JP3210342B2 - 全合成親和性試薬 - Google Patents

全合成親和性試薬

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Description

【発明の詳細な説明】 1.発明の利用分野 本発明は、一般に、選択したリガンドに対する結合特
異性及び所望の親和性を有するタンパク質、ポリペプチ
ド及び／又はペプチド指定全合成親和性試薬（Totally
Synthetic Affinity Reagents:TSARs）のための大型タ
ンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドライブラリ
ーを作製及びスクリーニングするための方法に関する。
本発明はさらに、本発明の方法にしたがって同定される
新規のTSARs、並びに同一結合特異性を有する結合ドメ
イン又はその一部を包含する組成物に関する。
2.発明の背景 ランダムペプチドライブラリーの構築のためには２つ
の異なるアプローチがある。第一のアプローチによれ
ば、ペプチドは幾つかのフォーマットでin vitroで化学
的に合成された。例えば、Fodor,S.,et al.,1991,Scien
ce 251:767−773は、個々の顕微鏡スライド上に短鎖ペ
プチドの公知の列を合成するための複雑な手段、光化学
及びコンピューター処理在庫管理の使用を記載する。Ho
ughten,R.,et al.,1991,Nature 354:84−86は、各ペプ
チド中の一次及び二次残基が別々に且つ特異的に限定さ
れる遊離ヘキサペプチドの混合物を記載する。Lam,K.,e
t al.,1991,Nature 354:82−84は、コレクション中の各
ビーズがその上にアミノ酸残基の単一無作為配列を固定
したペプチドのライブラリーを固相スプリット合成計画
が産生した“一ビーズ一ペプチド”アプローチを記載す
る。殆どの部分に関しては、化学合成系は、一般に約10
アミノ酸より小さい、特に約６−８アミノ酸の短鎖ペプ
チドの列の生成に充てられた。直接アミノ酸シーケンシ
ングは、単独で又はペプチド合成計画の複合記録保持と
組み合わせて必要とされる。組換え体DNA法を用いる第
二のアプローチによれば、ペプチドは可溶性融合タンパ
ク質又はウイルスキャプシド融合タンパク質としてin v
ivoに発現された。第二のアプローチを以下に簡単に考
察する。
第二のアプローチによる多数のペプチドライブラリー
は、M13ファージを用いた。M13は、過去20年間分子生物
学実験室における馬車馬的存在であった線状バクテリオ
ファージである。ウイルス粒子は、一本鎖環状DNA分子
として、６つの異なるキャプシドタンパク質及びウイル
スゲノムの１つのコピーで構成される。M13 DNAが大腸
菌E.coliのような宿主細胞中に一旦導入されると、それ
は二本鎖環状DNAに変換される。ウイルスDNAは、ウイル
ス粒子中に見出される一本鎖DNAを生成するのに用いら
れる複製の二次オリジンを保有する。ウイルスの形態形
成中、一本鎖DNA及びウイルスタンパク質の整然とした
集合が認められ、ウイルス粒子はだいたい分泌のような
工程で細胞から押し出される。M13ウイルスは他のバク
テリオファージ（例えばλ）のように溶原性でも溶解性
でもない；細胞は、一旦感染を受けると、慢性的にウイ
ルスを放出する。この特徴により、感染培養におけるウ
イルスの高力価、即ち1012pfu/mlが達成される。
M13ファージのゲノムは、〜8000ヌクレオチドの長さ
であり、完全にシーケンシングされた。ウイルスキャプ
シドタンパク質、即ちタンパク質III（p III）は細菌の
感染に関与する。大腸菌では、Ｆ因子にコードされるピ
リジンpillinタンパク質はp IIIタンパク質と相互作用
し、ファージ取込みに関与する。したがってM13ウイル
スに対する大腸菌宿主はすべて、それらがＦ因子を保有
するために雄性であると考えられる。数人の研究者は、
406アミノ酸長鎖p IIIキャプシドタンパク質が２つのド
メインを有するということを特然変異分析から確定し
た。Ｃ末端はタンパク質をウイルス被膜とをつなぎ止
め、一方p IIIのＮ末端の部分は大腸菌ピリンpillinタ
ンパク質との相互作用に不可欠である（Crissaman,J.W.
and Smith,O.P.,1984,Virology 132:445−455）。p III
タンパク質のＮ末端はウイルス感染に必要であることが
示されているが、しかし成熟タンパク質の最Ｎ末端は変
化を耐容する。1985年、George Smithはウイルス被膜表
面に異種タンパク質を発現するための実験系としてバク
テリオファージM13のp IIIタンパク質の使用を報告する
実験を発表した（Smith,G.P.,1985,Science 228:1315−
1317）。M13ファージp III遺伝子表示系は抗体エピトー
プをマッピングするのに有用なものであることが、２つ
のグループによって、後に別々に認識された。De la Cr
uz,V.,et al.,（1988,J.Biol.Chem.263:4318−4322）
は、Plasmodium falciparum表面被膜タンパク質を遺伝
子III中にクローン化し、発現して、ポリクローナル抗
体との免疫反応性に関して組換え体ファージを試験し
た。Parmley,S.F.及びSmith,G.P.（1988,Gene 73:305−
318）は、遺伝子IIIにおいて大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子のセグメントをクローン化し、発現して、抗β
−ガラクトシダーゼモノクローナル抗体のエピトープを
保有する組換え体を同定した。後者の著者はさらに、組
換え体ファージの混合物をビオチニル化モノクローナル
抗体とともにインキュベートして、ファージ−抗体複合
体をストレプタビジ−被覆プラスチックプレートで特異
的に回収する“バイオパニングbiopanning"と呼ばれる
工程を記載した。
1989年、Parmley,S.F.とSmith,G.P.,（1989,Adv.Exp.
Med.Biol.251:251−218）は、p III遺伝子中にクローン
化された短鎖合成DNAセグメントがエピトープのライブ
ラリーを示すことを示唆した。これらの著者は、直鎖エ
ピトープはしばしば長さが〜６アミノ酸であるために、
考えうるすべてのヘキサペプチドを発現するための無作
為組換え体DNAライブラリーを用いて抗体と結合するエ
ピトープを単離し得ると推論した。
ScottとSmith（Scott,J.K.and Smith,G.P.,1990,Scie
nce 249:386−390）は、M13の表面におけるヘキサペプ
チドの“エピトープライブラリー”の構築及び発現を記
載する。33塩基対Bgl I消化オリゴヌクレオチド配列をS
fi I消化ファージfd−tet、即ちf USE5 RF中に挿入し
て、ライブラリーを作った。33塩基対断片は、無作為又
は“縮退”コード配列（NNK）６（ここでＮはＧ、Ａ、
Ｔ及びＣを表し、ＫはＧ及びＴを表す）を含有する。著
者は、ライブラリーが4 x 107個の異なるヘキサペプチ
ドを発現する2 x 108個の組換え体から成る；論理的
に、このライブラリーは6.4 x 107個の考え得るペプチ
ドの69％を発現した（206）、いうことを述べた。Cwirl
a等（Cwirla,S.E.,et al.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 87:6378−6382）もM13 fdファージの遺伝子p III融合
体として発現されるヘキサペプチドの多少似ているライ
ブラリーを記載した。1991年12月26日にDowerとCwirla
が発表したWQ91/19818は、五量体〜八量体無作為アミノ
酸配列の同様のライブラリーを記載する。
Devlin et al.,1990,Science,249:404−406は、オリ
ゴヌクレオチド合成のための（NNS）コード計画（ここ
でＳはＧ又はＣである）を用いて生成される約15残基の
ペプチドライブラリーを記載する。
Christian等は、デカペプチドを発現するファージ表
示ライブラリーを記載した（Christian,R.B.,et al.,19
92,J.Mol.Biol.227:711−718）。自己相補的３′末端を
有する縮退コドン〔NN（G/T）〕10を包含するオリゴヌ
クレオチドにより出発DNAを生成した。この配列は、ヘ
アピンを形成する際には、相補的鎖を生成するためにT4
DNAポリメラーゼにより用いられる自己プライミング複
製部位を生じる。ScottとSmith（上記）が記載したfUSE
5ベクター中にクローニングするために、５′末端及び
ヘアピンのSfi I部位で二本鎖DNAを切断した。
他の研究者は、ファージ粒子の表面における非ウイル
スDNAの発現のために他のウイルスキャプシドタンパク
質を用いた。タンパク質p IIIは主なウイルスキャプシ
ドタンパク質であって、そのＣ末端でM13ウイルス粒子
の一本鎖DNAと相互作用する。それは50アミノ酸長であ
り、約2,700コピー／粒子で存在する。タンパク質のＮ
末端は露呈され、挿入を耐容するが、しかし大型挿入物
はウイルス粒子中への融合p IIIタンパク質の集合を乱
すことが報告されている（Cesareni,G.,1992,FEBS Let
t.307:66−70）。p III融合タンパク質の負の作用を最
小限にするために、ファージミド系が用いられた。ファ
ージミドを保有する細菌細胞はヘルパーファージに感染
されて、野性型と融合p VIIIキャプシド分子の混合物を
有するウイルス粒子を分泌する。遺伝子VIIIは、M13ウ
イルス粒子の表面にペプチドを発現するための部位とし
ても役立った。Plasmodium falciparum主表面抗原の異
なるセグメントに対応する４及び６アミノ酸配列を線状
バクテリオファージfdの匹敵する遺伝子中にクローン化
し、発現させた（Greenwood,J.,et al.,1991,J.Mol.Bio
l.220:821−827）。
Lenstra（1992,J.Immunol.Meth.152:149−157）は、
細菌発現ベクター中のβガラクトシダーゼタンパク質と
の融合タンパク質として無作為ヘキサ又はオクタペプチ
ドを発現するためのそれらの３′末端の８ヌクレオチド
長回文配列を有する約17又23縮退塩基のオリゴヌクレオ
チドをアニーリングすることを包含する困難な工程によ
るライブラリーの構築を記載する。次にクレノウKlenow
DANポリメラーゼでDNAを二本鎖形態に変換し、ベクタ
ー中に盲端結紮して、Hind III断片として放出した。次
にこれらの断片を截断βガラクトシダーゼのＣ末端で発
現ベクター中にクローン化して、107組換え体を生成し
た。次にコロニーを溶解して、ニトロセルロースフィル
ター上にブロッティングして（104/フィルター）、いく
つかの異なるモノクローナル抗体との免疫反応性に関し
てスクリーニングした。何度もスクリーニングして多数
のクローンを単離し、シーケンシングした。
選択されたリガンドに対する結合親和性を有するペプ
チドを同定するための使用が示唆されたペプチドのライ
ブラリーを生成するための上記の方法とは全く異なっ
て、オリゴヌクレオチドの合成及びアッセンブリーのた
めの本発明の計画は、以前のいかなる慣用的ライブラリ
ーよりもサイズの大きい、即ち長さの長い予測されない
アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を産生す
る。
挿入オリゴヌクレオチドの長さは好ましくは15未満、
最も好ましくは約６〜８アミノ酸をコードする短さを維
持すべきであるという当業界での慣用的教示とは全く反
対に、本発明人は、約22より大きなアミノ酸をコードす
るライブラリーが構築され得るのみならず、TSAR又はタ
ンパク質、ポリペプチド及び／又は種々のリガンドに対
する結合特異性を有するタンパク質を同定するためにこ
のようなライブラリーが有益にスクリーニングされ得る
ということを見出した。
さらに、より長さの長い本発明のライブラリーの挿入
合成オリゴヌクレオチドは、可能性のある結合タンパク
質／ペプチドにおける、並びにペプチドの結合ドメイン
の実際の結合部分の側面に位置する配列における二次及
び／又は三次構造の開発の機会を提供する。このような
複雑な構造的特徴は、短鎖長オリゴヌクレオチドを用い
る場合にのみ、実行可能である。
当業界で理解されているように、ペプチドライブラリ
ーにより発現去れるオリゴヌクレオチドにおけるTAG
（停止）コドン頻度を低減する必要がある。当業者は、
サプレッサーtDNA遺伝子を保有する宿主を用いてこの問
題を解決することを予期し得る。しかしながら、慣用的
教示に対比して、本発明者は意外にも、無作為ペプチド
をコードするオリゴヌクレオチドのTAG停止コドン発現
を回避するには抑制は100％有効であるわけではないこ
とを発見した。無作為ペプチドをコードする長鎖のオリ
ゴヌクレオチドを発現する場合、この問題は非常に重大
になる。本発明は、有用なライブラリーの生成に及ぼす
このような問題の負の影響を有効に且つ効率よく最小限
にする。
本出願の第二項におけるあらゆる参考文献の引用又は
確認は、このような参考文献が本発明に対する従来技術
として有用であるということの承認と解釈されるもので
はない。
3.発明の概要 本発明は、選択されたリガンドと結合するTSARと呼ば
れるタンパク質／ポリペプチド及び／又はペプチドを同
定するための方法及び組成物、即ちライブラリーを提供
する。本発明で用いる場合、TSARは、少なくとも２つの
異なる機械的領域を含む鎖状体化異種機能性タンパク
質、ポリペプチド及び／又はペプチドを包含するよう意
図される。異種機能性TSAR分子の一領域はリガンドに対
する及和性を有する結合ドメインであって、１）特異的
条件下でその結合強度、２）特異的条件下でのその結合
安定性、及び３）選択配位子に対するその選択特異性を
特徴とする。異種機能性TSAR分子の第二の領域は、生物
学的又は化学的に活性で、発現及び／又は検出及び／又
はTSARsの精製を増強するエフェクタードメインであ
る。
本発明の一態様によれば、TSARは任意の別のリンカー
ドメイン又は結合ドメインとフェクタードメインとの間
の領域を含有する。リンカー領域は、（１）結合及びエ
フェクタードメイン間の構造的スペーサー領域として、
（２）結合及びエフェクタードメインを連結を解く又は
分離するための助けとして、あるいは（３）発現ベクタ
ーによる結合ドメイン及び／又はTSARの表示のための構
造的助けとして役立つ。
本発明はさらに、新規のTSAR試薬、及び選択されたリ
ガンドに対する特異性を全て有するTSARの結合ドメイン
又はその一部を包含する組成物、並びにTSAR及びTSARの
結合ドメイン又はTSAR結合ドメインの結合特異性を保持
するその一部を包含する組成物を用いる方法を提供す
る。
本発明の方法によれば、組換え体ベクターのライブラ
リーを精製又は構築して複数の異種機能性融合タンパク
質、ポリペプチド及び／又はペプチドTSARsを発現す
る。好ましい態様では、TSARをライブラリーの組換え体
ベクターの表面に発現させる。
本発明は、選択されたリガンドと結合するタンパク
質、ポリペプチド及び／又はペプチドを同定するための
方法であって、（ａ）予測できないヌクレオチドを１つ
又はそれ以上の連続した配列で並んでいる予測できない
ヌクレオチドを包含するオリゴヌクレオチドによりコー
ドされる結合ドメイン（この場合、予測できないヌクレ
オチドの総数は約60以上且つ約600又はそれ未満であ
る）；並びに（ｂ）結合ドメインの発現又は検出を高め
るタンパク質又はペプチドであるオリゴヌクレオチド配
列によりコードされるエフェクタードメインを包含する
複数の異種機能性融合タンパク質を発現する組換え体ベ
クターのライブラリーを、リガンド結合へ導く条件下で
複数の異種機能性融合タンパク質を選択されたリガンド
と接触させ、リガンドと結合する融合タンパク質を単離
することによりスクリーニングすることから成る方法を
包含する。あるいは本発明は、（ａ）（ｉ）予測できな
いヌクレオチドを１つ又はそれ以上の連続した配列で並
んでいる予測できないヌクレオチドを包含するオリゴヌ
クレオチドによりコードされる結合ドメイン（この場
合、予測できないヌクレオチドの総数は約60以上且つ約
600又はそれ未満である）；並びに（ii）結合ドメイン
の発現又は検出を高めるタンパク質又はペプチドをコー
ドするオリゴヌクレオチド配列によりコードされるエフ
ェクタードメインを包含する複数の異種機能性融合タン
パク質を発現するベクターのライブラリーを生成し、
（ｂ）リガンド結合を促す条件下で複数の異種機能性融
合タンパク質を選択されたリガンドと接触させ、リガン
ドと結合する融合タンパク質を単離することによりベク
ターのライブラリーをスクリーニングすることから成る
選択されたリガンドと結合するタンパク質及び／又はペ
プチドを同定する方法を包含する。さらに本発明の方法
は、結合ドメインのアミノ酸配列を推定するために同定
される異種機能性融合タンパク質の結合ドメインをコー
ドするヌクレオチド配列を確定することから成る。
本発明の一態様にしたがって複数のタンパク質、ポリ
ペプチド及び／又はペプチドTSARを発現する組換え体ベ
クターのライブラリーを調製するために、以下の計画に
したがってin vitroでヌクレオチドの一本鎖組を合成
し、組み立てる。
合成ヌクレオチド配列は、変化しないヌクレオチド位
置と変化する又は予測できないヌクレオチド位置とを有
するよう意図される。非変異ヌクレオチドはヌクレオチ
ド配列の特定の部位に位置して、合成オリゴヌクレオチ
ドのアッセンブリー及びクローニングに際して助けとな
る。変異ヌクレオチドの組の５′末端で、非変異ヌクレ
オチドは有効な制限酵素切断部位をコードする。３′末
端非変異ヌクレオチド位置は、６、９又は12ヌクレオチ
ドの相補的対であって、２つの合成一本鎖組のヌクレオ
チドを一緒にアニーリングし、二本鎖DNA（本明細書で
は合成二本鎖オリゴヌクレオチドと呼ぶ）に変換する助
けとなる。
本発明のライブラリーを構築するために用いられる予
測できないオリゴヌクレオチドの合成及びアッセンブリ
ーのための計画は、ｍ＋ｎ変異体、式（NNB）ｎ＋ｍ
（ここでＢはＧ、Ｔ又はＣであり、ｎ及びｍは各々20≦
ｎ＋ｍ≦200又は20〜200の予測できないコドンが複数の
タンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドをコード
する合成二本鎖オリゴヌクレオチド中に組み込まれるよ
うな整数である）の予測できないヌクレオチド配列を含
む。
本発明の一態様は、選択されたリガンドと結合するタ
ンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチドを同定する
ための方法であって、以下の： （ａ）式 ５′Ｘ（NNB）nJZ3′の一次ヌクレオチド配
列を式３′Ｚ′OU（NNV）mY5′ （ここでＸ及びＹはＸ≠Ｙであるような制限酵素認識部
位であり； ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はＴであり； ＢはＧ、Ｔ又はＣであり； ＶはＧ、Ａ又はＣであり； ｎは10≦ｎ≦100であるような整数であり； ｍは10≦ｎ≦100であるような整数であり； Ｚ及びＺ′は各々Ｚ及びＺ′が互いに相補的であるよ
うな６、９又は12ヌクレオチドの配列であり； ＪはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔであるか又は無しであり； ＯはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔであるか又は無しであり； ＵはＧ、Ａ、Ｃ又は無しであるが、但しＪ、Ｏ又はＵ
のいずれかがなしである場合には、Ｊ、Ｏ及びＵはすべ
てない）の二次ヌクレオチド配列とアニーリングして、
アニール化ヌクレオチド配列を二本鎖オリゴヌクレオチ
ドに変換することによりアッセンブリーされる二本鎖オ
リゴヌクレオチドによりコードされる結合ドメイン、並
びに （ｂ）複数の異種機能性融合タンパク質をリガンド結合
へ導く条件下で選択の上記のリガンドと接触させて、上
記のリガンドを結合する異種機能性融合タンパク質を単
離することにより、結合ドメインの発現又は検出を高め
るタンパク質又はペプチドをコードするオリゴヌクレオ
チド配列によりコードされるエフェクタードメインを含
有する複数の異種機能性融合タンパク質を発現するベク
ターのライブラリーをスクリーニングすることから成る
方法を提供する。
本発明はさらに、半剛性コンホメーション構造を構成
するよう意図される複数の異種機能性融合タンパク質を
発現するベクターのライブラリーを作製するための方法
を包含する。これは、変異ヌクレオチドの連続配列を截
断する別の非変異残基を合成ヌクレオチド配列中に組み
込むことにより達成される。これらの別の非変異ヌクレ
オチド配列は、発現異種機能性融合タンパク質の結合ド
メインに構造を賦与するアミノ酸をコードするよう意図
される。好ましい態様において、別の非変異ヌクレオチ
ドはシステイン残基をコードする。ライブラリーが酸化
環境で発現される場合、少なくとも１つのジスルフィド
結合が形成され、それにより各々の異種機能性融合タン
パク質に少なくとも１つのループ又はクローバー型コン
ホメーションでさえも形成され得る。
本発明はさらに、選択されたリガンドと結合するタン
パク質、ポリペプチド及び／又はペプチドを調製するた
めの方法であって、本発明のベクターのライブラリーを
スクリーニングすることにより同定されるアミノ酸配列
を化学的に又は組換え技術により合成することから成る
方法を包含する。
3.1.発明の目的及び効果 本発明は、再現可能、迅速、簡単、有効及び相対的に
安価な結合分子の同定方法を提供する。さらに本発明は
多様なタンパク質、ポリペプチド及び／又はペプチド分
子の大型ライブラリーを作製し、スクリーニングする方
法を提供する。したがって本発明は、選択されたリガン
ドに対する新規の且つ改良された結合特異性、親和性及
び安定性を有するものを同定するために有効にスクリー
ニングされる複数の長鎖タンパク質、ポリペプチド及び
／又はペプチドを生じる大型ライブラリーを作製する迅
速且つ容易な方法を提供する。本発明の方法及び組成物
を用いて得られる結合特性の相違点は、天然結合分子又
はその一部分を模倣するか又は置換するために、広範囲
の適用に用いられる。
特異的遺伝子及び公知の配列の単離に頼る方法に対比
して、本発明は、遺伝子を精製又は単離する必要がない
し、TSARを生成するために結合配列の部分の機能につい
ての詳細な知識もリガンド結合に関与するアミノ酸も必
要としないという利点を有する。唯一の要件は、そのリ
ガンドに対する親和性を有するTSARを見出すためにTSAR
ライブラリーをスクリーニングするのに必要なリガンド
を有することである。TSARはin vitroでスクリーニング
されるため、TSAR/リガンド相互作用に伴う溶媒要件
は、水性溶媒に限定されない。したがってin vivoで見
出されたものとは異なる非生理学結合相互作用が利用さ
れる。
本発明の計画にしたがって、48個の異なるコドンを用
いて、変異ヌクレオチドは20個の天然アミノ酸すべてを
コードする。これは64個の異なるコドンが用いられる天
然に見出されるよりもやや低い変動性を示すが、しかし
変異ヌクレオチドを意図する本発明の計画は有益に、他
の式のヌクレオチドを用いるもののような慣用的計画に
おけるよりも大きな変動性を提供する。
ここに教示したNNB計画の使用は、内部停止コドンを
有する組換え体の数を最小にすることにより特に有益で
ある。この差異は、長鎖ペプチドが発現される場合には
大きくなる。挿入オリゴヌクレオチドのサイズが大き
い、例えば約20コドン以上である場合には、これは特に
重要になる。例えば本明細書に教示した方法を用いる
と、100コドンのオリゴヌクレオチドにおいては、停止
コドンを有さない、即ちオープンリーディングフレーム
を有する確率は、（47/48）100又は約12％であり、一方
（NNS）又は（NNK）法を用いた場合は、このような確率
は（31/32）100は約４％に過ぎない。NNN案を用いうる
が、しかし停止コドンを有する組換え体の数の増大は認
められず、即ち停止コドンを有さない頻度は（61/64）
100又は約１％未満である。
NNB案は、TSARがサプレッサーtRNA遺伝子を欠く宿主
中で発現される場合、別の柔軟性を提供する。即ち、NN
B案は強い分子遺伝子操作を施された宿主生物に限定さ
れず、したがって宿主選択に際してより大きな柔軟性を
提供する。
コドントリプレットの使用により総じて停止コドンを
回避しうるが、しかしその場合は各宿主に対するコドン
の理想的好みを知る必要がある。NNBは宿主範囲により
大きな柔軟性を提供する。さらにコドントリプレット形
態でのオリゴヌクレオチドは市販されていず、トリプレ
ットを合成するための化学的手順は厄介である。
さらに本発明の案は、ライブラリーにしばしば見出さ
れるようなGCヌクレオチドが豊富な合成オリゴヌクレオ
チドの使用を避ける。このようなオリゴヌクレオチドは
適切にアッセンブルし、シーケンシングするのが難し
い。
おそらく最も有意には、オリゴヌクレオチドの合成及
びアッセンブリーのための本発明の案は、いかなる従来
の慣用的ライブラリーよりもサイズが大きい予測できな
いアミノ酸配列をコードするオリゴヌクレオチドの配列
を提供する。本発明により構築した場合、本発明の合成
二本鎖オリゴヌクレオチドは、TSAR結合ドメインに制限
酵素部位をコードする長さが少なくとも約77−631のヌ
クレオチド、相補的部位、及び約20−200の予測不可能
アミノ酸を包含する。好ましい態様によれば、ｎ及びｍ
は10以上、又は50又はそれ未満である。したがって合成
二本鎖オリゴヌクレオチドは、TSAR結合ドメインにおい
て少なくとも77−331ヌクレオチドを包含し、約20−100
の予測できないアミノ酸をコードする。特定の実施例に
おいては、合成オリゴヌクレオチドはTSAR結合ドメイン
でそれぞれ20、24及び36の予測できないアミノ酸と、2
7、35及び42アミノ酸をコードする。
挿入オリゴヌクレオチドの長さを好ましくは15未満、
最も好ましくは約６−８アミノ酸をコードする短さに維
持すべきであるという当業者での慣用的教示とは全く反
対に、本発明人は、約22より大きなアミノ酸をコードす
るライブラリーが構築され得るのみならず、TSARs又は
タンパク質、ポリペプチド及び／又は種々の配位子に対
する結合特異性を有するタンパク質を同定するためにこ
のようなライブラリーが有益にスクリーニングされ得る
ということを見出した。
さらに、より長さの長い本発明のライブラリーの挿入
合成オリゴヌクレオチドは、可能性のある結合タンパク
質／ペプチドにおける、並びにペプチドの結合ドメイン
の実際の結合部分の側面に位置する配列における二次及
び／又は三次構造の展開の機会を提供する。このような
複雑な構造的展開は、短鎖長オリゴヌクレオチドを用い
る場合にのみ、実行可能である。
さらに本発明は半剛性構造又は配座が結合ドメイン中
に特異的に意図される方法を提供する。
TSARsは新規の物質に対する結合親和性の発生及び公
知の物質に対する異なる結合親和性の発生が望ましい系
に特に有用である。
TSAR又はTSAR（又は同一結合特異性を有するその部
分）の結合ドメインを包含する組成物は、結合親和性を
有するペプチド又はポリペプチドを使用するあらゆるin
vivo又はin vitro適用に用い得る。したがってTSAR又
はTSAR組成物は、細胞表面受容体、ウイルス受容体、酵
素、レクチン、インテグリン、アドヘジョン、Ca＋＋結
合タンパク質、金属結合タンパク質、DNA又はRNA結合タ
ンパク質、イムノグロブリン、ビタミン補因子、あらゆ
る生体有機物又は無機化合物を認識するペプチド等の代
わりに又はそれと結合するために用い得る。
標的に対する親和性によって、in vivoで用いるTSAR
あるいはTSAR結合ドメイン又はその一部を含む組成物
は、金属イオン、放射性同位元素、ペプチド、毒素又は
その断片、あるいは酵素又はその断片のような化学的に
又は生物学的に活性な部分を細胞中又は細胞上の特異的
標的に供給しうる。TSARはさらに、他の分子の検出、定
量、分離又は精製のためにモノクローナル抗体又は他の
特異的結合分子同様の実用性をin vitroで有し得る。あ
る態様において、多数のTSAR又はその結合ドメインを多
量体単位として集合させて、同一特異性を有する多結合
ドメインを提供し、生物学的又は化学的活性を有する別
の分子と融合させ得る。
本発明で生成されるTSARは、モノクローナル又はポリ
クローナル抗体のような高分子の機能を取り換え得るの
で、それによりハイブリドーマ形成又はin vivo抗体産
生のための複雑な方法を必要としない。さらにTSARは他
の天然結合分子とは異なって、スクリーニング工程にお
けるそれらの直接且つ迅速な検出を可能にする容易に特
性化され且つ指定される活性を有する。
TSARはさらに、天然リガンドタンパク質、糖タンパク
質又はポリペプチド、あるいは相互作用し、そして結合
に関与する配位子の天然標的中の配列を説明するのに特
に有用であることが見出された。しばしば、配位子分子
の配列が公知である場合でさえ、標的との相互作用に関
与する特異的配列は分からない。特に、分子が大きい場
合には、この結合部位のマッピングは標準技術によれば
骨の折れる仕事である。天然リガンドと結合するTSARs
を単離する場合、これらのTSARのいくつかはそのリガン
ドに対する天然標的中の特異的配列を模倣する配列を含
有することが判明した。TSAR配列と標的配列との比較に
より、リガンド結合に関与する特異的配列を有益に確定
し得る。
4.図面の簡単な説明 本発明についての以下の詳細な説明、本発明の特定の
態様の実施例、及び添付の図面を参照することにより、
本発明をさらに理解しうる。
図１（Ａ−Ｆ）は、本発明の方法によるTSARライブラ
リーの構築を説明する図である。図1Aは、図1B及びＣに
説明した直鎖ライブラリー及び二分子ライブラリーのた
めの合成オリゴヌクレオチドの合成及びアッセンブリー
を示す（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ又はT;B＝Ｇ、Ｔ又はＣ、及び
Ｖ＝Ｇ、Ａ又はC;並びにｎ及びｍは10≦ｎ≦100、及び1
0≦ｍ≦100であるような整数である）。図1D−Ｆは、半
剛性ライブラリーであるよう意図される代表ライブラリ
ーを示す。半剛性ライブラリーのためのオリゴヌクレオ
チドの合成及びアッセンブリーは図1Aと同様であるが、
但し特異化不変性位置を含む。詳細に関しては本文5.1
項参照。
図２は、m13mp8,ベクターm655及びm663の誘導体の地
面を示す（Fowlkes et al.,1992,BioTechniques,13:422
−427参照）。
図３（Ａ−Ｄ）は、M13のp III遺伝子のアミノ酸残基
198−406をコードする截断部分が大腸菌Pel B遺伝子の
リーダー配列と結合し、lacプロモーターの制御下で発
現される。ファージミドpBluescript II SK＋に由来す
るファージミドベクターの環状制限地図をしめす。Ｇ及
びＳはそれぞれアミノ酸グリシン及びセリンを表す;c−
mycは、Evan et al.,1985,Mol.Cell.Biol.５:3610−361
6に記載された9E10モノクローナル抗体により認識され
るヒトｃ−myc腫瘍遺伝子エピトープを表す。図3Aは、
ファージミドpDAF1の制限地図を表し；図3Bは、ファー
ジミドpDAF2の制限地図を表す；図3CはファージミドpDA
F3の制限地図を説明する；図3DはpDAF1,pDAF2及びpDFA3
の構築を示す図である。
図４は、プラスミド発現ベクターp340の構築の工程を
示す。詳細に関しては本文９項参照。
図５（Ａ−Ｂ）は発現ベクタープラスミドp677−２の
構築工程（図5A）及び構造（図5B）を示す。詳細は本文
5.1.2.1項参照。
図６は、プラスミドベクター中で発現されるTSARライ
ブラリーのスクリーニングに関する略図である。詳細は
本文5.2.項参照。
図７はリンカードメインが結合ドメインとエフェクタ
ードメインを繋ぐTSARを表す図である。図は尺度通りに
描かれているわけではない。詳細は本文5.3.項参照。
図８はTSAR−９ライブラリーの構築を示す。Ｎ＝Ａ、
Ｃ、Ｇ又はT;B＝Ｇ、Ｔ又はＣ及びＶ＝Ｇ、Ａ又はＣ。
詳細に関しては本文6.1.1項参照。
図９は、TSAR−12ライブラリーの構築を示す。Ｎ＝
Ａ、Ｃ、Ｇ又はT;B＝Ｇ、Ｔ又はＣ及びＶ＝Ｇ、Ａ又は
Ｃ。詳細に関しては6.2項参照。代表的な適切なベクタ
ー中への挿入及び適切な宿主中での発現を示す。
図10は、TSAR−９ライブラリーの23無作為選択成員の
合成オリゴヌクレオチドの可変性領域によりコードされ
るアミノ酸の使用頻度を示す。示した値は、各アミノ酸
が観察された時間数とオリゴヌクレオチドを合成するの
に用いた式を基礎にして予測した時間との比較である；
基準線の上及び下の棒のサイズにより、予測値からの放
散を示す。詳細に関しては本文6.3.1項参照。
図11は、TSAR−13ライブラリーの構築を示す。詳細に
関しては本文6.4項参照。
図12は、ファージベクター上に発現され、7E11.9−５
及び7E11.12−３（それぞれ配列番号:26及び29）と呼ば
れるTSARが7E11−C5モノクローナル抗体とその抗原との
結合を用量依存方式で阻害したことを示す。ＯはTAR7E1
1.9−５（IC 50＝1.7 x 1010）による結合の競合を示
す；●はTSAR7E11.12−３（IC 50＝3.55 x 1011）によ
る結合の競合的阻害を示す；▽は、対照タンパク質であ
るベクターM663のp III遺伝子による結合の競合的阻害
を示す。詳細に関しては本文7.2項参照。
図13は、7E11−C5結合TSARの結合ドメインの一部を包
含するペプチド（アミド形態）（配列番号:31）が7E11
−C5抗体のその抗原との結合を競合的に阻害したことを
示す。２つの（アミド形態）対照ペプチド１及び２（配
列番号:32及び33）を比較のために含めた。7E11−C5抗
体により認識されるものとは異なるLNCaP細胞抽出物中
の抗原を認識する別のモノクローナル抗体であるB139の
結合を阻害する能力を評価した。＊は配列番号:31によ
るLNCaP細胞抽出物と結合する7E11−C5モノクローナル
抗体の阻害を示す；□は、配列番号:31によるLNCaP細胞
抽出物と結合するB139モノクローナル抗体の阻害を示
す；◇は、対照ペプチド１（配列番号:32）による7E11
−C5抗体結合の阻害を示す；△は、対照ペプチド１（配
列番号:32）によるB139モノクローナル抗体結合の阻害
を示す；○は、対照ペプチド２（配列番号:33）による7
E11−C5モノクローナル抗体の阻害を示す； 対照ペプチド２（配列番号:33）によるB139モノクロー
ナル抗体の阻害を示す。詳細に関しては本文7.2項参
照。
図14は、0.5−500μg/mlの範囲の濃度で50μl/ウエル
を用いて固定した場合、7E11−C5結合TSARの一部を包含
するペプチド（配列番号:31と呼ばれるペプチド（アミ
ド））との7E11−C5モノクローナル抗体の用量依存性結
合を示す。○は、0.5μg/mlでの配列番号:31を示す；△
は、5.0μg/mlでの配列番号:31を示す；□は、50μg/ml
での配列番号:31を示す；そして＊は500μg/mlでの配列
番号:31を示す。詳細に関しては本文7.2項参照。
図15は、7E11−C5モノクローナル抗体が7E11−C5結合
TSARの一部を包含するペプチドを特異的に結合し、その
ペプチドが（アミド形態）配列番号:31と呼ばれ、一方
別の無関係なモノクローナル抗体B139は特異的に結合し
なかった。＊は、7E11−C5の固定化配列番号:31との結
合を示す；□は、B139抗体の固定化配列番号:31との結
合を示す。
図16（Ａ−Ｂ）は、Zn（II）−IDA、Cu（II）−IDA及
びNi（II）−IDA上に分別された単離Zn（II）−IDA選択
ファージのクロマトグラフィー処理特性を示す。図16A
は、さらに特性表示するために選択された４つのZn（I
I）−IDA選択ファージ（表２）を示す。クローンをZn
（II）−IDA、Cu（II）−IDA及びNi（II）−IDA上で分
別した。３つの分画を収集し、ファージの存在に関して
滴定した：戦場（■）、溶離（黒枠□）、及びT10NT中
に再懸濁した金属（II）−IDAカラムマトリックス
（□）。各分画中の回収ファージのパーセンテージを示
す。図16Bは、Zn（II）−IDAからのZn（II）−IDA選択
クローンZnlB8の溶離を示す。ZnlB8をZn（II）−IDA上
に分別して、種々の試薬で溶離した。３つの分画を収集
し、ファージの存在に関して滴定した：戦場（■）、溶
離（黒枠□）、及びT10NT中に再懸濁した金属（II）−I
DAカラムマトリックス（□）。値は分画中の回収ファー
ジの％として示した。詳細に関しては本文7.3項参照。
図17は、C46モノクローナル抗体に対する発癌性胚抗
原（CEA）を有するC46−9.1（配列番号:68）（●）及び
C46−9.2（配列番号:69）（○）と呼ばれるTSARsの競合
的結合を示す。詳細に関しては本文7.5項参照。
図18は、ELISA検定フォーマットでのC46抗体を有する
TSAR C46.9−２（配列番号:69）の結合ドメインのアミ
ノ酸配列を基礎にした合成重複八量体ペプチド（８−me
rs）の結合を示す。詳細に関しては本文7.5項参照。
図19は、カルモジュリン結合TSAR（配列番号:135）を
基礎にしたペプチド（配列番号:176）のカルモジュリン
との結合がEGTA濃度の増大により阻害され、これはカル
モジュリンとの結合がカルシウム依存性であることを示
す、ということを図示している。□はカルシウムの存在
下でCa Mと結合する配列番号:176を示し；○はEGTA濃度
の増大下でのCa Mと結合する配列番号:176の阻害を示
す。詳細に関しては本文7.9項参照。
図20 − Ca Mタンパク質キナーゼ（Ca M Ｋ）及び
骨格ミオシン軽鎖キナーゼ（MLCK）による固定化カルモ
ジュリンと結合するストレプタビジン標識化配列番号:1
76の阻害。詳細に関しては本文7.9項参照。
図21 − カルシウムイオン存在下での、カルモジュ
リンと結合した（−）及び及び結合していない（−）配
列番号:176ペプチドの蛍光。詳細に関しては本文7.9項
参照。
図22 − カルモジュリン濃度増大下での配列番号:1
76ペプイドの蛍光。詳細に関しては本文7.9項参照。
図23 − Ｎ末端半配列番号:195（▼）、Ｃ末端半配
列番号:180（▲）、Ｗ−Ａ配列番号:178（◆）、カルモ
ジュリンに結合する配列番号176ペプチドと競合する逆
配列（配列番号:177）（ｘ）。詳細に関しては本文7.9
項参照。
5.発明の詳細な説明 本発明は、選択されたリガンドに結合するTSARといわ
れているタンパク質／ポリペプチド及び／又はペプチド
を同定するための方法及び組成物を提供する。本発明で
用いられているように、TSARは、少なくとも二つの別個
の反応領域を含む、連結された異種機能性のタンパク
質、ポリペプチド及び／又はペプチドを包含することを
意図している。TSAR分子の異種機能性の一つの領域は、
リガンドに親和性を有する結合ドメインであり、すなわ
ち（１）特定条件下の結合の強さ、（２）特定条件下の
結合の安定性、及び（３）選択されたリガンドのための
選択特異性により特徴づけられる。異種機能性のTSAR分
子の第二の領域は、TSARの発現及び／又は検出及び／又
は精製を増強するための、生物学的又は化学的に活性で
あるエフェクタードメインである。このエフェクタード
メインは、ベクターの表面タンパク質、酵素若しくはそ
のフラグメント、毒素若しくはそのフラグメント、治療
上のタンパク質若しくはペプチド、又はタンパク質若し
くはペプチド（それらの機能は、金属イオンなどのよう
な物質の付着のための部位を提供することであり、すな
ち、この発現されたTSARの、発現及び／又は検出及び／
又は精製を増強するに有用である）として容易に発現で
きる構造タンパク質又はフラグメントを含む、多くの生
物学的又は化学的に活性なタンパク質から選択される。
本発明の実施態様の一つにより、TSARは、結合ドメイ
ンとエフェクタードメインの間に、場合による付加的リ
ンカードメイン又は領域を含むことができる。このリン
カー領域は、（１）結合ドメインとエフェクタードメイ
ンの間の構造的スペーサーとして、（２）結合ドメイン
とエフェクタードメインを離すか若しくは分ける目的
で、又は（３）発現ベクターによる結合ドメイン及び／
又はTSARの表示のために構造的助けとして働く。このTS
AR（図７も参照されたい）の場合によるリンカー領域の
より詳細な記載については，第5.3節（後述）を参照さ
れたい。
本発明で用いられているように、リガンドは、タンパ
ク質のレセプターが、本来存在するか、又は本発明の方
法により調製することができるために、分子又はその部
分を含む物質を包含することを意図している。リガンド
に結合しているTSARは、レセプター、すなわちそのリガ
ンドが適合し、そして結合する錠として機能することが
できるか、あるいはTSARは、リガンドがより大きなタン
パク質分子であるとき、リガンドに適合し、そして結合
する鍵として機能することができる。この発明におい
て、リガンドは、特定的にTSARと相互作用するか又は結
合する物質であり、限定されないが、有機化学基、イオ
ン、金属若しくは非−金属無機イオン、グリコタンパク
質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、炭水
化物、炭水化物ポリマー、脂質、脂肪酸、ウイルス粒
子、膜小胞、細胞壁成分、合成有機化合物、生化学化合
物及び無機化合物又は上述のいずれかのものの部分のい
ずれかを含む。
本発明は、さらに、新規なTSAR試薬及びTSARの結合ド
メイン又はその部分（それらは、特定的に選択されたリ
ガンドを有する）を含む、新規なTSAR試薬及び組成物、
並びにTSAR及びTSARの結合ドメイン又はその部分（それ
らは、TSAR結合ドメインの結合特性を保持している）を
含む組成物を用いる方法を提供する。
単に説明を容易にするために、本発明の記載は、以下
の項に分けることができる。（Ａ）（ｉ）構築及び（i
i）ライブラリーのスクリーニングを含むTSARを同定す
る方法；（Ｂ）TSAR又はその部分の結合ドメインを含む
TSAR及び組成物；並びに（Ｃ）TSAR及びTSAR組成物の適
用又は用途。TSARライブラリーを構築する方法の記載
は、さらに以下のように分けることができる．（ａ）合
成オリゴヌクレオチドの調製及び組み立て；（ｂ）合成
オリゴヌクレオチドの適当な発現ベクターへの挿入；及
び（ｃ）ベクターのライブラリーの発現。線状の、二分
子及び半固定のライブラリーを構築する方法が記載され
ている。
5.1.TSARを同定する方法：ライブラリーの構築 最も一般的態様において、迅速にかつ効率的に、TSAR
に新規な結合試薬を同定するための本発明の方法は、二
つの工程を含む：（ａ）例えばベクターの到達しやすい
表面構造タンパク質に付着している。融合タンパク質と
して、複数のタンパク質、ポリペプチド及び／又はペプ
チドをコードする、挿入された合成オリゴヌクレオチド
配列を発現するベクターのライブラリーの構築；及び
（ｂ）関心のあるリガンドに結合しているタンパク質、
ポリペプチド及び／又はペプチドを生成するそれらの構
成員を単離するための発現ライブラリー又は複数の組換
えベクターのスクリーニング。この単離されたベクター
の挿入された合成オリゴヌクレオチドの核酸配列が、決
められ、そしてコードされたこのアミノ酸配列が、推定
され、選択されたリガンドに結合したTSAR結合ドメイン
が同定される。
本発明は、選択されたリガンドに結合しているタンパ
ク質、ポリペプチド及び／又はペプチドを同定する方法
を包含し、以下の方法を含む：（ａ）予測できないヌク
レオチドが一つ以上の連続配列で配列されている予測で
きないヌクレオチド（そこでは予測できないヌクレオチ
ドの総数は約60に等しいかそれより大きく、約600に等
しいかそれより小さい）を含むオリゴヌクレオチドによ
りコードされている結合ドメイン、及び（ｂ）結合ドメ
インの発現又は検出を増強するタンパク質又はペプチド
をコードしているオリゴヌクレオチド配列によりコード
されているエフェクタードメインを、含む複数の異種機
能性の融合タンパク質を発現する組み換えベクターのラ
イブラリーを、複数の異種機能性の融合タンパク質をリ
ガンド結合を促す条件下に選択されたリガンドと接触さ
せ、次いでリガンドに結合した融合タンパク質を単離す
ることによりスクリーニングすることを含む。あるい
は、本発明は、選択されたリガンドに結合するタンパク
質及び／又はペプチドを同定するための方法を包含し、
以下の方法を含む：（ａ）（ｉ）予測できないヌクレオ
チドが一つ以上の連続配列で配列されている予測できな
いヌクレオチド（そこでは予測できないヌクレオチドの
総数は約60に等しいかそれより大きく、約600に等しい
かそれより小さい）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドに
よりコードされている結合ドメイン、及び（ii）結合ド
メインの発現又は検出を増強するタンパク質又はペプチ
ドをコードしているオリゴヌクレオチド配列によりコー
ドされているエフェクタードメインを含む異種機能性の
複数の融合タンパク質を発現するベクターのライブラリ
ーを作製させること；及びリガンド結合を促す条件下選
択されたリガンドと異種機能性の複数の融合タンパク質
を接触させ、次いでリガンドに結合している異種機能性
の融合タンパク質を単離することにより、ベクターのラ
イブラリーをスクリーニングすることを含む。さらに加
えて、この方法又は本発明は、さらに同定された異種機
能性の融合タンパク質の結合ドメインをコードしている
ヌクレオチド配列を決定し、結合ドメインのアミノ酸配
列を推定することを含む。
もちろん、本発明によりライブラリーが、一度構築さ
れたならば、このライブラリーは、与えられたリガンド
に結合するTSARを同定するための、多くの異なる選択さ
れたリガンドと何回でもスクリーニングすることができ
る。このようなスクリーニング方法も、また本発明のな
かに包含されている。
5.1.1.オリゴヌクレオチドの調製及び組み立て 本発明の実施態様の一つに従い、複数のタンパク質、
ポリペプチド及び／又はペプチドTSARを発現するベクタ
ーのライブラリーを調製するために、ヌクレオチドの一
本鎖のセットを合成し、以下のスキームにより試験管内
（In Vitro）で組み立てた。
合成されたヌクレオチド配列は、変異又は予測できな
いもの及び変異しないヌクレオチド位置を有するように
設計した。一つの構成員は、５′（NNB）n3′で表さ
れ、そして他の構成員は、３′（NNV）m5′（ここで、
Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴであり;Bは、Ｇ、Ｔ又はＣであ
り;Vは、Ｇ、Ａ又はＣであり;nは、10≦ｎ≦100である
ような整数であり、そしてｍは、10≦ｎ≦100であるよ
うな整数である）で表される変異ヌクレオチドのペア
を、合成オリゴヌクレオチドに組み立てるために合成し
た。本発明により組み立てたように、それぞれの挿入さ
れた合成二本鎖オリゴヌクレオチド配列中には、少なく
ともｎ＋ｍの変異コドンが存在している（図1A）。当業
者に理解されているように、変異ヌクレオチド位置は、
20の天然由来のアミノ酸をコードする能力を有し、本発
明により組み立てたとき、ただ一つの停止コドン、すな
わちTAGをコードする。本発明の変異ヌクレオチドによ
りコードされたアミノ酸の配列は、予測できず、かつ実
質的にランダム配列である。「予測されなかった」又は
「予測できない」及び「実質的にランダム」の用語は、
本明細書では、コードされたアミノ酸に関して交換可能
として用いられており、20の天然由来のアミノ酸が起こ
る変異ヌクレオチドによりコードされたTSARの結合ドメ
インでのどこかの与えられた位置が、予測できないこと
を意味することを意図している。
本スキームによる変異ヌクレオチドは、48の異なるコ
ドンの使用によりすべての20の天然由来のアミノ酸をコ
ードする。このことは、天然で見出される、ここでは64
の異なるコドンが用いられている、よりいくらか少ない
変異であるけれども、変異ヌクレオチドを設計するため
の本スキームは、好都合には、式NNK（ここで、ＫはＧ
又はＴ（Dower,WO91/19818（前述）参照）である）又は
式NNS（ここで、Ｓは、Ｇ又はＣ（Devlin,WO91/18980参
照）である）のヌクレオチドを用いたそのような従来の
スキーム（ここでは、ただ32のコドンが用いられてい
る）よりも大きな変異を提供する。
さらに、第5.1.3節（後述）で議論するように、合成
オリゴヌクレオチドが、発現ベクター中に挿入されたと
き、ただ一つの停止コドンTAGが、突然変異宿主、例え
ばE.coli supE中でベクターライブラリーの発現により
抑制されることができる（一般的には、Sambrook,Frits
h and Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manu
al,2d.ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,pp.2.
55,2.57−.59,4.13−4.15 1989（以後Maniatisとする）
参照）。
当業者により理解されているように、式NNK又はNNSの
変異コドンの使用は、現在使用したNNB式のように、た
だ一つの停止コドン、すなわちTAGをコードするであろ
う。もしサプレッサー、例えばSupEの使用は、ただ一つ
の停止コドンを抑制するために100％有効であるので、
従来の方法により用いられたこれらのスキームにかえて
本NNBスキームを用いる差又は利点はない。
他方、もし抑制が100％有効でないか、又は特定のベ
クター／宿主系のために抑制が用いられないならば、そ
のときは31アミノ酸よりむしろ47アミノ酸コーティング
コドンを用いるためには、現在教示のNNBは、NNK又はNN
S系のいずれかよりもより有利であるだろう。ヌクレオ
チドの特定の長さのNNB配列での停止コドンを有する機
会は、より少なくなる。説明のために、現在教示されて
いるNNBスキームを用いた36コドンの配列中に停止コド
ンを有する確率は、〔１−（47/48）36〕又は約53％で
あり、一方NNK又はNNSスキームを用いると、その確率
は、〔１−（31/32）36〕又は68％である。このNNNスキ
ームは、用いることができるが、しかし停止コドンでの
組換えの数が増大し、例えば〔１−（62/64）36〕＝0.8
2又は82％である。したがって、現在教示されているNNB
スキームは、特に内部停止コドンでの組換えの数を最少
にする利点を有する。この相違は、より長いTSARペプチ
ドが発現されたときに、大きくなる。これは、特に挿入
されたオリゴヌクレチドの寸法が大きい、例えば約20コ
ドンより大きいときに、重要になる。例えば、現在教示
されている方法を用いて、100コドンのオリゴヌクレオ
チドにおいて、停止コドンを持たない、すなわち開かれ
た読み枠を持つ確率は、（47/48）100又は約12％である
が、一方NNS又はNNK法を用いたときには、そのような確
率は、（31/32）100又はたった４％である。
実際、第6.3節（後述）でより詳細に説明するよう
に、supE E.coli突然変異体でのM13ベクター誘導体によ
り発現した本発明による挿入された合成オリゴヌクレオ
チドの多くの分析は、非常に少ないTAG停止コドンが、T
SARベクターにより発現させた結合ドメイン配列中に見
られる。したがって、この系でのsupEの使用は効率的で
ないが、しかし本NNBスキームの使用は、特に有用であ
るように見える。
このNNBスキームは、TSARペプチドがサプレッサーtRN
A遺伝子を欠く宿主中で発現させられるときに、さらな
る可動性を提供する。すなわち、このNNBスキームは、
強烈な分子遺伝子操作に付される宿主有機体にのみで制
限されず、したがって宿主選択で大きな可動性を提供す
る。
コドントリプレットを用いることにより全体で停止コ
ドンを避けることができるが、しかしそのときにはそれ
ぞれの宿主の理想的に好ましいコドンを知ることが必要
である。NNBは、宿主範囲により大きな可動性を提供す
る。
非変異ヌクレオチドは、合成されたオリゴヌクレチド
の組み立て及びクローニングのためにヌクレチド配列の
特定の部位に位置している。変異ヌクレオチドのセット
の５′末端で、非変異ヌクレオチドは、有効制限酵素切
断部位をコードする。５′末端での非変異ヌクレオチド
は、制限酵素（１）これは同じ緩衝条件で機能すること
ができる；（２）高い特異的活性で商業的に入手でき
る；（３）合成された二本鎖オリゴヌクレオチドの互い
に相補的自己結索を阻止することができない；（４）挿
入された二本鎖オリゴヌクレオチド配列内の切断頻度を
低くするために切断認識部位の６又は８ヌクレオチドを
必要とする。したがって、６節（後述）に例示したペプ
チドライブラリーの特定の実施態様に対して、選択され
た部位のペアは、Xho IとXba I、及びSal IとSpe Iから
選択される。有用な制限酵素部位の他の例は、以下のも
のを含むが、これに限定されない:Nco I、Nsi I、Pal
I、Not I、Sfi I、Pme Iなど。５′末端非変異位置での
制限部位は、オリゴヌクレオチドが適切な発現ベクター
中に挿入されたときの連結の間に適当な位置及び組換え
分子形成の効率のよい製造を促進するように機能する。
したがって、本発明のもう一つの実施態様に対して、
変異ヌクレオチドが、メチル化dNTPの一つ以上を用いて
合成され、そして効果的切断のための制限部位をコード
した、５′末端非変異ヌクレチドが、非−メチル化dNTP
を用いて合成された。この実施態様は、適当なベクター
中に挿入するための末端での長い長さの合成オリゴヌク
レチドの効率のよい切断を提供するが、一方変異ヌクレ
オチド配列での切断を避ける。
３′末端非変異ヌクレオチド位置は、ヌクレオチドの
二つの合成一本鎖を一緒にアニーリングし、そしてここ
で示された合成した二本鎖オリゴヌクレオチドを、二本
鎖DNAに変換するために、相補的に６、９又は12ヌクレ
オチドのペアである。
第６節（後述）に例示したペプチドライブラリーの特
定の実施態様において、３′末端非変異ヌクレオチド
は、５′GCGGTG3′と３′CGCCAC5′、及び５′CCAGG
T3′と３′GGTCCA5′、これらは、また特定のアミノ
酸、グリシン、又はジペプチド、プロリン−グリシン、
をコードしており、発現された、タンパク質、ポリペプ
チド及び／又はペプチドに対し、それぞれスイベル又は
ヒンジ配置の可動性を提供している。
さらに、他の特定の実施態様において、コードしてい
る鎖の３′末端ヌクレオチドは、５′GGGTGCGGC3′であ
り、これはグリシン、シスチン、グリシンをコードして
いる。酸化環境において、このシスチンは、結合ドメイ
ン中で他のシスチンとジスルフィド結合を形成し、発現
ペプチドの半剛性コンホメーションを形成する。
他の実施態様において、相補的な３′末端は、また短
い荷電クラスター（例えば、KKKK、DDDD又はKDKD）、又
は鋭い曲げ（例えば、NPXY、YXRF（ここで、Ｘはどのよ
うなアミノ酸でもよい）を提供するアミノ酸配列をコー
ドしている。他の別の実施態様において、相補的な３′
末端は、また所望の結合を有するか又は生物活性を有す
ると知られているペプチドを提供する短いアミノ酸配列
をコードしている。特定の例は、制限しないがRGD、HA
V、HPQθ（ここで、θは非−極性アミノ酸である）を含
むペプチドをコードしている。
図1Aは、一般的に本発明の方法による組み立て方法を
示している。オリゴペプチド配列は、このようにして以
下の方法により組み立てられる：示された式を有する一
本鎖ヌクレオチドのペアの合成： （ａ）５′→３′制限部位−（NNB）ｎ−相補部位；及
び （ｂ）３′→５′相補部位−（NNV）ｍ−制限部位、 ここで、ｎは、10≦ｎ≦100である整数であり、そして
ｍは、10≦ｍ≦100である整数である。より特に、一本
鎖ヌクレオチドは、第１の式５′Ｘ（NNB）nJZ3′そし
て第２の式３′Ｚ′OU（NNV）mY5′ ここで、Ｘ及びＹは、ＸがＹに等しくない制限酵素認
識部位であり； Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴであり； Ｂは、Ｇ、Ｔ又はＣであり； Ｖは、Ｇ、Ａ又はＣであり； ｎは、10≦ｎ≦100である整数であり； ｍは、10≦ｍ≦100である整数であり Ｚ及びＺ′は、それぞれ、６、９又は12ヌクレオチドの
配列であり、Ｚ及びＺ′は、互いに相補的であり； Ｊは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又は無しであり； Ｏは、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又は無しであり； Ｕは、Ｇ、Ａ、Ｃ又は無しであるが；但し、しかしなが
ら、もしＪ、Ｏ又はＵのいずれか一つが、無しであれ
ば、そのときは、Ｊ、Ｏ及びＵは、すべて無しである。
ヌクレオチドの一本鎖のセットの合成のいずれかの方
法は、自動ヌクレオチド合成装置のそのような使用を含
んで適切である。この合成装置は、ヌクレチドが、等モ
ルであるか、又は非−等モルの比のいずれかで変異位
置、すなわちＮ、Ｂ、Ｖ、Ｊ、Ｏ又はＵの位置で組み込
まれることができる。この所望の長さのヌクレオチド配
列は、例えばHPLCで精製することができる。
目的の長さの精製された１本鎖ヌクレオチドの対を、
Taq、Vent（登録商標）又はBst DNAポリメラーゼのよう
な適切なDNAポリメラーゼ、及び適切な温度サイクリン
グを使用して、アニーリングとDNA合成のサイクルの繰
り返しにより、適切な緩衝液中で一緒に反応させる。大
腸菌DNAポリメラーゼのクレノー断片を使用することが
できるが、当業者には理解されるように、このようなポ
リメラーゼは、各周期で補充することが必要であり、こ
のためあまり好適ではない。ここで長さｍ＋ｎより大き
い２本鎖DNA反応生成物は、例えばフェノール／クロロ
ホルム抽出とエタノール沈殿により単離される。
緩衝液に再懸濁液、２本鎖合成オリゴヌクレオチド
を、適切な制限酵素で切断して、多数の合成オリゴヌク
レオチドを得る。この２本鎖の合成オリゴヌクレオチド
は、高解像度ポリアクリルアミドゲル電気泳動、又はNu
Sieve/MetaMorph（FMC Corp.,Rockl and,MA）アガロー
スゲル電気泳動などの方法により、適切なサイズのもの
が選択される。オリゴヌクレオチドのサイズを選択する
ことにより、不適切なサイズの無駄な組み立て生成物や
不完全な消化生成物が実質的に除外される。本発明のラ
イブラリーを作成するために使用される予測できないオ
リゴヌクレオチドの合成と組み立てのスキームは、20n
＋ｍ≦200即ち20〜200の予測できないコドンが、合成２
本鎖オリゴヌクレオチド中に組み込まれるように、式
（NNB）n+m（式中、Ｂは、Ｇ、Ｔ又はＣであり；そして
ｎ及びｍは、各々整数である）の予測できないヌクレオ
チド配列であるｍ＋ｎ変異体を組み込んでいる。このよ
うなスキームは、従来のライブラリーでは得られなかっ
た多くの重要な利点を提供する。組み立てられる時、本
合成オリゴヌクレオチドは、異なるアミノ酸をコードす
る48個のコドンの使用により天然に存在する20個全ての
アミノ酸をコードする。これは、異なる64個のコドンが
使用される天然に見い出されるものと比べて、幾分少な
いが、本スキームは、従来の他のスキームに比べて有利
に多い。例えば、変異体ヌクレオチドが式NNK（式中、
Ｋは、Ｇ又はＴである）又はNNS（式中、Ｓは、Ｃ又は
Ｇである）を有する従来のスキームは、異なるアミノ酸
をコードするわずか32個のコドンしか使用していない。
アミノ酸をコードするより多くのコドンの使用は、本ラ
イブラリーが発見する時に、本ライブラリーを宿主のコ
ドンの選り好みをより受けにくいものにしている。本ス
キームと従来のスキームの両者ともわずか１個の停止コ
ドンを確保しているのみであるが、本明細書で教示され
るNNBの使用は、従来のNNS又はNNKスキームに比べて停
止コドンの確率が低下している合成オリゴヌクレオチド
を有利に与える。更に、本スキームは、変異体コドンの
NNS式を使用するライブラリーにしばしば見られるよう
な、GCヌクレオチドに富んだ合成ヌクレオチドの使用を
回避する。当業者には公知であるように、GC残基に富ん
だヌクレオチド配列は、正しく組み立てて配列決定する
のが難しい。
（ａ）５′→３′制限部位−（NNB）ｎ−相補的部位；
及び （ｂ）３′→５′相補的部位−（NNV）ｍ−制限部位、 で示される２つの異なる１本鎖ヌクレオチド配列よりな
る、変異体及び非変異体領域を有するヌクレオチドのセ
ットを使用する、オリゴヌクレオチドを組み立てるため
の本スキームは、２つの１本鎖のヌクレオチドのセット
の有効なアニーリングを有利に提供する。この組み立て
方法は有効に作用するため、最初に合成される必要があ
るのは比較的少量のDNAのみであり、合成ヌクレオチド
は、アニーリングと伸長の繰り返しサイクルで、Taq DN
Aポリメラーゼのような適切なポリメラーゼを使用し
て、有効に２本鎖オリゴヌクレオチドに変換することが
できる。
恐らく最も有意には、オリゴヌクレオチドの合成と組
み立てのための本スキームは、いかなる従来のライブラ
リーに比べてもサイズの大きい、予測できないアミノ酸
配列をコードするオリゴヌクレオチドの配列を与える。
本発明により作成される時、本合成２本鎖オリゴヌクレ
オチドは、制限酵素部位、相補的部位及びTSAR結合ドメ
イン中で約20〜200個の予測できないアミノ酸をコード
する、長さが少なくとも約77〜631個のヌクレオチドよ
りなる。好適な実施態様では、ｎ及びｍは、10以上かつ
50以下である。即ち、合成２本鎖オリゴヌクレオチド
は、少なくとも77〜331個のヌクレオチドよりなり、TSA
R結合ドメイン中で約20〜100個の予測できないアミノ酸
をコードする。具体例では、合成オリゴヌクレオチド
は、TSAR結合ドメイン中で、各々20、24及び36個の予測
できないアミノ酸と、27、35及び42個の全アミノ酸をコ
ードする。
当該分野で従来の理論では、挿入オリゴヌクレオチド
の長さは、好適には15個未満、最も好適には約６〜８個
のアミノ酸をコードする小ささに保つべきである。これ
とは完全に反対に、本発明者らは約20個を超えるアミノ
酸をコードするライブラリーを作成することができるだ
けでなく、このようなライブラリーでは、TSAR即ち種々
のリガンドに対する結合特異性を有するタンパク、ポリ
ペプチド及び／又はタンパクを同定するために有利にス
クリーニングすることができることを見い出した。
薬剤開発のために結合分子を同定するためにコンピュ
ーターモデル化を利用することに興味ある人々の間で
は、非ペプチド性の模倣物を開発するためのリード化合
物として使用されるペプチドは、最大約６〜８個のアミ
ノ酸に保つべきであることが従来の理論であった。より
大きなペプチドのコンピューターモデル化は、実際的で
ないか又は有益でないと考えられてきた。このため、従
来の理論では、短いペプチド配列のライブラリーをスク
リーニングすることがより生産的であった。これとは完
全に反対に、結合ペプチドを同定するためにはるかに長
いペプチドのライブラリーを有効に作成しスクリーニン
グするための方法を提供する本発明は、後でそのような
コンピューターモデル化技術を利用して薬剤開発のため
に使用できる小さなモチーフ（即ち、６〜８個のアミノ
酸）を首尾よく解明した。更に、本発明者らは、本発明
の方法により同定されるより長いペプチドが、薬剤候補
の完全に新しい展望を提供すると信じている。
セクション７（以下）の実施例で照明されるように、
本挿入オリゴヌクレオチドの長さが、アミノ酸の短い配
列が共通であるか又はある一定のリガンドに結合する多
くのタンパク／ペプチド結合に、共有されているTSAR
（即ち共有される結合モチーフを有するTSAR）を同定す
る能力、及び同一リガンドへの結合特異性を有する他の
ペプチド（非モチーフ）といかなる共有配列ももたない
TSARを同定する能力を提供している。即ち本ライブラリ
ーは、単純又は複合結合部位で、リガンドに親和性を有
するTSARを同定する能力を提供する。
特定の応用、即ち抗体のエピトープに対して結合特異
性を有するTSARの同定で、大きな挿入オリゴヌクレオチ
ド配列を有する本ライブラリーは、少数の隣接するアミ
ノ酸残基を包含するエピトープ（即ち単純エピトープ）
だけでなく、不連続のアミノ酸を包含するエピトープ
（即ち複合エピトープ）をも同定又はマッピングする機
会を提供する。
更に、本ライブラリーの挿入された合成オリゴヌクレ
オチドのサイズの大きさは、可能性ある結合タンパク／
ペプチド、及び結合ドメイン中の実際の結合部分に隣接
する配列の２次及び／又は３次構造の展開の機会を提供
する。このような複雑な構造の展開は、短い長さのオリ
ゴヌクレオチドだけが使用される時には不可能である。
最後に、従来の理論では見落とされたように、長いペ
プチドライブラリーは、短いペプチドライブラリーより
もはるかに増大した複雑さを提供し、これは当業者にと
って明白ではなかった。このはるかに増大した複雑さ
は、含めて数えなければならない引き込み窓の概念と関
係する；即ち、窓の数＝［配列の長さ］−［窓のサイ
ズ］＋１である。この概念は、以下の２つのライブラリ
ーの比較により説明することができる。リガンドへの結
合部位が、５個の隣接するアミノ酸残基（ペンタマー）
を要すると仮定する。ペンタマーを発見する第１のライ
ブラリー、及び本発明により作成されるトリ−デカマー
（30量体）を発現する別のライブラリーの、等しい数の
組み換え体よりなる２つのライブラリーにおいて、第２
のライブラリーは、第１のライブラリーに比較して26倍
結合部位に「富んで」いる。言い換えると、本発明によ
る１つの30量体のライブラリーで表されるのと同じ数の
可能なペンタマーを達成するためには、26個のペンタマ
ーライブラリーを作成しなければならない。当然この差
は、発現するペプチドの長さが長くなるほど増大する。
本発明の別の実施態様により、第1D〜Ｆ図に示される
ように、その構造中にある程度のコンホメーションの剛
性（rigidity）を有する多数のTSARタンパク、ポリペプ
チド及び／又はペプチドを発現するライブラリー（半剛
性（semirigid）ペプチドライブラリー）が作成され
る。半剛性ペプチドライブラリーでは、多数の合成オリ
ゴヌクレオチドが、合成変異体又は予測できないオリゴ
ヌクレオチド内の、又はこれに隣接するある構造をとる
アミノ酸をコードするコドンの位置により強制される。
唯一の又は少数の異なるコンホメーションしかとること
のできないペプチドを発現する。上述のように作成さ
れ、発現する多数のタンパクが、多くの短命な異なるコ
ンホメーションをとることが可能な、第1B図に示したラ
イブラリーとは異なり、半剛性ペプチドライブラリーで
は、発現する多数のタンパク質は、唯一の又は少数のコ
ンホメーションしかとることができない。
ペプチドが半剛性であるか又はある程度のコンホメー
ションの剛性を有するように本発明のライブラリーを作
成するために、４つの異なる方法を使用することができ
る。第１の方法では、発現されるペプチドが、予測でき
ない又は変異体の残基内に、又はこれらに隣接して、１
対の非変異体システイン残基を有するように、合成オリ
ゴヌクレオチドが設計される（第1D図参照）。酸化条件
下でこのライブラリーが発現される時、このシステイン
残基は酸化状態になり、ジスルフィド結合により架橋し
てシスチンを形成しやすい。即ちこのペプチドは、剛性
又は半剛性のループを形成する。このシステイン残基を
コードするヌクレオチドは、変異体ヌクレオチド配列か
らアミノ酸６〜27個離れて位置する。
非変異体残基の実際の位置は、本発明による線状ペプ
チドライブラリー中に観察される配置でモデル化するこ
とができる。例えば、セクション６（以下）に例示され
るTSAR−９又はTSAR−12ライブラリーからの多くのTSAR
ペプチドのランダム単離及び配列決定により、挿入され
た合成オリゴヌクレオチドにより２個又は４個のシステ
インがコードされるTSARが得られた。例えば、システイ
ン残基をコードする適切なTGCコドンを含有する、以下
の一般式： （１）Ｘ（NNB）６（TGC）（NNB）11Z（NNB）14（TGC）（NNB）3Y （TSARs−９−6 ＆ 9）； （２）Ｘ（NNB）１（TGC）（NNB）10（TGC）２（NNB）4Z（NNB）８（TGC） （NNB）9Y（TSAR−９−９′）； （３）Ｘ（NNB）16（TGC）（NNB）1Z（NNB）16（TGC）（NNB）1Y （TSAR−９−12′）； （４）Ｘ（NNB）11（TGC）（NNB）6Z（NNB）７（TGC）（NNB）10Y （TSAR−９−13′） により表されるオリゴヌクレオチドによりコードされ
る、TSAR−９−６、９、９′、12′、13′（配列番号１
〜５）のようなペプチドを参照のこと。これらのファー
ジは安定で感染性であるため、システインの位置は耐性
である。
第２の方法では、クローバー葉構造（第1E図参照）を
与える２本鎖オリゴヌクレオチド配列は、例えば、式： Ｘ（TGC）１（NNB）10（TGC）１（NNB）6Z（NNB）２（TGC）１（NNB）14（TGC）
1Y により表すことができる。これらのペプチドが適切なベ
クターで発現される時、システイン残基は３つの異なる
ジスルフィド結合配置をとり、そのため３つの異なるパ
ターンの「クローバー葉」を生成する。この型の剛性ラ
イブラリーにより発現される多数のタンパク、ポリペプ
チド及び／又はペプチドは、最も適するものをそこから
選択するための多くの異なるリガンド結合ポケットを形
成する。上記第１又は第２の型の半剛性ライブラリーが
酸化条件下でウイルスベクターで発現される時には、１
個の付対システイン残基がウイルスベクターと架橋して
これらを非感染性にしやすいため、発現される予測でき
ない又はランダムなペプチド領域内の奇数のシステイン
発生に対して選択が生じやすいことに注意されたい。
第３の方法では、発現される多数のタンパク質が、変
異体ヌクレオチド配列内に位置する非変異体システイン
及びヒスチジン残基の両方を有するように、合成ヌクレ
オチドが設計され、組み立てられる（第1F図参照）。非
変異体残基の位置は、亜鉛フィンガータンパク（zinc−
finger proteins）（即ち、−CX2-4CX12HX3-4H−、ここ
でＸは、任意のアミノ酸である）に見られるシステイン
及びヒスチジン残基の配置に従ってモデル化することが
でき、こうして亜鉛フィンガー様タンパクのライブラリ
ーが生成される。本明細書で使用される「亜鉛フィンガ
ー様タンパク」という用語は、発現されるタンパク上に
亜鉛フィンガー又は類似の構造を与える非変異体のシス
テイン及びヒスチジン残基を含有する任意の発現される
多数のタンパクを意味する。
第４の方法（第1F図参照）では、多数のタンパクが、
変異体ヌクレオチド配列内に位置する非変異体ヒスチジ
ン残基を有するように設計される。非変異体残基の実際
の位置は、例えば、これらのTSARはファージベクターで
発現されると安定で感染性のファージを生じるような、
セクション7.3（例えば、Znl−B7、−B6、−A7、−A12;
配列番号36、37、41、51）に示される亜鉛結合TSARのよ
うな、本発明により同定される亜鉛結合TSAR中に観察さ
れる配置に従ってモデル化することができる。説明のた
め、ヒスチジン含有TSARの例は、以下の一般式： （１）Ｘ（NNB）４（CAC）（NNB）４（CAC）（NNB）8Z（NNB）６（CAC） （NNB）８（CAC）２（NNB）Ｙ（TSAR−Zn1−B7）； （２）Ｘ（NNB）６（CAC）（NNB）９（CAC）（NNB）Ｚ（CAC）（NNB）４（CAC）
２ （NNB）６（CAC）（NNB）（CAC）（NNB）2Y（TSAR−Zn1−B6）； （３）Ｘ（NNB）１（CAC）（NNB）11（CAC）１（NNB）（CAC）（NNB）2Z（NNB）
６ （CAC）（NNB）５（CAC）２（NNB）4Y（TSAR−Zn1−A7）；及び （４）Ｘ（CAC）（NNB）２（CAC）（NNB）９（CAC）（NNB）２（CAC）（NNB）Ｚ （CAC）（NNB）６（CAC）（NNB）４（CAC）（NNB）（CAC）（NNB）3Y （TSAR−Zn1−A12） （式中、CACは、ヒスチジンのコドンを表す）により表
すことができる。この多数のタンパクの剛性クローバー
葉コンホメーションを維持するために、TSARタンパクは
１〜1000μＭの塩化亜鉛の存在下で発現され採取され
る。発現されるタンパクは、Cu2＋やNi2＋のような他の
２価の金属陽イオンで飽和してもよい。この型の剛性ラ
イブラリーのメンバーは、金属イオンがしばしば酵素の
触媒部位内にあるため、有利な化学反応性を有する。具
体的な実施態様において、合成１本鎖ヌクレオチドは、
式:5′Ｘ［α（NNB）ａ］cJZ3′ の第１のヌクレオチド配列を、式： ３′Ｚ′OU［（NNV）ｂβ］dY5′ （式中、ａ、ｃ、ｂ、ｄは、20≦［ａ］ｃ＋［ｂ］ｄ≦
200;かつｃ及びｄは各々≧１である整数であり； αは、コードするペプチドにある構造を与える非変異
体ヌクレオチド配列であり、βは、その相補助ヌクレオ
チド配列が、コードされるペプチドにある構造を与える
非変異体ヌクレオチド配列であり；そして Ｘ、Ｙ、Ｎ、Ｂ、Ｖ、Ｚ、Ｚ′、Ｊ、Ｏ、Ｕは、上記
と同義である）の第２のヌクレオチド配列とアニーリン
グすることにより組み立てられる。
予測できないオリゴヌクレオチドの合成のためのこの
スキームは、（ａ×ｃ）＋（ｂ×ｄ）の算術和、即ち
［ａ］ｃ＋［ｂ］ｄの変形、予測できないヌクレオチド
配列、即ち［（NNB）ａ］ｃ＋［（NNV）ｂ］ｄ、非変異
体ヌクレオチドに隣接される、即ちα及びβの総計を組
み込み、これは構造を与えるアミノ酸配列をコードして
いる。
例として、α及びβは、１個以上のシステイン残基の
コドン、例えばGly−Cys−Gly（この例では、ａ及びｂ
は各々好適には≧６かつ≦27である）を含むことがで
き、発現されるループ形成性ペプチド構造中の異なるシ
ステイン間にジスルフィド結合を生成する。適切なオリ
ゴヌクレオチドは、例えば、式： ５′Ｘα（NNB）ａα（NNB）aZ3′ の第１のヌクレオチド配列を、式： ３′Ｚ′（NNV）ｂβY5′ の第２のヌクレオチド配列とアニーリングすることによ
り組み立てることができる。更に詳しくは、αがGly−C
ys−Gly配列をコードし、βの相補的配列が同一の配列
をコードし、そしてａ及びｂの両方が７に等しい場合
に、合成１本鎖ヌクレオチドは、第１のヌクレオチド配
列:5′Ｘ（GGG）（TGT）（GGG）（NNB）７（GGG）（TG
T）（GGG）（NNB）７（GGG） （TGT）（GGG）３′ を、第２のヌクレオチド配列:3′（CCC）（ACA）（CC
C）（NNV）７（CCC）（ACA）（CCC）Y5′ （式中、GGGは、グリシンのコドンを表し、そしてTGT
は、システインのコドンを表す）とアニーリングするこ
とにより組み立てられる。このオリゴヌクレオチドスキ
ームは、そのアミノ酸配列がGCGX7GCGX7GCGX7GCGである
ペプチドをコードする。
或は、α及びβは、１個以上のヒスチジン残基、例え
ばGly−His−Gly−His−Glyをコードすることができ
る。更に別の実施態様では、α及びβは、ａ及びｂが各
々≦約７であるLeu残基をコードすることができる。こ
のような別の実施態様は、発現されるペプチド中にアル
ファらせん構造を与えるであろう。
更に、また別の実施態様により、ヌクレオチドのアニ
ーリングを促進するための相補的配列を与えるため、α
基はＺの代わりに使用され、βはＺ′の代わりに使用さ
れる。発現されるペプチドに構造的な制約を及ぼすアミ
ノ酸をコードする他のヌクレオチド配列が可能であるこ
とは、上記説明に基づいて当業者には明白であり、それ
らもまた本発明の範囲に包含される。
これらの半剛性ライブラリーの更なる特徴は、ペプチ
ドの剛性を可逆的に破壊するか又は改変することにより
単離物の結合性を制御することができる点である。例え
ば、特定のリガンドに結合したTSARを、還元剤（即ち、
DTT、β−メルカプトエタノール）又は２価の陽イオン
キレート化剤（即ち、EDTA、EGTA）で緩やかに溶出する
ことが可能である。このような試薬は、例えばファージ
ベクターで発現するTSARライブラリーを標的リガンドか
ら溶出するために使用することができる。低濃度のEDTA
又はEGTAは、ファージの完全な形（integrity）又は感
染性を破壊しないようである。
一旦ファージが回収されて、溶液からチオールを除去
することが必要と考えれば、還元されたシステイン残基
は、インドアセトアミドでアルキル化することができ
る。この処理は、ジスルフィド結合形成の回復を妨害
し、ファージの感染性を10〜100倍低下させるだけであ
り、これはファージ培養物は通常1012プラーク形成単位
／ミリリットルの力価に達するため許容される。或は、
溶出試薬は透析により除去することができる（即ち、透
析バッグ、Centricon/Amicon微量濃縮器）。
5.1.2適切なベクターへの剛性オリゴヌクレオチドの挿
入 上述のように調製された適切なサイズの多数のオリゴ
ヌクレオチドは適切なベクターに挿入され、これは適切
な宿主に挿入されるとベクターの発現成分との異種機能
性（heterofunctional）の融合タンパクとして多数のタ
ンパク、ポリペプチド及び／又はタンパクを発現し、こ
れが選択したリガンドに親和性を有するTSARを同定する
ためにスクリーニングされる。更なる実施態様により、
多数のタンパク、ポリペプチド及び／又はペプチドは、
更に結合及びエフェクタードメイン間の連結ドメインよ
りなる。この実施態様の好適なモードでは、連結ドメイ
ンは、多数のオリゴヌクレオチドが挿入されるベクター
のエフェクタードメインとの融合タンパクとして発現さ
れる。
5.1.2.1 線形ライブラリー 当業者は、複数のオリゴヌクレオチドの転写と翻訳を
達成するためには、剛性オリゴヌクレオチドを、選択さ
れたベクター−ホスト系となじむプロモーターの制御下
に置かなければならないことが判るであろう。プロモー
ターはDNA中の一領域であって、そこにRNAポリメラーゼ
が付着して転写を開始する。選択されたプロモーターは
ベクター−ホスト系において機能するものであれば合成
されたものでも単離されたものでもよい。例えば、ホス
ト系としてよく用いられるE.coliは、lacプロモーター
やtrpプロモーターなど多くのプロモーターや、そのバ
クテリオファージやプラスミドのプロモーターを有す
る。さらに、合成されたプロモーターや、pTACプロモー
ターなどの組換え技法で生産したプロモーターもそれに
隣接した遺伝子セグメントを高レベルに発現させるため
に用いることができる。
挿入されたオリゴヌクレオチドを効果的に翻訳するた
めにはシグナルもまた必要である。例えば、E.coliのmR
NAにおいては、リボソーム結合部位は、165のリボーソ
ームRNAの３′末端の塩基に相補的な他の配列の他に、
翻訳開始コドンAUGまたはGUGを含む。Snine/Dalgarno
（S/D）配列など、上記の後者の配列のうちの幾つかが
E.coliおよび他の適切なホスト細胞中で同定されてい
る。ホスト細胞系に適合するどのようなS/D−ATG配列を
も使用することができる。これらのS/D−ATG配列として
は、バクテリオファージλのcro遺伝子またはＮ遺伝子
のS/D−ATG配列、トリプトファンＥ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、Ａ遺
伝子のS/D−ATG配列、および本技術分野において知られ
ている合成S/D配列または他のS/D−ATG配列が挙げられ
るがこれらに限定されるものではない。このように、調
節要素はポリペプチドやタンパク質の発現を制御して細
胞中で反応剤が合成されるように仕向けるとともに、ホ
スト細胞にとって毒性であるかもしれない産物が合成さ
れて細胞の成長を阻害する結果となるのを防ぐ。
様々なベクターの何れをも本発明方法において使用す
ることができる。このようなベクターの例としては、0X
174、λ、M13やその誘導体であるfl、fd、Pflなどのバ
クテリオファージベクター、ファージミドベクター、プ
ラスミドベクター、バキュロウイルスベクターなどの昆
虫ウイルス、パルボウイルスベクター、アデノウイルス
ベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイル
スベクターなどを含む哺乳類細胞ベクター、Tyl、キラ
ー粒子などの酵母ベクターが挙げられるがこれらに限定
されるものではない。
適切なベクターは、TSARの発現および／または検出を
助けるため、TSARのエフェクタードメインをコードする
遺伝子を含有するかまたはこれを含有するように処理さ
れる。エフェクタードメイン遺伝子は多数のクローニン
グ部位を含有するかまたはこれを含有するように処理さ
れる。そのような遺伝子における少なくとも二つの異な
った制限酵素部位は、ポリリンカーを有しており、好ま
しい。ベクターDNAは、ポリリンカー内で二つの異なっ
た制限酵素によって切断され、上述したように組み立て
られる二本鎖合成オリゴヌクレオチドの末端に相補的な
末端を生成する。好ましくは、切断後のベクター末端
は、自己連結しない非適合性粘着端を有するか、または
DNAポリメラーゼを用いて自己連結しない非適合性粘着
端を有するように修飾され、これによって二本鎖合成オ
リゴヌクレオチドの挿入、さらにTSAR融合タンパク質、
ポリペプチド、および／またはペプチドを発現するリコ
ンビナントが形成される。この二本鎖合成オリゴヌクレ
オチドは、DNAリガーゼを用いて、適切に切断されたベ
クターに連結される。
本発明の発明者は、驚くべきことに、ベクター表面上
で発現される異機能性融合タンパク質として、TSARをベ
クター（例えばファージやプラスミド）に発現させよう
とする場合に、当該ベクターのポリリンカー領域内に
「スタッファーフラグメント（stuffer fragment）」を
含ませるようにすることが特に有用であることを見いだ
した。本発明においては「スタッファーフラグメント」
は、クローニングにおいて有用な、少なくとも２つの制
限酵素部位によってフランキングされた公知のDNA配列
である。比較的短い（約24−45長）ヌクレオチドを包含
するものであり、このDNA配列は公知のモノクローナル
抗体のエピトープなどの公知のリガンドによって認識さ
れる結合部位をコードする。スタッファーフラグメント
の末端の制限酵素部位は、合成二本鎖オリゴヌクレオチ
ドを挿入するのに有用であり、これによりスタッファー
フラグメントが削除される。発現された異種融合タンパ
ク質とスタッファーフラグメントを含有するプラスミド
ベクターまたはファージとの間の物理的な結合によっ
て、また、スタッファーフラグメントが免疫活性を有す
るタンパク質（すなわち免疫マーカー）をコードする公
知のDNA配列を包含することによって、スタッファーフ
ラグメントの存否な容易に検出することができる。この
検出は、DNAシーケンシング、PCR、またはハイブリダイ
ゼーションを用いてヌクレオチドレベルで、あるいは例
えば免疫学的検定法を用いてアミノ酸レベルで容易に行
うことができる。そのような測定は、合成二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを挿入して得られるリコンビナント（TSAR
発現）ベクターと非リコンビナントベクターとを迅速に
差別化しうるものである。
一つの有利な様相においては、スタッファーフラグメ
ントを使用することにより、ベクター内の従来のポリリ
ンカーを使用する場合に頻繁に遭遇する問題、即ちポリ
リンカーの制限部位が接近しすぎており、隣接する部位
を独立して分割し、同時に使用することができないとい
う問題を避けることができる。
本発明の好適な実施例によれば、スタッファーフラグ
メントは、ネズミモノクローナル抗体9E10（イーバン
（Evan）ら、1985年、Mol.Cell.Biol.5:3610−3616）に
よって認識されるヒトｃ−mycタンパク質のエピトープ
をコードするDNAフラグメントを含有する。このネズミ
モノクローナル抗体9E10は、アミノ酸の短いフランキン
グ配列を制限酵素部位として働く５′および３′末端に
有し、この制限部位を使用して合成二本鎖オリゴヌクレ
オチドを挿入することができる。したがって、好ましい
スタッファーフラグメントは、9E10モノクローナル抗体
によって認識されるｃ−mycタンパク質のエピトープを
コードするDNAを含有しており、9E10モノクローナル抗
体は、アミノ酸配列EQKLISEEDLN（配列番号６）と少数
のフランキングアミノ酸をNH2およびCOOH末端に有し、
これらはスタッファーフラグメントを除去し、合成二本
鎖オリゴヌクレオチドを挿入するための適切な制限酵素
部位を提供する。
本発明者によって思いがげず発見されたように、“ス
タッファー”フラグメントを使用することによりTSARラ
イブラリーが提供された。このライブラリーにおいて
は、見出される非組換え体の数が驚くほど少ない。例え
ば、スタッファーフラグメントがｃ−mycタンパク質の
エピトープを含む、下記第６節に例示されたSAR−９ラ
イブラリーおよびTSAR−12ライブラリーでは、TSARを発
現するベクターの約５％以下のものが、非組換え体であ
ることが発見された。これは必要とされるTSAR結合タン
パク質を同定するために選択される多数の候補を提供で
きるため、特に有利である。
出願人は次に理論的説明を述べるが、これは、本発明
の方法において採用されるベクターにスタッファーフラ
グメントを含有させることによって、非組換え体の数が
有利なことに非常に少なくなることを説明する特定のカ
ニズムまたは理論に限定することを意図するものではな
い。
スタッファーフラグメントの挿入により、非組換え体
ベクターをかなり且つ比較できる程度に弱体化すること
ができ、この結果、非組換え体と組換え体ベクターの成
育の差が最小になる。このように成育の差を最小にする
ことにより、非組換え体が組換え体を過育成させること
を阻止する。また、そのような有利な最小化は、特に、
本TSARライブラリにおけるように、二本鎖合成オリゴヌ
クレオチドが大型である場合において、組換え体ベクタ
ーの生産を効率よく行うのに特に有用である。
本発明の他の様相においては、スタッファーフラグメ
ントは、必要であれば、非組換え体ベクターを除去し
て、TSAR発現ベクターのポピュレーションを増やすため
の効率的な手段を提供する。スタッファーフラグメント
は、例えば、非組換え体ベクターの表面上に免疫学的に
活性な表面タンパク質を発現するため、例えば、固定化
された抗体に対して結合するためのアクセス可能な目的
物質を提供する。したがって、非組換体は、例えば、抗
体を固定したカラム上の連続通路によってライブラリー
から簡単に除去でき、ライブラリー中のTSAR発現ベクタ
ーのポピュレーションを増やすことができる。
好適な実施例においては、ベクターが糸状バクテリオ
ファージであるか、またはベクターを糸状バクテリオフ
ァージから得る。M13、fl、fd、Pfl等に限定するもので
はないが、その例には、ファージ構造タンパク質、好ま
しくは、p III、p VIII等のファージコートタンパク質
をコードするベクターを含む。より好ましい実施例で
は、糸状ファージm655、m663（図２のイラスト参照）
や、フォールクス（Fowlkes）ら（1992年、BioTechniqu
es、13:422−427）によって記載された、構造コートタ
ンパク質p III（配列番号７）をコードするm666等のM13
由来のファージベクターである。
ファージベクターは、バクテリオファージ構造タンパ
ク質をコードする遺伝子の５′領域に位置するクローニ
ング部位を含むように選択されるか、そのように製作さ
れ、これにより複数の挿入された合成二本鎖オリゴヌク
レオチドがバクテリオファージの表面上に融合タンパク
質として発現する。有利なことに、これによって複数の
アクセス可能な発現したタンパク質／ペプチドを提供で
きるだけでなく、タンパク質／ペプチドと挿入されたオ
リゴヌクレオチドとの間の物理的な結合を提供し、同定
されたTSARをスクリーニングしたり、配列決定したりす
ることが容易になる。或いは、そのベクターは、構造タ
ンパク質をコードする遺伝子の３′領域に近接したクロ
ーニング部位を含むように選択されるか、そのように作
られ、これにより複数の発現したタンパク質がＣ端末融
合タンパク質を構成する。
好適な実施態様によれば、構造バクテリオファージは
p IIIである。フォールクスにおいて述べられ、図２に
示されたm663ベクターが下記第６章において例示する実
施例で使用された。m663は、Ｎ末端の端に導入されたXh
o IおよびXba I制限部位によってフランキングされた
“スタッファーフラグメント”を含むｃ−mycエピトー
プを有するp IIIを含む。そのライブラリーは、複数の
合成オリゴヌクレオチドを、好適なベクター、好ましく
はp IIIタンパク質の成熟したコートタンパク質のＮ末
端に近接したクローニング部位にクローニングすること
によって作られ、これにより、オリゴヌクレオチドは、
コートタンパク質−融合タンパク質として発現する。
他の実施態様によれば、複数のオリゴヌクレオチドが
ファージミドベクターに挿入される。ファージミドは、
欠損介助ファージと共に用いられ、失われたウイルスタ
ンパク質や複製機能を提供する。M13由来ファージミド
のウイルス粒子としての増殖に有用な介助ファージとし
ては、限定するものではないが、M13ファージK07、R40
8、VCS等が挙げられる。好適なファージミドベクター
は、下記第８章の詳細な例において述べられている。一
般的には、本実施例（図３参照）の好ましい態様によれ
ば、適切なファージミドベクターは、Bluescript IISK
＋ベクター（GenBank ＃52328）（アルチング−ミーズ
（Alting−Mees）ら、1989年、Nucl.Acid.Res.17（2
2）:9494頁）を処理することによって構築され、（１）
M13K p III遺伝子の切断された部分、即ち、成熟したp
IIIのアミノ酸残基198−406をコードするヌクレオチ
ド、（２）上流リボソーム結合位置とPst I、Xho I、Hi
nd IIIおよびXba I制限部位の短いポリリンカーにリー
ドされるPelB信号、これにおいてXho IとXba I位置は合
成された二本鎖オリゴヌクレオチドがクローン化でき、
m663ファージベクターとして同じリーディングフレーム
に発現できる、および（３）ポリリンカーとp III遺伝
子との間にgly−gly−gly−gly−serをコードするリン
カー配列を含有する。
本発明の他の実施態様によれば、合成されたオリゴヌ
クレオチドはプラスミドベクターに挿入される。TSARラ
イブラリーを発現するための好ましいプラスミドベクタ
ーの例は、図４に示されたプラスミドp340−１（ATTC
No.40516）の誘導体である。
発現ベクターとして好適なp340−１誘導体を得るため
に、Nco I−Bam HIフラグメントをp340−１プラスミド
から除去し、正しいリーディングフレームにXho IとXba
I制限部位を有する二本鎖配列によって置換する。実際
には、p340−１を、制限酵素を用いてBgl II及びXba I
部位において切断しし、２つのオリゴヌクレオチドを用
いてアニーリングする：（１）５′−CATGGCTCGAGGCTGA
GTTCTAGA−３′（配列番号８）、およびNco IおよびBam
H I粘着性端を有する５′−GATCTCTAGAACTCAGCCTCGAGC
−３′（配列番号９）。E.coliの結さつと転換の後、p3
40−1Dと命名された、必要とされるプラスミドを含むリ
コンビナントを、挿入された配列番号８および９に基づ
いて選択し、配列決定で確認する。親のp340−１のよう
に、必要とされるp340−1Dは機能的なβ−ガラクトシダ
ーゼを産生しない。これは、その遺伝子がフレームの外
にあるためである。したがって、合成二本鎖オリゴヌク
レオチドを、Xho IとXba I制限部位を用いてp340−1Dベ
クターに挿入する場合、リーディングフレームが回復さ
れ、TSAR結合ドメインは、β−ガラクトシダーゼを有す
る融合タンパク質として発現する。IPTGに暴露された場
合、TSARライブラリーを発現するベクターは、同定可能
な青色のコロニーを産生する。
本発明によるTSARライブラリーの発現に有用なプラス
ミドベクターの他の例は、プラスミドpLamBと命名され
たプラスミドpTrc99Aのプラスミド誘導体であり、複数
の挿入されたオリゴヌクレオチドがLamBタンパク質の融
合タンパク質として発現するクローニング部位を有する
E.coliのLamBタンパク質を含むように作られる。
このLamBタンパク質は、セル当たり何千ものコピーに
おいて発現する約47kのDaltonsのE.coliのトリメトリッ
クな外部膜タンパク質である。LamB遺伝子は既に配列決
定されている（クレメント（Clement）およびホフナン
（Hofnung）、1981年、Cell 27:507−514）。このタン
パク質のコンピュータモデリングは、16のトランスメン
ブランドメインを含む可能性があり、特定のペプチドル
ープは細胞の外側に露出されており、他は周辺質に向い
ていることを示唆している。さらに、LamBのアミノ酸残
基153における挿入によって、E.coliの表面に天然のcDN
Aまたは遺伝子フラグメントが発現した（シャービット
（charbit）ら、1988年、Gene 70:181−189）。60アミ
ノ酸残基の長さまでをコードするインサートでも、LamB
タンパク質の機能を維持できた。
LamB遺伝子にクローニング位置を含むプラスミドに本
発明の合成オリゴヌクレオチドを挿入することは、数々
の理由により有用である。第１に、このプラスミドを発
現するリコンビナントバクテリアは、TSARライブラリー
を発現するための有用なファージベクターに似かよった
ものとなる。即ち、各細胞が、細胞の外側に近接できる
ように発現された予想できないペプチドを有しており、
また各細胞は、その予想できないペプチドをコードする
DNAを有している。このペプチドとそのコーディング要
素との間の物理的な結合は、そのライブラリーを種々の
スクリーニング計画によって調べることを可能にする。
第２に、その予期できないペプチドは、LamBタンパク質
の中央に発現するため、E.coliメンブランへの挿入によ
って基部が係留されたループ内に配座的に拘束される。
これは、多くの配座をもっと自由にとることができる、
M13 p III分子のＮ末端に予想できないペプチドがある
場合と対照的である。第３に、プラスミドを用いた場合
のE.coliの転換率は、M13ファージDNAを用いた場合に比
べ高い（即ち10倍を越える）ため、より大きなTSARライ
ブラリー（即ち、より多くのリコンビナント）を発生で
きる。
アマン（Amann）ら、1988年、Gene 69:301−315（フ
ァーマシア、ニュージャージー州ピスカタウエイ）によ
って述べられた、アンピシリン耐性のプラスミドpTrc99
aは、lacリプレッサーのための遺伝子（lac IQ）有し、
Ptacプロモータとして知られている誘導可能なプロモー
タとその転写は、培養細菌にIPTGを加えることによって
誘導される。プロモータの下流は、Shine−Dalgarno配
列、ATG開始コドン、制限部位ポリリンカー、および強
い転写ターミネータである。
図５（Ａ−Ｂ）は、pLamBベクターの調製を示す。Lam
B遺伝子をpTrc99aに誘導するために、E.coliのLamB遺伝
子をPCRによって増殖する。aa １−153と152−421から
の２つのセグメントにおいて遺伝子が増殖され、それと
同時にコドン153と154の間にXho IとXba I部位が作られ
るようにオリゴヌクレオチドが設計される。pTrc99aはN
co IとHind IIIによって切断し、両方のフラグメントを
単純な結さつによって導入して、pLamBと命名されたベ
クターを得た。そのpLamBベクターは、ｃ−myc表面フラ
グメントまたは合成二本鎖オリゴヌクレオチドがクロー
ンでき、かつm663ベクターと同じリーディングフレーム
内に発現できるように位置決めされたXho IおよびXba I
部位を含む。
本発明の本実施例の他の態様によれば、修飾されたpL
amBプラスミド内において、複数の合成オリゴヌクレオ
チドをLamB遺伝子のＣ末端に発現させることができる。
これは、LamB遺伝子のXba I部位に停止コドンを導入し
て修飾されたベクターをつくり出すことによって容易に
達成できる。これに替え、本発明に従って組み立てられ
た二本鎖合成オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチ
ドにおける最後の（NNV）とＹとの間に停止コドンを挿
入することにより、合成中に修飾できる。LamBタンパク
質は、トランキレートされ機能的でなくなっている（即
ち、もはやマルトース吸収において、もしくはファージ
レセプターとして機能しない）が、タンパク質は必須で
ないので、細胞は生存可能な状態を維持する。Ｃ末端で
発現したTSARペプチドは、LamBタンパク質内で発現した
場合に比べ、より多数の配座を取ることができる。
5.1.2.2. 二分子のライブラリー 本発明の他の実施態様によれば、図1Cに示したような
二分子の配座を有する、複数のタンパク質、ポリペプチ
ド、および／またはペプチドを発現するようにライブラ
リーが構成される。このライブラリーは数々の有利な面
を有する。第１に、二分子の対合を形成するプロセスに
おいてポケットが形成される。このポケットは、“鍵”
のための“錠（ロック）”、即ち種々の大きさの分子を
作る。第２に、特定の突然変異株である予想できないペ
プチド配列を他のものと種々の組み合わせで組み合わせ
ることにより、多数のポケットが形成され、これらから
最も適合するものが選択される。第３に、二分子ライブ
ラリーにおける組み合わせ的対合は、ライブラリーの
“複雑さ”を増すための非常に有効な手段である。この
複雑さは、二分子の組の数の２乗に比例して増加する。
二分子ライブラリーを調製するためには、オリゴヌクレ
オチドを合成し、下記の方法に従って組み立てる。この
方法の鍵となる特徴は、一対のヘテロダイマー化（hete
rodimerization）ドメインを、発現したペプチドをコー
ドする、突然変異種かまたは予想できないオリゴヌクレ
オチドに隣接する好適なベクター内のリンカードメイン
として利用していることである（リンカードメインのよ
り詳細な記載については下記第5.3章参照）。ヘテロダ
イマー化ドメインは、短く、約31以下のアミノ酸をコー
ドし、また簡単にはホモダイマーを形成しない。ヘテロ
ダイマー化ドメインの例には、例えば、コラーゲン、ケ
ラチン、イーストタンパク質GCN4ヘリックス−ターン−
ヘリックスモーティフス、ロイシンジッパーモーティフ
スだけでなく、ｃ−fosやｃ−jun（概要については、コ
ステンリー（Kostenly）ら、1992年、J.Immunol.148:15
47−1533、およびオーシェア（Ｏ′Shea）ら、1992年、
Cell.68:699−708参照）において発見される、αヘリッ
クスまたはヘリカル構造のような構造を含む。ヘリック
ス−ターン−ヘリックスモーティフスを含むタンパク質
は、パボ（Pabo）およびサウアー（Sauer）、1984年、A
nn.Rev.Biochem.53:293において検討されている。
1985年、ベルグ（Berg）（1986年、Sience 232:48
5）は、核酸結合および遺伝子の調節に関与する５種類
のタンパク質は、小さい独立構造の金属結合ドメイン
（亜鉛フィンガーと呼ばれる）を形成できることを述べ
ている。この５種類とは、１）配列Cys−X2−Cys−X4−
His−X4−Cys（配列番号10）の一つのコピーを有するレ
トロウイルスの小ギャグ形核酸結合タンパク質;2）Cys
−X2−Cys−X13−X2−Cys（配列番号11）を有するアデ
ノウイルスE1A遺伝子産物;3）Cys−X2−Cys−X9−Cys−
X2−Cys（配列番号12）を有するtRNAシンセターゼ;4）C
ys−X2−Cys−X11-13−His−X2−His（配列番号13）のS
V40およびポリオーマウイルスのラージＴ抗原；および
５）Cys−X3−His−X5−Cys−X2−Cys（配列番号14）を
有するバクテリオファージである。なお、Ｘは任意のア
ミノ酸である。これらの配列は、金属結合ドメインに含
まれている。“ロイシンジッパー”は、エンハンサー結
合タンパク質、またはラット肝核のEBP（ランドシュル
ツ（Landshultz）ら、1988年、Science 240:1759）中
の８個のヘリカルターン全体にわたる７番目毎の位置に
存在するロイシンの周期的な繰り返しである。この領域
内のαヘリックスは、ヘリックスの一側が疎水性のアミ
ノ酸によって構成され、ヘリックスの他側は、チャージ
を有する側鎖とチャージを有しない極側鎖とを有する両
親媒性を呈することに着目し、著者は、この構造は普通
でないヘリカルの安定性を有し、タンパク質ドメイン相
互およびタンパク質ドメイン内での相互作用を含むヘリ
カルタンパク質ドメインの嵌合、即ち“ジッパーリン
グ”を可能とすると提案した。もっと最近では、チャク
ラバーティー（Chakrabarrty）ら（1991年、Nature 35
1:586−588）は、αヘリカルパターンは、アミノ酸配列
Leu−Ｘ−Leu−X2−Leu−X3等によって発生され、ラン
ドシェルツが示したように７番目毎だけではないことを
示した。さら、α螺旋構造を増加した配列は、アミノ酸
配列Glu−Ala−Ala−Ala−Arg−Ala−Ala−Glu−Ala−A
la−Ala−Arg（配列番号15）を用いることによって得ら
れる（メルトゥカ（Merutka）ら、1991年、Biochem.30:
4245−4258）。下記の方法では、説明を簡単にするため
に、ヘテロダイマー化ドメインｃ−fosとｃ−junに関し
てのみ記載する。これは実施例の範囲をこれらの例に限
定することを意図するものではない。上記のヘテロダイ
マー化ドメインは、発明の本実施例において同様に採用
できる。
上記第5.1.1.1章に記載された二本鎖合成オリゴヌク
レオチド配列の合成と構築の後、その配列は適切なベク
ターに挿入される。２つの別々のサブライブラリーが作
られる。即ち、（１）ヌクレオチドｃ−fosダイマー化
（dimerization）ドメインに隣接して配列決定された合
成オリゴヌクレオチドを有するもの、即ち、アミノ酸TD
TLQAETDQLEDKKSALQTEIANLLKEKEKL（配列番号16）を含む
アミノ酸残基162−193、および（２）ｃ−junダイマー
化ドメインに隣接して配列決定された合成オリゴヌクレ
オチドを有するもの、即ち、ベクターのアミノ酸IARLEE
KVKTLKAQNSELASTANMLREQVAQL（配列番号17）を含むアミ
ノ酸残基286−317である。各サブライブラリーにおいて
ホモダイマー化の程度が最小になるように条件を決定す
る。ホモダイマー化を最小にする条件には、例えば、フ
ァージミドベクター、一対のシステイン残基によるダイ
マー化ドメインのフランキング、タンパク質質分解の制
限、および／またはpH条件の変更などが含まれる。２つ
のサブライブラリーは、ウイルス粒子と１対１の割合で
共に混合され、ヘテロダイマー化を促進するために適切
な条件に晒される。もしサブライブラリーの各々が108
個の異なったメンバーを含んでいれば、各サブライブラ
リーの1016個のウイルス粒子が共に混合され、1016個の
異なった二分子の組み合わせを発生する。例えば、サブ
ライブラリーからのファージ（またはベアリングファー
ジミド）によって感染したバクテリアを含む培養物10リ
ットルを一晩放置すると、100ml未満の容量中に再懸濁
できる1016個の粒子を得ることができる。このダイマー
化されたファージまたはファージミドの粒子は、二分子
のペプチドライブラリーを構成する。
二分子ライブラリーの他の形態は、下記のようにして
構成される。一つの実施例においては、合成オリゴヌク
レオチドは、同一の細胞内において可溶性およびp III
融合タンパク質として発現する。感染したバクテリアの
細胞が両方の形の分子を発現する場合、ヘテロダイマー
化ドメインは、両方の形の分子が細胞周辺腔と結合し、
M13粒子の表面に移動できるようにする。この方法は、
ファージの表面での重鎖または軽鎖の抗体分子の構築に
似通っている（ホーゲングーム（Hoogengoom）ら、1991
年、Nucl.Acids.Res.19:4133−4137）。他の実施例で
は、一本鎖合成オリゴヌクレオチドp III融合タンパク
質が両方のダイマー化ドメインを含み、分子内において
相互作用を起こす。この方法は、ファージの表面での一
本鎖の抗体の発現に似通っている（バーバス（Barbas）
ら、1992年、Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA、89:4457−446
1）。
5.1.3 ベクターの発現 適切な発現ベクターの調製が終わると、それらを、E.
coli、Bacillus subtilis、昆虫細胞、哺乳動物細胞、
酵母細胞等の適切な宿主に、例えば、エレクトロポレー
ションによって移入し、移入された宿主細胞を、コロニ
ーまたはファージの産生に適した培養条件下で培養する
ことによって複数のオリゴヌクレオチドを発現させる。
宿主細胞は、プロテアーゼ欠損であることが好ましく、
サプレッサーtRNA遺伝子を有していても、有していなく
てもよい。
エレクトロポレートされた細胞の少量の分割量をプレ
ートに塗布し、コロニーまたはプラークの数を数えて組
換え体の数を測定する。宿主細胞中の組換えベクターの
ライブラリーを高い濃度でプレートに塗布し、組換えベ
クターの単一増幅を行なう。
例えば、本発明による合成二本鎖オリゴヌクレオチド
を含むように処理された組換えM13ベクターのm666、m65
5またはm663（図２参照）をDH5αＦ′E.coli細胞にエレ
クトロポレーションによって移入する。TSARが、宿主の
E.coli細胞から押し出されたウイルスカプシドの外表面
上に発現し、スクリーニングに適用可能となる。親であ
るm666、m655またはm663ベクターは、ｃ−mymスタッフ
ァーフラグメントを含んでいる。二本鎖合成オリゴヌク
レオチドがXho I部位とXba I部位との間に挿入される場
合、スタッファーフラグメントは除去される。発現した
ライブラリーのクローニング効率は、ｃ−mycスタッフ
ァーフラグメントを認識する9E10抗体を用いたフィルタ
ーブロッティングによって簡単に測定できる。
一方、二本鎖合成オリゴヌクレオチドがちょうどXho
I部位とXba I部位にクローニングされた場合、スタアッ
ファーフラグメントは残留する。そして、ベクターによ
って発現したp III融合タンパク質内にｃ−mycエピトー
プが発現する。m663ベクターの利点は、XgalおよびIPTG
上に塗布されたE.coli内で発現した時に青色の点として
容易に観察できる無傷のLacZ+遺伝子を含んでいること
である。
TSARは、E.coliなどの細菌宿主細胞に含まれるプラス
ミドベクター内で発現できる。TSARのタンパク質は、E.
coli細胞中に蓄積し、細胞の溶解産物をスクリーニング
のために調製する。プラスミドp340−1Dの使用について
は、実施例（図４参照）に記載されている。上記したよ
うなp340−1D内におけるTSARライブラリーは、β−ガラ
クトシダーゼとともに、共機能性融合タンパク質を発現
した。親のベクター（合成オリゴヌクレオチドを持たな
い）においては、β−ガラクトシダーゼがフレーム外に
あり、機能しない。アンピシリン、IPTGおよびXgalを有
するLBプレート上に塗布したとき、TSARオリゴヌクレオ
チドを有するコロニーは青色のコロニーを産生する。こ
れに対し、組換え体でないp340−1D、即ち抑制されてい
ない停止コドンを有するオリゴヌクレオチドを持つp340
−1D組換え体を含むコロニーは白くなる。青と白のコロ
ニーの相対的な数により、組換え体の割合が明らかとな
り、ライブラリー中の組換え体の総数の見積に便利であ
り、またスクリーニングにおいても便利である（下記第
5.2章参照）。
合成された二本鎖オリゴヌクレオチドを含むpLamBプ
ラスミドベクターは、E.coli細胞中にエレクトロポレー
ションすることができ、転換は、アンピシリンを有する
LBプレート上で選択される。37℃で一晩インキュベート
すると、プレートはLBで覆われ、細胞を回収するととも
に、全てのプレートからの細胞がプールされる。これら
の細胞にグリセリンを20％加え、分割量を−70℃で保存
し、スクリーニングに使用するE.coliの外膜に発現した
TSARのスクリーニングのために使用する。
合成された二本鎖オリゴヌクレオチドを含有し押し出
されたファージの外面に発現したファージミドベクター
は、感染細菌またはヘルパーファージを有するバクテリ
オファージとして増殖する。
発現したpDAF2−３ファージミドは、融合p IIIタンパ
ク質のための“エピトープタブ”として機能するｃ−my
c遺伝子を含んでいるという利点も備えている。ファー
ジミドゲノムを有するファージの約0.1〜10％が融合p I
II分子と合体する。キメラ状のp IIIタンパク質が無傷
であることは、ｃ−mycエピトープの発現に基づいて評
価できる。9E10抗体を用いてｃ−mycエピトープの発現
を引続き行なうことにより、融合p III分子がM13ウイル
ス粒子に完全に組み込まれたことを監視することができ
る。
pDAF2−３を発現する場合、9E10抗体を用いてｃ−mym
ペプチドの上流を免疫学的に検出でき、これにより下流
側の合成されたオリゴヌクレオチドである発現したTSAR
ペプチドは適切に発現したものと推定できる。
さらに、E.coliの幾つかの異なった株をエレクトロポ
レーションし、同じライブラリーの異なったバージョン
を確立することは価値あることである。もちろん、スク
リーニング実験の全体を通じて同じE.coli株を使用しな
ければならない。この戦略は、ペプチド−p III融合タ
ンパク質の配列の特性に起因して、ウイルスの構築、分
泌および、個々のM13組換え体の感染率に対して、生態
内での生物学的選択が、ポジティブおよびネガティブの
両方に行なわれる可能性があることを考慮したものであ
る。したがって、異なるゲノタイプ（即ち、シャペロン
過発現、または分泌の増加）を有するE.coliは、細菌宿
主として機能する。何故なら、それらは、微妙に、予想
できないように相違するライブラリーを産生するためで
ある。
5.2. TSARの同定方法：ライブラリーのスクリーニング 一旦ライブラリーが本発明方法によって構築された
ら、このライブラリーをスクリーニングして、選択した
あるリガンドに対して結合親和性を有するTSARを同定す
る。上述したように、本発明においては、リガンドと
は、分子であると分子の一部分であるとを問わず、その
リガンドに対するタンパク質レセプターが天然に存在す
るかあるいは本発明方法によってそのようなタンパク質
質レセプターが調製可能である物質をいう。よって本発
明においてはリガンドはTSARの結合ドメインと特異的に
反応する物質であって、その例としては、化学上の基、
イオン、金属、タンパク質、糖タンパク質あるいはその
一部、ペプチドあるいはその一部、核酸あるいはその一
部、ショ糖、炭水化物あるいは炭水化物重合体、脂質、
脂肪酸、ウイルス粒子あるいはその一部、膜ベシクルあ
るいはその一部、細胞壁成分、合成有機化合物、生体有
機化合物および無機化合物が挙げられるが、これらに限
定されるものではない。
本発明のTSARライブラリーのスクリーニングは、当業
者に知られている各種方法によって行うことができる。
もしTSARが細胞表面分子を有する融合タンパク質とし
て発現されれば、スクリーニングにあたってはベクター
を固定化標的リガンドと接触させてこのリガンドに結合
するベクターを収穫するのが有利である。このような有
用なスクリーニング方法は「パンニング」技法と呼ばれ
るものであって、Fowlkesらによる“BioTechniques"13
（３）422−27（1992年）に記載されている。本ライブ
ラリーをスクリーニングするのに有用なパンニング法に
おいては、標的リガンドは、プレート、磁性ビーズなど
のビーズ、セファロースなどの上に固定化される。ビー
ズはカラム中で使用される。ある特定の態様において
は、固定化された標的リガンドはビオチンや２−フルオ
ロクローム等を用いて「タッグ貼付（tagged）」してFA
CSソーティングを行う。
TSARを発現するファージのライブラリーであるファー
ジとプラスミドベクターのスクリーニングは、磁性ビー
ズを用いて次のように行うことができる。磁性ビーズ製
造業者の指示に従って標的リガンドを磁性ビーズに結合
する。ビーズと未反応基に対する非特異的結合を阻止す
るために、ビーズを過剰量のBSAとともにインキュベー
トする。次にPBS−0.05％Tween20中にビーズを何度も懸
濁させて洗浄し、プラスチック試験管の壁に沿って強力
な磁石で回収する。その後ビーズは使用時まで冷蔵保存
される。
スクリーニングの実験においては、ライブラリーの分
割量を、再懸濁させたビーズ試料と混合する。試験管の
内容物を４℃で１−２時間攪拌する。強力磁石で磁性ビ
ーズを回収し、液体は吸引除去する。ビーズにPBS−0.0
5％Tween20を加え、試験管を数回反転してビーズを再懸
濁させ、次いでビーズを磁石で試験管壁へと引き寄せな
がら洗浄する。試験管内容物を除去し、さらに５−10回
洗浄を繰り返す。50mMのグリシン−HCl（pH2.2）、100
μg/mlのBSA溶液を洗浄されたビーズに加え、タンパク
質を変性させるとともに結合したファージを遊離させ
る。短いインキュベーション時間の後、ビーズを強力磁
石で試験管壁に引き寄せ、液体分は清浄な試験管に移
す。1MのTris−HCl（pH7.5）または1MのNaH2PO4（pH7）
を試験管に加えてファージ試料のpHを中性とする。次い
でファージを例えば10-3から10-6に希釈し、分割量をE.
coliDH5αＦ′細胞でプレーティングして試料中のプラ
ーク形成ユニットの数を決定する。ある場合にはプレー
ティングをXGalおよびIPTGの存在下で行い、プラークを
色で識別する（即ちlacZ+プラークは青、lacZ-プラーク
は白）。試料の力価も比較のために決定する（希釈率は
通常10-6から10-9）。付加的詳細については下記第7.1
章を参照されたい。
あるいはTSARを発現するファージのライブラリーのス
クリーニングは次のようにしてマイクロタイタープレー
トを用いて行うことができる。標的リガンドを例えば10
0nMのNaHCO3（pH8.5）に希釈して、リガンド液の小分割
量をマイクロタイタープレートのウェルに（例えば４℃
で一夜インキュベートすることにより）吸着させる。BS
A溶液（1mg/ml、100mMのNaHCO3、pH8.5）の分割量を加
え、プレートを室温で１時間インキュベートする。マイ
クロタイタープレートの内容物を除去し、ウェルをPBS
−0.05％Tween20で注意深く洗浄する。未結合標的物質
が存在しなくなるまでプレートを繰り返し洗浄する。フ
ァージ溶液の小分割量を各ウェルに導入し、ウェルを室
温で１−２時間インキュベートする。マイクロタイター
プレートの内容物を捨て繰り返し洗浄する。プレートの
各ウェルに洗浄液を加え室温で20時間インキュベートし
て解離定数が大きく解離が早い結合ファージを遊離させ
る。次いでウェルをさらに５回洗浄して全ての未結合フ
ァージを除去する。
ウェルに結合したファージを回収するにはpH変化を利
用する。50mMのグリシン−HCl（pH2.2）の分離量、100
μg/mlのBSA溶液を洗浄されたウェルに加え、タンパク
質を変性させるとともに結合したファージを遊離させ
る。５−10分後、内容物を清浄な試験管に移す。1MのTr
is−HCl（pH7.5）または1MのNaH2PO4（pH7）の小分割量
を試験管に加えてファージ試料のpHを中性とする。次い
でファージを例えば10-3から10-6に希釈し、分割量をE.
coliDH5αＦ′細胞でプレーティングして試料中のプラ
ーク形成ユニットの数を決定する。ある場合にはプレー
ティングをXGalおよびIPTGの存在下で行い、プラークを
色で識別する（即ちlacZ+プラークは青、lacZ-プラーク
は白）。試料の力価も比較のために決定する（希釈率は
通常10-6から10-9）。他の代替的な方法によれば、TSAR
のライブラリーのスクリーニングは以下に記すように最
初に「富化」段階、次いでフィルターリフト段階（filt
er lift step）を経る方法によって達成することができ
る。
先ず、与えられたリガンドに結合可能で、発現された
TSARライブラリー（例えばファージ中で）から得られた
TSAR（「陽性体（positives）」を、パンニングや親和
クロマトグラフィーを１回ないし２回繰り返すことによ
って富化する。選択したリガンドでマイクロタイマーの
ウェルを受動的にコーティングする（例えば100μｌ中
約10μｇ）。非特異的なTSARがプラスチック表面に付着
するのを防ぐために、ウェルをBSA溶液でブロックす
る。TSARを発現する約1011の粒子をウェルに加え数時間
インキュベートする。未結合TSARは、プレートの洗浄を
繰り返すことによって除去し、特異的に結合したTSAR
を、酸性グリシン−HCl溶液あるいは他の溶出バッファ
ーを用いて溶出させる。溶出したTSARファージ溶液はア
ルカリで中性とし、更に、例えばE.coli感染と寒天−ブ
ロスを含有する大ペトリ皿上へのプレーティングによっ
て増幅する。
TSARを発現する増幅された培養物の力価を測定し、こ
のプロセスを繰り返す。あるいは、市販されている活性
化ビーズ試薬を用いて、リガンドを共有結合的にアガロ
ースやアクリルアミドビーズに結合させることもでき
る。TSAR溶液はその後、結合したビーズマトリックスを
含有する小カラムに単純に通し、このカラムは十分洗浄
した上で酸やその他の溶離剤で溶出する。何れの場合に
おいても、陽性体を約＞1/105の頻度まで富化すること
が目的である。
富化の後、フィルターリフトアッセイを行う。例え
ば、TSARがファージ中で発現されている場合、およそ１
−2X105のファージが500μｌの対数期のE.coliに添加さ
れ、0.7％アガロース含有ブロスを用いて大きなLB−ア
ガロースプレート上にプレーティングする。アガロース
を固化させ、この固化アガロース表面上にニトロセルロ
ースフィルター（例えば0.45μ）を置く。フィルターと
プレートの再配置が可能なように滅菌針を用いて一連の
レジストレーションマークを付して次のように生育させ
る。ファージプラークを37℃で一夜生育させる（フィル
ターの存在は本プロセスを阻害しない）。フィルターを
プレートから除去するが、これには個々のプラークから
のファージがin siutで存在している。次いでリガンド
（または「プローブ」）の非特異的結合を防止するた
め、フィルターをBSA溶液または他の阻止剤と１−２時
間接触させる。
プローブ自身は、例えばビオチン化（市販のNHS−ビ
オチン使用）や、西洋ワサビペルオキシダーゼやアルカ
リフォスファターゼなどによる直接酵素標識法によって
標識される。このようにして標識されたプローブは、い
つまでも安定で数回にわたり再使用できる。ブロックさ
れたフィルターは、プローブ溶液に数時間暴露され、こ
れによりプローブはその場でフィルター上のファージに
結合し、プローブに対しペプチドが高い親和性を有する
ことを示す。その後フィルターを洗浄して未結合のプロ
ーブを除去し、次いで酵素基質溶液に暴露する（直接標
識プローブの場合）かあるいは、さらに酵素標識された
アビジンに暴露（ビオチン化プローブの場合）して展開
させる。陽性のファージプラークは、原プレート上のプ
ラークに対応する、フィルター上の着色酵素分解産物の
局在付着によって同定される。開いたフィルターを、レ
ジストレーションマークを用いて簡単にプレートに再配
置し、「陽性」プラークをアガロースからくり抜いてフ
ァージを回収する。原プレート上のプラークの濃度が高
いことから、通常は初回のパスでプレートから単一のプ
ラークを分離することは不可能である。よって最初のく
り抜いたコアから回収されたプラークを低濃度で再プレ
ーティングし、このプロセスを繰り返して個々のプラー
ク、かくしてファージの単一クローン、を単離させる。
細菌細胞表面上でTSARを発現するプラスミドベクター
のライブラリーのスクリーニングは、次のようにして磁
性ビーズを用いて行うことができる。標的リガンドを、
基本的にはファージベクターのスクリーニングについて
上に記載した通りに処理して磁性ビーズと結合させる。
細菌細胞表面上に発現された複数のTSARタンパク質を
発現するリコンビナントプラスミドベクターを含有する
細菌細胞試料を、小分割量の再懸濁ビーズと混合する。
試験管の内容物を４℃で１−２時間攪拌する。次いで強
力磁石で磁性ビーズを回収し、液体は吸引除去する。1m
lのPBS−0.05％Tween20を加え、試験管を数回反転して
ビーズを再懸濁させ、次いでビーズを磁石で試験管壁へ
と引き寄せて液体分を除去しながらビーズを洗浄する。
５−10回ビーズの洗浄を繰り返す。例えばLB＋アンピシ
リンなどの培地試料を含有する培養フラスコにビーズを
移す。結合した細胞は富化培地中で細胞分割し、娘細胞
は固定化された標的物質から離れる。細胞が対数期にあ
るときは、インデューサーを培養に再添加し、より一層
TSARタンパク質を生成させる。これらの細胞を遠心分離
で収穫して再スクリーニングに付す。
スクリーニング実験を成功裏に行うには、一連のスク
リーニングを３回行うのが最適である。回収された細胞
をその後低濃度でプレーティングし、コロニーを単離し
て個別に分析する。個々のコロニーを選択し、これをア
ンピシリン含有LB培地に接種するために用いる。37℃で
一夜培養したのち、遠心操作する。個々の細胞の分割量
をとり、ビーズに付着した標的リガンドへの結合に関し
再びテストする。他のビーズに付着結合した無関係なリ
ガンドは陰性コントロールとして使用する。
あるいは、細菌細胞表面上にTSARを発現するプラスミ
ドベクターのライブラリーのスクリーニングは、次のよ
うにして行うこともできる。標的リガンドを上記のよう
にしてマイクロタイタープレートに吸着させ、ファージ
ベクターをスクリーニングする。未結合標的リガンドが
なくなるまでウェルを洗浄した後、細菌細胞試料を少量
の培地に加えてマイクロタイターのウェルに分配する。
十分インキュベーションした後、未結合細菌がなくなる
までプレートを繰り返し洗浄する。大量の（約100ml
の）LB＋アンピシリンを各ウェルに添加し、プレートを
37℃で２時間インキュベートする。結合した細胞は富化
培地中で細胞分割し、娘細胞は固定化された標的物質か
ら離れる。ウェルの内容物を、約10mlのLB＋アンピシリ
ンを含有する培養フラスコに移す。細胞が対数期にある
ときは、インデューサーを培養に再添加し、より一層TS
ARタンパク質を生成させる。これらの細胞を遠心分離で
収穫して再スクリーニングに付す。
磁性ビーズを用いたスクリーニングについては、上記
のような一連のスクリーニング手続きを数回繰り返すこ
とでスクリーニングを行うことができる。
他の態様によれば、ファージや細菌細胞等の宿主細胞
やベクターの表面タンパク質としてTSARを発現するライ
ブラリーは、固相マトリックス（例えばセファロースや
シリカなど）に固定化されたリガンドカラムにそのライ
ブラリーの溶液を通し、十分洗浄して溶出させた後カラ
ムに結合したファージを回収することによって得られ
る。
更に他の態様によれば、弱い結合ライブラリーの構成
員は遅延クロマトグラフィー特性に基づいて単離するこ
とができる。スクリーニングに関するこの態様の内の一
つによれば、各分画がカラムから流出・収集され、あと
に続く分画（trailing fractions）が確保される（即ち
ピーク分画の移動度が遅れた構成員が確保される）。こ
れらの構成員はその後濃縮され、再びカラム上に通さ
れ、よって再び遅延分画が確保される。クロマトグラフ
ィーを連続して行うことによって、固定化されたリガン
ドに対し、弱いとはいえ幾らかの親和性を有するライブ
ラリー構成員を単離することができる。これらのライブ
ラリー構成員は、カラムを通過する時に何百万ものリガ
ンド反応がありうるため、その移動度が遅延する。加え
て、この方法では標的に対しそこそこの親和性を有する
構成員を選択するため、解離時間が迅速である。希望に
よりこのようにして選択されたTSAR結合ドメインをコー
ドするオリゴヌクレオチドを突然変異させて、発現さ
せ、かつ再クロマトグラフィーに対して（または他の方
法でスクリーニングして）、一層改善された結合活性を
見いだすこともできる。
あるいは、ライブラリーをスクリーニングして、固定
化されたリガンドを有するプラスチックプレート（ELIS
Aプレートなど）や磁性ビーズ（共有結合または非特異
的結合）の上に保持された構成員を回収することもでき
る。他の態様によれば、同一二機能的（homobifunction
al、例えばDSP、DST、BSOCOES、EGS、DMS等）または異
種二機能的（heterobifunctional、例えばSPDP）な架橋
剤を上記の方法の何れかと組み合わせて弱い結合構成員
の捕獲を促進することができる。これらの架橋剤は可逆
的で、構成員の構造や伝染性を崩壊させることのない十
分温和な処理（即ちチオール、塩基、過ヨウ素塩、ヒド
ロキシアミンとの接触）によってライブラリー構成員の
回収を許すものでなければならない。溶出試薬は透析
（即ち透析袋、Centricon/Amiconマイクロコンセントレ
ーター）によって除去される。
ライブラリーをスクリーニングすることのひとつの重
要な側面は、溶出のそれである。説明を明確にするた
め、以下においてはファージによるTSAR発現の点から考
察する。しかしながら、このような考察が、TSARが表面
融合分子上で発現されるいかなる系にも適用可能である
ことは、容易に理解される。ファージの回収の間のペプ
チド−標的相互作用を妨害する条件は、ファージ上で発
現される複数のタンパク質からの与えられた各ペプチド
配列に対して特異的であることが考えられる。例えば、
ある種の相互作用は酸性pHにより妨害され、塩基性pHに
よっては妨害されないことが可能であり、その逆であっ
てもよい。したがって、種々の溶出条件（pH2〜３、pH1
2〜13、競合における標的過剰、洗浄剤、弱いタンパク
質変性剤、尿素、種々の温度、光、金属イオンの存在又
は不在、キレート剤等が挙げられるが、これらに限らな
い）を試験し、各セットの条件について回収されたファ
ージ上に発現されたTSARタンパク質の一次構造を比較し
て、各リガンド/TSARの組合せについて適切な溶出条件
を決定することが重要である。これらの溶出条件のいく
つかは、殺菌性であるためにファージ感染と相容性がな
い可能性があり、透析により除去することが必要となる
〔すなわち、透析バッグ、セントリコン／アミコン（Ce
ntricon/Amicon）マイクロコンセントレーター（microc
oncentrators）〕。
異なる条件下で溶出される異なる発現れたタンパク質
の能力は、標的との結合に関与する特異的なペプチド領
域の変性のためだけでなく、隣接する領域のコンホメー
ションの変化のためでもありうる。これらの隣接する
（フランキングする）配列は、実際の結合配列との組合
せで変性されうる。これらのフランキング領域は、溶出
条件（すなわち、pH2〜３、pH12〜13、競合における標
的過剰、洗浄剤、弱いタンパク質変性剤、尿素、熱、低
温、光、金属イオン、キレート剤等）にさらされたこと
に応答して、その二次構造又は三次構造を変化させるこ
とができ、そのことが、標的への結合に関連するペプチ
ドのコンホメーションの脱形成（deformation）に導
く。
TSARが結合ドメインとエフェクタードメインとの間に
リンカー領域を含む別の代替的態様に従えば、特定のTS
ARライブラリーは、（１）ベクター（好ましくはファー
ジベクター）を、DNA配列がコラーゲンのセグメント
（又はコラゲナーゼが切断しうるペプチド）をコード
し、例えばp3.コートタンパク質遺伝子のようなエフェ
クタードメインをコードする遺伝子に隣接して存在し、
それが、このコラーゲンセグメントがなおコラゲナーゼ
により切断されうるように再現可能に架橋する一対のシ
ステイン残基をコードするDNAフラグメントにフランキ
ングするように、工学的処理し、（２）上述のとおりに
二本鎖合成オリゴヌクレオチドを構築・組立て（アセン
ブル）し、工学的処理を施したベクターに挿入し、
（３）好適な宿主において複数のベクターを発現させ
て、ベクターのライブラリーを作成し、（４）ライブラ
リー全体をコラゲナーゼで１回処理し、（５）固定化し
たリガンドへの結合についてスクリーニングし、（６）
過剰なファージを洗い落とし、そして（７）過剰のDTT
（すなわち、1mM）により全ての結合したファージを溶
出することにより、調製し、スクリーニングすることが
できる。DTTは、そのような小さい分子（分子量154.3）
であるため、ファージに対して容易に高いモル過剰とな
ることができ、つながれたファージの架橋した結合に到
達することにおいて、非常に効果的であるはずである。
ジスルフィド結合の還元の後、粒子は、ペプチド−リガ
ンド複合体からはずれ（uncoupled）、付加的なスクリ
ーニングのラウンドのために全長p3.分子を有する粒子
を再生成するために細菌を感染するのに用いることがで
きる。この代替的な態様は、有利にも一般的に効果的な
溶出条件の使用を可能にし、したがって、他の公知の溶
出の方法を用いては回収されない可能性がある、TSARを
発現するファージの同定を可能にする。説明のために、
この態様を用いて、極めて緊密に結合するTSARを回収す
ることができた。
図６には、宿主細胞内に蓄積する可溶性タンパク質と
してプラスミドベクターで発現されたリガンド結合性TS
ARを同定するためのライブラリーのスクリーニングのた
めの方法を、模式的に描いてある。プラスミドp340−1D
の使用は、説明のための例として記載されている。第5.
1.2節において上述したように（後述の第９節も参照さ
れたい）、Xhol.及びXbal.部位を導入した後にp340−1D
に構築したTSARライブラリーは、以下のようにスクリー
ニングすることができる。Xhol.＋Xbal.により切断した
オリゴヌクレオチドを、T4DNAリガーゼを用いて、Xhol.
＋Xbal.で切断したp340−1Dに連結し、lacZ-、supE+の
E.coliにトランスフェクトする。成功している形質転換
体を選択するためには、この調製物を、Luria Broth（L
B）及びアンピシリン（100μg/ml）を含む100枚の別々
のペトリプレートにプレーティングする。37℃で一晩イ
ンキュベートした後、5mlの液体LB培地を添加し、ガラ
ス棒でかきとることにより、各プレートからのコロニー
をプールする。次に、細胞を遠心分離及び懸濁によって
洗浄し、最後の再懸濁を20％グリセロールにて行う。こ
のプールを100個のアリコートに分け、凍結させる（−7
0℃）。
トランスフェクトした細胞の少量のアリコートを、ア
ンピシリン、IPTG及びXGalを含むLBプレート上に低密度
でプレーティングし、個々のコロニーを生じさせる。オ
ープンリーディングフレームを有するTSARオリゴヌクレ
オチドをもつコロニーは青いコロニーを生じるが、一
方、抑制されていないストップコドンを担持するオリゴ
ヌクレオチドを有するp340−1D組換え体又は組換え体で
はないp340−1Dを宿すコロニーは白色である。青色と白
色のコロニーの相対的な数により、組換え体のパーセン
トが明らかになる。この数字は、ライブラリー中の組換
え体の総数を概算する上で有用である。スクリーニング
の目的のためには、100個の連結アリコートを解凍し、
各々から少量をとってLB＋アンピシリン中で培養（25m
l）を開始することができる。細胞が対数増殖期にある
時、IPTGを培養に添加して（最終濃度200μＭ）、TSAR
ペプチド−βガラクトシダーゼ遺伝子融合物によりコー
ドされる複数のタンパク質の発現を誘導する。約２時間
の誘導の後、遠心分離により細胞を収穫し、TSAR−βガ
ラクトシダーゼ融合タンパク質を、精製する。精製した
タンパク質は、アミコン（Amicon）マイクロコンセント
レーターを用いて濃縮する。100試料の融合タンパク質
を、次いで固定化した標的への結合についてスクリーニ
ングする。これらの標的は、純粋なものであることも、
又は複合体混合物の一部であることも、どちらも可能で
ある。さらに、標的は、マイクロタイタープレートのウ
ェルに結合されたもの、ニトロセルロース又はナイロン
フィルター上に点着（スポット）されたもの、あるいは
マトリックスビーズに連結されたものであることができ
る。
代表的には、スクリーニングは、複数のTSARペプチド
−βガラクトシダーゼ融合タンパク質を、固定化した標
的と共にインキュベートすることからなる。明確にする
ために、標的は、以下においてはマイクロタイタープレ
ートのウェルに結合させたものとして記載する。各アリ
コートの少量（５〜50μｌ）を、各ウェルに固定化され
た同じ標的を有するマイクロタイタープレートに添加す
る。１〜２時間のインキュベーションの後、ウェルの内
容物を捨て、PBS−５％Tween 20でウェルを約10回洗浄
する。どのウェルにTSARペプチド−βガラクトシダーゼ
融合タンパクが保持されているかを決定するために、ウ
ェルにONPG試薬を添加して発色させる。ウェルの光学密
度を、プレートリーダー（読取り機）を用いて測定す
る。
陽性の色反応を有するウェルを、次いで、試験したア
リコートと相関させる。それらのアリコートに対応する
細胞を、再び解凍し、新鮮LB液で希釈（〜106倍）し、2
0枚のペトリプレート（LB＋アンピシリン）上に分配す
る。各プレート上に形成されるコロニーを、5mlの液体L
B培地を添加してガラス棒でかきとることにより、各プ
レートからプールする。細胞を、次に遠心分離及び懸濁
により洗浄し、最後の再懸濁を20％グリセロール中にて
行う。このプールを、次いで20個の個々のアリコートに
分け、−70℃で凍結させる。次に、各アリコートを液体
培養として生育させ、細胞が対数増殖期にある時に、培
養にIPTGを添加して（最終濃度200μＭ）、親出願の第1
1節に記載されたとおりに精製されるTSARペプチド−β
ガラクトシダーゼ融合タンパク質によりコードされる複
数のタンパク質の発現を誘導する。次いで、精製したタ
ンパク質をアミコンのマイクロコンセントレーターを用
いて濃縮する。
理解されるように、スクリーニング、陽性ウェルの同
定、適切な凍結細胞アリコートのペトリプレート上への
サブ分割、及び融合タンパク質の調製は、スクリーニン
グサイクルを構成する。このサイクルは、結合活性を有
するTSARペプチド−βガラクトシダーゼ融合タンパク質
を担持する単一のアイソレート（単離株）を最終的に同
定するために、ふるい分けるようなやり方で反復するこ
とができる。組換えDNA単離のこの方法は、ハイブリダ
イゼーションもしくは免疫学的検出に基づくライブラリ
ーからの組換え体の単離（Maniatisを参照されたい）又
はハイブリドーマの同定のための現行の方法学と類似で
ある（図６を参照されたい）。
この方法学は、いくつかの利点を有する。第一に、TS
ARペプチドは誘導時まで発現されず、ライブラリーに対
する生物学的選択の機会がより少ない可能性がある。第
二に、β−ガラクトシダーゼのような酵素は、触媒作用
があるため、強力なエフェクタードメインを提供する。
第三に、スクリーニングの方法は、ほとんどの分子生物
学及び免疫学研究室で利用可能な現行の専門的技術によ
くかなうものである。第四に、酵素を不活性化すること
なく、非常に大きいタンパク質がβ−ガラクトシダーゼ
に融合されている。β−ガラクトシダーゼは、そのＮ末
端での挿入／融合に非常に寛容であるようであり、これ
は大きいTSARを発現させることにおいて有用な特徴であ
る。
5.3.TSAR及びTSAR結合ドメインを含む組成物 本発明においては、TSARと呼ばれる新規な全て合成に
よる親和性試薬が同定される。これは、可溶性の、容易
に精製されるタンパク質／ポリペプチド及び／又はペプ
チドとして生産することができ、商業的な量で製造し、
単離することができる。これらのTSAR試薬は、少なくと
も２つの別個の機能的領域を含む、連なった（concaten
ated）ヘテロ機能性（官能性）タンパク質、ポリペプチ
ド及び／又はペプチドである。ヘテロ機能性TSAR分子の
１つの領域は、リガンドに対する親和性を有する結合ド
メインであり、これは、１）特異的条件下での結合の強
度、２）特異的条件下での結合の安定性、及び３）選択
したリガンドに対する選択的特異性、により特徴づけら
れる。ヘテロ機能性TSAR分子の第２の領域は、TSARの発
現及び／又は検出を強化するために生物学的又は化学的
に活性なエフェクタードメインである。エヘェクタード
メインは、ベクターの表面タンパク質として接近可能に
発現される構造タンパク質、酵素又はそのフラグメン
ト、毒素（トキシン）又はそのフラグメント、治療効果
のあるタンパク質又はペプチド、あるいは発現及び／又
は発現されたTSARの検出を強化するのに有用な、金属イ
オン等の物質の付着部位を提供する機能を有するタンパ
ク質又はペプチド等を含む、多数の生物学的又は化学的
に活性なタンパク質から選ばれる。
本発明の１つの態様によれば、TSARは、場合によって
は、付加的な領域、すなわち結合ドメインとエフェクタ
ードメインとの間のリンカードメインを含むことができ
る。図７は、本発明のこの態様に従ったTSARを模式的に
示す。ペプチドリンカードメインの存在又は不在は、用
いうるリンカーのタイプと同様、任意である。
リンカー領域は、（１）結合ドメインとエフェクター
ドメインとの間の構造的スペーサー領域として、（２）
結合ドメインとエフェクタードメインとを脱カップリン
グ（uncouple）又は分離する一助として、又は（３）発
現ベクターによるTSAR及び／又は結合ドメインのディス
プレイのための構造的な助けとして、役立つ。リンカー
配列は、安定で、TSAR領域の分離を提供することがで
き、あるいは、化学的、生物学的、物理的又は酵素的手
段による切断に対して感受性であることもできる。切断
可能なリンカーを用いる場合、使用する配列は、TSARタ
ンパク質のエフェクタードメインから、TSARの結合ドメ
イン部分が遊離されることを可能にする配列である。し
たがって、切断に対して感受性のリンカーを用いる場
合、そのヘテロ機能性TSARタンパク質は、TSARと同じ結
合特異性を有する一機能性（官能性）結合タンパク質、
ポリペプチド又はペプチドの産生の中間体であることが
できる。
特定の態様においては、切断可能な配列は、酵素によ
り分解可能な配列である。しかし、コラゲナーゼ感受性
配列は一例にすぎない（例えば、後述のセクション９を
参照されたい）。酵素により切断可能なリンカードメイ
ンとして用いることができる他の有用な配列は、エンテ
ロキナーゼ又は因子Xaによる切断に対して感受性のある
ものである。例えば、エンテロキナーゼは、配列Asp−A
sp−Asp−Lys（配列番号18）中のリジンの後を切断す
る。因子Xaは、配列Ile−Glu−Gly−Arg（配列番号19）
を有する部位に特異的であり、アルギニンの後を切断す
る。別の有用な配列はLeu−Val−Pro−Arg−Gly−Ser−
Pro（配列番号20）であり、これはArg及びGly残基の間
で、トロンビンにより切断される。用いることができる
他の酵素により切断可能な配列は、微生物プロテアー
ゼ、ペプチダーゼ、ウイルスプロテアーゼ、補体カスケ
ーゾ酵素、及び血液凝固／血餅溶解経路の酵素により認
識される部位をコードする配列である。他の酵素により
切断可能な配列も、当業者により認識され、本発明のこ
の態様において含めることを意図される。代替的には、
この配列は、例えばペプチド配列のメチオニン残基を攻
撃する臭化シアン（シアノゲンブロミド）のような化学
的手段により切断可能な部位を含むように選択してもよ
い。別の化学的切断手段としては、ペプチド配列のプロ
リン残基で切断するギ酸の使用が挙げられる。本発明
は、ここに与えられた化学的切断の特定の例に限られる
べきではなく、当業者に公知のあらゆる化学的切断法の
使用をも含む。したがって、切断可能なリンカー部分を
有するTSARは、結合機能及び選択したリガンドに対する
特異性を有する一機能性タンパク質、ポリペプチド又は
ペプチドの産生における中間体として役立つことができ
る。
代替的には、リンカー部分は、安定あるいは化学的及
び／又は酵素的切断に対して低感受性であることがで
き、結合ドメインと、TSARの他のペプチド部分との間の
連結として役立ちうる。例えば、リンカードメインは、
溶出の間に、結合ドメインの回収のための、形の制御可
能な助けとして役立つことができる変形可能な（deform
able）タンパク質であることができる。別の例として
は、リンカードメインは、（ａ）例えば１つ以上のプロ
リン残基により与えられるもののような蝶番（ヒンジ）
又は連結（リンク）領域、（ｂ）例えば１つ以上のグリ
シン残基により与えられるもののような旋回（swivel）
領域、又は（ｃ）ｃ−fos又はｃ−jun配列により与えら
れるもののような、TSAR結合ドメインをバイモレキュラ
ー（bimolecular）ポケットの形態で表すことを助ける
ヘテロ二量体化ドメイン（図1cを参照されたい）を提供
することができる。
TSARの化学的又は生物学的に活性なエフェクタードメ
インは、TSARに、検出可能な、診断上の、酵素的な、又
は治療上の特徴を付与する。酵素的活性又は治療的活性
は、例えば、TSARがインビボ（in vivo）での適用に使
用される場合には治療上の効果について有用であるのと
同様に、スクリーニング過程におけるTSARの同定又は検
出に有用でありうる。例えば、フィブリンに対する親和
性を有する結合ドメインに接続された、タンパク質分解
活性を有する治療的グループ（基）は、血液のクロット
（血餅）中のフィブリン成分に結合に結合してそれを溶
かすTSARをもたらす。
代替的には、エフェクタードメインは、金属（放射
性、磁性、常磁性等の金属が挙げられるが、これらに限
らない）を結合し、TSARの検出を可能にするタンパク質
部分であることができる。TSARに用いることができる生
物学的又は化学的に活性なエフェクターペプチドの他の
例としては、トキシン又はそのフラグメント、検出可能
な酵素活性を有するペプチド、金属と結合するペプチ
ド、特異的な細胞性又は細胞外成分を結合するペプチ
ド、TSAR分子の発現を強化するペプチド、蛍光分子と相
互作用するペプチド、及びTSARを同定するための好都合
な手段を提供するペプチドが挙げられるが、これらに限
らない。
後述のセクション９に見出される特定の態様において
は、酵素β−ガラクトシダーゼの全長配列をTSARのエフ
ェクタードメインとして用いた。このタンパク質は、適
正な基質、例えばＸ−gal又はONPGの添加に際し、視認
可能な検出手段を提供する。しかしながら、TSARのエフ
ェクタードメインは、タンパク質の完全なコード配列で
ある必要はない。宿主細胞により容易に発現され、望ま
しい活性又は機能を有するタンパク質の一部分（フラク
ション）を用いてもよい。
本発明の最も一般的な態様によれば、リンカードメイ
ンが存在する場合には、それがTSARの結合ドメインとエ
フェクタードメインとの間になければならないことを除
き、TSARの２つ以上の領域について、互いに関して意図
される特定の順序はない。TSARの領域の位置は、相互に
交換可能である（interchangeable）。より好ましい態
様においては、結合ドメインはヘテロ機能性タンパク
質、ポリペプチド又はペプチドのＮ末端に位置し、エフ
ェクタードメインはカルボキシル末端に位置する。
本発明の別の態様によれば、TSARは、複数の結合ドメ
イン又は複数の活性エフェクター部分、又は複数の各々
の組合せを含むことができる。
選んだリガンドのTSARとの結合が本発明の方法により
いったん同定されてしまうと、TSARの結合ドメインのア
ミノ酸配列は、TSARを発現するとして同定されたベクタ
ー中の挿入されたオリゴヌクレオチド配列のヌクレオチ
ド配列から推定することができる。TSARの結合ドメイン
を含むタンパク質／ペプチドは、組換えDNA技術又は当
業界で公知の標準的化学合成法（例えば、Hunkapiller
et al.1984,Nature 310:105−111を参照されたい）によ
り、製造することができる。組換え又は化学合成技術の
どちらにより製造されたかにかかわらず、同定されたTS
ARの結合ドメインを含むタンパク質／ペプチドは、TSAR
結合ドメインと同一のアミノ酸配列を有するもの、なら
びに機能的に等価のアミノ酸残基で影響のない（サイレ
ント）変化をもたらす配列内の残基が置換されているも
の、を含む。例えば、配列内の１つ以上のアミノ酸が、
機能的等価物として作用する同様の極性の別のアミノ酸
で置換されることができ、サイレント変化をもたらしう
る。配列内のアミノ酸のための置換物は、そのアミノ酸
が属するクラスの他のメンバーから選択してもい。例え
ば、非極性（疎水性）アミノ酸には、グリシン、アラニ
ン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェ
ニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが含まれ
る。極性中性アミノ酸には、セリン、スレオニン、シス
テイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが含ま
れる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニ
ン、リジン及びヒスチジンが含まれる。負に荷電した
（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン
酸が含まれる。本発明の方法に従って、あるTSARが目的
の特定の標的リガンドの結合物（バインダー）として同
定された場合、発現されたTSARペプチド配列のどの領域
が標的リガンドの結合に関与しているかを決定すること
は有用でありうる。このような解析は、２つの異なるレ
ベル、すなわちヌクレオチド配列レベル及びアミノ酸配
列レベルで実施することができる。
分子生物学的な技術により、リガンド結合TSARを、オ
リゴヌクレオチドのレベルで確認し、さらに解析するこ
とが可能である。第一に、挿入されたオリゴヌクレオチ
ドを、適切な制限酵素を用いて切断し、ともに発現ベク
ターに再連結して、そのようなベクターの発現産物をリ
ガンドの結合についてスクリーニングし、TSARオリゴヌ
クレオチドが結合ペプチドをコードすることを確認する
ことができる。第二に、オリゴヌクレオチドを、別のベ
クター、例えばファージからファージミドへ、又はp340
−1D又はpLamBプラスミドへ、トランスファーすること
ができる。もしこのドメインがリガンドへの結合に必要
かつ充分であれば、新たに発現された融合タンパク質
は、同じ結合活性を獲得するはずである。この最後のア
プローチは、もとのベクターによりコードされるフラン
キングするアミノ酸残基（すなわち、融合のパートナ
ー）が何らかの形でTSARペプチドに影響を与えるか否か
についても評価する。第三に、オリゴヌクレオチドを、
TSARについて決定したヌクレオチド配列に基いて合成
し、クローニング、又は２片に切断された内部及びフラ
ンキングプライマーを用いるPCR増幅法により増幅し、
２つの、半分のTSARフラングメントとしてクローニング
する。このようにして、挿入されたオリゴヌクレオチド
を２つの等しい半分ずつにさらに分割する。結合に重要
なTSARドメインが小さい場合、一方の組換えクローンが
結合し、他方は結合しないであろう。どちらの半分も結
合しない場合、両方が重要であるか、あるいはドメイン
の必須の部分が中間にかかっているかのどちらかである
（このことは中央の領域のみを発現させることにより試
験することができる）。
代替的には、予測されるTSARペプチドに相当するペプ
チドを合成することにより、結合ドメインを解析するこ
とができる。第一に、ペプチド全体を合成し、標的リガ
ンドに対する結合について評価して、そのTSARペプチド
が結合に必要かつ充分であることを確認すべきである。
第二に、短いペプチドフラグメント、例えば重複する10
量体（10mers）を、TSAR結合ドメインのアミノ酸配列に
基いて合成し、リガンドと結合するものを同定するため
に試験することができる。例えば、後述の第7.5節を参
照されたい。
さらに、ある種の場合には、ある標的リガンドに対す
る親和性を有する異なるTSARの一次構造を比較した後
に、線形モチーフが明らかになる可能性がある。結合に
対するこれらのモチーフの貢献は、競合実験において合
成ペプチドを用いて確認することができる〔すなわち、
標的に対するファージの結合の50％を阻害することがで
きるペプチドの濃度（IC50）を測定する〕。例えば、後
述の第7.2節を参照されたい。これとは反対に、結合に
重要である疑いが持たれているモチーフ又は領域を、TS
ARインサートをコードするDNAから除去するか又は突然
変更させ、変更された置き換えられたペプチドを、結合
について再試験することができる。
TSARの結合ドメインを含むこれらのタンパク質／ペプ
チド組成物、又は上記結合ドメインと同じ結合特異性を
有するそれらの部分は、本明細書においては「TSAR組成
物」と呼ばれ、本発明の範囲内に含まれるものであり、
第5.4節（後述）に記載される適用に有用である。
さらに、いったんTSARの結合ドメインが同定される
と、１つのTSARの結合ドメインを単離し、異なるエフェ
クタードメインに融合させることにより、新たなTSARを
創り出すことができる。TSARの生物学的又は化学的に活
性なエフェクタードメインは、変えることができる。代
替的には、個々のTSARの結合特性は、TSAR結合ドメイン
配列を変えることにより改変して、特定のリガンドに対
して異なる特性を有するTSARの関連ファミラーを作るこ
とができる。
さらに、方向づけられた（directed）進化の方法にお
いて、同定されたTSARタンパク質／ペプチドを、TSAR結
合ドメインをコードするヌクレオチド配列の突然変異誘
発、選択、及び増幅の付加的なラウンドにより改良する
ことができる。突然変異誘発は、親配列とわずかに（例
えば１〜10％）異なる、新たなセットのオリゴヌクレオ
チドの創作及びクローニングにより達成することができ
る。選択及び増幅は上述のとおりに実施する。単離した
ペプチドが改良された結合特性を有することを確認する
ために、lacZ発現が異なる突然変異体と親ファージと
を、スクリーニング実験の間、共に処理することができ
る。スクリーニング実験のコースにおけるもとの青色−
白色の比の変化は、強化されたバインダーの選択がうま
くいっていることを評価するための視覚的手段として役
立つ。このプロセスは、何回ものサイクルで行うことが
できる。
5.4. TSARおよびTSAR成分の応用および用途 TSARおよび、TSARの結合領域またはその一部を構成し
本発明の新しい方法によりTSARと同じ結合特異性を持つ
ことが確認されたTSAR成分は、従来、抗体の結合領域、
DNA結合タンパク質、RNA結合タンパク質、金属結合タン
パク質、ヌクレオチドヒダおよびGTP結合タンパク質、
カルシウム結合タンパク質、インテグリン、アドヘシン
およびレクチンなどの粘着タンパク質、酵素、あるいは
リガンドに結合親和性を持つ他の小ペプチドまたは高分
子の一部分、などが行なってきたin vivoおよびin vitr
oでの用途に有用である。
TSAR生成物は、あらゆる分野の工業または製薬業にお
いて、与えられたリガンドに特異性を持つペプチド結合
部分を用いる場面で使うことができる。TSARはまた、本
発明の方法により与えられたリガンドに結合親和性、特
異性および結合活性を持つように製造され選択された単
機能結合ペプチドの製造に中間体となることもできる。
さらにいろいろな治療または予防に応用するための新薬
候補物質の開発に有望な手がかりを見つけるためにも使
うことができる。そこで本発明によればTSARおよびTSAR
成分は広範囲のさまざまな応用、たとえば生物医学の分
野、生物調節および害虫制御、農業、化粧品、環境調節
および廃棄物処理、化学、触媒作用、栄養および食品工
業、軍事利用、気候調節、製薬、その他を含む分野に応
用できるが、これらに応用が限られている訳ではない。
下に述べる応用はTSARおよびTSARの結合領域を構成する
成分の用途を説明する例として挙げたものであって、応
用の限界を示すものではない。他の応用は熟練した専門
の技術者にはすぐに見て取れるであろうし、本発明はそ
れらを包含するよう意図されている。
TSARおよびTSAR成分は生物医学、生物調節および制御
の分野で広範囲のさまざまなin vivo応用に有用であ
る。これら応用のあるものでは、TSARは、酵素、ホルモ
ン受容体、免疫グロブリン、金属結合タンパク質、カル
シウム結合タンパク質、核酸結合タンパク質、ヌクレオ
チド結合タンパク質、インテグリン、アドヘシンおよび
レクチンなど粘着タンパク質、等の成分の模擬代替物と
して使われる。また他の応用では、TSARはタンパク質／
ペプチド、糖または受容体分子に結合する他の三つの分
子、たとえばストレプトアビジン、免疫グロブリン、細
胞受容体などに結合する分子の模擬分子として用いられ
る。
他のin vivo用途としてTSARおよびTSAR成分のワクチ
ン免疫原としての投与があり、能動免疫法として有用で
ある。TSARはまた、与えられた細胞またはウイルスの高
分子リガンドに特異性を持つ第一次TSARを先ず生成させ
次いで第一次TSARに結合する第二次TSARを開発する、す
なわち第一次TSARを第二次TSARを確認するためのリガン
ドとして使うというやり方で、ワクチンの免疫原開発に
使われる。第二次TSARは最初の細胞またはウイルス高分
子リガンド部位を模倣するが、適切なペプチド結合配列
のみを含み、不適切なペプチド配列は排除する。第二次
段階で開発された全TSARまたは結合領域またはその一部
分が能動免疫プログラムの免疫原として使用できる。
in vivo応用ではTSARおよびTSAR成分は動物またはヒ
トに、注射（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、
心房内、***内、尿道内など）、局所適用、上皮または
粘膜皮膚面からの吸収など、様々な経路を通じて投与で
きる。生物調節または制御のための植物、昆虫および原
生生物への応用は、生物への直接適用、生息場所への散
布、周囲の環境または周囲の水への添加、などによって
行なうことができる。
化学工業では、TSARは分離、精製、分取法、触媒作用
などに使用される。
診断学の分野では、TSARはリンパ液、血液、尿、便、
唾液、汗、涙、粘液、その他の生理的液体または固体に
存在するリガンドの検出に使うことができる。組織学お
よび病理学の分野では、TSARは組織切片、器官切片、塗
抹標本、または他の肉眼的または顕微鏡的検査のための
試料中のリガンド検出のために使うことができる。TSAR
はまた他の診断法で、ホルモン検出キットあるいは細
菌、ウイルス、マイコプラズマ、真菌、原虫など病原体
の検出キットに抗体の代替物として使用できる。TSARは
さらに、TSAR結合のリガンドとしてモノクローナル抗体
を用いることによりモノクローナル抗体が結合するエピ
トープを決定し、これによりモノクローナル抗体開発に
用いられたもとの免疫原のエピトープを決定するのにも
使うことができる。このようにして、TSARまたは結合領
域またはその一部分は擬エピトープ及び／またはマイモ
トープとなり得る。
次の例は説明の目的のためにのみ呈示するもので、本
発明の範囲をいかなる面でも限定するものではない。
6. 例:TSARライブラリの調製 TSARライブラリは本発明に従い、下に述べるように調
製された。
6.1 TSAR−９ライブラリの調製 6.1.1. オリゴヌクレオチドの合成および集合 図８にオリゴヌクレオチドの構造式およびTSAR−９ラ
イブラリの構築に用いられた集合計画を示す。オリゴヌ
クレオチドはアプライドバイオシステム380a合成機（Fo
ster City,CA）を用いて合成し、全長オリゴヌクレオチ
ドをHPLCにより精製した。
各オリゴヌクレオチド対５μｇを、緩衝液（67mMトリ
ス−HCl、pH8.8、10mMβ−メルカプトエタノール、16.6
mM硫酸アンモニウム、6.7mM EDTA、50μg/ml BSA）中で
0.1％トリトンＸ−100、2mM dNTPおよびTao DNAポリメ
ラーゼ20単位と共に混合した。集合反応液は30秒間72℃
で、次いで30秒間30℃で加温した；この操作を60回繰り
返した。変性過程は用いていないので集合反応はPCRで
ないことに注意しなければならない。充填反応は熱サイ
クル装置（Ericomp,LaJolla,CA）を用い次ぎの要領で行
なった:72℃で30秒間、30℃で30秒間、60サイクル繰り
返し。低温相は、オリゴヌクレオチド対２組の間で６つ
の塩基の相補領域でアニーリングを起こさせるためであ
る。反応生成物はフェノール／クロロホルムで抽出し、
エタノール沈澱させた。その結果、ヌクレオチドの90％
以上が二本鎖合成オリゴヌクレオチドに変換されてい
た。
10mMトリス−HCl、pH7.5、1mM EDTAを含む緩衝液（T
E）緩衝液）300μｌに再懸濁後、オリゴヌクオチド断片
の端を、供給元の指示に従いXba IおよびXho I（New En
gland BioLabs,Beverly,MA）で切断した。断片は４％ア
ガロースゲル電気泳動法により精製した。正しいサイズ
のバンドを取り出し電気溶離し、エタノール沈澱により
濃縮してTE緩衝液100μｌに再懸濁した。集合したオリ
ゴヌクレオチドの約５％は内部Xho IまたはXba I部位を
もつと期待される；しかし集合計画の結合過程では全長
分子のみが用いられた。合成オリゴヌクレオチド断片の
濃度は、適当な量のマーカーと共に臭化エチジウム染色
ゲル上を走らせて強度を比較することにより測定した。
DNA操作のうち詳細に記述されていない部分は、すべて
前述のManiatisに従って行なった。
酵素消化させた集合オリゴヌクレオチドが結合可能で
あることを証明するために、合成DNA断片の自己結合能
を検査した。消化された断片は、T4DNAリガーゼを含む
結合緩衝液中で一晩18℃で加温した。結合産物をアガロ
ースゲル電気泳動法により検査すると、臭化エチジウム
染色上に鎖状体バンドが見られた。５本のそれぞれ単位
長さが異なる鎖状体バンド（すなわち、二量体、三量
体、四量体、五量体、六量体）が見られ、これは合成DN
A断片が結合のための有効な基質であることを示唆し
た。
6.1.2. ベクターの構築 TSARライブラリ発現に有用であるM13由来ファージベ
クターの構築は最近報告された（Fowlkesら、1992、Bio
Techniques、13:422−427）。TSAR−９ライブラリ発現
のために、Fowlkes報告で記述されたようにM13由来ベク
ターであるm663を構築した。図２に、ｃ−myc−エピト
ープをもつp III遺伝子を含むm663ベクター、すなわち
成熟Ｎ−末端に挿入され両側のXho IおよびXba I制限部
位にはさまれた充填断片、を示す。
6.1.3. TSAR−９ライブラリの発現 合成されたオリゴヌクレオチドは、p III遺伝子を含
みXho IおよびXba Iにより二重消化されたm663RFDNA（F
owlkes、supra）に、リガーゼと共に一晩12℃で加温し
て、結合させた。具体的には、ベクターDNA50ngおよび
消化された合成DNA5ngをT4DNAリガーゼを含む結合緩衝
液（50mMトリス、pH8.0、10mM MgCl2、20mM DTT、0.1mM
ATP）50μｌ中で混合した。一晩12℃で結合反応後、DN
Aをエタノール沈澱により濃縮し70％エタノールで洗浄
した。ついで結合DNAをE.coli（DH5αＦ′;GIBCO BRL、
Gaithersburg,MD）に電気穿孔法により導入した。
電気穿孔により導入した細胞の小部分を培地に塗布
し、組換え体が108個生成したことを確かめるためプラ
ーク数を数えた。組換えベクターを含むE.coli細胞のラ
イブラリは組換えファージの単増幅のため高密度（150m
Mペトリ皿につき〜400,000）で培地に塗布した。８時間
後に、各皿を18時間SMG緩衝液（100mM NaCl、10mMトリ
ス−HCl、pH7.5、10mM MgCl2、0.05％ゼラチン）で洗浄
して組換えバクテリオファージを回収し、グリセロール
を50％の割合で添加して−80℃で冷凍した。
このようにして作製したTSAR−９ライブラリは、−2x
1011pfu/mlの作業力価をもっていた。
6.2. TSAR−12ライブラリの作製 図９に合成オリゴヌクレオチドの構造式およびTSAR−
12ライブラリの構築に用いられた集合計画を示す。図９
に示すようにTSAR−12ライブラリは実質的には、次に述
べる外を除き、上の第6.1節で記述したTSAR−９ライブ
ラリと同じように調製した：（１）予知されなかった各
変異オリゴヌクレオチド配列、すなわちNNBは長さが54
ヌクレオチドではなく30ヌクレオチドである；（２）変
異非予知配列の５′末端に含まれる制限部位はXho Iお
よびXba IではなくSal IおよびSpe Iである；（３）二
本鎖の徐冷再対合を助ける３′末端の非変異配列はCCAG
CTではなくGCGGTG（５′から３′）である。
dNTPおよびTaoDANポリメラーゼ存在下の無数のアニー
リングと鎖延長の繰り返しを含む合成および上の第6.1.
1項で記述した精製後、合成二重鎖オリゴヌクレオチド
断片をSal IおよびSpe I制限酵素で消化し、T4DNAリガ
ーゼを用いて、m663ベクターに含まれるM13 p III遺伝
子をコードするヌクレオチド配列に結合させ、第6.1.2
および6.1.3項で記述したTSAR−12表現ベクターのライ
ブラリを得た。結合DNAは電気穿孔法によりE.coli（DH5
αＦ′;GIBCO BRL,Gaitheraburg,MD）に導入した。E.co
li細胞のライブラリは組換えファージの増幅のため高密
度（150mMペトリ皿につき−400,000）で培地に塗布し
た。８時間後に、SMG緩衝液で18時間洗浄して組換えバ
クテリオファージを回収し、グリセロールを50％の割合
で添加して−80℃で冷凍した。
このようにして作製したTSAR−12ライブラリは、−2
x 10 11pfu/mlの作業力価をもっていた。
6.3 TSAR−９およびTSAR−12ライブラリの特徴づけ 上の第6.1および6.2節で記述した各TSARライブラリの
ための挿入された合成オリゴヌクレオチドは2036（〜10
47）通りの解読能を持ち、各形質転換実験では〜1014分
子が使われたので、これらTSARライブラリの構成要因は
それぞれが独特な筈である。ペトリ皿増幅後、ライブラ
リ液または原液はmlあたり各構成因子のコピーを104個
含む。
いずれのライブラリでも、これまで確認された挿入オ
リゴヌクレオチド配列のうちで欠失または挿入を示すも
のは非常に少なかった（＜10％）。これはおそらく、本
条件下におけるオリゴヌクレオチド構築の正確さおよ
び、p IIIがファージ増殖に必須のタンパク質であるた
め或る種の変異（すなわち、フレームシフト変異）は許
されないという事実を反映したものと思われる。
これらライブラリに表現された変異非予知ペプチド
に、おそらくオリゴヌクレオチドの合成中にin vitroで
起こされた偏りまたは増殖するファージによる発現中に
in vivoで起こった偏りにより、なんらかの解読の偏り
が存在するかどうかを確かめるため、下に示すように挿
入断片を配列した。
6.3.1 TSAR−９ライブラリの特徴づけ TSAR−９ライブラリから無作為に選んだ23分離試料
の、挿入合成ヌクレオチドを検査した。E.coli（DH5α
Ｆ′）細胞を含む2xYTブイヨン1mlに接種するには個別
プラークを用い、37℃で一晩通気しながら培養した。DN
AはManiatis（上掲）に従って培養上清液から分離し
た。23個の分離試料はSanger法（1979、Proc.Nat′l Ac
ad.Sci.USA 74:5463−5467）に従い、TSAR表現のため使
用したm663ベクターのp III遺伝子クローニング部位か
ら89ヌクレトチド下流のオリゴヌクレオチド５′−AGCG
TAACGATCTCCCG（配列番号21）をプライマーとして、配
列させた。
ヌクレオチド配列およびこれらがコードするアミノ酸
配列は、MacVectorコンピュータプログラム（IBI,New H
aven,CT）を用いて解析した。アミノ酸の頻度測定には
マイクロソフトのEXCELプログラムを用いた。これら解
析は、アミノ酸をコードするヌクレオチドコドン、従っ
てほとんどのアミノ酸は、表現タンパク質のTSAR9ライ
ブラリでは期待された頻度で起こったことを、示した。
著名な例外はグルタミンおよびトリプトファンであっ
て、前者は過剰に後者は過小に表現されていた。
挿入ヌクレオチドではTAG終止コドンが少なかった、
即ち〜200個の分離試料中２個のみしかTAG終止コドンを
含んでいなかった、点が興味深い。集合計画から、ファ
ージ挿入物の約半分［１−（47/48）36］は少なくとも
一つのTAGコドンを持つと期待される。しかしTAGを持つ
ファージの殆どは、細菌宿主がsupEなのに、ライブラリ
から消失していたと思われる。これらは抑制の有効率が
100％未満であったことの結果かもしれない。
挿入された合成二重鎖オリゴヌクレオチド配列にコー
ドされたアミノ酸配列は、固定PG−コーディングセンタ
ーを除き、単一配列に鎖状化し、マイクロソフトEXCEL
プログラムを用いて各アミノ酸の使用頻度を決定した。
結果は図10に示す。図10に示したように、これら頻度を
オリゴヌクレオチドの集合計画から期待される頻度と比
較し、期待値からの逸脱度を基線上下の棒の高さによっ
て表わした。逸脱度の有意性はχ２検定により検査し
た；■、□および□の棒はそれぞれ確率＞93％、75−93
％および＜75％を表わす。図10が示すように、大半のア
ミノ酸は期待される頻度で出現したが、著明な例外とし
てグルタミンおよびトリプトファンはそれぞれ多少過
剰、過小であった。
このように、不変のPro−Glyを除き、いかなる部位に
いかなるアミノ酸が出現してもよい事が分かった；この
結果、配列は予想できないまたは無作為となる。
6.3.2 TSAR−12ライブラリの特徴づけ TSAR−12ライブラリから無作為に選んだ約10個の挿入
オリゴヌクレオチドを、上の第6.3.1.節で記述したよう
にDNA配列決定により検査した。分離試料はTSAR−12ラ
イブラリから無作為に選び、TSAR9分離試料と同じく配
列決定のために調製した。分析の結果、不変のGlyを
除、いかなる部位にいかなるアミノ酸が出現してもよい
事が分かった；この結果、配列は予想できないか、また
は無作為となる。
6.4 TSAR−13及びTSAR−14の半硬性ライブラリーの作
成 半剛性構造を形成することができるペプチドを表すTS
ARライブラリーのもう一つの具体例を示す。この具体例
のオリゴヌクレオチドにおける変異残基をコードするコ
ーディングスキームは、詳細の説明に記載の、より好ま
しいコード法の態様とは異なる。
6.4.1. オリゴヌクレオチドの合成と組み立て TSAR−13とTSAR−14のライブラリーに使用のオリゴヌ
クレオチドの構造式とTSAR−13ライブラリーの構築に使
用の組み立てスキームを第11図に示している。同じオリ
ゴヌクレオチドデザインをTSAR−13とTSAR−14のライブ
ラリーにも使用した。TSAR−13はファージミド、TSAR−
14はファージで発現された。オリゴヌクレオチドは、予
想されていないヌクレオチドの連続配列の両端に隣接し
ている非変異ヌクレオチドを含むように設計された。こ
の例では、一本鎖ヌクレオチド配列が、二本鎖オリゴヌ
クレオチドに変換されてコード化する：（ａ）５′〜
３′の制限部位−システイン、グリシン−（NNK）８−G
ly−Cys−Gly（NNK）８−相補部位Gly−Cys−Gly:
（ｂ）３′〜５′の相補部位Gly−Cys−Gly（NNM）８−
Gly−Cys−Gly−Pro−Pro−Gly−制限部位。それゆえ、
ライブラリーは、酸化環境において二硫化物接着を形成
する４個のシステイン残基がそれぞれにある半剛性接着
ドメインを有し、クローバの葉の構成を採用するように
設計される。TSAR接着ドメインとp III又はエフェクタ
ードメインの間によじれを形成するように追加のプロリ
ン残基が入れられた。一本鎖ヌクレオチドの設計におい
て、２個の二本鎖ヌクレオチドがヌクレオチド配列をコ
ードする所定の相補グリシン、システイン、グリシンで
アニールすることを確実にするすべての４個の可能なグ
リシンのコドンを利用した。
オリゴヌクレオチドは、Applied Biosystems 380a合
成装置（カリフォルニア州フォスター市）で合成し、全
長のオリゴヌクレオチドをゲル電気泳動により精製し
た。
オリゴヌクレオチド対をアニーリングするため、200p
molのオリゴヌクレオチド対をシーケンナーゼバッファ
ー（40mMトリスpH7.5、20mM MgCl2、50mM NaCl）におい
て、総容量200ulで、0.1ug/ml BSA、10mM DTTと混合し
た。混合物は、42℃で５分間、次に37℃で15分間インキ
ュベートした。各0.2mMの濃度と20単位のシーケンナー
ゼに４個のdNTPをすべて追加することにより「（バージ
ョン2.0（オハイオ州クリーブランド、U.S.バイオケミ
カル）」、さらに、37℃で15分間インキュベートするこ
とにより内部の反応をすべて引き起こした。残存のポリ
メラーゼ活性は65℃で２時間インキュベートすることに
より、熱で非活性化した。冷却後、制限バッファー（10
mMトリスpH7.5、50mM NaCl、10nM MgCl2）、追加の0.1u
g/ml BSAと追加の2mM DTTを、それぞれ300単位のXba
I、Xho Iと共に追加することにより、オリゴヌクレオチ
ドの断片の末端を開裂させた。３件の対照反応を同時に
行った。第一の対照アリコート、つまり、充填反応の10
μｌのアリコートにおいて、第一の制限酵素（Xba I）
を同じ最終濃縮物（単位／μｌ）に加えた。第二の対照
アリコートに、別の制限酵素（Xho I）を加えた。第三
の対照アリコートには制限酵素を加えなかった。すべて
の試料を制限酵素のメーカーが推薦する温度で２時間イ
ンキュベートした。***したオリゴヌクレオチドは容積
比１対１のフェノール／クロロフォルムで抽出し、エタ
ノールを沈殿させた。断片は、1X TBEにおいて、15％の
非変性予備ポリアクリルアミドゲルで精製した。正しい
寸法（対照見本との比較で判定）の帯を取り除き、単離
して、エタノールを沈殿させ、TEバッファーに再び懸濁
させた。
6.4.2 ファージミドベクターの構築 ファージミドベクターpDAF1の構築を後述の8.1に説明
している。このベクターを修正して、m666からp III遺
伝子のアミノ末端を挿入することにより全長のp III遺
伝子を含有した。pDAF3とm666をAiwN IとXba Iで切断
し、0.7kbの断片をm666からpFLP3に転移させ、ベクター
pFLP3を生成させた。
6.4.3 TSAR−13ファージミドライブラリーの発現 合成オリゴヌクレオチドは、Xba I、Xho I二重消化pF
LP3 DNAに結合され、LX1の青色E.coliにエレクトポレー
トした。アリコートをプレートして、力価が８×107全
コロニーであると測定した。ライブラリー全体をアンピ
シリンプレートでプレートした。TSAR−13ライブラリー
を発現するため、７×1010セルを300mlの2xYTの培地に
加え、37℃で30分間インキュベートし、その後、４×10
11pfuのM13K07ヘルパーファージを加えた。0.004％のIP
TG、２％グルコースを加えるか、又は、何も加えないで
アリコートを誘導し、１時間インキュベートした。次
に、150mlの2xYT培地と70μg/mlのカナマイシンを加
え、細胞をさらに37℃で４時間インキュベートした。フ
ァージミド粒子をPEG沈殿させて、遠心分離で集め、4ml
の培地に再懸濁させた。それぞれの力価は２×1012pfu/
mlであった。組換え体の総数は８×107であった。
6.4.4 ファージベクターの構築 TSAR−14ライブラリーを発現するため、前記6.1.2に
記載のTSAR−９ライブラリーの一員を、EcoR IとHind I
IIを用いてポリリンカーを切断し、pUC18ポリリンカー
を挿入することにより修正して（以前は、Xba I部位を
削除して修正した）青色のプラークを生成した。
6.4.5 TSAR−14ファージライブラリーの発現 次に、合成オリゴヌクレオチドを、TSAR−９ライブラ
リーについて説明したとおり、p III遺伝子を含むXba
I、Xho I二重消化m666に結合した。結合されたDNAを次
にエレクトロポラーションによりE.coli細胞に導入し
た。
6.5 TSAR−13ライブラリーの特徴づけ 各TSAR−13ライブラリーの挿入合成オリゴヌクレオチ
ドには、2024（1.68×1031）のポテンシャルコード化複
雑度があった。形質転換実験に1012の分子を使用したた
め、ライブラリーの各メンバーが独特であるはずであ
る。無作為で選択された２個の単離物の挿入合成オリゴ
ヌクレオチドは、TSAR−13ライブラリーから検査した。
２個の無作為単離物の配列は次のように推測された： CGDGQEPPETGCGVSRKRVSXGCGRLLTXXXXGCGPPGSR（配列番
号142）及びCGRGARFSWMGCGGWGISQATGCGPDFPFYDGCGPPGSR
（配列番号143）。配列中のＸは、二番目の鎖を配列さ
せることにより単離に分解できるゲル人工産物によるあ
いまいさを表している。これらの単離物（配列番号14
2、143）から決定される配列には、約８個の変異又は予
測不能のコドンの連続配列の両端に隣接するヌクレオチ
ド配列を含む非変異システインが含まれている。
7.リガンド結合TSARの確認 一連の実験において、前記６節に説明のTSAR−９とTS
AR−12のライブラリーを本発明に従い、選択された様々
な異なるリガンドに対し結合特異性を有する、発現され
たタンパク質ペプチドを得るためにスクリーニングし
た。
7.1 スクリーニングの方法 特に記している場合を除き、次の方法を用いてTSAR−
９とTSAR−12のライブラリーをスクリーニングした。
選択したリガンドは、メーカーの指示に従い、次の二
つの供給物の片方から得た磁気ビーズに接合した：アミ
ノ末端微粒子支持体＃８−4100B（Advanced Magnetic
s、マサチューセッツ州ケンブリッジ）とDynabeads M−
450、トシル活性化（Dynal、ニューヨーク州グレートネ
ック）。未反応グループとビーズに対する非特異結合を
阻止するため、ビーズは過剰なウシ血清アルブミン（BS
A）でインキュベートした。ビーズは、次に、PBS−0.05
％ツウィーン20中に懸濁させて繰り返し洗浄し、強力な
磁石で回収した。次に、ビーズを必要になるまで４℃で
保管した。
スクリーニング実験において、1mlのライブラリーを1
00μｌの再懸濁ビーズ（１〜5mg/ml）と混合した。管内
容物を４℃で１時間から２時間、回転した。次に、磁気
ビーズを強力磁石で回収し、吸引により液体を取り除い
た。次に、1mlのPBS 0.05％ツウィーン20を追加し、ビ
ーズを数回逆転させて再懸濁させ、磁石でビーズを管壁
に引き寄せ、液体を取り除いてビーズを洗浄した。ビー
ズをさらに５回から10回、繰り返し洗浄した。50μｌの
50mMグリシン−HCl（pH2.2）、100mg/mlのBSA溶液を洗
浄済みビーズに加えて、タンパク質を変性させ、結合し
ているファージを解放した。５分から10分後、強力磁石
でビーズを管の側面に引っ張り、次に液体分を清澄な管
に移した。管に、100μｌの1Mトリス−HCl（pH7.5）又
は1M NaH2PO4（pH7）を加えて、ファージサンプルのpH
を中和させた。次に、ファージを連続して10-3から10-6
に希釈し、アリコートをE.Coli DH5αＦ′セルＦでプレ
ートして、サンプルの単位を形成するプラークの数を判
断した。一定の場合において、プラークの色差別のた
め、XGalとIPTGの存在下でプレートを行った（つまり、
lacZプラーク＋は青、lacZ-プラークは白である）。入
れたサンプルの力価も比較のため測定した（希釈は通常
は10-6から10-9であった）。
スクリーニング実験に成功するために、一般的に、次
の方法で連続スクリーニングを３回行った。第一に、ラ
イブラリーをスクリーニングし、回収したファージを直
ちに再スクリーニングした。第二に、第二回後に回収さ
れたファージをマニアティスに従いプレート増幅した。
ファージは、〜5mlのSMGでプレートを重ね、４℃でプレ
ートを一晩インキュベートすることにより、SMGに溶離
させた。第三に、次に、小さなアリコートをプレートか
ら取り、再スクリーニングした。次に、回収したファー
ジを低濃度でプレーティングして、個別分析用の単離プ
ラークを得た。
個々のプラークは楊枝で取り出し、2xYTにおけるE.co
li F細胞の培養物の接種に使用した。37℃で一晩培養
後、次に培養物を遠心分離で回転させた。次に、上清を
清澄な管に移し、ファージ原料として供した。一般的
に、力価は1012hfu/mlで、４℃で安定している。次に、
個々のファージアリコートをリガンド被膜ビーズに結合
するか、その他の対照ビーズ（つまり、BSA被膜ビーズ
又は他のリガンドで結合のビーズ）に対する結合の不足
について再試験した。
7.2 TSAR結合7E11−C5の確認 一連の実験において、TSAR−９とTSAR−12のライブラ
リーを、反前立腺がん腫モノクローン抗体、つまり、7E
11−C5抗体に対して結合特異性を有する発現タンパク質
／ペプチドについてスクリーニングした。7311−C5モノ
クローン抗体は、1992年11月10日発行の米国特許5,162,
504号に記載されている。
TSAR−９はTSAR−12のライブラリーを7.1の説明に従
い、発現されたファージ粒子を、ビーズメーカーが供給
する指示書に従い共有的に取り付けられた7E11−C5モノ
クローン抗体を有するDynal磁気ビーズ（ニューヨーク
州グレートネック）に接触させることにより、連続２回
スクリーニングした。7E11−C5単一クローン抗体を結合
しているファージは、強力磁石を用いて回収し、プレー
ト増幅した。増殖されたファージは、次に、磁気ビーズ
で再スクリーニングし、プレーティングした。９個の異
なるヌクレオチド配列から成る。14個のファージを、7E
11−C5モノクローン抗体に対する高い親和力に基づき単
離した。
7E11−C5結合ファージによりコードされたTSARの結合
ドメインのアミノ酸配列を表１に示す。
９個の7E11−C5を結合しているTSARは、同じアイソト
ープ、つまり、米国特許4,522,918及び4,612,282に記載
のB7 2.3モノクローン抗体、あるいは、牛血清アルブ
ミン（BSA）に少なくとも1,000〜10,000倍以上強力に結
合する。事実、7E11−C5を結合するTSARは、いずれも、
CEA抗原を認識するC46モノクローン（ロセンストラウス
等、1990年、ガン免疫、Immunol,Immunother 32:207−2
13を参照）を含め、試験されたその他のモノクローン抗
体に結合しない。
表１に示すように、7E11−C5を接着している９個のTS
ARは、６個のアミノ酸の直線一致動因、つまり、Ｘが明
らかにアミノ酸であるＭ（Y/W/H/I）XXL（H/R）を共有
している。最近、7E11−C5MAbにより認識された前立腺
ガン細胞に発現されているタンパク質の配列が発表され
た（イスラエリ等、1993年、Cancer Res、53:227−23
0）。タンパク質の配列には位置が２個ある。それは残
渣ｘ−ｘ′とｙ−ｙ′で、配列が7E11−C5結合TSARにお
いて明らかにされている直線一致動因に整合する。それ
ゆえ、本発明の方法は、自然に発生するタンパク質にお
いて7E11−C5により認識されるエピトープの識別に使用
できる直線一致動因を明らかにしている。エピトープの
確認には、タンパク質から正確な配列を合成すること、
一方又は両方が7E11−C5に接着することあるいは7E11−
C5の抗原への結合を抑制することがある。
7E11−C5抗体に対する各種の7E11−C5結合TSARの相対
的親和性を比較した。マイクロ力価プレートをファージ
結合前に異なる量の抗体（つまり、0,4,20,100,500ng）
で被膜した。我々の予測は、抗体に対する親和性が最大
のTSARが、より少ない量の抗体で被膜されたウェルに依
然として効果的に結合するであろう、ということであっ
た。最も良好に結合したTSARは、９−１、９−３、９−
５、12−１であった。これらのTSARには、動因に第二の
アミノ酸があった。次のクラスのTSARは、結合力が〜２
倍低かった。12−２によって代表されるように、これも
第二のアミノ酸としてＹがあった。３個のTSARは、９−
２、９−４、12−４に代表されるように、最高に結合す
るものと比較して、５倍から10倍結合力が低かった。こ
れらの挿入物には、動因の第二の位置にＷ又はＨがあっ
た。最後に、TSAR 12−３は、最高に結合するものと比
較して50倍未満であった。このTSARには、それぞれ第二
と第六の位置にＩとＲがあった。それゆえ、7E11−C5エ
ピトープは、変異と非変異の残基がある直線ペプチド配
列により模倣することができる。
7E11−C5モノクローン抗体により認識された抗原は、
LNCaPヒト前立腺ガン細胞株（ATCC＃CRL 1740）におい
て高度に発現される。表１に説明の３個のTSARペプチ
ド、つまり、7E11.9−１（配列番号22）、7E11−９−５
（配列番号26）、7E11.12−２（配列番号28）の名称のT
SARの、7E11−C5モノクローン抗体の抗原結合部位を認
識する能力を、LNCaP細胞リゼイトを「捕獲」抗原とし
て使用して、競合結合ELISA分析で次のように評価し
た： ポリ塩化ビニールノ96−ウェルELESAプレート（Cook
e、バージニア州アレキサンドリア）の各ウェルをLMCaP
ヒト前立腺ガン細胞（ATCC＃CRL 1740）リゼイトで塗
布した。リゼイトは、全面LNCaP細胞培養を収穫し、４
容量の1mM MgCL2に５分間懸濁させ、２μｇのDNase（イ
ンディアナ州インディアナポリス、ボーリンガー・マン
ハイム）と混合し、ダウンス・ポモジュナイザ（ニュー
ジャージー州ウィートン）で40ストローク使用して均質
にして調整した。LNCaPリゼイト（0,1X PBSにおいて1:
50の希釈のウェル当たり50μｌ［ダルベッコのpH7.2、J
RH、ペンシルバニア州デンパー］）を37℃で一晩、ELIS
Aプレート上で空気乾燥した。ELISAプレートは、室温で
60分間、PBSにおいて、１％のBSA（イリノイ州カンカキ
ー、ペンテックス・フラクションＶ、マイルズ）の150
μl/ウェルでブロックした。
室温で１時間、LNCaP抗原被覆ELISAプレートに加える
前に、室温で１時間、7E11−C5モノクローン抗体（30ng
/ml）（1:1）で高濃度のTSAR産生ファージをプレインキ
ュベートすることにより競合分析評価を行った。ブラン
クの対照群は、一次抗体が不在のブロック溶液を使用し
た。ファージ（MAb）なしのバッファーでプレインキュ
ベートされた7E11−C5モノクローン抗体は、正の対照群
であった。発現ベクターm663ファージも非特異性ファー
ジ対照群として使用した。
プレートは、0.05のツィーン−20でPBSにおいて４回
洗浄した。結合されたモノクローン抗体7E11−C5は、次
の方法で検出した：（１）室温で60分間、１％BSA−PBS
において、0.4ng/mlに希釈した抗マウスIgGI−HRP（ニ
ューヨーク州オレンジパーク、フィッシャー・バイオテ
ック）の50μl/ウェルで培養。（２）PBSにおいて、0.0
5％ツィーン−20で６回、プレートを洗浄、（３）100μ
l/ウエルのABTS基質［200μl ABTS,（ボーリンガー・マ
ンハイム）、10mlクエン酸バッファー（pH4）、10μl H
2O2］を追加した。反応生成物の光学濃度は、マルチス
カンプレートリーダー（Molecular Devices、カルフォ
ルニア州メンロパーク）を用いて終点分析で測定した。
競合抑制率（％）は、正の対照群の反応度を試験サンプ
ルと比較して決定した。7E11.9−５と7E11.12−３のフ
ァージを用いて得た結果を第12図に示す。
第12図に示すように、7E11.9−５と7E11−12−１の名
称が付いているTSAR産生ファージは、7E11−C5モノクロ
ーン抗体の抗原に対する結合を線量依存様式で抑制し
た。7E11.9−１の名称が付いているTSAR産生ファージも
7E11−Ｃモノクローン抗体結合を抑制した（データは示
していない）。TSAR 7E11.12−３ファージは、TSAR 7
E11.9−５ファージと比較して、7E11−C5モノクローン
抗体に対する相対的親和性が約50倍低い。このことは、
抗体結合の50％を抑制するために必要な高ファージ濃度
に反映されている。3.5×1011のIC50は1.7×1010のIC50
に匹敵する。MAb 9E10により認識されたｃ−mycエピト
ープを含むM663ファージは、結合を抑制しなかった。こ
のことは、ファージの表面に正しいペプチドが存在して
いる場合に限り抑制が発生することを実証している。
さらに、7E11−C5を結合しているTSAR、つまり、アミ
ノ酸配列LYANPGMYSRLHSPA（配列番号31）を有するTSAR
7E11.0−１（配列番号22）の一つの一部に対応するペ
プチドを、Applied Biosystem合成装置（カルフォルニ
ア州フォスター市）を用いて合成し、HPLCにより精製し
た。別の一連の実験において、配列番号31を有するペプ
チドがp III融合タンパク質として発現される元のTSAR
と実質的に同じ活性を維持していることが実証された。
このペプチドは元のTSARから誘導されたものである。
下記の実験のために、配列番号31と名付けられTSAR系
の合成ペプチドを精製（逆相HPLC）として調製した。
一連の実験において、配列番号31（アミド形態）の7E
11−C5モノクローン抗体の抗原結合部位を認識する能力
は、実質的には本書に記載の非活動抗原としてLNCaP抽
出物を使用して、競合結合ELISAにおいて評価した。TSA
R系のペプチド（配列番号31）の濃縮は、1.75〜1130nM
の範囲であった。7311−C5モノクローン抗体の濃度は、
30ng/ml（0.2nM）に維持された。ペプチドは、抗原被膜
のELISAプレートに加える前に、室温で１時間、7E11−C
5モノクローン抗体でプレインキュベートした。RGD−2
1:NH2−PSYYRGDAGPSYYRGDAG−CONH2（配列番号32）とCY
T−379:NH2−SYGRGDVRGDFKCTCCA−CONH2（配列番号33）
のアミノ酸配列を有する追加の対照ペプチド（アミド形
態）も評価した。ここでは、これらの対照ペプチドを対
照ペプチド１と対照ペプチド２と呼んでいる。配列番号
31（アミド形態）と２個の対照ペプチド、対照ペプチド
１と対照ペプチド２の、別のモノクローン抗体、つま
り、メリーランド州ペセスダのNIH国立ガンセンターの
ジェフリー・シュロムら入手したB139の競争して抑制す
る能力も評価した。B139モノクローン抗体は、ヒトの上
皮細胞と反応するミューレインIgGIモノクローン抗体
で、7E11−C5抗体により認識する抗原とは異なる抗原を
LNCaP抽出物の中に認識する。9ng/mlの濃度で、B139モ
ノクローン抗体を使用した。得られた結果を第13図に示
す。
第13図に示すように、配列番号31（アミド形態）は、
抗体のペプチドと一価の結合部位の約400対１のモル比
に対応する約160nMのIC50で、7E11−C5モノクローン抗
体のLNCaP抽出物への結合を効果的競争的に抑制した。
対照ペプチド１と対照ペプチド２の二つの対照ペプチド
は、7E11−C5抗体と効果的に競合しなかった。その上、
配列番号31（アミド形態）、対照ペプチド１と対照ペプ
チド２のいずれも、アイソトープ整合対照B139モノクロ
ーン抗体の結合を競合的に抑制しなかった。ここに提示
した結果に基づき、配列番号31（アミド形態）が7E11−
C5モノクローン抗体の抗原結合部位を特異的に認識し、
実際には、エピトープを模倣することが明らかである。
別の一連の実験において、非活性化により形態が制約
された場合の、特異的に7E11−C5に結合する配列番号31
（アミド形態）の能力を次の手順で評価した： 10％PBS（ダルベッコ、pH7.2、ハゼルトン）に希釈し
たペプチドを、ポリ塩化ビニールプレート上に吸収させ
て固定させた。配列番号31（アミド形態）を0.5、５、5
0または500μg/mlで、10％PBSにおいて希釈した。同じ
濃度範囲の10％PBSの対照ペプチドが対照の役割りを果
たした。容積50μｌの試験又は対照のペプチド溶液を各
ウェルに加えて、４℃で一晩インキュベートした。ペプ
チド溶液を取り除き、10％BSA−PBSをブロック溶液とし
て加えた。7E11−C5モノクローン抗体又は対照B139モノ
クローン抗体を1.7から10,000ng/mlの濃度範囲で加え、
プレートを室温で１時間インキュベートした。結合され
た7E11−C5モノクローン抗体を前記のように、抗マウス
IgGI−HRPで検出した。
固定化配列番号31（アミド形態）の濃度が0.5μg/ml
から500μg/mlに変化した時に得た結合分析評価の結果
を第14図に示している。7E11−C5の量依存結合が試験し
たすべてのペプチド濃度において観察された（第14
図）。さらに第14図に示すように、配列番号31（アミド
形態）への最適抗体結合は、配列番号31（アミド形態）
の５μg/ml溶液で塗布されたプレート上に発生した。
7E11−C5モノクローン抗体に対する固定化配列番号31
（アミド形態）の特異性も、固定化の配列番号31（アミ
ド形態）を有するELISAプレートのウェルを接触させ、7
E11−C5抗体又は非関連B139抗体（対照抗体）のいずれ
かで４℃で一晩、50μｌのペプチドでインキュベートし
て評価した。第15図に示しているその結果は、7E11−C5
抗体が配列番号31（アミド形態）被膜プレートに特異的
に結合し、B139抗体が配列番号31（アミド形態）被膜プ
レートに結合しなかったことを実証している。
さらに、ELISAプレート上で固定化すると、無関係の
対照ペプチド１と対照ペプチド２は、試験したいずれの
抗体にも結合しなかった（データは示していない）。
得た結果に基づき判断して、7E11−C5結合TSAR及びか
かるTSARの一部を構成する配列番号31などのペプチド
は、免疫反応分析試料の開発や7E11−C5抗体の親和性ク
ロマトグラフィーの開発に有効なはずである。前記に説
明のように、このようなTSAR組成は、7E11−C5抗原のエ
ピトープの説明に有効であったが、関係する抗原が前立
腺ガンや正常前立腺に対して高度に制約されているた
め、前立腺切開を受けている患者又は前立腺切開後の患
者に対する前立腺ガン用ワクチンの制作に有用なエピト
ープのミメトープの制作にも有効である可能性がある。
さらに、TSAR組成は、7E11−C5抗体の商業生産における
品質管理分析評価のフォーマット化においても有益であ
った。
7.3 TSAR結合金属の確認 別の一連の実験において、TSARライブラリーを、亜
鉛、銅、ニッケルなどを含む選択されたリガンドとして
の金属イオンに対して結合特異性を有するタンパク質／
ペプチドに対して選別した。
特定の実験において、固定化された金属アフィニティ
ークロマトグラフィー（IMAC）を使用した。このクロマ
トグラフィーにおいて、イミノジ酢酸セファロースは、
三座方式でZn+2を配位し、固定し、及び、他のリガンド
との相互作用のための残りの配位部位を提供する働きを
する。
TSAR−９の無作為ペプチドライブラリーを次の手順で
IMACクロマトグラフィーにかけた。0.5mlの床容積イミ
ノジ酢酸（IDA）セファロース（シグマ・ケミカル社）
のカラムを、1mlの殺菌二重蒸溜（dd）H2Oで洗浄し、dd
H2Oにおいて5mlの10mM ZnCl2を充填し、次に3mlの殺菌d
dH2Oを付加し、10mlの10mMトリス−HCl、150mM NaCl、
0.1％のツィーン20、pH7.5（T10NT）で平衡化して、Zn
（II）IDAカラムを作った。1012pfuのTSAR−９無作為ペ
プチドライブラリーをZn（II）IDAカラムの上を通過さ
せ、10ml T10NTで洗浄した。結合ファージを500μl 200
mMのグリシン−HCl、pH2.2で溶離し、次にpHを500μl 1
Mのリン酸塩バッファー、pH7.5＋1ml T10NTで中和させ
た。溶離したファージをさらに２回選別にかけ、その結
果をE.coli DH5αＦ′の上で一晩成長させることにより
増幅した。
Zn−結合TSARを発現する単離ファージをバイアス無し
で選別し、一晩増殖し、TSARをコードするDNAを配列化
した。
亜鉛結合ファージによりコードされたTSARの結合ドメ
インのアミノ酸配列を表２に示す。
表２は、Zn（II）結合TSARの結合ドメインの推論アミ
ノ酸配列を示している。TSARペプチドのアミノ酸配列
は、有意の直線一致動因を明らかにしていないが、その
アミノ酸組成は、その位置を無視して考えると、顕著な
バイアスを示している。入力TSAR−９ライブラリーのア
ミノ酸組成と比較して、クローンは、ヒスチジン（ｐ＜
２×10-17）及びプロリン（ｐ＜0.05）の豊富な残留物
を統計的に有意に共有し、並びにアラニン（ｐ＜0.0
8）、バリン（ｐ＜0.09）、ロイシン（ｐ＜0.0003）及
びシステイン（ｐ＜0.00008）の残留物の不足を統計的
に有意に共有している。入力STAR−９ライブラリーに観
察されたアミノ酸組成は、これらの計算の基準となるた
め、これらのバイアスの原因はZn（II）−IDA選択過程
にあるものとしなければならない。
Zn（II）−IDA選択ペプチドに関連する最高に劇的な
バイアスは、ヒスチジンに対して3.6倍の富化と8.5倍の
システイン残基の抑制であった。無作為で選択されたTS
AR−９クローンに表示されたペプチドには、平均で1.73
±1.44（平均±標準偏差）のヒスチジンと1.23±1.19の
システイン残基が含まれ、Zn（II）−IDA選択ファージ
に表示されたペプチドには平均で、6.21±1.13ヒスチジ
ンと0.16±0.50のシステインが含まれている。in vivo
［ベルグ、1988、Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85:99−10
2（ベルグ、1988年）］及びIMAC［イップ等、1989年、A
nal.Biochem.183:159−171（イップ）］の両方におい
て、金属配位におけるヒスチジン残留物の重要性が良く
記述されている。システイン残留物はin vivo［ベル
グ、1990年、Ann.Rev.Biophy.Biochem,19:405−421（ベ
ルグ、1990）］におけるタンパク質により、Zn2+配位に
参与しているが、観察されたシステインの不足は、イッ
プの計算により、IMACにおけるペプチド保持にシステイ
ンの貢献度が小さいことと一致している。アーノルド
（1991年、Biotechnol.9:151−156）は、システイン
は、金属イオンの存在下酸化して、二硫化物ブリッジを
形成し、固定化金属との相互作用に役にたたなくなる傾
向があるため、システインがIMACにおける保持に貢献し
ない可能性を示唆している。システイン残基が選択され
ないことはそのような影響で説明することが可能である
が、システインの劇的な抑制はさらに説明を必要とす
る。二硫化物結合がZn（II）−IDAとの安定相互作用と
の不適合な形態にペプチドを制約する傾向がある可能性
がある。
表面的には、Zn（II）−IDA選択ファージ上に発現さ
れるペプチド内のアミノ酸の分布の一部の側面が非無作
為的に見える。この可能性を調査するため、複数の統計
学的試験を行った。この試験において、ｎ＋１、ｎ＋
２、ｎ＋３又はｎ＋４の位置（ヒスチジン残基との関係
で）で発見された特定のクラスの観察されたアミノ酸の
数と無作為分布を想定して見込まれる数と比較した。相
互のヒスチジン残留物の分布に統計学的に有意なバイア
スは発見されなかった。同様に、集団として芳香族側鎖
（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）を有
するアミノ酸、集団として脂肪族側鎖（グリシン、アラ
ニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）を有する残
基、及びプロライン残基は、ヒスチジンとの関係で無作
為的に分布しているようである。最後に、無作為ペプチ
ドにおけるヒスチジンの位置分布に有意なバイアスは見
られない。
異なる特性に基づき、表２に記載のTSARから４個−Zn
lA1、ZnlA6、ZnlA12、ZnlB8（配列番号49、50、51、5
2）選択して、クロマトグラフによる特性検査を行っ
た。TSARを選択して、変異挿入物内におけるヒスチジン
残基の豊富な量と分布の範囲を表すことを試みた。ZnlA
1とZnLA6には、それぞれの無作為ペプチド内にヒスチジ
ンが７個あり、ZnlA12とZnlB8には、それぞれヒスチジ
ンが８個及び５個ある。ZnlA12とZnlB8には、予測され
ないペプチド内部に良く分布したヒスチジンがあり、Zn
lA1とZnLA6のヒスチジンはそれぞれ相対的、例外的に集
団になっている。
Zn（II）−IDA選択TSARBに相対的結合を定量化するた
め、各TSARコード化ファージをZn（II）−IDAにわたり
クロマトグラフ処理した。ファージについて、画分を３
個集めて、滴定濃度にした。洗浄（未結合）、溶離（結
合、溶離）、コラム（結合、未溶離）。この方法で画分
すると、各TSAR結合ドメインは、非選択ファージクロー
ンにわたり、少なくとも４ログ富化を一貫して表示した
（データ表示無し）。さらに、各クローンは、回収ファ
ージの15％（ZnlA1として）から85％（ZnlB8として）の
範囲の一貫した程度の保持を示した。
ZnlB8は、その結合ドメイン内にあるヒスチジンが最
少のため、ヒスチジンの絶対数がZn（II）−IDAに対す
る結合の効率の唯一の決定要素ではないようである。ヒ
スチジン残留物を分離する配列も、直接的（配位金属に
より）あるいは間接的（ヒスチジン／金属相互作用に影
響を及ぼすことにより）に、保持に貢献するに違いな
い。複数の研究（ヘムダン等、1989年、Proc.Nat′l.Ac
ad.Sci.,USA 86:1811−1815;イップ）がIMACによるタン
パク質保持は、主に表面ヒスチジンの数により決まると
の結論を出しているが、別の機能群も結合に貢献するこ
とが示されている（イップ）。
さらに、ヒスチジンの分布が最大のTSAR（ZnA12）とZ
nlB8がZn（II）−IDAによる保持が最低であることを示
すことが実験により実証されている。この観察結果は、
無作為ペプチド内にヒスチジン相互に統計学的に有意な
位置バイアスが検出されなかった事実に一致している。
恐らく隣接するヒスチジン残留物の配位幾何学は分離し
ているヒスチジン残留物より好ましくないため、長さｎ
のポリヒスチジンの結合に対する貢献度が予測されない
ペプチド内に無作為に散乱するｎ個のヒスチジンより低
いことは妥当なようである。
識別されたZn−結合タンパク質の結合特異性を、Z
n+2、Cu+2又はNi+2が付加されているIDAカラムを用いて
クロマトグラフィーにより評価した。1mlの100mMトリス
−HCl、150mM NaCl、0.1％ツィーン−20、pH7.5（T100N
T）における特定のZn−結合ファージ（１×1011pfu）を
Zn（II）−、Cu（II）−又はNi（II）−IDAカラムに入
れ、前記のようにカラムを洗浄した。ただし、T100NTを
T10NTの代わりにした。カラムを酸−Zn+2（T100NTにお
いて2ml 100mM ZnCl2、pH7.5）又はイミダゾール（T100
NTにおいて2ml 100mMイミダゾール、pH7.5）で溶離し
た。３個の画分を集めて、ファージの存在に対して滴定
濃度にした。洗浄画分（■）、滴定濃度画分 とT10NTに再懸濁の金属II−IDAカラムマトリックス
（□）。その結果を第16図ＡとＢに示す。
第16図ＡとＢに示すように、Zn結合TSARもCu（II）−
IDAに結合し、それよりも程度は小さいがNi（II）−IDA
にも結合する。さらに、第16図Ｂに示すように、Zn結合
TSARは、充填されていないIDA−セファロースにより保
持されず、Zn（II）、つまり、T100NT中のZnCl2（pH7.
5）で溶離された。
Zn+2結合に対して前記のように、Cu+2及びNi+2の結合
TSARについてTSAR−９ライブラリーをスクリーニングし
た。ただし、IMACにはCu+2又はNi+2を充填した。
表３及び４表に、銅（Cu+2）結合TSARとニッケル（Ni
+2）結合TSARの結合ドメインのアミノ酸配列を示してい
る。
得られた結果に基づき、金属イオン結合TSARとかかる
TSARの一部から成るペプチドは、例えば、各種のタンパ
ク質やペプチドの親和性クロマトグラフィー精製法の開
発に有効であるはずである。
ある特定の用途において、金属イオン結合TSAR（又は
その一部）が化学的に、あるいは、再結合法により、合
成中のタンパク質に取り付けられる。金属イオンはカラ
ム上で固定され、カラムは反応混合物、培地又は細胞抽
出物からの所望のタンパク質の精製に有効率に使用され
る。別の用途では、金属イオン結合TSAR（又はその一
部）が親和性カラムに結合され、有毒排水又は患者血液
サンプルなどの生物学的液体などの溶液からZn（II）、
Cu（II）又はNi（II）などの有毒重金属イオンの除去に
使用される。さらに別の用途では、例えば、クロモフォ
アル・トリプトファンを化学的又は再結合法により、
湖、河、工業排水、血液やリンパ液などの生物学的液体
の水性見本あるいは液体見本における、Zn（II）、Cu
（II）、Ni（II）などの金属イオンの存在の検出に有益
に使用するバイオセンサーに有効な金属イオン結合TSAR
又はその一部に取り付けることができる。
7.4 ポリクローナル抗体を結合するTSARの確認 別の一連の実験において、TSAR−９ライブラリーをポ
リクローナル抗体、つまり、ヤギ抗マウスFc抗体（GA
M）に対して結合特異性を有する、発現されたタンパク
質／ペプチドに対して、7.1に記載のスクリーニング法
を用いて選別した。
TSAR−９ライブラリーをポリクローナル抗体で次の手
順で選別した。親和性精製、ヤギ抗マウスFcポリクロー
ナル抗体（GAM）をシグマ・ケミカル社（ミズリー州セ
ントルイス）から購入し、磁気ビーズ（マサチューセッ
ツ州ケンブリッジ、アドバンスド・マグネチック）でイ
ンキュベートした。GAM被膜の磁気ビーズをTSAR−９フ
ァージで１時間から２時間、回転しインキュベートし
た。GAMに対して結合親和性を有するTSARを発現するフ
ァージを、強力磁石を用いて結合ファージGAMビーズ複
合体を除去して分離した。結合ファージを酸溶離、つま
り、50μl 200mMグリシンHCl、pH2.2、次いで100μl 1M
NaHPO4、pH7.0を行って、ビーズ複合体から取り除い
た。
GAM結合TSARの推測アミノ酸配列をDNA配列により決定
した。GAM結合ファージによりコードされたTSARの結合
ドメインのアミノ酸配列を表５に示している。表５に示
しているGAM結合TSARのすべてが、他のヤギ抗マウスポ
リクローナル抗体で被覆した磁気ビーズに結合しなかっ
た（データは示されていない）。このような結果は、ポ
リクローナル抗体が、一つずつ特異性が異なることを示
唆している。それゆえ、TSARをポリクローナル抗体の結
合に有効にする場合は、個々の患者毎にスクリーニング
を行うべきであり、このスクリーニングは、高速法と発
明のライブラリーを用いて効率的に行うことができる。
表５に提示のTSAR配列を検討すると、RT（I/L）（S/
T）KPの３個のGAM結合TSARが一致していることが示唆さ
れる。ゲンバンク（Gen Bank）を検査して、マウスγ−
2aとγ−３の重ポリペプチド鎖（RTISKP;aa216−221）
のFc領域内にこの配列が存在していることが明らかにな
った。それゆえ、この方法によりマップされる親和性−
精製ヤギポリクローナル抗体の主要標的の一つは、マウ
ス免疫グロブリン重鎖における不連続領域のようであ
る。おもしろいことに、この領域は脊髄動物の間で異な
っている。
表５に提示の残りのGAM結合TSARは、他の３個のGAM結
合TSARとは異なり、ヤギ抗マウスIgビーズに効果的に結
合する。挿入配列のどの部分（つまり、一次側、二次
側）が結合させるのか明らかでない。注目すべきことと
して、このTSARの一次側配列が、検査したマウス免疫グ
ロブリン配列に整合しないことである。
得られた結果に基づき、GAM結合TSAR及び配列番号64
−67などの、かかるTSARの一部を構成するペプチドは、
他の種に対する交差反応を回避する特定の抗マウス抗体
を商業的に調製するために有益であるはずである。さら
に、TSAR GAMバインダーは、免疫性のマウス抗体の特異
的領域の説明に有効であった。この情報は、ヒトのin v
ivoに使用する修正マウス抗体の設計に有効であり、こ
のような免疫性配列が不足している修正抗体がヒト抗マ
ウス抗体（HAMA）反応の頻度を減少させるはずである。
7.5 TSARと結合したC46抗体の識別 さらに他の一連の実験で、発がん性が未発達の抗原
（CEA）のモノクローナル抗体、即ち、抗CEAのC46抗体
に対する結合特異性を有する発現された蛋白／ペプチド
について、TASAR−９ライブラリーのスクリーニングを
行った（Rosenstrausら、1990、Cancer Immunol,Immuno
ther.32:207−213参照） 前記7.2節に示したように、C46モノクローナル抗体と
結合する蛋白／ペプチドについて、TSAR−９ライブラリ
ーをスクリーニングした。ただし、7E11−C5モノクロー
ナル抗体の代わりに用いられているモノクローナル抗体
C46を除く。
C46モノクローナル抗体に特異な結合親和性を示すTSA
Rでコードした２個の組み換えファージを一貫性を持つ
ように分離した。これらのファージは抗前立腺腫瘍抗体
7E11−C5、又は、18F7抗体とは結合しなかった。18F7抗
体は、自己免疫疾患である全身性紅斑性狼瘡のマウス・
モデルと関連するSm抗原を認識するモノクローナル抗体
である（7.6節以降参照）。C47結合ファージによりコー
ドされたTSARの結合領域のアミノ酸配列を表６に示す。
特定された２個のC46を結合したTSARのアミノ酸配列
は、お互いの明白な類似性が小さいか、無かった。当
初、Barnettら、1988、Genomics 3:59−66で発表されて
いるヒトCEAの配列と比較したとき、配列番号16につい
て指摘されている独自性が小さいか無かった。他方、配
列番号68の短い領域、即ちアミノ酸残渣22−25に位置す
るIDVLは、CEA蛋白上の短い領域、即ち、アミノ酸残渣5
86−590のLDVLと一致していた。そうではあるが、その
ような４アミノ酸ロング・モチーフ［中心的模様が長い
部分］はTSARライブラリーからもっと頻繁に分離される
はずという事実にたって、C46抗体により認識されたエ
ピトープは単純で無いように見える。
C46を結合したTSARが、C46抗体の抗原結合部位を認識
する能力を低下のようにELISA分析を用いて評価した。
マイクロ滴定用のディッシュ・ウエルにC46モノクロ
ナール抗体（100mMのNaHCO3中に5g/ml、pH8.5）50μｌ
に４℃で２時間塗布した。そのウエルに50μｌのBSA（1
00mMのNaHCO3中に1g/ml、pH8.5）を加え、ウエルを30分
間室温で放置した。ウエルをPBS−0.05％ Tween20で洗
浄した（5x）。
各ウエルに25μｌのどちらかのC46結合のファージ（C
46.9−１又はC46.9−２）25μｌ及び高純度CEAの量を増
加させて（１、25、250、2500ng）加えた（Scripps Cl
inic）。室温での２時間の放置の後で、ウエルをPBS−
0.05％ Tween20で洗浄した（10x）。次に、200mMのグ
リシンHCl（pH2.2）25μｌをウエルに加え、室温で５分
間放置した。次にその液を、1MのNaHPO4が50μｌ入って
いる新しいマイクロ滴定用ディッシュ・ウエルに移し
た。次に、ウエルの内容物を連続的に希釈し、アリコー
トをプラークをカウントするために放置した。結果を図
17に示す。
図17に示すように、CEAは、C46抗体と結合するため
に、両方のC46結合のTASRと効果的に競争していた。
C46.9−２結果のTSAR、即ち配列番号69の結合領域内
の一連の重なるように８分割（８−mer）したペプチド
を合成して、C46モノクロナール抗体との反応性を調査
した。合成された８分割ペプチド（８−mers）のアミノ
酸配列は以下の表6aに示す。
より具体的には、「ペプチド・オン・ピン」（Chiron
Mimotopes,Victoria,Australia）として入手した合成
８分割標本を、メーカーが示唆した通りにELISA分析を
用いて、潜在的なエピトープ及びミモトープを特定する
ために評価した。メーカーの指示に基づいて、C46モノ
クローナル抗体と共に、特定の「ペプチド・オン・ピ
ン」を放置した。ウエルを洗浄し、アルカリ・ホスファ
ターゼと結合したヤギの抗マウス抗体と共に放置した。
ｐ−ニトロフェニル・ホスフェート（U.S.Biochemical
s,Cleveland,OH）を用いた色反応が開発された。ウエル
を405nmの波長で、ELISAプレート・リーダーを用いて走
査した。ELISA分析の結果を図18に示す。
図18に示すように、C46.9−２から得られた１個の特
定８分割標本即ち配列番号157がC46抗体と有意な反応性
を示した。他の８分割標本のどれもC46抗体と有意な反
応性を示さなかった。
最初に、Barnettら（前記）が発表している既知のCEA
の配列と比較したときに、配列番号69について気づいた
独自性は小さいか無かったけれども、C46抗体と有意な
反応性を持つ８分割標本のアミノ酸配列、即ち、配列番
号157は幾分、ヒトCEAに存在する配列SNPSPQYSW（配列
番号175）と類似している（Bernettら、前記参照）。CE
Aのアミノ酸配列全体に散在するいくつかのジペプチド
は配列番号157と指定された８分割標本に示されてい
る。そのような類似性及び図18に示されている結果に基
づいて、今回の方法を用いて特定した８分割標本は、CE
Aの不連続エピトープの直線的表示であるように見え
る。
同様に、C46.9−１、配列番号68の結合領域内で、分
析用の重なっている８分割標本のペプチドがペプチド・
オン・ピンとして合成され、C46モノクローナル抗体と
の反応性について評価された。８分割標本のどれもC46
抗体との有意な反応性を示さず、結合に重要な残渣が単
純８分割ペプチド内で表示できないことが示された。C4
6.9−１ペプチドとC46の結合は不連続エピトープによる
可能性がある、又は、特殊な適合性を必要とする可能性
がある。このことは、本方法が抗体結合部位の不連続な
エピトープ又はミモトープを特定するのに極めて有用で
あることを示している。
不連続エピトープは変性及び（又は）還元条件により
悪影響を受けることがある。それで、そのような条件下
では、標的の抗原にも結合しなくなる。種々の濃度（22
0mM、100mM、80mM、60mM、40mM、20mM、0mM）のジチオ
テレイトール（DTT）で変性されたCEAへのC46モノクロ
ーナル抗体の反応性を評価した（各試験について、１μ
ｇのCEA、１μｇのC46を使用）。約80mM以上の濃度で、
還元し、DTTで処理されたCEAへのC46の結合は検出され
なかった。他の実験では、CEAはヨードアセトアミドで
アルキル化され、次に種々の濃度のDTT（０、20、40、8
0、160mM）で還元された。アルキル化と還元を行ったCE
AのC46抗体への結合をELISA分析形式のヤギの抗マウス
アルカリ・ホスファターゼ二次抗体を用いて分析した。
40mM以上のDTTの濃度で、アルカリ化と還元を行ったCEA
の結合は著しく減少した。そのような結果はCEAに不連
続のエピトープが存在することと一致していて、配列番
号68を有するTSARと指定したC46.9−１と結合したC46の
アミノ酸配列により十分に模擬化しうる。
得られた結果に基づいて、TSAR、及び、例えば、配列
番号68−69のようなTSARの部分から成っているペプチド
と結合しているC46は免疫反応性の分析法の開発に、
又、C46抗体の親和性の精製に有用なはずである。上記
のように、そのようなTSARの合成は、例えば、結腸直
腸、卵巣又は乳がんに対するワクチン調製に有用なエピ
トープのミメトープ調製にも有用であろう。さらに、TS
ARの合成は抗CEA抗体特にC46の商用生産のための品質管
理用分析法形成にも有用であろう。
7.6. TSARと結合した抗Sm抗体の識別 更に他の一連の実験で、以下のように、マイクロ滴定
用プレート形式でELISA分析を用いて（Debra Bloom and
Stebe Clark,University of North Carolina,Chapel H
ill,NCからの贈与として入手した）自己免疫疾患である
全身性紅斑性狼瘡のマウス・モデルと関連するSm抗原の
SmB蛋白を認識する２種のモノクローナル抗体の一方に
対して結合特異性を有する発現蛋白／ペプチドについ
て、TSAR−９及びTSAR−12ライブラリーを調査した。
50μｌのSm抗体を100mMのNaHCO3、pH8.5で、１μg/ml
に希釈して、マイクロ滴定用のプレート（Corning）の
ウエルに入れた。プレートは４℃で一晩放置した。100
μｌのBSA溶液（mMのNaHCO2、pH8.5で1mg/ml）を加え、
プレートを１時間室温で放置した。マイクロ滴定用のプ
レートを空にし、ウエルをスクイーズ・ボトルを用い
て、PBS−0.05％ Tween 20で注意深く洗浄した。
プレートは５回洗浄し、未結合の抗体を除去した。次
に、25μｌのファージ溶液を各ウエルに導入し、プレー
トを室温で１−２時間放置した。マイクロ滴定用プレー
ートの内容物は除去して、スクイーズ・ボルトを用い
て、PBS−0.05％ Tween 20を注意深くウエルに満たし
た。プレートは未結合のファージを除去するために５回
洗浄した。プレートは洗浄溶液と共に20分間室温で放置
して、結合ファージが高い分離係数で除去できるように
した。次に、ウエルを５回を超える回数洗浄して、残っ
ている未結合のファージを除去した。
ウエルに結合したファージはpH変化による溶出により
回収された。50mMのグリシンHCl（pH2.2）50マイクロリ
ットル、10mg/mlのBAS溶液を添加してウエルを洗浄し、
蛋白を変性させ、結合ファージを除去した。次に、５−
10分後、内容物を洗浄なチューブに移した。そして、1M
のTris−HCl（pH7.5）又は1MのNaH2PO4（pH7）100μｌ
を添加して、ファージ・サンプルのpHを中性化した。次
に、ファージを10-3から10-6に希釈し、サンプルのプラ
ーク形成単位数を決定するために、アリコートに大腸菌
のDH5αＦ′細胞を塗布した。ある場合に、プラークの
色判別のためにXGal及びIPTGの存在下で、塗布が行われ
た（即ち、lacZ+プラークはブルー、lacZ-プラークは
白）。入力サンプルの滴定も比較のために行われた（希
釈は一般に10-6又は10-9）。
順調な結果を得たスクリーニング実験では、一般に、
連続的スクリーニングを３回行った。連続スクリーニン
グは以下のように行った。第１に、ライブラリーをスク
リーニングし、回収されたファージを直ちに再スクリー
ニングした。第２に、第２回の後で回収されたファージ
はManiatisに基づいてプレート増殖をした。〜5mlのSMG
でプレートをおおって、４℃で一晩放置することによ
り、ファージをSMGに分離した。第３に小さな部分標本
をプレートから採取して再スクリーニングした。回収し
たプラークは低密度に塗布して、個々の分析のために分
離したプラークを作成した。
個々のプラークを爪楊枝で取り出し、2xYT内の大腸菌
Ｆ′細胞の培地に移した。37℃で一晩の培養の後、培地
は遠心分離で分離した。上澄み液を清浄なチューブに移
し、ファージ原料として保存した。全体として、４℃で
安定させた時、1012pfu/mlの滴定値になった。次に個々
のファージの部分標本について、抗体が結合しているEL
ISAプレートと結合し、かつ、他のプレート・ウエル
（即ち、BSAを塗布したミクロ滴定用ウエル又は種々の
対照用抗体を塗布したウエル）に結合しないかどうか再
検査した。
抗Smの18F7の抗体を結合しているファージによりコー
ドされたいくつかのTSARの結合領域のアミノ酸配列を表
７に示す。抗Smの22G−12の抗体を結合しているファー
ジによりコードされたいくつかのTSARの結合領域のアミ
ノ酸配列を表８に示す。
（注１）NH2及びCOOHの末端残基になる非変異アミノ酸
は示されていない。
（注２）このTSARは全長ではない。この先端切断は生体
内の組み換えによるか、又は、クローン生成したオリゴ
ヌクレオチド断片内の内部XBa １部位の発生による。
（注３）Ｘは決定されたヌクレオチド・配列内の不確実
性により識別不能のアミノ酸残基を示す。
たTSARのアミノ酸配列は、5B蛋白内の配列RVPを除い
て、主要なSm抗原に主要な共通配列ないし類似性が無い
ことを示している。そうではあるが、モチーフ、即ち、
DGVP、NXRVP、LNP（H/Y）（I/L）（L/A）があり、TSAR
をコードしているいくつかのファージ内に存在している
ように見える。非モチーフ・配列も分離された。これら
の予備データから、抗原は不連続エピトープを認識して
いること又は異なるモチーフが同じ又は類似の構造をと
れることを創造させる。表８に示されている抗Smの22G1
2を結合しているTSARのアミノ酸配列はモチーフのＥ（V
/L/R）（N/F/N）RYP及び非モチールの配列も示してい
る。
7.7 TSARを結合しているストレプタビジンの識別 他の一連の実験で、TSAR−９及びTSAR−12ライブラリ
ーをスクリーニングして、ストレプタビジン（SA）の結
合特異性を有する発現蛋白／ペプチドを探した。SAを塗
布した磁気ビーズ（Advanced Magntics,Cambridge,MA）
に結合するライブラリーからファージを分離した。チュ
ーブに移して、60分間放置した後で、ファージとビード
の複合体を強力磁石で回収した。結合ファージは前記7.
1節に示したように、200mMのグリシンHCl（pH2.2）で回
収し、pH7.0で中性化した。さらに２回の精製の後で、
個々のプラークを分離した。（SAへの結合ファージスク
リーニングで除外された）非結合ファージと比較して、
回収したファージの大部分がSAへの結合が＞105倍高か
った。
２回のスクリーニング実験で、個々のTSARを結合して
いるSAがTSAR−９ライブラリーから１倍から20倍回収さ
れ、２種類のクローンが分離された。TSAR−９ライブラ
リーから分離されたファージを結合したSAによりコード
されたTSARの結合領域のアミノ酸配列が表９に示されて
いる。TSAR−12ライブラリーから分離されたSA結合ファ
ージについては対応する配列は決定されなかった。表９
は結合ファージが２分類に分類できることを示してい
る。第１に、SAと結合したペプチドの大部分がコンセン
サス・モチーフHP（Q/M）Θを共有している（ここでΘ
は非極性のアミノ酸を示す）。コンセンサス・配列はラ
ンダムな15のアミノ酸ファージのライブラリー（Devlin
ら、1990、Science 249:404−406）及びビーズ上の合成
ペプチド（Lamら,1991、Nature 354:82−84）を用いて
決定されたものと類似している。HP（Q/M）Θモチーフ
はファージ・インサートの種々の部位で発現できる。さ
らに、このモチーフは多くの場合（即ち、69％）、アミ
ノ酸Ｐ又はＤによりCOOH側の側面に位置する。第２に、
コンセンサス・配列が欠けていて、お互いに明白な類似
性を有していないSA結合ペプチドの小分類がある。その
ような分類はSA結合親和性でスクリーニングした他の小
規模ライブラリーの説明では報告されていない。
表９に示したSA結合TSARのアミノ酸配列を検討する
と、（１）−を非極性アミノ酸残基であるものとして１
つのコンセンサスモチーフつまりHP（Q/M）（−）を共
有する13のタンパク質のグループ（「マチーフ」タンパ
ク質）と（２）このようなコンセンサスモチーフを共有
しないタンパク質の小さいグループ（「非モチーフ」タ
ンパク質）、という２つの別々のクラスにタンパク質を
分類することが可能であるということがわかる。このモ
チーフは、無作為のオリゴヌクレオチドコーディング配
列の長さ全体にわたりさまざまな位置に見られる。非モ
チーフタンパク質は、アミノ酸配列に関して、相互間で
又はモチーフタンパク質との間で見かけの類似性を全く
もたない。
SAに対するファージの相対的結合を比較するため、フ
ァージのうちのいくつかをLacZ+（青色）に変換させ、
その他のLacZ（白色）ファージと混合させた（1:1）。
モチーフSA結合TSARsは同等に良好に結合すると思わ
れ、一方非モチーフSA結合TSARsは、モチーフSA結合TSA
Rsより約５倍良好に結合した。
ストレプトアビジンに対する同定されたタンパク質の
結合の特異性は、ジアミノビオチン、イムノビオチン、
リポ酸及びイミターザリドンを含む、ビオチンといくつ
かのビオチン類似体による結合阻害を評価することによ
って調査された。SA−1,−2,−４及び−14（配列番号11
6、114、104及び117）という。表９に示された４つの代
表的TSARを評価した。ストレプトアビジンに対する代表
的TSARsの各々との結合は、テストされたビオチン及び
全てのビオチン類似体によって完全に阻害された。それ
ぞれ約0.2,3,1050及び5000μＭのIC50値が観察された。
さらに、４つの代表的SA−結合剤を用いて、アビジン
に対するSA結合TSARの結合が評価された。SA及びアビジ
ンが各々ビオチンに対する親和性をもつ構造的に類似し
たタンパク質であるにせよ、SA結合TSARsのいずれも、
未変性又は非グリコシル化アビジンに対し結合すること
はできなかった（Accurate Chemicals,Westkury,NY）。
かくして、結合ドメインは、選択したリガンドに対する
高い特異性を有すると思われる。
得られた結果に基づくと、ストレプトアビジン結合TS
ARs及び、例えば配列番号103〜117といったこのようなT
SARの一部分を含むペプチドはビオチン−ストレプトア
ビジン結合が一般に利用されているあらゆる利用分野に
おいて特に有効であるはずである。例えば、SA結合TSAR
配列又はその一部分は、かかるTSARをコードするオリゴ
ヌクレオチドをタンパク質をコードする遺伝子内に挿入
することによって又はTSARを合成しタンパク質に化学的
に付着させることによって、問題のタンパク質へと工学
処理することが可能であろう。このような問題のタンパ
ク質は、ストレプトアビジンカラムを用いて、効率良く
親和力精製することができるだろう。さらに、ビオチン
・ストレプトアビジン結合を利用する全ての検定様式が
SA結合TSAR又はその一部分をビオチンの代わりに使用で
きるであろう。
7.8 ポリスチレンを結合するTSARの同定 もう１つの実験においては、TSAR−12ライブラリーの
多くの発現されたタンパク質が単独で磁気ビーズに結合
するものと思われた。従って、もう１つの一連の実験に
おいては、ポリスチレンに対する結合特異性をもつ発現
されたタンパク質／ペプチドについて、TSAR−12ライブ
ラリーをスクリーニングした。上述のとおりの「ふるい
分け」技術においては、２つのタイプの被覆されていな
いポリスチレン磁気ビーズ、すなわちAdvanced Magneti
csとDynalが使用された。強磁石を用いてタンパク質−
ビーズ複合体を除去し、上述の通り、結合したファージ
を回収した。
さらにもう１つの一連の実験においては、被覆されて
いないポリスチレンマイクロプレートを用いてポリスチ
レンに対する特異性をもつタンパク質についてTSAR−12
ライブラリーをスクリーニングした。酸変性を用いてプ
レートからポリスチレン−ビーズ結合ファージを解離さ
せた。
ポリスチレン結合TSARの結合ドメインのアミノ酸配列
は表10に示されている。大部分の分離株は１回だけ回収
した。見かけ上の線形モチーフは全くないものの、ペプ
チドはトリプトファン、チロシン及びグリシンを豊富に
含み、アルギニン、バリン及びリジンが少なく、システ
イン残基は完全に欠如している。
表10で実証した通り、ポリスチレンに対する結合親和
力を有する数多くのTSARが同定された。ポリスチレン結
合TSARは、ビーズ又はプレートのいずれかの形状をした
プラスチックに対して結合する。これらのTSARは、ポリ
塩化ビニル又はポリプロピレンに対して結合しない。
得られた結果に基づくと、ポリスチレン結合TSAR及
び、例えば配列番号118〜134といったこのようなTSARの
一部分を含むペプチドは、ELISA検定の改善にとって有
用であるはずである。例えば特定の一実施態様において
は、特異的方向性でのポリスチレンの表面へのタンパク
質はペプチドの結合を導くポリスチレン特異的部位を含
むよう、タンパク質及び／又はペプチドを工学処理する
ことはできる。この結果、タンパク質の表示はより優れ
たものとなり、感応性は増大する。ポリスチレン特異的
TSAR又はその一部分は、かかるTSARをコードするオリゴ
ヌクレオチドをタンパク質をコードする遺伝子内に挿入
することによってか又はTSARを合成してタンパク質に化
学的に付着させることによって、問題のタンパク質へと
工学処理することができる。一実施態様においては、１
つの抗体のFc領域に対してポリスチレン特異的TSAR又は
その一部分を付着させ、このような抗体全てが、そのFc
領域を下にしてその抗原結合部位を同等に露呈させ、EL
ISA検定様式における結合のために充分利用できるよう
にした状態でポリスチレン表面に結合できるようになっ
ている。
7.9 カルモジュリンを結合するTSARの同定 さらにもう１つの一連の実験においては、カルモジュ
リン（CaM）に対する結合特異性を有する発現されたタ
ンパク質／ペプチドについて、TSAR−12ライブラリーを
スクリーニングした。
特に、TSAR−12ライブラリーを、以下の通り、CaMに
対する結合について連続的に３度スクリーニングした。
ELISAプレートを１晩４℃で、100mMのNaHCO3中の１μ
g/mlのカルモジュリン（pH8.5）を用いて被覆した。フ
ァージの非特異的結合を遮断させるため、各々のウェル
に対し100mMのNaH2CO3中2mg/mlのBSA（pH8.5）を200μ
ｌ加え、プレートを１時間室温でインキュベートした。
遊離カルモジュリンタンパク質を除去するべきPBS−0.0
5％−Tween20で５回ウェルを洗浄した後、50μｌのファ
ージ（1011hfu/ml）を、室温で２時間のインキュベーシ
ョンのために付加した。結合したファージを回収する前
に、ウェルをPBS−0.05％ Tween20で10回洗浄した。結
合したファージを200mMのグリシン−HCl（pH2.2）25μ
ｌで溶出し、次に100mMのNaPO4（pH7.5）50μｌを付加
してpHを中和させた。回収したファージを直ちに再度ス
クリーニングし、ELISAプレートに２度目に結合したフ
ァージをプレート増幅させた。増幅されたプレート上の
ファージを、PBSでの３時間のインキュベーション後に
収集し、次に３度目のスクリーニングをした。
３回の連続スクリーニングは、CaMに結合するTSARを
コードしたファージ分離株を生成した。スクリーニング
段階の各々におけるアリコートをm663青色ファージと混
合し、CaM被覆されたELISAプレートに対する結合につい
て同時にスクリーニングさせた。スクリーニングの各回
で、ライブラリー組換え体（白色）の収量は著しく増大
した。３回目のスクリーニングの後、37℃で一晩2xYT中
のE.coli DH5αＦ′細胞の2mlの培養の中で、８つの分
離株を成長させた。これらの培養中のファージを次にCa
Mに対するその培養について個別に試験した。８つのう
ち７つのファージがCaMを結合することが立証された。
さらに、CaM結合ファージはBSA又はポリスチレンを結合
しない。
TSARをコードする７つのファージのオリゴヌクレオチ
ドを配列決定したところ、TSARの結合ドメインをコード
する同一のDNAインサートを支持していることがわかっ
た。
CaM−12.1と呼称される。CaM結合TSARの結合ドメイン
の演繹されたアミノ酸配列（配列番号135）は、以下の
表11に示されている。
表 11 カルモジュリン結合TSAR1 Ｖ PRWIEDSLRGGAA Ｒ AQTRLASA NH2及びCOOHは末端残基における不変アミノ酸は示し
ていない。
CaMに対する親和力を有するその他のメンバーを同定
できるか否かを見極めるため、わずかに異なる方法を用
いて、TSAR−12ライブラリーを再度スクリーニングし
た。これを行うため、ライブラリーのアリコートをビオ
チニル化されたCaMと混合し、結合したファージを（ス
トレプトアビジン）SA−磁気ビーズで回収した。TSARラ
イブラリーからのSA結合ファージの分離を防ぐため、洗
浄に先立ちビーズ複合体に対して、余剰の遊離ビオチン
を付加した。遊離ビオチンはSAに対してきわめて良好に
結合するため、ライブラリー内の全てのSA結合ファージ
の結合と競い退けた。洗浄溶液からビーズを回収するの
に純磁石を使用しながら、PBS−0.05％のTween20で10回
ビーズを洗浄した。結合したファージ50μｌの50mMグリ
シン−HCl、pH2.2で溶出させ、次に100μｌの100mM NaP
O3（pH7.5）を付加してpHを中和した。回収したファー
ジを直ちに再度スクリーニングした。ファージ溶液をビ
オチニル化したCaMで混合し、ファージ−CaM複合体を、
SA磁気ビーズで回収した。
２度目に結合したファージを、プレート増幅させた。
増幅されたプレートからのファージを、次に、CaMで被
覆されたELISAプレートに対する結合についてスクリー
ニングした。これらのファージはCaMに対し結合するも
ののBSA被覆されたウェルには結合しないことがわかっ
た。CaM被覆されたウェルから回収したファージを次に
プレート増幅し、CaMで被覆されたウェルで４度目のス
クリーニングを行った。このとき成長したファージを個
々の分離株として回収した。CaMで被覆されたウェルに
対する結合について48の分離株をテストし、うち47は結
合すると思われた。これらのファージのうち９個を配列
決定し、その全てに同一のヌクレオチド配列をもつ合成
オリゴヌクレオチドが挿入されていることがわかった。
この配列は、上の表11で示したTSAR CaM−12.1の配列
（配列番号135）と一致した。かくしてTSAR CaM−12.1
を発現するファージ、２回の別々の異なるスクリーニン
グ実験から反復的に分離された。
さらにいくつかの方法は、CaMP12.1 TSARの結合特性
を検査した。まず第１に、その他のカルシウム結合タン
パク質を結合するCaMP12.1ファージの能力についてテス
トした。これはパルブアルブミン又はビタミンＤカルシ
ウム結合タンパク質（共にSigma,St.Lonis,MOからのも
の）で被覆されたELISAプレートウェルと結合できなか
った。これは又、カルモジュリン結合タンパク質、カル
シニューリン（Sigma,St.Lonis,MO）にも結合しなかっ
た。第２に、CaMとのCaM−12.1ファージの結合について
競合する天然カルモジュリン結合ペプチド及びタンパク
質の能力をテストした。予備実験は、CaM依存性タンパ
ク質キナーゼ（＃208734;Calbiochem,San Diego,CA）及
びミツバチ毒メリチン（＃444605;Calbiochem,San Dieg
o,CA）の結合ドメインに対応するペプチドが、CaMに対
するCaM結合TSAR CaM−12.1と競合しうることを示唆し
た。第３に、合成非ペプチドCaM拮抗体W7（＃681629;Ca
lbiochem,San Diego,CA）の能力を、CaMに対するCaM−1
2.1の結合について競合するその能力に関してテストし
た。W7は、CaMに対する結合について、CaM−12.1と競合
すると思われる（結果は示さず）。要約すると、（１）
CaM−12.1は、それが高親和力のCa2+結合タンパク質で
あるからではなく、特異的にCaMを結合する；（２）CaM
−12.1は、CaM依存性タンパク質キナーゼペプチド、メ
リチン及びW7の結合部位と部分的に重複するか又はこの
部位により影響される部位においてCaMを結合する。
CaM結合ファージは同様に、遊離カルシウムイオンの
存在下及び不在下でCaMを結合するその能力についても
テストされた。カルシウムイオンが存在するか又は不在
である条件を提供するべくウェルに対し10mMのCaCl2又
は1mMのEGTAのいずれかが付加された予備実験におい
て、７つのCaM結合TSARは全て、両方の処置において等
しく良好に結合し、それらがカルシウムに依存しない形
でカルモジュリンを結合するということを示唆してい
た。しかしながら、恐らくは、使用したEGTAの濃度が検
定中の全てのカルシウムイオンを結合するのに不充分で
あったと思われた。より高い濃度のEGTAを用いて、付加
的な実験を行った。特定的に言うと、1mM、5mM又は10mM
のEGTAを付加した。図19に示されているように、CaM結
合ファージの配列STVPRWIEDSLRGGAARAQTRLASAK-（配列
番号176）に基づいて合成されたペプチドは、カルシウ
ムに依存した形でCaMを結合することが示された。さら
に、10mMのEGTAによってファージ結合が阻害されたウェ
ルに対してカルシウムイオンが付加し戻された時点で、
CaMに対するファージの結合は回復された。
表示されたペプチド配列VPRWIEDSLRGGAATAQTRLASA
（配列番号135）がCaMに対するファージCaM.12−１の結
合の原因であったことを証明するため、ビオチニル化さ
れたＣ末端をもつペプチドとして配列STVPRWIEDSLRGGAA
RAQTRLASAK（配列番号176）を調製した。ビオチンの存
在により、ストレプタヒージン結合したアルカリ性ホス
ファターゼを伴うペプチドの検出が可能となった。ELIS
Aにより、ペプチドが固定化されたCaMを効率良く結合す
ることが観察された。
ペプチド−CaM複合体に安定したものであり、50％の
解離には最高20分を要する。このことは、以下の実験に
より確認された。まず第１に、ビオチニル化されたペプ
チド、配列番号176を、ストレプトアビジン分子１個に
つき１つのペプチドというモル比で100μｌのPBS−Wwee
m20中のストレプトアビジン結合したアルカリ性ホスフ
ァターゼと混合した。15分後、1nMのビオチン、1mMのCa
Cl2及び10μg/mlのBSAを含むPBS−Tween20を用いて、試
料を10mlになるまで希釈した。試料をウェル間で分配
し、３時間室温でインキュベートした。ウェルを５回洗
浄し、ウェルに対して100μｌの緩衝液（PBS−Tween2
0、25μg/ml CaM）を付加した。さまざまな時点で、液
体を除去し、リン酸ｐ−ニトロフェニル（U.S Biochemi
cals,Cleveland,OH）で置き換えた。ウェルを、405nmの
波長でELISAプレート読み取り装置（Molecular Device
s）により走査した。
配列番号176ペプチドがどこでCAM分子を結合したかを
見極めるため、我々は、CaMの中央のリンカー領域に結
合することを以前に示されていたその他のペプチドとの
結合を遮断するよう試みた（Persechimi及びKretsinge
r,1988,J.Cardiovasc,Pharmaclo 12:Sl−12:Ikura et a
l.,1992,Cell Calcium（細胞カルシウム）13:391−400;
Chapman et al.,1992,Biochemistry（生化学）31:128 1
9−25;Meador et al.,1992,Science（科学）257:251−2
55を参照のこと）。さまざまなタンパク質を結合してCa
2+に依存する形でその活性を調節するのはこの領域であ
る。CaM依存性タンパク質キナーゼII（Payne et al.,19
88,J.Biol.Chem.263:7190−7195）及びミオシンＬ鎖キ
ナーゼ（Ikura et al.,前出:Means et al.,1991,Adv.Ex
p.Med.Biol.,304:11−24:Persechini及びKretsinger,前
出）のCaM結合ドメインに対応するペプチドは、CaMに対
するペプチド（配列番号176）の結合と競合することが
わかった（図20）。これらの結果は、配列番号176のペ
プチドが、CaM依存性タンパク質キナーゼII及びミオシ
ンＬ鎖キナーゼのCaM結合ドメインと同じ又は隣接する
部位でCaMを結合するということを実証している。
ペプチドは同様に、定常状態蛍光法によって１μＭの
KDでCa2+に依存する形でCaMを結合するということも観
察された（図21参照）。スペクトルの最大値における青
色シフトが、ペプチドのトリプトファン残基がCaMとの
複合体内でより疎水性の環境に入るということを示して
いた（図22参照）。時間分解測定によって、ペプチドが
CaMに対する結合において著しい構造的変化を受けるこ
ということがわかる。
CaMに対するCaM特異的TSARの結合の原因である部位が
５つ又は６つの残基のペプチドにすぎなかったならば、
TSAR−12ライブラリーから約10〜20のCaM結合TSARを分
離することを予想したことだろう。しかしながら、わず
か１つの特定のCaM結合TSARのみが反復的に分離された
ことから、CAM特異的TSARとCAMの間の相互作用の部位は
複雑である。すなわち部位は単に５〜６個以上の残基を
必要とすると思われる。CaMに対する結合に関与する配
列176の領域を例示するため、カルモジュリンについて
配列番号176の結合と競合する４つの修正されたペプチ
ドの能力を検査した。修正されたペプチドは、（ａ）Ｎ
末端13残基STVPRWIEDSLRG配列番号179;（ｂ）Ｃ末端13
残基GAARAQTRLASWK配列番号180;（ｃ）位置４でＷがAST
VPRAIEDSLRGGAARAQTRLASWK配列番号178に変更された配
列番号176のペプチド；及び（ｄ）逆配列KASALRTQARAAG
GRLSDEIWRPVTS配列番号177をもつペプチドであった。図
23を見ればわかるように、４つのペプチドのいずれも、
カルモジュリンに対する結合に関して配列番号176と競
合することができなかった。さらに、混合されたＮ末端
及びＣ末端ペプチドも配列番号176と競合できなかっ
た。従って、ペプチドのＮ末端及びＣ末端の両方の半分
の中の特異的残基が、カルモジュリンに対する結合のた
めに重要である。従って、この結合剤は、結合ドメイン
が約20個のアミノ酸よりもはるかに小さいライブラリー
内では同定され得なかった。
得られた結果に基づくと、配列番号135又は136を含む
カルモジュリン結合TSAR又はこのTSARを含む組成物は、
悪性度の発達を伴う細胞増殖高血圧、うっ血性心不全、
不整脈及び胃腸障害などを含む広範は症状スペクトルの
治療において利用できるカルモジュリン拮抗体として有
用である。一般に、Mannhold,R.,及びTimmerman,H.,199
2年、Pharm.Weckbl−Sci,14（４）:161−66を参照のこ
と。
8.例:TSARライブラリーの発現のために有用なファージ
ミベクター 本発明に従ったTSARライブラリーの発現にとって有用
であるいくつかのファージミドベクターについて以下で
記述する。
8.1 ベクターpDAF1の構築 ベクターpDAF1は以下の通りに構築される。
ファージミドベクターpDAF1を作り上げるため、M13遺
伝子IIIのセグメントをBlue−script II sk＋ベクター
（Gen Bamk＃52328）内にトランスファした。このベク
ターは、細菌内で自律的に複製し、アンピシリン薬物耐
性標識及びベクターが或る一定の条件下で製造されM13
粒子内にパッケージングされ得るようにするf1複製起点
を有している。これらのM13ウイルス粒子は、ヘルパー
ヘアージによりコードされた野生型p III分子とファー
ジミドによりコードされた組換え型p III分子の両方を
支持することになる。これらのファージミドは、組換え
型p III分子の１つ又は２つのコピーのみを発現し、一
価表示系と呼ばれてきた（Garrand et al.,1991,Biotec
hnol.９:1373−1377参照）。遺伝子III全体を発現する
のではなく、むしろこのベクターは、遺伝子IIIの切形
形態をもつ〔ヒト成長ホルモンは、全長形態のNH2末端
で表示された場合にモノクローナル抗体に対しよりアク
セス可能であるということを実証したLowman et al.,19
91（Biochemistriy 30:10832−10838）を一般に参照の
こと〕。ここで構築されたファージミドベクターにおい
ては、TSARオリゴヌクレオチドは、成熟p III分子のア
ミノ酸198〜406に対応する切形p III分子の成熟未端に
おいて発現される。
好ましいベクターは、p IIIタンパク質のアミノ酸198
〜406、p III遺伝子内の短いポリリンカー及びポリリン
カーとp III分子の間のリンカーgly−gly−gly−serを
コードするpDAFである。このプラスミドは、プロモータ
からp IIIを発現し、適切なM13ウイルスアセンブリのた
めの細菌膜に対するp IIIの区画化の誘導のためPelBリ
ーダー配列を利用する。
PCRを介してM13mp8DNAからp III遺伝子の一部分（aa
198−406）を増幅するため、１対のオリゴヌクレオチド
をCGTTACGAATTCTTAAGACTCCTTATTACGCA（配列番号136）
及びCGTTAGGATCCCCATTCGTTTCTGAATATCAA（配列番号13
7）として設計した。これらのオリゴヌクレオチドは
５′末端近くにBamH I及びEcoR I部位を支持していたこ
とから、次に、PCR産物をBamH I及びEcoR Iで消化さ
せ、同じ酵素で消化されたpBluescript II SK＋DNAと連
結させ、形質転換によりE.coli内に導入した。組換え体
を同定した後、上流リボソーム結合部位を伴うPelBシグ
ナルリーダーをコードする付加的な２本鎖DNAセグメン
トをその中にクローニングさせた。このセグメントは、
オリゴヌクレオチドGCGACGCGACGAGCTCGACTGCAAATTCTATT
TCAA（配列番号138）及びCTAATGTCTAGAAAGCTTCTCGAGCCC
TGCAGCTGCACCTGGGCCATCGACTGG（配列番号139）を用いて
E.coli DNAからPCRによって調製された。PCR産物の末端
は、ベクター内にPst I,Xho I,Hand III及びXba I部位
の短いポリリンカーを導入した。Xho I及びXba I部位
は、組合わされたTSARオリゴヌクレオチドが上述のファ
ージベクター内の場合と同じ読取り枠内でクローニング
され発現されうるように、位置づけされた。ベクター内
に導入されたDNAの第３かつ最終のセグメントは、ポリ
リンカーと遺伝子IIIの間のリンカー配列gly−gly−gly
−gly−ser（配列番号141）をコードした。このリンカ
ーは、p III分子の反復した配列モチーフと一致し、発
現されたペプチドとp IIIタンパク質分子を分離するス
イベル点を作り出すべくキメラ遺伝子内に含み入れられ
た。このベクターはpDAF1と命名された。図3AはpDAFAフ
ァージミドベクターを概略的に示す。
8.2 ベクターpDAF2及びpDAF3の構築 ベクターpDAF2及びpDAF3はpDAF1から調製されるが、
各々がそれぞれPst I,Xho I,Hind III及びXba I制限部
位のポリリンカーのNH2及びCOOH末端側でｃ−mycコーデ
ィング配列を含んでいるという点で、親ベクターと異な
っている。図3B及びＣは、ファージミドベクターpDAF2
及びpDF3を概略的に示している。pDAF2及びpDAF3ベクタ
ーは、図3D内に概略的に示されている通りに構築されて
いる。
9.例:TSARライブラリーの発現のために有用なプラスミ
ドベクター 9.1 初期ベクターbJG200 プラスミドpJG200が、一般的なTSARD発現ベクターを
産生するように修正された出発物質であった。初期プラ
スミドpJG200は、プロテアーゼ感応性リンカーペプチド
についてコードするDNAの一片を介して検出可能な活性
をもつ標識ペプチドに対して修正な読取り枠内で融合さ
れた標的シストロンを含んでいた［Germino及びBastia,
1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:4692;Germino et a
l.,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:6848］。もとのベ
クターpJG200内のプロモータは、ファージラムダのPRプ
ロモータであった。このプロモータに隣接しているの
は、CI857熱不安定性抑制因子のための遺伝子とそれに
続くリボソーム結合部位及びファージラムダのcro遺伝
子のAUGイニシエータートリプレットである。Germino及
びBastiaは、適正な翻訳段階において、LacZβ−ガラク
トシダーゼに対してコラーゲン配列か融合されたベクタ
ーを産生するべく、ATGイニシエーターの次のBamH I制
御部位の中にニワトリpro−２コラーゲンの３重らせん
領域を含むフラグメントを挿入した。プラスミドR6K複
製イニシエータタンパク質コーティング配列を挿入する
ため、単一のBamH I制限部位を再生させて使用した。
プラスミドpJG200は、CI857抑制因子を不活性化しPR
プロモータからの転写開始を可能にした温度シフトの後
ハイブリッド融合産物として、R6Kレプリケーターイニ
シエータータンパク質を発現した。コラーゲン／β−ガ
ラクトシダーゼ融合に隣接しこれと同一枠内にあるATG
イニシエーターを伴う親ベクター構成体（非インサート
ベクター）も、ATGイニシエーターコドン（５′）及び
コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合（３′）に対し
て同一枠内で接合されたR6Kレプリケーターイニシエー
タータンパク質を含むpJG200（インサートベクター）
も、両方共、プラスミドで形質転換された細菌細胞内で
β−ガラクトシダーゼ活性を生成した。その結果、イン
サートを伴うプラスミドを含んだ細菌株は、いかなるイ
ンサートも伴わない親ベクターを含む菌株と区別不可能
である。
9.2 PR,CI857抑制因子及びCROのアミノ末端の除去 本発明に従ったpJG200に対する最初の変性は、融合タ
ンパク質のためのATG開始部位を提供したcroタンパク質
のアミノ末端、PRプロモーター、CI857抑制因子を含ん
でいたEcoR I−BamH Iフラグメントの除去及び置換であ
った。p258プラスミドを産生するべく、EcoR I部位を維
持すると同時にNco I,Bgl II及びBamH I制限エンドヌク
レアーゼにより認識された付加的なDNA配列をコードす
るオリゴヌクレオチドリンカーを挿入した。この修正に
より、コラーゲン／β−ガラクトシダーゼ融合と枠外に
ある新しいATG開始コドンが提供された。その結果、p25
8プラスミドで形質転換された細胞内にはβ−ガラクト
シダーゼ活性は全くない。その上、その修正により、cr
oタンパク質のアミノ末端が除去され、そのため、ATG開
始コドンに隣接して挿入された、結果として得られるあ
らゆる組換え型融合産物は、そのアミノ末端にcroコー
ドされたアミノ酸をもたないことになる。これとは対照
的に、もとのpJG200ベクターから発現された組換え型タ
ンパク質は全て、そのアミノ末端にcroコードされたア
ミノ酸を有している。
9.3 PTACプロモーター、シャイン・ダルガーノ配列及
びATGコドンの付加 TSAR発現ベクターの第２の構築段階においては、１つ
の制限フラグメントつまりpKK233−２のEcoR I−Nco I
フラグメント（Pharmacia,Biochemicals,Milwaukee,W
I）が、プラスミドp277を産生するべくEcoR I−Nco I制
限部位内に挿入された。その結果、p277プラスミドは、
pKK233−２のPTAC（PTRCとしても知られている）プロモ
ーター、lacZリボソーム結合部位及びATG開始コドンを
含んでいた。
p277プラスミドの中では、標的タンパク質配列の挿入
により、適当な菌株バックグラウンド内でのIPTG誘発可
能なプロモーターからのその転写が可能が可能になる。
適当な菌株バックグラウンドは、未誘発のPTACプロモー
タからの転写を阻害するのに充分なlac抑制タンパク質
を提供する。使用することのできる適切な菌株として
は、JM101又はXL1−Blueが含まれる。細胞は、化学物質
IPTGを少量付加するだけで誘導され得ることから、p277
プラスミドは、誘発のために温度シフトを必要とするプ
ロモーターに比べ商業的に多大な利点を提供する。例え
ば、PRプロモーターによる誘発には、pJG200のPRプロモ
ーターを阻害するCI185抑制因子を不活性化するために
温度シフトが必要となる。温度誘発可能なプロモーター
を含む商用量の細胞培養の誘発には、誘発のために必要
な温度シフトを生成するために大量の細胞及び媒質を加
熱するという不便な段階が必要である。
プロモーター変化のもう１つの付加的な利点は、細胞
が高い温度又は温度シフトを受けていないということに
ある、高い温度又は温度シフトは、結果として熱衝撃応
答及び、組換え型タンパク質ならびに宿主タンパク質を
分解させることのできる熱衝撃応答プロテアーゼの誘発
をもたらす〔Grossman et al.,1984,Cell 38:383;Baker
et al.,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.81:6779を参照〕。
9.4 リボソーム結合部位の改善 p277発現ベクターは、29の塩基対すなわち５′CATGTA
TCGATTAAATAAGGAGGAATAAC3′（配列番号141）p277のNco
I部位内に挿入してプラスミドp340−１を産生すること
によってさらに修正された。この29bpの配列は、Schone
r「ミニシストロン」配列〔Schoner et al.,1986,Proc.
Natl.Acad.Sci.83:8506〕の一部分に関係づけられるも
のの、これとは異なるものである。これらの29の塩基対
の内含は、リボソーム/mRNA相互作用のために最適なシ
ャイン／ダルカーノ部位を提供する。p340−１発現ベク
ターは、商用調製物に必要な高い収量に適したきわめて
誘発度の高いプロモーター、翻訳を改善するための改良
型の合成リボソーム結合部位領域、そして分離時点での
フラグメント挿入の視覚的指標を提供するための手段を
含んでいることから、pJG200とは著しく異なっている。
ベクターp340−１の構築における各段階については、図
４に示されている。
10.微生物の寄託 以下のプラスミドが、1988年11月29日付でAmerican T
ype Culture Collection（ATCC）,Rockintle,MDに寄託
され、次の受入れ番号を割当てられた。
プラスミド 受入れ番号 p340 ATCC 40516 本書に記述され請求されている発明は、そのいくつか
の態様の例示として意図されている本書内の特定の実施
態様によって範囲が限定されるべきものではない。等価
の実施態様は全く本発明の範囲内に入るものとされる。
実際、前述の説明から当業者には、本書に図示・記述さ
れたものにつけ加えての本発明のさまざまな変形形態が
明らかとなることだろう。かかる変形態様も添付のクレ
ームの範囲内に入るものとして意図されている。
同様に、ヌクレオチド及びペプチドのために与えられ
た全ての塩基対及びアミノ酸残基の数及びサイズはおお
よそのものであり、記述を目的として用いられたもので
あるということも理解すべきである。
一定数の参照文献が本書中で引用されているが、これ
らの開示全てがその全体として本書に参考として内含さ
れるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） Ａ６１Ｋ 37/02 (31)優先権主張番号 １８９，３３１ (32)優先日 平成６年１月31日(1994．1．31) (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (72)発明者 フォールクス， ダーナ エム. アメリカ合衆国 27514 ノースキャロ ライナ州 チャペル ヒル， ブルック ビュー ドライブ 632番地 (56)参考文献 国際公開91／12328（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．87，ｐ．6378− 6382 Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．249，ｐ. 386−390 Ｇｅｎｅ，Ｖｏｌ．73，ｐ．305−318 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏ ｌ．13，Ｎｏ．３，ｐ．422−426 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA G01N 33/566 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (59)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】選択されたリガンドに結合するタンパク
    質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの同定方法で
    あって、 （ａ）ヌクレオチドが一つまたはそれ以上の連続した配
    列で並んでおり、そのヌクレオチドの総数が約60以上約
    600以下であり、そしてそのヌクレオチドのコーディン
    グ鎖が、 式（NNB）ｎ＋ｍ （ここで、ＮはA,C,GまたはT; ＢはG,TまたはC; ｎおよびｍは20≦ｎ＋ｍ≦200となるような整数を表
    す）である、オリゴヌクレオチドによってコードされる
    結合ドメイン、ならびに （ｂ）該結合ドメインの発現または検出を高めるタンパ
    ク質またはペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配
    列によってコードされるエフェクタードメイン、 からなる各タンパク質を含む複数の異種機能性融合タン
    パク質の１つを各ベクターがコードする組み換えベクタ
    ーのライブラリーを、リガンド結合へ導く条件下で該複
    数の異種機能性融合タンパク質を該リガンドに接触さ
    せ、そして該リガンドに結合する融合タンパク質を単離
    することによってスクリーニングすることを含む該方
    法。
  2. 【請求項２】結合ドメインが、式５′Ｘ（NNB）ｎ JZ
    3′の第１ヌクレオチド配列を式３′Ｚ′OU（NNV）ｍ
    Y5′の第２ヌクレオチド配列に、相補な部位Ｚおよび
    Ｚ′の箇所でアニーリングし（ここで、ＸおよびＹはＸ
    ≠Ｙであるような制限酵素認識部位;NはA,C,GまたはT; ＢはG,TまたはC; ＶはG,AまたはC; ｎは10≦ｎ≦100であるような整数； ｍは10≦ｍ≦100であるような整数； ＺおよびＺ′はそれぞれ互いに相補な6,9または12ヌク
    レオチドの配列であり；そして、 ＪはA,C,G,Tまたは無し； ＯはA,C,G,Tまたは無し； そしてＵはG,A,Cまたは無し； 但し、J,OまたはＵのいずれ一つが無しである場合、J,O
    およびＵはすべて無し）、 そしてアニールされたオリゴヌクレオチドを二本鎖オリ
    ゴヌクレオチドに変換することによって組み立てた二本
    鎖オリゴヌクレオチドによってコードされるものであ
    る、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】同定された異種機能性融合タンパク質の結
    合ドメインをコードするヌクレオチド配列を、該結合ド
    メインのアミノ酸配列を推定するために決定することを
    さらに含む請求項１記載の方法。
  4. 【請求項４】複数の異種機能性融合タンパク質が、組み
    換えベクターの表面または該ベクターを発現するウイル
    スもしくは宿主細胞の表面に発現している請求項１記載
    の方法。
  5. 【請求項５】組み換えベクターがファージ、ファージミ
    ド、またはプラスミドベクターである請求項４記載の方
    法。
  6. 【請求項６】複数の異種機能性融合タンパク質が、該組
    み換えベクターを含む宿主細胞内で発現され、蓄積され
    る請求項１記載の方法。
  7. 【請求項７】宿主細胞が細菌細胞である請求項６記載の
    方法。
  8. 【請求項８】異種機能性融合タンパク質が、結合ドメイ
    ンとエフェクタードメインの間にリンカードメインをさ
    らに含む請求項１記載の方法。
  9. 【請求項９】リンカードメインが化学または酵素的手段
    によって切断を受けやすい、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】リガンドが、非イオン性化学基、イオ
    ン、金属、タンパク質またはその一部、ペプチドまたは
    その一部、核酸またはその一部、炭水化物、脂質、ウイ
    ルス粒子またはその一部、膜小胞またはその一部、細胞
    壁成分、合成有機化合物、生物有機化合物および無機化
    合物から成る群から選択される請求項１記載の方法。
  11. 【請求項１１】リガンドが、抗体の可変領域、酵素／基
    質結合部位、酵素／補助因子結合部位、調節DNA結合タ
    ンパク質、RNA結合タンパク質、金属結合タンパク質の
    結合部位、ヌクレオチド折り畳みまたはGTP結合タンパ
    ク質、カルシウム結合タンパク質、膜タンパク質、ウイ
    ルスタンパク質およびインテグリン（integrin）から成
    る群から選択される天然に存在するレセプターに結合す
    るリガンドである請求項１記載の方法。
  12. 【請求項１２】リガンドが、ATCC No.10494として寄託
    されているハイブリドーマ細胞株によって産生される7E
    11−C5モノクローナル抗体の特性である前立腺癌特異性
    を有するモノクローナル抗体である請求項１記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】リガンドが金属イオンである請求項１記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】金属イオンが亜鉛、銅およびニッケルか
    ら成る群から選択される請求項13記載の方法。
  15. 【請求項１５】リガンドが、ヤギ抗−マウスFc抗体の特
    性である結合特異性を有するポリクローナル抗体である
    請求項１記載の方法。
  16. 【請求項１６】リガンドが、癌胎児性抗原モノクローナ
    ル抗体である請求項１記載の方法。
  17. 【請求項１７】リガンドが、ストレプトアビジンである
    請求項１記載の方法。
  18. 【請求項１８】リガンドが、ポリスチレンである請求項
    １記載の方法。
  19. 【請求項１９】リガンドが、カルモジュリン（calmodul
    in）である請求項１記載の方法。
  20. 【請求項２０】複数の異種機能性融合タンパク質が半剛
    性なコンホメーション構造を形成することができる請求
    項１記載の方法。
  21. 【請求項２１】半剛性なコンホメーション構造を形成す
    ることのできる同定された異種機能性融合タンパク質の
    結合ドメインをコードするヌクレオチド配列を該結合ド
    メインのアミノ酸配列を推定するために決定することを
    さらに含む請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】各異種機能性融合タンパク質が少なくと
    も２つの非変異システイン残基を含み、各非変異システ
    イン残基が、式（NNB）ｎのヌクレオチドの連続した配
    列の両端に隣接して位置しているヌクレオチドによって
    コードされ、該非変異システイン残基が該タンパク質中
    で約６から約27アミノ酸残基だけ互いに離れている、請
    求項20記載の方法。
  23. 【請求項２３】ライブラリーが、少なくとも一つのジス
    ルフィド結合の形成をもたらす酸化環境下で発現されて
    少なくとも一つのシスチンを形成し、それによって各異
    種機能性融合タンパク質内で少なくとも一つのループコ
    ンホメーションを形成させる請求項22記載の方法。
  24. 【請求項２４】各異種機能性融合タンパク質が少なくと
    も４つの非変異システイン残基を含み、各非変異システ
    イン残基が予測できないヌクレオチドの連続する配列の
    両端に隣接して位置しているヌクレオチドによってコー
    ドされ、該非変異システイン残基が該タンパク質中で約
    ６から約27アミノ酸残基だけ互いに離れている請求項20
    記載の方法。
  25. 【請求項２５】ライブラリーが、少なくとも二つのジス
    ルフィド結合の形成をもたらす酸化環境下で発現され、
    それによって各異種機能性タンパク質内で少なくとも一
    つのクローバー葉型コンホメーションを形成させる請求
    項24記載の方法。
  26. 【請求項２６】各異種機能性融合タンパク質が式（NN
    B）ｎのヌクレオチドの連続する配列の両端に隣接して
    位置しているヌクレオチドによってコードされる非変異
    システインおよび非変異ヒスチジンの両残基を含み、非
    変異システインおよび非変異ヒスチジン残基の融合タン
    パク質内の位置が亜鉛フィンガー様タンパク質を形成さ
    せる請求項20記載の方法。
  27. 【請求項２７】各異種機能性タンパク質が、式（NNB）
    ｎのヌクレオチドの連続する配列の両端に隣接して位置
    しているヌクレオチドによってコードされる非変異ヒス
    チジン残基を含む請求項20記載の方法。
  28. 【請求項２８】ライブラリーが各異種機能性融合タンパ
    ク質内のヒスチジン残基の一部または全部を架橋するの
    に十分な濃度の二価カチオンの存在下で発現される請求
    項26または27記載の方法。
  29. 【請求項２９】二価カチオンが、Zn2+、Cu2+、Ni2+から
    成る群から選択される請求項28記載の方法。
  30. 【請求項３０】選択されたリガンドに結合するタンパク
    質及び／又はペプチドを同定する方法であって、 （ａ） ｉ）ヌクレオチドが一つまたはそれ以上の連続
    した配列で並んでおり、そのヌクレオチドの総数は約60
    以上約600以下であり、そのヌクレオチドのコーディン
    グ鎖は式（NNB）ｎ＋ｍ（ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又は
    T;BはＧ、Ｔ又はC;並びに、ｎ及びｍは20≦ｎ＋ｍ≦200
    となるような整数を表す）を含む、オリゴヌクレオチド
    によりコードされる結合ドメイン、 ii）結合ドメインの発現又は検出を高めるタンパク質又
    はペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列により
    コードされるエフェクタードメイン を含む、複数の異種機能性融合タンパク質を発現する組
    換えベクターのライブラリーを作製し、並びに、 （ｂ） リガンド結合へ導く条件の下で、複数の異種機
    能性融合タンパク質を選択された前記リガンドと接触さ
    せ、該リガンドに結合する異種機能性融合タンパク質を
    単離することによって、組換えベクターのライブラリー
    をスクリーニングすることを含む方法。
  31. 【請求項３１】前記結合ドメインのアミノ酸配列を推定
    するために、同定した異種機能性融合タンパク質の結合
    ドメインをコードするヌクレオチド配列を決定すること
    をさらに含む、請求項30記載の方法。
  32. 【請求項３２】選択されたリガンドに結合するタンパク
    質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを調製するた
    めの方法であって、以下の段階を含む方法。 （ａ）請求項３または31記載の方法に従って、選択され
    たリガンドに結合するタンパク質、ポリペプチドおよび
    ／またはペプチドを同定する段階；および （ｂ）段階（ａ）で同定されたアミノ酸配列を、化学的
    又は組換え技術のいずれかにより合成する段階。
  33. 【請求項３３】ATCC No.10494として寄託されたハイブ
    リドーマ細胞系により産生された7E11−C5モノクローナ
    ル抗体に特有な前立腺癌特異性を有するモノクローナル
    抗体に特異的に結合するタンパク質であって、配列番号
    22〜31からなる群から選ばれるアミノ酸配列を有するタ
    ンパク質。
  34. 【請求項３４】Ｍ（W/Y/H/I）XXL（H/R）を含む配列を
    有する請求項33記載のタンパク質。
  35. 【請求項３５】金属イオンに特異的に結合するタンパク
    質であって、配列番号34〜63からなる群から選ばれるア
    ミノ酸配列を有するタンパク質。
  36. 【請求項３６】ヤギ抗マウスFc抗体に特有な結合特異性
    を有するポリクローナル抗体に特異的に結合するタンパ
    ク質であって、配列番号64〜67からなる群から選ばれる
    アミノ酸配列を有するタンパク質。
  37. 【請求項３７】RT（I/L）（S/T）KPを含む配列を有する
    請求項36記載のタンパク質。
  38. 【請求項３８】C46モノクローナル抗体に特有な癌胎児
    性抗原結合特異性を有するモノクローナル抗体に特異的
    に結合するタンパク質であって、配列番号68〜69からな
    る群から選ばれるアミノ酸配列を有するタンパク質。
  39. 【請求項３９】ポリスチレンに特異的に結合するタンパ
    ク質であって、配列番号118〜134からなる群から選ばれ
    るアミノ酸配列を有するタンパク質。
  40. 【請求項４０】カルモジュリンに特異的に結合するタン
    パク質であって、配列番号135のアミノ酸配列を有する
    タンパク質。
  41. 【請求項４１】（ａ） ヌクレオチドが１又はそれ以上
    の連続配列で並んでおり、そのヌクレオチドの総数は約
    60以上約600以下であり、ヌクレオチドのコーティング
    鎖が式（NNB）ｎ＋ｍ（ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はT;BはＧ、Ｔ
    又はC;及び、ｎ及びｍは20≦ｎ＋ｍ≦200であるような
    整数である）を含む、オリゴヌクレオチドによりコード
    される結合ドメイン、並びに、 （ｂ） 結合ドメインの発現又は検出を高めるタンパク
    質又はペプチドをコードするオリゴヌクレオチド配列に
    よりコードされるエフェクタードメイン を含む、複数の異種機能性融合タンパク質の一つを各ベ
    クターがコードする組換えベクターのライブラリーであ
    って、選択されたリガンドに特異性を有する異種機能性
    融合タンパク質を同定するためにスクリーニングされ得
    る前記ライブラリー。
  42. 【請求項４２】結合ドメインが、式 ５′Ｘ（NNB）nJZ
    3′の第１ヌクレオチド配列を式 ３′Ｚ′OU（NNV）ｍ
    Y5′の第２ヌクレオチド配列に対応する位置Ｚ並びに
    Ｚ′でアニーリングさせ、 （ここで、Ｘ及びＹは、Ｘ≠Ｙであるような制限酵素認
    識部位； ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はT; ＢはＧ、Ｃ又はT; ＶはＧ、Ａ又はC; ｎは、10≦ｎ≦100であるような整数； ｍは、10≦ｍ≦100であるような整数； Ｚ及びＺ′は、Ｚ及びＺ′が互いに相補的であるよう
    な、６、９又は12ヌクレオチド配列のいずれかであり；
    及び、 ＪはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又は無し； ＯはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又は無し；及び、 ＵはＧ、Ａ、Ｃ又は無しであるが、Ｊ、Ｏ又はＵのいず
    れか１つが無しであれば、Ｊ、Ｏ及びＵは全て無しであ
    る） そして、アニールしたオリゴヌクレオチドを二本鎖オリ
    ゴヌクレオチドに変換させることにより組み立てた二本
    鎖オリゴヌクレオチドによってコードされる結合ドメイ
    ンである、請求項41記載のライブラリー。
  43. 【請求項４３】組換えベクターがファージ、ファージミ
    ド又はプラスミドベクターを含む、請求項41記載のライ
    ブラリー。
  44. 【請求項４４】複数の異種機能性融合タンパク質がファ
    ージ、ウイルス粒子又は細胞の表面で発現される、請求
    項41記載のライブラリー。
  45. 【請求項４５】複数の異種機能性融合タンパク質が、組
    換えベクターを含む宿主細胞内で発現及び蓄積される、
    請求項41記載のライブラリー。
  46. 【請求項４６】異種機能性融合タンパク質が、結合ドメ
    インとエフェクタードメインとの間にさらにリンカード
    メインを含む、請求項41記載のライブラリー。
  47. 【請求項４７】リンカードメインが、化学的又は酵素的
    手法により選択的に開裂することができるものである、
    請求項41記載のライブラリー。
  48. 【請求項４８】異種機能性融合タンパク質の結合ドメイ
    ンが、半剛性のコンホメーション構造を形成することが
    できる、請求項41記載のライブラリー。
  49. 【請求項４９】各異種機能性融合タンパク質が、少なく
    とも１つのシスチンを形成する少なくとも１つのジスル
    フィド結合を含み、それにより、各異種機能性融合タン
    パク質において少なくとも１つのループのコンホメーシ
    ョンを形成させることができる、請求項41記載のライブ
    ラリー。
  50. 【請求項５０】各異種機能性融合タンパク質が、少なく
    とも２つのシスチンを形成する少なくとも２つのジスル
    フィド結合を含み、それにより、各異種機能性融合タン
    パク質において少なくとも１つのクローバー葉様コンホ
    メーション構造を形成させることができる、請求項41記
    載のライブラリー。
  51. 【請求項５１】各異種機能性融合タンパク質が、ヌクレ
    オチドの１又はそれ以上の連続配列の両端に位置するヌ
    クレオチドによりコードされるシステイン及びヒスチジ
    ンの両残基を複数含み、そして、タンパク質中のシステ
    イン及びヒスチジン残基の位置が亜鉛フィンガー様タン
    パク質におけるシステイン及びヒスチジン残基の位置に
    類似するものである、請求項41記載のライブラリー。
  52. 【請求項５２】（ａ） １又はそれ以上の複数の異なる
    第１のヌクレオチド配列であって、ヌクレオチドが一つ
    またはそれ以上の連続した配列で並んでおり、そのヌク
    レオチドの総数が約60以上約600以下であり、そしてそ
    のヌクレオチドのコーディング鎖が、 式（NNB）ｎ＋ｍ （ここで、ＮはA,C,GまたはT; ＢはG,TまたはC; ｎおよびｍは20≦ｎ＋ｍ≦200となるような整数を表
    す）である該ヌクレオチド配列、および （ｂ） 生物学的又は化学的に活性なエフェクタードメ
    インをコードする第２のヌクレオチド配列 を、複数のベクターに挿入することを含む、複数の異種
    機能性融合タンパク質を発現する組換えベクターのライ
    ブラリーを作製する方法であって、各第１ヌクレオチド
    配列／第２ヌクレオチド配列の組み合わせは５′ATG開
    始コドンから下流に位置し、同じ読み枠内にある融合タ
    ンパク質をコードするベクターのライブラリーを作製す
    る方法。
  53. 【請求項５３】結合ドメインが、式 ５′Ｘ（NNB）nJZ
    3′の第１ヌクレオチド配列と式 ３′Ｚ′OU（NNV）ｍ
    Y5′の第２ヌクレオチド配列とを対応する位置Ｚ及び
    Ｚ′でアニーリングさせ、 （ここで、Ｘ及びＹは、Ｘ≠Ｙであるような制限酵素認
    識部位； ＮはＡ、Ｃ、Ｇ又はT; ＢはＧ、Ｃ又はT; ＶはＧ、Ａ又はC; ｎは、10≦ｎ≦100であるような整数； ｍは、10≦ｍ≦100であるような整数； Ｚ及びＺ′は、Ｚ及びＺ′が互いに相補的であるよう
    な、６、９又は12ヌクレオチド配列のいずれかであり；
    及び、 ＪはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又は無し； ＯはＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ又は無し；及び、 ＵはＧ、Ａ、Ｃ又は無しであるが、Ｊ、Ｏ又はＵのいず
    れか１つが無しであれば、Ｊ、Ｏ及びＵは全て無しであ
    る） そして、アニールしたオリゴヌクレオチドを二本鎖オリ
    ゴヌクレオチドに変換させることにより組み立てた二本
    鎖オリゴヌクレオチドによってコードされる結合ドメイ
    ンである、請求項52記載の方法。
  54. 【請求項５４】複数の異種機能性融合タンパク質が、組
    換えベクターの表面または該ベクターを発現するウイル
    スもしくは宿主細胞の表面に発現している、請求項52記
    載の方法。
  55. 【請求項５５】複数の異種機能性融合タンパク質が、組
    換えベクターを含む宿主細胞内で発現及び蓄積される、
    請求項52記載の方法。
  56. 【請求項５６】異種機能性融合タンパク質が、半剛性の
    コンホメーション構造を形成することができる、請求項
    52記載の方法。
  57. 【請求項５７】推定アミノ酸配列のどの部分が同定され
    たタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの
    天然に存在する選択されたリガンドへの結合と関係する
    かを同定する段階をさらに含む、請求項３記載の方法。
  58. 【請求項５８】患者の自己免疫反応の結合特異性を同定
    する方法であって、自己免疫反応の指標となる自己抗体
    を含むことが推測される患者からの生物学的液体の試料
    を、結合へ導く条件下で請求項41記載の該ライブラリー
    と接触させ、該患者の試料に結合する該ライブラリーか
    らの融合タンパク質を単離することを含む方法。
  59. 【請求項５９】同定された融合タンパク質の結合ドメイ
    ンをコードするヌクレオチド配列を決定することをさら
    に含む、請求項58記載の方法。
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