JP3272743B2 - 安定なsod活性を有する胎盤または肝臓抽出液およびそれを含有する外用剤組成物 - Google Patents

安定なsod活性を有する胎盤または肝臓抽出液およびそれを含有する外用剤組成物

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  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、胎盤または肝臓の抽出
液をプロテアーゼで酵素分解し、分子量10,000以
下の物質を除去して得られる安定なSOD活性を有する
抽出液(以下単に抽出液という場合がある)およびそれ
を含有することを特徴とする安全な外用剤組成物に関す
るものである。
【0002】
【従来の技術】ラジカルスカベンジャーであるSOD
(スーパーオキシドジィスムターゼ)は、人間を含めて
広く動物および微生物に存在する一種の生体防御酵素で
あり、細胞内において有害で反応性の高い活性酵素、例
えばスーパーオキシドラジカル(O2 ) , ヒドロキシル
ラジカル( ・OH)等の活性酸素種の濃度を低下させる
ことから、生命の恒常性維持に係わる重要な酵素として
注目されている。
【0003】例えば、胎盤エキスにSODが含まれてい
ることは公知であり(特開昭61−277626号公
報)、ヒト胎盤からSODを単離する製造法も知られて
いる(特開昭56−102787号公報、特開昭57−
155991号公報)。
【0004】また、SODには強い抗炎症作用や皮膚の
紅斑抑制作用があることが、ラット・カラゲニン足浮腫
試験などによって認められており〔Oyanagui.
Y.:Inhibition of superoxi
de anions atthe prostagla
ndin phase of carrageenan
foot−oedema.Biochem.Phar
macol.25:1465−1472,1976:A
kira Y.,Yoshiki M.,Miyach
i I.,J.Dermtol.,14,569(19
87)〕、関連の技術も開示されている(例えば、特開
昭56−7720号公報など)。
【0005】さらに、SODの種々の特性を利用した化
粧料も知られている(例えば、特公昭59−10324
号公報、特開昭55−87712号公報など)。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、SOD
は優れた特性があるにもかかわらず、本来不安定な酵素
であるため、特に水溶液の状態で保存した時にSOD活
性を失ったり、濁りが生じる等の問題があった。
【0007】したがって、従来技術によって得られた原
料を、例えば化粧料の有効成分として配合しても、SO
Dそのものの効果が発揮されなかったり、色や臭いが経
時的に変化することなどによって商品価値を損なう問題
があるため、安定なSOD活性を有する原料や製剤の開
発が望まれていた。
【0008】本発明は、このような現状に鑑みてなされ
たもので、安定なSOD活性を有する胎盤または肝臓抽
出液およびそれを配合することを特徴とする外用剤組成
物を提供することを目的とするものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究の
結果、胎盤または肝臓の抽出液をプロテアーゼで酵素分
解し、酵素分解して得られる分子量10,000以下の
物質を除去することによって、安定なSODの活性を有
する抽出液が得られ、これを外用剤基剤に配合すること
で、SODの活性低下が著しく改善された外用剤組成物
が得られることを見出し本発明を完成した。
【0010】本発明の外用剤組成物に配合する抽出液
は、胎盤または肝臓に水、水とアルコールなどの有機溶
媒との混合溶媒を使用して一般の抽出法により抽出した
液に、SOD活性が失活しない一定のpH、温度条件下
でプロテアーゼを作用させ、蛋白質を酵素分解した後、
分子量10,000以下のものを除去することによって
得られる。なお、プロテアーゼによる酵素分解時間は、
後述する製造例からわかるように、少なくとも5時間を
要することによって安定なSOD活性を有するものが得
られる
【0011】本発明で使用する胎盤または肝臓の種類は
特に制限されないが、胎盤の場合は、ヒト,ウシ,ウ
マ,ブタなどが好適であり、肝臓の場合はウシ,ウマ,
ブタ,トリなどが好適に使用される。
【0012】蛋白分解酵素を作用させる場合は、SOD
の活性を維持させる必要があることから、pHは5〜
9、好ましくは6.5〜8.5、温度は5〜50℃、好
ましくは20〜40℃の反応条件が良い。蛋白質を分解
する際に用いる酵素は、中性プロテアーゼ(例 アクチ
ナーゼE(科研製薬製))、パパイン、トリプシンが好
適に使用される。
【0013】さらに、蛋白分解酵素液中からSODを不
安定にする要因を取り除くために、限外濾過や透析膜を
利用して濾過するなど通常の操作で分子量10,000
以下の物質を除去する。
【0014】このようにして得られる本発明の抽出液
は、安定なSOD活性を有ししかも皮膚に対する刺激が
殆どないため、これを外用剤基剤に配合することによっ
て、臭いや色調の経時変化の少ない安定なSOD活性を
有する安全な外用剤組成物を提供することができる。
【0015】本発明の抽出液を配合した製剤の剤型は、
外用の形態であれば特に制限はなく、医薬品や化粧料に
通常に用いられる剤型、例えば化粧水、クリーム、乳
液、パック、エッセンス、軟膏剤、乳剤など種々の基剤
を使用することができる。但し、クリームなどの製造工
程中、乳化時の長時間の高温加熱はSODの活性が損な
われることから好ましくなく、必ず45℃以下の条件で
抽出液を添加、攪拌することが望まれる。
【0016】本発明の抽出液を前記基剤に配合する場
合、外用剤の全量に対して0.01〜50.0%(重
量)で、好適には0.1〜30%(重量)が使用され
る。
【0017】以下、実施例によって本発明を詳細に説明
する。
【0018】
【実施例】
製造例 1 ウシ胎盤1kgを冷生理食塩水で洗浄した後細切し、精
製水2kgを加え、30℃で3時間攪拌しながら抽出す
る。次に、これを遠心分離(8,000rpm、20分
間、5℃)後、上清液をとり弱塩基性(pH7.3)に
調整し、アクチナーゼE(科研製薬製)を加え、30℃
で5時間攪拌する。さらにこの溶液を酸性(pH4.
5)にし、遠心分離(8,000rpm、10分間、5
℃)後中性(pH7.0)にし、透析膜処理で分子量1
0,000以下の物質を取り除いてSOD活性10,5
00unit/mlを有するウシ胎盤抽出液を得た。
【0019】製造例 2 ウマ肝臓1kgを冷生理食塩水で洗浄した後細切し、精
製水3kgを加え、40℃で3時間攪拌しながら抽出す
る。次に、これを遠心分離(8,000rpm、20分
間、5℃)後、上清液をとり弱塩基性(pH8.0)に
調整し、アクチナーゼE(科研製薬製)を加え、20℃
で6時間攪拌する。さらにこの溶液を酸性(pH4.
5)にし、遠心分離(8,000rpm、10分間、5
℃)後中性(pH7.0)にし、限外濾過で分子量1
0,000以下の物質を取り除いてSOD活性25,0
00unit/mlを有するウマ肝臓抽出液を得た。
【0020】製造例 3 ブタ胎盤1kgを冷生理食塩水で洗浄した後細切し、精
製水とエタノール混液1:1)2kgを加え、30℃で
3時間攪拌しながら抽出する。次に、これを遠心分離
(8,000rpm、20分間、5℃)後、上清液を取
りパパインを加え、25℃で5時間攪拌する。さらにこ
の溶液を酸性(pH4.5)にし、遠心分離(8,00
0rpm、10分間、5℃)後中性(pH7.0)に
し、限外濾過で分子量10,000以下の物質を取り除
き、SOD活性3,000unit/mlを有するブタ
胎盤抽出液を得た。
【0021】製造例 4 ウシ肝臓1kgを冷生理食塩水で洗浄した後細切し、精
製水3kgを加え、35℃で3時間攪拌しながら抽出す
る。次に、これを遠心分離(8,000rpm、20分
間、5℃)後、上清液を取り、トリプシンを加え、15
℃で8時間攪拌する。さらにこの溶液を酸性(pH5.
0)にし、遠心分離後(8,000rpm、10分間、
5℃)中性(pH7.0)にし、透析膜を用いて分子量
10,000以下の物質を取り除いてSOD活性23,
000unit/mlを有するウシ肝臓抽出液を得た。
【0022】製造例 5 トリ肝臓1kgを冷生理食塩水で洗浄した後細切し、精
製水2.2kgおよびエタール0.8kgを加え、40
℃で3時間攪拌しながら抽出する。次に、これを遠心分
離(8,000rpm、20分間、5℃)後上清液を取
り、アクチナーゼEを加え、30℃で5時間攪拌する。
さらに、この溶液を酸性(pH4.5)にし、遠心分離
(8,000rpm、10分間、5℃)後中性(pH
7.0)にし、透析膜で分子量10,000以下の物質
を取り除き、SOD活性17,000unit/mlを
有するトリ肝臓抽出液を得た。
【0023】次に、本願発明の酵素分解液ならびにこれ
を配合した製剤の試験結果(効果データ)を示す。
【0024】試験例 (1)胎盤または肝臓抽出液のSOD活性 以下の実験の結果、本発明の各臓器抽出液のSOD活性
は非常に安定であることがわかった。
【0025】a)臓器エキスの抽出法 臓器(胎盤または肝臓)1kgをミンチにし、精製水2
kgを加え、40℃で約3時間攪拌抽出する。この抽出
液を遠心分離(8,000rpm、20分間、5℃)
し、上清液を10%水酸化ナトリウム水溶液でpHを弱
塩基性(7.5)に調整し、アクチナーゼEを添加し、
30℃で5時間攪拌しながら、酵素分解する。これを弱
酸性(約pH5.0)にし、一夜放置後、遠心分離
(8,000rpm、10分間、5℃)して上清液をと
る。さらに、この液のpHを中性(7.0)にして分子
量10,000以下の物質を取り除き、試験液とする。
【0026】b)SOD活性測定法 0.05M炭酸ナトリウム緩衝液(pH10.2)の
2.4mlに、3mMキサンチン、3mMエデト酸二ナ
トリウム、0.15%牛血清アルブミン、0.75mM
ニトロブルーテトラゾリウムの各試液0.1mlを加え
る。これに精製水で適当希釈の臓器抽出エキス試料0.
1mlを加え、25℃で10分間放置後、キサンチンオ
キシダーゼ(約1unit/ml)0.1mlを加え
て、25℃でインキュベートする。
【0027】20分後、6mM塩化銅溶液0.1mlを
加えて反応を停止させ、560nmの吸光度を測定す
る。
【0028】吸光度の50%阻害する濃度を1単位とす
る。
【0029】c)臓器抽出液のSOD活性の経時安定性 上記の試験液(本発明の抽出液)、比較液(上記試験例
において酵素分解および分子量分画をしないものを比較
例1とし、酵素分解はするが分子量分画をしないものを
比較例2とした)を5,20,45℃で1か月間保存
し、2,10,16,30日目に外観の変化(沈澱、濁
り、異臭の有無)を観察するとともに、SOD活性の変
化を測定した。
【0030】結果を表1〜表4に示す。
【0031】
【表1】
【0032】
【表2】
【0033】
【表3】
【0034】
【表4】
【0035】以上のように、本発明の各臓器抽出液は、
すべての温度条件においてSOD活性の低下は殆ど見ら
れず、安定であることが確認された。
【0036】また、外観の変化も認められなかった。
【0037】次に外用剤組成物の具体的な処方例を示す
が、本発明はかかる実施例にのみに限定されるものでは
ない。
【0038】〔処方例〕 処方例1(クリーム) (重量%) ポリオキシエチレンオレイルエーテル(P.O.E.O) 1.60 モノステアリン酸グリセリン 3.00 サラシミツロウ 2.80 セタノール 3.00 ステアリン酸 1.75 流動パラフィン 7.10 パルソール1789 0.50 スクワラン 4.50 グリセリン 2.50 カーボポール940 0.08 クレワットN 0.01 製造例3で製造したブタ胎盤抽出液 0.10 精製液 73.06 この他に少量の香料および防腐剤を添加した。
【0039】 処方例2(乳液) (重量%) スクワラン 5.00 ワセリン 2.00 ミツロウ 0.50 ソルビタンセスキオレイン酸エステル 1.20 プロピレングリコール 5.00 エタノール 5.00 カルボキシビニルポリマー(1%水溶液) 20.00 水酸化カリウム 0.10 製造例1で製造したウシ胎盤抽出液 10.00 精製液 51.60 この他に少量の香料、防腐剤および酸化防止剤を添加し
た。
【0040】処方例3(乳液) 処方例2において、「製造例1で製造したウシ胎盤抽出
液」の代わりに、「製造例2で製造したウマ肝臓抽出
液」を用いた処方を処方例3とした。
【0041】処方例4(乳液) 処方例2において、「製造例1で製造したウシ胎盤抽出
液」の代わりに、「製造例5で製造したトリ肝臓抽出
液」を用いた処方を処方例4とした。
【0042】 処方例5(化粧水) (重量%) クエン酸 0.40 炭酸カルシウム 0.20 エタノール 5.00 プロピレングリコール 9.00 製造例4で製造したウシ肝臓抽出液 30.00 精製液 55.40 この他に少量の香料および防腐剤を添加した。
【0043】 処方例6(パック) (重量%) ビーガム 5.00 スクワラン 2.00 プロピレングリコール 5.00 酸化亜鉛 10.00 エタノール 5.00 製造例2で製造したウマ肝臓抽出液 2.00 精製水 61.00 この他に少量の香料および防腐剤を添加した。
【0044】 処方例7(エッセンス) (重量%) カルボキシビニルポリマー(1%水溶液) 10.00 グリセリン 20.00 エタノール 1.00 ヒアルロン酸ナトリウム(1%水溶液) 10.00 製造例2で製造したウマ肝臓抽出液 10.00 精製水 49.00 この他に少量の香料および防腐剤を添加した。
【0045】 処方例8(ヘアトニック) (重量%) エタノール(95%) 75.00 グリセリン 5.00 製造例4で製造したウシ肝臓抽出液 5.00 精製水 15.00 この他に少量の香料および防腐剤を添加した。
【0046】
【発明の効果】本発明によれば、安定なSOD活性を有
する種々の胎盤または肝臓抽出液を得ることができ、こ
れを自明の外用剤基剤に配合することにより、SOD本
来の作用がいかんなく発揮される、安全で、商品価値の
損なわれない外用剤組成物が提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12N 9/50 C12N 9/76 9/76 C12P 21/06 C12P 21/06 A61K 37/50 (56)参考文献 特開 昭64−55143(JP,A) 特開 平2−300137(JP,A) 特開 昭63−284133(JP,A) 特開 昭62−135434(JP,A) 特開 昭64−20084(JP,A) 特開 昭62−130684(JP,A) 特開 昭56−32422(JP,A) 特開 昭56−7720(JP,A) 特開 昭55−87712(JP,A) 特開 昭57−155991(JP,A) 特開 昭56−102787(JP,A) 特開 昭64−63383(JP,A) 特開 昭61−277626(JP,A) 特公 昭59−10324(JP,B2) 特表 昭62−501472(JP,A) 特表 昭63−501473(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) A61K 35/50 A61K 7/00 A61K 7/06 A61K 35/407

Claims (2)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 胎盤または肝臓抽出液を少なくとも5時
    プロテアーゼで酵素分解し、分子量10,000以下
    の物質を除去して得られる安定なSOD活性を有する抽
    出液。
  2. 【請求項2】 胎盤または肝臓抽出液を少なくとも5時
    プロテアーゼで酵素分解し、分子量10,000以下
    の物質を除去して得られる安定なSOD活性を有する抽
    出液を含有することを特徴とする外用剤組成物。
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