JP3223958B2 - 金属結合ラクトフェリン及びその用途 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、金属、特に生体の
生理作用をつかさどる微量元素を多量に結合した金属結
合ラクトフェリンまたは金属結合ラクトフェリン分解物
に関する。また、本発明は、このような金属結合ラクト
フェリンまたは金属結合ラクトフェリン分解物を配合し
た金属、特に微量元素を多量に含有させた医薬、飲食品
及び飼料に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体に必要な微量元素であるといわれて
いる物質のうち、動物実験で必須の微量元素であること
が確認されている物質は27種類以上存在するといわれて
いる。そのうち、所要量の多い微量元素としては、ナト
リウム及びカリウムを除くと、一日当たり、カルシウム
が600g、マグネシウムが300g及び鉄が10mgである。ま
た、日本においては所要量の定めはないが、米国におい
て所要量の定めがある微量元素としては、一日当たり、
亜鉛が15mg、銅が 1.5〜３mg及びマンガンが２〜５mg等
である。

【０００３】日常、これらの微量元素を飲食品から充分
量摂取することが望ましいといえるが、食習慣や地域
性、あるいは疾病等の要因により、これらの微量元素を
飲食品から充分量摂取することができないという事態も
起こり得る。そのような場合、これらの微量元素を補助
的に摂取させる必要が生じてくる。そして、現在、鉄を
始めとして、様々な微量元素を含む補助食品が開発さ
れ、市販もされている。しかし、これらの微量元素のう
ち、特に、鉄、亜鉛、銅等は独特の金属臭を有するの
で、そのままでは食用に適さないという問題があった。
また、これらの微量元素は油脂類の酸化を促進するの
で、油脂類を含有する飲食品の風味を劣化させてしまう
という問題もあった。

【０００４】一方、乳中には鉄結合性蛋白質であるラク
トフェリンが存在することが知られている。そして、こ
のラクトフェリンには、細菌の増殖に必要な鉄をキレー
トして奪い去ることにより、細菌の増殖を抑制する効果
があることが知られている。また、ラクトフェリンの有
する鉄結合性を利用して、鉄を結合させたラクトフェリ
ンを調製し、これを鉄補給を目的とした飲食品の素材と
して使用することも提案されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、炭酸や
重炭酸を介して鉄とラクトフェリン類を結合させた鉄−
ラクトフェリンを提案した (特開平7-304798号公報) 。
また、同様にして亜鉛とラクトフェリン類を結合させた
亜鉛−ラクトフェリンを提案した (特願平7-344831号)
。そして、さらに、各種の金属とラクトフェリン類と
の結合性について、鋭意研究を進めていたところ、単一
の金属をラクトフェリン類と反応させるよりも、複数種
の金属を同時にラクトフェリン類と反応させる方が、多
量の金属をラクトフェリン類に結合させることができる
ことを見出した。また、さらにラクトフェリン類分解物
についても同様の性質があることを見出した。

【０００６】そして、この複数種の金属を結合したラク
トフェリン類や金属を結合したラクトフェリン類分解物
は、金属臭を呈さず、長期間安定で、耐熱性を有すると
いう性質を示し、これらを微量元素補給の目的で、医薬
や飲食品、あるいは飼料に配合しても劣化しないことを
見出し、本発明を完成するに至った。したがって、本発
明は、複数種の金属を多量に結合した金属結合ラクトフ
ェリンまたは金属結合ラクトフェリン分解物を提供する
ことを課題とする。さらに、本発明は、複数種の金属を
多量に結合した金属結合ラクトフェリンや金属結合ラク
トフェリン分解物を配合したミネラル補給用医薬、飲食
品及び飼料を提供することを課題とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は、種々の金属、
特に微量元素とラクトフェリン類やラクトフェリン類分
解物とを簡便に結合させる方法を検討する中で、単一の
金属を結合させるよりも複数種の金属を結合させる方が
ラクトフェリン類やラクトフェリン類分解物に多量の金
属を結合させることができることを見出しなされたもの
である。

【０００８】本発明の金属結合ラクトフェリンは、例え
ば、ラクトフェリン類を含む溶液に複数種の金属を含む
溶液を加えて混合することにより調製することができ
る。また、炭酸イオン、重炭酸イオン、又は炭酸イオン
及び重炭酸イオンを含有する溶液、複数種の金属を含む
溶液及びラクトフェリン類を含む溶液を混合することに
より調製することができる。

【０００９】本発明において使用するラクトフェリン類
としては、ヒトやウシ等の哺乳類の乳等の分泌液から分
離されるラクトフェリンを例示することができる。さら
に、血液や臓器等から分離されるトランスフェリンや卵
等から分離されるオボトランスフェリン等もラクトフェ
リンと同様に使用することができる。これらのラクトフ
ェリン類については、既に大量に調製する方法がいくつ
も知られており、どのような方法で調製されたラクトフ
ェリン類であっても良い。また、ラクトフェリン類は完
全に単離されている必要はなく、他の成分が含まれてい
ても構わない。さらに、遺伝子操作により、微生物、動
物細胞、トランスジェニック動物等から生産されたラク
トフェリン類を使用することも可能である。

【００１０】また、本発明の金属結合ラクトフェリン分
解物は、例えば、ラクトフェリン類分解物を含む溶液に
複数種の金属を含む溶液を加えて混合することにより調
製することができ、あるいは、炭酸イオン、重炭酸イオ
ン、又は炭酸イオン及び重炭酸イオンを含有する溶液、
複数種の金属を含む溶液及びラクトフェリン類分解物を
含む溶液を混合することにより調製することができる。
ラクトフェリン類分解物とは、ラクトフェリン類をトリ
プシン、ペプシン、キモトリプシン等の蛋白分解酵素に
より、あるいは、酸やアルカリにより分解したものであ
る。これらは、分子量 1,000以上70,000以下程度の分解
物が好適である。

【００１１】一方、本発明において使用することができ
る金属としては、塩化第二鉄、塩化亜鉛、塩化銅、塩化
マンガン、塩化ニッケル、塩化アルミニウム、塩化コバ
ルト等を使用することができ、また、各種金属の硫酸塩
や燐酸塩等を使用することもできる。そして、添加する
金属量は、ラクトフェリン類1Mに対し、それぞれの金属
イオンが好ましくは3M以上、より好ましくは 15M以上で
あり、上限は500M以下である。添加する金属の一種類の
量が前記した上限を越えると、製造中あるいは保存中に
沈澱が生じたり、完全に結合せずに金属がイオンの状態
で残存したりする。

【００１２】さらに、本発明において使用することがで
きる炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液とし
ては、炭酸水、重炭酸アンモニウム溶液、重炭酸ナトリ
ウム溶液、重炭酸カリウム溶液、炭酸ナトリウム溶液、
炭酸カルシウム溶液等であり、これらの溶液を混合して
使用しても良い。また、これらの溶液には、その他の成
分、例えば、糖質、蛋白質、脂肪等が含まれていても構
わない。

【００１３】調製された金属結合ラクトフェリンや金属
結合ラクトフェリン分解物は、金属に特有の金属臭が無
く、長期間に安定で、しかも耐熱性を有しており、さら
に、金属に起因する酸化作用も抑制されているという性
質を有するので、医薬、飲食品及び飼料等に配合するミ
ネラル補給用素材として有用である。 本発明者らは、
複数種の金属をラクトフェリン類やラクトフェリン類分
解物に同時に結合させることにより、単一の金属を結合
させるよりも多量の金属をラクトフェリン類やラクトフ
ェリン類分解物に結合させることができることを初めて
見出した。

【００１４】以下に試験例を示し、本発明の金属結合ラ
クトフェリン及び金属結合ラクトフェリン分解物の特性
を説明する。

【試験例１】以下の溶液を調製した後、混合して金属結
合ラクトフェリンを製造し、ラクトフェリンに結合する
各金属量を調べた。 （Ａ溶液）1M重炭酸ナトリウムを含む溶液1L （Ｂ１溶液） 100mM各金属塩を含む溶液0.2L 但し、２種の金属を含む溶液の場合は、各金属塩を等量
混合し、金属塩 200mMを含む溶液を調製した。また、３
種の金属を含む溶液の場合は、各金属塩を等量混合し、
金属塩 300mMを含む溶液を調製した。 （Ｂ２溶液）１mMラクトフェリンを含む溶液0.8L

【００１５】まず、Ａ溶液に、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混
合したＢ溶液を加えて撹拌し、各金属が結合したラクト
フェリンを含む溶液を調製した。そして、この溶液300m
l を分子量10,000カットの透析膜で超純水に対して透析
し、結合しなかった金属を除去して完全に脱塩した後、
凍結乾燥し、ラクトフェリンに結合している各金属量を
誘導結合プラズマ発光分光分析器（ＩＣＰ）で測定し
た。その結果を表１に示す。この結果、金属結合ラクト
フェリンをラクトフェリンに対し、90％以上の収率で得
ることができた。

【００１６】

【表１】 ─────────────────────────── 金属塩 金属／ラクトフェリン（モル比） ─────────────────────────── 鉄 101 銅 32 マンガン 9 コバルト 7 ニッケル 8 アルミニウム 1 鉄＋銅 98＋62 鉄＋マンガン 92＋31 鉄＋ニッケル 94＋24 鉄＋アルミニウム 81＋ 8 鉄＋コバルト 87＋12 銅＋亜鉛 67＋31 銅＋マンガン 62＋11 鉄＋銅＋亜鉛 96＋60＋29 ─────────────────────────── 表中、２種の金属塩を用いた場合は、そのモル比は、金
属塩の順に記載した。例えば鉄＋銅の項の98＋62は鉄9
8、銅62の意味である。以下の表も同様である。

【００１７】なお、本試験で使用した金属塩は、鉄が塩
化第二鉄、銅が塩化銅(II)、亜鉛が塩化亜鉛(II)、マン
ガンが塩化マンガン(II)、コバルトが塩化コバルト、ニ
ッケルが塩化ニッケル、アルミニウムが塩化アルミニウ
ムである。なお、使用した各金属塩を300mM 溶解した水
溶液300ml をそれぞれ分子量10,000カットの透析膜で超
純水に対して透析し、１週間脱塩したものを凍結乾燥
し、試料の対照とした。これを同様にＩＣＰで分析した
ところ、これら全ての対照試料は、金属量が透析前の量
の 0.3％以下であり、遊離の金属は透析で全て除去され
ることを確認した。上記の結果より、複数種の金属をラ
クトフェリンと同時に結合させる方が、各金属を単独で
結合させるよりも多量の金属をラクトフェリンと結合さ
せることができることが判った。

【００１８】

【参考例１】50mMリン酸緩衝液(pH 7.5)に溶解したラク
トフェリンに対してトリプシン(TYPEIII、シグマ社製）
１重量％を添加し、37℃で24時間加水分解した。そし
て、さらにトリプシン１重量％を添加し、37℃で24時間
加水分解してラクトフェリンを完全に加水分解した。な
お、この加水分解反応を行うに際し反応液は、除菌フィ
ルターにより除菌して菌の増殖を抑制し、さらに、トル
エン一滴を滴下した状態で反応に供した。次に、分子量
1,000カットの透析膜で透析し、凍結乾燥して、分子量
が主として55,000及び30,000及び10,000からなり、その
他分子量 1,000以上のペプチドからなるラクトフェリン
分解物を得た。

【００１９】

【試験例２】以下の溶液を調製した後、混合して金属結
合ラクトフェリン分解物を製造し、ラクトフェリン分解
物に結合する各金属量を調べた。 （Ａ溶液）1M重炭酸ナトリウムを含む溶液1L （Ｂ１溶液） 100mM各金属塩を含む溶液0.2L 但し、２種の金属を含む溶液の場合は、各金属塩を等量
混合し、金属塩 200mMを含む溶液を調製した。また、３
種の金属を含む溶液の場合は、各金属塩を等量混合し、
金属塩 300mMを含む溶液を調製した。 （Ｂ２溶液）ラクトフェリン換算で13.2μM/L となるよ
うラクトフェリン分解物を水に溶解した溶液0.8L

【００２０】なお、ラクトフェリン分解物は、参考例１
で得られたものを使用した。まず、Ａ溶液に、Ｂ１溶液
とＢ２溶液を混合したＢ溶液を加えて撹拌し、各金属が
結合したラクトフェリン分解物を含む溶液を調製した。
そして、この溶液を４℃で90時間、分子量 1,000カット
の透析膜で超純水に対して透析し、完全に脱塩した後、
凍結乾燥し、ラクトフェリン分解物に結合している各金
属量をＩＣＰで測定した。その結果を表２に示す。な
お、この各金属が結合したラクトフェリン分解物を調製
する操作の過程で沈澱は全く生じなかったが、対照とし
て、ラクトフェリン分解物に代えてトリプシンを使用し
たものについては、沈澱が生じ、異なった挙動を示し
た。

【００２１】

【表２】 ──────────────────────────── 金属塩 金属／ラクトフェリン分解物（モル比） ──────────────────────────── 鉄 101 銅 33 鉄＋銅 93＋75 銅＋亜鉛 66＋35 鉄＋銅＋亜鉛 94＋55＋27 ────────────────────────────

【００２２】なお、本試験で使用した金属塩は、鉄が塩
化第二鉄、銅が塩化銅(II)、亜鉛が塩化亜鉛(II)、マン
ガンが塩化マンガン(II)、コバルトが塩化コバルト、ニ
ッケルが塩化ニッケル、アルミニウムが塩化アルミニウ
ムである。上記の結果より、複数種の金属をラクトフェ
リン分解物と同時に結合させる方が、各金属を単独で結
合させるよりも多量の金属をラクトフェリン分解物と結
合させることができることが判った。

【００２３】

【試験例３】以下の溶液を調製した後、混合して金属結
合ラクトフェリンを製造し、耐熱性を調べた。 （Ａ溶液）1M重炭酸ナトリウムを含む溶液1L （Ｂ１溶液）50mM各金属塩を含む溶液0.2L 但し、２種の金属を含む溶液の場合は、各金属塩を等量
混合し、金属塩 100mMを含む溶液を調製した。また、３
種の金属を含む溶液の場合は、各金属塩を等量混合し、
金属塩 150mMを含む溶液を調製した。 （Ｂ２溶液）１mMラクトフェリンを含む溶液0.8L

【００２４】まず、Ａ溶液に、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混
合したＢ溶液を加えて撹拌し、各金属が結合したラクト
フェリンを含む溶液を調製した。また、Ｂ１溶液とＢ２
溶液を混合したＢ溶液を撹拌し、各金属が結合したラク
トフェリンを含む溶液を調製した。得られた水溶液は分
子量10,000カットの限外濾過膜で0.1mS/cmまで脱塩し
た。そして、これらの金属結合ラクトフェリンを含む溶
液を、0.2M食塩を含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH 7.5)
の模擬緩衝液で希釈して総金属濃度を 3.6mM/Lとし、90
℃で10分間の加熱による沈澱の生成を観察した。その結
果を表３に示す。

【００２５】

【表３】 ────────────────── 金属塩 沈澱の有無 ────────────────── 鉄 無 銅 無 亜鉛 無 マンガン 無 ニッケル 無 アルミニウム 無 鉄＋銅 無 鉄＋ニッケル 無 鉄＋マンガン 無 鉄＋アルミニウム 無 亜鉛＋銅 無 銅＋マンガン 無 鉄＋銅＋亜鉛 無 ──────────────────

【００２６】なお、本試験で使用した金属塩は、鉄が塩
化第二鉄、銅が塩化銅(II)、亜鉛が塩化亜鉛(II)、マン
ガンが塩化マンガン(II)、ニッケルが塩化ニッケル、ア
ルミニウムが塩化アルミニウムである。上記の結果よ
り、複数種の金属が結合したラクトフェリンも耐熱性を
有することが判った。

【００２７】

【試験例４】試験例１と同様の方法により、ラクトフェ
リン１分子当たり、鉄96分子、銅60分子及び亜鉛29分子
が結合した金属結合ラクトフェリンを調製し、魚油に対
する酸化安定性を調べた。また、対照として、上記の金
属結合ラクトフェリンと同様のモル比を有する塩化第二
鉄、塩化銅(II)及び塩化亜鉛(II)の混合物を調製し、魚
油に対する酸化安定性を調べた。なお、各試料の組成は
以下に示す通りであり、金属結合ラクトフェリン又は金
属塩混合物をウルトラディスパーサー (ヤマト社製) で
魚油に分散させた。 試料１：魚油 6,000mg 試料２：魚油 6,000mg＋金属結合ラクトフェリン20nM 試料３：魚油 6,000mg＋金属結合ラクトフェリン200nM 試料４：魚油 6,000mg＋金属結合ラクトフェリン2,000n
M 試料５：魚油 6,000mg＋金属塩混合物（鉄 1.9μM,銅
1.2μM,亜鉛0.58μM) 試料６：魚油 6,000mg＋金属塩混合物（鉄19μM,銅12μ
M,亜鉛 5.8μM) 試料７：魚油 6,000mg＋金属塩混合物（鉄 190μM,銅 1
20μM,亜鉛58μM) なお、試料５は試料２に相当する金属量であり、試料６
は試料３に相当する金属量であり、試料７は試料４に相
当する金属量である。そして、各試料の自動酸化に対す
る安定性については、基準油脂分析試験法のＣＤＭ試験
(基準油脂分析試験法 Cd2.4.28.2-93) に従って行い、
測定温度80℃でランシマット装置 (メトローム社製) に
よりＣＤＭ試験で定義される酸化誘導期の長さを測定し
て評価した。その結果を表４に示す（酸化誘導期が長け
れば長い程、酸化安定性は高い）。

【００２８】

【表４】 ──────────── 試料 酸化誘導期 ──────────── 1 5.2(時間) 2 5.1 3 5.3 4 5.4 5 ＜0.1 6 ＜0.1 7 ＜0.1 ────────────

【００２９】金属塩混合物を添加した魚油では、測定開
始直後から激しい劣化が認められたが、金属結合ラクト
フェリンを添加した魚油では、金属無添加の魚油と酸化
誘導期は変わらなかった。したがって、金属結合ラクト
フェリンとして魚油に金属を添加することにより、金属
による魚油の劣化を完全に抑制することができることが
判った。また、同様にして調製した試料について、40℃
でオーブン保存試験を行い、経時的にサンプリングして
過酸化物価（ＰＯＶ）を測定したが、ランシマット試験
と同様の傾向が見られた。

【００３０】

【試験例５】試験例１と同様の方法により、ラクトフェ
リン１分子当たり、鉄98分子及び銅62分子が結合した金
属結合ラクトフェリンを調製し、大豆油に対する酸化安
定性を調べた。また、対照として、上記の金属結合ラク
トフェリンと同様のモル比を有する塩化第二鉄及び塩化
銅(II)の混合物を調製し、大豆油に対する酸化安定性を
調べた。なお、各試料の組成は以下に示す通りであり、
金属結合ラクトフェリン又は金属塩混合物をウルトラデ
ィスパーサー（ヤマト社製）で大豆油に分散させた。 試料１：大豆油 6,000mg 試料２：大豆油 6,000mg＋金属結合ラクトフェリン20nM 試料３：大豆油 6,000mg＋金属結合ラクトフェリン200n
M 試料４：大豆油 6,000mg＋金属結合ラクトフェリン2,00
0nM 試料５：大豆油 6,000mg＋金属塩混合物（鉄 2μM,銅
1.2μM) 試料６：大豆油 6,000mg＋金属塩混合物（鉄20μM,銅12
μM) 試料７：大豆油 6,000mg＋金属塩混合物（鉄 200μM,銅
120μM) なお、試料５は試料２に相当する金属量であり、試料６
は試料３に相当する金属量であり、試料７は試料４に相
当する金属量である。そして、各試料の自動酸化に対す
る安定性については、基準油脂分析試験法のＣＤＭ試験
(基準油脂分析試験法 Cd2.4.28.2-93) に従って行い、
測定温度 120℃でランシマット装置 (メトローム社製)
によりＣＤＭ試験で定義される酸化誘導期の長さを測定
して評価した。その結果を表５に示す。

【００３１】

【表５】 ──────────── 試料 酸化誘導期 ──────────── 1 4.9(時間) 2 5.2 3 5.1 4 4.8 5 ＜0.1 6 ＜0.1 7 ＜0.1 ────────────

【００３２】金属塩混合物を添加した大豆油では、測定
開始直後から激しい劣化が認められたが、金属結合ラク
トフェリンを添加した大豆油では、金属無添加の大豆油
と酸化誘導期は変わらなかった。したがって、金属結合
ラクトフェリンとして大豆油に金属を添加することによ
り、金属による大豆油の劣化を完全に抑制することがで
きることが判った。また、同様にして調製した試料につ
いて、40℃でオーブン保存試験を行い、経時的にサンプ
リングしてＰＯＶを測定したが、ランシマット試験と同
様の傾向が見られた。

【００３３】

【発明の実施の形態】本発明の金属結合ラクトフェリン
は、複数種の金属を含む溶液及びラクトフェリン類を含
む溶液を混合することにより得られ、あるいは、炭酸、
重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含む溶液、複数種の金属
を含む溶液及びラクトフェリン類を含む溶液を混合する
ことにより得ることができる。また、本発明の金属結合
ラクトフェリン分解物は、複数種の金属を含む溶液及び
ラクトフェリン類分解物を含む溶液を混合することによ
り得られ、あるいは、炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭
酸を含む溶液、複数種の金属を含む溶液及びラクトフェ
リン類分解物を含む溶液を混合することにより得ること
ができる。なお、本発明の金属結合ラクトフェリン及び
金属結合ラクトフェリン分解物は熱に安定であるので、
これらの粉末を大量に製造する場合は噴霧乾燥を行うと
良い。

【００３４】本発明の金属結合ラクトフェリンや金属結
合ラクトフェリン分解物を飲食品や飼料に配合するに際
しては、配合量等に特に制限はなく、物理的に可能な量
を配合することができる。また、本発明の金属結合ラク
トフェリンや金属結合ラクトフェリン分解物は、油脂を
含む食品１kgに対し50〜300g程度配合してもこの食品の
劣化は見られないので、油脂や油脂を含む飲食品、飼料
等に直接配合しても問題はない。したがって、大豆油、
菜種油、綿実油、ゴマ油、サフラワー油、オリーブ油、
トウモロコシ油等の植物油や魚油、乳脂、豚脂等の動物
油等、さらにはビタミンＡ、ビタミンＥ、ビタミンＤ等
の脂溶性ビタミン等の酸化され易い物質に直接配合する
ことも可能である。そして、本発明の金属結合ラクトフ
ェリンや金属結合ラクトフェリン分解物を配合した飲食
品や飼料を製造するに際しては、加熱殺菌や滅菌を行う
ことが可能である。また、医薬として用いる場合は、金
属結合ラクトフェリンや金属結合ラクトフェリン分解物
自体を粉末または溶液の形にして用いてもよいが、通常
は、医薬の配合剤として知られている補助剤、ビタミ
ン、その他の栄養補給成分等と混合し、粉剤、顆粒剤、
錠剤、カプセル剤あるいは液剤として用いられる。な
お、金属にはそれ自体に過剰症が存在するので、過剰摂
取の状況を避けるよう栄養学的見地から適性な配合量を
決定する必要がある。

【００３５】以下に実施例を示し、本発明を詳しく説明
する。

【実施例１】200μM ウシラクトフェリン(DMV社製) 溶
液（Ａ溶液)10Lと10mM塩化第二鉄、10mM塩化銅(II)及び
10mM塩化亜鉛(II)を含む溶液（Ｂ溶液)10Lを調製した
後、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌、混合した。そして、
この混合溶液をさらに1M炭酸水素ナトリウム水溶液20L
に混合し、分子量50,000カットの限外濾過膜で脱塩及び
濃縮し、噴霧乾燥して、鉄、銅及び亜鉛を結合した金属
結合ラクトフェリン172gを製造した。得られた金属結合
ラクトフェリンは、ラクトフェリン１μM あたり鉄50μ
M 、銅50μM 及び亜鉛50μM が結合していた。この金属
結合ラクトフェリンについて、総金属濃度が５mg/100ml
となるよう希釈し官能評価試験を実施したところ、金属
味を感じたパネラーは10名中１名もいなかった。

【００３６】

【実施例２】1.2M重炭酸ナトリウムと10μM ウシラクト
フェリン(DMV社製) を含む溶液（Ａ溶液）1Lと 1.0mM塩
化第二鉄及び 0.5mM塩化銅(II)を含む溶液（Ｂ溶液）1L
を調製した後、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌、混合し
た。そして、この混合溶液を分子量 5,000カットの限外
濾過膜で脱塩、濃縮して鉄及び銅を結合した金属結合ラ
クトフェリンを含む溶液を製造した。得られた金属結合
ラクトフェリンは、ラクトフェリン１μM あたり鉄99μ
M 及び銅49μM が結合していた。この金属結合ラクトフ
ェリンを含む溶液について、総金属濃度が10mg/100mlと
なるよう0.2M食塩を含む50mMトリス−塩酸緩衝液(pH 8.
0)で希釈した。そして、ネジ口付き試験管に密封して90
℃で10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、室温で１
ヶ月保存して沈澱の有無を肉眼で判定したところ、沈澱
は全く認められなかった。また、官能評価試験を実施し
たところ、金属味を感じたパネラーは10名中１名もいな
かった。

【００３７】

【実施例３】1.2M重炭酸ナトリウムと10μM ウシラクト
フェリン(DMV社製) を含む溶液（Ａ溶液）1Lと 5.0mM塩
化第二鉄及び 1.0mM塩化銅(II)を含む溶液（Ｂ溶液）1L
を調製した後、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌、混合し
た。そして、この混合溶液を分子量 5,000カットの限外
濾過膜で脱塩、濃縮して鉄及び銅を結合した金属結合ラ
クトフェリンを含む溶液を製造した。この金属結合ラク
トフェリンを含む溶液について、総金属濃度が10mg/100
mlとなるよう0.2M食塩を含む50mMトリス−塩酸緩衝液(p
H 8.0)で希釈した。そして、ネジ口付き試験管に密封し
て90℃で10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、室温
で１ヶ月保存して沈澱の有無を肉眼で判定したところ、
沈澱は全く認められなかった。また、官能評価試験を実
施したところ、金属味を感じたパネラーは10名中１名も
いなかった。なお、この金属結合ラクトフェリンを含む
溶液を分子量10,000カットの透析膜で超純水に対して透
析し、完全に脱塩した後、凍結乾燥し、ラクトフェリン
に結合している各金属量をＩＣＰで測定したところ、ラ
クトフェリン１分子当たり、鉄 382分子及び銅70分子が
結合していることが判った。

【００３８】

【実施例４】1.0mM硫酸銅及び 0.2mM塩化亜鉛(II)を含
む溶液（Ａ溶液）0.2Lと50μM トランスフェリン（アポ
型、和光純薬工業製）を含む溶液（Ｂ溶液）0.8Lを調製
した後、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌、混合した。そし
て、この混合溶液を分子量 5,000カットの限外濾過膜で
脱塩、濃縮して銅及び亜鉛を結合した金属結合トランス
フェリンを含む溶液を製造した。得られた金属結合ラク
トフェリンは、ラクトフェリン１μM あたり鉄70μM 及
び亜鉛18μM が結合していた。この金属結合トランスフ
ェリンを含む溶液について、総金属濃度が10mg/100mlと
なるよう0.2M食塩を含むイミダゾール緩衝液(pH 6.8)で
希釈した。そして、ネジ口付き試験管に密封して90℃で
10分間加熱し、室温まで自然冷却した後、37℃で１ケ月
保存して沈澱の有無を肉眼で判定したところ、沈澱は全
く認められなかった。

【００３９】

【実施例５】0.5M炭酸ナトリウム及び0.7M重炭酸カリウ
ムを含む溶液1Lを酢酸でpH 8.3に調整した溶液（Ａ溶
液）、 1.0mM塩化第二鉄及び 0.5mM塩化アルミニウムを
含む溶液（Ｂ１溶液）0.2L、 0.01N塩酸溶液中でペプシ
ン (シグマ社製) によりオボトランスフェリン（タイプ
IV、シグマ社製）を37℃で１時間加水分解したオボトラ
ンスフェリン分解物800mg(トランスフェリン換算で10μ
M 相当) を含む溶液（Ｂ２溶液）0.8Lを調製した後、ま
ず、Ｂ１溶液とＢ２溶液を混合してＢ溶液を調製し、さ
らに、Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌、混合した。そし
て、この混合溶液を分子量 1,000カットの透析膜で脱塩
して鉄及びアルミニウムを結合した金属結合トランスフ
ェリン分解物を含む溶液を製造した。この金属結合トラ
ンスフェリン分解物を含む溶液について、総金属濃度が
30mg/200mlとなるよう50mMリン酸緩衝液(pH 7.0)で希釈
した。そして、ネジ口付き試験管に密封して90℃で10分
間加熱し、室温まで自然冷却した後、37℃で１ヶ月保存
して沈澱の有無を肉眼で判定したところ、沈澱は全く認
められなかった。なお、この金属結合トランスフェリン
分解物を含む溶液を分子量10,000カットの透析膜で超純
水に対して透析し、完全に脱塩した後、凍結乾燥し、オ
ボトランスフェリン分解物に結合している各金属量をＩ
ＣＰで測定したところ、オボトランスフェリン分解物１
mg当たり、鉄0.05mg及びアルミニウム 0.002mgが結合し
ていることが判った。

【００４０】

【実施例６】実施例２で得られた鉄及び銅を結合した金
属結合ラクトフェリンを含む溶液20L を鉄濃度が５mg/2
00ml及び銅濃度が３mg/200mlとなるよう生乳に添加して
均質化した後、 150℃で２秒間滅菌し、直ちに４℃に冷
却して無菌的に 250ml容紙容器に充填した。そして、37
℃で３ヶ月保存した後、遠心分離して沈澱物の有無を調
べたが、沈澱は全く認められなかった。また、大腸菌数
及び一般細菌数共に０であった。さらに、生乳を同様の
条件で殺菌し保存したものを対照として官能評価試験を
実施したところ、金属味や味及び香り等に異常を感じた
パネラーは10名中１名もいなかった。

【００４１】

【実施例７】参考例１に示した方法に従い、ウシラクト
フェリン分解物を調製した。一方、1.3M重炭酸ナトリウ
ムを含む溶液（Ａ溶液）1L、 0.9mM塩化第二鉄及び0.6m
M塩化マンガンを含む溶液（Ｂ１溶液）0.2L、ラクトフ
ェリン換算で10μM相当の上記ウシラクトフェリン分解
物を含む溶液（Ｂ２溶液）0.8Lを調製した後、まず、Ｂ
１溶液とＢ２溶液を混合してＢ溶液を調製し、さらに、
Ａ溶液にＢ溶液を加えて撹拌、混合して鉄及びマンガン
を結合した金属結合ラクトフェリン分解物を含む溶液を
製造した。この金属結合ラクトフェリン分解物を含む溶
液をネジ口付き試験管に密封して90℃で10分間加熱し、
室温まで自然冷却した後、37℃で１ヶ月保存して沈澱の
有無を肉眼で判定したところ、沈澱は全く認められなか
った。また、官能評価試験を実施したところ、金属味を
感じたパネラーは10名中１名もいなかった。

【００４２】

【実施例８】ウシラクトフェリン500g、塩化第二鉄６水
和物250g及び硫酸銅 50gを水50L に溶解した溶液に、重
炭酸ナトリウム 25gを撹拌しながら加え混合した。そし
て、この混合溶液を分子量 5,000カットの限外濾過膜で
脱塩及び濃縮し、噴霧乾燥して鉄及び銅を結合した金属
結合ラクトフェリン410gを製造した。この金属結合ラク
トフェリン410gを55℃に加熱して溶解した純製ラード20
kgに加え、ホモミキサーで激しく撹拌して分散化処理を
行い、鉄及び銅を強化したラードを製造した。

【００４３】

【実施例９】実施例２と同様にして得られた鉄及び銅を
結合した金属結合ラクトフェリンの凍結乾燥粉末を使用
し、以下の配合のビタミンＥを含有する 150mgカプセル
を打ち抜き法により製造した。 配合比（％） カプセル用溶液 ゼラチン 45 グリセリン 22 水 33 原料組成 ビタミンＥ 35 (200IU) 金属結合ラクトフェリン 20 小麦胚芽油 40 乳化剤 5 このカプセル剤は、健康食品として用いられる。なお、
このカプセル剤について、37℃で３ヶ月保存して官能評
価試験を実施したが、油脂の異臭及び金属味を感じたパ
ネラーは10名中１名もいなかった。

【００４４】

【実施例１０】実施例２と同様にして得られた鉄及び銅
を結合した金属結合ラクトフェリンの凍結乾燥粉末を使
用し、以下の配合のマーガリンを製造した。 配合比（％） 大豆硬化油（融点42℃） 10 大豆白絞油 40 パーム油 25 グリセリン脂肪酸エステル (ヨウ素価60) 0.5 脱脂粉乳 1 金属結合ラクトフェリン 0.5 乳酸 0.1 水 22.9

【００４５】また、比較例として、金属結合ラクトフェ
リンに代えて塩化第二鉄・６水和物及び塩化銅（１１）
・２水和物を使用し、以下の配合のマーガリンを製造し
た。 配合比（％） 大豆硬化油（融点４２℃） １０ 大豆白絞油 ４０ パーム油 ２５ グリセリン脂肪酸エステル（ヨウ素価６０） ０．５ 脱脂粉乳 １ 塩化第二鉄・６水和物 ０．２ 塩化銅（１１）・２水和物 ０．１５ 乳酸 ０．１ 水 ２３．０５

【００４６】さらに、対照として、以下の配合のマーガ
リンを製造した。 配合比（％） 大豆硬化油（融点42℃） 10 大豆白絞油 40 パーム油 25 グリセリン脂肪酸エステル (ヨウ素価60) 0.5 脱脂粉乳 1 乳酸 0.1 水 23.4 そして、これらのマーガリンについて、製造直後及び15
℃で６ヶ月保存後のＰＯＶを測定した。その結果を表６
に示す。

【００４７】

【表６】 上記の結果より、金属結合ラクトフェリンを使用すると
金属によるマーガリンの劣化が完全に抑制されることが
判った。

【００４８】

【実施例１１】乳清蛋白濃縮物（ＷＰＣ）890g及び乳糖
5.2kgを温湯60kgで溶解した後、牛乳7.5kg及びカゼイ
ン400gを加え、さらに、水溶性ビタミン類 (ビタミンＢ
₁ 、ビタミンＢ₂ 、ビタミンＢ₆ 、ビタミンＢ₁₂、ビタ
ミンＣ、パントテン酸、ナイアシン、葉酸、ビオチン、
コリン、イノシトール) 75g 及び鉄、銅、亜鉛以外のミ
ネラル類 (炭酸カルシウム、塩化カリウム、硫酸マグネ
シウム) 75g を加えて溶解した。次に、この溶液に実施
例１と同様にして得られた鉄、銅及び亜鉛を結合した金
属結合ラクトフェリン 10.3gを加えて溶解した。そし
て、脂溶性ビタミン類 (ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタ
ミンＥ、ビタミンＫ、βカロチン) を溶解、混合した調
製脂肪 2.5kgを加えて混合した後、殺菌し、濃縮及び噴
霧乾燥して乳児用調製粉乳10kgを製造した。そして、こ
の乳児用調製粉乳について官能評価試験を実施したとこ
ろ、金属味を感じたパネラーは10名中１名もいなかっ
た。また、この乳児用調製粉乳については、ＰＯＶの上
昇も見られず安定した品質の製品であることが判った。
なお、この乳児用調製粉乳は、100g当たり鉄６mg、銅0.
31μg 及び亜鉛 2.6mgが含まれており、特殊栄養食品の
規格やＦＡＯ／ＷＨＯをはじめとする各種の勧告値や推
奨値を満足するものであった。

【００４９】

【実施例１２】実施例２と同様にして得られた鉄及び銅
を結合した金属結合ラクトフェリン２kg、大豆粕 120k
g、脱脂粉乳 140kg、大豆油40kg、コーン油20kg、パー
ム油 280kg、トウモロコシ澱粉 148kg、小麦粉90kg、フ
スマ20kg、ビタミン混合物90kg、セルロース30kg、鉄及
び銅を除くミネラル混合物20kgを配合し、イヌ飼育用飼
料1,000kgを製造した。

【００５０】

【発明の効果】本発明の金属結合ラクトフェリン及び金
属結合ラクトフェリン分解物は、一種の金属を結合させ
た金属結合ラクトフェリンまたは金属結合ラクトフェリ
ン分解物にくらべて多量の金属を含有せしめることがで
き、しかも複数種の金属が多量に結合しているにも拘わ
らず、金属味が発現せず、また、金属に起因する酸化作
用も抑制されているので、金属を強化する目的で医薬、
飲食品、飼料等に配合することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｐ 3/02 Ａ６１Ｋ 37/14 (72)発明者 浜下 一正 埼玉県川越市南大塚２−11−４ 南台ハ イツ401 (72)発明者 富澤 章 埼玉県入間市豊岡５−３−33 アーデン 710 (72)発明者 相川 均 埼玉県東松山市五領町12−89 パークタ ウン五領５−503 (72)発明者 高橋 健 埼玉県所沢市松葉町25−19 メゾン松葉 302 (56)参考文献 Ｍｉｌｃｈｗｉｓｓｅｎｓｃｈａｆ ｔ，Ｖｏｌ．45，Ｎｏ．４（1990）ｐ. 225−229 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/79 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＪＡＦＩＣファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトフェリン類またはその分解物に複
   数種の金属が結合した金属結合ラクトフェリンまたは金
   属結合ラクトフェリン分解物。
2. 【請求項２】 ラクトフェリン類またはその分解物１分
   子に複数種の金属がそれぞれ３〜 500分子結合した金属
   結合ラクトフェリンまたは金属結合ラクトフェリン分解
   物。
3. 【請求項３】 複数種の金属を含む溶液及びラクトフェ
   リン類またはその分解物を含む溶液を混合することによ
   り得られる請求項１又は２に記載の金属結合ラクトフェ
   リンまたは金属結合ラクトフェリン分解物。
4. 【請求項４】 炭酸、重炭酸、又は炭酸及び重炭酸を含
   む溶液、複数種の金属を含む溶液及びラクトフェリン類
   又はその分解物を含む溶液を混合することにより得られ
   る請求項１又は２に記載の金属結合ラクトフェリンまた
   は金属結合ラクトフェリン分解物。
5. 【請求項５】 複数種の金属が、生体の生理作用をつか
   さどる微量元素である請求項１〜４のいずれかに記載の
   金属結合ラクトフェリンまたは金属結合ラクトフェリン
   分解物。
6. 【請求項６】 複数種の微量元素が、鉄、銅、亜鉛、マ
   ンガン、コバルト、ニッケル及びアルミニウムのなかか
   ら選択される２種以上のミネラルである請求項５に記載
   の金属結合ラクトフェリンまたは金属結合ラクトフェリ
   ン分解物。
7. 【請求項７】 請求項１〜６のいずれかに記載の金属結
   合ラクトフェリンまたは金属結合ラクトフェリン分解物
   を配合したミネラル補給用医薬、飲食品又は飼料。