JP4347609B2 - 膀胱癌検査キット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、染色体を分析して膀胱癌を検査する検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
膀胱癌の癌化では染色体の脱落が起こり、染色体、４ｐ、８ｐ、９ｐ、９ｑ、１１ｐ、や１７ｐ部位における高頻度のヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity：LOH）が報告されている（非特許文献１〜５参照）。従って、これらのLOHを検出することで、膀胱癌についての有効な検査を行うことができる。しかしながら、この方法では、膀胱癌から摘出した組織細胞を用いており、より簡便な方法が切望されている。
【０００３】
特許文献１には、初期膀胱癌患者の尿中から回収した核酸を用いて、９番染色体のLOHを解析し、膀胱癌を検査する方法が開示されている。この検査法は9番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）において一塩基多型部位（SNP）および、繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト型多型部位を利用して、9番染色体の欠失を検出している。9番染色体上の遺伝子多型の存在する領域を、ＰＣＲ法で増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られた核酸断片を一本鎖核酸高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ）で解析し、該遺伝子多型部位のＬＯＨを検出する方法である。
【０００４】
【非特許文献１】
Cancer Res. 54 p784-788 Spruck III等(1994 )
【非特許文献２】
Cancer Genet. Cytogenet. 77 p118-124 Matsuya等(1994)
【非特許文献３】
Lancet 342p469-471 Dalbagni等(1993)
【非特許文献４】
Cancer Res. 54 p531-538 Knowles 等(1994)
【非特許文献５】
Cancer Res. 50 p7081-7083 Olumi 等(1990)
【特許文献１】
特開平１１−３４１９９９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、特許文献１の検査方法では、長腕末端付近（9ｑ32−ｑ34.3）において利用したVAV2遺伝子領域内の遺伝子多型部位ではヘテロ接合体の頻度が低く、LOH解析が不可能な場合があった。このため、従来の膀胱癌検査方法においては、長腕末端付近における染色体の欠損を同定することが困難であり、有効な検査を行えないといった問題があった。
本発明の目的は、長腕末端付近における染色体の欠損の効率的な同定に関する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者が鋭意検討した結果、９番染色体に存在するABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を利用してLOHを検出することで、９番染色体の長腕末端領域の欠損を効率よく検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明に係る膀胱癌検査キットは、９番染色体のABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む領域を効率的に増幅できるプライマーを含んでいる。ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位においては、集団内におけるヘテロ接合体である頻度（ヘテロ接合性）が非常に高い。このため、ABO式血液型遺伝子に存在する多型部位を用いてＬＯＨを検出することにより、当該多型部位近傍の欠失、言い換えれば、９番染色体長腕末端近傍の欠失を確実に検出することができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参酌して説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明を適用する膀胱癌検査方法は、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む９番染色体の遺伝子多型部位群を解析する工程ａと、上記遺伝子多型部位群解析の結果、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を検出する工程ｂとを含む。なお、本発明に係る膀胱癌検査方法において、膀胱癌とは、一部修正して行ったＷＨＯのグレード分類ではＧ1以下の初期癌を、ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological staging system：American joint Committee on Cancer(1988)）ではpＴaあるいはpＴis等の表在性膀胱癌を含む意味である。
【０００９】
工程ａ
「ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位」とは、図１に示すように、染色体9q34.1部位から9q34.2部位の範囲に存在する遺伝子多型部位を意味する。具体的には、当該遺伝子多型部位は、ABO式血液型遺伝子における遺伝子エクソン６内に存在する遺伝子多型部位を意味する。より具体的には、当該遺伝子多型部位は、GeneBankにおける登録番号AF134412に示されたｃＤＮＡの開始コドンから数えて261番目の塩基、及び/又は297番目の塩基を意味する。ここで、261番目の遺伝子多型部位は、遺伝子型がグアニン又はグアニン欠失であり、297番目の遺伝子多型部位は、遺伝子型がグアニン又はアデニンである。なお、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位としては、これらに限定されず、例えば、Hum Genet (1996) 97: 777-783に開示されている遺伝子多型部位を使用することもできる。
【００１０】
「遺伝子多型部位群」とは、少なくとも、上記ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む意味である。遺伝子多型部位群は、上記ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位と、９番染色体に存在するその他の遺伝子多型部位とを含む意味であっても良い。その他の遺伝子多型部位としては、特に限定されないが、特開平１１−３４１９９９号公報に開示されているD9S304、D9S303、ALDOB、D9S775及びVAV2等を挙げることができる。ここで、ALDOBは、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型を意味し、９ｑ２２上と同定されている（Am. J. Hum.Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。また、VAV2は、９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型であり、コスミドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセンター中央病院で見出されたものである。さらに、D9S304、D9S303及びD9S775は、４塩基単位の繰り返しであるマイクロサテライト型多型であり、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報入手できる。
【００１１】
工程ａにおける解析とは、解析の結果に基づいて、その後の工程ｂにおいてヘテロ接合性の消失を検出できるような解析を意味する。具体的に工程ａにおける解析においては、該遺伝子多型部位群を構成する個々の遺伝子多型部位（ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む）を含む領域を増幅させるような、いわゆる核酸増幅法を実施し、その後、核酸フラグメントの増幅の有無を検定する。
【００１２】
本発明に係る膀胱癌検査方法においては、工程ａに先立って検査対象の試料を調製してもよいし、予め調製された試料に対して検査を行っても良い。検査対象の試料としては、例えば、尿等の生体試料を使用することができる。また、生体試料とは、腫瘍組織自体も含む意味である。腫瘍組織は手術や生体検査などにより採取することもできる。
【００１３】
尿とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診尿や、病院における外来・入院患者尿で、膀胱癌の検査や再発など、膀胱癌の早期発見を必要とするもの等が挙げられ、特に限定されずこれらの全てが対象となる。また、採尿方法を工夫した特殊なデバイスで、尿中に脱落してくる細胞を効率よく集めたものも対象となる。
【００１４】
工程ａにおいて核酸増幅法を行う場合には、採取した試料から核酸を抽出する。核酸の抽出方法は、特に限定されず、従来公知の方法を使用することができる。例えば、尿中に存在する細胞から核酸を抽出することもできるし、その他検査対象の組織から採取した細胞から核酸を抽出することもできる。検査対象から尿を採取した場合には、尿中に脱落してきた本人の細胞由来の核酸を含むものであれば何でもよく、通常、尿中に脱落した新陳代謝された正常細胞及び/又は癌細胞由来の核酸を、種々の方法で効率よく抽出することができる。
【００１５】
工程ａにおいて核酸増幅方法は、特に限定されるものではないが、例えば、PCR法、鎖置換増幅法（SDA法）、等温遺伝子増幅法（ICAN法）、LAMP法などがある。いずれの方法においても、該ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む領域を増幅できるプライマーを含む膀胱癌検査キットを用いて行うことができる。この膀胱癌検査キットに含まれるプライマーとしては、上述した「ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位」を含む領域を増幅できるものであれば、如何なる塩基配列からなるものであっても良い。
【００１６】
例えば、プライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列のうち連続する５塩基以上を含む第１のプライマーと、配列番号２に示す塩基配列のうち連続する５塩基以上を含む第２のプライマーとからなる一対のプライマーセットを挙げることができる。なお、第１のプライマーは配列番号１に示す塩基配列であっても良い。すなわち、第１のプライマーは5'-TCTCCATGTGCAGTAGGAAAGGATG-3'であってもよい。第２のプライマーは配列番号２に示す塩基配列であっても良い。すなわち、第２のプライマーは5'-CACAGTTAACCCAATGGTGGTGTT-3'であってもよい。また、プライマーとしては、図２に示す遺伝子エクソン６の部分配列を増幅するように設計されたプライマーであっても良い。
【００１７】
９番染色体のABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位以外の遺伝子多型部位を含む領域を増幅する際には、当該領域の塩基配列情報に基づいてプライマーを設計することができる。その他の遺伝子多型部位として、例えば、D9S304、D9S303、ALDOB、D9S775又はVAV2を含む領域をそれぞれ増幅する際には、上述したデータベース等において近傍の塩基配列を取得し、取得した塩基配列に基づいてプライマーを設計することができる。
【００１８】
また、これらプライマーを設計する際には、増幅する領域の長さが100〜200bpでとなるように設計することが好ましい。また、後述する工程ｂにおける核酸フラグメントの検出を容易にする目的等で、プライマーを標識することもできる。また、ＰＣＲを実施する際に標識した塩基成分（例えば燐の放射性標識塩基）を用いる方法、又は、ＰＣＲを実施した後に標識する方法により、核酸フラグメントを標識することができる。標識処理方法としては、後述する工程ｂ後に検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検出）を用いた標識方法を挙げることができる。プライマーに対しては、例えば、プライマーの末端を予めＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光標識したものを用いる。また、蛍光標識としてはアプライドバイオシステムズ社のFAMTM、TETTM、HEXTM、TAMRATM、ROXTMなども使用できる。これらの場合、プライマーの５’末端または３’末端のどちらか一方を標識すればよく、好ましくはプライマーの５’末端を標識したものを用いる。
【００１９】
工程ａでは、好ましくは検査対象の生体試料及び上述プライマーを用いて核酸増幅反応を行った後、核酸フラグメントの増幅の有無を検定する。核酸フラグメントの増幅の有無を検定するには、例えば、反応溶液を一本鎖DNA高次構造多型解析のための電気泳動に供する。より具体的には、上述した核酸増幅反応の後、核酸フラグメントの末端を平滑化処理し、その後、キャピラリー電気泳動装置を利用することができる。上述したように核酸フラグメントを標識しておくことによって、ラベルを指標として核酸フラグメントの有無を検定することができる。
【００２０】
なお、工程ａにおいては、後述する工程ｂでヘテロ接合性の消失を検出できる。つまり、遺伝子多型解析を実施可能な方法であれば、如何なる方法を用いてもよく、上述したような核酸増幅方法とそれに続くキャピラリー電気泳動法に限定されない。後述する工程ｂでヘテロ接合性の消失を検出できるような結果を示す方法としては、例えば、質量分析装置を利用した方法やＲＴ−ＰＣＲ法やブランチド核酸ハイブリダイゼーション法（ｂ−核酸）等の方法や伸長反応時に生成される副産物をATPに変換し、これを利用して検出する方法や核酸マイクロアレイ等が利用できる。さらに、実際的には上述のような遺伝子多型解析において、定量的遺伝子多型解析が可能な方法が望ましい。
【００２１】
質量分析装置を用いる場合には、上述した核酸増幅方法に際して、遺伝子多型部位のパターンに応じて長さの異なる核酸フラグメントを増幅できるようにプライマーを設計し、このプライマーを用いて核酸増幅を行う。その後、増幅した塩基長の異なる核酸フラグメントの質量を質量分析装置により測定することで核酸フラグメントの有無を検定することができる。
【００２２】
また、工程ａにおいては、核酸増幅方法における伸長反応の進行が遺伝子多型部位におけるパターンの違いに依存するようにプライマーを設計し、伸長反応が起こった場合に発生する副産物（ATP）を利用して発光を行う系で、汎用の発光測定装置で測定することができる。
【００２３】
さらに、工程ａにおいては、核酸マイクロアレイを用いることができる。これは異なる波長帯の蛍光標識で標識された同じ塩基配列を持つ２種類のプライマーセットを用いる。一方のプライマーセットを用いて、正常細胞より得られた核酸に対して、また、もう一方のプライマーセットを用いて疾患由来細胞より得られた核酸に対して各々PCRを行う。これより得られた正常細胞由来核酸増幅断片と疾患細胞由来核酸増幅断片とを混合し、その蛍光を核酸マイクロアレイにより測定する方法である。
【００２４】
工程ｂ
上述した工程ａの後、工程ｂでは、上記工程ａにおける遺伝子多型部位群解析の結果に基づいて、ヘテロ接合性の消失を検出する。「ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）」とは、ある遺伝子遺伝子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異なる個体）で、一方のアレルが消失することを意味する。したがって、工程ｂにおいて、工程ａの解析結果に基づいて、検査対象の９番染色体におけるヘテロ接合性を検出することによって、９番染色体のいずれか一方の（言い換えると、父方及び/又は母方由来の）少なくとも一部の欠失を検出することができる。９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失とは、相同染色体である９番染色体の一方が完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、相同染色体の互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失を起こした場合を含むものである。
【００２５】
上記工程ａにおいて核酸増幅方法とそれに続くキャピラリー電気泳動法を行った場合には、当該電気泳動法によって核酸フラグメントの有無を検定することができるため、９番染色体におけるヘテロ接合性の消失を検出することができる。具体的には、核酸フラグメントを一本鎖DNA高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ）で解析し、ＬＯＨを検出する方法である。特に、Taq-ポリメラーゼを使用したPCRによる核酸フラグメントの増幅後、このPCR産物の末端を平滑化処理し、得られた核酸フラグメントをＳＳＣＰで解析するＬＯＨの検出方法は、特開平９−２０１１９９等に開示されている方法が利用できる。
【００２６】
ＳＳＣＰの結果としては、例えば、図３に示すように、核酸フラグメントに含まれる遺伝子多型部位のパターンに応じてアレル毎に異なるピークとして示すことができる。図３で示す各血液型のジェノタイプ（遺伝子型）は、２ヵ所の遺伝子多型部位の組合せにより複数存在する。より具体的には、Ａ型、正式名称としてはＡ101型のジェノタイプは261番目の多型部位がグアニンで、297番目の多型部位がアデニンであり、Ｂ型（Ｂ101型）のジェノタイプでは261番目の多型部位がグアニンで、297番目の多型部位がグアニンである。同様に、Ｏ1型（Ｏ101型）のジェノタイプは261番目のグアニンが欠失しており、更に297番目がアデニンであり、Ｏ2型（Ｏ201型）のジェノタイプは261番目のグアニンが欠失し、297番目がグアニンである。ヒトの血液型を決定する遺伝子型は両親に由来する対立遺伝子の遺伝子型によって決定され、これら4つの遺伝子型の組合せにより、図３に示す合計10種類の組合せが存在する。さらに、実際の検体では全ての９番染色体が欠失しているとは限らないので、完全にピークが消失するのではなく図３のようにピークの減少として検出される。図３から分かるように、９番染色体の所定の領域が欠失している場合、欠失した領域に対応する核酸フラグメントのピークが、健常サンプルと比較して小さくなる。従って、図３に示す１０種類のアレル毎に異なるピークを検出し、核酸フラグメントの有無を判定することによって、検査対象の９番染色体における欠失を特定することができる。
【００２７】
また、上記工程ａにおいて、核酸増幅の後に質量分析装置を用いて核酸フラグメントを遺伝子多型解析する場合には、質量分析装置それぞれが異なる質量の核酸フラグメントとして検出でき、その結果から求めた核酸フラグメントの有無に基づいて９番染色体におけるヘテロ接合性の消失を検出することができる。
【００２８】
特に、本発明に係る膀胱癌検査方法においては、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を用いてＬＯＨを検出している。ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位においては、集団内におけるヘテロ接合体である頻度（ヘテロ接合性）が非常に高いため、９番染色体における当該遺伝子多型部位近傍の欠失を確実に検出することができる。言い換えれば、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を用いてＬＯＨを検出することによって、９番染色体長腕末端近傍の欠失を確実に検出することができる。
【００２９】
また、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位として、例えば、遺伝子エクソン６の261番目の遺伝子多型部位及び297番目の遺伝子多型部位を用いる場合には、これら２つの遺伝子多型部位のうちいずれか一方がヘテロ接合体であればよいため、９番染色体における当該遺伝子多型部位近傍（９番染色体長腕末端近傍）の欠失をより確実に検出することができる。
【００３０】
さらに、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位に加えて、当該遺伝子多型部位以外の遺伝子多型部位を用いることによって、これらすべての遺伝子多型部位近傍の欠失を検出することができる。すなわち、工程ａで解析する遺伝子多型部位を、９番染色体に存する遺伝子多型部位のなかから９番染色体の全体を網羅するように適宜選択することによって、９番染色体の全体にわたって欠失を検出することができる。例えば、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位に加えて、上述したD9S304、D9S303、ALDOB及びD9S775についてＬＯＨを検出することによって、９番染色体の全体に亘って欠失を検出することができる。このように、９番染色体の全体に亘って欠失を検出することによって、膀胱癌の悪性度を検査することができる。
【００３１】
なお、上述した工程ａ及び工程ｂは、例えば図４に示す検査装置１において実行することができる。検査装置１は、生体試料から核酸を抽出する核酸抽出部２と、抽出した核酸を膀胱癌検査キットに含まれる反応溶液と混合する核酸混合部３と、反応溶液に含まれる核酸を鋳型として核酸増幅を実行する核酸増幅部４とを備える。また、検査装置１は、反応溶液に含まれる核酸フラグメントを検出する検出部５を備える。さらに、検査装置１は、核酸抽出部２と核酸混合部３と核酸増幅部４に関する操作条件等の入力及びこれら各部からデータ等が出力される操作・出力部７を備える。さらにまた、検査装置１は、検出部に対する操作条件等を入力し、検出部からの検出データが出力される操作・ＬＯＨ解析部８を備える。
【００３２】
このように構成された検査装置１を用いることによって、検査対象から採取した生体試料からの核酸の抽出、反応溶液の調製、反応溶液に含まれる核酸の増幅反応、及びＬＯＨの検出を自動的に行うことができる。また、検査装置１を用いることによって、多数の検査対象の解析を同時に行うことができる。
【００３３】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実験例１
１．検体の入手
膀胱癌患者の検体は、次のようにして入手して処理後、ＬＯＨを解析するまで保存した。経尿道切除術（ＴＵＲ）やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の一部は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、−８０℃で凍結保存した。尿は、内視鏡検査前に、自然排尿で、５０ｍＬの遠心チューブに採取した。この尿を、１０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、沈渣を集めた。この沈渣に、４０ｍＬの生理食塩水を加えて再分散し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、残ったペレットを−８０℃で凍結保存した。正常組織核酸は、末梢血の白血球（ＰＢＬ）から抽出した。１０ｍＬの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心後、血漿を廃棄した。この採血管に、０．２％の食塩水４０ｍＬを加えて溶血し、再度３０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清液を捨て、同様の操作を２回繰り返した。残ったペレットは、−８０℃で凍結保存した。陰性対照には、良性の尿路疾患患者２０例の尿と血液を採取し、膀胱癌患者の検体と同様に処理して、−８０℃に凍結して保存した。
【００３５】
２．核酸の抽出
上記１．で得られた凍結保存検体からの核酸の抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Moleular Biology, Elsevir Science Publishing 社出版）や菅野らの（Lab. Invest. 68 ｐ361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要約すると、６５℃で１５分間処理した検体に、１ｍｇ／ｍＬプロテナーゼＫ、１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、０．４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液を加えて３７℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加えて２回核酸を抽出した。抽出液に、０．１容の３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液と２．５容の冷無水エタノールを加え、−２０℃で２時間冷却し、核酸を沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして２０μｇのグリコーゲンを加え、核酸の回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、１ｍＬの８０％エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。この核酸を含む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解した。
【００３６】
３．蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーの調製
第９染色体上のABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを表１にまとめた。
【００３７】
【表１】
【００３８】
Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTM（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、配列番号１のＰＣＲ用プライマーの５’末端側を、indodicarbocyanine（Ｃｙ５）蛍光色素で標識した。遺伝子多型部位としては、第９番染色体上の、ABO式血液型遺伝子のエクソン６（ＡＢＯエキソン６）の部位を使用した。このABOエクソン６は染色体9q34.1部位から9q34.2部位と同定されているが、表1に示したプライマー配列は本発明者等が独自に膀胱癌再発検査に有用な遺伝子多型部位としてSSCP用に最適化したものである。
【００３９】
４．ＰＣＲ
生体試料より抽出したゲノム核酸（鋳型）0.1μg 、表１に示したプライマーを各1.0ｐＭ、10ｎＭヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、10μＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）、50ｍＭＫＣｌ、1.5ｍＭＭｇＣｌ2、0.001％(w/v)ゼラチン、Ｔａｑ核酸ポリメラーゼ（Perkin Elmer社）1.25unitを加え、全液量を25μlとした。この溶液について、以下の条件でPCRを行った。ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で１２分間の初回変性の後、９５℃で３０秒、５７℃で3０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとして３５サイクル、その後、７２℃で７分間の伸長反応を行う条件とした。
【００４０】
５．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化
ＰＣＲで増幅した核酸フラグメントは、Klenow fragment （宝酒造（株）製）で処理し、末端を平滑化した。５μL のＰＣＲ産物に、0.5 units の Klenow fragment１μｌを加え、37℃で30分間反応し、反応後100ｍＭＥＤＴＡ１μｌ加えた（Genes. Chromosomes &Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
【００４１】
６. 一本鎖DNA高次構造多型解析（ＳＳＣＰ解析）
末端平滑化した核酸フラグメントは、ポリアクリルアミドゲルとトリス・グリシンバッファー（Tris：１５％(w/v)、Glycine：３．２％(w/v)）を用いて、ファルマシア社の電気泳動装置Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTMにより泳動条件１８℃、２５Ｗで１５００分で解析を行った。
【００４２】
実施例２
VAV2 と ABO エクソン６におけるヘテロ接合体の割合の比較
9番染色体上の遺伝子多型部位がほぼ同じ場所（9ｑ34）に位置するVAV2とABOエクソン６に関するヘテロ接合体とヘテロ接合体の割合（ヘテロ接合性）とを比較した（表２）。従来遺伝子遺伝子多型部位として使用していたVAV2では膀胱癌患者72例のうち30例がヘテロ接合体で、ヘテロ接合体の割合は約41.7％だった。これに対し、ABOエクソン６では膀胱患者72例の57例がヘテロ接合体で、ヘテロ接合体の割合は約79.2％だった。
【００４３】
【表２】
【００４４】
表２に示した結果より、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を用いてＬＯＨを検出することにより、９番染色体長腕末端近傍の欠失を効率的に検出でき、膀胱癌の検査性能を大幅に向上できることが明らかとなった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明よれば、９番染色体における長腕末端付近の欠損を効率的に同定できる。
【００４６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】第９番染色体と第９番染色体におけるABO式血液型遺伝子を拡大して示す図である。
【図２】 ABOエクソン６の遺伝子配列構造を示す図である。
【図３】ＳＳＣＰ解析による出力を示す図である。
【図４】膀胱癌の検査を行う検査装置を概略的に示す図である。
【符号の説明】
１…検査装置、２…核酸抽出部、３…核酸混合部、４…核酸増幅部
５…検出部
【発明の属する技術分野】
本発明は、染色体を分析して膀胱癌を検査する検査キットに関する。
【０００２】
【従来の技術】
膀胱癌の癌化では染色体の脱落が起こり、染色体、４ｐ、８ｐ、９ｐ、９ｑ、１１ｐ、や１７ｐ部位における高頻度のヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity：LOH）が報告されている（非特許文献１〜５参照）。従って、これらのLOHを検出することで、膀胱癌についての有効な検査を行うことができる。しかしながら、この方法では、膀胱癌から摘出した組織細胞を用いており、より簡便な方法が切望されている。
【０００３】
特許文献１には、初期膀胱癌患者の尿中から回収した核酸を用いて、９番染色体のLOHを解析し、膀胱癌を検査する方法が開示されている。この検査法は9番染色体の短腕部（９ｐ）と長腕部（９ｑ）において一塩基多型部位（SNP）および、繰り返し単位の差が１単位以上であるマイクロサテライト型多型部位を利用して、9番染色体の欠失を検出している。9番染色体上の遺伝子多型の存在する領域を、ＰＣＲ法で増幅後、該ＰＣＲ産物の末端を平滑化処理し、得られた核酸断片を一本鎖核酸高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ）で解析し、該遺伝子多型部位のＬＯＨを検出する方法である。
【０００４】
【非特許文献１】
Cancer Res. 54 p784-788 Spruck III等(1994 )
【非特許文献２】
Cancer Genet. Cytogenet. 77 p118-124 Matsuya等(1994)
【非特許文献３】
Lancet 342p469-471 Dalbagni等(1993)
【非特許文献４】
Cancer Res. 54 p531-538 Knowles 等(1994)
【非特許文献５】
Cancer Res. 50 p7081-7083 Olumi 等(1990)
【特許文献１】
特開平１１−３４１９９９号公報
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、特許文献１の検査方法では、長腕末端付近（9ｑ32−ｑ34.3）において利用したVAV2遺伝子領域内の遺伝子多型部位ではヘテロ接合体の頻度が低く、LOH解析が不可能な場合があった。このため、従来の膀胱癌検査方法においては、長腕末端付近における染色体の欠損を同定することが困難であり、有効な検査を行えないといった問題があった。
本発明の目的は、長腕末端付近における染色体の欠損の効率的な同定に関する。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者が鋭意検討した結果、９番染色体に存在するABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を利用してLOHを検出することで、９番染色体の長腕末端領域の欠損を効率よく検出できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００７】
本発明に係る膀胱癌検査キットは、９番染色体のABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む領域を効率的に増幅できるプライマーを含んでいる。ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位においては、集団内におけるヘテロ接合体である頻度（ヘテロ接合性）が非常に高い。このため、ABO式血液型遺伝子に存在する多型部位を用いてＬＯＨを検出することにより、当該多型部位近傍の欠失、言い換えれば、９番染色体長腕末端近傍の欠失を確実に検出することができる。
以下、上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について図面を参酌して説明する。
【０００８】
【発明の実施の形態】
本発明を適用する膀胱癌検査方法は、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む９番染色体の遺伝子多型部位群を解析する工程ａと、上記遺伝子多型部位群解析の結果、ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）を検出する工程ｂとを含む。なお、本発明に係る膀胱癌検査方法において、膀胱癌とは、一部修正して行ったＷＨＯのグレード分類ではＧ1以下の初期癌を、ＴＭＮ分類（tumor-nodes-metastasis pathological staging system：American joint Committee on Cancer(1988)）ではpＴaあるいはpＴis等の表在性膀胱癌を含む意味である。
【０００９】
工程ａ
「ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位」とは、図１に示すように、染色体9q34.1部位から9q34.2部位の範囲に存在する遺伝子多型部位を意味する。具体的には、当該遺伝子多型部位は、ABO式血液型遺伝子における遺伝子エクソン６内に存在する遺伝子多型部位を意味する。より具体的には、当該遺伝子多型部位は、GeneBankにおける登録番号AF134412に示されたｃＤＮＡの開始コドンから数えて261番目の塩基、及び/又は297番目の塩基を意味する。ここで、261番目の遺伝子多型部位は、遺伝子型がグアニン又はグアニン欠失であり、297番目の遺伝子多型部位は、遺伝子型がグアニン又はアデニンである。なお、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位としては、これらに限定されず、例えば、Hum Genet (1996) 97: 777-783に開示されている遺伝子多型部位を使用することもできる。
【００１０】
「遺伝子多型部位群」とは、少なくとも、上記ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む意味である。遺伝子多型部位群は、上記ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位と、９番染色体に存在するその他の遺伝子多型部位とを含む意味であっても良い。その他の遺伝子多型部位としては、特に限定されないが、特開平１１−３４１９９９号公報に開示されているD9S304、D9S303、ALDOB、D9S775及びVAV2等を挙げることができる。ここで、ALDOBは、９番染色体上のヒトのアルドラーゼＢ遺伝子（ＡＬＤＯＢ）のイントロン８における１塩基置換の遺伝子多型を意味し、９ｑ２２上と同定されている（Am. J. Hum.Genet. 52 p835-840 Brooks 等(1993)）。また、VAV2は、９ｑ３４上と同定されたＶＡＶ２遺伝子上のＴ／Ｃ置換の遺伝子多型であり、コスミドクローンＬ１９６Ｃ８株の塩基配列の測定データ（Gene Bank 登録番号ＡＣ００２１１１）に基づいており、国立がんセンター中央病院で見出されたものである。さらに、D9S304、D9S303及びD9S775は、４塩基単位の繰り返しであるマイクロサテライト型多型であり、ゲノムデータベース（インターネット上のアドレス：http://gdbwww.gdb.prg/）から情報入手できる。
【００１１】
工程ａにおける解析とは、解析の結果に基づいて、その後の工程ｂにおいてヘテロ接合性の消失を検出できるような解析を意味する。具体的に工程ａにおける解析においては、該遺伝子多型部位群を構成する個々の遺伝子多型部位（ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む）を含む領域を増幅させるような、いわゆる核酸増幅法を実施し、その後、核酸フラグメントの増幅の有無を検定する。
【００１２】
本発明に係る膀胱癌検査方法においては、工程ａに先立って検査対象の試料を調製してもよいし、予め調製された試料に対して検査を行っても良い。検査対象の試料としては、例えば、尿等の生体試料を使用することができる。また、生体試料とは、腫瘍組織自体も含む意味である。腫瘍組織は手術や生体検査などにより採取することもできる。
【００１３】
尿とは、集団検診、健康診断、ドック検診、郵送検診などの検診尿や、病院における外来・入院患者尿で、膀胱癌の検査や再発など、膀胱癌の早期発見を必要とするもの等が挙げられ、特に限定されずこれらの全てが対象となる。また、採尿方法を工夫した特殊なデバイスで、尿中に脱落してくる細胞を効率よく集めたものも対象となる。
【００１４】
工程ａにおいて核酸増幅法を行う場合には、採取した試料から核酸を抽出する。核酸の抽出方法は、特に限定されず、従来公知の方法を使用することができる。例えば、尿中に存在する細胞から核酸を抽出することもできるし、その他検査対象の組織から採取した細胞から核酸を抽出することもできる。検査対象から尿を採取した場合には、尿中に脱落してきた本人の細胞由来の核酸を含むものであれば何でもよく、通常、尿中に脱落した新陳代謝された正常細胞及び/又は癌細胞由来の核酸を、種々の方法で効率よく抽出することができる。
【００１５】
工程ａにおいて核酸増幅方法は、特に限定されるものではないが、例えば、PCR法、鎖置換増幅法（SDA法）、等温遺伝子増幅法（ICAN法）、LAMP法などがある。いずれの方法においても、該ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む領域を増幅できるプライマーを含む膀胱癌検査キットを用いて行うことができる。この膀胱癌検査キットに含まれるプライマーとしては、上述した「ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位」を含む領域を増幅できるものであれば、如何なる塩基配列からなるものであっても良い。
【００１６】
例えば、プライマーとしては、配列番号１に示す塩基配列のうち連続する５塩基以上を含む第１のプライマーと、配列番号２に示す塩基配列のうち連続する５塩基以上を含む第２のプライマーとからなる一対のプライマーセットを挙げることができる。なお、第１のプライマーは配列番号１に示す塩基配列であっても良い。すなわち、第１のプライマーは5'-TCTCCATGTGCAGTAGGAAAGGATG-3'であってもよい。第２のプライマーは配列番号２に示す塩基配列であっても良い。すなわち、第２のプライマーは5'-CACAGTTAACCCAATGGTGGTGTT-3'であってもよい。また、プライマーとしては、図２に示す遺伝子エクソン６の部分配列を増幅するように設計されたプライマーであっても良い。
【００１７】
９番染色体のABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位以外の遺伝子多型部位を含む領域を増幅する際には、当該領域の塩基配列情報に基づいてプライマーを設計することができる。その他の遺伝子多型部位として、例えば、D9S304、D9S303、ALDOB、D9S775又はVAV2を含む領域をそれぞれ増幅する際には、上述したデータベース等において近傍の塩基配列を取得し、取得した塩基配列に基づいてプライマーを設計することができる。
【００１８】
また、これらプライマーを設計する際には、増幅する領域の長さが100〜200bpでとなるように設計することが好ましい。また、後述する工程ｂにおける核酸フラグメントの検出を容易にする目的等で、プライマーを標識することもできる。また、ＰＣＲを実施する際に標識した塩基成分（例えば燐の放射性標識塩基）を用いる方法、又は、ＰＣＲを実施した後に標識する方法により、核酸フラグメントを標識することができる。標識処理方法としては、後述する工程ｂ後に検出し易いものであれば特に制限はなく、放射性物質、蛍光物質、化学発光物質、ビオチン（酵素標識アビジンで検出）を用いた標識方法を挙げることができる。プライマーに対しては、例えば、プライマーの末端を予めＡ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄ（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）で蛍光標識したものを用いる。また、蛍光標識としてはアプライドバイオシステムズ社のFAMTM、TETTM、HEXTM、TAMRATM、ROXTMなども使用できる。これらの場合、プライマーの５’末端または３’末端のどちらか一方を標識すればよく、好ましくはプライマーの５’末端を標識したものを用いる。
【００１９】
工程ａでは、好ましくは検査対象の生体試料及び上述プライマーを用いて核酸増幅反応を行った後、核酸フラグメントの増幅の有無を検定する。核酸フラグメントの増幅の有無を検定するには、例えば、反応溶液を一本鎖DNA高次構造多型解析のための電気泳動に供する。より具体的には、上述した核酸増幅反応の後、核酸フラグメントの末端を平滑化処理し、その後、キャピラリー電気泳動装置を利用することができる。上述したように核酸フラグメントを標識しておくことによって、ラベルを指標として核酸フラグメントの有無を検定することができる。
【００２０】
なお、工程ａにおいては、後述する工程ｂでヘテロ接合性の消失を検出できる。つまり、遺伝子多型解析を実施可能な方法であれば、如何なる方法を用いてもよく、上述したような核酸増幅方法とそれに続くキャピラリー電気泳動法に限定されない。後述する工程ｂでヘテロ接合性の消失を検出できるような結果を示す方法としては、例えば、質量分析装置を利用した方法やＲＴ−ＰＣＲ法やブランチド核酸ハイブリダイゼーション法（ｂ−核酸）等の方法や伸長反応時に生成される副産物をATPに変換し、これを利用して検出する方法や核酸マイクロアレイ等が利用できる。さらに、実際的には上述のような遺伝子多型解析において、定量的遺伝子多型解析が可能な方法が望ましい。
【００２１】
質量分析装置を用いる場合には、上述した核酸増幅方法に際して、遺伝子多型部位のパターンに応じて長さの異なる核酸フラグメントを増幅できるようにプライマーを設計し、このプライマーを用いて核酸増幅を行う。その後、増幅した塩基長の異なる核酸フラグメントの質量を質量分析装置により測定することで核酸フラグメントの有無を検定することができる。
【００２２】
また、工程ａにおいては、核酸増幅方法における伸長反応の進行が遺伝子多型部位におけるパターンの違いに依存するようにプライマーを設計し、伸長反応が起こった場合に発生する副産物（ATP）を利用して発光を行う系で、汎用の発光測定装置で測定することができる。
【００２３】
さらに、工程ａにおいては、核酸マイクロアレイを用いることができる。これは異なる波長帯の蛍光標識で標識された同じ塩基配列を持つ２種類のプライマーセットを用いる。一方のプライマーセットを用いて、正常細胞より得られた核酸に対して、また、もう一方のプライマーセットを用いて疾患由来細胞より得られた核酸に対して各々PCRを行う。これより得られた正常細胞由来核酸増幅断片と疾患細胞由来核酸増幅断片とを混合し、その蛍光を核酸マイクロアレイにより測定する方法である。
【００２４】
工程ｂ
上述した工程ａの後、工程ｂでは、上記工程ａにおける遺伝子多型部位群解析の結果に基づいて、ヘテロ接合性の消失を検出する。「ヘテロ接合性の消失（ＬＯＨ）」とは、ある遺伝子遺伝子多型部位のヘテロ接合体（父方と母方のアレルが異なる個体）で、一方のアレルが消失することを意味する。したがって、工程ｂにおいて、工程ａの解析結果に基づいて、検査対象の９番染色体におけるヘテロ接合性を検出することによって、９番染色体のいずれか一方の（言い換えると、父方及び/又は母方由来の）少なくとも一部の欠失を検出することができる。９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の欠失とは、相同染色体である９番染色体の一方が完全に欠失したり、部分的に欠失した場合や、相同染色体の互いに異なる遺伝子部位に部分的な欠失を起こした場合を含むものである。
【００２５】
上記工程ａにおいて核酸増幅方法とそれに続くキャピラリー電気泳動法を行った場合には、当該電気泳動法によって核酸フラグメントの有無を検定することができるため、９番染色体におけるヘテロ接合性の消失を検出することができる。具体的には、核酸フラグメントを一本鎖DNA高次構造多型解析法（ＳＳＣＰ）で解析し、ＬＯＨを検出する方法である。特に、Taq-ポリメラーゼを使用したPCRによる核酸フラグメントの増幅後、このPCR産物の末端を平滑化処理し、得られた核酸フラグメントをＳＳＣＰで解析するＬＯＨの検出方法は、特開平９−２０１１９９等に開示されている方法が利用できる。
【００２６】
ＳＳＣＰの結果としては、例えば、図３に示すように、核酸フラグメントに含まれる遺伝子多型部位のパターンに応じてアレル毎に異なるピークとして示すことができる。図３で示す各血液型のジェノタイプ（遺伝子型）は、２ヵ所の遺伝子多型部位の組合せにより複数存在する。より具体的には、Ａ型、正式名称としてはＡ101型のジェノタイプは261番目の多型部位がグアニンで、297番目の多型部位がアデニンであり、Ｂ型（Ｂ101型）のジェノタイプでは261番目の多型部位がグアニンで、297番目の多型部位がグアニンである。同様に、Ｏ1型（Ｏ101型）のジェノタイプは261番目のグアニンが欠失しており、更に297番目がアデニンであり、Ｏ2型（Ｏ201型）のジェノタイプは261番目のグアニンが欠失し、297番目がグアニンである。ヒトの血液型を決定する遺伝子型は両親に由来する対立遺伝子の遺伝子型によって決定され、これら4つの遺伝子型の組合せにより、図３に示す合計10種類の組合せが存在する。さらに、実際の検体では全ての９番染色体が欠失しているとは限らないので、完全にピークが消失するのではなく図３のようにピークの減少として検出される。図３から分かるように、９番染色体の所定の領域が欠失している場合、欠失した領域に対応する核酸フラグメントのピークが、健常サンプルと比較して小さくなる。従って、図３に示す１０種類のアレル毎に異なるピークを検出し、核酸フラグメントの有無を判定することによって、検査対象の９番染色体における欠失を特定することができる。
【００２７】
また、上記工程ａにおいて、核酸増幅の後に質量分析装置を用いて核酸フラグメントを遺伝子多型解析する場合には、質量分析装置それぞれが異なる質量の核酸フラグメントとして検出でき、その結果から求めた核酸フラグメントの有無に基づいて９番染色体におけるヘテロ接合性の消失を検出することができる。
【００２８】
特に、本発明に係る膀胱癌検査方法においては、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を用いてＬＯＨを検出している。ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位においては、集団内におけるヘテロ接合体である頻度（ヘテロ接合性）が非常に高いため、９番染色体における当該遺伝子多型部位近傍の欠失を確実に検出することができる。言い換えれば、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を用いてＬＯＨを検出することによって、９番染色体長腕末端近傍の欠失を確実に検出することができる。
【００２９】
また、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位として、例えば、遺伝子エクソン６の261番目の遺伝子多型部位及び297番目の遺伝子多型部位を用いる場合には、これら２つの遺伝子多型部位のうちいずれか一方がヘテロ接合体であればよいため、９番染色体における当該遺伝子多型部位近傍（９番染色体長腕末端近傍）の欠失をより確実に検出することができる。
【００３０】
さらに、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位に加えて、当該遺伝子多型部位以外の遺伝子多型部位を用いることによって、これらすべての遺伝子多型部位近傍の欠失を検出することができる。すなわち、工程ａで解析する遺伝子多型部位を、９番染色体に存する遺伝子多型部位のなかから９番染色体の全体を網羅するように適宜選択することによって、９番染色体の全体にわたって欠失を検出することができる。例えば、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位に加えて、上述したD9S304、D9S303、ALDOB及びD9S775についてＬＯＨを検出することによって、９番染色体の全体に亘って欠失を検出することができる。このように、９番染色体の全体に亘って欠失を検出することによって、膀胱癌の悪性度を検査することができる。
【００３１】
なお、上述した工程ａ及び工程ｂは、例えば図４に示す検査装置１において実行することができる。検査装置１は、生体試料から核酸を抽出する核酸抽出部２と、抽出した核酸を膀胱癌検査キットに含まれる反応溶液と混合する核酸混合部３と、反応溶液に含まれる核酸を鋳型として核酸増幅を実行する核酸増幅部４とを備える。また、検査装置１は、反応溶液に含まれる核酸フラグメントを検出する検出部５を備える。さらに、検査装置１は、核酸抽出部２と核酸混合部３と核酸増幅部４に関する操作条件等の入力及びこれら各部からデータ等が出力される操作・出力部７を備える。さらにまた、検査装置１は、検出部に対する操作条件等を入力し、検出部からの検出データが出力される操作・ＬＯＨ解析部８を備える。
【００３２】
このように構成された検査装置１を用いることによって、検査対象から採取した生体試料からの核酸の抽出、反応溶液の調製、反応溶液に含まれる核酸の増幅反応、及びＬＯＨの検出を自動的に行うことができる。また、検査装置１を用いることによって、多数の検査対象の解析を同時に行うことができる。
【００３３】
【実施例】
以下に、実験例及び実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。
【００３４】
実験例１
１．検体の入手
膀胱癌患者の検体は、次のようにして入手して処理後、ＬＯＨを解析するまで保存した。経尿道切除術（ＴＵＲ）やバイオプシィーで入手した新鮮な組織の一部は、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、−８０℃で凍結保存した。尿は、内視鏡検査前に、自然排尿で、５０ｍＬの遠心チューブに採取した。この尿を、１０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、沈渣を集めた。この沈渣に、４０ｍＬの生理食塩水を加えて再分散し、再度１０００ｒｐｍで５分間遠心後、上清を捨て、残ったペレットを−８０℃で凍結保存した。正常組織核酸は、末梢血の白血球（ＰＢＬ）から抽出した。１０ｍＬの静脈血をヘパリン入りの採血管に採取し、３０００ｒｐｍで１５分間遠心後、血漿を廃棄した。この採血管に、０．２％の食塩水４０ｍＬを加えて溶血し、再度３０００ｒｐｍで１５分間遠心後、上清液を捨て、同様の操作を２回繰り返した。残ったペレットは、−８０℃で凍結保存した。陰性対照には、良性の尿路疾患患者２０例の尿と血液を採取し、膀胱癌患者の検体と同様に処理して、−８０℃に凍結して保存した。
【００３５】
２．核酸の抽出
上記１．で得られた凍結保存検体からの核酸の抽出は、プロテナーゼＫで消化後、フェノール・クロロフォルムで抽出するデイビスら（Basic Method in Moleular Biology, Elsevir Science Publishing 社出版）や菅野らの（Lab. Invest. 68 ｐ361-366 Sugano等(1993)）の方法で行った。要約すると、６５℃で１５分間処理した検体に、１ｍｇ／ｍＬプロテナーゼＫ、１０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ、０．４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１５０ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌトリス−塩酸緩衝液を加えて３７℃で一夜インキュベート後、この反応液に等量のフェノール：クロロフォルム＝１：１溶液を加えて２回核酸を抽出した。抽出液に、０．１容の３ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム溶液と２．５容の冷無水エタノールを加え、−２０℃で２時間冷却し、核酸を沈殿させた。尿と癌組織のサンプルには、エタノール沈殿のキャリアーとして２０μｇのグリコーゲンを加え、核酸の回収率を向上させた。この溶液を遠心して沈殿物を集め、さらに、１ｍＬの８０％エタノールを加えて洗浄後、真空遠心濃縮機で沈殿を乾固した。この核酸を含む沈殿物は、ＴＥ緩衝液で再溶解した。
【００３６】
３．蛍光標識オリゴヌクレオチドプライマーの調製
第９染色体上のABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を含む領域を増幅するためのプライマーを表１にまとめた。
【００３７】
【表１】
Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTM（Ｃｙ５TM）ａｍｉｄｉｔｅ試薬（ファルマシア社）を用いて、配列番号１のＰＣＲ用プライマーの５’末端側を、indodicarbocyanine（Ｃｙ５）蛍光色素で標識した。遺伝子多型部位としては、第９番染色体上の、ABO式血液型遺伝子のエクソン６（ＡＢＯエキソン６）の部位を使用した。このABOエクソン６は染色体9q34.1部位から9q34.2部位と同定されているが、表1に示したプライマー配列は本発明者等が独自に膀胱癌再発検査に有用な遺伝子多型部位としてSSCP用に最適化したものである。
【００３９】
４．ＰＣＲ
生体試料より抽出したゲノム核酸（鋳型）0.1μg 、表１に示したプライマーを各1.0ｐＭ、10ｎＭヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、10μＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ8.3）、50ｍＭＫＣｌ、1.5ｍＭＭｇＣｌ2、0.001％(w/v)ゼラチン、Ｔａｑ核酸ポリメラーゼ（Perkin Elmer社）1.25unitを加え、全液量を25μlとした。この溶液について、以下の条件でPCRを行った。ＰＣＲ増幅の条件は、９５℃で１２分間の初回変性の後、９５℃で３０秒、５７℃で3０秒及び７２℃で３０秒を１サイクルとして３５サイクル、その後、７２℃で７分間の伸長反応を行う条件とした。
【００４０】
５．ＰＣＲ産物の３’末端平滑化
ＰＣＲで増幅した核酸フラグメントは、Klenow fragment （宝酒造（株）製）で処理し、末端を平滑化した。５μL のＰＣＲ産物に、0.5 units の Klenow fragment１μｌを加え、37℃で30分間反応し、反応後100ｍＭＥＤＴＡ１μｌ加えた（Genes. Chromosomes &Cancer 15 p157-164 Sugano等(1996)）。
【００４１】
６. 一本鎖DNA高次構造多型解析（ＳＳＣＰ解析）
末端平滑化した核酸フラグメントは、ポリアクリルアミドゲルとトリス・グリシンバッファー（Tris：１５％(w/v)、Glycine：３．２％(w/v)）を用いて、ファルマシア社の電気泳動装置Ａ．Ｌ．Ｆ．ｒｅｄTMにより泳動条件１８℃、２５Ｗで１５００分で解析を行った。
【００４２】
実施例２
VAV2 と ABO エクソン６におけるヘテロ接合体の割合の比較
9番染色体上の遺伝子多型部位がほぼ同じ場所（9ｑ34）に位置するVAV2とABOエクソン６に関するヘテロ接合体とヘテロ接合体の割合（ヘテロ接合性）とを比較した（表２）。従来遺伝子遺伝子多型部位として使用していたVAV2では膀胱癌患者72例のうち30例がヘテロ接合体で、ヘテロ接合体の割合は約41.7％だった。これに対し、ABOエクソン６では膀胱患者72例の57例がヘテロ接合体で、ヘテロ接合体の割合は約79.2％だった。
【００４３】
【表２】
表２に示した結果より、ABO式血液型遺伝子に存在する遺伝子多型部位を用いてＬＯＨを検出することにより、９番染色体長腕末端近傍の欠失を効率的に検出でき、膀胱癌の検査性能を大幅に向上できることが明らかとなった。
【００４５】
【発明の効果】
本発明よれば、９番染色体における長腕末端付近の欠損を効率的に同定できる。
【００４６】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】第９番染色体と第９番染色体におけるABO式血液型遺伝子を拡大して示す図である。
【図２】 ABOエクソン６の遺伝子配列構造を示す図である。
【図３】ＳＳＣＰ解析による出力を示す図である。
【図４】膀胱癌の検査を行う検査装置を概略的に示す図である。
【符号の説明】
１…検査装置、２…核酸抽出部、３…核酸混合部、４…核酸増幅部
５…検出部
Claims (5)
- 検査対象の生体試料を用いて、９番染色体のABO式血液型遺伝子におけるエクソン６に存在する２６１番目の塩基及び/又は２９７番目の塩基に関する一塩基多型を解析する工程と、
上記解析の結果に基づいて、上記多型部位に関するヘテロ接合性の消失を検出する工程と
を含む膀胱癌検査方法。 - 検査対象の生体試料を用いて、９番染色体のABO式血液型遺伝子におけるエクソン６に存在する２６１番目の塩基及び/又は２９７番目の塩基に関する一塩基多型を解析する工程と、
上記解析の結果に基づいて、９番染色体のいずれか一方の少なくとも一部の消失を検出する工程と
を含む膀胱癌検査方法。 - 上記一塩基多型及びその他の多型部位を含む核酸断片を増幅し、増幅した核断片を用いて上記解析を行うことを特徴とする請求項１又は２記載の膀胱癌検査方法。
- 上記解析は、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析であることを特徴とする請求項１又は２記載の膀胱癌検査方法。
- 上記一本鎖ＤＮＡ高次構造多型解析はキャピラリー式電気泳動により実施することを特徴とする請求項４記載の膀胱癌検査方法。
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