JP3239456B2 - Method for dissolving liposome membrane and immunoassay using the same - Google Patents
Method for dissolving liposome membrane and immunoassay using the sameInfo
- Publication number
- JP3239456B2 JP3239456B2 JP21727292A JP21727292A JP3239456B2 JP 3239456 B2 JP3239456 B2 JP 3239456B2 JP 21727292 A JP21727292 A JP 21727292A JP 21727292 A JP21727292 A JP 21727292A JP 3239456 B2 JP3239456 B2 JP 3239456B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- liposome
- biotin
- substance
- avidin
- antigen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、アビジンとビオチンと
の反応を利用したリポソーム膜の新しい溶解方法と、該
溶解方法を利用した、例えば抗原、抗体、糖鎖、レクチ
ン、核酸等の新規定量方法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel method for dissolving liposome membranes utilizing the reaction between avidin and biotin, and a novel method for quantifying antigens, antibodies, sugar chains, lectins, nucleic acids, etc. using the dissolution method. About the method.
【0002】[0002]
【発明の背景】免疫測定法は、抗原抗体反応を利用した
測定法であり、例えば体液中のタンパク質,ホルモン,
活性ペプチド,オータコイド,腫瘍マーカー,免疫グロ
ブリン等の生体成分、ジゴキシン,フェニトイン,フェ
ノバルビタール等の薬剤等の微量成分を特異的に測定す
る方法の1つとして広く用いられている。現在一般によ
く利用されている免疫測定法としては、例えばラジオイ
ムノアッセイ法(RIA法)やエンザイムイムノアッセ
イ法(EIA法)等が挙げられる。これらの方法は検体
中の微量成分を定量的に測定し得る方法ではあるが、夫
々問題点も有している。即ち、RIA法に於いては、放
射性同位元素を使用しなければならないことから、特別
な設備が必要である点、及び廃棄物の処理が問題となる
点等の問題点が、また、EIA法に於いては、測定に比
較的時間を要する点、及び自動分析機への応用が難しい
点等の問題点が夫々挙げられる。BACKGROUND OF THE INVENTION An immunoassay is an assay utilizing an antigen-antibody reaction, such as protein, hormone,
It is widely used as one of the methods for specifically measuring biological components such as active peptides, autakoids, tumor markers, and immunoglobulins, and trace components such as drugs such as digoxin, phenytoin, and phenobarbital. Examples of immunoassays that are currently generally used include, for example, a radioimmunoassay (RIA) and an enzyme immunoassay (EIA). Each of these methods is a method capable of quantitatively measuring a trace component in a specimen, but each has its own problems. That is, in the RIA method, radioisotopes must be used, so that special equipment is required, and the problem of waste disposal becomes a problem. However, there are problems in that the measurement takes a relatively long time and that application to an automatic analyzer is difficult.
【0003】そこで、最近では、これらの問題点を有さ
ない免疫測定法として、リポソームを用いる免疫活性測
定法(以下、リポソーム免疫測定法と略記する。)が提
案され注目を浴びている。この方法の代表的なものとし
ては、特開昭56-132564号公報に記載の方法が挙げられ
る。この方法は、測定対象物質を表面に固定化し内部に
標識物質(例えば酵素等)を保持したリポソーム、検
体、及び測定対象物質に対する抗体を混合して抗原抗体
反応を行わせた後、補体を添加すると、該リポソームの
表面上に形成された抗原抗体複合物により活性化された
補体が該リポソーム膜を溶解して、該リポソーム中の標
識物質を遊出させ、その量から検体中の測定対象物質量
を測定するという方法である。この補体を用いたリポソ
ーム免疫測定法(以下、補体免疫測定法と略記する。)
は、RIA法やEIA法の上記問題点を有さず、且つ均
一反応系中で一連の反応を行えるため、簡便に且つ短時
間に測定を実施し得る点から注目を集めている測定方法
である。Therefore, recently, as an immunoassay method which does not have these problems, an immunoassay method using liposomes (hereinafter abbreviated as liposome immunoassay method) has been proposed and attracted attention. A representative example of this method is the method described in JP-A-56-132564. In this method, a liposome in which a substance to be measured is immobilized on a surface and a labeling substance (eg, an enzyme or the like) is held, a sample, and an antibody to the substance to be measured are mixed, and an antigen-antibody reaction is performed. Upon addition, the complement activated by the antigen-antibody complex formed on the surface of the liposome dissolves the liposome membrane, allowing the labeling substance in the liposome to elute, and measuring the amount in the sample from the amount. This is a method of measuring the amount of a target substance. Liposome immunoassay using this complement (hereinafter abbreviated as complement immunoassay).
Is a measurement method that has attracted attention because it does not have the above-mentioned problems of the RIA method or the EIA method and can perform a series of reactions in a homogeneous reaction system, so that measurement can be performed easily and in a short time. is there.
【0004】しかしながら、補体免疫測定法では、補体
自体が不安定な物質であるため測定用試薬の安定性に問
題があることや、測定用試薬と非特異的に反応して補体
を活性化しリポソームの一部を破壊して標識物質を遊出
させてしまうような作用を有する物質が試料中に存在し
て測定誤差が生じる等の問題があるところから、補体以
外のリポソーム膜溶解活性を有する物質(以下、膜溶解
剤と略記する)を使用するリポソーム免疫測定法が、次
いで開発された。However, in the complement immunoassay, there is a problem in the stability of the measuring reagent because complement itself is an unstable substance, and the complement reacts non-specifically with the measuring reagent to convert complement. Dissolution of liposome membranes other than complement can be caused by the presence of a substance in the sample that has the effect of activating and destroying part of the liposome to dislodge the labeling substance, causing measurement errors. A liposome immunoassay using an active substance (hereinafter abbreviated as a membrane lysing agent) was then developed.
【0005】即ち、リッチフィールドらにより報告され
たミツバチ毒の主要成分であるメリチンに代表されるサ
イトリシンを用いた方法がそれである。この方法は、メ
リチン分子と測定対象物質との複合体を調製し、この複
合体が測定対象物質に対する抗体と結合するとメリチン
の膜溶解活性が失われることを利用して、メリチン−測
定対象物質複合体と遊離の測定対象物とを、該抗体と競
合的に反応させた後、残存するメリチンのリポソーム膜
溶解活性を測定することにより、測定対象物質を定量す
る方法である(W.J.Litchfieldら,Clin.Chem.,30巻,14
41頁,1984)。しかしな がら、この方法も、メリチンの
入手が難しいことや、メリチンを高濃度に使用しなけれ
ば充分なリポソーム膜溶解活性が得られないこと等の問
題点があり、必ずしも実用的な方法とは言えない。That is, a method using cytolysin represented by melittin, which is a main component of bee venom, reported by Richfield et al. This method prepares a complex of a melittin molecule and a substance to be measured, and takes advantage of the fact that the membrane lytic activity of melittin is lost when the complex binds to an antibody against the substance to be measured. This is a method for quantifying a substance to be measured by reacting the body and a free substance to be measured with the antibody competitively, and then measuring the liposome membrane dissolving activity of the remaining melittin (WJ Litchfield et al., Clin. Chem., Volume 30, 14
41, 1984). However, this method also has problems that it is difficult to obtain melittin and that sufficient liposome membrane dissolving activity cannot be obtained unless melittin is used at a high concentration. I can not say.
【0006】[0006]
【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、補体やサイトリシンを用いる方法に代る新
しいリポソーム膜溶解方法と、この溶解方法を利用し
た、例えば抗原、抗体、糖鎖、レクチン、核酸等の新規
な定量方法を提供することを目的とする。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and provides a new liposome membrane dissolving method instead of a method using complement or cytolysin, and an antigen, antibody, It is an object of the present invention to provide a novel method for quantifying sugar chains, lectins, nucleic acids, and the like.
【0007】[0007]
【発明の構成】本発明は、予め膜表面上にビオチンを固
定化したリポソームに、界面活性剤とアビジンとを作用
させることを特徴とする、リポソーム膜溶解方法、及び
界面活性剤とアビジンとを含んで成る、予め膜表面上に
ビオチンを固定化したリポソームの膜溶解剤、並びに予
め膜表面上にビオチンを固定化し、且つ内部に標識物質
を保持したリポソームに対する界面活性剤とアビジンと
の該リポソーム膜溶解活性を、測定対象物質とそれに対
して特異的に結合する性質を有する物質との反応を利用
して減少させ、その減少の程度に応じて該リポソームか
ら遊出する標識物質量を測定することにより測定対象物
質量を定量することを特徴とする定量方法の発明であ
る。The present invention provides a method for dissolving a liposome membrane and a method for dissolving a surfactant and avidin, wherein a surfactant and avidin are allowed to act on liposomes having biotin immobilized on the membrane surface in advance. A liposome membrane solubilizer comprising biotin immobilized on the membrane surface in advance, and a liposome comprising a surfactant and avidin for the liposome in which biotin is immobilized on the membrane surface in advance and a label is retained inside Membrane lytic activity is reduced by using a reaction between a substance to be measured and a substance having a property of specifically binding thereto, and the amount of a labeling substance that migrates from the liposome is measured according to the degree of the reduction. This is an invention of a quantification method characterized by quantifying the amount of a substance to be measured.
【0008】即ち、本発明者らは、補体やサイトリシン
を用いる方法に代わる新しいリポソーム膜溶解方法を見
出すべく鋭意研究の途上、予め膜表面上にビオチンを固
定化したリポソーム(以下、ビオチンリポソームと略記
する。)にアビジンを反応させる際に界面活性剤を共存
させると、意外にも該リポソーム膜が溶解され、しかも
その溶解の程度は反応させるアビジンの量に対応するこ
と、更にはこの反応と、例えば抗原、抗体、糖鎖、レク
チン若しくは核酸等の測定対象物質とそれに特異的に結
合し得る性質を有する物質との反応とを組み合わせるこ
とにより、これら測定対象物質の定量を行い得ることを
見出し本発明を完成させるに至った。That is, the inventors of the present invention have intensively studied to find a new method for dissolving a liposome membrane instead of a method using complement or cytolysine. In the course of intensive research, liposomes having biotin immobilized on the membrane surface in advance (hereinafter referred to as biotin liposome) When a surfactant is present in the reaction of avidin, the liposome membrane is unexpectedly dissolved, and the degree of the dissolution corresponds to the amount of avidin to be reacted. And the reaction between a substance to be measured, such as an antigen, an antibody, a sugar chain, a lectin, or a nucleic acid, and a substance having a property capable of specifically binding to the substance. The present invention has been completed.
【0009】本発明に於いて用いられるビオチンとして
は、アビジンとの結合能を有しているものであれば、そ
の由来は特に限定されず、動物の肝臓,肉,乳,卵由来
のもの、微生物由来のもの、穀類や野菜由来のもの、合
成されたもの等何れにてもよい。The biotin used in the present invention is not particularly limited as long as it has an ability to bind to avidin, and is derived from animal liver, meat, milk and eggs. It may be any of those derived from microorganisms, those derived from cereals or vegetables, and those synthesized.
【0010】また、本発明に係るビオチンリポソームと
しては、リポソームの膜表面上にビオチンが固定化され
たものであれば特に限定することなく挙げられるが、そ
のようなビオチンリポソームの製法としては例えば架橋
法,脂質活性化法等の常法によりリポソーム膜表面にビ
オチンを固定化する方法、或は予めビオチンを共有結合
させた脂質(以下、ビオチン結合脂質と略記する。)を
用いてリポソームを調製することによりビオチンをリポ
ソーム膜に組み込む方法(Bayerら,B.B.A.,vol.550,
464,1979等)等が挙げられ、中でもビオチン結合脂質
を用いてリポソームを調製することによりビオチンをリ
ポソーム膜に組み込む方法がより好ましく挙げられる。
尚、ビオチンリポソームの膜表面上に固定化されるビオ
チン量としては、アビジンと界面活性剤存在下で該リポ
ソーム膜が溶解される量であれば特に限定されないが、
通常10〜400pmol、好ましくは60〜350pmolの範囲が挙げ
られる。[0010] The biotin liposome according to the present invention is not particularly limited as long as biotin is immobilized on the membrane surface of the liposome. Examples of the method for producing such biotin liposome include cross-linking. Liposomes are prepared by immobilizing biotin on the liposome membrane surface by a conventional method such as a lipid activation method or a lipid to which biotin has been covalently bonded in advance (hereinafter abbreviated as biotin-bound lipid). By incorporating biotin into the liposome membrane (Bayer et al., BBA, vol.550,
464, 1979, etc.). Among them, a method of incorporating biotin into a liposome membrane by preparing a liposome using a biotin-bound lipid is more preferable.
The amount of biotin immobilized on the biotin liposome membrane surface is not particularly limited as long as the liposome membrane is dissolved in the presence of avidin and a surfactant.
Usually, the range is 10 to 400 pmol, preferably 60 to 350 pmol.
【0011】本発明で用いられる、内部に標識物質を保
持したビオチンリポソーム(以下、標識ビオチンリポソ
ームと略記する。)としては、上記した如くして得られ
るビオチンリポソームの内部に標識物質を保持させたも
のであれば何れにてもよい。本発明で用いられるリポソ
ームそのものの調製方法としては、従来から知られてい
るボルテックスイング法,超音波法,界面活性剤除去
法,逆相蒸発法(REV法),エタノール注入法,エー
テル注入法,プレ-ベジクル(Pre-Vesicle)法,フレンチ
プレスエクストルージョン(French Press Extrusion)
法,Ca2+融合法,アニーリング(Annealing)法,凍結融
解融合法,凍結乾燥法,W/O/Wエマルジョン法等の方法
や、最近、S.M.Grunerら[Biochemistry, 24, 2833(198
5)]により報告された Stable Plurilamellar Vesicle
法(SPLV法)、本発明者の一部らによって報告され
たリポポリサッカライドを膜構成成分の一部とする方法
(特開昭63-107742号公報)等の方法が全て挙げられ
る。また、その主たる膜構成成分としては、通常のリポ
ソームの調製に於いて膜素材として用いられている天然
レシチン(例えば、卵黄レシチン,大豆レシチン等)や
ジパルミトイルフォスファチジルコリン(DPPC),ジミリ
ストイルフォスファチジルコリン(DMPC),ジステアロイ
ルフォスファチジルコリン(DSPC),ジオレオイルフォス
ファチジルコリン(DOPS),ジパルミトイルホスファチジ
ルエタノールアミン(DPPE),ジミリストイルフォスファ
チジルエタノールアミン(DMPE),ジパルミトイルフォス
ファチジルグリセロール(DPPG),ジミリストイルフォス
ファチジン酸(DMPA),卵黄フォスファチジルグリセロー
ル等のリン脂質、或はガングリオシド糖脂質,スフィン
ゴ糖脂質,グリセロ糖脂質等の糖脂質等の1種又は2種
以上、或はこれらとコレステロール類との混合系、或は
これらに更にリポポリサッカライド等を組み合わせたも
の等が全て挙げられる。As the biotin liposome containing a labeled substance therein (hereinafter, abbreviated as labeled biotin liposome) used in the present invention, the labeled substance is retained inside the biotin liposome obtained as described above. Any of them may be used. The method for preparing the liposome itself used in the present invention includes vortex swing method, ultrasonic method, surfactant removal method, reverse phase evaporation method (REV method), ethanol injection method, ether injection method, and the like. Pre-Vesicle method, French Press Extrusion
Method, Ca2 + fusion method, annealing (Annealing) method, freeze-thaw fusion method, freeze-drying method, W / O / W emulsion method, and recently, SMGruner et al. [Biochemistry, 24, 2833 (198
5)] Stable Plurilamellar Vesicle reported by
And the method of using lipopolysaccharide as a part of the membrane component reported by some of the present inventors (JP-A-63-107742). The main membrane components include natural lecithin (eg, egg yolk lecithin, soybean lecithin, etc.), dipalmitoyl phosphatidylcholine (DPPC), and dimyristoyl, which are used as membrane materials in the preparation of ordinary liposomes. Phosphatidylcholine (DMPC), distearoylphosphatidylcholine (DSPC), dioleoylphosphatidylcholine (DOPS), dipalmitoylphosphatidylethanolamine (DPPE), dimyristoylphosphatidylethanolamine (DMPE), One kind of phospholipid such as palmitoyl phosphatidyl glycerol (DPPG), dimyristoyl phosphatidic acid (DMPA), egg yolk phosphatidyl glycerol, or glycolipid such as ganglioside glycolipid, glycosphingolipid, glyceroglycolipid, etc. Or two or more, or these and cholesterol Mixed system, or more like a combination of lipopolysaccharide etc. thereof all.
【0012】本発明に係るビオチンリポソーム(或は標
識ビオチンリポソーム)の調製法を、ビオチン結合脂質
を原料の1つとして用いて界面活性剤除去法により調製
する場合を例に取り上げて以下に詳しく説明する。即
ち、先ず例えば前記公知文献(Bayerら,B.B.A.,vol.5
50,464,1979)に記載された方法に準じて調製された
ビオチン結合脂質とコレステロール類とを適当な有機溶
媒(例えば、クロロホルム,エーテル類,アルコール類
等)に溶解し、減圧下で濃縮乾固後、デシケーター中で
充分減圧乾燥する。次いで、作製された脂質フィルムに
界面活性剤水溶液(20〜100mM)を加えて、これを均一に
分散させる。ここで使用する界面活性剤としては、例え
ば、従来からこの分野に於いてよく用いられているコー
ル酸,ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル,
オクチルグルコシド等が挙げられるが、望ましくは、オ
クチルグルコシドの様な臨界ミセル濃度(CMC)の高い界
面活性剤が良い。次に、要すればリポポリサッカライド
類を粉末のまま、或は溶液として加え、更に要すれば適
当な標識物質を含む溶液を加えて充分に攪拌混合する。
この後、直ちに界面活性剤を除去するのが最も望ましい
が、その方法としては透析法,ゲル濾過法,樹脂吸着法
等、自体公知の方法が挙げられる。処理条件は時間とし
て1時間乃至1昼夜で、温度はリポソームの膜構成成分
等により若干異なるが、0〜70℃位の範囲で適宜選択し
て行えばよい。特に、界面活性剤を除去する方法とし
て、Sepharose 4B(ファルマシア社商品名)を用いるゲ
ル濾過や遠心分離等の操作により行えば、遊離の標識物
質等も同時に除去できるので有利である。かくして得ら
れたビオチンリポソーム(或は標識ビオチンリポソー
ム)は限外濾過等により所定の濃度に濃縮して使用、又
は保存される。ビオチンリポソーム(或は標識ビオチン
リポソーム)のサイズの均一化に関しては、繁用されて
いるポリカーボネート膜を用いる方法で良いが、ゲル濾
過法[例えば Sephacryl S-1000(ファルマシア社商品
名)を使用]で行うのも効果的である。The method for preparing the biotin liposome (or labeled biotin liposome) according to the present invention will be described in detail below, taking as an example a case where the biotin liposome is prepared by a surfactant removing method using a biotin-bound lipid as one of the raw materials. I do. That is, first, for example, the above-mentioned known literature (Bayer et al., BBA, vol.5)
50, 464, 1979), dissolving a biotin-bound lipid and cholesterol prepared according to the method described in an appropriate organic solvent (eg, chloroform, ethers, alcohols, etc.) and concentrating to dryness under reduced pressure. After solidification, the mixture is sufficiently dried in a desiccator under reduced pressure. Next, an aqueous surfactant solution (20 to 100 mM) is added to the prepared lipid film, and the resultant is uniformly dispersed. Examples of the surfactant used here include cholic acid, polyoxyethylene octyl phenyl ether, and coxy acid, which are conventionally used in this field.
Octyl glucoside and the like can be mentioned, and a surfactant having a high critical micelle concentration (CMC) such as octyl glucoside is preferable. Next, if necessary, the lipopolysaccharides are added as a powder or as a solution, and if necessary, a solution containing an appropriate labeling substance is added, followed by sufficient stirring and mixing.
After this, it is most desirable to immediately remove the surfactant, and examples thereof include methods known per se, such as dialysis, gel filtration, and resin adsorption. The treatment conditions are 1 hour to 1 day and night, and the temperature varies slightly depending on the membrane components of the liposome, etc., but may be appropriately selected within the range of about 0 to 70 ° C. In particular, it is advantageous to remove the surfactant by performing an operation such as gel filtration or centrifugation using Sepharose 4B (trade name of Pharmacia) as a method for removing the surfactant, because free labeling substances and the like can be removed at the same time. The biotin liposome (or labeled biotin liposome) thus obtained is used or stored after being concentrated to a predetermined concentration by ultrafiltration or the like. Regarding the homogenization of the size of biotin liposomes (or labeled biotin liposomes), a method using a commonly used polycarbonate membrane may be used, but a gel filtration method [for example, using Sephacryl S-1000 (trade name of Pharmacia)] is used. It is also effective to do so.
【0013】界面活性剤除去法以外の方法で本発明に係
るビオチンリポソーム(或は標識ビオチンリポソーム)
を調製する場合についても、同様に、自体公知の或はそ
の他のリポソーム調製法に準じてこれを行えば良い。[0013] The biotin liposome (or labeled biotin liposome) of the present invention by a method other than the surfactant removal method
In the case of preparing the liposome, it may be similarly performed according to a method known per se or another liposome preparation method.
【0014】標識ビオチンリポソーム内に保持される標
識物質としては、補体を用いるリポソーム免疫測定法に
於いて通常用いられる、リポソーム外に遊出した際に検
出可能な標識物質であれば何れにてもよく特に限定され
ることなく挙げられるが、例えばアルカリホスファター
ゼ,グルコース-6-リン酸脱水素酵素,β-ガラクトシダ
ーゼ等の酵素類、例えば4-メチルウンベリフェリルβ-D
-ガラクトシド、p-ヒドロキシフェニルプ ロピオン酸、
4-メチルウンベリフェリルフォスフェート、グルコース
-6-リン酸 等の酵素の基質、例えばカルボキシフルオレ
セイン、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレ
セインイソシアネート、テトラローダミンイソチオシア
ネート、5-ジメチルアミノ-1-ナフタレンスルフォニル
クロリド等の蛍光物質類、例 えばアルセナゾIII,4-(2
-ピリジルアゾ)レゾルシノール,2-(5-ブロモ-2-ピリジ
ルアゾ)-5-(N-プロピル-N-スルホプロピル)アミノフェ
ノール ナトリウム塩等の色素類、例えばルミノール,
イソルミノール,ルシフェリン,エオシンY,オーラミ
ンO,ビス(2,4,6-トリクロロフェニル)オキザレート,
N-メチルアクリジニウムエステル等の発光物質類、例え
ば2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オ キシル(TEMP
O)等に代表されるスピンラベル化剤類等が代表的なもの
として挙げられる。また、リポソームに保持される標識
物質の量は標識物質の種類により異なり特に限定されな
いが、リポソーム膜の破壊の前後で充分検出可能な差が
生じる量が保持されていれば良く、例えば標識物質がグ
ルコース-6-リン酸脱水素酵素の 場合を例にとると、リ
ポソーム調製時に使用される標識物質を含む溶液として
通常1000〜5000U/ml、好ましくは2000〜3000U/mlの濃度
の酵素溶液を用いればよい。The labeling substance retained in the labeled biotin liposome may be any labeling substance which is usually used in liposome immunoassay using complement and which can be detected when it has migrated out of the liposome. Examples thereof include, but are not limited to, enzymes such as alkaline phosphatase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, and β-galactosidase, for example, 4-methylumbelliferyl β-D
-Galactoside, p-hydroxyphenylpropionic acid,
4-methylumbelliferyl phosphate, glucose
Substrates for enzymes such as -6-phosphate, for example, fluorescent substances such as carboxyfluorescein, fluorescein isothiocyanate, fluorescein isocyanate, tetrarhodamine isothiocyanate, 5-dimethylamino-1-naphthalenesulfonyl chloride, for example, arsenazo III, 4- (2
Dyes such as -pyridylazo) resorcinol, 2- (5-bromo-2-pyridylazo) -5- (N-propyl-N-sulfopropyl) aminophenol sodium salt, for example, luminol,
Isorluminol, luciferin, eosin Y, auramine O, bis (2,4,6-trichlorophenyl) oxalate,
Luminescent substances such as N-methylacridinium ester, for example, 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl (TEMP
Typical examples thereof include spin labeling agents represented by O) and the like. Further, the amount of the labeling substance retained in the liposome is different depending on the type of the labeling substance and is not particularly limited. It is sufficient that the labeling substance is retained in such an amount that a sufficiently detectable difference before and after the liposome membrane is destroyed is retained. Taking the case of glucose-6-phosphate dehydrogenase as an example, an enzyme solution having a concentration of usually 1,000 to 5,000 U / ml, preferably 2,000 to 3,000 U / ml is used as a solution containing a labeling substance used in preparing liposomes. I just need.
【0015】本発明に於いて用いられるアビジンとして
は、ビオチンとの結合能を有しているものであればその
由来は特に限定されないが、通常は卵白由来のものが好
ましく挙げられる。尚、微生物由来のストレプトアビジ
ン等、アビジンと同等の作用を有するものも本発明に於
いてはアビジンと同様に使用できることは言うまでもな
い。The origin of avidin used in the present invention is not particularly limited as long as it has a binding ability to biotin, but usually, it is preferably derived from egg white. It is needless to say that those having the same action as avidin, such as streptavidin derived from microorganisms, can be used in the present invention in the same manner as avidin.
【0016】本発明に於いて用いられる界面活性剤とし
ては、例えばポリオキシエチレンセチルエーテル,ポリ
オキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル類、例えばポリオキシエチレンオク
チルフェニルエーテル等のポリオキシエチレンアルキル
フェニルエーテル類、例えばポリオキシエチレンソルビ
タンモノオレエート,ポリオキシエチレンソルビタンモ
ノパルミテート,ポリオキシエチレンソルビタンモノス
テアレート,ポリオキシエチレンソルビタントリオレー
ト等のポリオキシエチレンアルキルエステル類、例えば
オクタノイル-N-メチルグルカミド,ノナノイル-N-メチ
ルグルカミド,デカノイル-N-メチルグルカミド等のメ
チルグルカミド誘導体、例えばn-オクチル-β-D-グルコ
シド等のアルキル糖誘導体等の非イオン界面活性剤、例
えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、ラウリルベンゼン
スルホン酸、デオキシコール酸、コール酸、トリス(ヒ
ドロキシメチル)アミノメタンドデシルサルフェイト(T
ris DS)等のアニオン界面活性剤、例えばオクタデシル
アミン酢酸塩,テトラデシルアミン酢酸塩,ステアリル
アミン酢酸塩,ラウリルアミン酢酸塩,ラウリルジエタ
ノールアミン酢酸塩等のアルキルアミン塩、例えば塩化
オクタデシルトリメチルアンモニウム,塩化ドデシルト
リメチルアンモニウム,塩化セチルトリメチルアンモニ
ウム,臭化セチルトリメチルアンモニウム,塩化ラウリ
ルトリメチルアンモニウム,メチル硫酸アリルトリメチ
ルアンモニウム,塩化ベンザルコニウム,塩化テトラデ
シルジメチルベンジルアンモニウム,塩化オクタデシル
ジメチルベンジルアンモニウム,塩化ラウリルジメチル
ベンジルアンモニウム等の第4級アンモニウム塩、例え
ば塩化ラウリルピリジニウム,塩化ステアリルアミドメ
チルピリジニウム等のアルキルピリジニウム塩等のカチ
オン界面活性剤、3-[(3-コラミドアミドプロピル)ジメ
チルアンモニオ]-1-プロパンスルホネイト、3-[(3-コラ
ミドアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキ
シ-1-プロパンスルホネイト等の両性界面活性剤、サポ
ニン(大豆由来)、ジギトニン等の天然の界面活性剤等
の界面活性剤が挙げられる。また、本発明の溶解方法に
於けるこれらの使用濃度としては、用いるビオチンリポ
ソーム(或は標識ビオチンリポソーム)の膜組成や調製
方法、或は界面活性剤の種類により異なるが、少なくと
も界面活性剤単独ではビオチンリポソーム(或は標識ビ
オチンリポソーム)の膜を溶解せず、アビジンを共存さ
せた場合に初めて該リポソーム膜を溶解する濃度、或は
用いるビオチンリポソーム(或は標識ビオチンリポソー
ム)の膜を溶解したとしてもその程度がアビジンを共存
させて溶解させた場合に比較して充分に差が見られる程
度となるような濃度であれば何れにてもよく、通常リポ
ソームを含む溶液中の最終濃度として、0.001〜1.0V/V
%、好ましくは0.02〜0.5V/V%の範囲で適宜選択され
る。The surfactant used in the present invention includes, for example, polyoxyethylene alkyl ethers such as polyoxyethylene cetyl ether and polyoxyethylene lauryl ether, and polyoxyethylene alkyl such as polyoxyethylene octyl phenyl ether. Phenyl ethers, for example, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene alkyl esters such as polyoxyethylene sorbitan triolate, for example, octanoyl-N-methyl Methylglucamide derivatives such as glucamide, nonanoyl-N-methylglucamide, decanoyl-N-methylglucamide, and alkyl sugar derivatives such as n-octyl-β-D-glucoside Nonionic surfactants like, for example, sodium dodecyl sulfate (SDS), lauryl benzenesulfonic acid, deoxycholic acid, cholic acid, tris (hydroxymethyl) aminomethane dodecyl Sulfate (T
anionic surfactants such as ris DS), for example, alkylamine salts such as octadecylamine acetate, tetradecylamine acetate, stearylamine acetate, laurylamine acetate, lauryldiethanolamine acetate, for example, octadecyltrimethylammonium chloride, dodecyl chloride Trimethylammonium, cetyltrimethylammonium chloride, cetyltrimethylammonium bromide, lauryltrimethylammonium chloride, allyltrimethylammonium methylsulfate, benzalkonium chloride, tetradecyldimethylbenzylammonium chloride, octadecyldimethylbenzylammonium chloride, lauryldimethylbenzylammonium chloride, etc. Quaternary ammonium salts such as laurylpyridinium chloride, stearylamidomethylpyridinium chloride, etc. Cationic surfactants such as alkylpyridinium salts, 3-[(3-cholamidoamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate, 3-[(3-cholamidoamidopropyl) dimethylammonio] -2- Examples of the surfactant include amphoteric surfactants such as hydroxy-1-propanesulfonate, and natural surfactants such as saponin (derived from soybean) and digitonin. The concentration of these used in the dissolution method of the present invention varies depending on the membrane composition and the preparation method of the biotin liposome (or labeled biotin liposome) to be used, or the type of the surfactant. Then, the concentration of the biotin liposome (or labeled biotin liposome) or the concentration of the biotin liposome (or labeled biotin liposome) to be dissolved only when avidin coexists was dissolved without dissolving the biotin liposome (or labeled biotin liposome) membrane. As long as the concentration is such that the difference is sufficiently large compared to the case where avidin is dissolved in the coexistence, it may be any concentration, usually as the final concentration in the solution containing liposomes, 0.001 to 1.0 V / V
%, Preferably in the range of 0.02 to 0.5 V / V%.
【0017】本発明に於いて用いられるビオチンリポソ
ーム(或は標識ビオチンリポソーム)の使用量を最終反
応液中の濃度で示すと、該リポソームに含有されるリン
脂質量として通常1〜500nmol/ml、好ましくは5〜100n
mol/mlである。When the amount of the biotin liposome (or labeled biotin liposome) used in the present invention is indicated by the concentration in the final reaction solution, the amount of the phospholipid contained in the liposome is usually 1 to 500 nmol / ml, Preferably 5-100n
mol / ml.
【0018】本発明の溶解方法は、例えば以下の如くし
て容易に実施し得る。即ち、ビオチンリポソーム(或は
標識ビオチンリポソーム)を含有する溶液に、上記した
如き濃度となるように界面活性剤を添加し、且つまた適
当量のアビジンを添加すれば、該リポソーム膜は添加し
たアビジン量に対応して溶解される。尚、このとき添加
するアビジン量としては、ビオチンリポソーム(或は標
識ビオチンリポソーム)上のビオチンと結合して該リポ
ソーム膜を溶解し得る量であれば特に限定されないが、
最終反応液中の濃度として通常0.5〜6μg/ml、好まし
くは1.0〜2.5μg/mlである。The dissolution method of the present invention can be easily carried out, for example, as follows. That is, if a surfactant is added to a solution containing biotin liposomes (or labeled biotin liposomes) so as to have a concentration as described above and an appropriate amount of avidin is added, the liposome membrane is added to the added avidin. Dissolved according to volume. The amount of avidin to be added at this time is not particularly limited as long as it can bind to biotin on the biotin liposome (or labeled biotin liposome) and dissolve the liposome membrane.
The concentration in the final reaction solution is usually 0.5 to 6 μg / ml, preferably 1.0 to 2.5 μg / ml.
【0019】本発明の溶解方法を、例えば抗原抗体反
応、糖鎖とレクチンとの反応、或は核酸とそれに相補的
なポリヌクレオチドとの反応等の、測定対象物質とそれ
に対して特異的に結合する性質を有する物質(以下、結
合能物質と略記する。)との反応と組み合わせると、種
々の物質の定量を効果的に行うことができる。本発明の
定量方法は、当該本発明の溶解方法を有効に利用したも
のである。即ち、本発明の定量方法は、予め膜表面上に
ビオチンを固定化し、且つ内部に標識物質を保持したリ
ポソームに対する界面活性剤とアビジンとの該リポソー
ム膜溶解活性を、測定対象物質とそれに対して特異的に
結合する性質を有する物質との反応を利用して減少さ
せ、その減少の程度に応じて該リポソームから遊出する
標識物質量を測定することにより測定対象物質量を定量
することを特徴とする定量方法である。本発明の定量方
法を実施する際の測定系の主たる構成は、下記(A)群
の何れかと、(B)と、(C)群の何れかと(D)との
組合せから成る。 (A)リポソーム類 (i)標識ビオチンリポソーム。 (ii)膜表面上に測定対象物質とビオチンとを共に固定化
した標識ビオチンリポソーム。 (iii)膜表面上に結合能物質とビオチンとを共に固定化
した標識ビオチンリポソーム。 (B)界面活性剤 (C)アビジンを含む試薬類 (i)測定対象物質と結合したアビジンと結合能物質との
組合せ試薬。 (ii)結合能物質と結合したアビジン。 (iii)ビオチンと結合した測定対象物質と、測定対象物
質と、アビジンとの組合せ試薬。 (iv)ビオチンと結合した結合能物質とアビジンとの組合
せ試薬。 (v)アビジンと結合能物質との組合せ試薬。 (vi)アビジン。 (D)試料(測定対象物質を含有。) 但し、上記(A)〜(D)の構成要素の組合せの内、
(A)のリポソーム類と(C)のアビジンを含む試薬類
との組合せは、下記のものに限定される。(A)のリポ
ソーム類が(i)標識ビオチンリポソームの場合、(C)
のアビジンを含む試薬類は(i)〜(iv)の何れかである。
また、(A)のリポソーム類が(ii)膜表面上に測定対象
物質とビオチンとを共に固定化した標識ビオチンリポソ
ームの場合、(C)のアビジンを含む試薬類は(v)に限
られる。更に、(A)のリポソーム類が(iii)膜表面上
に結合能物質とビオチンとを共に固定化した標識ビオチ
ンリポソームの場合、(C)のアビジンを含む試薬類は
(vi)に限られる。上記各種組合せからなる本発明の代表
的な定量方法を、以下に模式図で示すが、本発明の定量
方法は、これらに限定されるものではないことは言うま
でもない。The lysis method of the present invention can be used to specifically bind to a substance to be measured, such as an antigen-antibody reaction, a reaction between a sugar chain and a lectin, or a reaction between a nucleic acid and a polynucleotide complementary thereto. When combined with a reaction with a substance having the following properties (hereinafter, abbreviated as a binding ability substance), the quantification of various substances can be performed effectively. The quantification method of the present invention utilizes the dissolution method of the present invention effectively. That is, the quantification method of the present invention is a method for immobilizing biotin on a membrane surface in advance, and dissolving the liposome membrane dissolving activity of a surfactant and avidin for a liposome holding a labeling substance therein, with respect to the measurement target substance and the The amount is reduced by utilizing a reaction with a substance having a property of specifically binding, and the amount of a substance to be measured is determined by measuring the amount of a labeling substance that migrates from the liposome according to the degree of the reduction. It is a quantification method. The main configuration of the measurement system when the quantification method of the present invention is carried out comprises a combination of any one of the following groups (A), (B), (C) and (D). (A) Liposomes (i) Labeled biotin liposomes. (ii) A labeled biotin liposome in which a substance to be measured and biotin are both immobilized on a membrane surface. (iii) A labeled biotin liposome in which a binding substance and biotin are both immobilized on a membrane surface. (B) Surfactant (C) Reagents containing avidin (i) Combined reagent of avidin bound to a substance to be measured and a binding substance. (ii) Avidin bound to a binding substance. (iii) a combination of a substance to be measured bound to biotin, a substance to be measured and avidin. (iv) A combination reagent of avidin and a binding substance that has been bound to biotin. (v) A combination reagent of avidin and a binding substance. (vi) Avidin. (D) Sample (contains the substance to be measured) However, among the combinations of the constituent elements (A) to (D),
Combinations of the liposomes (A) and the reagents containing avidin (C) are limited to the following. When the liposomes of (A) are (i) labeled biotin liposomes, (C)
The reagents containing avidin are any of (i) to (iv).
When the liposomes (A) are (ii) labeled biotin liposomes in which a substance to be measured and biotin are immobilized on the membrane surface, the reagents containing avidin (C) are limited to (v). Further, when the liposomes of (A) are (iii) labeled biotin liposomes having both a binding substance and biotin immobilized on the membrane surface, the reagents containing avidin of (C) are:
Limited to (vi). Representative quantification methods of the present invention comprising the above various combinations are shown in the following schematic diagrams, but it goes without saying that the quantification method of the present invention is not limited to these.
【式1】 (Equation 1)
【式2】 (Equation 2)
【式3】 (Equation 3)
【式4】 (Equation 4)
【式5】 (Equation 5)
【式6】 尚、上記定量方法に於ける測定対象物質と結合能物質と
の組合せの代表例を示すと表1の如くになる。(Equation 6) Table 1 shows typical examples of the combination of the substance to be measured and the binding substance in the above-described quantification method.
【表1】 上記定量方法について、測定対象が抗原又は抗体の場合
を例にとり、以下により具体的に述べる。[Table 1] The above quantification method will be described in more detail below, taking the case where the measurement target is an antigen or an antibody as an example.
【0020】〈方法−1〉 (試薬) ・膜表面上にビオチンと測定対象である抗原とを共に固
定化した標識ビオチンリポソーム(以下、抗原固定化リ
ポソーム−1と略記する。) ・アビジン ・上記抗原に対する抗体 ・界面活性剤 (原理及び操作法)抗原固定化リポソーム−1と界面活
性剤とを含む溶液に、測定対象の抗原を含む試料と、ア
ビジンと、上記抗原に対する抗体を含む溶液とを添加し
て反応させると、該抗体と試料中の該抗原、或は該抗体
と該リポソーム膜表面に固定化された該抗原とにより抗
原抗体反応が起こると同時に、アビジンと該リポソーム
膜表面に固定化されたビオチンとの間でアビジン−ビオ
チン結合反応が起こる。一方、該リポソーム膜表面で抗
原抗体反応が起こると該リポソーム膜表面に結果的に固
定化された抗体がアビジン−ビオチン結合反応を立体的
に阻害する。従って、試料中の該抗原量が多ければ該リ
ポソーム膜表面に固定化される抗体量は少なくなるので
アビチン−ビオチン結合反応が阻害される割合が低下し
て、該リポソームに保持された標識物質の遊出量が増加
するという現象が起こるし、試料中の該抗原量が少なけ
ればこれと反対に標識物質の遊出量が減少するという現
象が起こる。従って、上記の反応の結果遊出された標識
物質量をその性質に応じた方法により測定し、得られた
測定値を、予め濃度既知の該抗原溶液を試料として同様
に反応を行って作成した該抗原濃度と遊出される標識物
質量との関係を表わす検量線に当てはめれば、試料中の
該抗原量を測定することが可能となる。<Method-1> (Reagent)-Labeled biotin liposome in which biotin and an antigen to be measured are both immobilized on the membrane surface (hereinafter abbreviated as antigen-immobilized liposome-1)-Avidin-Above Antibody to antigen ・ Surfactant (Principle and operation method) A solution containing the antigen to be measured, avidin, and a solution containing the antibody to the antigen are added to a solution containing the antigen-immobilized liposome-1 and the surfactant. Upon addition and reaction, an antigen-antibody reaction occurs between the antibody and the antigen in the sample, or the antibody and the antigen immobilized on the liposome membrane surface, and at the same time, immobilizes avidin and the liposome membrane surface. An avidin-biotin binding reaction occurs between the biotin and the immobilized biotin. On the other hand, when an antigen-antibody reaction occurs on the liposome membrane surface, the antibody immobilized on the liposome membrane surface sterically inhibits the avidin-biotin binding reaction. Therefore, if the amount of the antigen in the sample is large, the amount of the antibody immobilized on the surface of the liposome membrane is small, so that the rate of inhibition of the avidin-biotin binding reaction is reduced, and the labeling substance retained by the liposome is reduced. There occurs a phenomenon that the amount of transmigration increases, and conversely, if the amount of the antigen in the sample is small, the amount of transmigration of the labeling substance decreases. Therefore, the amount of the labeling substance leached as a result of the above reaction was measured by a method according to its properties, and the measured values obtained were prepared by performing the same reaction using the antigen solution having a known concentration in advance as a sample. When applied to a calibration curve representing the relationship between the antigen concentration and the amount of the labeled substance that is leached, the amount of the antigen in the sample can be measured.
【0021】〈方法−2〉 (試薬) ・膜表面上にビオチンと測定対象である抗体に対する抗
原とを共に固定化した標識ビオチンリポソーム(以下、
抗原固定化リポソーム−2と略記する。) ・アビジン ・界面活性剤 (原理及び操作法)抗原固定化リポソーム−2と界面活
性剤とを含む溶液に、測定対象の抗体を含む試料と、ア
ビジンを含む溶液とを添加して反応させると、試料中の
該抗体と該リポソーム膜表面に固定化された抗原とによ
り抗原抗体反応が起こると同時に、添加されたアビジン
と該リポソーム膜表面に固定化されたビオチンとにより
アビジン−ビオチン結合反応が起こる。一方、該リポソ
ーム膜表面で抗原抗体反応が起こった場合には結果的に
該リポソーム膜表面に固定化された該抗体がアビジン−
ビオチン結合反応を立体的に阻害する。従って、試料中
の該抗体量が多ければ該リポソーム膜表面に固定化され
る該抗体量は多くなるのでアビチン−ビオチン結合反応
が阻害される割合が増加して、該リポソームに保持され
た標識物質の遊出量が減少するという現象が起こるし、
試料中の該抗体量が少なければこれと反対に標識物質の
遊出量が増加するという現象が起こる。従って、上記の
反応の結果遊出された標識物質量をその性質に応じた方
法により測定し、得られた測定値を、予め濃度既知の該
抗体溶液を試料として同様に反応を行って作成した該抗
体濃度と遊出される標識物質量との関係を表わす検量線
に当てはめれば、試料中の該抗体量を測定することが可
能となる。<Method-2> (Reagent) A labeled biotin liposome (hereinafter, referred to as "labeled biotin liposome") in which biotin and an antigen for an antibody to be measured are both immobilized on a membrane surface.
Abbreviated as antigen-immobilized liposome-2. -Avidin-Surfactant (Principle and operation method) When a sample containing an antibody to be measured and a solution containing avidin are added to a solution containing antigen-immobilized liposome-2 and a surfactant, and reacted. At the same time, an antigen-antibody reaction occurs between the antibody in the sample and the antigen immobilized on the liposome membrane surface, and at the same time, an avidin-biotin binding reaction is caused by the added avidin and the biotin immobilized on the liposome membrane surface. Occur. On the other hand, when an antigen-antibody reaction occurs on the liposome membrane surface, the antibody immobilized on the liposome membrane surface eventually becomes avidin-
Sterically inhibits biotin binding reaction. Therefore, if the amount of the antibody in the sample is large, the amount of the antibody immobilized on the surface of the liposome membrane is large, so that the rate of inhibition of the avidin-biotin binding reaction is increased, and the labeling substance held by the liposome is increased. Phenomenon that the amount of migration of
On the contrary, if the amount of the antibody in the sample is small, a phenomenon occurs in which the amount of the labeled substance translocating increases. Therefore, the amount of the label substance that was leached as a result of the above reaction was measured by a method according to its properties, and the measured values obtained were prepared by performing the same reaction using the antibody solution having a known concentration in advance as a sample. When applied to a calibration curve representing the relationship between the concentration of the antibody and the amount of the labeled substance to be leached, the amount of the antibody in the sample can be measured.
【0022】〈方法−3〉 (試薬) ・標識ビオチンリポソーム ・測定対象である抗原を固定化したアビジン ・上記抗原に対する抗体 ・界面活性剤 (原理及び操作法)標識ビオチンリポソームと界面活性
剤とを含む溶液に、測定対象の抗原を含む試料と、該抗
原を固定化したアビジンを含む溶液と、上記抗原に対す
る抗体を含む溶液とを添加して反応させると、該抗体と
試料中の該抗原、或は該抗体とアビジンに固定化された
該抗原とにより抗原抗体反応が起こると同時に、該アビ
ジンと該リポソーム膜表面に固定化されたビオチンとに
よりアビジン−ビオチン結合反応が起こる。一方、該ア
ビジン上で抗原抗体反応が起こった場合には結果的に該
アビジン上に固定化された抗体がアビジン−ビオチン結
合反応を立体的に阻害する。従って、試料中の該抗原量
が多ければ該アビジン上に固定化される抗体量は少なく
なるのでアビチン−ビオチン結合反応が阻害される割合
が低下して、該リポソームに保持された標識物質の遊出
量が増加するという現象が起こるし、試料中の該抗原量
が少なければこれと反対に標識物質の遊出量が減少する
という現象が起こる。従って、上記の反応の結果遊出さ
れた標識物質量をその性質に応じた方法により測定し、
得られた測定値を、予め濃度既知の該抗原溶液を試料と
して同様に反応を行って作成した該抗原濃度と遊出され
る標識物質量との関係を表わす検量線に当てはめれば、
試料中の該抗原量を測定することが可能となる。<Method-3> (Reagent)-Labeled biotin liposome-Avidin on which the antigen to be measured is immobilized-Antibody to the above-mentioned antigen-Surfactant (Principle and operation method) Labeling biotin liposome and surfactant The solution containing the antigen to be measured, a sample containing the antigen to which the antigen is immobilized, a solution containing avidin having the antigen immobilized thereon, and a solution containing an antibody to the antigen are added and reacted. Alternatively, an antigen-antibody reaction occurs between the antibody and the antigen immobilized on avidin, and at the same time, an avidin-biotin binding reaction occurs between the avidin and biotin immobilized on the liposome membrane surface. On the other hand, when an antigen-antibody reaction occurs on the avidin, the antibody immobilized on the avidin sterically inhibits the avidin-biotin binding reaction. Therefore, if the amount of the antigen in the sample is large, the amount of the antibody immobilized on the avidin will be small, and the rate of inhibiting the avidin-biotin binding reaction will be reduced, so that the labeled substance retained in the liposome will play a role. A phenomenon occurs in which the amount of output increases, and a phenomenon in which, if the amount of the antigen in the sample is small, the amount of migration of the labeling substance decreases. Therefore, the amount of the label substance that has been leached as a result of the above reaction is measured by a method according to its properties,
If the obtained measured value is applied to a calibration curve representing the relationship between the antigen concentration and the amount of label substance to be eluted prepared by performing the same reaction using the antigen solution having a known concentration in advance as a sample,
It becomes possible to measure the amount of the antigen in the sample.
【0023】〈方法−4〉 (試薬) ・標識ビオチンリポソーム ・測定対象である抗体に対する抗原を固定化したアビジ
ン ・界面活性剤 (操作法)標識ビオチンリポソームと界面活性剤とを含
む溶液に、測定対象の抗体に対する抗原を固定化したア
ビジンを含む溶液と、測定対象の抗体を含む試料とを添
加して反応させると、試料中の該抗体とアビジン上に固
定化された該抗原とにより抗原抗体反応が起こると同時
に、該アビジンと該リポソーム膜表面に固定化されたビ
オチンとによりアビジン−ビオチン結合反応が起こる。
一方、該アビジン上で抗原抗体反応が起こった場合には
結果的に該アビジン上に固定化された該抗体がアビジン
−ビオチン結合反応を立体的に阻害する。従って、試料
中の該抗体量が多ければ該アビジン上に固定化される該
抗体量は多くなるのでアビチン−ビオチン結合反応が阻
害される割合が増加して、該リポソームに保持された標
識物質の遊出量が減少するという現象が起こるし、試料
中の該抗体量が少なければこれと反対に標識物質の遊出
量が増加するという現象が起こる。従って、上記の反応
の結果遊出された標識物質量をその性質に応じた方法に
より測定し、得られた測定値を、予め濃度既知の該抗体
溶液を試料として同様に反応を行って作成した該抗体濃
度と遊出される標識物質量との関係を表わす検量線に当
てはめれば、試料中の該抗体量を測定することが可能と
なる。<Method-4> (Reagent)-Labeled biotin liposome-Avidin immobilized with an antigen for the antibody to be measured-Surfactant (Operation method) Measured in a solution containing labeled biotin liposome and surfactant When a solution containing avidin in which an antigen for the target antibody is immobilized and a sample containing the antibody to be measured are added and allowed to react, the antigen in the sample and the antigen immobilized on avidin react with the antigen-antibody. At the same time as the reaction occurs, an avidin-biotin binding reaction occurs between the avidin and the biotin immobilized on the liposome membrane surface.
On the other hand, when an antigen-antibody reaction occurs on the avidin, the antibody immobilized on the avidin sterically inhibits the avidin-biotin binding reaction. Therefore, if the amount of the antibody in the sample is large, the amount of the antibody immobilized on the avidin is large, so that the rate of inhibition of the avidin-biotin binding reaction is increased, and the amount of the labeled substance retained in the liposome is increased. A phenomenon occurs in which the amount of transmigration decreases, and a phenomenon occurs in which, if the amount of the antibody in the sample is small, the amount of transmigration of the labeling substance increases. Therefore, the amount of the label substance that was leached as a result of the above reaction was measured by a method according to its properties, and the measured values obtained were prepared by performing the same reaction using the antibody solution having a known concentration in advance as a sample. When applied to a calibration curve representing the relationship between the concentration of the antibody and the amount of the labeled substance to be leached, the amount of the antibody in the sample can be measured.
【0024】〈方法−5〉 (試薬) ・標識ビオチンリポソーム ・ビオチンを固定化した測定対象の抗原 ・上記抗原に対する抗体 ・アビジン ・界面活性剤 (操作法)標識ビオチンリポソームと界面活性剤とを含
む溶液に、測定対象である抗原を含む試料と、ビオチン
を固定化した測定対象の抗原とを含む溶液と、上記抗原
に対する抗体とアビジンとを含む溶液とを添加して反応
させると、該抗体と試料中の該抗原、或は該抗体とビオ
チンを固定化した該抗原とにより抗原抗体反応が起こる
と同時に、ビオチンを固定化した該抗原上のビオチンと
アビジン、或は該リポソーム膜表面に固定化されたビオ
チンとアビジンとによりアビジン−ビオチン結合反応が
起こる。一方、ビオチンを固定化した該抗原上で抗原抗
体反応が起こった場合には結果的にビオチンを固定化し
た該抗原上に固定化された抗体がアビジン−ビオチン結
合反応を立体的に阻害する。従って、試料中の該抗原量
が多ければビオチンを固定化した該抗原上に固定化され
る抗体量は少なくなるので該抗原上のビオチンとアビジ
ンとの反応が阻害される割合が減少し、それと対照的に
該リポソーム膜表面に固定化されたビオチンとアビジン
との反応が起こり難くなるので該リポソームに保持され
た標識物質の遊出量が減少するという現象が起こるし、
試料中の該抗原量が少なければこれと反対に標識物質の
遊出量が増加するという現象が起こる。従って、上記の
反応の結果遊出された標識物質量をその性質に応じた方
法により測定し、得られた測定値を、予め濃度既知の該
抗原溶液を試料として同様に反応を行って作成した該抗
原濃度と遊出される標識物質量との関係を表わす検量線
に当てはめれば、試料中の該抗原量を測定することが可
能となる。<Method-5> (Reagent) • Labeled biotin liposome • Antigen to be measured on which biotin is immobilized • Antibody against the above antigen • Avidin • Surfactant (Operation method) Contains labeled biotin liposome and surfactant To the solution, a sample containing the antigen to be measured, a solution containing the antigen to be measured with biotin immobilized thereon, and a solution containing an antibody to the antigen and avidin are added to react with each other. An antigen-antibody reaction occurs between the antigen in the sample or the antibody and the antigen on which biotin is immobilized, and at the same time, biotin and avidin on the biotin-immobilized antigen or immobilized on the liposome membrane surface An avidin-biotin binding reaction is caused by the biotin and avidin. On the other hand, when an antigen-antibody reaction occurs on the biotin-immobilized antigen, the antibody immobilized on the biotin-immobilized antigen results in steric inhibition of the avidin-biotin binding reaction. Therefore, if the amount of the antigen in the sample is large, the amount of the antibody immobilized on the biotin-immobilized antigen is reduced, so that the rate at which the reaction between biotin and avidin on the antigen is inhibited decreases, and In contrast, since the reaction between biotin and avidin immobilized on the liposome membrane surface is unlikely to occur, a phenomenon occurs in which the amount of the labeling substance retained in the liposome is reduced, and
If the amount of the antigen in the sample is small, a phenomenon occurs in which the amount of the labeled substance translocating increases. Therefore, the amount of the labeling substance leached as a result of the above reaction was measured by a method according to its properties, and the measured values obtained were prepared by performing the same reaction using the antigen solution having a known concentration in advance as a sample. When applied to a calibration curve representing the relationship between the antigen concentration and the amount of the labeled substance that is leached, the amount of the antigen in the sample can be measured.
【0025】〈方法−6〉 (試薬) ・標識ビオチンリポソーム ・ビオチンを固定化した、測定対象である抗体に対する
抗原 ・アビジン ・界面活性剤 (操作法)標識ビオチンリポソームと界面活性剤とを含
む溶液に、ビオチンを固定化した、測定対象の抗体に対
する抗原を含む溶液と、アビジンを含む溶液と、測定対
象の抗体を含む試料とを添加して反応させると、試料中
の該抗体とビオチンを固定化した該抗原とにより抗原抗
体反応が起こると同時に、ビオチンを固定化した該抗原
上のビオチンとアビジン、或は該リポソーム膜表面に固
定化されたビオチンとアビジンとによりアビジン−ビオ
チン結合反応が起こる。一方、ビオチンを固定化した該
抗原上で抗原抗体反応が起こった場合にはビオチンを固
定化した該抗原上に固定化された該抗体がアビジン−ビ
オチン結合反応を立体的に阻害する。従って、試料中の
該抗体量が多ければビオチンを固定化した該抗原上に固
定化される該抗体量は多くなるので該抗原上のビオチン
とアビジンとの反応が阻害される割合が増加し、それと
対照的に該リポソーム膜表面に固定化されたビオチンと
アビジンとの反応が起こり易くなるので、該リポソーム
に保持された標識物質の遊出量が増加するという現象が
起こるし、試料中の該抗体量が少なければこれと反対に
標識物質の遊出量が減少するという現象が起こる。従っ
て、上記の反応の結果遊出された標識物質量をその性質
に応じた方法により測定し、得られた測定値を、予め濃
度既知の該抗体溶液を試料として同様に反応を行って作
成した該抗体濃度と遊出される標識物質量との関係を表
わす検量線に当てはめれば、試料中の該抗体量を測定す
ることが可能となる。<Method-6> (Reagent) Labeled biotin liposome Antigen to antibody to be measured, immobilized with biotin Avidin Surfactant (Operation method) Solution containing labeled biotin liposome and surfactant Then, a solution containing biotin-immobilized antigen containing the antibody to be measured, a solution containing avidin, and a sample containing the antibody to be measured are added and allowed to react, thereby immobilizing the antibody and biotin in the sample. At the same time as the antigen-antibody reaction occurs with the immobilized antigen, an avidin-biotin binding reaction occurs between biotin and avidin on the biotin-immobilized antigen or biotin and avidin immobilized on the liposome membrane surface. . On the other hand, when an antigen-antibody reaction occurs on the biotin-immobilized antigen, the antibody immobilized on the biotin-immobilized antigen sterically inhibits the avidin-biotin binding reaction. Therefore, if the amount of the antibody in the sample is large, the amount of the antibody immobilized on the antigen on which biotin is immobilized is increased, so that the rate at which the reaction between biotin and avidin on the antigen is inhibited increases, In contrast, a reaction between avidin and biotin immobilized on the liposome membrane surface is apt to occur, so that a phenomenon occurs in which the amount of the labeling substance retained in the liposome is increased, and the On the contrary, if the amount of the antibody is small, the phenomenon that the amount of the labeling substance translocated decreases will occur. Therefore, the amount of the label substance that was leached as a result of the above reaction was measured by a method according to its properties, and the measured values obtained were prepared by performing the same reaction using the antibody solution having a known concentration in advance as a sample. When applied to a calibration curve representing the relationship between the concentration of the antibody and the amount of the labeled substance to be leached, the amount of the antibody in the sample can be measured.
【0026】尚、測定対象が抗原や抗体ではなく糖鎖や
レクチン或は核酸等の場合には、上記した如き方法に於
いて、抗原及び抗体の代りに、糖鎖とレクチン、或は核
酸とそれに相補的なポリヌクレオチドとを用いて同様の
操作を行えばよい。When the object to be measured is not an antigen or an antibody but a sugar chain, a lectin or a nucleic acid, a sugar chain and a lectin or a nucleic acid are used instead of the antigen and the antibody in the above-described method. The same operation may be performed using a polynucleotide complementary thereto.
【0027】上記定量方法を実施するために用いられる
測定用試液は、上記の各方法に於いて用いられる各試薬
を適宜含有させた2種以上の試液として調製される。各
試液中に含有させる試薬の組み合わせを決定する際に
は、アビジンとビオチン、抗原と抗体、糖鎖とレクチ
ン、或は核酸とそれに相補的なポリヌクレオチド等、共
存させた場合保存中にお互いに反応を起こすもの同士が
同一の試液中に共存しないように考慮しなければならな
いことは言うまでもない。好ましい試薬の組み合わせと
しては、例えば以下の如き組み合わせが挙げられる。The measuring reagents used for carrying out the above-mentioned quantification method are prepared as two or more reagents containing the respective reagents used in each of the above methods as appropriate. When deciding the combination of reagents to be contained in each test solution, avidin and biotin, antigen and antibody, sugar chain and lectin, or nucleic acid and its complementary polynucleotide, etc. Needless to say, it is necessary to consider that the reactants do not coexist in the same reagent solution. Preferred combinations of reagents include, for example, the following combinations.
【0028】i)測定対象が抗原の場合 ・第1試液 膜表面上にビオチンと測定対象物質(抗原)とを共に固
定化した標識ビオチンリポソームを含有。 ・第2試液 測定対象物に対する抗体を含有。 ・第3試液 アビジン及び界面活性剤を含有。I) When the measurement target is an antigen: The first test solution contains a labeled biotin liposome in which biotin and a measurement target substance (antigen) are both immobilized on the membrane surface.・ Second test solution Contains antibodies against the measurement target. -Third reagent solution Contains avidin and a surfactant.
【0029】ii)測定対象が抗体の場合 ・第1試液 膜表面上にビオチンと測定対象物質である抗体に対する
抗原とを共に固定化した標識ビオチンリポソームを含
有。 ・第2試液 アビジン及び界面活性剤を含有。Ii) When the object to be measured is an antibody • First test solution Contains a labeled biotin liposome in which biotin and an antigen for the antibody to be measured are both immobilized on the membrane surface. -Second reagent solution Contains avidin and a surfactant.
【0030】このようにして調製された各測定用試液の
pHとしては、上記した如き試薬の保存安定性やアビジ
ンとビオチンとの反応等を阻害しないpHであれば特に
限定されないが、通常5〜9、好ましくは6〜8の範囲
から適宜選択され、該試液中には、このpHを維持する
ために例えばリン酸塩、ホウ酸塩、トリス(ヒドロキシ
メチル)アミノメタン、グッド(Good)緩衝剤、ベロナ
ール等の緩衝剤が含まれていてもよい。Each of the test liquids thus prepared was
The pH is not particularly limited as long as it does not inhibit the storage stability of the reagent and the reaction between avidin and biotin, as described above, but is usually appropriately selected from the range of usually 5 to 9, preferably 6 to 8, and In order to maintain the pH, the reagent may contain a buffer such as phosphate, borate, tris (hydroxymethyl) aminomethane, Good (Good) buffer and Veronal.
【0031】これら本発明の定量方法に於いて用いられ
る主たる試薬類は前記本発明の溶解方法で用いられる各
種試薬類の中から適宜選択して使用すればよいし、ま
た、その他必要に応じて添加される各種防腐剤、標識物
質を測定するのに必要な試薬類(例えば、酵素の基質
等)等は、自体公知の補体免疫測定法に於いて通常用い
られているものの中から適宜選択して使用すればよい。
また、これら試薬類等の測定用試液中の濃度範囲等も自
体公知の補体免疫測定法に於いて通常用いられる濃度範
囲等から適宜選択し決定すれば足りる。The main reagents used in the quantification method of the present invention may be appropriately selected from the various reagents used in the dissolution method of the present invention, and may be used as necessary. Various preservatives to be added and reagents necessary for measuring the labeling substance (eg, enzyme substrate) are appropriately selected from those usually used in a complement immunoassay known per se. And use it.
Also, the concentration range of the reagents and the like in the test solution for measurement may be determined by appropriately selecting from the concentration range ordinarily used in a complement immunoassay known per se.
【0032】上記の定量方法を実施する際の反応条件と
しては、標識物質の有する検出可能な性質を失活させず
且つアビジンとビオチンとの結合反応及び測定対象物質
と結合能物質との結合反応(例えば抗原抗体反応、糖鎖
とレクチンとの反応や、核酸とそれに相補的なポリヌク
レオチドとの反応等)を阻害しない条件であれば特に限
定されないが、具体的には反応温度としては通常20〜50
℃、好ましくは25〜40℃の範囲から、反応時間としては
通常5〜60分間、好ましくは5〜30分間の範囲から適宜
選択される。The reaction conditions for carrying out the above-described quantification method include a binding reaction between avidin and biotin and a binding reaction between a substance to be measured and a binding ability substance without inactivating the detectable properties of the labeling substance. (Eg, antigen-antibody reaction, reaction between sugar chain and lectin, reaction between nucleic acid and polynucleotide complementary thereto) is not particularly limited as long as it does not inhibit the reaction. ~ 50
° C, preferably in the range of 25 to 40 ° C, and the reaction time is appropriately selected in the range of usually 5 to 60 minutes, preferably 5 to 30 minutes.
【0033】尚、上記の定量方法を実施する際に使用す
る界面活性剤としては、先に述べた本発明の溶解方法に
於ける使用濃度範囲で使用した場合に標識物質の有する
検出可能な性質を失活させないものであって、且つアビ
ジンとビオチンとの結合反応及び測定対象物質と結合能
物質との結合反応(例えば抗原抗体反応、糖鎖とレクチ
ンとの反応や、核酸とそれに相補的なポリヌクレオチド
との反応等)を阻害しないもののなかから適宜選択され
なければならないことは言うまでもない。The surfactant used in carrying out the above quantification method includes a detectable property possessed by the labeling substance when used in the above-mentioned concentration range used in the dissolution method of the present invention. And a binding reaction between avidin and biotin and a binding reaction between a substance to be measured and a binding substance (for example, an antigen-antibody reaction, a reaction between a sugar chain and a lectin, or a nucleic acid and its complementary Needless to say, it must be appropriately selected from those which do not inhibit the reaction with the polynucleotide.
【0034】本発明の定量方法に於いて、測定対象物質
が抗原である場合に使用される抗体としては、測定対象
物質に対する抗体であれば何れにてもよく特に限定され
ない。即ち、常法、例えば「免疫実験学入門、第2刷、
松橋直ら、(株)学会出版センター、1981」等に記載の
方法に準じて、馬、牛、羊、兎、山羊、ラット、マウス
等の動物に測定対象を免疫して作製されるポリクローナ
ル性抗体でも、或はまた常法、即ちケラーとミルスタイ
ン(Nature,256巻,495頁,1975)により確立された細 胞
融合法に従い、マウスの腫瘍ラインからの細胞と測定対
象物で予め免疫されたマウスの脾細胞とを融合させて得
られるハイブリドーマが産生する単クローン性抗体でも
何れにてもよく、これらを単独で或はこれらを適宜組み
合わせて用いる等は任意である。また、これら抗体は、
要すればペプシン,パパイン等の酵素を用いて消化して
F(ab') 、Fab'、或はFabとして使用してもよいこと
は言うま でもない。In the quantification method of the present invention, the antibody used when the substance to be measured is an antigen is not particularly limited as long as it is an antibody against the substance to be measured. That is, a conventional method, for example, "Introduction to immunological experiments, 2nd printing,
Polyclonal antibodies prepared by immunizing animals such as horses, cows, sheep, rabbits, goats, rats, mice and the like according to the method described in Nao Matsuhashi, Gakkai Shuppan Center, 1981, etc. However, or alternatively, according to the cell fusion method established by Keller and Milstein (Nature, 256, 495, 1975), cells were previously immunized with cells from the tumor line of the mouse and the analyte. Any monoclonal antibody produced by a hybridoma obtained by fusing with mouse spleen cells may be used, and these may be used alone or in an appropriate combination thereof. Also, these antibodies
Needless to say, it may be digested with enzymes such as pepsin and papain and used as F (ab '), Fab' or Fab.
【0035】本発明の定量方法に於いて、測定対象物質
が抗体である場合に使用される抗原としては、測定対象
物質と結合する抗原であれば何れにてもよく特に限定さ
れない。In the quantification method of the present invention, the antigen used when the substance to be measured is an antibody is not particularly limited as long as it is an antigen that binds to the substance to be measured.
【0036】本発明の定量方法に於いて、測定対象物質
が糖鎖である場合に使用されるレクチンとしては、測定
対象の糖鎖と特異的に結合し得る性質を有するものであ
れば特に限定することなく挙げられるが、例えばコンカ
ナバリンA、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチ
ン、ダツラレクチン、ヒイロチャワンタケレクチン、ヒ
ママメレクチン、ピーナッツレクチン、小麦胚芽レクチ
ン等が好ましく挙げられる。In the quantification method of the present invention, the lectin used when the substance to be measured is a sugar chain is not particularly limited as long as it has a property capable of specifically binding to the sugar chain to be measured. Examples thereof include, but are not limited to, concanavalin A, lentil lectin, kidney bean lectin, datsura lectin, Japanese bean lectin, Japanese bean lectin, peanut lectin, and wheat germ lectin.
【0037】本発明の定量方法に於いて、測定対象物質
がレクチンである場合に使用される糖鎖としては、測定
対象物質と結合する糖鎖であれば、天然由来のもので
も、合成されたものでも何れにてもよく特に限定されな
い。In the quantification method of the present invention, when the substance to be measured is a lectin, any sugar chain that is naturally derived as long as it binds to the substance to be measured may be synthesized. It may be any one of them and is not particularly limited.
【0038】本発明の定量方法に於いて、測定対象物質
が核酸である場合に使用される測定対象の核酸に相補的
なポリヌクレオチドとしては、測定対象の核酸と特異的
に結合し得る性質を有するものであれば、天然由来のも
のでも、合成されたものでも特に限定することなく使用
することができる。In the quantification method of the present invention, the polynucleotide complementary to the nucleic acid to be measured used when the substance to be measured is a nucleic acid has a property capable of specifically binding to the nucleic acid to be measured. As long as it has, it can be used without any particular limitation, whether it is of natural origin or synthesized.
【0039】標識物質の量を測定する方法としては、例
えば標識物質が酵素の場合には、例えば「酵素免疫測定
法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利
夫・辻章夫・石川栄治編集、51〜63頁、共立出版
(株)、1987年9月10日発行」等に記載された方法に準
じて該標識物質の測定を行えばよく、標識物質が蛍光物
質の場合には、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第
1版、(株)ソフトサイエンス社、1983」等に記載され
た方法に準じて該標識物質の測定を行えばよく、標識物
質が発光性物質の場合には、例えば「酵素免疫測定法、
蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・
辻章夫・石川栄治編集、252〜263頁、共立出版(株)、
1987年9月10日発行」等に記載された方法に準じて該標
識物質の測定を行えばよく、また、標識物質がスピンラ
ベル化剤としての性質を有する物質の場合には、例えば
「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北
川常廣・南原利夫・辻章夫・石川栄治編集、264〜271
頁、共立出版(株)、1987年9月10日発行」等に記載さ
れた方法に準じて該標識物質の測定を行えばよい。As a method for measuring the amount of the labeling substance, for example, when the labeling substance is an enzyme, for example, "Enzyme-linked immunosorbent assay, Protein Nucleic Acid Enzyme Supplement No. 31, Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Ishikawa The labeling substance may be measured according to the method described in Eiji Edit, pp. 51-63, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., published on September 10, 1987. For example, the labeling substance may be measured according to the method described in “Illustration, Fluorescent Antibody, Akira Kawao, First Edition, Soft Science Co., Ltd., 1983” or the like. In the case of, for example, "enzyme immunoassay,
Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No.31, Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara,
Edited by Akio Tsuji and Eiji Ishikawa, pages 252-263, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd.
The labeling substance may be measured according to the method described in "September 10, 1987" or the like. When the labeling substance is a substance having properties as a spin labeling agent, for example, "enzyme" Immunoassay, Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No. 31, Edited by Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Eiji Ishikawa, 264-271
Page, published by Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., September 10, 1987 ”or the like.
【0040】本発明の定量方法により測定可能な測定対
象物質としては、それに対する結合能物質が存在するも
の特に限定することなく挙げられるが、例えば何らかの
方法によりそれに対する抗体を作製し得るもの、生体内
で生じる抗体、特定のレクチンと特異的に結合する性質
を有する糖鎖を含んでなるもの、レクチン、核酸が挙げ
られ、具体的には、例えば血清,血液,血漿,尿等の生
体体液中に含まれる核酸、蛋白質、脂質、ホルモン、活
性ペプチド、オータコイド、薬剤、特定物質に対する抗
体、レクチン等が代表的なものとして挙げられる。更に
具体的には、例えば、α-フェトプロテイン(AFP),CA
19-9,前立腺特異抗原(PSA),癌胎児性抗原(CEA)等の癌
マーカー、例えばインシュリン,ヒト絨毛性ゴナドトロ
ピン(hCG),チロキシン(T4),トリヨードサイロニン(T
3),プロラクチン ,甲状線刺激ホルモン(THS)等のホル
モン、例えばヒスタミン,セロトニン,プ ロスタグラ
ンジン,アンギオテンシン,ブラジキニン等のオータコ
イド、例えばジゴキシン,フェニトイン,モルヒネ,ニ
コチン,ジニトロフェノール(DNP),フェノバルビ
タール(PB)等の薬物、例えば抗トキソプラズマ抗体
等の抗体、例えばコンカナバリンA,レンズマメレクチ
ン,インゲンマメレクチン,ダツラレクチン,ヒイロチ
ャワンタケレクチン,ヒママメレクチン,ピーナッツレ
クチン,小麦胚芽レクチン等のレクチン、B型肝炎ウイ
ルス(HBV),C型肝炎ウ イルス(HCV),ヒト免疫不全ウ
イルス(HIV),成人T細胞白血病ウイルス(HTLV),サイ
トメガロウイルス(CMV),ヒトパピローマウイルス(HPV)
等のウイルス由来の核酸、例えばヒト胃癌,ヒト白血
病,ヒト神経芽腫等の癌細胞由来のオンコジーン等が挙
げられる。The substance to be measured which can be measured by the quantification method of the present invention includes, but is not limited to, a substance having a binding ability to the substance. Examples include antibodies produced in the body, those containing a sugar chain having a property of specifically binding to a specific lectin, lectins, and nucleic acids, and specifically, in biological fluids such as serum, blood, plasma, and urine. Representative examples thereof include nucleic acids, proteins, lipids, hormones, active peptides, autakoids, drugs, antibodies to specific substances, lectins, and the like. More specifically, for example, α-fetoprotein (AFP), CA
19-9, cancer markers such as prostate specific antigen (PSA) and carcinoembryonic antigen (CEA) such as insulin, human chorionic gonadotropin (hCG), thyroxine (T4), and triiodothyronine (T
3), hormones such as prolactin and thyroid stimulating hormone (THS), such as histamine, serotonin, prostaglandin, anotachoids such as angiotensin, bradykinin, etc., such as digoxin, phenytoin, morphine, nicotine, dinitrophenol (DNP), phenobarbital Drugs such as (PB), for example, antibodies such as anti-toxoplasma antibody, for example, lectins such as concanavalin A, lentil lectin, kidney bean lectin, datsura lectin, Hilochawan lectin, chickpea lectin, peanut lectin, wheat germ lectin, hepatitis B virus (HBV), hepatitis C virus (HCV), human immunodeficiency virus (HIV), adult T-cell leukemia virus (HTLV), cytomegalovirus (CMV), human papillomavirus (HPV)
And oncogenes derived from cancer cells such as human gastric cancer, human leukemia, and human neuroblastoma.
【0041】本発明の溶解方法は、また、特定物質の定
性的な検出に利用することも可能である。即ち、例えば
検出対象物質に対する結合能物質(例えば抗原に対する
抗体、特定糖鎖に対するレクチン、核酸に対する相補的
なポリヌクレオチド等)にアビジンを標識し、これを検
出対象物質と反応させた後、生じた検出対象物質とそれ
に対する結合能物質との複合体を分離し、これに標識ビ
オチンリポソームと界面活性剤とを作用させて標識物質
を遊出させる。遊出された標識物質をその性質に応じた
方法で測定することにより、検出対象物質の有無を判定
することができる。The lysis method of the present invention can also be used for qualitative detection of a specific substance. That is, for example, avidin is labeled on a substance capable of binding to a substance to be detected (for example, an antibody to an antigen, a lectin to a specific sugar chain, a polynucleotide complementary to a nucleic acid, etc.), and is reacted with the substance to be detected. The complex of the substance to be detected and the substance capable of binding thereto is separated, and the labeled biotin liposome and a surfactant are allowed to act on the complex to allow the labeled substance to translocate. The presence or absence of the substance to be detected can be determined by measuring the migrated label substance by a method according to the property.
【0042】以下に実施例を挙げて本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもの
ではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.
【0043】実施例1. ビオチン修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノー
ルアミンの調製 ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(シグ
マ社製)76mg(0.11mmol)をクロロホルム5mlに懸濁さ
せたものに、N-メチルモルホリン(和光純薬工業(株)
製)24μl(0.22mmol)及びN-ヒドロキシスクシンイミ
ドアミノカプロイルビオチン(ベクターラボラトリーズ
社製)50mg(0.11mmol)を含むジメチルホルムアミド
(DMF)溶液1mlを添加し、5℃で一夜撹拌反応させ
た。反応終了後、溶媒を留去し、シリカゲルカラム(溶
離液;クロロホルムとメタノールとの混合溶媒)を用い
て精製を行い、ビオチン修飾ジパルミトイルホスファチ
ジルエタノールアミン68mgを得た(収率;60%)。 標識ビオチンリポソーム液の調製 ジミリストイルホスファチジルコリン48mg(71μmo
l)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール5.5mg
(8μmol)、コレステロール31.75mg(82μmol)及び
上記で調製したビオチン修飾ジパルミトイルホスファ
チジルエタノールアミン0.8mg(0.79μmol)を5mlのク
ロロホルムに溶解した後、ロータリーエバポレーターを
用いて溶媒を留去し、次いで減圧デシケーター中で一夜
放置し薄膜をフラスコ壁面に作製させた。これにグルコ
ース-6-リン酸脱水素酵素水溶液7.5ml[2,500U/ml、in
10mM トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tri
s)緩衝液(pH7.8)]を加え、ボルテックスミキサー
で均一になるまで撹拌しリポソーム懸濁液を調製した。
得られたリポソーム懸濁液をエクストルーダー(ライペ
ックスバイオメンブランズ社登録商標)を用いてポアサ
イズが2μM、1μM、0.6μMのニュクリポアー膜
(ニュクリポアー社登録商標)で2回、0.4μM及び0.2
μMのニュクリポアー膜で3回サイジングを行い、平均
粒径225nmのリポソームを得た。得られたリポソーム懸
濁液を遠心チューブに移し4℃、36,000rpmで1時間遠
心する操作を5回繰り返し、最後に5mlの100mM Tris
緩衝液(pH7.8)に懸濁し標識ビオチンリポソーム液を
得た。 アビジン−ビオチン結合反応を利用した標識ビオチン
リポソーム膜の溶解 (試料)所定の界面活性剤とアビジンとを所定濃度含む
100mM Tris 緩衝液(pH7.8)を調製し試料とした。 (酵素基質溶液)グルコース-6-リン酸を15.4mM、ニコ
チンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を7.0mM、3-(N
-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPS
O)を20mM及びTrisを20mMを含む溶液を調製し、酵素基
質溶液とした。 (操作法)上記で調製した標識ビオチンリポソーム液
を225mM Tris 緩衝液(pH7.8)で400倍に希釈した溶液
100μlに試料50μlを加え37℃で2.5分間反応させた。次
いでこれに酵素基質溶液95μlを加え37℃で5分間反応
させた後、5分間当たりの340nmの吸光度変化(ΔE)
を測定した。得られたΔEと試料中のアビジン濃度との
関係を表わす検量線を図1に示す。尚、図1に於いて、
−○−は界面活性剤としてコール酸ナトリウムを1.0%
含有させた試料を用いて得られた結果を、−□−は界面
活性剤としてトリトン X-100(ローム アンド
ハース社商品名)を0.25%含有させた試料を用いて得ら
れた結果を夫々示す。Embodiment 1 Preparation of biotin-modified dipalmitoyl phosphatidylethanolamine Dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (Sigma) (76 mg, 0.11 mmol) suspended in chloroform (5 ml) was mixed with N-methylmorpholine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
1) of a dimethylformamide (DMF) solution containing 24 μl (0.22 mmol) and 50 mg (0.11 mmol) of N-hydroxysuccinimidoaminocaproylbiotin (manufactured by Vector Laboratories) was added, and the mixture was stirred and reacted at 5 ° C. overnight. After completion of the reaction, the solvent was distilled off, and purification was performed using a silica gel column (eluent; mixed solvent of chloroform and methanol) to obtain 68 mg of biotin-modified dipalmitoylphosphatidylethanolamine (yield; 60%). Preparation of Labeled Biotin Liposome Solution Dimyristoyl phosphatidylcholine 48 mg (71 μmo
l), dimyristoyl phosphatidyl glycerol 5.5mg
(8 μmol), 31.75 mg (82 μmol) of cholesterol and 0.8 mg (0.79 μmol) of the biotin-modified dipalmitoylphosphatidylethanolamine prepared above were dissolved in 5 ml of chloroform, and the solvent was distilled off using a rotary evaporator. It was left overnight in a desiccator to form a thin film on the wall of the flask. 7.5 ml of an aqueous solution of glucose-6-phosphate dehydrogenase [2,500 U / ml, in
10mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tri
s) Buffer solution (pH 7.8)] and stirred with a vortex mixer until uniform to prepare a liposome suspension.
The obtained liposome suspension was passed through an extruder (registered trademark of Leipex Biomembrane's), twice with a Nuclepore membrane (registered trademark of Nuclelipore) having pore sizes of 2 μM, 1 μM and 0.6 μM, and 0.4 μM and 0.2 μM, respectively.
Sizing was performed three times with a μM Nuclepore membrane to obtain liposomes having an average particle size of 225 nm. The operation of transferring the obtained liposome suspension to a centrifuge tube and centrifuging at 4 ° C. and 36,000 rpm for 1 hour was repeated 5 times, and finally, 5 ml of 100 mM Tris
The suspension was suspended in a buffer (pH 7.8) to obtain a labeled biotin liposome solution. Dissolution of labeled biotin liposome membrane using avidin-biotin binding reaction (Sample) Contains a given concentration of a given surfactant and avidin
A 100 mM Tris buffer (pH 7.8) was prepared and used as a sample. (Enzyme substrate solution) 16.4 mM glucose-6-phosphate, 7.0 mM nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), 3- (N
-Morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPS
A solution containing 20 mM O) and 20 mM Tris was prepared and used as an enzyme substrate solution. (Operation method) A solution obtained by diluting the labeled biotin liposome solution prepared above with 400 times with 225 mM Tris buffer (pH 7.8).
50 μl of the sample was added to 100 μl, and reacted at 37 ° C. for 2.5 minutes. Next, 95 μl of the enzyme substrate solution was added thereto, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 5 minutes. Then, the change in absorbance at 340 nm per 5 minutes (ΔE)
Was measured. FIG. 1 shows a calibration curve representing the relationship between the obtained ΔE and the avidin concentration in the sample. In FIG. 1,
-○-is 1.0% sodium cholate as a surfactant
The results obtained using the sample contained therein,-□-indicates Triton X-100 (Rohm and
The results obtained using samples containing 0.25% of Haas (trade name) are shown.
【0044】比較例1.試料として、所定濃度のメリチ
ンを含む溶液を用いた以外は実施例1のと同じ試薬を
用い、同様の操作を行ってΔEを測定した。得られたΔ
Eと試料中のメリチン濃度との関係を表わす検量線を図
1に併せて示す(−×−)。図1の結果から明らかなよ
うに、グルコース-6-リン酸脱水素酵素を標識物質とし
て内包させた標識ビオチンリポソーム膜を本発明の溶解
方法により溶解させた場合には、該リポソーム膜は共存
するアビジン濃度に比例して溶解されることが判る。ま
た、本発明の溶解方法による膜溶解作用は、従来同様の
目的で用いられていたメリチンよりも明らかに高いこと
が判る。Comparative Example 1 ΔE was measured by using the same reagent as in Example 1 except that a solution containing a predetermined concentration of melittin was used as a sample. Δ obtained
A calibration curve representing the relationship between E and the concentration of melittin in the sample is also shown in FIG. 1 (− × −). As is clear from the results of FIG. 1, when the labeled biotin liposome membrane containing glucose-6-phosphate dehydrogenase as a labeling substance is dissolved by the dissolution method of the present invention, the liposome membrane coexists. It turns out that it is dissolved in proportion to the avidin concentration. Further, it can be seen that the membrane dissolving action by the dissolving method of the present invention is clearly higher than that of melittin used for the same purpose as before.
【0045】実験例1. (アビジン溶液)アビジンを所定濃度含む100mM Tris-H
Cl緩衝液(pH7.8、30mM NaCl及び0.5mMエチレンジアミ
ン四酢酸・2Na含有。)を調製しアビジン溶液とした。 (界面活性剤溶液)所定の界面活性剤を所定濃度含む10
0mM Tris-HCl緩衝液(pH7.8、30mM NaCl及び0.5mM エ
チレンジアミン四酢酸・2Na含有。)を調製し界面活性
剤溶液とした。 (酵素基質溶液)グルコース-6-リン酸を15.4mM、NA
Dを7.0mM、3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンス
ルホン酸(MOPSO)を20mM及びTrisを20mMを含む溶液を
調製し、酵素基質溶液とした。 (リポソーム試液)実施例1ので調製した標識ビオチ
ンリポソーム液を225mM Tris 緩衝液(pH7.8)で400倍
に希釈したものをリポソーム試液とした。 (操作法)アビジン溶液50μl、リポソーム試液100μl
及び界面活性剤溶液20μlを混合し、37℃で5分間反応
させた。次いでこれに酵素基質溶液95μlを加え37℃で
5分間反応させた後、5分間当たりの340nmの吸光度変
化(ΔE)を測定した。得られたΔEとアビジン溶液中
のアビジン濃度との関係を表わす検量線を図2〜4に示
す。尚、図2は界面活性剤としてトリトン X-100
(ローム アンド ハース社商品名)を用いた場合に、
図3は界面活性剤としてコール酸ナトリウムを用いた場
合に、図4は界面活性剤として3-[(3-コラミドアミドプ
ロピル)ジメチルアンモニオ]-2-ヒドロキシ-1-プロパン
スルホネイト(CHAPSO)(同仁化学研究所社製)を用いた
場合に得られた結果を夫々示し、各図中、−○−は界面
活性剤濃度が2.0%(界面活性剤溶液中の濃度を示す。
以下同じ。)である場合を、−●−は界面活性剤濃度が
1.0%である場合を、−□−は界面活性剤濃度が0.5%で
ある場合を、−△−は界面活性剤濃度が0.25%である場
合を、−◇−は界面活性剤濃度が0.125%である場合
を、−◆−は界面活性剤無添加である場合を夫々示す。
図2〜4の結果から明らかな如く、本発明の溶解方法に
於いては界面活性剤が必須であることが判る。Experimental Example 1 (Avidin solution) 100 mM Tris-H containing avidin at a specified concentration
A Cl buffer solution (pH 7.8, containing 30 mM NaCl and 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid / 2Na) was prepared and used as an avidin solution. (Surfactant solution) Contains a specified concentration of a specified surfactant 10
A 0 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.8, containing 30 mM NaCl and 0.5 mM ethylenediaminetetraacetic acid / 2Na) was prepared and used as a surfactant solution. (Enzyme substrate solution) glucose-6-phosphate at 15.4 mM, NA
A solution containing 7.0 mM of D, 20 mM of 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) and 20 mM of Tris was prepared as an enzyme substrate solution. (Liposome test solution) The labeled biotin liposome solution prepared in Example 1 was diluted 400-fold with 225 mM Tris buffer (pH 7.8) to obtain a liposome test solution. (Operation method) Avidin solution 50μl, liposome test solution 100μl
And 20 µl of a surfactant solution, and reacted at 37 ° C for 5 minutes. Next, 95 μl of the enzyme substrate solution was added thereto and reacted at 37 ° C. for 5 minutes, and the change in absorbance (ΔE) at 340 nm per 5 minutes was measured. Calibration curves showing the relationship between the obtained ΔE and the avidin concentration in the avidin solution are shown in FIGS. FIG. 2 shows Triton X-100 as a surfactant.
(Rohm and Haas product name)
FIG. 3 shows a case where sodium cholate was used as a surfactant, and FIG. 4 shows a case where 3-[(3-cholamidoamidopropyl) dimethylammonio] -2-hydroxy-1-propanesulfonate (CHAPSO) was used as a surfactant. ) (Manufactured by Dojindo Laboratories) is shown, and in each figure,-○-indicates that the surfactant concentration is 2.0% (the concentration in the surfactant solution).
same as below. ),-●-indicates that the surfactant concentration is
1.0%,-□-when the surfactant concentration is 0.5%,-△-when the surfactant concentration is 0.25%,-◇-when the surfactant concentration is 0.125%. And-◆-indicates the case where no surfactant was added.
As is clear from the results of FIGS. 2 to 4, it is understood that a surfactant is essential in the dissolution method of the present invention.
【0046】実施例2.本実施例に於いて使用している
化合物名中の略号の正式名称は以下の通り。 BOC:t-ブトキシカルボニル基、 Z :ベンジルオキシカルボニル基。 Nα-ビオチニル-Nε-ジニトロフェニル-L-リシン・ジ
パルミトイルホスファチジルエタノールアミン縮合物の
合成 i)Nα-BOC-L-リシン・ジパルミトイルホスファチジルエ
タノールアミン縮合物の合成 Nα-BOC-Nε-Z-L-リシン(和光純薬工業(株)製)440mg
(1.16mmol)をクロロホルム20mlに溶解したものにN-メ
チルモルホリン(和光純薬工業(株)製)254μl(2.32mm
ol)及びクロロギ酸イソブチル(和光純薬工業(株)製)
237μl(1.74mmol)を添加し、0℃で30分間撹拌反応さ
せた。次いでこれにジパルミトイルホスファチジルエタ
ノールアミン(シグマ社製、以下DPPEと略記する。)50
0mg(0.72mmol)を添加し、室温で一夜撹拌下に反応さ
せた。反応終了後、溶媒を留去し、シリカゲルカラム
(溶離液;クロロホルムとメタノールとの混合溶媒)に
より精製を行い、Nα-BOC-Nε-Z-L-リシン・DPPE縮合物
592mg(収率:78%)を得た。得られたNα-BOC-Nε-Z-L
-リシン・DPPE縮合物285mg(0.27mmol)を、メタノール
とエタノールとの混合溶媒20mlに溶解させ、これに5%
パラジウムカーボン(和光純薬工業(株)製)200mgを加
えた後、水素添加接触還元を行った。反応終了後パラジ
ウムカーボンを瀘去し、反応液を濃縮してNα-BOC-L-リ
シン・DPPE縮合物240mg(収率:96%)を得た。 ii)Nα-アミノ-Nε-ジニトロフェニル-L-リシン・DPPE
縮合物の合成 ジニトロフェニルアミノブチル酸(シグマ社製)50mg
(0.19mmol)をクロロホルム5mlに溶解したものにN-メ
チルモルホリン(和光純薬工業(株)製)40.8μl(0.38m
mol)及びクロロギ酸イソブチル(和光純薬工業(株)
製)36.1μl(0.29mmol)を添加し、0℃で30分間撹拌
反応させた。次いでこれに上記i)で得たNα-BOC-L-リ
シン・DPPE縮合物120mg(0.13mmol)を添加し、室温で
一夜撹拌下に反応させた。反応終了後、溶媒を留去し、
シリカゲルカラム(溶離液;クロロホルムとメタノール
との混合溶媒)により精製を行い、Nα-BOC-Nε-ジニト
ロフェニル-L-リシン・DPPE縮合物82mg(収率:54%)
を得た。得られたNα-BOC-Nε-ジニトロフェニル-L-リ
シン・DPPE縮合物82mg(0.07mmol)を、0℃に冷却した
トリフルオロ酢酸(TFA)を40%含むクロロホルム溶液に
溶解させ、2時間撹拌反応させた。反応終了後、溶媒を
留去し、シリカゲルカラム(溶離液;クロロホルムとメ
タノールとの混合溶媒)により精製を行い、Nα-アミノ
-Nε-ジニトロフェニル-L-リシン・DPPE縮合物60mg(収
率:80%)を得た。 iii)Nα-ビオチニル-Nε-ジニトロフェニル-L-リシン・
DPPE縮合物の合成 上記ii)で得たNα-アミノ-Nε-ジニトロフェニル-L-リ
シン・DPPE縮合物60mg(0.056mmol)をクロロホルム3m
lに溶解したものにN-メチルモルホリン(和光純薬工業
(株)製)14.5μl(0.132mmol)及びN-ヒドロキシスクシ
ンイミドアミノカプロイルビオチン(ベクターラボラト
リーズ社製)30mg(0.066mmol)を含むDMF溶液を添
加し、5℃で一夜撹拌下に反応させた。反応終了後、溶
媒を留去し、シリカゲルカラム(溶離液;クロロホルム
とメタノールとの混合溶媒)により精製を行い、Nα-ビ
オチニル-Nε-ジニトロフェニル-L-リシン・DPPE縮合物
61mg(収率:77%)を得た。 DNP固定化標識ビオチンリポソーム液の調製 ビオチン修飾ジパルミトイルホスファチジルエタノール
アミンの代りに上記で得たNα-ビオチニル-Nε-ジニ
トロフェニル-L-リシン・DPPE縮合物(0.79μmol)を使
用した以外は、実施例1のと同じ試薬を用い、同様の
操作を行って、平均粒径が223nmのDNP固定化標識ビ
オチンリポソーム液を得た。 アビジン−ビオチン結合反応を利用したDNP固定化
標識ビオチンリポソーム膜の溶解 標識ビオチンリポソーム液の代りに、上記で得たDN
P固定化標識ビオチンリポソーム液を用いた以外は、実
施例1のと同じ試薬を用い、同様の操作を行って、ア
ビジン−ビオチン結合反応を利用してDNP固定化標識
ビオチンリポソーム膜を溶解させた。得られたΔEと試
料中のアビジン濃度との関係を表わす検量線を図5に示
す。尚、図5に於いて、−○−は界面活性剤としてコー
ル酸ナトリウムを1.0%含有させた試料を用いた場合に
得られた結果を、−□−は界面活性剤としてトリトンX
-100 (ローム アンド ハース社商品名)を0.25%
含有させた試料を用いた場合に得られた結果を夫々示
す。Embodiment 2 FIG. The formal names of the abbreviations in the compound names used in this example are as follows. BOC: t-butoxycarbonyl group, Z: benzyloxycarbonyl group. Synthesis of Nα-biotinyl-Nε-dinitrophenyl-L-lysine dipalmitoylphosphatidylethanolamine condensate i) Synthesis of Nα-BOC-L-lysine dipalmitoylphosphatidylethanolamine condensate Nα-BOC-Nε-ZL-lysine (Manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 440mg
(1.16 mmol) dissolved in 20 ml of chloroform was added to 254 μl of N-methylmorpholine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (2.32 mm
ol) and isobutyl chloroformate (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
237 µl (1.74 mmol) was added, and the mixture was stirred and reacted at 0 ° C for 30 minutes. Then, dipalmitoyl phosphatidylethanolamine (manufactured by Sigma, hereinafter abbreviated as DPPE) 50 is added thereto.
0 mg (0.72 mmol) was added, and the mixture was reacted at room temperature with stirring overnight. After completion of the reaction, the solvent is distilled off, and the mixture is purified by a silica gel column (eluent; mixed solvent of chloroform and methanol), and Nα-BOC-Nε-ZL-lysine / DPPE condensate
592 mg (yield: 78%) were obtained. Obtained Nα-BOC-Nε-ZL
-Dissolve 285 mg (0.27 mmol) of lysine-DPPE condensate in 20 ml of a mixed solvent of methanol and ethanol, and add 5%
After adding 200 mg of palladium carbon (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), hydrogenated catalytic reduction was performed. After completion of the reaction, the palladium carbon was filtered off, and the reaction solution was concentrated to obtain 240 mg of Nα-BOC-L-lysine / DPPE condensate (yield: 96%). ii) Nα-amino-Nε-dinitrophenyl-L-lysineDPPE
Synthesis of condensate Dinitrophenylaminobutyric acid (Sigma) 50mg
N-methylmorpholine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 40.8 μl (0.38 m
mol) and isobutyl chloroformate (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
36.1 μl (0.29 mmol) was added and reacted at 0 ° C. for 30 minutes with stirring. Next, 120 mg (0.13 mmol) of the Nα-BOC-L-lysine / DPPE condensate obtained in the above i) was added thereto, and the mixture was reacted at room temperature with stirring overnight. After completion of the reaction, the solvent was distilled off.
Purification was performed using a silica gel column (eluent; mixed solvent of chloroform and methanol), and 82 mg of Nα-BOC-Nε-dinitrophenyl-L-lysine / DPPE condensate (yield: 54%)
I got 82 mg (0.07 mmol) of the obtained Nα-BOC-Nε-dinitrophenyl-L-lysine / DPPE condensate is dissolved in a chloroform solution containing 40% of trifluoroacetic acid (TFA) cooled to 0 ° C. and stirred for 2 hours. Reacted. After completion of the reaction, the solvent was distilled off and the residue was purified with a silica gel column (eluent; mixed solvent of chloroform and methanol).
60 mg (yield: 80%) of -Nε-dinitrophenyl-L-lysine.DPPE condensate was obtained. iii) Nα-biotinyl-Nε-dinitrophenyl-L-lysine
Synthesis of DPPE condensate 60 mg (0.056 mmol) of Nα-amino-Nε-dinitrophenyl-L-lysine / DPPE condensate obtained in ii) above was mixed with 3 m of chloroform.
l-N-methylmorpholine (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
A DMF solution containing 14.5 μl (0.132 mmol) and 30 mg (0.066 mmol) of N-hydroxysuccinimidoaminocaproylbiotin (manufactured by Vector Laboratories) was added, and reacted at 5 ° C. overnight with stirring. After the reaction is completed, the solvent is distilled off, and the residue is purified by a silica gel column (eluent; mixed solvent of chloroform and methanol), and Nα-biotinyl-Nε-dinitrophenyl-L-lysine / DPPE condensate
61 mg (yield: 77%) were obtained. Preparation of DNP-immobilized labeled biotin liposome solution The procedure was performed except that the Nα-biotinyl-Nε-dinitrophenyl-L-lysine / DPPE condensate (0.79 μmol) obtained above was used instead of the biotin-modified dipalmitoyl phosphatidylethanolamine. Using the same reagents as in Example 1, the same operation was performed to obtain a DNP-immobilized labeled biotin liposome solution having an average particle size of 223 nm. Dissolution of DNP-Immobilized Labeled Biotin Liposome Membrane Using Avidin-Biotin Binding Reaction Instead of the labeled biotin liposome solution, the DN obtained above was used.
Except that the P-immobilized labeled biotin liposome solution was used, the same operation was performed using the same reagent as in Example 1, and the DNP-immobilized labeled biotin liposome membrane was dissolved using an avidin-biotin binding reaction. . FIG. 5 shows a calibration curve representing the relationship between the obtained ΔE and the avidin concentration in the sample. In FIG. 5, -−- indicates the results obtained when a sample containing 1.0% of sodium cholate was used as a surfactant, and-□-indicates Triton X as a surfactant.
-100% (Rohm and Haas brand name) 0.25%
The results obtained when using the contained samples are shown below.
【0047】比較例2.試料として、所定濃度のメリチ
ンを含む溶液を用いた以外は実施例2のと同じ試薬を
用い、同様の操作を行ってΔEを測定した。得られたΔ
Eと試料中のメリチン濃度との関係を表わす検量線を図
5に併せて示す(−×−)。図5の結果から明らかなよ
うに、本願発明の膜溶解方法は、表面にビオチンと共に
DNPを固定化したリポソームに対しても有効に作用
し、且つその溶解の程度は共存するアビジンの濃度に比
例することが判る。また、本発明の溶解方法による膜溶
解作用は、DNP固定化標識ビオチンリポソームに対し
ても従来同様の目的で用いられていたメリチンよりも明
らかに高いことが判る。Comparative Example 2 ΔE was measured by using the same reagent as in Example 2 except that a solution containing a predetermined concentration of melittin was used as a sample. Δ obtained
A calibration curve showing the relationship between E and the melittin concentration in the sample is also shown in FIG. 5 (− × −). As is clear from the results shown in FIG. 5, the membrane dissolution method of the present invention effectively acts on liposomes having DNP immobilized on the surface together with biotin, and the degree of dissolution is proportional to the concentration of coexisting avidin. You can see. In addition, it can be seen that the membrane dissolving effect of the dissolving method of the present invention is clearly higher for DNP-immobilized labeled biotin liposomes than for melittin which has been used for the same purpose as before.
【0048】実施例3.DNPの測定 (試料)所定濃度のDNPを含む100mM Tris 緩衝液(p
H7.8)を試料とした。 (酵素基質液)グルコース-6-リン酸を15.4mM、NAD
を7.0mM、3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンスル
ホン酸(MOPSO)を20mM、Trisを20mM及び抗DNP抗体
(ICNイムノバイオケミカルズ社製)4μgAb/mlを含
む溶液を調製し、酵素基質溶液とした。 (リポソーム試液)実施例2ので調製したDNP固定
化標識ビオチンリポソーム液を225mM Tris緩衝液(pH
7.8)で500倍に希釈したものをリポソーム試液とした。 (アビジン溶液)アビジンを132nM、及びトリトン X-
100(ローム アンド ハース社登録商標)を0.25%
含む100mM Tris 緩衝液(pH7.8)をアビジン溶液とし
た。 (操作法)試料10μlと酵素基質液100μlとを混合し、3
7℃で2.5分間インキュベイトした後、リポソーム試液95
μlを添加し、更に37℃で2.5分間インキュベイトした。
次いでこれにアビジン溶液50μlを添加して37℃で5分
間インキュベイトした後、5分間当たりの340nmの吸光
度変化(ΔE)を測定した。得られたΔEと試料中のD
NP濃度との関係を表わす検量線を図6に示す。図6の
結果から明らかな如く、本発明の方法によりDNPを感
度よく測定し得ることが判る。Embodiment 3 FIG. Measurement of DNP (Sample) 100 mM Tris buffer (p
H7.8) was used as a sample. (Enzyme substrate solution) 15.4 mM glucose-6-phosphate, NAD
A solution containing 7.0 mM, 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO) at 20 mM, Tris at 20 mM and an anti-DNP antibody (ICN Immunobiochemicals, Inc.) at 4 μg Ab / ml was prepared. A substrate solution was used. (Liposome test solution) The DNP-immobilized labeled biotin liposome solution prepared in Example 2 was mixed with a 225 mM Tris buffer solution (pH
What was diluted 500 times in 7.8) was used as a liposome test solution. (Avidin solution) 132 nM of avidin and Triton X-
0.25% for 100 (Rohm and Haas registered trademark)
The 100 mM Tris buffer (pH 7.8) was used as an avidin solution. (Operation method) Mix 10 μl of the sample with 100 μl of the enzyme substrate solution,
After incubating at 7 ° C for 2.5 minutes, liposome TS 95
μl was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C. for 2.5 minutes.
Next, 50 μl of the avidin solution was added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes, and then the change in absorbance (ΔE) at 340 nm per 5 minutes was measured. The obtained ΔE and D in the sample
FIG. 6 shows a calibration curve representing the relationship with the NP concentration. As is clear from the results of FIG. 6, it can be seen that DNP can be measured with high sensitivity by the method of the present invention.
【0049】実施例4.フェノバルビタールの定量 フェノバルビタール結合アビジン液の調製 アビジン16mg(0.24μmol)を0.16M ホウ酸緩衝液(0.
13M NaCl含有。pH7.9)8mlに溶解したものに、4-ヒド
ロキシアゾベンゼン-2-カルボン酸(東京化成(株)製)
を0.01M含む0.16M ホウ酸緩衝液(0.13M NaCl含有。p
H7.9)2mlを加えて反応させた後、1-(4-カルボキシブ
チル )フェノバルビタールのN-ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル6.5mg(0.24μmol×63)を含むDMF溶液を
添加し、5℃で一夜撹拌反応させた。反応終了後、反応
液を0.16M ホウ酸緩衝液(0.13MNaCl含有。pH7.9)で
予め平衡化しておいたセファデックス G−25カラム
を用いてゲル濾過により精製し、フェノバルビタール
(以下、PBと略記する。)結合アビジン液35mlを調製
した。 PB結合アビジンを利用した標識ビオチンリポソーム
膜の溶解 (試料)上記で得たPB結合アビジン液を100mM Tris
緩衝液(pH7.8)で適宜希釈したものを試料とした。 (酵素基質溶液)実施例1と同じものを用いた。 (リポソーム試液)実施例1ので調製した標識ビオチ
ンリポソーム液を225mM Tris 緩衝液(pH7.8)で300倍
に希釈したものをリポソーム試液とした。 (界面活性剤溶液)トリトン X-100(ローム ア
ンド ハース社登録商標)を0.25%含む100mM Tris 緩
衝液(pH7.8)を界面活性剤溶液とした。 (操作法)試料50μlと酵素基質溶液100μlとを混合し
て、37℃で2.5分間インキュベイトした後、界面活性剤
溶液50μlを加え、更に37℃で2.5分間インキュベイトし
た。次いでこれにリポソーム試液95μlを添加して37℃
で10分間インキュベイトした後、10分間当たりの340nm
の吸光度変化(ΔE)を測定した。得られたΔEとPB
結合アビジン液の希釈倍率との関係を表わす検量線を図
7に示す。図7の結果から明らかな如く、標識ビオチン
リポソームの膜は共存するPB結合アビジン濃度に比例
して溶解されることが判る。 PB結合アビジンを利用したPBの定量 (試料)所定濃度のPBを含む100mM Tris 緩衝液(pH
7.8)を試料とした。 (酵素基質溶液)グルコース-6-リン酸を15.4mM、NA
Dを7.0mM、3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンス
ルホン酸(MOPSO)を20mM、Trisを20mM及び抗PB抗体
(和光純薬工業(株)社製)を5μgAb/ml含む溶液を調製
し、酵素基質溶液とした。 (リポソーム試液)実施例1ので調製した標識ビオチ
ンリポソーム液を225mM Tris 緩衝液(pH7.8)で300倍
に希釈したものをリポソーム試液とした。 (PB結合アビジン溶液)上記で得たPB結合アビジ
ン液をトリトン X-100(ローム アンドハース社
登録商標)を0.25%含む100mM Tris 緩衝液(pH7.8)
で20倍に希釈してPB結合アビジン溶液とした。 (操作法)試料10μlと酵素基質溶液100μlとを混合し
て、37℃で2.5分間インキュベイトした後、PB結合ア
ビジン溶液50μlを加え、更に37℃で2.5分間インキュベ
イトした。次いでこれにリポソーム試液95μlを添加し
て37℃で10分間インキュベイトした後、10分間当たりの
340nmの吸光度変化(ΔE)を測定した。得られたΔE
と試料中のPB濃度との関係を表わす検量線を図8に示
す。図8の結果から明らかな如く、本発明の方法により
PBを測定し得ることが判る。Embodiment 4 FIG. Determination of phenobarbital Preparation of phenobarbital-bound avidin solution Avidin 16 mg (0.24 μmol) was added to 0.16 M borate buffer (0.
Contains 13M NaCl. 4-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was dissolved in 8 ml of pH 7.9).
0.1M M borate buffer (containing 0.13M NaCl. P
After adding 2 ml of H7.9), a DMF solution containing 6.5 mg of N-hydroxysuccinimide ester of 1- (4-carboxybutyl) phenobarbital (0.24 μmol × 63) was added, and the mixture was stirred at 5 ° C. overnight. Reacted. After completion of the reaction, the reaction solution was purified by gel filtration using a Sephadex G-25 column which had been equilibrated with a 0.16 M borate buffer (containing 0.13 M NaCl, pH 7.9), and phenobarbital (hereinafter referred to as PB). This was abbreviated as). 35 ml of bound avidin solution was prepared. Dissolution of labeled biotin liposome membrane using PB-conjugated avidin (Sample) The PB-conjugated avidin solution obtained above was dissolved in 100 mM Tris
A sample appropriately diluted with a buffer (pH 7.8) was used as a sample. (Enzyme substrate solution) The same one as in Example 1 was used. (Liposome Test Solution) The labeled biotin liposome solution prepared in Example 1 was diluted 300 times with 225 mM Tris buffer (pH 7.8) to obtain a liposome test solution. (Surfactant solution) A 100 mM Tris buffer (pH 7.8) containing 0.25% of Triton X-100 (Rohm and Haas®) was used as a surfactant solution. (Operation method) After mixing 50 µl of the sample and 100 µl of the enzyme substrate solution and incubating at 37 ° C for 2.5 minutes, 50 µl of a surfactant solution was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2.5 minutes. Next, 95 μl of the liposome test solution was added thereto, and the mixture was added at 37 ° C.
After incubating for 10 minutes at 340nm per 10 minutes
Was measured for absorbance change (ΔE). ΔE and PB obtained
FIG. 7 shows a calibration curve representing the relationship with the dilution ratio of the bound avidin solution. As is clear from the results in FIG. 7, the membrane of the labeled biotin liposome is dissolved in proportion to the concentration of the coexisting PB-bound avidin. Quantification of PB using PB-bound avidin (Sample) 100 mM Tris buffer (pH
7.8) was used as a sample. (Enzyme substrate solution) glucose-6-phosphate at 15.4 mM, NA
A solution containing 7.0 mM of D, 20 mM of 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO), 20 mM of Tris and 5 μg Ab / ml of anti-PB antibody (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). It was prepared and used as an enzyme substrate solution. (Liposome Test Solution) The labeled biotin liposome solution prepared in Example 1 was diluted 300 times with 225 mM Tris buffer (pH 7.8) to obtain a liposome test solution. (PB-conjugated avidin solution) A 100 mM Tris buffer (pH 7.8) containing 0.25% of Triton X-100 (registered trademark of Rohm and Haas Co.) with the PB-conjugated avidin solution obtained above.
And diluted 20-fold to give a PB-bound avidin solution. (Operation method) After mixing 10 µl of the sample and 100 µl of the enzyme substrate solution and incubating at 37 ° C for 2.5 minutes, 50 µl of a PB-conjugated avidin solution was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2.5 minutes. Next, 95 μl of the liposome test solution was added thereto, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 10 minutes.
The change in absorbance at 340 nm (ΔE) was measured. ΔE obtained
FIG. 8 shows a calibration curve representing the relationship between the PB concentration and the PB concentration in the sample. As is clear from the results of FIG. 8, it can be seen that PB can be measured by the method of the present invention.
【0050】実施例5.牛胎児血清アルブミンの定量 (試料)所定濃度の牛胎児血清アルブミン(BSA)を
含む100mM Tris 緩衝液(pH7.8)を試料とした。 (酵素基質溶液)グルコース-6-リン酸を15.4mM、NA
Dを7.0mM、3-(N-モルホリノ)-2-ヒドロキシプロパンス
ルホン酸(MOPSO)を20mM、Trisを20mM及び抗BSA抗
体(バインディングサイト社製)75μg Protein/mlを含
む溶液を調製し、酵素基質溶液とした。 (リポソーム試液)実施例1ので調製した標識ビオチ
ンリポソーム液を225mM Tris 緩衝液(pH7.8)で400倍
に希釈したものにビオチン修飾BSA(シグマ社製)を
1μg/ml含有させてリポソーム試液とした。 (アビジン溶液)アビジンを132nM、及びコール酸ナト
リウムを0.5%含む100mM Tris 緩衝液(pH7.8)をアビ
ジン溶液とした。 (操作法)試料20μlと酵素基質溶液100μlとを混合し
て、37℃で2.5分間インキュベイトした後、リポソーム
試液95μlを加え、更に37℃で2.5分間インキュベイトし
た。次いでこれにアビジン溶液50μlを添加して37℃で1
0分間インキュベイトした後、10分間当たりの340nmの吸
光度変化(ΔE)を測定した。得られたΔEとBSA濃
度との関係を表わす検量線を図9に示す。図9から明ら
かな如く、本発明の方法によりBSAを感度よく測定し
得ることが判る。Embodiment 5 FIG. Determination of fetal bovine serum albumin (Sample) A 100 mM Tris buffer (pH 7.8) containing a predetermined concentration of fetal bovine serum albumin (BSA) was used as a sample. (Enzyme substrate solution) glucose-6-phosphate at 15.4 mM, NA
A solution containing 7.0 mM of D, 20 mM of 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid (MOPSO), 20 mM of Tris, and 75 μg Protein / ml of anti-BSA antibody (manufactured by Binding Site) was prepared. A substrate solution was used. (Liposome test solution) A biotin-modified BSA (manufactured by Sigma) was diluted to 1/400 with a 225 mM Tris buffer solution (pH 7.8), and 1 µg / ml of the labeled biotin liposome solution prepared in Example 1 was added thereto. did. (Avidin solution) A 100 mM Tris buffer (pH 7.8) containing 132 nM of avidin and 0.5% of sodium cholate was used as an avidin solution. (Operation method) After mixing 20 µl of the sample and 100 µl of the enzyme substrate solution and incubating at 37 ° C for 2.5 minutes, 95 µl of a liposome test solution was added, and the mixture was further incubated at 37 ° C for 2.5 minutes. Then add 50 μl of the avidin solution and add
After incubating for 0 minutes, the change in absorbance (ΔE) at 340 nm per 10 minutes was measured. FIG. 9 shows a calibration curve representing the relationship between the obtained ΔE and the BSA concentration. As is clear from FIG. 9, it can be seen that BSA can be measured with high sensitivity by the method of the present invention.
【0051】[0051]
【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、アビジンと
ビオチンとの反応を利用したリポソーム膜の新しい溶解
方法を提供するものであり、その膜溶解作用は従来知ら
れていたリポソーム膜溶解方法より強力であり、且つそ
の作用は共存するアビジンの量に対応するという特徴を
有しているため、この膜溶解作用を利用することにより
種々の物質の定量が可能となる点に顕著な効果を奏し、
斯業に貢献するところ大なる発明である。As described above, the present invention provides a new method for dissolving a liposome membrane utilizing the reaction between avidin and biotin. It has the characteristic that it is more powerful and its action corresponds to the amount of coexisting avidin, so it has a remarkable effect in that quantification of various substances becomes possible by utilizing this membrane dissolving action. Playing,
It is a great invention that contributes to the industry.
【0052】[0052]
【図1】図1は、実施例1及び比較例1で得られた検量
線を示す。FIG. 1 shows the calibration curves obtained in Example 1 and Comparative Example 1.
【図2】図2は、実験例1で得られた検量線を示す。FIG. 2 shows a calibration curve obtained in Experimental Example 1.
【図3】図3は、実験例1で得られた検量線を示す。FIG. 3 shows a calibration curve obtained in Experimental Example 1.
【図4】図4は、実験例1で得られた検量線を示す。FIG. 4 shows a calibration curve obtained in Experimental Example 1.
【図5】図5は、実施例2及び比較例2で得られた検量
線を示す。FIG. 5 shows calibration curves obtained in Example 2 and Comparative Example 2.
【図6】図6は、実施例3で得られた検量線を示す。FIG. 6 shows a calibration curve obtained in Example 3.
【図7】図7は、実施例4で得られた検量線を示す。FIG. 7 shows a calibration curve obtained in Example 4.
【図8】図8は、実施例4で得られた検量線を示す。FIG. 8 shows a calibration curve obtained in Example 4.
【図9】図9は、実施例5で得られた検量線を示す。FIG. 9 shows a calibration curve obtained in Example 5.
【0053】[0053]
図1及び5に於いて、−○−は界面活性剤としてコール
酸ナトリウムを1.0%含有させた試料により得られた結
果を、−□−は界面活性剤としてトリトン X-100
(ローム アンド ハース社商品名)を0.25%含有させ
た試料により得られた結果を、−×−は試料として所定
濃度のメリチン溶液を使用して得られた結果を夫々示
す。図2〜4に於いて、−○−は界面活性剤濃度が2.0
%(界面活性剤溶液中の濃度を示す。以下同じ。)であ
る場合を、−●−は 界面活性剤濃度が1.0%である場合
を、−□−は界面活性剤濃度が0.5%である場合を、−
△−は界面活性剤濃度が0.25%である場合を、−◇−は
界面活性剤濃度が0.125%である場合を、−◆−は界面
活性剤無添加である場合を夫々示す。In FIGS. 1 and 5, -.largecircle. Represents the result obtained from a sample containing 1.0% of sodium cholate as a surfactant, and -.quadrature. Represents Triton X-100 as a surfactant.
(Rohm and Haas Co., Ltd.) contains 0.25% of the sample, and-×-shows the result obtained by using a melittin solution having a predetermined concentration as the sample. In FIGS. 2 to 4, -−- indicates that the surfactant concentration is 2.0.
% (Indicating the concentration in the surfactant solution; the same applies hereinafter),-●-indicates that the surfactant concentration is 1.0%, and-□-indicates that the surfactant concentration is 0.5%. If-
Δ- indicates the case where the surfactant concentration is 0.25%,-◇-indicates the case where the surfactant concentration is 0.125%, and-◆-indicates the case where no surfactant is added.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭61−53568(JP,A) 加藤典昭ほか「高分子リポソームの認 識・会合に関する研究」高分子学会予稿 集38巻,1989,pp2854−2856 Alexander L.Kliba nov et al,”Biotin− Bearing pH−Sensiti ve Liposomes:High− Affinity Binding t o Avidin Layer”,Jo urnal of Liposome Research,Vol.1,No. 2,1989,pp233−244 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 33/544 G01N 33/53 ────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References JP-A-61-53568 (JP, A) Noriaki Kato et al. “Research on recognition and association of polymer liposomes” Proceedings of the Society of Polymer Science, 38, 1989, pp. 2854- 2856 Alexander L. Klibanov et al, "Biotin-bearing pH-Sensitive Liposomes: High-Affinity Binding to Avidin Layer", Journal of Liposomal. 1, No. 2, 1989, pp233-244 (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 33/544 G01N 33/53
Claims (7)
ソームに、界面活性剤とアビジンとを作用させることを
特徴とする、リポソーム膜溶解方法。1. A method for dissolving a liposome membrane, wherein a surfactant and avidin are allowed to act on liposomes having biotin immobilized on the membrane surface in advance.
化し、且つ内部に標識物質を保持したリポソームであ
る、請求項1に記載のリポソーム膜溶解方法。2. The method for dissolving a liposome membrane according to claim 1, wherein the liposome is a liposome having biotin immobilized on the membrane surface and a label substance retained therein.
め膜表面上にビオチンを固定化したリポソームの膜溶解
剤。3. A liposome membrane-dissolving agent comprising biotin immobilized on a membrane surface in advance, comprising a surfactant and avidin.
内部に標識物質を保持したリポソームに対する界面活性
剤とアビジンとの該リポソーム膜溶解活性を、測定対象
物質とそれに対して特異的に結合する性質を有する物質
との反応を利用して減少させ、その減少の程度に応じて
該リポソームから遊出する標識物質量を測定することに
より測定対象物質量を定量することを特徴とする定量方
法。4. A liposome membrane dissolving activity of a surfactant and avidin for a liposome having biotin immobilized on a membrane surface in advance and holding a labeling substance therein is specifically bound to a substance to be measured and the liposome membrane-dissolving activity. Quantifying the amount of a substance to be measured by measuring the amount of a labeling substance that migrates from the liposome in accordance with the degree of the reduction by utilizing a reaction with a substance having the property of causing .
又は抗体であり、それに対して特異的に結合する性質を
有する物質が抗体又は抗原(ハプテンを含む。)であ
る、請求項4に記載の定量方法。5. The substance to be measured is an antigen (including a hapten).
5. The method according to claim 4, wherein the substance that is an antibody and has a property of specifically binding thereto is an antibody or an antigen (including a hapten).
それに対して特異的に結合する性質を有する物質がレク
チン又は糖鎖である、請求項4に記載の定量方法。6. The substance to be measured is a sugar chain or a lectin,
The method according to claim 4, wherein the substance having the property of specifically binding thereto is a lectin or a sugar chain.
特異的に結合する性質を有する物質がそれに相補的なポ
リヌクレオチドである、請求項4に記載の定量方法。7. The method according to claim 4, wherein the substance to be measured is a nucleic acid, and the substance having a property of specifically binding thereto is a polynucleotide complementary thereto.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP21727292A JP3239456B2 (en) | 1991-07-23 | 1992-07-23 | Method for dissolving liposome membrane and immunoassay using the same |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3-206571 | 1991-07-23 | ||
JP20657191 | 1991-07-23 | ||
JP21727292A JP3239456B2 (en) | 1991-07-23 | 1992-07-23 | Method for dissolving liposome membrane and immunoassay using the same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05273213A JPH05273213A (en) | 1993-10-22 |
JP3239456B2 true JP3239456B2 (en) | 2001-12-17 |
Family
ID=26515725
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP21727292A Expired - Fee Related JP3239456B2 (en) | 1991-07-23 | 1992-07-23 | Method for dissolving liposome membrane and immunoassay using the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3239456B2 (en) |
-
1992
- 1992-07-23 JP JP21727292A patent/JP3239456B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Alexander L.Klibanov et al,"Biotin−Bearing pH−Sensitive Liposomes:High−Affinity Binding to Avidin Layer",Journal of Liposome Research,Vol.1,No.2,1989,pp233−244 |
加藤典昭ほか「高分子リポソームの認識・会合に関する研究」高分子学会予稿集38巻,1989,pp2854−2856 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05273213A (en) | 1993-10-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU551950B2 (en) | Immunoassay products and methods | |
Rongen et al. | Liposomes and immunoassays | |
US4708933A (en) | Immunoliposome assay-methods and products | |
US4483921A (en) | Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme | |
US4704355A (en) | Assay utilizing ATP encapsulated within liposome particles | |
US4783400A (en) | Homogeneous enzyme immunoassay system and method | |
US5210040A (en) | Process for coupling antibodies or antibody fragments to liposomes | |
US5501953A (en) | Process for quantitatively lysing liposomes and a process for determining the amount of an analyte using same | |
EP0243471A1 (en) | Solid-phase liposome immunoassay system | |
JP2927486B2 (en) | Immunoassay and reagents used for it | |
JP3239456B2 (en) | Method for dissolving liposome membrane and immunoassay using the same | |
JPH079428B2 (en) | Immunoassay method | |
JP2527434B2 (en) | Liquid for measurement Single reagent | |
Kim et al. | Liposome immunoassay (LIA) for gentamicin using phospholipase C | |
US4971916A (en) | Liposome based homogeneous immunoassay for diagnostic tests | |
JP3407076B2 (en) | Method for stabilizing liposome membrane and method for measuring hapten using the same | |
EP0552954B1 (en) | Immunoassay and reagents used therefor | |
JPH07110331A (en) | Human complement value measuring method and reagent component for measuring the value | |
JPH06207939A (en) | Dissolving method for ribosome membrane and quantification of antigen or antibody utilizing the method | |
EP0258388A1 (en) | Immunoliposome assay - methods and products | |
JPH07113639B2 (en) | Immunoassay reagent | |
JPH0898682A (en) | Assay reagent and determination method using the reagent | |
JPH0224561A (en) | Microcapsule | |
JPH11264822A (en) | Immunoanalytical reagent and immunoanalytical method using the same | |
JPH06130061A (en) | Reagent and method for measuring immunity |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20010911 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |