JP3235223U - 二光子誘導放出抑制複合顕微鏡 - Google Patents
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Abstract
【課題】STEDイメージングと二光子イメージングとの2種の機能を集積させ、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、最先端の生物医学研究のために強力なツールである、二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供する。【解決手段】二光子誘導放出抑制複合顕微鏡10は、二光子イメージングユニット100とSTEDイメージングユニット200を備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある場合、STED超解像度イメージングユニットを用いることができ、そして、対物レンズ(OL)で集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せる。【選択図】図1
Description
本考案は、顕微光学イメージングの技術分野に関し、特に、二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に関する。
光学超解像度顕微鏡法では、イメージングの解像度が光回折の限界を超え、そのイメージング解像度が従来の光学顕微鏡よりもはるかに高く、近年の研究の焦点となっており、さまざまなタイプのものが現れる。誘導放出抑制(StimulatedEmissionDepletion、STED)顕微鏡法は、初めて提案されており直接光回折の限界を克服する遠視野光学顕微鏡法であり、レーザー共焦点顕微イメージングに基づくものであり、他のタイプの超解像度顕微鏡法に比べて、イメージングの速度が高く、生細胞をイメージングすることができ、生物医学の研究においてより精細な構造を検出できる。
STEDイメージングは、解像度が極めて高いものの、イメージング深度が低く、二光子顕微イメージングは、解像度が悪いが、近赤外光を用いるため、イメージング深度が高く、しかしながら、現在、厚いサンプルの場合、二光子イメージングを用い、サンプルの表層の興味がある領域の場合、STED超解像度イメージングを用い得る、STEDイメージングと二光子イメージングとの2種の機能を集積させた複合顕微鏡の技術についての報告はまだ提案されていない。
これを鑑み、従来技術に存在している欠陥に対して、励起スポットと損失光スポットを素早く高精度で集束させ得る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡を提供することが求められる。
上記の目的を達成させるために、本考案は下記の技術案を採用する。
二光子誘導放出抑制複合顕微鏡であって、
二光子イメージングユニットとSTEDイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第1反射鏡、第2反射鏡、第1ダイクロイックミラー、第2フィルタ、第1レンズと第2レンズからなるビームエキスパンダ、第7反射鏡、第2ダイクロイックミラー、λ/4スライド、第6反射鏡、XYスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第3ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム、第3フィルタ、第8反射鏡、第3レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第2反射鏡と前記第1反射鏡によって反射され、前記第1ダイクロイックミラーに入り、前記第1ダイクロイックミラーを透過した後、前記第2フィルタに入り、前記第2フィルタを透過して射入した励起光ビームは、前記第1レンズと前記第2レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第2レンズから射出された後、前記第7反射鏡によって反射されて前記第2ダイクロイックミラーに入り、前記第2ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ/4スライドに入り、さらに前記第6反射鏡によって反射されて、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順次経て前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーによって反射され、前記第3フィルタに入り、前記第3フィルタは、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第3フィルタを透過した蛍光は、前記第8反射鏡によって反射され、前記第3レンズに入り、前記第3レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記STEDイメージングユニットは、スーパコンティニウムレーザー、光ファイバスプライス、4自由度レギュレータ、前記第1ダイクロイックミラー、前記第2フィルタ、前記第1レンズと前記第2レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第7反射鏡、前記第2ダイクロイックミラー、第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡、位相板、前記λ/4スライド、前記第6反射鏡、前記XYスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第3ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム、前記第3フィルタ、第8反射鏡、第4レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第8反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、前記光ファイバスプライスは、前記4自由度レギュレータに挟持され、前記4自由度レギュレータは、前記光ファイバスプライスのXY軸方向の周りの2自由度回転とXY軸方向に沿う2自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザーの位置と伝送方向を調整し、
前記スーパコンティニウムレーザーから放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライスによってコリメート出力され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーを経た後、波長が第1波長未満の光が前記第1ダイクロイックミラーにより反射され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーによって反射された部分は、前記第2フィルタでフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第1レンズと前記第2レンズからなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第2レンズから射出された後、前記第7反射鏡によって反射され、前記第2ダイクロイックミラーに入り、前記第2ダイクロイックミラーを透過し、
前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーを経た後、波長が前記第1波長よりも大きい光が、前記第1ダイクロイックミラーを透過し、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーを透過した部分は、前記第1フィルタでフィルタリングされて損失光となり、前記損失光は、前記第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡を順次経て前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第2ダイクロイックミラーによって反射され、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第2ダイクロイックミラーを経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ/4スライドに入って偏光調整され、前記第6反射鏡によって反射され、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズTLを順次経た後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、前記第3ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーによって反射され、前記第3フィルタに入り、前記第3フィルタは、射入されたレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第8反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記第3フィルタを透過した蛍光は、前記第4レンズに直接入り、前記第4レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、STEDイメージング蛍光信号の検出を実現する。
二光子イメージングユニットとSTEDイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第1反射鏡、第2反射鏡、第1ダイクロイックミラー、第2フィルタ、第1レンズと第2レンズからなるビームエキスパンダ、第7反射鏡、第2ダイクロイックミラー、λ/4スライド、第6反射鏡、XYスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第3ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム、第3フィルタ、第8反射鏡、第3レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第2反射鏡と前記第1反射鏡によって反射され、前記第1ダイクロイックミラーに入り、前記第1ダイクロイックミラーを透過した後、前記第2フィルタに入り、前記第2フィルタを透過して射入した励起光ビームは、前記第1レンズと前記第2レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第2レンズから射出された後、前記第7反射鏡によって反射されて前記第2ダイクロイックミラーに入り、前記第2ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ/4スライドに入り、さらに前記第6反射鏡によって反射されて、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順次経て前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーによって反射され、前記第3フィルタに入り、前記第3フィルタは、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第3フィルタを透過した蛍光は、前記第8反射鏡によって反射され、前記第3レンズに入り、前記第3レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記STEDイメージングユニットは、スーパコンティニウムレーザー、光ファイバスプライス、4自由度レギュレータ、前記第1ダイクロイックミラー、前記第2フィルタ、前記第1レンズと前記第2レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第7反射鏡、前記第2ダイクロイックミラー、第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡、位相板、前記λ/4スライド、前記第6反射鏡、前記XYスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第3ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム、前記第3フィルタ、第8反射鏡、第4レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第8反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、前記光ファイバスプライスは、前記4自由度レギュレータに挟持され、前記4自由度レギュレータは、前記光ファイバスプライスのXY軸方向の周りの2自由度回転とXY軸方向に沿う2自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザーの位置と伝送方向を調整し、
前記スーパコンティニウムレーザーから放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライスによってコリメート出力され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーを経た後、波長が第1波長未満の光が前記第1ダイクロイックミラーにより反射され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーによって反射された部分は、前記第2フィルタでフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第1レンズと前記第2レンズからなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第2レンズから射出された後、前記第7反射鏡によって反射され、前記第2ダイクロイックミラーに入り、前記第2ダイクロイックミラーを透過し、
前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーを経た後、波長が前記第1波長よりも大きい光が、前記第1ダイクロイックミラーを透過し、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーを透過した部分は、前記第1フィルタでフィルタリングされて損失光となり、前記損失光は、前記第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡を順次経て前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第2ダイクロイックミラーによって反射され、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第2ダイクロイックミラーを経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ/4スライドに入って偏光調整され、前記第6反射鏡によって反射され、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズTLを順次経た後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、前記第3ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーによって反射され、前記第3フィルタに入り、前記第3フィルタは、射入されたレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第8反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記第3フィルタを透過した蛍光は、前記第4レンズに直接入り、前記第4レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、STEDイメージング蛍光信号の検出を実現する。
いくつかの好適な実施例では、前記第1反射鏡、前記第2反射鏡、第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡、前記第6反射鏡、前記第7反射鏡、及び第8反射鏡は、いずれもXY軸の周りに角度を調整できる。
いくつかの好適な実施例では、前記第1反射鏡及び前記第2反射鏡の角度をXY軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡システムに素早くアクセスできる。
いくつかの好適な実施例では、前記第2レンズの光軸のZ方向に沿う位置が調整可能である。
いくつかの好適な実施例では、前記第7反射鏡の角度をX軸又はY軸の周りに調整し、X方向又はY方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のZ方向に沿って前記第2レンズの位置を調整し、Z方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせる。
いくつかの好適な実施例では、前記第1波長は532nmである。
いくつかの好適な実施例では、前記第2フィルタの中心波長は488nmであり、前記第1フィルタの中心波長は592nmである。
いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の相位分布は、0−2πのらせん分布である。
いくつかの好適な実施例では、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記XYスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動し、前記3次元ナノ変位プラットフォームが動かない。
いくつかの好適な実施例では、STEDイメージング蛍光信号を検出する際に、前記XYスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記3次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルを走査して移動させ、イメージングを実現する。
いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー及び前記スーパコンティニウムレーザーは、前記二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。
本考案では、上記技術案による利点は以下のとおりである。
本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、二光子イメージングユニットとSTEDイメージングユニットを備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある場合、STED超解像度イメージングユニットを用いることができ、そして、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、STEDイメージングと二光子イメージングとの2種の機能を集積させ、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。
本願の目的、技術案及び利点をより明確に説明するために、以下、図面及び実施例を参照しながら、本願をさらに詳細に説明する。なお、ここで説明する特定の実施例は本願を解釈するために過ぎず、本願を限定するものではない。
図1は、本考案の実施例に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡10の構造模式図を示し、二光子イメージングユニット100とSTEDイメージングユニット200を備える。
前記二光子イメージングユニット100は、フェムト秒レーザー110、第1反射鏡M1、第2反射鏡M2、第1ダイクロイックミラーDM1、第2フィルタF2、第1レンズL1と第2レンズL2からなるビームエキスパンダ、第7反射鏡M7、第2ダイクロイックミラーDM2、λ/4スライド120、第6反射鏡M6、XYスキャンガルバノメータ130、走査レンズSL、チューブレンズTL、第3ダイクロイックミラーDM3、対物レンズOL、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム140、第3フィルタF3、第8反射鏡M8、第3レンズL3、及び光電子増倍管(PMT)150を備える。
本考案の実施例に係る二光子イメージングユニット100の作動方式は以下のとおりである。
前記フェムト秒レーザー110から放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第1反射鏡M1と前記第2反射鏡M2によって反射され、前記第1ダイクロイックミラーDM1に入り、前記第1ダイクロイックミラーDM1を透過した後、前記第2フィルタF2に入り、前記第2フィルタF2を透過して射入した励起光ビームは、前記第1レンズL1と前記第2レンズL2からなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第2レンズL2から射出された後、前記第7反射鏡M7によって反射されて前記第2ダイクロイックミラーDM2に入り、前記第2ダイクロイックミラーDM2を透過した後、前記λ/4スライドに入り、さらに前記第6反射鏡M6によって反射されて、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズSLと前記チューブレンズTLを順次経て前記第3ダイクロイックミラーDM3に入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーDM3を透過した光ビームは、前記対物レンズOLに入り、且つ前記対物レンズOLによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズOLによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーDM3に入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーDM3によって反射され、前記第3フィルタF3に入り、前記第3フィルタF3は、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第3フィルタF3を透過した蛍光は、前記第8反射鏡M8によって反射され、前記第3レンズL3に入り、前記第3レンズL3によって集束された光ビームは前記光電子増倍管(PMT)に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現する。
なお、二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記XYスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動し、前記3次元ナノ変位プラットフォームが動かない。
前記STEDイメージングユニット200は、スーパコンティニウムレーザー210、光ファイバスプライス220、4自由度レギュレータ230、前記第1ダイクロイックミラーDM1、前記第2フィルタF2、前記第1レンズL1と前記第2レンズL2からなる前記ビームエキスパンダ、前記第7反射鏡M7、前記第2ダイクロイックミラーDM2、第3反射鏡M3、第4反射鏡M4、第5反射鏡M5、位相板240、前記λ/4スライド120、前記第6反射鏡M6、前記XYスキャンガルバノメータ130、前記走査レンズSL、前記チューブレンズTL、前記第3ダイクロイックミラーDM3、前記対物レンズOL、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム140、前記第3フィルタF3、第8反射鏡M8、第4レンズL4、ピンホール250、及びアバランシェダイオード260を備え、前記第8反射鏡M8は、所在する光路の外に移動可能であり、前記光ファイバスプライス220は、前記4自由度レギュレータ230に挟持され、前記4自由度レギュレータ230は、前記光ファイバスプライス220のXY軸方向の周りの2自由度回転とXY軸方向に沿う2自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光の位置及び伝送方向を調整する。
本考案の実施例に係るSTEDイメージングユニット200の作動方式は以下のとおりである。
前記スーパコンティニウムレーザー210から放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライス220によってコリメート出力され、前記光ファイバスプライス220から出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーDM1を経た後、波長が第1波長未満の光が前記第1ダイクロイックミラーDM1により反射され、前記光ファイバスプライス220から出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーDM1によって反射された部分は、前記第2フィルタF2でフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第1レンズL1と前記第2レンズL2からなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第2レンズL2から射出された後、前記第7反射鏡M7によって反射され、前記第2ダイクロイックミラーDM2に入り、前記第2ダイクロイックミラーDM2を透過し、
前記光ファイバスプライス220から出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーDM1を経た後、波長が前記第1波長よりも大きい光が、前記第1ダイクロイックミラーDM1を透過し、前記光ファイバスプライス220から出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーDM1を透過した部分は、前記第1フィルタF1でフィルタリングされて損失光となり、前記損失光は、前記第3反射鏡M3、第4反射鏡M4、第5反射鏡M5を順次経て前記位相板240に入り、前記位相板240を透過した光ビームは、前記第2ダイクロイックミラーDM2によって反射され、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第2ダイクロイックミラーDM2を経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ/4スライド120に入って偏光調整され、前記第6反射鏡M6によって反射され、前記XYスキャンガルバノメータ130に入り、前記XYスキャンガルバノメータ130から射出された光ビームは、前記走査レンズSLと前記チューブレンズTLを順次経た後、前記第3ダイクロイックミラーDM3に入り、前記第3ダイクロイックミラーDM3を透過した光ビームは、前記対物レンズOLに入り、且つ前記対物レンズOLによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム140上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズOLによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーDM3に入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーDM3によって反射され、前記第3フィルタF3に入り、前記第3フィルタF3は、射入されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第8反射鏡M8は所在する光路の外に移動され、前記第3フィルタF3を透過した蛍光は、前記第4レンズに直接入り、前記第4レンズL4の焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホール250から射出された光ビームは、前記アバランシェダイオード260に入り、それにより、STEDイメージング蛍光信号の検出を実現する。
前記光ファイバスプライス220から出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーDM1を経た後、波長が前記第1波長よりも大きい光が、前記第1ダイクロイックミラーDM1を透過し、前記光ファイバスプライス220から出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーDM1を透過した部分は、前記第1フィルタF1でフィルタリングされて損失光となり、前記損失光は、前記第3反射鏡M3、第4反射鏡M4、第5反射鏡M5を順次経て前記位相板240に入り、前記位相板240を透過した光ビームは、前記第2ダイクロイックミラーDM2によって反射され、且つ前記励起光と前記損失光は、前記第2ダイクロイックミラーDM2を経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ/4スライド120に入って偏光調整され、前記第6反射鏡M6によって反射され、前記XYスキャンガルバノメータ130に入り、前記XYスキャンガルバノメータ130から射出された光ビームは、前記走査レンズSLと前記チューブレンズTLを順次経た後、前記第3ダイクロイックミラーDM3に入り、前記第3ダイクロイックミラーDM3を透過した光ビームは、前記対物レンズOLに入り、且つ前記対物レンズOLによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム140上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズOLによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーDM3に入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーDM3によって反射され、前記第3フィルタF3に入り、前記第3フィルタF3は、射入されたレーザー光を抑制し、蛍光を透過し、前記第8反射鏡M8は所在する光路の外に移動され、前記第3フィルタF3を透過した蛍光は、前記第4レンズに直接入り、前記第4レンズL4の焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホール250から射出された光ビームは、前記アバランシェダイオード260に入り、それにより、STEDイメージング蛍光信号の検出を実現する。
なお、STEDイメージング蛍光信号を検出する際に、前記XYスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記3次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルを走査して移動させ、イメージングを実現する。
いくつかの好適な実施例では、前記第1反射鏡M1、前記第2反射鏡M2、第3反射鏡M3、第4反射鏡M4、第5反射鏡M5、前記第6反射鏡M6、前記第7反射鏡M7及び第8反射鏡M8は、レーザー光の光ビームが顕微鏡システムに精度よく結合して入力されるように、すべてXY軸方向の周りに角度を調整することができる。
なお、フェムト秒レーザーについては、それから放射された光ビームが自由空間で伝播し、XY軸の周りに角度を調整可能な第1反射鏡M1と第2反射鏡M2が使用され、M1とM2を調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは顕微鏡システムに素早くアクセスできる。
なお、スーパコンティニウムレーザーについては、光ファイバを用いてコリメートレーザー光を出力し、光ファイバの末端には光ファイバスプライスがあり、光ファイバスプライスが4自由度レギュレータに挟持され、この4自由度レギュレータによって光ファイバスプライスはXY方向の周りに移動したり、XY軸の周りに回転したりすることができ、それによって、光ファイバスプライスから放射されたレーザー光は光路に素早く正確に結合できる。
いくつかの好適な実施例では、前記第1波長は532nmであり、前記第2フィルタF2の中心波長は488nmであり、前記第1フィルタF1の中心波長は592nmである。
いくつかの好適な実施例では、前記位相板上の位相分布は0−2πのらせん分布である。
いくつかの好適な実施例では、前記フェムト秒レーザー110及び前記スーパコンティニウムレーザー210は、前記二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる。
なお、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡で使用されるフェムト秒レーザー光とスーパコンティニウムレーザーは、両方ともに体積が大きく、顕微鏡の輸送や位置移動時に、これらのレーザーを顕微鏡から取り外す必要があり、フェムト秒レーザー光及びスーパコンティニウムレーザーが顕微鏡システムに素早く接続できるように、前記フェムト秒レーザー及び前記スーパコンティニウムレーザーが二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられ、それにより、取り外しや輸送が簡便になる。
図2は、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での励起スポットの光強度分布(XY面とXZ面内の光強度分布)を示し、励起光が対物レンズを経た後、長い楕円形の中実三次元スポットとして集束される。
図3は、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡において対物レンズの焦点での損失光スポットの光強度分布(XY面とXZ面内の光強度分布)を示し、損失光が、対物レンズを経た後、柱体形状の中空三次元スポットとして集束される。
なお、STEDイメージングには、励起スポットと損失光スポットを三次元方向に精度よく重なり合わせる必要があり、損失光スポットの位置を基準(一定に維持)として、励起光スポットと精度よく重なり合うように励起光スポットの三次元位置を調整し、X軸又はY軸の周りに第3反射鏡M7の角度を調整することにより、励起光スポットのX方向又はY方向での位置を変えることができ、光軸のZ方向に沿って第2レンズL2の位置を調整することにより、励起光スポットのZ方向での位置を変えることができ、それにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることができる。
本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、二光子イメージングユニットとSTEDイメージングユニットを備え、厚いサンプルの場合、二光子イメージングユニットを用い、サンプルの表層の興味がある場合、STED超解像度イメージングユニットを用いることができ、そして、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、本考案に係る二光子誘導放出抑制複合顕微鏡は、STEDイメージングと二光子イメージングとの2種の機能を集積させ、対物レンズで集束された励起光と損失光のスポットの三次元分布を精度よく重なり合せ、最先端の生物医学研究のために強力なツールを提供する。
もちろん、本考案による二光子誘導放出抑制複合顕微鏡にはさまざまな置換や変形を加えることもでき、上記実施形態の特定の構造に制限されない。要するに、本考案の保護範囲は、当業者にとって明らかな置換、代替や変形を含むべきである。
本考案では、現在の好適な実施形態を参照しながら説明したが、当業者が理解できるように、上記の好適な実施形態は、本考案を説明するためのものに過ぎず、本考案の保護範囲を限定するものではなく、本考案の精神及び原則の範囲内で行われる任意の修飾、等価置換、改良などはすべて本考案の実用新案登録請求の範囲内に含まれるべきである。
Claims (12)
- 二光子イメージングユニットとSTEDイメージングユニットを備え、
前記二光子イメージングユニットは、フェムト秒レーザー、第1反射鏡、第2反射鏡、第1ダイクロイックミラー、第2フィルタ、第1レンズと第2レンズからなるビームエキスパンダ、第7反射鏡、第2ダイクロイックミラー、λ/4スライド、第6反射鏡、XYスキャンガルバノメータ、走査レンズ、チューブレンズ、第3ダイクロイックミラー、対物レンズ、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム、第3フィルタ、第8反射鏡、第3レンズ、及び光電子増倍管を含み、
前記フェムト秒レーザーから放射されたフェムト秒レーザー光は、前記第2反射鏡と前記第1反射鏡によって反射され、前記第1ダイクロイックミラーに入り、前記第1ダイクロイックミラーを透過した後、前記第2フィルタに入り、前記第2フィルタを透過して射入した励起光ビームは、前記第1レンズと前記第2レンズからなるビームエキスパンダに入り、光ビームは前記第2レンズから射出された後、前記第7反射鏡によって反射されて前記第2ダイクロイックミラーに入り、前記第2ダイクロイックミラーを透過した後、前記λ/4スライドに入り、さらに前記第6反射鏡によって反射されて、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズを順に経て前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーによって反射され、前記第3フィルタに入り、前記第3フィルタは、射入したレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第3フィルタを透過した蛍光は、前記第8反射鏡によって反射され、前記第3レンズに入り、前記第3レンズによって集束された光ビームは、前記光電子増倍管に入り、それにより、二光子イメージング蛍光信号の検出を実現し、
前記STEDイメージングユニットは、スーパコンティニウムレーザー、光ファイバスプライス、前記第1ダイクロイックミラー、前記第2フィルタ、前記第1レンズと前記第2レンズからなる前記ビームエキスパンダ、前記第7反射鏡、前記第2ダイクロイックミラー、第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡、位相板、前記λ/4スライド、前記第6反射鏡、前記XYスキャンガルバノメータ、前記走査レンズ、前記チューブレンズ、前記第3ダイクロイックミラー、前記対物レンズ、サンプルを置くための3次元ナノ変位プラットフォーム、前記第3フィルタ、第8反射鏡、第4レンズ、ピンホール、及びアバランシェダイオードを備え、前記第8反射鏡は、所在する光路の外に移動可能であり、
前記スーパコンティニウムレーザーから放射されたパルスレーザー光は、前記光ファイバスプライスによってコリメート出力され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーを経た後、波長が第1波長未満の光が前記第1ダイクロイックミラーにより反射され、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーによって反射された部分は、前記第2フィルタでフィルタリングされて励起光となり、前記励起光は、前記第1レンズと前記第2レンズからなるビームエキスパンダに入り、且つ前記第2レンズから射出された後、前記第7反射鏡によって反射され、前記第2ダイクロイックミラーに入り、前記第2ダイクロイックミラーを透過し、
前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光は、前記第1ダイクロイックミラーを経た後、波長が前記第1波長よりも大きい光が、前記第1ダイクロイックミラーを透過し、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光のうち、前記第1ダイクロイックミラーを透過した部分は、前記第1フィルタでフィルタリングされて光損失となり、前記光損失は、前記第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡を順に経て前記位相板に入り、前記位相板を透過した光ビームは、前記第2ダイクロイックミラーによって反射され、且つ前記励起光と前記光損失は、前記第2ダイクロイックミラーを経た後集束され、集束された光ビームは、前記λ/4スライドによって偏光調整され、前記第6反射鏡によって反射され、前記XYスキャンガルバノメータに入り、前記XYスキャンガルバノメータから射出された光ビームは、前記走査レンズと前記チューブレンズTLを順に経た後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、前記第3ダイクロイックミラーを透過した光ビームは、前記対物レンズに入り、且つ前記対物レンズによって前記3次元ナノ変位プラットフォーム上にあるサンプルに集束され、サンプルから放射された蛍光は、前記対物レンズによって収集された後、前記第3ダイクロイックミラーに入り、且つ前記第3ダイクロイックミラーによって反射され、前記第3フィルタに入り、前記第3フィルタは、射入されたレーザー光を抑制し、且つ蛍光を透過し、前記第8反射鏡は所在する光路の外に移動され、前記第3フィルタを透過した蛍光は、前記第4レンズに直接入り、前記第4レンズの焦点位置でのピンホールに集束され、前記ピンホールから射出された光ビームは、前記アバランシェダイオードに入り、それにより、STEDイメージング蛍光信号の検出を実現する、ことを特徴とする二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。 - 前記第1反射鏡、前記第2反射鏡、第3反射鏡、第4反射鏡、第5反射鏡、前記第6反射鏡、前記第7反射鏡、及び第8反射鏡は、いずれもXY軸の周りに角度を調整できる、ことを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記第1反射鏡及び前記第2反射鏡の角度をXY軸の周りに調整することにより、フェムト秒レーザー光から放射された光ビームは、前記複合顕微鏡システムに素早く接続できることを特徴とする請求項2に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記第2レンズの光軸のZ方向に沿う位置が調整可能である、ことを特徴とする請求項2に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記第7反射鏡の角度をX軸又はY軸の周りに調整し、X方向又はY方向における励起光スポットの位置を調整し、光軸のZ方向に沿って前記第2レンズの位置を調整し、Z方向における励起光スポットの位置を調整することにより、励起光スポットと損失光スポットを精度よく重なり合わせることを特徴とする請求項4に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記光ファイバスプライスは4自由度レギュレータに挟持され、前記4自由度レギュレータは、前記光ファイバスプライスのXY軸方向の周りの2自由度回転とXY軸方向に沿う2自由度移動を調整することで、前記光ファイバスプライスから出力されたレーザー光の位置及び伝送方向を調整することを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記第1波長は532nmであることを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記第2フィルタの中心波長は488nmであり、前記第1フィルタの中心波長は592nmであることを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記位相板上の相位分布は、0−2πのらせん分布であることを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 二光子イメージング蛍光信号を検出する際に、前記XYスキャンガルバノメータは光ビームを走査して移動し、前記3次元ナノ変位プラットフォームが動かないことを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- STEDイメージング蛍光信号を検出する際に、前記XYスキャンガルバノメータは移動走査を行わず、ゼロ位置に留まり、前記3次元ナノ変位プラットフォームは、サンプルの走査移動を連行し、イメージングを実現することを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
- 前記フェムト秒レーザー及び前記スーパコンティニウムレーザーは、前記二光子誘導放出抑制複合顕微鏡に取り外し可能に取り付けられる、ことを特徴とする請求項1に記載の二光子誘導放出抑制複合顕微鏡。
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