JP3195336B2

JP3195336B2 - 分画化方法

Info

Publication number: JP3195336B2
Application number: JP51118589A
Authority: JP
Inventors: フイツシヤー，デレク; フランシス，ジリアン・エリザベス; デルガド，クリスチーナ
Original assignee: ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メデイシン
Priority date: 1988-10-20
Filing date: 1989-10-20
Publication date: 2001-08-06
Anticipated expiration: 2016-08-06
Also published as: DE68928638T2; GB8824591D0; EP1316562A2; US20020127244A1; EP0727438A2; EP0727438A3; EP1316562A3; EP0439508B1; WO1990004606A1; US6384195B1; DE68928638D1; JPH04501260A; ATE164851T1; EP0439508A1; EP0727437A3; JPH11315098A; EP0727437A2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、ポリエチレングリコール−蛋白質付加体を
分画化するための方法に関する。

ポリエチレングリコールは、エチレンオキサイド単
位、HO（CH₂CH₂O）nCH₂CH₂OH（式中、ｎは変化でき、20
0〜20,000の分子量を有する化合物を与え得る）から成
る長鎖の線状合成ポリマーである。これは無毒であり、
そしてヒトに対して経口的にそして静脈内注射的に投与
されてきている（ひどい複合免疫不全症のためのPEG−
アデノシンデアミナーゼ；急性リンパ芽球白血病のため
のPEG−アスパラギン；酸素毒のためのPEG−スーパーオ
キシドジスムターゼ（３−７））。PEGは、このPEGのOH
基に関する適切な誘導化に続いて、蛋白質に対して連成
させることができる。リジンの側鎖のNH₂基は、特に利
用し易い部位であり、そしていくつかか、或は多くの部
位が修飾され得る。それらの製造に対する適切な技術が
得られれば、PEGで修飾された蛋白質は、数多くの治療
学的および他の用途を有することになる。潜在的な臨床
的使用のための多くの蛋白質は、連続注入による投与に
必要な半減期が極めて短い（高価であり、不快でありそ
して潜在的な危険度の多い操作）。PEGの修飾は、血漿
の半減期を伸ばし、そして酵素の生物利用性を増大させ
るために用いられてきた（以下を参照）。蛋白質の抗原
性の減少もまた、PEGの修飾によって生じ、そしてこれ
は臨床的使用を広げ、そしてより長引いた投与を可能に
している。更に、多面的な生物学的効果を有する蛋白質
を用いると、PEGの修飾は、個別の生物学的特性の差別
的損失のため、新規な活性スペクトルを有する生成物を
作り出す。抗体を用いると、例えば、PEG修飾は、抗体
結合および補体結合活性を解離する。PEG修飾はまた、
それらの有用性を上昇させ得る方法で蛋白質の生化学的
および物理学的特性を変化させる（例えば、増大した溶
解性；蛋白質分解的劣化に対する増大した耐性；変化し
た反応速度、pHおよび／または温度最適条件、および酵
素に関する変化した基質特異性）。蛋白質に関するこの
共有結合修飾は次のような数多くの重要性を有してい
る；（ｉ）向上した血漿の半減期；これは数多くの蛋白質を
用いて見いだされ（表１および出典８〜17参照）、そし
て既に臨床的に利用されてきた。アデノシンデアミナー
ゼ欠乏症の２人の子供が、PEG修飾されたウシのアデノ
シンデアミナーゼを用いて成功裏に治療された（18）。
急性リンパ芽球性白血病において、PEG−アスパラギナ
ーゼを用いて、20人の患者の74％に完全なもしくは部分
的緩解傾向が達成された（５）。Meth Aマウスの肉腫モ
デル中、PEG−インターロイキン２を用いて、向上した
半減期および増強された抗腫瘍力もまた観察された（1
9）。半減期に関するこの向上に対する基礎は分かって
いないが、PEG修飾で大きさが増大するため、小さいペ
プチドの糸球体濾過の減少のような因子を含んでいる可
能性がある（19）。生物学的潜在能力の増大（これに
は、向上した半減期に加えて他の現象も関係し得る）
は、癌の治療における薬理学的薬剤であるPEG−シトキ
ン付加体の使用において潜在的に非常に重要である。

ii）変化した生化学的および物理学的特性：親水性PEG
鎖の添加（生理学的pHでは制限された溶解性を有するイ
ンターロイキン２のような蛋白質にとって有益である
（19））のため増大した溶解性（20）、蛋白質分解劣化
に対する向上した耐性（21）、反応速度またはpHおよび
温度最適条件の変化、或は酵素の基質特異性（10、20、
22、23）が含まれる。この目的は、機能、例えば補体固
体活性および抗原−結合に対する差別的効果が、各々、
IgGのPEG修飾の後失われそして保持されることの観察に
関係している。PEG−リボヌクレアーゼは、高分子量の
基質に関しては変化した活性を有するが、しかし低分子
量の基質に関しては有していない（25）。これらの効果
は、修飾された蛋白質上の部位の数およびPEGポリマー
の長さを変化させることによってある程度調節され得
る。

（iii）減少した抗原性：これには、未修飾蛋白質に対
する抗体への反応に関する減少した能力、およびPEG蛋
白質それら自身の低い免疫不全が含まれる（26）。

蛋白質へのPEGの連成は、通常、蛋白質中の求核性の
基（主にリジンＥ−アミノ基）で充分に置換され得る適
切な薬剤を用いてPEGのヒドロキシル基を活性化させる
ことで達成される（27）。塩化シアヌールは、PEGの活
性化のための薬剤として最も広く用いられている薬剤で
あり、そしてこれには、修飾すべき蛋白質を用いた次の
連成段階のために非常に塩基性のpHが必要とされる（2
8、27）。このような不利な条件を避ける目的で（成長
因子のような不安定な蛋白質で処理するとき特に重要で
ある）、代替方法が探求されてきた。しかしながら、1,
1′−カルボニルジイミダゾールは連成段階に非常に長
時間要し（14）、そしてフェニルクロロ蟻酸エステル類
を用いても塩基性のpHが必要であることは避けられない
（25）。

このような多くの情報が長年に渡って利用されてきた
が、PEG−蛋白質は商業的には広く利用されていない。

トレシルクロライド（2,2,2−トリフルオロエタン−
スルホニルクロライド）が、アガロース、およびヒドロ
キシル基を有する他の固体状の支持体を活性化するため
に有益であることが見いだされ、従って、それらは蛋白
質に対してカップリングされ得る。この方法の魅力は、
蛋白質に対する連成が迅速にそして非常に穏やかな条件
下で生じることである（28、29）。我々は、この方法を
成功裏に、モノメトキシPEG（MPEG）（これは誘導可能
な単一の遊離OH基を有している）の活性化に適用した。
我々は、次に、穏やかな条件（pHが7.5のホスフェート
緩衝液、室温）下、抗体（30）およびアルブミン（実施
例１参照）の両方に対してMPEGを連成させることを実証
した。従来技術に対する優位性は、この反応混合物が無
害であり、そしてPEG−蛋白質を使用する前に除去する
必要がないことである。我々はまた、連成段階後の過剰
のトレシル−PEGを中和する技術を開発し（他の蛋白質
および／または細胞との反応を抑制する）、従って、そ
れを除去するための面倒なクロマトグラフィーまたは限
外濾過法の必要性を避けた。これらの改良は、この方法
を不安定な成長因子蛋白質（これらは、周知のごとく、
限界濾過法のような操作に対して敏感である）に適用す
るときに重要である。

カップリング段階に対する許容される（変性させな
い）条件が得られると、PEG−蛋白質の生物学的特性に
影響を与える２つの主要な変法があり、そしてこれらは
この製造工程中制御され得る。１つは、蛋白質１分子当
たりに付着しているPEG分子の長さであり、そして２番
目は、１個の蛋白質当たりのPEG分子の数である。

蛋白質が数個のリジン基を有している場合、蛋白質に
対する活性化MPEGのモル比を変化させると、置換の度合
に対して著しく影響を与える（実施例２参照）。必要な
のは、所望される生物学的特性に対する最良の成果を与
える置換度を決定する手段であり、従って、このような
置換度を達成するための最良の製造計画を考案すること
である。生化学的な監視方法は、取り扱いにくく
（２）、そして修飾された蛋白質分子の割合に関する置
換の可変性の見積もりを与えない。それらはまた、異な
る度合の置換を有する材料の回収を可能にしない（後者
は、モル比を変えることによる制御が困難である、何故
ならば、高モル比での充分な置換に近づくまで、いかな
る与えられたモル比でも置換度の幅広い分布が観察され
るからである（実施例２参照））。どのような置換度が
最適な効果を生じるかを決定するための分析上の研究、
および製造方法の両方共、異なる（好適には精密に限定
された）度合の置換を有するペプチド／蛋白質を分画す
るための手段が必要とされている。この問題は、幅広い
ものであると考えられる、何故ならば、臨床的に最も有
益な蛋白質は数個のリジン残基を有しているからである
（表II）。表II 成長因子リジン残さ全アミノ酸インターロイキン：インターロイキン１ 19 271 インターロイキン２ 10 153 インターロイキン３ 9 166 （マスト細胞成長因子;113と同様）インターフエロン：ガンマ 20 146 繊維芽細胞（ベータ） 11 166 白血球（ベータ） 8 166 Ｇ−CSF 4 178 GM−CSF 6 144 12種以上の蛋白質に関するPEG修飾をここに記述して
きたが、更に実際上の詳細においてしばしば、PEGで置
換されているそれらの度合に関するPEG−蛋白質の不均
質さに対してはほとんど注意が払われていなかった（2
3）。

PEG含有水系の二相系中のPEG蛋白質付加体の分配挙動
は、今まで明らかにされておらず、そしてまた、PEG置
換の度合と分配係数との間の関係も明らかにされていな
かった。このような系における分配挙動の調査研究にお
いて、我々は、驚くべきことに、PEG含有水系二相系
が、特徴的に、PEG−蛋白質を選択的に分離するように
作り変えられ、従って、生化学的特性に対する修飾の度
合の効果を監視するために用いることができ、そして大
規模スケールでは、特定の度合の置換を有するPEG蛋白
質を製造するために用いることができることを見い出し
た。

従って、本発明は、PEG含有水系の二相系中、PEG蛋白
質付加体を分配させることを含む、PEG−蛋白質付加体
の混合物を分画化するための方法を提供する。好適に
は、この工程は更に、該二相系の１つの相から予め決め
られた度合のPEG置換を有するPEG−蛋白質付加体を回収
する段階を含む。いかなるPEG蛋白質付加混合物も本発
明に従って分画化され得るが、モノメトキシPEGの付加
体、好適には蛋白質とトレシルモノメトキシPEG（TMPE
G）との反応で生じる付加体の使用が好適である。本発
明の詳細な面においては、リジンまたはアルブミンの添
加によって、未反応のTMPEGが壊されるか、或は付加体
生成反応が抑制される。分配は、バッチ式もしくは連続
式で行われ、例えば２つの相の向流の流れによって行わ
れ、そして追加的分画化を得るため繰り返してもよい。

蛋白質に対するPEGの修飾度合の分析（モル比）我々は、PEGとデキストランとの水系の二相系中の相
分配を用いて、PEG−蛋白質の分配係数の対数とPEGに対
してカップリングされたアミノ酸の数との間に直線関係
が存在していることを確立した。この関係は、我々の知
る限りでは、以前には確立されておらず、そして対数の
直線関係は予測されていたが、理論的に予測された挙動
からの有意な逸脱が存在している。回帰に関するパラメ
ーターは、この２つの成分の分配の挙動を基として予測
されたものではない。従って、この発見は従来の研究に
は実質的には含まれていない。本方法の基礎は、蛋白質
に対してPEGを連成させると、おのずと、PEGの豊富な上
相に対する親和力が増大し、従って、分配係数（上相中
の濃度／底部相中の濃度）が上昇することにある。この
関係の指数的性質は、分配を、修飾を監視するための非
常に敏感な方法にする。本発明は以下の実施例１中で詳
細に説明する。該回帰に関する方程式はまた、蛋白質調
製に関する置換の不均質性を分析するため、そして個々
の画分中に存在する置換の度合を明らかにするためにも
用いられる。

驚くべきことに、この関係は、PEG修飾された蛋白質
全てに対して適用できるものではない。ある場合には、
分配係数の対数と修飾との間に複雑な関係が存在してい
る。このような発見は従来の研究には実質的に含まれて
いない。この観察は、凝集、変性および表面特性の付随
する変化、等電点の変化を含む多くの因子が基となって
いる。理論によって範囲を限定されるのを望むものでは
ないが、この結果は（実施例３参照）、PEGで修飾され
た蛋白質を分画するための相分配の使用が、必須条件と
して、分析的相分配のために必要であることを強調して
いる。

個々の反応条件下で生じた修飾の不均質性に関する分析
のための方法論（即ち、蛋白質１分子当たりのPEG分子
数の範囲） PEG修飾した蛋白質に対して一連の移行を行うための
向流分布に関連した相分配を使用することで、均質的に
または不均質的に修飾された蛋白質類が識別される。均
質的に修飾された蛋白質は、同一の分配係数を有してい
るが、我々は、不均質的に修飾された蛋白質に関して、
蛋白質を有する画分の範囲に渡って分配係数における増
分が存在していることを示した。方法１の分析を基とし
た方程式を用いて、個々の画分中の置換度が計算でき、
そして与えられたモル比で製造されたサンプルの不均質
性が明らかにされ得る。本方法は、我々が知る限り、以
前には、PEG−蛋白質付加体の置換に関する不均質性を
示すために適用されていなかった。この方法の詳細を以
下の実施例２に示す。

異なる度合に修飾された蛋白質および／またはペプチド
類の分離カップリング段階中の与えられた（飽和以下の）モル
比で得られる置換度合に関して普及している考えをあて
はめると、蛋白質の最適機能が達成されるPEG−蛋白質
比を決定するためには、置換と蛋白質の生物学的特性
（望まれるのと望まれないとの両方）との間の関係を試
験する必要がある。これは、PEGの長さ、並びに置換の
度合を変化させた母体として行う必要がある。

本方法は、PEGで異なる度合に置換されたPEG−蛋白質
を分画するため、向流分布に関連した製造的スケールの
相分配を用いている。

次に、最適な蛋白質の特性にどの分配係数が関係して
いるかが確立されたならば、製造的相分配（向流分布の
使用の有無に拘らず）を、所望される度合の置換を有す
る蛋白質を分画するために用いてことができる。このこ
とは、置換度が最適な生物学的特性を得るのに重要であ
る場合、そしてPEG連成に関する反応条件を変化させる
ことによって、充分に精密な度合の置換ができない場
合、製造工程において必要である。

本方法の使用ｉ）臨床的使用のためのPEG−蛋白質付加体の製造遺伝工学で製造された蛋白質は数多くの潜在的な臨床
的役割を有しており、従って、我々はここに広範な実施
例を与えることはできない。PEGは、酵素、抗体、ペプ
チドホルモン、成長因子およびシトキン類を含む多くの
種類の蛋白質を修飾するために使用されてきた。組換え
DNA技術を用いた臨床的使用のための蛋白質の増大し続
ける製造によって、臨床的および他の用途のための上記
蛋白質の利用度が大きく増大している。造血成長因子
は、例えば、化学的および放射線療法によって誘発され
た血球減少症を軽減するのに顕著な効果を有している
（31−33）。分化因子およびシトキン類もまた、直接抗
腫瘍効果を通して、並びに宿主応答を調節することによ
る両方で、異常増殖の治療において将来の見込みを示し
ている（４、５中で再考）。バイオ活性を示すペプチド
類もまた臨床的な試みを受け、そしてペプチドホルモン
類（例えば、インシュリン）の使用が良好に確立されて
いる。

しかしながら、これらの蛋白質の使用には制限があ
り、これは適切なPEG−蛋白質付加体の製造によって解
決できる。最初は、それらは迅速に清澄化され、従って
しばしば、連続した注入が必要とされる。それらはま
た、製造コストが高く、従って、供給が制限されてお
り、特に開発の初期段階にある。該蛋白質の抗原性およ
び物理的または生化学的特性もまた望ましいものではな
い（上述したように）。更に、いくつかの因子が多面的
な作用を有しており、これらは、もし修飾できれば、新
規な可能性のある臨床的使用を有する蛋白質を単独で生
じさせる。例えば、いくつかの因子は有力な分化誘発剤
であるがまた、成長刺激効果を有しており、このこと
が、変性を受けていない状態のそれらに関して、悪性の
分化治療における用途としては不適切なものにしてい
る。これらの特性の１つのみを維持しているPEG−蛋白
質付加体の製造は、異なる範囲の臨床的使用を有する新
規な因子を生じさせる。

記述した方法は、置換の最良の割合が選択できるよう
にPEG−蛋白質比と生物学的特性との間の関係を分析す
ることを可能にする。この分析的方法はまた、所望の置
換度を有するPEG−蛋白質付加体（即ち、所望の生物学
的特性を有する）を製造および／または分画するための
製造計画を設計するための必須な情報も与える。

ii）研究手段として本方法はまた、可能な研究用途を有する。PEGによる
置換度を変化させて、蛋白質の生物学的特性に影響を与
える様式を分析することによって、特定の特性を促進
（または抑制）する置換の範囲が測定できる。置換度を
変化させた一連の画分を製造するための予備的方法を用
いて、種々の置換度で修飾されたアミノ酸の位置を生化
学的に（例えば、ペプチド地図を用いて）確立すること
ができる。これは、受容部位を即座に最大から最小に修
飾すると共にカップリング段階中のモル比を増大させる
と、変化する。これによって、蛋白質上のどの位置が個
々の生物学的特性に関係しているかの測定が可能にな
る。

本発明を以下の実施例で説明する。

使用した全ての試薬はANALARグレードであった。特定
の製品に関しては、原産地が示してある。

トレシル化モノメトキシポリエチレングリコール（TMPE
G）の製造トレシルクロライドの加水分解を避けるため、全ての
試薬は使用前に乾燥した。

ａ）モノメトキシポリエチレングリコールの乾燥 MPEG（Mr5000、Union Carbide、USA）をベンゼン（沸
点79〜80℃）に溶解した後、水−有機共沸混合物（沸点
65℃）を蒸留して除去した。減圧下溶媒を除去してMPEG
を回収した後、これを真空下室温に一晩放置することに
よって最終的乾燥を行った。

ｂ）ジクロロメタンの乾燥ジクロロメタン（British Drug House、Poole、U.K.
からのANALAR）を、モレキュラーシーブA3（溶媒リット
ル当たり100g）を用いて、室温で一晩乾燥した。

ｃ）トレシルクロライドを用いたMPEGの活性化トレシルクロライドを用いたMPEG−5000の活性化を、
2.5:1の、トレシルクロライドとMPEG中の利用され得る
ヒドロキシル基とのモル比を用いて行った。

乾燥したMPEG（18g、3.5ミリモル）を、室温で、乾燥
ジクロロメタン（45mL）中に溶解した。この混合物を０
℃に冷却し、マグネティックスターラーを用いて撹拌
し、そして1.125mL（14ミリモル）のピリジン（BDH、U.
K.）および1mL（９ミリモル）のトレシルクロライド（F
luka AG、スイス）を０℃で滴下した。1.5時間一定した
撹拌で、この反応を室温で継続させた後、減圧下の蒸留
でジクロロメタンを除去した。白色の固体を、室温で一
晩真空下乾燥した。

ｄ）TMPEGの洗浄 TMPEGをメタノール−HCl混合物（250:1）に懸濁した
後、−20℃で８時間沈澱させた。得られる白色の固体を
０℃で集めた後、この濾液のピリジン含有量を検査した
（255nm）。ピリジンが検出されなくなるまで、洗浄用
混合物としてメタノール−HCl（1000:1）を用いてこの
操作を繰り返した。最後に、このピリジンを含んでいな
いTMPEG（12〜14g、収率65〜75％）を、室温で数時間真
空下乾燥した。

この得られる白色固体の硫黄含有量は0.5％であっ
た。この活性化したポリマーに関する平均分子量は5000
であることを考慮すると、MPEG1分子当たり１個のトレ
シル基の理論含有量は0.62％である。従って、該MPEG中
の約80％のヒドロキシル基が、トレシルエステルに変換
された。

トレシル化MPEGは、室温で３カ月間に渡って保存して
も安定であることが示された。１バッチの生成物から、
製造時から異なる期間経たMPEGサンプルを取り出して、
BSAと反応させた。この生成物MPEG−BSAを、水系のPEG
−デキストラン二相系中で分配させることによって分析
した。この期間中に得られるMPEG−BSAサンプルの分配
係数Ｋは0.9〜1.2（Log K）の範囲内であり、このTMPEG
製造物の安定性を示唆していた。

ｅ）蛋白質に対するTMPEGのカップリングウシの血清アルブミン（98〜99％、Sigma Chemical C
o.（U.S.A.））を用いた。カップリングは、塩化ナトリ
ウムを含有している燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）中
室温で行った（詳細は、各々の数値に対する底部の解説
を参照）。相当するカップリング用緩衝液中で製造した
適当容積の蛋白質とTMPEG溶液とを混合した後、室温で
穏やかに撹拌した。間隔を開けてサンプルを取り出し、
以下に示すように分析した。

ｆ）未変性の蛋白質およびMPEG修飾した蛋白質の分析ｉ）未変性アルブミン中の一級アミノ基を、TNBS−一
級アミン結合体のUV吸収を測定することから成るトリニ
トロベンゼンスルホン酸ナトリウム（TNBS）方法で定量
した（36）。PEGがこの方法を干渉するため、PEG修飾し
たアルブミンおよび未修飾の対照区中の一級アミノ基
を、Stocks他（37）が記述した蛍光分析によって測定し
た。

ii）未変性およびMPEG修飾アルブミンの両方の分配係
数を、4.75％（w/w）のPEG−6000（Lot 9159110、BDH、
UK）、4.75％（w/w）のDextran−T500（Dx）（Lot 3862
4、Pharmacia、Sweden）、0.01Mの燐酸ナトリウム緩衝
液pH6.8、0.15Mの塩化ナトリウムから成る二相系が1g入
っている単一管中、25℃で測定した。この相系は、40％
のPEG、約20％のDextran（旋光計で標準化した）、0.44
の燐酸ナトリウム緩衝液pH6.8、および0.6Mの塩化ナト
リウムから成るストック溶液から製造した。アルブミ
ン、およびMPEGにカップリングしたアルブミンを、相に
対して用いられている水0.1gを、該カップリング緩衝液
中のアルブミンとPEG−アルブミンとの溶液0.1gで置き
換えることによって、該相系中に混合した。

30〜40回逆さにすることによって混合した後、この相
を放置して、この相の完全な分離が達成されるまで静置
した。上相および底部相からの一定分量を、蛋白質濃度
に関して分析した。該分配係数は、上相と底部相中の蛋
白質の比率である。

iii）蛋白質濃度を、クーマシーブリリアントブルー
定量法によって測定した（38）。この定量法は、低濃度
の蛋白質を検出するために用いられ、PEGに対してもそ
してDextranに対しても、Lowry方法で生じるようないか
なる干渉をも受けさせない（39）。

（iv）向流分布アルブミンおよびMPEG−修飾アルブミンに関する向流
分布（CCD）を、4.75％（w/w）のPEG、4.75％（w/w）の
Dxおよび0.01Mの燐酸ナトリウムpH6.8で緩衝させた0.15
Mの塩化ナトリウムで生じさせた相系中で行った。この
相系は、所望される量の40％（w/w）のPEG−6000（Lot
9159110、BDH、UK）、20％（w/w）のDx−T500（Lot MI
02434、Pharmacia、Sweden）、0.6Mの塩化ナトリウム、
0.44Mの燐酸ナトリウム緩衝液pH6.8および蒸留水を混合
することによって製造した。一度、上相と底部相を、必
要とされるところまで25℃で分離させた。

University of Sheffield（UK）で作られた自動薄膜
向流分布装置BIOSHEF TLCCD MK2を用いた（40）。分布
ローターは、以下のように充填された60個の空洞で成り
立っている:0.823mLの底部相および0.823mLの上相は、
空洞２〜30および32〜60中に充填されていた。空洞１お
よび31は0.823mLの底部相が充填されており、そして二
相系の上相の0.823mLがサンプルを含有している。これ
は、大容積系としての同様なストック溶液から製造され
たが、この蒸留水を、適切な蛋白質を含有している溶液
で置き換え、そして実験を行う直前に作り上げた。静置
時間は７分であり振とう時間は25秒であった。

室温での30回の移行を完了した後、この空洞の内容物
を直接プラスチック製の管中に集めた。１つおきの空洞
の内容物を、0.01Mの燐酸ナトリウムでpH6.8に緩衝させ
た0.15Mの塩化ナトリウム0.8mLで希釈して、この相系を
壊した。次に、蛋白質の濃度を、Bradford定量法で測定
して、分布の形を得た。２つの相を未だ含有している残
りの管を、上相および底部相中の蛋白質濃度測定による
該蛋白質の分配係数の測定用として用いた。

実施例１ MPEGを用いたアルブミンの修飾およびこの複合体MPEG−
BSAの分配挙動１分子当たり60個のリシル残基を有する良好に差別化
された蛋白質として、BSAを選択した（41）。Sigmaから
供給されたBSA粉末は、１分子当たり61±６（ｎ＝12）
のアミノ基を示しており、従って、精製しないで用い
た。

0.5Mの塩化ナトリウムを含有している0.2Mの燐酸ナト
リウム緩衝液pH7.5中、室温で、この蛋白質をTMPEGと一
緒に培養した。BSAの最終濃度は1.5mg/mLであり、そし
てリシル基に対するTMPEGのモル比は１に対して16であ
った。この蛋白質の分配係数Ｋを、30、60、90および12
0分の培養後測定した。図１に示されるように、Ｋは、
最初の１時間BSAとTMPEGとの培養が進行するにつれて上
昇した後、「平行」に達する。Ｋの上昇は、MPEGがBSA
に結合したことを示しており、即ち、蛋白質の表面がよ
りPEG様になり、結果として、該二相系のPEGの豊富な上
相に向かう。これは、他の部分に詳しく記述した親和力
による分配化の例である（42、43）。我々は、通常のMP
EGと一緒に培養したBSAがその分配係数を上昇させなか
ったことを観察した（データは示していない）。従っ
て、分配係数の上昇（図１）は、蛋白質上への該ポリマ
ーの吸着によるというよりはむしろ、該蛋白質へのMPEG
の共有結合によるものであると述べることが可能であ
る。１時間培養した後のMPEG−BSA複合体に関して得ら
れる一定なＫ値（図１）は、明らかに、達成され得るＫ
の最大変化を示しており、そしてこれは、おそらく、利
用され得るPEG結合部位の飽和を示している。

異なる置換度を有するPEG−蛋白質付加体を作る目的
で、我々は、複合体MPEG−BSAの生成におけるBSA（リシ
ル残基）に対するTMPEGのモル比の影響を試験した。２
時間の培養時間を用いた。図２に示されるように、リシ
ル基に対するTMPEGのモル比を2:1〜16:1の範囲に渡って
上昇させると、BSAの分配係数の連続的上昇がもたらさ
れた。

分配係数と修飾度との間の関係水系の二相系における分配化は、複合体MPEG−アルブ
ミン（材料および方法を参照）に関するいかなる精製も
必要としない、アルブミンに対するTMPEGのカップリン
グを定性的にそして定量的に分析する手段を与える。こ
れは、付加体MPEG−蛋白質を未反応のMPEGから分離する
必要がある他の方法（44）に比べて相当に有利である。

分配係数Ｋと修飾度との間の量的な関係を確立するた
め、後者を、分配係数の対数と、試験した範囲（０〜30
％の修飾）に渡るアミノ基の置換度との間の関係におけ
る１級アミンに関する換算によって測定した（図3;r＝
0.96、ｐ＜0.001）。

Brooks他（45）は、修飾した蛋白質に関するＫ
（K_pL）は遊離蛋白質（K_p）およびリガンド（K_L）の両
方のＫ、並びに付着したポリマー分子数（ｎ）との関係
を有するべきであることを予測している。彼らは、下記
のように表され得る方程式K_pL＝K_p・K_L ⁿを与えた： log K_pL＝log K_p＋n log K_L 従って、修飾した蛋白質に関する分配係数の対数と付着
したリガンドの分子の数との間の直線関係は、各々log
K_Lおよびlog K_pのスロープおよび切片を用いて予測され
る。

図３から、この切片は、未修飾のアルブミンのlog K
に関する実験値の−0.39±0.09（平均値±SD、ｎ＝５）
と良好に一致した−0.36であることが見いだされた。し
かしながら、このスロープ（log K_L）は0.08であり、相
系中のPEG（¹⁴C−PEG−4000）の分配に関する独立した
測定によって得られる実験値（log K＝0.4±0.002、平
均値±SD、ｎ＝３）よりもずっと小さい。MPEGに関する
分配係数のこのような実験値と計算値との間の相違は、
修飾されたアミノ基の数の過剰な見積もりによるもので
あるとは考えられない、何故ならば、これは、ここで得
られる結果を生じさせるためには過剰な見積もりが80％
である必要があるからである。

Sharp他（１）は、異なる度合に修飾したMPEG−IgGs
の分配係数を測定し、そして、分配係数を基として、蛋
白質に付着したMPEG分子の数を計算するためBrookesの
方程式を用いた場合、¹⁴Cで標識したMPEGを用いること
で直接これを測定したとき得られる値に対して、これは
著しく下に見積もることになることを記述している。し
かしながら、これらの著書は、置換とLog Kとの間の関
係を確立しなかった。

実施例２向流分布による、MPEG修飾アルブミンの不均質性の実証アルブミンの分配係数とMPEGによる修飾度合との間の
関係を実証した後、我々は、MPEG−アルブミンをクロマ
トグラフィーを分析するため、多数回分配（即ち、向流
分布、CCD）を用いた。

図４は、アルブミン、MPEG修飾したアルブミン類１お
よび２に関するCCDの形を示している。これらの最後の
２つは、各々2:1および16:1のTMPEG:lysモル比を用いて
アルブミンをTMPEGと一緒に培養することによって得ら
れた。各々の画分中に存在している蛋白質に関する分配
係数もまた示した。

未修飾アルブミンは、CCDの列の左側に対して、画分
７および13の間に分布している（図４の上）。このCCD
の列の左側にある分布ピークの位置は、アルブミンの分
配が二相系の底部相に対して有利であり（即ち、低い分
配係数）、このことは、単一管の分配化における観察と
一致している（図１および２）。分布ピークに沿った全
ての未修飾アルブミンの分配係数に管する一定値（図４
の上）は、蛋白質製造の均質性と一致している。

MPEG−アルブミン_１は、画分14と26との間のCCDの形
（図４の中間）が未修飾のアルブミン（画分７〜15、図
４の上部）に関するものより右側によっていることを示
している。この結果は、未修飾のアルブミンとの比較に
おける、修飾したアルブミンに関する単一管の分配から
の単一管分配から得られる、より高い分配係数を反映し
ている（図１および２）。画分14と26との間の画分のい
ずれか中に存在しているアルブミンの分配係数は、未修
飾のアルブミンのそれ（図４の中および上）よりも高か
った。更に、前者の分配係数は、未修飾アルブミンのよ
うには一定でなく、しかし漸次的に、分布の形が左側か
ら右側に増大した（図４の中）。分配係数と修飾度との
間の関係により（図３）、分配に関するこの不均質性
は、修飾されたアルブミン類とMPEG修飾されたアルブミ
ン類との混合物からなっているMPEG−アルブミンが、修
飾度を基とした向流分布によって分画され得ることを示
している。

MPEG修飾したアルブミン_２（TMPEG:Lysのモル比は16:
1）に関するCCDの形（これは、単一管中の最も高い分配
係数を示した）（図２）は、画分23と28との間のCCDの
列が右側によって存在していた（図４の下）。これらの
画分中にあるアルブミンの分配係数（図４の下）は、画
分１〜23中のアルブミンに相当するものより高かった
（図４の上および下）。画分24および26中に局在してい
るMPEG修飾アルブミン類は、複合体MPEG−アルブミン_１
（図４の中）中に存在しているか、或はMPEG−アルブミ
ン_２（図４の下）中に存在しているかに拘らず、同じ分
配係数を有していることは特記すべきである。

log と図３の回帰から計算された置換度との関係（lo
g K＝0.084xn＝0.36）を定義している方程式を用いて、
修飾の度合（ｎ）が個々の画分に対して見積もられ得る
（表II）。

表II MPEG−アルブミン₁,（図4,中間）画分 log K 修飾されたNH₂の計算した番号＊ 14 −0.38 0 16 0.024 4.6 18 0.33 8.2 20 0.52 10.5 23 0.90 15.0 25 2.00 28.1 27 2.00 28.1 MPEG−アルブミン_２（図4,底部） 25 2.00 28.1 27 2.00 28.1 29 2.00 28.1 ＊注；用いたTMPEG製造において鎖流に関する有意な不
均質性が存在している場合、この見積もり値を補正する
必要がある、何故ならば、これが、PEG−蛋白質の付加
体の分配係数に影響を与えるからである（１）。

実施例３いくつかのMPEG−蛋白質の分配挙動が、実施例１中のMP
EG−BSAに関して示された挙動から派生していることの
実証蛋白質顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子gm−
CSFを、アルブミンに関して記述したのと同様にして、M
PEGにカップリングさせた。PEGによる異なる置換度を有
するPEG−gm−CSF複合体を生じさせるため、ある範囲の
PEG:リジンモル比をこのカップリング反応のために用い
た（10:1〜1000:1）。この蛋白質は、６個のリジンを有
しており、結果として１〜６の置換度を有する種類が理
論的に可能である。生物学的に活性な市販の標識された
gm−CSF−I¹²⁵（Amersham）を、これらの実験に用い
た。モル比を変化させた同様な実験のFPLCの形（以下の
実施例４を参照）は、モル比を増大させると漸次的な置
換が生じることを示している。

モル比を増大させると、log Kは上昇し、そして降下
する（図５）。このことは、明らかに、BSAとは異な
り、Brook方程式で予測される期待された対数の直線的
関係に従わないことを示している。同じ実験において、
沸騰することで変性されたgm−CSFは、減少したlog Kを
有しており、このことは、この蛋白質の立体的変化が、
PEG相への分配を減少させるように表面特性を変化させ
たことを示唆している。この材料を用いると、より低い
モル比で、より際だったＫの上昇が見られた。これは、
おそらくは、この変性した蛋白質のより開かれた構造に
より、PEG修飾がより容易になったことを反映している
ものと考えられる（この示唆は、変性したgm−CSFを用
いたとき305:1のTMPEG:リジンでのPEG化が、より大きな
高分子量ピークを生じるところのFPLCによって明確に示
される）（図６）。

これはこの方法の欠点であると考えられるが、次のこ
とを特記すべきである：１）Ｋ値は、未修飾蛋白質に関する値以下にはならなか
った（従って、CCD分離を可能にする可能性をまだ有し
ている）。

２）未変性の材料を用いた場合、Ｋの低下は、蛋白質に
対して非常に高いモル比を用いるときのみ生じる（生物
学的に活性を示すPEG−gm−CSFを生じさせるために用い
られるような範囲ではない）。

３）性能において、代替方法、即ちFPLCおよびPAGEは、
CCDよりも優れていなかった（以下を参照）。

実施例４ GM−CSFのための、リジンに対するTMPEGの単一モル比に
おける、不均質に修飾された生成物の製造に関する実証代表的な実験を図7aおよび7bに示し、ここでは、gm−
CSFを、ある範囲のリジンに対するTMPEGのモル比に対し
て暴露した。FPLCは、非常に小さい割合の材料を修飾し
た最も低いモル比を例外として（見掛け分子量における
シフトを基とした単一リジン上、PEG−IL2を用いたKatr
eの実験（19）参照）、該材料が不均質であることを示
している。不均質性を示す目的でFPLCがここでは用いら
れているが、この方法にはいくつかの欠点がある（以下
を参照）。

この実施例は、均一に修飾されたPEG−蛋白質複合体
を得るための問題が、アルブミンの如く数多くのリジン
を有する大きな蛋白質に限定されるものではないことを
示している。

実施例５この新規な方法の必要性を強調しているFPLCおよびPAGE
の欠点１）TMPEGの漸次的熟成がFPLC上で溶解しないPEG−シト
キン複合体を生じさせることの実証我々は、BSA（図8a）およびgm−CSFを含む蛋白質のFP
LCの形において、ゆっくりした溶出に変化させると、MP
EGが非特定の拡散効果を誘発することを見い出した。こ
のことは、TMPEGで修飾されたgm−CSFに関するFPLCの形
に対して行った観察と関係している。我々は、TMPEGの
バッチがより古くなるにつれて、リジンに対するTMPEG
の同モル比で得られる修飾された種類の数値の減少によ
って示されるような低下した活性になるばかりでなく、
低下させた溶出速度に伴うFPLCの形の分解能が漸次的に
失われることに気が付いた（図8b）。トレシル基が失わ
れるか、或は不活性になるにつれて、MPEGもしくはその
同等物（反応性を示しないTMPEG）でもって製造物が影
響を受けるように汚染され、そしてこれは、図8aの発見
を考慮すると、上記観察を説明し得る。

未カップリングのPEG（MPEG）は、有意には分配に影
響を与えないため（図９はI¹²⁵−gm−CSFに対する効果
の不足を示している）、不活性なTMPEGまたはMPEGが、F
PLCに対して悪い影響を与えるのとは反対に、CCDの如き
分配方法には影響を与えないことを記述できる。

図10aおよびｂは、CCDを用いると、修飾した材料が未
修飾の材料から明らかに区別され、一方、「熟成され
た」TMPEG調製物を用いたときのFPLCの場合、かなりの
オーバーラップがあり、そして修飾した材料と未修飾の
材料との間に明らかな分離が見られなかった。

この点に関して更に、MPEGを用いたときの発見とFPLC
は、FPLCが必要な場合、中和処理方策の選択を考慮すべ
きであることを示している。アルブミンはPEG−アルブ
ミンを生じさせ、リジンはカルボキシル基を有するPEG
誘導体を生じさせ、ヒドロキシアミンは末端ヒドロキシ
ル基を有するPEG分子を生じさせる。各々の中和生成物
の影響を、製造された特定のPEG−蛋白質を用いて検査
する必要がある。

２）PEG修飾した蛋白質のFPLCおよびPAGEで得られる見
掛け分子量は修飾度に対して単純な関係にない蛋白質分子の大部分を修飾するために充分なTMPEG:リ
ジンの比（例えば、305:1またはそれ以上の）を用いた
全ての実験において、修飾したgm−CSFは、未修飾の材
料よりも速いか遅いの両方で溶出した（図11aおよび
ｂ）。

同様の結果が、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用
いて得られ（図12）、ここでは、未変性および変性した
両方のrHu−gmCSF（レーン12、14〜16、19、20）に関し
て、該修飾は、結果として、材料を未修飾帯の前と後の
両方で流れさせた。しかしながら、この実験は、明らか
に、PAGEはFPLCとは異なり、MPEGによる悪影響を受けて
いないことを示している。

このことは、修飾の度合、特に、PEGで修飾したリジ
ン残基の数は、このどちらかの方法からも推測するのは
困難であることを明らかに示している。

３）FPLCはPEG−蛋白質生成物の不均質性を覆い隠しう
る FPLCは、以下の実施例６で示されるように、ある程度
は生成物の不均質性を示すことができるが、CCDは、FPL
Cでは外観上単純な形しか得られない材料に関してでさ
え、不均質性を示す。

実施例６ CCDは、FPLCを基にすると明らかには示されない修飾さ
れた材料でさえ不均質性を明らかに示す曲線に合致した演算規則によって分析された向流分布
の形は、存在する種類（この場合、種々のPEG−gm−CSF
複合体）の数の計算を可能にする。図13中のFPLCとCCD
の形の比較は、後者は、前者においては目立たない不均
質性を表示することができることを示している。

CCDは、大スケールで行うことができる追加的長所を
有しており、PEG−蛋白質の産業的生産に適している。

実施例７異なる度合に修飾させたgm−CSFが種々の生物学的活性
を有していることの実証未修飾の材料よりａ）速く、ｂ）一緒に、およびｃ）
遅く、溶出する修飾したサンプル（TMPEG:リジンが305:
1で製造）のFPLC画分からサンプルを取り出した。gm−C
SFは、数多くの異なる生物学的活性を有しており、我々
は、そのｆ−met−leu−phe誘発された好中球酸化的突
発活性の開始（ニトロブルーテトラゾリウム還元によっ
て定量）の使用を選択した。画分を、ミクロタイタープ
レート中、FMLPを有するヒトの末梢血液の好中球に暴露
した。

この画分の生物学的活性を、放射能（I¹²⁵標識したgm
−CSF、Amershamを用いて）を用いて、蛋白質に対して
正規化した。画分は、生物学的活性がないところから、
同じFPLC分画化からの未修飾材料のピークから得られる
画分中に見られる活性の３〜６倍の、範囲であった（図
14）。

この実施例は、所望の生物学的活性を達成するために
は、PEG−蛋白質の種類の正確な制御または分画を生じ
させる必要があることを示している。

方法１）FPLC カップリング用緩衝液で前もって平衡にしたSuperose
−12カラムの備わっているFharmacia FPLCシステム上で
サンプルを分析した。このサンプルの200μｌを該カラ
ム上に置き、そして次に、カップリング用緩衝液を用い
て、１分当たり0.3mlsの流速で溶出させ、0.25mLづつの
画分を集めた。

溶出用の緩衝液を変化させ、例えばいくつかの用途で
は、カップリング用緩衝液（0.125MのNaClを含有してい
る0.05Mの燐酸ナトリウムpH7.5）を用いた。細胞が直接
溶離剤に暴露される場合、燐酸塩で緩衝させた食塩水pH
7.3および約285mOsmを用いた。蛋白質は、充分に豊富な
場合、波長280mmの吸収で検出し、或は放射能標識（I
¹²⁵）を検知することで検出した。

２）SDSゲル電気泳動（PAGE） 15％のポリアクリルアミドゲルを濃縮用ゲルと一緒に
用いた。サンプルを、等容積の装荷用緩衝液と混合した
後、得られる混合物を、１分間100℃の水浴中に置くこ
とで変性させた。この変性させた混合物をくぼみ当たり
40μｌ装荷し、そして150ボルト；最大電流で電気泳動
を行った。このゲルをWhatman No 1濾紙上で乾燥した
後、希土類増感紙を用い−70℃で、このゲルの放射線写
真を撮った。このフィルムを、例えば４日間暴露した後
現像した。

３）NBT還元試験多形核白血球（PMN）を、Eggleton他の分画遠心分離
法を用いて単離した（J.Immunol Methods 121（1989）1
05−113）。用いた細胞濃度はハンクス液（HBSS）中1mL
当たり1x10⁷であった。FMLP（SIGMA）を、ジメチルスル
ホキサイド（DMSO、BDH）に溶解した後、1x10^-2％のDMS
O中1x10^-7の最終濃度で用いた。この試験溶液の一定分
量（30μｌ）を取り、そして三重のミクロタイタープレ
ート（１プレート当たり96個のくぼみ、NUNC）のくぼみ
中に充填した。

5.25％のウシ胎児血清を含有している50μｌのHBSSを
各々のくぼみに加えた。このプレートを37℃に温め、そ
してPMNを含有している予め温めたHBSSを25μｌ加え
た。開始させるため、この細胞を２時間培養した。FMLP
を含有している予め温めたNBT溶液100μｌ（イトロブル
ーテトラゾリウムグレードIII、SIGMA、0.1％w/v）を、
各々のくぼみに加えた（後者がNBT還元を開始させ
る）。氷上に15分間置いた後、反応を停止させた。操作
は、Rock（J.Immunol Methods 82（1989）161−167）が
記述している方法の改良法に従って行った。このプレー
トを遠心分離（1000rpm、６分間）にかけた後、上澄み
液を除去した。３分間空気乾燥した後、250μｌの70％
メタノールを加えた。遠心分離しそして上澄み液を除い
た後、この細胞を、100μｌの2M KOHを用いて溶解させ
た。12時間後125μｌのDMSOを各々のくぼみに加えた。
フィルター７（620nm）およびフィルター３（450nm）を
用いて、モードAbs2にセットしたTitertek Multiscan読
取機（Flow Labs）上で比色定量を行った。

追加的図の解説図５生物学的に活性な蛋白質および変性した（沸騰し
た）蛋白質に対して、TMPEG暴露した後のPEG/デキスト
ラン系中で、I¹²⁵標識した組換え型のヒトのgm−CSF（r
Hu−gmCSF）の相分配を行った。両方の製造に関して、l
og Kはカップリング比（TMPEG:リジン）に対して曲線型
である。後者は、修飾度を決定する（反応したリジン基
の数）。

図６ TMPEG:リジンの比が305:1のとき、rHu−gmCSFのT
MPEG暴露に先立って沸騰させると（下方のパネル）、最
高分子量で（矢印）FPLCピークが増大した。これは、沸
騰していない対照区（上方のパネル）に対して中間的な
ピーク４および５を減少させた。

図７ rHu−gmCSF−I¹²⁵の異なる２つのバッチのFPLC ａ）上方のパネル：未修飾のrHu−gmCSF: 中間のパネル305:1のTMPEG:リジンのモル比。

下方のパネル1000:1のTMPEG:リジンのモル比。

ｂ）上方のパネル10:1のTMPEG:リジンのモル比。

下方のパネル305:1 図８ａ）FPLCに先立って、蛋白質に対してMPEGを暴露する
と、形の拡散が生じ、これは潜在的に、サンプルがMPEG
または不活性化TMPEGで汚染されている場合、TMPEGで修
飾された蛋白質のFPLCを干渉し得る。

ｂ）漸次的に古くなったTMPEG（乾燥下室温で保存）の
使用は、修飾された蛋白質のFPLCの形を有意に変化させ
る。

図９ rHu−gmCSFの分配挙動に対するTMPEG（上方のパネ
ル）およびMPEG暴露（下方のパネル）の影響に関する比
較。後者は有意なＫの増分を生じない。

図10 TMPEG:リジンのモル比が305:1のとき、TMPEGの熟成し
た（19週）サンプルをrHu−gm−CSFに暴露したときの、
CCD（上方のパネル）とFPLC（下方のパネル）との比
較。CCSのみが、成功裏に、修飾と未修飾（矢印）との
間のピークを区別していた。

図11 PEG修飾したrHu−gmCSF（305:1のTMPEG:リジンに暴露
した）は、未修飾の材料よりも速くそして遅くの両方で
流れ、このことは、FPLCにおいては、見掛け分子量と、
PEGで修飾したリジン残基の数との間には明らかな関係
がないことを示している。

図12 未修飾と、TMPEG:リジンの種々のモル比に暴露してPE
G修飾したrHu−gmCSFのポリアクリルアミドゲル電気泳
動。レーン:1＝未修飾;2＝変性;6＝1000:1のTMPEG:リジ
ンに暴露;4＝500:1;5＝305:1;6＝マーカー;7＝100:1;81
0:1;9＝0:1;10＝305:1のMPEG:リジン;11＝10:1;12＝10
0:1で修飾した変性rHu−gmCSF;15＝10:1;16＝０−1;17
＝1000:1で修飾したrHu−gmCSF;18＝305:1で修飾したrH
u−gmCSF;19＝305:1で修飾した変性rHu−gmCSF;20＝変
性したrHu−gmCSF0:1。

図13 10:1のTMPEG:リジンに暴露したrHu−gmCSFに対するCC
D（上方のパネル）およびFPLC（下方のパネル）。FPLC
は未修飾の材料に関する小さいピークのみを示している
が、CCDの形はよりくっきりと不均質性を表している。
このCCDの形は、コンピュータープログラム（Blonquist
and Wold、Acta Chem Scand B28、56:1974）に適合
し、そして未修飾材料（矢印）の位置におけるそれに加
えて３つの曲線を表示している。

図14 NBT還元で測定した後（原文を参照）、１画分当たり
のI¹²⁵（c.p.m.）に関して表される存在する蛋白質の量
に関して正規化させたrHu−gmCSFの好中球開始活性。

未修飾（網目状の陰影をつけた）および305:1で修飾
したrHu−gmCSF（平行線をつけた）に関するFPLCからの
画分は、生物学的活性の比較を可能にする。この修飾し
た材料は、活性のない種類および未修飾材料よりも高い
活性を有する種類を含んでいる。

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e glycol"Clin.exp.Immunol.46、649−652。

17）Kamisaki Y.、Wada H.、Yagura T.、Matsushima A.
およびInada Y.著（1981）「モノメトキシエチレングリ
コールを用いた修飾による大腸菌Ｌ−アスパラギナーゼ
の免疫原性およびクリアランス速度の減少」“Reductio
n in the immunogenicity and clearance rate of Esch
erichia coli L−asparaginase by modification with
monomethoxypolyethylene glycol"J.Pharmacol.Exp.The
rap.216、410−414。

18）Hershfeld M.J.、Buckley R.H.、Greenberg M.L.、
Melton A.L.、Schiff R.、Hatem C.、Kurtzberg J.、Ma
rkert M.、Kobayashi R.H.、Kobayashi A.L.およびAbuc
howski A.著（1987）「ポリエチレングリコール修飾し
たアデノシンデアミナーゼを用いたアデノシンデアミナ
ーゼ欠乏症の治療」“Treatment of adenosine deamina
se deficiency with polyethylene glycol−modified a
densine deaminase"New Eng.J.Med.316、589−596。

19）Katre N.V.、Knauf M.J.およびLaird W.J.著（198
7）「ポリエチレングリコールによる組換えインターロ
イキン２の化学的修飾はマウスのMeth A肉腫モデル中の
効力を上昇させる」“Chemical modification of recom
binant interleukin 2 by polyethylene glycol increa
ses its potency in the murine Meth A sarcoma mode
l"Proc.Nat.Acad.Sci.84、1487−1491。

20）Chen R.H.−L.、Abuchowski A.、van Es T.、alczu
k N.C.およびDavis F.F.著（1988）「ポリ（エチレング
リコール）への共有結合的付着によって修飾された２種
の尿酸オキシターゼの特性」“Propeerties of two ura
te oxidases modified by the covalent attachment to
poly（ethylene glycol）"Biochim.Biophys.Acta 66
0、293−298。

21）Lisi P.L.、van Es T.、Abuchowski A.、Palczuk
N.C.およびDavis F.F.著（1982）「酵素治療1:ポリエチ
レングリコール:B−グルクロニダーゼは酸ムコ多糖症に
おける潜在的治療剤として接合する」“Enzyme therapy
1.Polyethylene glycol:B−glucuronidase conjugates
as potential therapeutic agents in acid mucopolys
accharidosis"。

22）Abuchowski A.およびDavis F.F.著（1979）「ポリ
エチレングリコール−トリプシン付加体の製造および特
性」“Preparation and properties of polyethylene g
lycol−trypsin adducts"Biochim.Biophys.Acta 578、4
1−46。

23）Wieder K.J.、Palczuk N.C.、van Es T.およびDavi
s F.F.著（1979）「ポリエチレングリコール：フェニル
アラニンアンモニア−リアーゼ付加体のいくつかの特
性」“Some properties of polyethylene glycol:pheny
lalanine ammonia−lyase adducts"J.biol Chem.254、1
2579−12587。

24）Suzuki T.、Kanbara N.、Tomono T.、Hayashi N.お
よびShinohara I.著（1984）「ポリ（エチレングリコー
ル）が連成した免疫グロブリンＧの物理化学的および生
物学的特性」“Physicochemical and biological prope
rties of poly（ethylene glycol）−coupled immunogl
obulin G"Biochim.Biophys Acta 788、248−255。

25）Veronese F.M.、Largajolli R.、Boccu E.、Benass
i C.A.およびSchiavon O.著（1985）「蛋白質の表面修
飾：フェニルクロロ蟻酸エステルによるモノメトキシ−
ポリエステルグリコールの活性化およびリボヌクレアー
ゼおよびスーパーオキシドジスムターゼの修飾」“Surf
ace modification of proteins.Activation of monomet
hoxy−polyethylene glycols by phenylchloroformates
and modification of ribonulease and superoxide di
smutase"Applied Biochem.Biotechnol.11、141−152。

26）「バイオ薬学的ポリマー類：バイオ薬学的使用のた
めのポリマー状材料および薬剤」“Biomedical Polymer
s.Polymeric Materials and Pharmaceuticals for Biom
edical Use"編集E.P.GoldbergおよびA.Nkajima、pp 441
−452、Academic Press、NY中のDavis .F.F.、Abuchows
ki A.、van Es T.、Palczuk N.C.、Sacova K.、Chen H.
−L.およびPyatak P.著（1980）「可溶非抗原性ポリエ
チレングリコール結合酵素」“Soluble、nonantigenic
polyethylene glycol−bound enzymes. 27）Harris J.M.著（1985）「ポリエチレングリコール
誘導体の実験室的合成」“Laboratory synthesis of po
lyethylene glycol derivaties"Rev.Macromol.Chem.Phy
s.C25、325−373。

28）Nilsson K.およびMosbach K.著（1981）「酵素並び
に高度に活性を示す塩化スルホニルを用いた支持体を有
する種々のヒドロキシル基に対する親和性リガンドの固
定化」“Immobilization of enzymes and affinity lig
ands to various hydroxyl group carrying supports u
sing highly reactive sulfonyl chlorides"Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.102、449−457。

29）Nilsson K.およびMosbach K.著（1984）「有機スル
ホニルクロライドを用いたリガンドの固定化」“Immobi
lization of ligands with organic sulfonyl chloride
s"Methods in Enzymology 104、56−69。

30）「細胞生物学およびバイオテクノロジーにおける水
系の相系を用いた分離の進展」“Advances in Separati
ons Using Aqueous Phase Systems in Cell Biology an
d Biotechnology"（編集D FisherおよびI A Sutherlan
d）、Plenum Press発行中のDelgado C.、Francis G.E.
およびFisher D.著（1988a）「トレシルクロライドを用
いた活性化による蛋白質へのPEGの連成：免疫親和性細
胞の分配における応用」“Coupling of PEG to protein
s by activation with tresyl chloride.Applications
in immunoaffinity cell partitioning" 31）Vadhan−Raj S.、LeMaistre A.、Keating M.他（19
87）「悪性を有する患者および骨髄不全を有する患者中
の組換え型ヒトの顆粒球−マクロファージコロニー刺激
因子の効果（要約）」“Effects of recombinant human
granulocyte−macrophage colony stimulating factor
in patients with malignancy and in patients with
bone marrow failure（abstract）"Blood 70、144a。

32）Gabrilove J.、Jakubowski A.、Fain K.他（1987）
「化学療法で誘発された好中球減少症の危険を有する癌
患者におけるrhG−CSFのフェーズI/II研究（要約」“A
phase I/II study of rhG−CSF in cancer patients at
risk for chemotherapy induced neutropenia（abstra
ct）"Blood 70、135a。

33）Morstyn G.、Duhrsen U.、Campbell L.他「メルフ
ェラニンを受けている進行した癌を有する患者中の顆粒
球−コロニー刺激活性（要約）」“Granulocyte−colon
y stimulating activity in patients with advanced c
ancer receiving melphalan（abstract）"Blood 70、14
0a。

34）Francis G.E.＆ Pinsky C.著（1987）「分化誘発剤
の臨床的試行：現在の試行および将来の見込み」“Clin
ical trials of differentiation inducing agents:Cur
rent trials and future prospects"「分化治療」“Dif
ferentiation Theray"に関する第２回会議の会報中の
章、Ravens Press（同封されたコピー） 35）「癌の化学療法および生物学的応答修飾剤、年会誌
９」“Cancer Cemotherapy and Biological Response M
odifiers Annuall 9"編集H.M.Pinedo、B.A.Chabnerおよ
びD.L.Longo、Elsevier Science Publishers B.V.、刊
行中のFrancis G.E.＆ Pinsky C.著（1987）「成長およ
び分化制御」“Growth and differentiation control" 36）Stocks S.J.、Jones A.J.M.、Ramey C.W.およびBro
oks D.E.著（1986）Anal.Biochem.154、232−234。

37）Habeed A.S.F.A.（1966）Anal.Biochem.14、328−3
36。

38）Bradford M.N.（1976）Anal.Biochem.72、248−25
4。

39）Johansson G.著（1985）「バイオテクノロジーにお
ける水系の二相系の分配、理論、方法、使用および応
用」“Partitioning Aqueous Two−phase Systems、The
ory、Methods、Uses and Applications to Biotechnolo
gy"（Walter H.、Brooks D.E.およびFisher D.編集）16
1−226頁、Academic Press、New York。

40）Treffry T.E.、Sharpe P.T.、Walter H.およびBroo
ks D.E.著（1985）「バイオテクノロジーにおける水系
の二相系の分配、理論、方法、使用および応用」“Part
itioning Aqueous Two−phase Systems、Theory、Metho
ds、Uses and Applications to Biotechnology"（Walte
r H.、Brooks D.E.およびFisher D.編集）132−148頁、
Academic Press、New York。

41）Peters T.Jr.著（1972）「血漿蛋白質」“The Plas
ma Proteins"（Putnam F.W.編集）第２版、第１巻、140
−142頁、Academic Press。

42）Albertson P.−A.著（1985）「細胞粒子および巨大
分子の分配」“Partition of Cell articles and Macro
molecules"第３版、Wiley、Interscience、New York。

43）Flanagan S.D.およびBarondes S.H.著（1975）J.Bi
ol.Chem.250、1484−1489。

44）Harris J.M.著（Rev.Macromal.Chem.Phys.C25、325
−373。

45）Brooks D.E.、Sharp K.A.およびFisher D.著（198
5）「バイオテクノロジーにおける水系の二相系の分
配、理論、方法、使用および応用」“Partitioning Aqu
eous Two−phase Systems、Theory、Methods、Uses and
Applications to Biotechnology"（Walter H.、Brooks
D.E.およびFisher D.編集）11−84頁、Academic Pres
s、New York。

なお、本発明の主たる特徴及び態様を示せば次のとお
りである。

1.PEG含有水系の二相系中のPEG/蛋白質付加物を分配す
ることを含む、ポリエチレングリコール（PEG）−蛋白
質付加物の混合物を分画するための方法。

2.該二相系の１つの相から、予め決められたPEG置換度
のPEG−蛋白質付加物を回収する段階を更に含む上記１
に従う方法。

3.該PEG−蛋白質付加物がモノメトキシPEGの付加物であ
る上記１または２に従う方法。

4.該モノメトキシPEG付加物が、蛋白質と2,2,2−トリフ
ルオロエタンスルホニルモノメトキシポリエチレングリ
コール（TMPEG）との反応によって形成される上記３に
従う方法。

5.未反応のTMPEGを分解するか或いはリジンまたはアル
ブミンを添加することによって該付加物生成反応を抑制
する上記４に従う方法。

6.分配をバッチ式または連続的に行う上記１〜５のいず
れか１項に従う方法。

7.分配を該二相の向流の流れによって行う上記６に従う
方法。

8.該蛋白質が顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子
（gm−CSF）である上記１〜７のいずれか１項に従う方
法。

9.PEG−gm−CSF付加物。

10.PEG−gm−CSF付加物およびそのための薬学的に許容
しうる担体または希釈剤を含む薬学的調剤。

11.該希釈剤または担体が注射に適したものである上記1
0に従う調剤。

12.該希釈剤または担体が注射用の無菌水であるかそれ
を含む上記11に従う調剤。

13.少なくとも１種の緩衝液、等浸透剤、防腐剤または
抗酸化剤を更に含む上記10〜12のいずれか１項に従う組
成物。

14.ヒトまたは動物体の処置方法またはヒトもしくは動
物体に対して行う診断方法における使用のための上記９
に従うPEG−gm−CSF付加物または上記10〜13のいずれか
１項に従う薬学的調剤。

15.ヒトまたは動物体の処置方法またはヒトもしくは動
物体に対して行う診断方法における使用のための薬剤の
製造における上記９に従うPEG−gm−CSF付加物または上
記10〜13のいずれか１項に従う薬学的調剤の使用。

16.該薬剤を静脈内または皮下注射または注入によって
投与する上記15に従う使用。

17.それらを必要としているヒトまたはヒト以外の動物
に対して有効で且つ無毒量の上記９に従うPEG−gm−CSF
付加物または上記10〜13のいずれか１項に従う薬学的組
成物を投与することを含む、ヒトまたは動物体の処置の
ための治療または診断方法。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｋ 49/00 ＡＥＤＣ０７Ｋ 14/535 Ｃ０７Ｋ 1/113 17/08 14/535 Ａ６１Ｋ 37/02 17/08 ＡＤＵ (72)発明者フイツシヤー，デレクイギリス国ロンドンエヌダブリユー３２ピーエフ・ロウランドヒルストリート（番地なし）ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メデイシン内 (72)発明者フランシス，ジリアン・エリザベスイギリス国ロンドンエヌダブリユー３２ピーエフ・ロウランドヒルストリート（番地なし）ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メデイシン内 (72)発明者デルガド，クリスチーナイギリス国ロンドンエヌダブリユー３２ピーエフ・ロウランドヒルストリート（番地なし）ロイヤル・フリー・ホスピタル・スクール・オブ・メデイシン内 (56)参考文献特開昭58−225025（ＪＰ，Ａ) 特開昭63−146828（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−226821（ＪＰ，Ａ) 日経バイオテクノロジー最新用語辞典 87，ｐ588〜589 日経マグロウヒル社, 1987−５−25 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 C07K 1/113 C07K 3/12 C07K 14/535 C07K 17/08 A61K 37/02 A61K 49/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】単一の誘導体化可能なヒドロキシル基を有
するポリエチレングリコール（PEG）の2,2,2−トリフル
オロエタンスルホニル誘導体を、合成された或いは組換
えDNA技術を用いて製造されたアルブミン以外の蛋白質
と反応させることにより得られた臨床上有用なポリエチ
レングリコール（PEG）−蛋白質共有付加物。
【請求項２】PEGの該スルホニル誘導体がスルホニル−
モノメトキシ−PEGである請求の範囲第１項記載の付加
物。
【請求項３】PEG−gm−CSFである請求の範囲第１項記載
の付加物。
【請求項４】単一の誘導体化可能なヒドロキシル基を有
するPEGの2,2,2−トリフルオロエタンスルホニル誘導体
を、合成された或いは組換えDNA技術を用いて製造され
たアルブミン以外の蛋白質と反応させることを特徴とす
るポリエチレングリコール（PEG）−蛋白質共有付加物
の製造方法。