica a beta-actina foi usado como um padrão de referência interna. Todos os conjuntos de oligonucleotídeo iniciador foram determinados com um pacote de software comercial (Primer Select DNAstar), usando parâmetros idênticos para gerar amplicons de tamanho similar.

[00123] Experimentos de sobrexpressão in vivo: Os plasmideos que continham eGFP:dnd, eGFP.nosl, zbax:dnd e ssbaxmosl (z: a partir de peixes zebra, ss, Salmo salaf) foram linearizados por Ncol digerido, e a reação de transcrição in vitro foi realizada segundo as instruções do fabricante (Message Machine T7 Kit (Ambion Inc., Austin, TX)). Os RNAs quiméricos com adição de nucleotideo guanina modificado sintetizados foram extraídos com fenol/clorofórmio, precipitados com etanol e dissolvidos em água sem RNAse em uma concentração final de 100-300 ng/uL. O RNAm com adição de nucleotideo guanina modificado sintético sentido foi injetado em embriões de peixe zebra no estágio de uma célula. Para o salmão atlântico e truta arco- íris, -2-20 nL das soluções de RNA foram microinjetados no blastodisco por meio da micrópila dos embriões entre 10 minutos e 4 horas após a fertilização. Os ovos fertilizados que são foram injetados foram colocados no sistema de cultivo de ovo para controlar satisfatoriamente a fertilização/sobrevivência. Para ensaiar a funcionalidade bax de peixe zebra, os embriões tratados de Salmo salar foram co-injetados com RNAm eGFP:nosl (50 pg/embrião) e RNAm zbax:nosl (50-150 pg/embrião). Os embriões controle foram injetados com RNAm eGFP:nosl sozinho (50 pg/embrião) e RNAm zbax: nosl sozinho, e os embriões tipo selvagem (WT) não receberam nenhuma injeção.

[00124] Análise do desenvolvimento de PGC: As PGCs foramanalisadas primeiro nos embriões no estágio prim-5 (~24 hpf), quando mais de 95 % das PGCs migraram para a região da crista genital. Os embriões vivos foram visualizados com microscopia de fluorescência, e o desenvolvimento de PGC foi analisado contando o número de PGCs em cada lado das cristas genitais, e o número de PGCs ectópicas. Para a coloração de laranja de acridina (AO), os embriões vivos foram descorionados manualmente em 24 hpf e colocados em AO, em 16,7 #g/mL, no meio do embrião por 20 minutos. Os embriões foram anestesiados em ácido 3-amino- benzóico a 0,0003 % e colocados em microscopia fluorescente para análise.

[00125] Histologia: Para a histologia, o tecido foi fixo por toda a noite em fixador de Bouin (Sigma), desidratado, e infiltrado em parafina. As seções de parafina foram cortadas a 0,5 pm e coradas com hematoxilina e eosina (Pacific Histology, San Diego, CA).

[00126] qRT-PCR e RT-PCR: As gônadas foram isoladas de macho e fêmea de peixe zebra estéril, parcialmente fértil e tipo selvagem macho de 2-3 meses de idade. O tecido foi coletado em reagente Trizol (Sigma) e o RNA foi extraído seguindo as instruções do fabricante. A transcriptase reversa MNLV foi usada para a síntese da primeira fita de DNAc. As reações de controle sem transcriptase reversa foram realizadas em paralelo. O RNA preparado por qRT-PCR foi tratado com DNAse I. Os oligonucleotídeos iniciadores a seguir foram usados para reação de RT-PCR (letra maiúscula) e qRT-PCR (letra minúscula): vasa sentido: 5’-TGGACTATATTTTCCTTGCT GTTG-3’ (SEQ ID NO:9) e 5’-cgtgagtggcagcaatcct-3’ (SEQ ID NO: 10); zbvasa reverso 5’-TATTCCCATTCCTCATCGTCTGC-3’ (SEQ ID NO: 11) e 5’-gtgtaggcttcacatatccag-3’ (SEQ ID NO: 12); zb sox9a sentido: 5’- CACCCTACGCTGGAGGATACG-3’ (SEQ ID NO: 13) e 5’cggtgaagaacg gccagagc-3’ (SEQ ID NO: 14); zb sox9a reverso 5’-CCATCATGCACTG AACGAACA-3’ (SEQ ID NO: 15) e 5’-ctgtagagtcagcaatgggt-3’ (SEQ ID NO: 16); β-actina sentido: 5’-GACATCAAGGAGAAGCTGTGC-3’ (SEQID NO: 17) β-actina reverso: 5’-GAGGAGGGCAAAGTGGTAAAC-3’ (SEQ ID NO: 1 8); e cypl9ala sentido 5’-CTGCTAGCCATCAGACACCA- 3’ (SEQ ID NO: 19); cypl9ala reverso: 5’-ATCCTGCAACTCCTG AGCAT-3’ (SEQ ID NO:20).

[00127] Análise de dados: Os números totais de PGC representam a soma de crista genital e PGCs ectópicas. A média total de PGCs e a média de PGCs ectópicas foram comparadas estatisticamente usando um teste t não pareado, ajuste de significância em P < 0,05.

Exemplo 1: Prova principal usando peixes zebra

[00128] Para avaliar a funcionalidade do construto de esterilidade materna (MSC) e documentar a remoção de PGCs em um organismo modelo, criou-se peixes zebra transgênicos que produzem 3’UTR bax-dnd de RNA no controle tanto de um promotor específico de oócito zona pellucida ou askopos (Figura 5A). Se a 3’UTR bax-dnd de RNA contribuída matemalmente for expressa durante a oogênese e permanecer presente nos ovos, o desenvolvimento embrionário resultará em indivíduos que não apresentam células germinativas. O resultado será uma geração estéril, ou que pode ser denominada um fenótipo estéril.

[00129] Para remover as PGCs, dependeu-se da ativação da maquinaria apoptótica intrínseca por sobre-expressão ectópica do gene pró-apoptótico bax de peixe zebra. Bax pertence a uma família de reguladores chaves de proteína de apoptose (família Bcl-2 (van Delft & Huang (2006) Cell Res. 16:203-13)) que contêm tanto elementos anti-apoptóticos (por exemplo, Bcl-2 e Bcl-XL) quanto pró-apoptóticos (por exemplo, Bax, Bik, Bad). A razão destas moléculas é um determinante importante do destino celular. A expressão elevada de gene anti-apoptótico favorece a maior sobrevivência das células, aumentando ao mesmo tempo os níveis de expressão de gene pró-apoptótico que acelera a morte celular. O controle preciso de morte celular para remover PGCs anormais, inadequadas ou em excesso é essencial para manter acontinuidade e integridade da linhagem germinal, prevenindo as células germinativas de colonizar locais sem ser as gônadas. Bax mostrou estar envolvido na apoptose da célula germinal na gônada de macho e fêmea em rato e camundongo (Knudson et al. (1995) Science 270:96; Perez et al. ( 1999) Nature Gen. 21 :200-03; Yamamoto et al. (2000) Soc. Study Reprod. 63: 1683-90; De Felini et al. ( 1999) Cell Death e Diff. 6:908-15). Bax e outros genes pro-apoptóticos também mostraram estar envolvidos na morte de PGCs, que são direcionadas inadequadamente durante a migração do sítio de origem para a gônada em embrião de peixe zebra, truta e camundongo (Stallock et al. (2003) Development 130:6589-97). Entretanto, a remoção de PGCs por expressão ectópica de Bax, ou qualquer outra proteína distribuída transgenicamente, não foi relatada.

[00130] Para demonstrar inicialmente a viabilidade desta abordagem, gerou-se um plasmídeo com bax-1 de peixe zebra fundido à 3’UTR do gene dnd de peixe zebra, no controle de um promotor T7 (Figura 4A). Preparou-se uma 3’UTR bax-dnd de RNAm sintético com adição de nucleotídeo guanina modificado a partir deste construto in vitro (Figura 4B), e injetou-se várias concentrações (80pg a 2ng) nos embriões de peixe zebra no estágio de 1-2 células, a partir de uma fêmea transgênica que expressa GFP do promotor zpc e com uma dnd-3’UTR (da maneira mostrada na figura 2, esta linhagem transgênica produz PGCs marcadas com GFP).

[00131] Os grupos de 15-20 embriões foram usados para cada dose de RNAm. Nas concentrações mais baixas, nenhuma diferença específica na sobrevivência foi observada entre grupos injetados com RNAm e o controle não injetado. As concentrações maiores ativaram a mortalidade embrionária dose-dependente (Figura 4C), caracterizada pela desintegração dos blastômeros e vitelo logo após a transição de blástula média. Isto sugere que altas doses de Bax-1 induz a apoptose em embriões. A redução da quantidade de hax-dnd-’3UTR de RNAm injetada resulta em menor mortalidade.Osembriões injetados com 400pg de RNA, que sobreviveram à gastrulação e pareceram fenotipicamente normais, foram analisados em microscopia fluorescente (Figura 4 F e G) e comparados com embriões irmãos injetados com PBS (Figura 4 D e E).

[00132] Os resultados demonstraram que PGCs em 3’UTR bax-dnd de RNA injetadas em embriões morreram: (i) PGCs fluorescentes em embriões tratados com RNA diminuíram muito em número ou ficaram completamente ausentes em embriões 48 hpf (horas após a fertilização), e (ii) PGCs em embriões injetados com RNA em 18-24 horas após a fertilização exibiram mudanças morfológicas que incluíram a formação de bolha na membrana, seguido pela formação de corpos apoptóticos característicos de células que se submetem à morte celular programada (Figura 4 H, I, J) (Rich et al. (1999) Nat. Cell. Biol. l:E60-71). Estes embriões não mostraram nenhuma deficiência somática, uma vez que continuaram a se desenvolver. Os embriões injetados com RNA foram aumentados para 20 até a maturidade e observou- se que todos se desenvolveram em machos fenotípicos (Figura 4K) que exibiram comportamento sexual de macho normal (ovas induzidas durante o pareamento com fêmeas tipo selvagem). Os irmãos injetados com PBS controle produziram tanto a progénie de macho quanto de fêmea com uma razão de sexo de ~50 % (Figura 4K).Além disso, 12 dos 20 peixes tratados com bax ficaram completamente estéreis, a se julgar pela sua incapacidade de fertilizar ovos em três acasalamentos consecutivos.Para confirmar o fenótipo estéril, dissecou-se a gônada de machos estéreis e encontrou-se uma estrutura do tipo tubo translúcido (Figura 4M) no lugar da estrutura ovoide opaca encontrada no macho fértil (Figura 4L).

Exemplo 2: Linhagem germinal transmissível por peixe zebra transgênico

[00133] A seguir, criou-se o peixe zebra transgênico que carrega os dois construtos estéreis matemos, zpc:zbax:dnd (MSCzpc) e kop.zbax:dnd (MSCkop) (Figura 5 A). Os vetores foram injetados em dois lotes de 200 ovos fertilizados. Uma taxa de sobrevivência de 60-70 % foi registrada três dias após a microinjeção. Com um mês, os embriões sobreviventes (~50 %) tiveram cortes na barbatana para detectar indivíduos que carregam o transgene. Dos 66 e 80 peixes selecionados, 25 (37 %) e 34 (42 %) foram testados como positivos para os transgenes MSCkop e MSCzpc, respectivamente. Os peixes que permaneceram positivos para PCR aumentaram até a maturidade sexual, os machos sexados e identificados foram cruzados com fêmeas tipo selvagem reprodutoras para determinar sua capacidade de transmitir o construto à sua progénie. Dos 11 e 13 machos selecionados para MSCkop e MSCzpc, respectivamente, 2 e 4 produziram pelo menos um grupo de embriões positivos em PCR (3 grupos de 7 embriões foram selecionados para cada par parental).

[00134] Estes 6 fundadores machos capazes de transmitir a linhagem germinal foram cruzados com fêmeas heterozigotas que carregam tanto construtos zpc eGFP:dnd (GFPzpc) quanto kop:eGFP:dnd (GFPkop). As mesmas linhagens GFP foram usadas em todos os cruzamentos subsequentes para estabelecer um marcador para avaliações de célula germinal.A progénie (~ 10-50 embriões/fundador/construto) a partir destes cruzamentos aumentou para ~1 mês e foi selecionada por PCR para identificar o peixe que carrega os transgenes MSC e GFP. Em média, 3 dos 10 embriões testados como positivo para o(s) MSC(s) (33,5 % +/- 9 %) indicaram um grau relativamente baixo de mosaicismo em linhagem germinal MSC. Estes peixes Fl evoluíram para a maturidade e foram sexados. No geral, identificou-se 19 machos Fl e 20 fêmeas Fl positivas para os MSCs (Figura 5B). A razão de sexo igual observada na progénie Fl derivada de fundadores machos transgênicos sugere que não existe nenhum efeito paterno ou zigótico do transgene na determinação do sexo. Utilizou-se machos e fêmeas Fl de cada linhagem para produzir a próxima geração de peixe transgênico com MSC.

Exemplo 3: Confirmação de remoção de PGC em embriões em desenvolvimento F2

[00135] Um máximo de 3 machos F1 e 3 fêmeas F1 por linhagem foi usado para estabelecer as linhagens. Os embriões F2 derivados de fêmeas que carregam tanto os transgenes de GFP quanto de MSC fora analisados por microscopia fluorescente, e os números de PGC (isto é, células positivas para GFP) foram registradas em 24 e 48 horas após a fertilização (hpf). Se os transgenes estiverem realmente na expressão materna específica, espera-se fêmeas Fl com MSC para produzir embriões com PGCs reduzidas ou ausentes, com relação aos embriões controle (isto é, aqueles produzidos por fêmea reprodutora com GFP). Mais de 90 % e 70 %, respectivamente, de todos os embriões das fêmeas F1 das linhagens MSCzpc22 e MSCzpc9 perderam completamente as células GFP+ visíveis. Ao contrário, as fêmeas F1 das linhagens MSCzpcl 1 e MSCzpc3 produziram apenas 5-10 % de embriões sem nenhum célula com GFP+ detectável. As três fêmeas F1 da linhagem MSCkop2 também produziram 30-80 % de embriões sem nenhum padrão GFP+. Além do mais, todos os outros embriões produzidos por fêmeas com GFP e MSC apresentaram números de PGCs que variam de normal a acentuadamente reduzido. Os números médios de PGCs por embrião (n=20) coletados de cada fêmea F1 são mostrados na figura 5E.

[00136] Os embriões F2 produzidos por fêmeas reprodutoras com GFP cruzadas com machos F1 tipo selvagem ou com MSC apresentaram aproximadamente 30 PGCs (Figura 5E), uma contagem normal (Yoon et al. (1997) Development 124:3157), sugerindo que nenhum efeito paterno ou zigótico do transgene do MSC em PGCs sobrevive.

[00137] Análise de deficiência precoce em PGCs. Para determinar mais precisamente o estágio no qual PGCs se tomam defeituosas, os embriões derivados da fêmea MSCzpc3 foram monitorados, os quais produziram embriões com contagens de PGC em 24 e 48 hpf variando de normal a zero (Grupo A, B e C respectivamente (Figura 5D)). Em 30 % epibolia (afinamento e aspersão de camadas de célula durante a gastrulação, ~5 hpf) observa-se células GFP em todos os embriões (Figura 5C1). Em ~10hpf, os grupos de embrião com números de PGC reduzidos poderiam ser identificados de maneira evidente.

[00138] Morte de PGC por apoptose. Em embriões onde as células GFP+ desapareceram eventualmente, detectou-se PGCs com sinais morfológicos de apoptose, tal como a formação de bolha na membrana, seguido pela formação de corpos apoptóticos. Os embriões derivados de fêmea Fl com MSC que não apresentam o construto GFP (Figura 5C2, linhagem MSCzpcll) foram corados com o corante vital laranja de acridina (AO, cloreto de acridina hemi-(cloreto de zinco)), e analisados em microscopia fluorescente. Da maneira mostrada na figura 5C2, as células verdes fluorescentes apareceram como um agrupamento na origem da gônada. Esta observação sugere que a esterilidade é em virtude da apoptose inicial das células germinativas primordiais. A confirmação adicional de que o fenótipo estéril de efeito materno é em virtude da apoptose induzida por bax ser mostrada em experimentos de resgate, da maneira descrita s seguir.

[00139] Em peixes zebra, a sobrexpressão de Bcl-XL bloqueia a apoptose induzida por uma dose letal mínima de Bax (Kratz et al. (2006) Cell Death & Differentiation 13:1631 - 1640). A 3’UTR bcl-XL: dnd de RNAm sintético com adição de nucleotídeo guanina modificado foi produzida, e foi microinjetada uma titulação deste transcrito em embriões em estágio uma célula derivados de fêmeas com MSC. Dos 10 embriões que sobreviveram à injeção, 8 se tomaram machos, enquanto 2 se tomaram fêmeas.Todos os 10 foram férteis. Os irmãos controle não injetados (n=20) foram todos machos e 90 % deles ficaram estéreis. Para testar se a ausência da expressão de GFP em 48 hpf é um indicador confiável de esterilidade, foram escolhidos embriões positivos e negativos para GFP em linhagens MSCzpc3 e MSCkop2, e estesforam destacados separadamente para maturação sexual (—3-4 meses). Os embriões da linhagem MSCzpc3 foram separados adicionalmente em grupos de 0-2; 3-6; e 7-13 PGCs (Figura 5D). Observa-se uma correlação evidente da esterilidade em um adulto e do número de PGCs observadas em um embrião.

Exemplo 4: Demonstração de esterilidade funcional direcionada maternalmente em adultos

[00140]As fêmeas transgênicas com MSC produzem preferivelmente descendentes machos. Os embriões de peixe (peixe zebra e medaka) com células germinativas reduzidas ou ausentes antes da diferenciação sexual desenvolvem-se como macho (Houwing et al. (2007) Cell 129:69-82; Slanchev et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 102:4074-79; Kurokawa et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sei. 104: 16958-63). Aqui, os machos foram identificados visualmente com base na forma do corpo, coloração e ausência de papilas urogenitais. Em todas estas linhagens, observa-se uma forte tendência para desenvolvimento de macho. Embora a tendência para macho tenha variado entre as linhagens, o número de machos foi consistentemente em excesso em 70 % na progénie de pelo menos 6 fêmeas Fl com MSC diferentes cruzadas com macho tipo selvagem (Figura 5B). De maneira interessante, a fêmea Fl com MSC que produz embriões com a deficiência em PGC mais forte (>85 % de redução no teor de PGC em embriões das linhagens MSCzpc9, zpc22, Figura 5E) também produziu a tendência mais forte para macho (90-100 % de macho) (Figura 5B). A masculinização da progénie não foi observada nos cruzamentos entre machos com MSC Fl e fêmeas tipo selvagem (machos com MSC herdado do pai produzem a progénie de 50 % de macho e 50 % de fêmea), e a progénie ficou fértil (Figura 5B). A variação do nível de penetração do fenótipo estéril pode ser em virtude das diferenças nos sítios de integração sites, número de cópia do transgene no genoma, ou processos epigenéticos que afetaram principalmente os níveis de expressão do transgene entre as diferentes linhagens.

[00141] A progénie de MSCzpc3 sexada foi previamente escolhida para contagem de PGC. Os embriões que apresentaram menos de 3 PGCs (n=12) desenvolveram-se todos como machos. Entre 3 e 6 PGCs resultaram em 70 % dos embriões que se desenvolvem como machos (n=10). Os embriões que apresentaram entre 7 e 13 PGCs desenvolveram-se com uma razão de sexo normal, apesar da redução acentuada nas contagens de PGC. Assim, uma redução de mais de 90 % das PGCs em 48 hpf gerará uma população de peixe zebra toda de machos.

[00142] As fêmeas transgênicas com MSC produzem progénie estéril (fenótipo estéril). Para determinar se a redução em número e/ou remoção completa de PGCs resulta em taxas reduzidas de fertilização e/ou peixe estéril, testou-se a progénie de machos F2 de três linhagens (MSCzpc9, MSCzpc22 e MSCkop2).Estes machos induziram todos satisfatoriamente as fêmeas tipo selvagem a colocar ovos. A soma de todos os ovos fertilizados e não fertilizados foi registrada após 2-3 acasalamentos consecutivos (Figura 7D).Observa-se que estas 3 linhagens exibiram penetração variada de um fenótipo “estéril”.Apenas um dos 14 machos F2 da linhagem MSCzpc22 produziu progénie viável.Este macho apresentou uma baixa taxa de fertilização de -15 %.Na linhagem MSCzpc9, apenas 33 % (4/12) dos machos produziu progénie viável.Suas taxas de fertilização variaram entre 20 e 80 %. Finalmente, todos os embriões negativos para GFP (aqueles sem PGCs visíveis) na linhagem MSCkop2 desenvolveram-se como indivíduos estéreis, enquanto todos (10/10) os embriões positivos para GFP se tomaram adultos férteis. Os embriões positivos para GFP, escolhidos com tão pouco quanto 1-3 PGCs visíveis, se tomaram férteis, indicando que um pequeno número de células germinativas que sobrevive pode ter sucesso em repovoar a gônada. Não observou-se nenhuma deficiência de fertilidade na progénie de machos transgênicos com MSC cruzados com fêmeas reprodutoras com GFP.

[00143] A expressão materna do transgene é necessária e suficientepara a esterilidade. Estes estudos preliminares com linhagens reprodutoras com GFP indicaram a expressão específica de oócito sem nenhuma expressão zigótica do transgene (nenhum GFP detectado em embriões de GFPzpc ou GFPkop macho cruzado com fêmea tipo selvagem). Como tal, a partir da fêmea com MSC Fl, pode-se esperar distribuição similar do transgene entre os peixes F2 irmãos férteis e estéreis. Em qRT-PCR, observa-se ~65 % e ~68 % MSC positivos respectivamente em embriões negativos para GFP (n=36 provavelmente estéreis) e em embriões positivos para GFP (n=34 provavelmente férteis), a partir da linhagem MSCkop2. Isto sugere uma herança mendeliana de duas cópias do transgene (75 %) em ambos os grupos. Confirmou-se a existência de adulto estéril não transgênico na linhagem MSCzpc22, onde 4 dos 12 peixes F2 estéreis não apresentam o transgene. Estes resultados confirmam adicionalmente que a herança materna é suficiente para a esterilidade. Assim, a herança materna do transgene do MSC resulta tanto em progénie estéril transgênica quanto não transgênica.

[00144] Estrutura da gônada em peixe zebra estéril. Para confirmar a esterilidade no nível celular e molecular, avaliou-se a morfologia completa e a estrutura celular da gônada em peixe estéril F2 e indivíduos férteis controle combinados por idade. Os peixes controle apresentam em geral gônadas moldadas e pareadas. Ao contrário, os peixes estéreis apresentam um par de estruturas de tipo tubo translúcido em cada lado da cavidade peritoneal (Figura 6A). Esta observação é consistente com os resultados do experimento de injeção de 3’UTR bax-dnd do RNAm (Figura 4M). As seções histológicas coradas com hematoxilina e eosina revelaram que as gônadas de peixes estéreis apresentam túbulos organizados, que se assemelham aos testes compostos de células que se assemelham às células de Sertoli e Leydig específicas de testes.Estes testes do tipo tubo perdem completamente as células germinativas (Figura 6C).

[00145] Desenvolvimento da gônada em embriões com númeroreduzido de PGC. Os peixes selecionados do grupo com 1-3 PGCs, que mostraram menor taxa de fertilização, apresentaram tanto para idêntico de gônada menor, mas em geral moldada, quanto apresentaram gônada dimórfica com um pequeno tamanho em um lado do abdômen e uma segunda gônada que se assemelha àquela observada em indivíduos estéreis. O tamanho reduzido da gônada continha pouquíssimos espermatozóides no lumem do lóbulo quando comparado às gônadas de macho tipo selvagem (Figura 6E).

[00146] Gônadas sem células germinativas são testículos. Para confirmar que a estrutura do tipo tubo dissecada em peixe estéril é uma gônada de macho, mediu-se por PCR em tempo real quantitativa (qRT-PCR) o nível de expressão de sox9a (Chiang et al. (2001) Dev. Biol. 231:149-163), um marcador de gene específico para as células de Sertoli. Sox9a foi expresso em gônadas de peixe estéril em um nível similar aos testículos tipo selvagem, indicando que as células de Sertoli estão presentes (Figura 7A, barras azuis). Para confirmar adicionalmente que nenhuma tecido de fêmea estava presente, ensaiou-se cypl9a la, que é expresso nos ovários, mas não nos testículos (Kishida & Gallard (2001) Endocrinology 142: 740). Assim como nos testículos de machos tipo selvagem, no houve detecção da expressão de cypl9a la (Figura 7A, barras vermelhas). Para avaliar adicionalmente o efeito do transgene em PGCs no nível molecular, comparou-se os níveis de expressão de um marcador de gene específico de célula germinal (vasa) na gônada dissecada de peixes zebra estéril parcialmente fértil e tipo selvagem (completamente fértil). A expressão de vasa não foi detectada por qRT-PCR em peixe estéril. Observou-se expressão elevada em peixes tipo selvagem, e um nível de expressão intermediário em peixes com fertilidade reduzida (Figura 7C).Estes resultados confirmam a observação histológica de que a linhagem germinal está ausente em peixe estéril. A análise por PCR da expressão de gene sox9a, vasa e β-actina, na gônada dissecada de três peixes estéreis e quatro tipo selvagem (dois machos e duas fêmeas), indicaadicionalmente que o tecido dissecado no peixe estéril contém células somáticas específicas de testículos (sox 9a positivo), mas nenhuma célula germinativa (vasa negativo) (Figura 7B).

Exemplo 5: O fenótipo de esterilidade está associado ao nível de expressão de transgene do MSC e pode ser propagado.

[00147] Observa-se que a gravidade do fenótipo induzido matemalmente (% de machos e progénie estéril) correlaciona-se bem com o nível de 3’UTR bax-dnd de RNAm materno (por qRT-PCR) nos ovos fertilizados (Tabela 1).A linhagem com MSC com o fenótipo com tendência a macho/estéril mais forte (por exemplo, MSCzpc22) expressou os níveis mais elevados de 3’UTR bax-dnd de RNAm. Uma linhagem transgênica, com fraca tendência a macho (por exemplo, MSCzpc3) e descendentes principalmente estéreis, expressou níveis muito baixos do transgene do MSC. As linhagens com fenótipos intermediários apresentaram níveis intermediários de expressão de transgene. Esta correlação é usada de maneira extrema como um indicador da força do fenótipo materno, e pode ser usada para selecionar as linhagens com MSC estéreis mais penetrantes em seleção inicial.Tabela 1

[00148]Tabela1: Correlação entreo nívelde RNAmMSC emembriões (F2, F3), produzidos a partir de duas gerações subsequentes de fêmeas com MSC (F1 e F2), e o percentual de a) descendentes machos e b) progénie estéril. O percentual de macho e progénie estéril é derivado do exame de n (número fornecido) adultos para cada linhagem. Os níveis de 3’UTR bax:dnd do RNAm em embriões iniciais foram determinados por q- PCR, a partir de uma média de 4 grupos de ovos para pelo menos duas fêmeaspara cada linhagem. Os níveis de expressão foram normalizados no gene de controle β-actina e expressos como um percentual do maior nível de expressão medido na linhagem MSCzpc22. SD: desvio padrão.

[00149] O fenótipo de esterilidade pode ser propagado.As linhagens transgênicas propagadas por meio da linhagem de macho mantiveram um fenótipo de esterilidade forte por pelo menos 2 gerações.Observa-se níveis muito similares de RNAm MSC em embriões produzidos por fêmeas Fl e F2 (Tabela 1, embriões F2 e F3), sugerindo que o fenótipo de esterilidade é mantido entre gerações subsequentes. De fato, com poucas exceções, confirmou-se que as fêmeas com MSC Fl e F2 MSC (produzidas a partir de machos F0 e Fl da mesma linhagem) produzem descendentes que exibem uma tendência a macho similar e fenótipo de esterilidade comparável. Os casos raros, onde observou-se a redução dos níveis de RNAm MSC em gerações subsequentes e a diminuição da força do fenótipo, foram provavelmente em virtude do menor número de cópias de transgenes do MSC associadas à herança mendeliana de integrantes múltiplos do transgene. Dessa maneira, observa-se fenótipos similares de macho e esterilidade nas progénies F2 e F3 a partir das fêmeas com MSC Fl e F2.

Exemplo 6: Aplicação em outros peixes ósseos

[00150] Expressão de PGCs alvejada em salmonídeos. O peixe zebra e Salmonidae pertencem a diferentes ciados de peixe (ostariophyans e euteleósteos, respectivamente), onde a maquinaria de localização de RNA no germoplasma pode estar envolvida de maneira diferente. Procurou-se determinar se a 3’UTR dead end (dnd) e nanosl (nosl) do peixe zebra pode alvejar a tradução do RNA nas células germinativas nos salmonóides salmão atlântico (Salmo salar) e truta arco-íris (Oncorhynchus mykiss). A 3’UTR nanosl (nosl) de peixe zebra foi usada neste estudo, uma vez que seu papel para a localização do RNA parece ser conservada entre as espécies de teleósteos que pertencem a todos os principais ciados da árvore filogenéticade peixe (dânio pérola, peixe dourado, bótia, manjuba, medaka e goby gelo) (Saito et al. (2006) Dev. Biol. 50:691). Para esta finalidade, gerou-se o vetor de transcrição de alto rendimento que direciona eGFP fundido na 3’UTR dos genes dnd e nosl (Figura 8A 1 -2).

[00151] Preparou-se RNAm sintético eGFP:dnd e eGFP: nosl com adição de nucleotídeo guanina modificado a partir destes construtos in vitro e injetou-se várias concentrações nos peixe zebra em estágio de 1 célula (controle), embriões, e trutas arco-íris fertilizadas e ovos de salmão atlântico (entre 10 minutos e 3 hpf). Após a microinjeção, a expressão ubíqua de GFP foi observada em todos os blastômeros em embriões de peixe zebra (Figura 8Z3), mas a expressão enfraqueceu rapidamente nas células somáticas (Figura 8Z1). O GFP forte apareceu nas PGCs logo após sua especificação (Figura 8Z1). As PGCs marcadas com GFP ficaram evidentemente visíveis em embriões de peixe zebra de 2 dias (Figura 8Z4).

[00152] Examinou-se a expressão do padrão de GFP em embriões de salmão de 20 dias (Figura 8S1) injetados com eGFP:nosl (Figura 8S1 -2), e embriões de truta de 30 dias (Figura 8T3) tratados tanto com RNAm eGFPmosl (Figura 8T3-4) quanto com eGFP:dnd (Figura 8T1 -2). Observa- se que ~30 % de todos os embriões examinados exibiram brilho fluorescente em tomo das células moldadas, localizadas em duas linhagens entre o trato digestivo e o lado dorsal da cavidade peritoneal (Figura 8S&T). Este padrão de expressão de GFP é similar àquele observado em embriões de truta arco- íris que receberam RNA eGFP:vasa (Yoshizaki et al. (2005) Biologly of reproduction 73:88). Este resultado confirma que a 3’UTR dnd e nosl de peixe zebra pode distribuir o RNAm e, subsequentemente, a expressão de proteína heteróloga para as PGCs de truta e salmão. A natureza evolutivamente conservada da maquinaria responsável pela tradução do RNAm de célula germinal materna nas PGCs toma o uso de 3’UTRs de célula germinal particularmente atraente para a distribuição de RNAm heterólogo,específico para PGCs para uma ampla faixa de espécies alvo.

[00153] Remoção de PGCs. Para demonstrar que o transgene pode funcionar em espécies distantes, testou-se se a sobrexpressão ectópica de bax de peixe zebra e/ou Salmo solar pode remover PGCs em Salmo salar e/ou peixe zebra, respectivamente. Amplificou-se por PCR e subclonou-se um novo DNAc de Salmo salar (ssbax), cujo nucleotídeo e sequências de aminoácidos traduzidos foram 94 % e 99 % idênticos ao regulador apoptótico Bax publicado na internet (Salmo salar, Leong et al. cGRASP). Fundiu-se ssbax à 3’UTR nanosl de peixe zebra e colocou-se este cassete em um vetor de transcrição. A partir deste construto (Figura 8C1), produziu-se RNA com adição de nucleotídeo guanina modificado sintético ssbax:nosl e injetou-se várias concentrações em embriões de peixe zebra em estágio de um célula. Microinjetou-se os embriões da fêmea reprodutora com GFP para comparar o padrão de expressão de GFP em embriões tratados e não tratados.

[00154] Observou-se uma redução acentuada na contagem de PGC em embriões microinjetados comparados ao controle injetado de maneira simulada (Figura 8C3). Os embriões sem PGCs detectável não mostraram nenhuma deficiência somática. Estes resultados suportam a noção de um mecanismo bem conservado de morte celular programada nestes ciados de teleósteos distantes. Para confirmar adicionalmente esta reivindicação, produziu-se RNAm bax:dnd de peixe zebra a partir do plasmídeo linearizado (Litmus 3’UTR 2&Í-T1 :bax:dnd). Os embriões de salmão em estágio de uma célula fertilizados foram divididos em três grupos e microinjetados com: (i) RNAms zbax:dnd e eGFP:nosl (RNAm de GFP é usado para marcar a célula germinal), (ii) RNAm eGFP: nosl sozinho e (iii) RNAm zbax:dnd sozinho. Em decorrência do lote de ovos fertilizados neste estudo apresentarem um taxa de sobrevivência pequena (ver tabela 2), a análise de GFP foi realizada em um tamanho deamostra pequeno. Apesar disso, 3 dos 9 embriões tratados com eGFP:nosl exibiram células com GFP detectáveis, enquanto nenhum sinal de GFP foi observado em nenhum dos 6 embriões tratados com eGFP:nosF, zbax:dnd (Tabela 2).Tabela 2

Claims (8)

1.Construto de expressão isolado, caracterizado pelo fato de que compreende: (i)um promotor do construto de esterilidade materna (MSC) que é ativo durante a ovogênese, em que o promotor MSC é selecionado a partir do grupo consistindo de zona pelúcida (zpc) e askopos (kop); (ii)um polinucleotídeos pró-apoptótico que, quando expressado em uma célula germinativa primordial (PGC) provoca a eliminação da PGC, em que o polinucleotídeo apoptótico é selecionado a partir do grupo consistindo de: bax, bak, bok, bad, bik, puma, noxa, e uma caspase efetora; e (iii)uma região não traduzida 3’ específica de célula germinal (UTR), em que a 3’UTR é uma 3’UTR de um gene selecionado a partir do grupo consistindo de deadend e vasa, em que (i), (ii), e (iii) estão operavelmente ligados.

2.Construto de expressão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a sequência de polinucleotídeos pró- apoptóticos reduz a expressão de um gene selecionado do grupo que consiste em: bcl-2, bcl-xl e bcl-w.

3.Método para produzir um peixe fêmea de finalização de linhagem, caracterizado pelo fato de que compreende: (i)introduzir o construto de expressão como definido na reivindicação 1, em uma célula progenitora de um peixe para gerar um animal fundador transgênico com construto de esterilidade materna (MSC) que carrega o construto de expressão em sua célula germinal; (ii)reproduzir o peixe fundador transgênico com MSC da etapa (i) para produzir um macho transgênico com MSC hemizigoto; (iii)reproduzir o peixe macho transgênico com MSC com um peixe fêmea que não apresenta o MSC; e (iv)selecionar a progénie de peixe fêmea transgênica com MSC da etapa (iii) para obter um peixe fêmea de finalização de linhagem, em que o peixe fêmea de finalização de linhagem é capaz de produzir uma geração estéril de progénie.

4.Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o peixe fêmea de finalização de linhagem carrega pelo menos um transgene não MSC adicional.

5.Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa (v) de cruzar o peixe fêmea de finalização de linhagem com um peixe macho para gerar a progénie de peixe estéril.

6.Método para propagar peixes transgênicos com construto de esterilidade materna (MSC), caracterizado pelo fato de que compreende: (i)introduzir o construto de expressão como definido na reivindicação 1, em um embrião de peixe para gerar um animal fundador transgênico com construto de esterilidade materna (MSC) que carrega o construto de expressão em sua célula germinal; (ii)reproduzir o animal fundador transgênico com MSC da etapa (i) para produzir um peixe macho transgênico com MSC hemizigoto; (iii)reproduzir o peixe macho transgênico com MSC com um peixe fêmea que não apresenta o MSC; e (iv)selecionar a progénie de peixe macho transgênico com MSC da etapa (iii) para reproduzir e propagar peixes transgênicos com MSC.

7.Método para gerar uma geração estéril de peixes, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de cruzar um peixe fêmea de finalização de linhagem obtido através do método como definido na reivindicação 3 com um macho, produzindo por meio disso uma geração estéril de peixes.

8.Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos um precursor carrega pelo menos um transgene não MSC adicional.

Images